JP2007525160A - βアミロイドペプチドを認識するヒト化抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、“Humanized Antibodies that Recognize Beta Amyloid Peptide”(βアミロイドペプチドを認識するヒト化抗体)と題された、2001年12月6日出願の以前に出願された米国特許出願第10/010,942号明細書(順に、“Humanized Antibodies That Recognize Beta−Amyloid Peptide”(β−アミロイドペプチドを認識するヒト化抗体)と題された、以前に出願された米国仮出願第60/251,892号明細書(2000年12月6日出願)(失効)の利益を主張する)の一部継続出願である、2003年3月14日出願の米国特許出願第10/388,389号明細書に対する優先権を主張する。上で言及された出願の内容全体は引用することにより本明細書に組み込まれる。
本発明は、アミロイド原性疾患(例えばアルツハイマー病)の予防および処置のための新たな免疫学的試薬、とりわけ治療的抗体試薬を特徴とする。本発明は、少なくとも部分的に、Aβペプチドに特異的に結合しかつアミロイド原性障害と関連する斑負荷の低下および/若しくは神経炎性ジストロフィーの低下で有効である2種のモノクローナル抗体の同定および特徴付けに基づく。これらの抗体の構造および機能分析は、予防的および/若しくは治療的使用のための多様なヒト化抗体の設計につながる。とりわけ、本発明はこれらの抗体の可変領域のヒト化を特徴とし、そして従ってヒト化免疫グロブリン若しくは抗体鎖、無傷のヒト化免疫グロブリン若しくは抗体、および機能的免疫グロブリン若しくは
抗体フラグメント、とりわけ特徴とされる抗体の抗原結合フラグメントを提供する。
[発明の詳細な記述]
本発明は、アルツハイマー病若しくは他のアミロイド原性疾患を予防若しくは治療するための新たな免疫学的試薬および方法を特徴とする。本発明は、少なくとも部分的に、βアミロイドタンパク質(Aβ)の結合(例えば可溶性および/若しくは凝集したAβの結合)、(例えば凝集したAβの)食作用の媒介、(例えば患者での)斑負荷の減少ならびに/または神経炎性ジストロフィーの低下で有効な2種のモノクローナル免疫グロブリン3D6および10D5の特徴付けに基づく。本発明はさらに、これらの免疫グロブリンの可変LおよびH鎖の一次および二次構造の決定および構造的特徴付け、ならびに活性および免疫原性に重要な残基の同定に基づく。
3個のCDRを包含する)かつ実質的にヒトアクセプター免疫グロブリンL若しくはH鎖配列からの可変枠組み領域を包含するヒト化免疫グロブリンL若しくはH鎖を特徴とするが、但し、最低1個の枠組み残基が、マウス3D6 L若しくはH鎖可変領域配列からの対応するアミノ酸残基で置換され、該枠組み残基は(a)抗原を直接非共有結合する残基;(b)CDRに隣接する残基;(c)(例えば相同な既知の免疫グロブリン鎖の解明された構造上のL若しくはH鎖をモデル化することにより同定される)CDRと相互作用する残基;および(d)VL−VH界面に参画する残基よりなる群から選択される。
(例えば配列番号14として示されるL鎖可変領域配列からの1、2若しくは3個のCDRを包含しかつ/または配列番号16として示されるH鎖可変領域配列からの1、2若しくは3個のCDRを包含する)かつ実質的にヒトアクセプター免疫グロブリンL若しくはH鎖配列からの可変枠組み領域を包含するヒト化免疫グロブリンL若しくはH鎖を特徴とするが、但し、最低1個の枠組み残基がマウス3D6 L若しくはH鎖可変領域配列からの対応するアミノ酸残基で置換され、該枠組み残基は(a)抗原を直接非共有結合する残基;(b)CDRに隣接する残基;(c)(例えば相同な既知の免疫グロブリン鎖の解明された構造上のL若しくはH鎖をモデル化することにより同定される)CDRと相互作用する残基;および(d)VL−VH界面に参画する残基よりなる群から選択される。
様において、本発明は、配列番号8に示されるところの可変H鎖領域および配列番号5に示されるところの可変L鎖領域を包含する免疫グロブリン若しくはその抗原結合フラグメントを特徴とする。なお別の態様において、本発明は、配列番号12に示されるところの可変H鎖領域および配列番号11に示されるところの可変L鎖領域を包含する免疫グロブリン若しくはその抗原結合フラグメントを特徴とする。別の態様において、本発明は10D5可変領域(例えば配列番号14若しくは配列番号16として示される可変領域配列)を包含するキメラ免疫グロブリンを特徴とする。なお別の態様において、免疫グロブリン若しくはその抗原結合フラグメントはIgG1からの定常領域をさらに包含する。
抗原結合タンパク質を指す。HおよびL鎖双方がドメインに折り畳まれる。「ドメイン」という用語は例えばβ−プリーツシートおよび/若しくは鎖間ジスルフィド結合により安定化されたペプチドループを含んでなる(例えば3ないし4個のペプチドループを含んでなる)H若しくはL鎖ポリペプチドの球状領域を指す。ドメインは、「定常」ドメインの場合は多様なクラスのメンバーのドメイン内の配列の変動の相対的欠如、若しくは「可変」ドメインの場合は多様なクラスのメンバーのドメイン内のかなりの変動に基づいて「定常」若しくは「可変」と本明細書でさらに称される。L鎖上の「定常」ドメインは「L鎖定常領域」、「L鎖定常ドメイン」、「CL」領域若しくは「CL」ドメイン)と互換性に称される。H鎖上の「定常ドメイン」は「H鎖定常領域」、「H鎖定常ドメイン」、「CH」領域若しくは「CH」ドメイン)と互換性に称される。L鎖上の「可変」ドメインは「L鎖可変領域」、「L鎖可変ドメイン」、「VL」領域若しくは「VL」ドメイン)と互換性に称される。H鎖上の「可変」ドメインは「H鎖可変領域」、「H鎖可変ドメイン」、「CH」領域若しくは「CH」ドメイン)と互換性に称される。
bc、Fv、一本鎖および一本鎖抗体を包含する。「二特異性」若しくは「二官能性」免疫グロブリン若しくは抗体以外は、免疫グロブリン若しくは抗体は同一のその結合部位のそれぞれを有すると理解される。「二特異性」若しくは「二官能性抗体」は2個の異なるH/L鎖対および2個の異なる結合部位を有する人工的ハイブリッド抗体である。二特異性抗体はハイブリドーマの融合若しくはFab’フラグメントの結合を包含する多様な方法により製造し得る。例えばSongsivilaiとLachmann、Clin.Exp.Immunol.79:315−321(1990);Kostelnyら、J.Immunol.148、1547−1553(1992)を参照されたい。
間の置換を伴う。非保存的置換はこれらの分類の1つの1メンバーを別の1メンバーと交換することを構成する。
とLane、Antibodies:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press(1988)を参照されたい);I−125標識を使用する固相直接標識RIA(Morelら、Mol.Immunol.25(1):7(1988)を参照されたい);固相直接ビオチン−アビジンEIA(Cheungら、Virology 176:546(1990));および直接標識RIA(Moldenhauerら、Scand.J.Immunol.32:77(1990))が既知である。典型的には、こうしたアッセイは、これらすなわち未標識の試験免疫グロブリンおよび標識した参照免疫グロブリンのいずれかを持つ固体表面もしくは細胞に結合した精製された抗原の使用を必要とする。競合阻害は試験免疫グロブリンの存在下で固体表面若しくは細胞に結合した標識の量を測定することにより測定する。通常、試験免疫グロブリンは過剰に存在する。通常、競合する抗体が過剰に存在する場合、それは共通の抗原への参照抗体の特異的結合を最低50〜55%、55〜60%、60〜65%、65〜70%、70〜75%若しくはそれ以上阻害することができる。
用語は本明細書で互換性に使用される。
ることができる。Fc受容体は、RavetchとKinet、Annu.Rev.Immunol 9:457−92(1991);Capelら、Immunomethods 4:25−34(1994);およびde Haasら、J.Lab.Clin.Med.126:330−41(1995)に総説されている。
I.免疫学的および治療的試薬
本発明の免疫学的および治療的試薬は、本明細書で定義されるところの免疫原若しくは抗体またはその機能的若しくは抗原結合フラグメントを含んでなるか若しくはそれらよりなる。基本的な抗体の構造単位はサブユニットの四量体を含んでなることが既知である。各四量体はポリペプチド鎖の2つの同一の対から構成され、各対は1個の「L」(約25kDa)および1個の「H」鎖(約50〜70kDa)を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主として抗原認識の原因である約100ないし110若しくはそれ以上のアミノ酸の可変領域を包含する。各鎖のカルボキシ末端部分は主としてエフェクター機能の原因である定常領域を規定する。
Immunological Interest(National Institutes of Health、メリーランド州ベセスダ、1987および1991)の定義に従う。代替の構造の定義はChothiaら、J.Mol.Biol.196:901(1987);Nature 342:878(1989);およびJ.Mol.Biol.186:651(1989)(下で集合的に「Chothiaら」と称され、そして全部の目的上そっくりそのまま引用することにより組み込まれる)により提案されてい
る。
A.Aβ抗体
本発明の治療薬はAβ若しくはアミロイド斑の他成分に特異的に結合する抗体を包含する。こうした抗体はモノクローナル若しくはポリクローナルであり得る。数種のこうした抗体は可溶性の形態に結合することなく凝集した形態のAβに特異的に結合する。数種は凝集した形態に結合することなく可溶性の形態に特異的に結合する。数種は凝集した形態および可溶性の形態双方に結合する。数種のこうした抗体は、天然に存在する長い形態のAβ(すなわちAβ42およびAβ43)に結合することなく天然に存在する短い形態のAβ(すなわちAβ39、40若しくは41)に結合する。数種の抗体は短い形態に結合することなく長い形態のAβに結合する。数種の抗体は完全長のアミロイド前駆体タンパク質に結合することなくAβに結合する。治療方法で使用される抗体は、好ましくは無傷(intact)の定常領域、若しくは少なくともFc受容体と総合作用するのに十分な定常領域を有する。ヒトアイソタイプIgG1は、貪食細胞上のFcRI受容体に対するヒトアイソタイプの最高の親和性を有するそれのために好ましい。抗体の一方のアームがAβに対する、そして他方がFc受容体に対する特異性を有する二特異性Fabフラグメントもまた使用し得る。好ましい抗体は約106、107、108、109若しくは1010M−1(これらの値の中間の親和性を包含する)より大きい(若しくはこれらに等しい)結合親和性でAβに結合する。
接配列を含有する。抗体への特異的結合を示す最も短いコア配列が、該抗体により結合されるエピトープを規定する。抗体はまた、エピトープ特異性が既に決定されている抗体との競合アッセイでもエピトープ特異性について試験し得る。例えば、Aβへの結合について3D6抗体と競合する抗体は、3D6と同一若しくは類似のエピトープに、すなわち残基Aβ1−5内で結合する。同様に、10D5抗体と競合する抗体は同一若しくは類似のエピトープに、すなわち残基Aβ3−7内で結合する。エピトープ特異性についての抗体のスクリーニングは治療的有効性の有用な予測因子である。例えば、Aβの残基1−7内の1エピトープに結合することが決定された抗体は、本発明の方法論によるアルツハイマー病の予防および治療において有効であることがありそうである。
1.ヒト以外の抗体の製造
本発明はヒト以外の抗体、例えば本発明の好ましいAβエピトープに対する特異性を有する抗体を特徴とする。こうした抗体は、本発明の多様な治療的組成物の処方で使用し得るか、または、好ましくはヒト化若しくはキメラ抗体(下に詳細に記述される)の製造のための相補性決定領域を提供し得る。ヒト以外のモノクローナル抗体(例えばネズミ、モルモット、霊長類、ウサギ若しくはラット)の製造は、例えばAβで動物を免疫することにより達成し得る。Aβ若しくはAβの免疫原性フラグメントを含んでなるより長いポリペプチド、またはAβに対する抗体に対する抗イディオタイプ抗体もまた使用し得る。HarlowとLane、上記(全部の目的上引用することにより組み込まれる)を参照されたい)。こうした免疫原は、天然の供給源から、ペプチド合成により若しくは組換え発現により得ることができる。場合によっては、免疫原は下述されるとおり担体タンパク質と融合若しくは別の方法で複合体形成して投与し得る。場合によっては、免疫原はアジュバントとともに投与し得る。「アジュバント」という用語は、抗原とともに投与される場合に該抗原に対する免疫応答を増加させるがしかし単独で投与される場合に該抗原に対する免疫応答を生成しない化合物を指す。アジュバントは、リンパ球補充(lymphocyte recruitment)、Bおよび/若しくはT細胞の刺激、ならびにマクロファージの刺激を包含するいくつかの機構により免疫応答を増加させ得る。数種の型のアジュバントを下述されるとおり使用し得る。フロイントの完全アジュバント、次いで不完全アジュバントが実験動物の免疫化に好ましい。
βの他のオーバーラップしないフラグメントへの結合を伴わないAβの特定の領域若しくは所望のフラグメントへの結合についてスクリーニングする。後者のスクリーニングは、Aβペプチドの欠失変異体の集合物への抗体の結合を測定すること、およびどの欠失変異体が該抗体に結合するかを決定することにより達成し得る。結合は例えばウエスタンブロット若しくはELISAにより評価し得る。抗体への特異的結合を示す最小のフラグメントが抗体のエピトープを規定する。あるいは、エピトープ特異性は、試験および参照抗体がAβへの結合について競合する競合アッセイにより決定し得る。試験および参照抗体が競合する場合には、それらは同一のエピトープ、または一方の抗体の結合が他方の結合を妨害するような十分に近接したエピトープに結合する。こうした抗体の好ましいアイソタイプはマウスアイソタイプIgG2a若しくは他の種の同等のアイソタイプである。マウスアイソタイプIgG2aはヒトアイソタイプIgG1の同等物である。
2.キメラおよびヒト化抗体
本発明はまた、βアミロイドペプチドに特異的なキメラおよび/若しくはヒト化抗体(例えばキメラおよび/若しくはヒト化免疫グロブリン)も特徴とする。キメラおよび/若しくはヒト化抗体は、キメラ若しくはヒト化抗体の構築のための出発原料を提供するマウス若しくは他のヒト以外の抗体と同一の若しくは類似の結合特異性および親和性を有する。
A.キメラ抗体の製造
「キメラ抗体」という用語は、そのLおよびH鎖遺伝子が、典型的には遺伝子工学により異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントから構築された抗体を指す。例えば、マウスモノクローナル抗体からの遺伝子の可変(V)セグメントを、IgG1およびIgG4のようなヒト定常(C)セグメントに結合しうる。ヒトアイソタイプIgG1が好ましい。典型的なキメラ抗体は、従って、マウス抗体からのVすなわち抗原結合ドメインおよびヒト抗体からのCすなわちエフェクタードメインよりなるハイブリッドタンパク質である。
B.ヒト化抗体の製造
「ヒト化抗体」という用語は、実質的にヒト抗体鎖(アクセプター免疫グロブリン若しくは抗体と称される)からの可変領域枠組み残基および実質的にマウス抗体(ドナー免疫グロブリン若しくは抗体と称される)からの最低1個の相補性決定領域を含んでなる最低1本の鎖を含んでなる抗体を指す。Queenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:10029−10033(1989)、米国特許第5,530,101号、同第5,585,089号、同第5,693,761号、同第5,693,762号明細書、Selickら、第WO 90/07861号明細書およびWinter、米国特許第5,225,539号明細書(全部の目的上そっくりそのまま引用することにより組み込まれる)を参照されたい。定常領域(1個若しくは複数)もまた、存在する場合は実質的に若しくは完全にヒト免疫グロブリンからである。
決定領域を同定すれば、次の段階は、生じるヒト化抗体の特性を至適化するためにこれらの成分からのどの残基(あれば)を置換すべきかを決定することである。一般に、ネズミの残基の導入はヒトにおけるヒト抗マウス抗体(HAMA)応答を導き出す抗体の危険を増大させるため、ネズミのアミノ酸残基でのヒトアミノ酸残基の置換は最小限にすべきである。免疫応答の技術に認識された決定方法を実施して、特定の患者における若しくは臨床試験の間のHAMA応答をモニターし得る。ヒト化抗体を投与された患者に、前記治療の投与の開始時におよびそれを通じて免疫原性の評価を与え得る。HAMA応答は、例えば、表面プラスモン共鳴技術(BIACORE)および/若しくは固相ELISA分析を包含する当業者に既知の方法を使用して、患者からの血清サンプル中のヒト化治療薬に対する抗体を検出することにより測定する。
(1)抗原を直接非共有結合する、
(2)CDR領域に隣接する、
(3)CDR領域と別の方法で相互作用する(例えばコンピュータモデル化により決定されるところのCDR領域の約3〜6Å内にある)、若しくは
(4)VL−VH界面に参画する
ことが合理的に期待される場合はマウス抗体からの同等な枠組みアミノ酸により置換すべきである。
hiaら、上記により定義されるところの構造的ループ残基を構成する場合、マウス抗体中に存在するアミノ酸をヒト化抗体中での置換に選択しうる。「CDR領域に隣接する」残基は、ヒト化免疫グロブリン鎖の一次配列中でCDRの1個若しくはそれ以上に直に隣接する位置、例えばKabatにより定義されるところのCDR若しくはChothiaにより定義されるところのCDRに直に隣接する位置のアミノ酸残基を包含する(例えばChothiaとLesk JMB 196:901(1987)を参照されたい)。これらのアミノ酸は、とりわけ、CDR中のアミノ酸と相互作用しかつアクセプターから選ばれる場合はドナーCDRを歪ませかつ親和性を低下させることがありそうである。さらに、隣接アミノ酸は抗原と直接相互作用するとみられ(Amitら、Science、233:747(1986))(引用することにより本明細書に組み込まれる)、また、ドナーからこれらのアミノ酸を選択することは元の抗体における親和性を提供する全部の抗原接触を保つために望ましいとみられる。
それらの全部は引用することにより本明細書に組み込まれる))。注目すべきことに、L鎖の位置2、48、64および71ならびにH鎖の26−30、71および94のアミノ酸(Kabatによる番号付け)は、多くの抗体中のCDRと相互作用することが可能であることが既知である。L鎖の位置35ならびにH鎖の93および103のアミノ酸もまたCDRと相互作用することがありそうである。全部のこれらの番号付けられた位置では、ヒト化免疫グロブリン中にあるべきアクセプターアミノ酸よりはむしろドナーアミノ酸(それらが異なる場合)の選択が好ましい。他方、L鎖の最初の5アミノ酸のようなCDR領域と相互作用することが可能なある残基を、ときに、ヒト化免疫グロブリンにおける親和性の喪失を伴わずにアクセプター免疫グロブリンから選ぶことができる。
酸がヒト配列の間で「希少」であるか若しくは「普遍的」であるかを決定する場合、該アクセプター配列と同一のサブグループのヒト配列のみを考慮することがしばしば好ましいことができる。
C.ヒト化3D6抗体の製造
本発明の好ましい一態様は、とりわけ本明細書に記述される治療および/若しくは診断の方法論での使用のためのAβのN末端に対するヒト化抗体を特徴とする。ヒト化抗体の製造のためのとりわけ好ましい一出発原料は3D6である。3D6はAβのN末端に特異
的でありかつアミロイド斑の食作用を媒介する(例えば食作用を誘導する)ことが示されている(実施例I〜Vを参照されたい)。3D6抗体のHおよびL鎖可変領域をコードするcDNAのクローニングおよびシークエンシングを実施例VIに記述する。
(1)抗原を直接非共有結合する、
(2)CDR領域に隣接する、Chothiaら、上記により提案される代替の定義のもとでCDR領域の一部である、若しくはCDR領域と別の方法で相互作用する(例えばCDR領域の約3A以内である)(例えば3D6の位置L2、H49およびH94のアミノ酸)、または
(3)VL−VH界面に参画する(例えば3D6の位置L36、L46およびH93のアミノ酸)
ことが合理的に期待される場合は、同等なマウスのアミノ酸により置換されるべきである。
で有意の配列の相同性を表さなかったため、H鎖のCDR3をモデル化するための鋳型として1qkz(PDB ID:1QKZ、Derrickら、J.Mol.Biol.293:81(1999))の解明された構造を選んだ。
045919のアラインメントは、残基H74、H77および/若しくはH89が、対応する生殖系列残基(例えばKabat ID 045919およびVH3−23を比較する場合に残基H74、H77および/若しくはH89)での置換に選択されうることを示す。同様に、3D6 L鎖に対する最高の程度の同一性を有する生殖系列配列はA1、A17、A18、A2およびA19を包含し、A19が最も好ましい。選択したL鎖アクセプター枠組みとこれらの生殖配列の1つとの間で一致しない残基を、対応する生殖系列残基での置換に選択し得る。
Proteins of Immunological Interest)から公的に入手可能である。本明細書に記述される抗体の三次元構造の情報は、例えば構造バイオインフォマティクス研究共同体(Research Collaboratory for Structural Bioinformatics)のタンパク質データバンク(PDB)から公的に入手可能である。PDBはワールドワイドウェブのインターネットを介して自由にアクセス可能であり、そしてBermanら(2000)Nucleic
Acids Research、p235−242により記述されている。本明細書で言及される生殖系列遺伝子配列は、例えば国立生物工学情報センター(National
Center for Biotechnology Information)(NCBI)のIgh、Ig κおよびIg λ生殖系列V遺伝子の集合物の配列のデータベース(国立保健研究所(National Institutes of Health
)(NIH)の国立医学図書館(National Library of Medicine)(NLM)の一部門として)から公的に入手可能である。NCBIの「Ig生殖系列遺伝子」データベースの相同性検索はIgG BLASTTMにより提供される。
い態様において、神経学的エンドポイント(例えばアミロイド負荷、神経炎性負荷など)をアッセイする。こうしたエンドポイントは、非侵襲的検出の方法論を使用して、生存する被験体で(例えばアルツハイマー病の動物モデル若しくは例えば免疫療法を受けているヒト被験体で)アッセイし得る。あるいは、こうしたエンドポイントは死後の被験体でアッセイし得る。動物モデルおよび/若しくは死後のヒト被験体でこうしたエンドポイントをアッセイすることは、類似の免疫治療の応用で利用されるべき多様な剤(例えばヒト化抗体)の有効性の評価において有用である。他の好ましい態様において、行動若しくは神経学的パラメータを上の神経病理学的活性若しくはエンドポイントの指標として評価し得る。
3.ヒト抗体
Aβに対するヒト抗体は下述される多様な技術により提供される。数種のヒト抗体は、競合結合実験により、そうでなければ本明細書に記述されるマウスモノクローナル抗体の1種のような特定の1マウス抗体と同一のエピトープ特異性を有するように選択する。ヒト抗体はまた、免疫原としてAβのフラグメントのみを使用することにより、および/若しくはAβの欠失変異体の集合物に対し抗体をスクリーニングすることにより、特定の1エピトープ特異性についてもスクリーニングし得る。ヒト抗体は好ましくはヒトIgG1アイソタイプ特異性を有する。
a.トリオーマ(trioma)の方法論
基礎的アプローチ、および本アプローチでの使用のための例示的一細胞融合パートナーSPAZ−4は、Oestbergら、Hybridoma 2:361(1983);Oestberg、米国特許第4,634,664号明細書;およびEnglemanら、米国特許第4,634,666号明細書(それらのそれぞれは全部の目的上そっくりそのまま引用することにより組み込まれる)により記述されている。本方法により得られる抗体産生細胞株は、それらが3種の細胞(2種はヒトおよび1種はマウス)の子孫であるためにトリオーマ(trioma)と呼ばれる。最初に、マウス骨髄腫株をヒトBリンパ球と融合して、Oestberg、上記により記述されるSPAZ−4細胞株のような抗体を産生しない異種ハイブリッド細胞を得る。該異種細胞をその後、免疫したヒトBリンパ球と融合して抗体産生トリオーマ細胞株を得る。トリオーマはヒト細胞から作成した通常のハイブリドーマより安定に抗体を産生することが見出された。
b.トランスジェニックのヒト以外の哺乳動物
Aβに対するヒト抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の最低1セグメントをコードする導入遺伝子を有するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物からも産生させ得る。通常、こうしたトランスジェニック哺乳動物の内因性の免疫グロブリン遺伝子座は機能的に不活性化する。好ましくは、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の該セグメントはHおよびL鎖成分の再配列されていない配列を包含する。内因性免疫グロブリン遺伝子の不活性化および外因性免疫グロブリン遺伝子の導入の双方を、標的化相同的組換え若しくはYAC染色体の導入により達成し得る。この方法から生じるトランスジェニック哺乳動物は、免疫グロブリン成分の配列を機能的に再配列しかつ内因性免疫グロブリン遺伝子を発現することなくヒト免疫グロブリン遺伝子によりコードされる多様なアイソタイプの抗体のレパートリーを発現することが可能である。これらの特性を有する哺乳動物の製造および特性は、例えばLonbergら、第WO93/12227号明細書(1993);米国特許第5,877,397号、同第5,874,299号、同第5,814,318号、同第5,789,650号、同第5,770,429号、同第5,661,016号、同第5,633,425号、同第5,625,126号、同第5,569,825号、同第5,545,806号明細書、Nature 148:1547(1994)、Nature Biotechnology 14:826(1996)、Kucherlapati、第WO 91/10741号明細書(1991)(それらのそれぞれは全部の目的上そっくりそのまま引用することにより組み込まれる)により詳細に記述されている。トランスジェニックマウスがとりわけ適する。抗Aβ抗体は、Lonberg若しくはKucherlapati、上記により記述されるようなトランスジェニックのヒト以外の哺乳動物をAβ若しくはそのフラグメントで免疫することにより得られる。モノクローナル抗体は例えば慣習的なKohler−Milsteinの技術を使用してこうした哺乳動物からのB細胞を適する骨髄腫細胞株に融合することにより製造する。免疫原性の剤で免疫したヒトから血清の形態でヒトポリクローナル抗体もまた提供し得る。場合によっては、こうしたポリクローナル抗体を、アフィニティー試薬としてAβ若しくは他のアミロイドペプチドを使用するアフィニティー精製により濃縮し得る。
c.ファージディスプレイ法
ヒト抗Aβ抗体を得るためのさらなる一アプローチは、Huseら、Science 246:1275−1281(1989)により概説された一般的プロトコルに従ってヒトB細胞からのDNAライブラリーをスクリーニングすることである。トリオーマの方法論について記述されたとおり、こうしたB細胞はAβ、フラグメント、Aβ若しくはフラグメントを含有するより長いポリペプチド、または抗イディオタイプ抗体で免疫したヒトから得ることができる。場合によっては、こうしたB細胞は抗体処置を最終的に受けることになる患者から得る。Aβ若しくはそのフラグメントに結合する抗体を選択する。こうした抗体(若しくは結合フラグメント)をコードする配列をその後クローン化しかつ増幅する。Huseにより記述されたプロトコルはファージディスプレイ技術と組合せてより効率的にされる。例えば、Dowerら、第WO 91/17271号明細書、McCaffertyら、第WO 92/01047号明細書、Herzigら、米国特許第5,877,218号明細書、Winterら、米国特許第5,871,907号明細書、Winterら、米国特許第5,858,657号明細書、Holligerら、米国特許第5,837,242号明細書、Johnsonら、米国特許第5,733,743号明細書およびHoogenboomら、米国特許第5,565,332号明細書(それらのそれぞれは全部の目的上そっくりそのまま引用することにより組み込まれる)を参照されたい。これらの方法で、メンバーがそれらの外側表面上に多様な抗体を表示するファージのライブラリーが製造される。抗体は通常Fv若しくはFabフラグメントとして表示される。所望の特異性をもつ抗体を表示するファージを、Aβペプチド若しくはそのフラグメントに対する親和性の強化により選択する。
4.可変領域の製造
ヒト化免疫グロブリンのCDRおよび枠組み成分を概念的に選択したら、こうした免疫グロブリンの多様な製造方法が利用可能である。暗号の縮重のため、多様な核酸配列が各免疫グロブリンのアミノ酸配列をコードすることができる。所望の核酸配列は新規固相DNA合成若しくは所望のポリヌクレオチドのより早期に製造されたバリアントのPCR突然変異誘発により製造し得る。オリゴヌクレオチドに媒介される突然変異誘発は標的ポリペプチドのDNAの置換、欠失および挿入バリアントの好ましい製造方法である。Adelmanら、DNA 2:183(1983)を参照されたい。簡潔には、所望の突然変異をコードするオリゴヌクレオチドを一本鎖DNA鋳型にハイブリダイズさせることにより、標的ポリペプチドのDNAを変える。ハイブリダイゼーション後にDNAポリメラーゼを使用して、オリゴヌクレオチドプライマーを組込みかつ標的ポリペプチドのDNA中に選択された変化をコードする鋳型の完全な第二の相補鎖を合成する。
5.定常領域の選択
上述されたとおり製造した抗体の可変セグメント(例えばキメラ、ヒト化若しくはヒト抗体のHおよびL鎖可変領域)は、典型的に、免疫グロブリン定常領域(Fc)(典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域)の最低一部分に連結する。ヒト定常領域のDNA配列は、多様なヒト細胞、しかし好ましくは不死化B細胞(Kabatら、上記およびLiuら、第WO87/02671号明細書を参照されたい)(それらのそれぞれは全部の目的上そっくりそのまま引用することにより組み込まれる)から公知の手順に従って単離し得る。通常、該抗体はL鎖およびH鎖双方の定常領域を含有することができる。H鎖定常領域は通常、CH1、ヒンジ、CH2、CH3およびCH4領域を包含する。本明細書に記述される抗体は、IgM、IgG、IgD、IgAおよびIgEを包含する全部のタイプの定常領域、ならびにIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4を包含するいずれかのアイソタイプを有する抗体を包含する。定常領域の選択は、部分的に、抗体依存性の補体および/若しくは細胞媒介性の毒性が望ましいかどうかに依存する。例えば、アイソタイプIgG1およびIgG3は補体活性を有し、そしてアイソタイプIgG2およびIgG4は有しない。抗体(例えばヒト化抗体)が細胞傷害性の活性を表すことが望ましい場合、定常ドメインは通常、補体を固定する定常ドメインであり、そしてクラスは典型的にIgG1である。こうした細胞傷害性の活性が望ましくない場合、定常ドメインはIgG2クラスのものでありうる。アイソタイプの選択は脳中への抗体の通過にもまた影響を及ぼし得る。ヒトアイソタイプIgG1が好ましい。L鎖定常領域はλ若しくはκであり
得る。ヒト化抗体は1種以上のクラス若しくはアイソタイプからの配列を含みうる。抗体は、2本のLおよび2本のH鎖を含有する四量体として、個別のH鎖、L鎖として、Fab、Fab’ F(ab’)2およびFvとして、若しくはHおよびL鎖可変ドメインがスペーサーにより連結されている一本鎖抗体として発現させ得る。
6.組換え抗体の発現
キメラ、ヒト化およびヒト抗体は典型的には組換え発現により製造する。定常領域に作動可能に連結されたLおよびH鎖可変領域をコードする核酸を発現ベクターに挿入する。LおよびH鎖は同一の若しくは異なる発現ベクターにクローン化し得る。免疫グロブリン鎖をコードするDNAセグメントは、免疫グロブリンポリペプチドの発現を確実にする発現ベクター(1種若しくは複数)中で制御配列に作動可能に連結する。発現制御配列は、限定されるものでないが、プロモーター(例えば天然に関連する若しくは異種のプロモーター)、シグナル配列、エンハンサー要素および転写終止配列を挙げることができる。好ましくは、発現制御配列は真核生物宿主細胞を形質転換若しくはトランスフェクトすることが可能なベクター中の真核生物プロモーター系である。ベクターが一旦適切な宿主に組込まれれば、該宿主を該ヌクレオチド配列の高レベル発現ならびに交差反応する抗体の収集および精製に適する条件下で維持する。
してCHO細胞株、多様なCos細胞株、HeLa細胞、好ましくは骨髄腫細胞株、若しくは形質転換したB細胞、またはハイブリドーマを包含する。好ましくは細胞はヒト以外である。これらの細胞の発現ベクターは、複製起点、プロモーター、およびエンハンサー(Queenら、Immunol.Rev.89:49(1986))のような発現制御配列、ならびにリボソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写ターミネーター配列のような必要なプロセシング情報部位を包含し得る。好ましい発現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、SV40、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルスなど由来のプロモーターである。Coら、J.Immunol.148:1149(1992)を参照されたい。
Maunal(Cold Spring Harbor Press、第2版、1989)(全部の目的上そっくりそのまま引用することにより組み込まれる)を参照されたい。哺乳動物細胞を形質転換するのに使用される他の方法は、ポリブレンの使用、プロトプラスト融合、リポソーム、電気穿孔および微小注入を包含する(全般として、Sambrookら、上記を参照されたい)。トランスジェニック動物の製造のため、導入遺伝子を受精卵に微小注入し得るか、若しくは胚幹細胞のゲノムに組込み得、そしてこうした細胞の核を除核卵細胞に移入し得る。
7.抗体フラグメント
抗体フラグメントもまた本発明の範囲内で企図されている。一態様において、ヒト以外、キメラおよび/若しくはヒト抗体のフラグメントが提供される。別の態様において、ヒト化抗体のフラグメントが提供される。典型的には、これらのフラグメントは最低107、およびより典型的には108若しくは109M−1の親和性での抗原への特異的結合を表す。ヒト化抗体フラグメントは、別個のH鎖、L鎖 Fab、Fab’ F(ab’)2、FabcおよびFvを包含する。フラグメントは組換えDNA技術、または無傷の免疫グロブリンの酵素的若しくは化学的分離により製造する。
8.動物モデルでの治療的有効性についての抗体の試験
7〜9月齢のPDAPPマウスの群それぞれにPBS中0.5mgのポリクローナル抗Aβ若しくは特異的抗Aβモノクローナル抗体を注入する。全部の抗体調製物は低エンドトキシンレベルを有するよう精製する。モノクローナル抗体は、Aβのフラグメント若しくはより長い形態のAβをマウスに注入すること、ハイブリドーマを調製すること、およびAβの他のオーバーラップしないフラグメントに結合することなくAβの所望のフラグメントに特異的に結合する抗体についてハイブリドーマをスクリーニングすることにより、フラグメントに対して製造し得る。
9.消失活性についての抗体のスクリーニング
本発明はまた、アミロイド沈着物若しくはいずれかの他の抗原、または消失活性が望ましい関連する生物学的実体の消失における活性についての抗体のスクリーニング方法も提供する。アミロイド沈着物に対する活性についてスクリーニングするため、アルツハイマー病を伴う患者若しくは特徴的なアルツハイマー病の病理学を有する動物モデルの脳からの組織サンプルを、小膠細胞のようなFc受容体をもつ貪食細胞、および試験中の抗体と培地中、in vitroで接触させる。貪食細胞は初代培養物またはBV−2、C8−B4若しくはTHP−1のような細胞株であり得る。いくつかの方法においては、成分を顕微鏡スライドガラス上で合わせて顕微鏡モニタリングを助長する。いくつかの方法においては複数の反応をマイクロタイター皿のウェル中で同時に実施する。こうした形式においては、別個の小型顕微鏡スライドガラスを別個のウェル中に据付け得るか、若しくはAβのELISA検出のような顕微鏡によらない検出形式を使用し得る。好ましくは、反応が進行する前の基礎値から出発して、および反応の間の1個若しくはそれ以上の試験値のin vitro反応混合物中のアミロイド沈着物の量の一連の測定を行う。抗原は例えばAβ若しくはアミロイド斑の他成分に対する蛍光標識した抗体で染色することにより検出し得る。染色に使用される抗体は消失活性について試験されている抗体と同一であっても若しくはなくてもよい。アミロイド沈着物の反応の間の基礎に関する低下は、試験中の抗体が消失活性を有することを示す。こうした抗体は、アルツハイマー病および他のアミロイド原性疾患の予防若しくは治療において有用であることがありそうである。
しもではなく、抗体および生物学的実体(ときに関連抗原を伴う)は貪食細胞を添加する前に相互と接触させる。培地中に残存する生物学的実体および/若しくは関連抗原の濃度を、存在する場合はその後モニターする。培地中の抗原若しくは関連する生物学的実体の量若しくは濃度の低下は、該抗体が貪食細胞とともに該抗原および/若しくは関連する生物学的実体に対する消失応答を有することを示す(例えば実施例IVを参照されたい)。10.変えられたエフェクター機能を有するキメラ/ヒト化抗体
定常領域(Fc領域)を含んでなる本発明の上述された抗体について、該分子のエフェクター機能を変えることもまた望ましいことがある。一般に、抗体のエフェクター機能は、多様なエフェクター分子、例えば補体タンパク質若しくはFc受容体への結合を媒介し得る該分子の定常すなわちFc領域中に存する。Fc領域への補体の結合は、例えば細胞病原体のオプソニン作用および溶解ならびに炎症応答の活性化において重要である。例えばエフェクター細胞の表面上のFc受容体への抗体の結合は、例えば抗体で被覆された病原体若しくは粒子の貪食および破壊、免疫複合体の消失、キラー細胞による抗体で被覆された標的細胞の溶解(すなわち抗体依存性の細胞媒介性の細胞傷害性、すなわちADCC)、炎症メディエーターの放出、抗体の胎盤通過、ならびに免疫グロブリン産生の制御を包含する多数の重要かつ多彩な生物学的応答を誘発し得る。
てLeu235をGluに変えることが該受容体に対する該変異体の相互作用を破壊することが示されている。従って、適切な突然変異を作成することにより本受容体の結合部位のスイッチをオンまたはオフに切り替え得る。
この部位でのいかなる他の置換もまた該グリコシル化部位を破壊することができる。
ーを製造することを包含する。該セグメントをその後、抗体の残存する部分、例えば抗体の可変領域、および細胞中での発現のための必要とされる制御配列に作動可能に連結し得る。
B.免疫学的および治療的剤をコードする核酸
アミロイド沈着物に対する免疫応答は、抗体および受動免疫に使用されるそれらの成分鎖をコードする核酸の投与によってもまた誘導し得る。こうした核酸はDNA若しくはRNAであり得る。免疫原をコードする核酸セグメントは、典型的に、患者の意図される標的細胞中のDNAセグメントの発現を可能にするプロモーターおよびエンハンサーのような制御配列に連結される。免疫応答の誘導のため望ましいところの血液細胞中での発現のため、L若しくはH鎖免疫グロブリン遺伝子からのプロモーターおよびエンハンサー要素、またはCMV主中初期プロモーターおよびエンハンサーが発現に導くのに適する。連結された制御配列およびコーディング配列はしばしば1ベクターにクローン化される。二本鎖抗体の投与のためには、該2本の鎖を同一若しくは別個のベクターにクローン化し得る。
94/12629号明細書、およびXiaoとBrandsma、Nucleic Acids.Res.24、2630−262(1996))からのウイルスベクターを包含する多数のウイルスベクター系が利用可能である。
合させ得る。例えばMcGeeら、J.Micro Encap.(1996)を参照されたい。
II.予防および治療方法
本発明は、とりわけ、例えばアミロイド原性疾患の予防若しくは処置のための、患者において、患者における有益な治療応答(例えばAβの食作用の誘導、斑負荷の低下、斑形成の阻害、神経炎性ジストロフィーの低下、認識機能の改善および/または認識低下の逆転、治療若しくは予防)を生成させる条件下での、Aβ内の特定のエピトープに対する治療的免疫学的試薬(例えばヒト化免疫グロブリン)の該患者への投与によるアルツハイマー病および他のアミロイド原性疾患の処置に向けられる。本発明はまた、アミロイド原性疾患の処置若しくは予防のための薬品の製造における開示される免疫学的試薬(例えばヒト化免疫グロブリン)の使用にも向けられる。
βの残基3−7内の1エピトープに特異的に結合する抗体の有効投薬量を投与することを伴う。なお別の局面において、本発明は、Aβの遊離のN末端残基を含んでなる1エピトープに結合する抗体を投与することを特徴とする。なお別の局面において、本発明は、Aβの1−10(ここでAβの残基1および/若しくは残基7はアスパラギン酸である)の残基内の1エピトープに結合する抗体を投与することを特徴とする。なお別の局面において、本発明は、完全長のアミロイド前駆体タンパク質(APP)に結合することなくAβペプチドに特異的に結合する抗体を投与することを特徴とする。なお別の局面において、該抗体のアイソタイプはヒトIgG1である。
A.処置の影響を受けやすい患者
処置の影響を受けやすい患者は、疾患の危険にさらされているがしかし症状を示していない個体、ならびに症状を現在示している患者を包含する。アルツハイマー病の場合、彼若しくは彼女が十分に長く生きる場合は事実上誰でもアルツハイマー病に罹る危険にさらされている。従って、本方法は、被験体患者の危険のいかなる評価に対する必要性も伴わずに一般集団に予防的に投与し得る。本方法は、アルツハイマー病の既知の遺伝的危険を有する個体にとりわけ有用である。こうした個体は、本疾患を経験した親族を有する者、および遺伝子若しくは生化学的マーカーの分析によりその危険が決定される者を包含する。アルツハイマー病に対する危険の遺伝子マーカーは、APP遺伝子の突然変異、とりわけそれぞれハーディ型およびスウェーデン型突然変異と称される位置717、ならびに位置670および671の突然変異を包含する(Hardy、上記を参照されたい)。危険の他のマーカーは、プレセニリン遺伝子PS1およびPS2、ならびにApoE4の突然変異、ADの家族歴、高コレステロール血症若しくはアテローム硬化症である。現在アルツハイマー病に罹っている個体は、特徴的な痴呆、ならびに上述された危険因子の存在か
ら認識し得る。加えて、多数の診断検査がADを有する個体を同定するために利用可能である。これらはCSF τおよびAβ42レベルの測定を包含する。上昇したτおよび減少したAβ42レベルはADの存在を知らせる。アルツハイマー病に罹っている個体は、実施例の節で論考されるところのADRDA基準によってもまた診断し得る。
B.処置レジメンおよび投薬量
予防的応用においては、製薬学的組成物若しくは薬品を、アルツハイマー病に感受性の、そうでなければその危険にさらされている患者に、危険を排除若しくは縮小する、重篤度を小さくする、または疾患の生化学的、組織学的および/若しくは行動上の症状を包含する該疾患の発症、その合併症ならびに該疾患の進行の間に現れる中間的な病理学的表現型を遅らせるのに十分な量で投与する。治療的応用においては、組成物若しくは薬品を、こうした疾患が疑われる、若しくは既に罹っている患者に、その合併症を包含する疾患の症状(生化学的、組織学的および/若しくは行動上の)、ならびに該疾患の進行中の中間的な病理学的表現型を治癒若しくは少なくとも部分的に停止するのに十分な量で投与する。
る。例示的一処置は例えば最低6か月の長期にわたる複数の投薬量の投与を伴う。付加的な例示的処置レジメンは2週ごとあたり1回若しくは月1回若しくは3ないし6か月ごとに1回の投与を伴う。例示的投薬スケジュールは、連日1〜10mg/kg若しくは15mg/kg、1日おきに30mg/kg、または毎週60mg/kgを包含する。いくつかの方法においては、異なる結合特異性をもつ2種若しくはそれ以上のモノクローナル抗体を同時に投与し、この場合投与される各抗体の投薬量は示される範囲内にある。
C.製薬学的組成物
本発明の剤は、しばしば、有効な治療薬、すなわち、および多様な他の製薬学的に許容できる成分を含んでなる製薬学的組成物として投与される。Remington’s Pharmaceutical Science(第15版、Mack Publishing Company、ペンシルバニア州イーストン(1980))を参照されたい。好ましい形態は意図される投与様式および治療的応用に依存する。組成物は、所望の製剤に依存して、動物若しくはヒトの投与のための製薬学的組成物を処方するのに一般に使用されるベヒクルと定義される製薬学的に許容できる非毒性の担体若しくは希釈剤もまた包含し得る。希釈剤は組合せの生物学的活性に影響を及ぼさないように選択する。こうした希釈剤の例は蒸留水、生理学的リン酸緩衝生理的食塩水、リンゲル液、ブドウ糖液、およびハンクス液である。加えて、製薬学的組成物若しくは製剤は他の担体、補助物質若しくは非毒性の非治療的非免疫原性安定剤なども包含しうる。
1368:201−15(1998))。
III.処置の経過のモニタリング
本発明は、アルツハイマー病に罹っているか若しくはそれに感受性である患者における処置のモニター方法、すなわち患者に投与されている1クールの処置のモニター方法を提供する。該方法を使用して、症候性の患者での治療的処置および無症候性の患者での予防的処置の双方をモニターし得る。とりわけ、該方法は受動免疫をモニターする(例えば投与された抗体のレベルを測定する)のに有用である。
の改善を示す治療的に処置した患者の集団での対照値と比較し得る。これらの場合の全部において、対照レベルに関して有意の減少(すなわち1標準偏差より大きい)は、処置を患者で再開すべきであることの指標である。
C.キット
本発明は上述されたモニター方法を実施するためのキットをさらに提供する。典型的には、こうしたキットはAβに対する抗体に特異的に結合する剤を含有する。該キットはまた標識も包含し得る。Aβに対する抗体の検出のため、標識は典型的に標識抗イディオタイプ抗体の形態である。抗体の検出のため、該剤はマイクロタイター皿のウェルへのように固相に予め結合して供給し得る。キットは、典型的に、該キットの使用のための説明書を提供するラベルもまた含有する。該ラベルは、測定された標識のレベルをAβに対する抗体のレベルと相互に関連づけるチャート若しくは他の対応レジメンもまた包含しうる。ラベルという用語は、キットの製造、輸送、販売若しくは使用の間のいずれかの時点でそれに貼付若しくは別の方法で付随するいかなる文書若しくは記録された資料も指す。例えばラベルという用語は、広告用チラシおよびパンフレット、包装資材、説明書、音声若し
くはビデオカセット、コンピュータディスク、ならびにキットに直接刻印された文書を包含する。
vivo画像化を実施するための)も提供する。こうしたキットは、典型的にはAβの、好ましくは残基1−10内の1エピトープに結合するための抗体を含有する。好ましくは、抗体は標識されているか、若しくは二次標識試薬がキットに包含される。好ましくは、該キットは、意図される応用を実施するため、例えばin vivo画像化アッセイを実施するための説明書のラベルが貼られている。例示的抗体は本明細書に記述されるものである。
D.in vivo画像化
本発明は患者におけるアミロイド沈着物のin vivo画像化方法を提供する。こうした方法は、アルツハイマー病若しくはそれに対する感受性を診断若しくはそれらを確認するのに有用である。例えば、該方法は痴呆の症状を伴って現れる患者で使用し得る。該患者が異常なアミロイド沈着物を有する場合には、該患者はアルツハイマー病に罹っていることがありそうである。該方法は無症候性の患者でもまた使用し得る。アミロイドの異常な沈着物の存在は将来の症候性疾患に対する感受性を示す。該方法は、以前にアルツハイマー病と診断された患者における疾患の進行および/若しくは処置に対する応答をモニターするのにもまた有用である。
実施例
本実施例はヘテロ接合性トランスジェニックマウスの脳中のAβの蓄積を阻害するAβに対する多様なモノクローナルおよびポリクローナル抗体の能力を試験する。
A.試験デザイン
8.5ないし10.5月齢の60匹の雄性および雌性のヘテロ接合性PDAPPトランスジェニックマウスをCharles River Laboratoryから得た。マウスを、Aβに向けられた多様な抗体で処理するため6群に分類した。動物は、動物の性、齢、血統および起源を群内で可能な限り緊密に一致させるように分配した。表2は該実験デザインを描く。
B.処置の経過のモニタリング
モノクローナル抗体は約10mg/kg(マウスの体重が50gであると想定した)の用量で注入した。抗体力価を28週の処置の間中モニターした。注入は、抗Aβ力価を1000より上に維持するため平均で7日ごとに腹腔内投与した。mAb 266は該アッセイで捕捉抗原として使用した凝集したAN1792に良好に結合しないためにそれに対するより低い力価が測定されたとは言え、この群について同一の投与スケジュールを維持した。モノクローナル抗体2H3を受けた群は、該抗体がin vivoであまりにも迅速に消失されたため最初の3週以内に中断した。
述されるとおり、Aβ1−42で被覆したプラスチック製マルチウェルプレートを用いるサンドイッチELISAを使用して、Aβ1−42結合抗体として測定した。各採血の平均力価を、ポリクローナル抗体ならびにモノクローナル抗体10D5および21F12について表3に示す。
C.脳中のAβおよびAPPレベル:
多様な抗Aβ抗体調製物での約6か月の処置後に、脳を生理的食塩水灌流後に動物から取り出した。一半球を免疫組織化学的分析のため調製し、そして第二の半球をAβおよびAPPレベルの定量に使用した。多様な形態のβアミロイドペプチドおよびアミロイド前駆体タンパク質(APP)の濃度を測定するために、半球を切開し、そして海馬、皮質および小脳領域のホモジェネートを5Mグアニジン中で調製した。これらを連続希釈し、そしてアミロイドペプチド若しくはAPPのレベルを、ELISAの形式での既知濃度のAβペプチド若しくはAPPの標準品の一連の希釈物との比較により定量した。
中央値)。対照群の小脳中のレベルの中央値(30.6ng/g組織)は海馬でよりも2,000倍以上より低かった。これらのレベルはこの齢のヘテロ接合性PDAPPトランスジェニックマウスについて以前に報告されたもの(Johnson−Woodら、上記)と同様である。
D.組織化学的解析:
PBS、ポリクローナルAβ42、21F12、266および10D5処置群のマウスからの脳のサブセットにおけるAβ免疫反応性斑の形態学を、Aβ42を用いる標準的免疫化手順に従った以前の研究のものと比較した。
、Aβに対するポリクローナルIg画分およびモノクローナル抗体の1種(10D5)は、斑負荷をそれぞれ93%および81%減少させた(p<0.005)。21F12は斑負荷に対する比較的限られた効果を有するようであった。pAbAβ1−42での処置後の脳の顕微鏡写真は、対照で処置した動物に関して、pAbAβ1−42処置した群における拡散した沈着物およびより大きな密集した斑の多くの非存在を示す。
E.リンパ球増殖応答
Aβ依存性のリンパ球増殖を、最終抗体注入8日後に収集した脾細胞を使用して測定した。新たに収集した細胞(ウェルあたり105)を、刺激のため5μMの濃度のAβ1−40の存在下で5日間培養した。陽性対照として、付加的な細胞をT細胞マイトジェンPHAとともに培養し、また、陰性対照として、添加されるペプチドを伴わずに細胞を培養した。
第二の研究において、10D5での処置を反復し、また、2種の付加的な抗Aβ抗体すなわちモノクローナル抗体3D6(Aβ1−5)および16C11(Aβ33−42)を試験した。対照群はPBS若しくは無関係なアイソタイプを一致させた抗体(TM2a)のいずれかを受けた。マウスは以前の研究より高齢(11.5〜12月齢のヘテロ接合性)であったが、それ以外は実験デザインは同一であった。もう一度、6か月の処置後に、10D5はPBS若しくはアイソタイプを一致させた抗体の対照のいずれに関しても80%以上斑負荷を減少させた(p=0.003)。Aβに対する他の抗体の一方すなわち3D6は等しく有効であり、86%の減少を生じた(p=0.003)。対照的に、該ペプチドに対する第三の抗体、16C11は斑負荷に対するいかなる効果も有することに失敗した。類似の知見がAβ42のELISA測定で得られた。
本実施例は、限られた血清濃度(25〜70μg/ml)で保持される場合に抗体がβ−アミロイド斑を装飾するのに十分なレベルでCNSへの到達経路を獲得したことを示す。
度を明らかにするために、各脳の連続切片を最初に抗Aβ抗体と、およびその後二次試薬と免疫反応させた。10D5および3D6は末梢投与後にCNS内の大部分の斑への到達経路を獲得した。斑負荷はこれらの処置群で16C11群に比較して大きく低下した。PDAPPマウスでエバンスブルーにより測定されるところの血管透過性の増大が存在しなかったため、CNS中への抗体の進入は血液脳関門の異常な漏出によらなかった。加えて、加齢PDAPPマウスの脳実質中の抗体の濃度は非トランスジェニックマウスにおいてと同一であり、血清中の抗体濃度の0.1%に相当した(アイソタイプに関係なく)。
斑消失に対する抗体の効果を検査するために、われわれは、初代小膠細胞をPDAPPマウス若しくはヒトAD脳のいずれかの未固定のクライオスタット切片とともに培養するex vivoアッセイを確立した。小膠細胞を新生DBA/2Nマウス(1〜3日齢)の大脳皮質から得た。皮質を50μg/mlのDNアーゼI(Sigma)を含むHBSS−(ハンクス平衡塩類溶液、Sigma)中で機械的に解離させた。解離した細胞を100μm細胞濾過器(Falcon)で濾過し、そして1000rpmで5分間遠心分離した。ペレットを増殖培地(高グルコースDMEM、10%FBS、25ng/ml rmGM−CSF)に再懸濁し、そして細胞をT−75プラスチック製培養フラスコあたり2個の脳の密度でプレーティングした。7〜9日後にフラスコを回転式振とう機で200rpmで37℃で2時間回転した。細胞懸濁液を1000rpmで遠心分離し、そしてアッセイ培地に再懸濁した。
C11は無効であった。加えて、該アッセイは、マウス若しくはヒト小膠細胞のいずれか、およびAβに対するマウス、ウサギ若しくは霊長類抗体を用いて実施した場合に匹敵する結果を提供した。
vivo有効性を暗示することを示す。
本実施例は、正常若しくはPDAPPいずれかのマウスの末梢組織への静脈内注入後に脳に送達される抗体の濃度を測定する。処置後、PDAPP若しくは対照の正常マウスを0.9%NaClで灌流した。脳領域(海馬若しくは皮質)を切開しかつ急速凍結した。脳を0.1%triton+プロテアーゼ阻害剤中でホモジェナイズした。免疫グロブリンがELISAにより抽出物中で検出された。F(ab’)2ヤギ抗マウスIgGを捕捉試薬としてRIAプレート上に被覆した。血清若しくは脳抽出物を1時間インキュベートした。抗マウスIgG1−HRP若しくはIgG2a−HRP若しくはIgG2b−HRP(Caltag)でアイソタイプを検出した。抗体は、アイソタイプに関係なく、血液
中で見出された濃度の1/1000である濃度で、CNS中に存在した。例えば、IgG1の濃度が血中でIgG2aの濃度の3倍であった場合、それは脳中で同様にIgG2aの3倍であり、双方は血中のそれらのそれぞれのレベルの0.1%で存在した。この結果はトランスジェニックおよび非トランスジェニック双方のマウスで観察され、PDAPPが独特に漏出する血液脳関門を有しないことを示す。
3D6 VHのクローニングおよび配列分析。3D6のH鎖可変VH領域を、2つの独立した方法によりハイブリドーマ細胞から調製したmRNAを使用するRT−PCRによりクローン化した。第一において、コンセンサスプライマー、5’プライマーとしての翻訳開始コドンを包含するVH領域リーダーペプチド(DNA #3818−3829)、およびg2b(DNA #3832)定常領域特異的3’プライマーを使用した。PCRで増幅した産物ならびに複数の独立に派生したクローンからの配列は相互と完全に一致した。3D6 VH領域の配列に対するさらなる確認として、5’RACE RT−PCRの方法論により得られるVHフラグメントおよび3’のg2b特異的プライマー(DNA
#3832)をシークェンシングすることにより該結果を確認した。再度、該配列はPCR産物ならびに複数の独立に単離されたクローン由来であった。双方の配列は(5’RACE産物からのリーダー領域中のV8I置換を除き)相互と完全に一致し、該配列が3D6のVH領域をコードするmRNA由来であることを示す。3D6のVH領域のヌクレオチド(配列番号3)およびアミノ酸配列(配列番号4)をそれぞれ表9Aおよび図2に示す。
#3806−3816)は翻訳開始コドンを包含するVL領域にハイブリダイズするように設計し、そして3’プライマー(DNA#3817)はV−J接合領域の下流のネズミのCk領域に特異的であった。PCRフラグメント、ならびにこのコンセンサスL鎖プライマー組を使用して単離された独立に派生したクローンのDNA配列分析は、該配列がV−J領域の接合の間のフレームシフト突然変異を含有したため、得られたcDNAが非機能的に再配列されたメッセージ由来であったことを示した。
と結論し得る。3D6のVL領域のヌクレオチド(配列番号1)およびアミノ酸配列(配列番号2)をそれぞれ表9Bおよび図1に示す。
クターをCOS細胞にコトランスフェクトした。2種の異なるH鎖クローン(H2.2およびH3.2)を3種の異なるキメラL鎖クローン(L3、L4およびL10)とともに独立にコトランスフェクトして結果の再現性を確認した。キメラ21.6抗体のトランスフェクションをベクターの陽性対照として実施した。トランスフェクション48時間後に馴化培地を収集し、そして抗体産生についてウエスタンブロット分析、若しくはAβ結合についてELISAによりアッセイした。
相同性/分子モデル化。ネズミの3D6抗体中の重要な構造的枠組み残基を同定するために、HおよびL鎖について最も近いネズミの抗体に基づき三次元モデルを生成した。この目的上、1CR9と呼称される抗体を3D6 L鎖をモデル化するための鋳型として選び(PDB ID;1CR9、Kanyoら、上記)、そして1OPGと呼称される抗体をH鎖をモデル化するための鋳型として選んだ(PDB ID:1OPG Kodandapaniら、上記)。(表1もまた参照されたい。)これらの抗体のL鎖およびH鎖との3D6のアミノ酸配列のアラインメントは、H鎖のCDR3を除き、1CR9および1OPG抗体が3D6と有意の配列の相同性を共有することを示した。加えて、選択した抗体のCDRループは、再度H鎖のCDR3を除き、3D6のCDRループがそうであるように同一のカノニカルのChothia構造分類にある。従って、1CR9および1OPGを、3D6の相同性モデル化のための解明された構造の抗体として最初に選択した。
& SegMod Module GeneMine(v3.5)ソフトウェアパッケージを使用して構築した。このソフトウェアはMolecular Applications Group(カリフォルニア州パロアルト)から無期限ライセンスのもとに購入した。Michael Levitt博士およびChris Lee博士により生み出さ
れたこのソフトウェアパッケージは、配列の相同性に基づく既知の構造の鋳型での一次構造の構造的モデル化に関与する段階を自動化することにより分子モデル化の過程を促進する。UNIX環境下でSilicon Graphics IRISワークステーションで作業して、該モデル構造は、好ましくない原子接触を緩和しかつ静電的およびファンデルワールス相互作用を至適化する一連のエネルギー最小化段階により、自動的に精緻なものとされる。
簡潔には、各V領域について、4種の大きな一本鎖のオーバーラップするオリゴヌクレオチドを合成した。加えて、特定のV領域の集成をさらに助長するために各V領域のための4種の短いPCRプライマーを合成した。この目的上使用したオリゴヌクレオチドのDNA配列を表15に示す。
似の結果は、観察されたDNA配列の誤りが集成に使用した長いDNAの合成の間の自動合成機の誤りから生じたことを示唆する。
残基1でのD→Y置換を除きバージョン1について示された置換のそれぞれを有する第二のバージョンのヒト化3D6を創製した。この残基がCDRと相互作用する残基と同定されたため、該残基での置換をバージョン1で実施した。しかしながら、置換は、その位置でヒト免疫グロブリンにとって希少であった1残基を欠失した。これゆえに置換を伴わない1バージョンを創製した。さらに、H鎖枠組み領域中の非生殖系列残基を生殖系列残基で置換した(すなわちH74=S、H77=TおよびH89=V)。バージョン2のLおよびH鎖のKabatの番号付けは、バージョン2のL鎖の残基1がasp(D)であり、H鎖の残基74がser(S)であり、H鎖の残基77がthr(T)でありかつH鎖の残基89がval(V)であることを除き、それぞれ表13および14に描かれたものと同一である。ヒト化3D6のバージョン1のLおよびH鎖のヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号34および36に示す。ヒト化3D6のバージョン2のLおよびH鎖のヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号35および37に示す。
凝集したAβへのヒト化3D6v1の結合。ヒト化3D6v1の機能試験を、一過性にトランスフェクトしたCOS細胞からの馴化培地を使用して実施した。細胞を、完全にキメラの抗体、キメラH鎖+ヒト化L鎖、若しくはキメラL鎖+ヒト化H鎖のいずれかの混合物、および最後に完全にヒト化した抗体でトランスフェクトした。馴化培地は、凝集したAβ1−42への結合についてELISAアッセイにより試験した。ヒト化抗体は実験誤差内の良好な活性を示し、かつ、キメラ3D6参照サンプルと識別不可能な結合特性を表した。結果を表16に示す。
ッセイは、h3D6v1およびh3D6v2に対するおよそ6倍より小さい結合親和性を示した。典型的には、ヒト化抗体はそれらのネズミの対蹠物に比較して結合親和性を約3〜4倍喪失する。従って、h3D6v1およびh3D6v2についての約3倍(ELISAおよびBIAcoreの結果の平均)の喪失は許容される範囲内にある。
るとおり、血液関門を横断することが可能であった。
10D5 VHのクローニングおよび配列分析。ハイブリドーマ細胞からの10D5のVHおよびVL領域を、5’RACE手順を使用するRT−PCRによりクローン化した。推定される10D5 VLドメインをコードする2個の独立のcDNAクローン由来のヌクレオチド配列(配列番号13)および推定されるアミノ酸配列(配列番号14)を表21および図9に示す。推定される10D5 VHドメインをコードする2個の独立のcDNAクローン由来のヌクレオチド配列(配列番号15)および推定されるアミノ酸配列(配列番号16)を表22および図10に示す。10D5 VLおよびVH配列は、それらがイニシエーターのメチオニンからC領域までの1個の連続したORFを含有しかつ免疫グロブリンV領域遺伝子の保存された残基の特徴を共有する限りにおいては、機能的V領域の基準に合致する。
本実施例は多様な神経病理学的エンドポイントに対するネズミのmAb 3D6の有効性を記述する。(変動する用量での)3D6での受動免疫とAβペプチドでの能動免疫との間で比較を行う。
免疫化
PDAPPマウスを3種の異なる用量すなわち10mg/kg、1mg/kgおよび10mg/kgを月1回(1×4)のmAb 3D6で受動免疫した。無関係のIgGγ2a抗体(TY 11/15)およびPBS注入が対照としてはたらいた。Aβペプチドでの能動免疫が比較としてはたらいた。各群で20と35匹の間の動物を分析した。
アミロイド負荷
アミロイド沈着物により占有される前頭皮質の程度を、3D6で免疫染色すること、次いで定量的画像解析により決定した。この分析の結果を表6に示す。免疫療法のそれぞれがアミロイド負荷の有意の減少に至った。
神経炎性負荷
3D6での受動免疫後の神経炎性負荷を、抗APP抗体8E5での脳切片の免疫染色、次いで定量的画像解析によりPDAPPマウスで測定した。神経炎性ジストロフィーはアミロイド斑の直近に位置する異栄養性神経突起の出現(例えば球状の外観をもつ神経突起)により示される。この分析の結果を表7に示す。3D6(IgGγ2aアイソタイプ、Aβ1−5を認識する)はAβペプチドでの能動免疫に比較して神経炎性負荷を有意に低下させなかった。以前に、10D5(Aβ3−7を認識するIgGγ1アイソタイプ)は神経炎性負荷を有意に低下させることが不可能であったことが観察されていた。
単回投与のフェーズI試験をヒトでの安定性を決定するために実施する。治療薬は、想定される有効性のレベルの約0.01から開始しかつ有効なマウス投薬量の約10倍のレベルに達するまで3の係数により増大させて、異なる患者に増大する投薬量で投与する。
持続期間を生存しかつ妨害するとみられる併用薬の使用のような複雑にする問題を欠くことがありそうであることである。患者機能の基礎評価は、MMSE、およびアルツハイマー病を伴う患者の状態および機能を評価するための包括的尺度であるADASのような、古典的計量心理学的基準を使用して行う。これらの計量心理学的尺度はアルツハイマー病の状態の進行の基準を提供する。適する定性的な生命尺度もまた処置をモニターするのに使用し得る。疾患の進行はMRIによってもまたモニターし得る。免疫原特異的抗体およびT細胞応答のアッセイを包含する患者の血液プロファイルもまたモニターし得る。
一般的材料および方法
A.ポリクローナルおよびモノクローナルAβ抗体の製造
抗Aβポリクローナル抗体は2群の動物から収集した血液から調製した。第一群は6ないし8週齢の100匹の雌性Swiss Websterマウスよりなった。それらを第0、15および29日に、CFA/IFAと組合せた100μgのAN1792で免疫した。第四の注入を半分の用量のAN1792を用いて第36日に与えた。動物を第42日に殺す際に放血し、血清を調製し、そして血清をプールして合計64mlを創製した。第二群は6ないし9週齢のPDAPPマウスと同系しかしヒトAPP遺伝子について非トランスジェニックの24匹の雌性マウスよりなった。それらを第0、14、28および56日に、CFA/IFAと組合せた100μgのAN1792で免疫した。これらの動物もまた、第63日に殺す際に放血し、血清を調製しかつ合計14mlのためプールした。該2ロットの血清をプールした。50%飽和硫酸アンモニウムを用いる2回の連続した沈殿を使用して抗体画分を精製した。最終沈殿物をPBSに対し透析しかつエンドトキシンについて試験した。エンドトキシンのレベルは1EU/mg未満であった。
B.抗体力価の測定
尾静脈に小さな切れ目を作成することおよび約200μlの血液を微小遠心管に収集することによりマウスを採血した。モルモットは、最初に後肢領域の毛を剃ること、およびその後18ゲージ針を使用して中足静脈に切れ目を入れること、ならびに血液を微小遠心管に収集することにより採血した。血液を室温(RT)で1時間凝血させ、ボルテックス攪拌し、その後14,000×gで10分間遠心分離して血餅を血清から分離した。血清をその後清浄な微小遠心管に移しかつ力価測定するまで4℃で保存した。
C.脳組織の調製
安楽死後に脳を取り出し、そして一半球を免疫組織化学的分析のため調製した一方、3種の脳領域(海馬、皮質および小脳)を他方の半球から切開し、そして特異的ELISA(Johnson−Woodら、上記)を使用して多様なAβタンパク質およびAPPの形態の濃度を測定するのに使用した。
パク質(Bachem)がマウス同腹子からの対照脳組織のホモジェネートに添加した場合に定量的に回収し得たことを示していた(Johnson−Woodら、上記)。
D.Aβレベルの測定
脳ホモジェネートを氷冷カゼイン希釈剤(0.25%カゼイン、PBS、0.05%アジ化ナトリウム、20μg/mlアプロチニン、5mM EDTA pH8.0、10μg/mlロイペプチン)で10倍希釈し、そしてその後16,000×gで4℃で20分間遠心分離した。合成Aβタンパク質標準品(1−42アミノ酸)およびAPP標準品は、最終組成物に0.5Mグアニジンおよび0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)を包含するように調製した。「全」AβサンドイッチELISAは、捕捉抗体としてAβのアミノ酸13−28に特異的なモノクローナル抗体、モノクローナル抗体266(Seubertら、上記)、およびレポーター抗体としてAβのアミノ酸1−5に特異的なビオチニル化モノクローナル抗体3D6(Johnson−Woodら、上記)を利用する。3D6モノクローナル抗体は分泌型APP若しくは完全長のAPPを認識しないが、しかしアミノ末端のアスパラギン酸をもつAβ種のみを検出する。このアッセイは約50ng/ml(11nM)の感度の下限を有し、そして1ng/mlまでの濃度で内因性のネズミのAβタンパク質に対する交差反応性を示さない(Johnson−Woodら、上記)。
E.APPレベルの測定
2種の異なるAPPアッセイを利用した。APP−α/FLと呼称される第一のものはAPP−α(α)および完全長(FL)の形態のAPPの双方を認識する。第二のアッセイはAPP−αに特異的である。APP−α/FLアッセイはAβの最初の12アミノ酸を包含する分泌型APPを認識する。レポーター抗体(2H3)はAPP695のアミノ酸612−613の間に存在するα−クリップ部位に特異的でないため(Eschら、Science 248:1122−1124(1990));このアッセイは完全長のAPP(APP−FL)もまた認識する。APP−FLの脳ホモジェネートを枯渇させるためにAPP−FLの細胞質尾部に対する固定されたAPP抗体を使用する予備実験は、APP−α/FL APPのおよそ30〜40%がFLであることを示唆している(データは示されない)。APP−α/FLおよびAPP−αアッセイ双方のための捕捉抗体は、
APP695の形態のアミノ酸444ないし592に対し生じられたmAb 8E5である(Gamesら、上記)。APP−α/FLアッセイのためのレポーターmAbは、APP695のアミノ酸597−608に特異的なmAb 2H3(Johnson−Woodら、上記)であり、また、APP−αアッセイのためのレポーター抗体はAPPのアミノ酸605ないし611に対し生じられたmAb 16H9のビオチニル化誘導体である。APP−αFLアッセイの感度の下限は約11ng/ml(150ρM)(Johnson−Woodら)であり、また、APP−α特異的アッセイの下限は22ng/ml(0.3nM)である。双方のAPPアッセイのため、mAb 8E5を、mAb 266について上述されたとおり96ウェルEIAプレートのウェル上に被覆した。精製した組換え分泌型APP−αをAPP−αアッセイおよびAPP−α/FLアッセイの参照標準として使用した(Eschら、上記)。5Mグアニジン中の脳ホモジェネートサンプルをELISA試料希釈剤(0.014Mリン酸緩衝液、pH7.4、0.6%ウシ血清アルブミン、0.05%チメロサール、0.5M NaCl、0.1%NP40)で10倍希釈した。それらをその後、0.5Mグアニジンを含有する試料希釈剤で4倍希釈した。希釈したホモジェネートをその後16,000×gでRTで15秒間遠心分離した。APP標準およびサンプルを二重のアリコートでプレートに添加しかつRTで1.5時間インキュベートした。ビオチニル化レポーター抗体2H3若しくは16H9をサンプルとともにRTで1時間インキュベートした。試料希釈剤で1000倍希釈したストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ(Boehringer Mannheim)をウェル中でRTで1時間インキュベートした。蛍光基質4−メチルウンベリフェリルホスフェートを30分のRTでのインキュベーションのため添加し、そしてプレートを365nmの励起および450nmの発光でCytofluor tm 2350蛍光計(Millipore)で読取った。
F.免疫組織化学
脳をPBS中4%パラホルムアルデヒド中で40Cで3日間固定し、そしてその後切片にするまで1%パラホルムアルデヒド、PBS中4℃で1から7日まで保存した。40ミクロン厚の冠状切片をRTでビブラトームで切断し、そして免疫組織化学的処理前に−20℃で低温保護物質(リン酸緩衝液中30%グリセロール、30%エチレングリコール)中で保存した。各脳について、それぞれ連続する240μmの間隔により分離される背側海馬の水準の6切片を、以下の抗体、すなわち(1)PBSおよび1%ウマ血清中2μg/mlの濃度に希釈したビオチニル化抗Aβ(mAb、3D6、ヒトAβに特異的);若しくは(2)PBSおよび1.0%ウマ血清中3μg/mlの濃度に希釈したヒトAPPに特異的なビオチニル化mAb、8E5;若しくは(3)トリス緩衝生理的食塩水、pH7.4(TBS)中0.25%Triton X−100および1%ウマ血清で500倍希釈したグリア線維性酸性タンパク質(GFAP;Sigma Chmical Co.)に特異的なmAb;若しくは(4)TBS中0.25%Triton X−100および1%ウサギ血清で100倍希釈したCD11b、MAC−1抗原に特異的なmAb(Chemicon International);若しくは(5)TBS中0.25%Triton X−100および1%ウサギ血清で100倍希釈したMHC II抗原に特異的なmAb(Pharmingen);若しくは(6)PBS中1%ウサギ血清で100倍希釈したCD 43に特異的なラットmAb(Pharmingen)、若しくは(7)PBS中1%ウサギ血清で100倍希釈したCD 45RAに特異的なラットmAb(Pharmingen);若しくは(8)PBS中1%ウサギ血清で100倍希釈したCD 45RBに特異的なラットモノクローナルAβ(Pharmingen);若しくは(9)PBS中1%ウサギ血清で100倍希釈したCD 45に特異的なラットモノクローナルAβ(Pharmingen);若しくは(10)PBS中1%ウサギ血清で100倍希釈したCD3eに特異的なビオチニル化ポリクローナルハムスターAβ(Pharmingen)、若しくは(11)PBS中1%ウサギ血清で200倍希釈したCD3に特異的なラットmAb(Serotec)の1種とともに;または(12)1%正常ウマ血清を含有する一次抗体を欠くPBSの溶液とともに一夜インキュベートした。
Laboratories;Vectastatin Elite ABCキット)と1時間反応させた。一次抗体としてのMAC−1若しくはMHC II特異的モノクローナル抗体とともにインキュベートした切片は、その後、TBSで200倍希釈したウサギで作成したビオチニル化抗ラットIgGとRTで1時間反応させ、次いで、TBSで1000倍希釈したアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体とともに1時間インキュベートした。GFAP、MAC−1およびMHC II特異的抗体とインキュベートした切片は、その後、それぞれ0.05%DAB、0.01%過酸化水素、0.04%塩化ニッケル、TBSでの4および11分間のRTでの処理により可視化した。
G.画像解析
CCDビデオカメラおよびSony TrinitronモニタによりNikon Microphot−FX顕微鏡に接続したVideometric 150画像解析装置(Oncor,Inc.、メリーランド州ゲイサーズバーグ)を免疫反応性のスライドガラスの定量に使用した。切片の画像をビデオバッファに保存し、そして、免疫標識された構造により占有される全画素面積を選択かつ計算するための色および彩度に基づく閾値を決定した。各切片について、海馬の輪郭を人的に描き、そして海馬により占有される全画素面積を計算した。アミロイド負荷パーセントを:(mAb 3D6と免疫反応性のAβ
沈着物を含有する海馬領域の画分)×100として測定した。同様に、神経炎性負荷パーセントは:(モノクローナル抗体8E5と反応性のジストロフィー性の神経突起を含有する海馬領域の画分)×100として測定した。Simple 32ソフトウェアアプリケーションプログラムを動作するC−Imaging装置(Compix,Inc.、フィラデルフィア州クランベリータウンシップ)をOptronicsカメラによりNikon Microphot−FX顕微鏡に接続し、そしてGFAP陽性の星状細胞ならびにMAC−1およびMHC II陽性小膠細胞により占有される膨大後部皮質のパーセントを定量するのに使用した。免疫反応した切片の画像をビデオバッファに保存し、そして、免疫標識された細胞により占有される全画素面積を選択かつ計算するためのモノクロに基づく閾値を決定した。各切片について、膨大後部皮質(RSC)の輪郭を人的に描き、そしてRSCにより占有される全画素面積を計算した。星状細胞増加のパーセントを:(GFAP反応性の星状細胞により占有されるRSCの画分)×100と定義した。同様に、小膠細胞症のパーセントを:(MAC−1若しくはMHC II反応性の小膠細胞により占有されるRSCの画分)×100と定義した。全部の画像解析について、それぞれ連続する240μmの間隔により分離される背側海馬の水準の6切片を各動物について定量した。全部の場合で、動物の処置状態は観察者に未知であった。
Claims (158)
- (i)配列番号2として示される3D6免疫グロブリンL鎖可変領域配列からの可変領域の相補性決定領域(CDR)、および(ii)ヒトアクセプター免疫グロブリンL鎖配列からの可変枠組み領域を含んでなるが、但し、最低1個の枠組み残基がマウス3D6 L鎖可変領域配列からの対応するアミノ酸残基で置換され、該枠組み残基が:
(a)抗原を直接非共有結合する残基;
(b)CDRに隣接する残基;
(c)CDRと相互作用する残基;および
(d)VL−VH界面に参画する残基
よりなる群から選択される、ヒト化免疫グロブリンL鎖。 - (i)配列番号4として示される3D6免疫グロブリンH鎖可変領域配列からの可変領域の相補性決定領域(CDR)、および(ii)ヒトアクセプター免疫グロブリンH鎖からの可変枠組み領域を含んでなるが、但し、最低1個の枠組み残基がマウス3D6 H鎖可変領域配列からの対応するアミノ酸残基で置換され、該枠組み残基が:
(a)抗原を直接非共有結合する残基;
(b)CDRに隣接する残基;
(c)CDRと相互作用する残基;および
(d)VL−VH界面に参画する残基
よりなる群から選択される、ヒト化免疫グロブリンH鎖。 - CDRと相互作用する残基が、1CR9の解明された構造に基づき3D6 L鎖をモデル化することにより同定される、請求項1に記載のL鎖。
- CDRと相互作用する残基が、1NLDの解明された構造に基づき3D6 L鎖をモデル化することにより同定される、請求項1に記載のL鎖。
- CDRと相互作用する残基が、1OPGの解明された構造に基づき3D6 H鎖をモデル化することにより同定される、請求項2に記載のH鎖。
- (i)配列番号2として示される3D6免疫グロブリンL鎖可変領域配列からの可変領域の相補性決定領域(CDR)、および(ii)ヒトアクセプター免疫グロブリンL鎖配列からの可変枠組み領域を含んでなるが、但し、最低1個の枠組み残基がマウス3D6 L鎖可変領域配列からの対応するアミノ酸残基で置換され、該枠組み残基が、3D6免疫グロブリンL鎖可変領域の三次元モデルの解析により同定されるところのL鎖可変領域のコンホメーション若しくは機能に影響を及ぼすことが可能な残基である、ヒト化免疫グロブリンL鎖。
- (i)配列番号4として示される3D6免疫グロブリンH鎖可変領域配列からの可変領域の相補性決定領域(CDR)、および(ii)ヒトアクセプター免疫グロブリンH鎖からの可変枠組み領域を含んでなるが、但し、最低1個の枠組み残基がマウス3D6 H鎖可変領域配列からの対応するアミノ酸残基で置換され、該枠組み残基が、3D6免疫グロブリンH鎖可変領域の三次元モデルの解析により同定されるところのH鎖可変領域のコンホメーション若しくは機能に影響を及ぼすことが可能な残基である、ヒト化免疫グロブリンH鎖。
- 枠組み残基が、抗原と相互作用することが可能な残基、抗原結合部位に近接する残基、CDRと相互作用することが可能な残基、CDRに隣接する残基、CDR残基の6Å以内の残基、カノニカル残基、バーニア領域残基、鎖間充填残基、希少残基、および構造モデ
ルの表面上のグリコシル化部位残基よりなる群から選択される、請求項6に記載のL鎖。 - 枠組み残基が、抗原と相互作用することが可能な残基、抗原結合部位に近接する残基、CDRと相互作用することが可能な残基、CDRに隣接する残基、CDR残基の6Å以内の残基、カノニカル残基、バーニア領域残基、鎖間充填残基、希少残基、および構造モデルの表面上のグリコシル化部位残基よりなる群から選択される、請求項7に記載のH鎖。
- 枠組み残基が、1CR9の解明された構造に基づいて3D6 L鎖をモデル化することにより同定される、請求項6若しくは8に記載のL鎖。
- 枠組み残基が、1NLDの解明された構造に基づいて3D6 L鎖をモデル化することにより同定される、請求項6若しくは8に記載のL鎖。
- 枠組み残基が、1OPGの解明された構造に基づいて3D6 H鎖をモデル化することにより同定される、請求項7若しくは9に記載のH鎖。
- (i)配列番号2として示される3D6免疫グロブリンL鎖可変領域配列からの可変領域の相補性決定領域(CDR)、および(ii)ヒトアクセプター免疫グロブリンL鎖からの可変枠組み領域を含んでなるが、但し、L1、L2、L36およびL46(Kabatの番号付け規約)よりなる群から選択される最低1個の枠組み残基がマウス3D6 L鎖可変領域配列からの対応するアミノ酸残基で置換されている、ヒト化免疫グロブリンL鎖。
- (i)配列番号4として示される3D6 H鎖可変領域配列からの可変領域の相補性決定領域、および(ii)ヒトアクセプター免疫グロブリンH鎖からの可変枠組み領域を含んでなるが、但し、H49、H93およびH94(Kabatの番号付け規約)よりなる群から選択される最低1個の枠組み残基がマウス3D6 H鎖可変領域配列からの対応するアミノ酸残基で置換されている、ヒト化免疫グロブリンH鎖。
- ヒトアクセプターL鎖がサブタイプκII(Kabatの規約)のものである、請求項1、3、4、6、8、10、11および13のいずれか1つに記載のL鎖。
- ヒトアクセプターH鎖がサブタイプIII(Kabatの規約)のものである、請求項2、5、7、9、12および14のいずれか1つに記載のH鎖。
- ヒトアクセプターL鎖が、Kabat ID 019230、Kabat ID 005131、Kabat ID 005058、Kabat ID 005057、Kabat ID 005059、Kabat ID U21040およびKabat ID U41645よりなる群から選択される、請求項15に記載のL鎖。
- ヒトアクセプターL鎖がKabat ID 019230である、請求項15に記載のL鎖。
- ヒトアクセプターH鎖が、Kabat ID 045919、Kabat ID 000459、Kabat ID 000553、Kabat ID 000386およびKabat ID M23691よりなる群から選択される、請求項16に記載のH鎖。
- ヒトアクセプターH鎖がKabat ID 045919である、請求項16に記載のH鎖。
- 最低1個の希少ヒト枠組み残基が、その位置でヒト可変L鎖配列に共通であるアミノ酸残基で置換されている、請求項1、3、4、6、8、10、11、13、15、17および18のいずれか1つに記載のL鎖。
- 最低1個の希少ヒト枠組み残基が、生殖系列可変L鎖配列からの対応するアミノ酸残基で置換されている、請求項1、3、4、6、8、10、11、13、15、17および18に記載のL鎖。
- 生殖系列可変L鎖配列がA1、A17、A18、A2およびA19よりなる群から選択される、請求項22に記載のL鎖。
- 最低1個の希少ヒト枠組み残基が、その位置でヒト可変H鎖配列に共通であるアミノ酸残基で置換されている、請求項2、5、7、9、12、14、16、19および20のいずれか1つに記載のH鎖。
- 最低1個の希少ヒト枠組み残基が、生殖系列可変H鎖配列からの対応するアミノ酸残基で置換されている、請求項2、5、7、9、12、14、16、19および20のいずれか1つに記載のH鎖。
- 生殖系列可変H鎖配列がVH3−48、VH3−23、VH3−7、VH3−21およびVH3−11よりなる群から選択される、請求項25に記載のH鎖。
- 生殖系列可変H鎖配列がVH3−23である、請求項25に記載のH鎖。
- 希少枠組み残基が、L鎖可変領域サブグループのヒトL鎖可変領域配列の10%未満のその位置での存在に基づいて選択され、また、共通残基はL鎖可変領域サブグループの配列の50%以上のその位置での存在に基づいて選択される、請求項21〜23のいずれか1つに記載のL鎖。
- 希少枠組み残基が、H鎖可変領域サブグループのヒトH鎖可変領域配列の10%未満のその位置での存在に基づいて選択され、また、共通残基はH鎖可変領域サブグループの配列の50%以上のその位置での存在に基づいて選択される、請求項24〜26のいずれか1つに記載のH鎖。
- モノクローナル抗体3D6 L鎖からの相補性決定領域(CDR)ならびに可変領域枠組み残基L1、L2、L36およびL46(Kabatの番号付け規約)を含んでなり、残部がヒト免疫グロブリンからであるL鎖。
- モノクローナル抗体3D6 H鎖からの相補性決定領域(CDR)ならびに可変枠組み残基H49、H93およびH94(Kabatの番号付け規約)を含んでなり、残部がヒト免疫グロブリンからであるH鎖。
- 請求項1、3、4、6、8、10、11、13、15、17および18のいずれか1つに記載のL鎖、ならびに請求項2、5、7、9、12、14、16、19および20のいずれか1つに記載のH鎖を含んでなるヒト化免疫グロブリン、若しくは前記免疫グロブリンの抗原結合フラグメント。
- 最低107M−1の結合親和性でβアミロイドペプチド(Aβ)に特異的に結合する、請求項32に記載の免疫グロブリン若しくは抗原結合フラグメント。
- 最低108M−1の結合親和性でβアミロイドペプチド(Aβ)に特異的に結合する、請求項32に記載の免疫グロブリン若しくは抗原結合フラグメント。
- 最低109M−1の結合親和性でβアミロイドペプチド(Aβ)に特異的に結合する、請求項32に記載の免疫グロブリン若しくは抗原結合フラグメント。
- H鎖アイソタイプがγ1である、請求項32に記載の免疫グロブリン若しくは抗原結合フラグメント。
- 可溶性βアミロイドペプチド(Aβ)および凝集したAβの双方に結合する、請求項32に記載の免疫グロブリン若しくは抗原結合フラグメント。
- 可溶性βアミロイドペプチド(Aβ)が脱凝集したAβである、請求項37に記載の免疫グロブリン。
- βアミロイドペプチド(Aβ)の食作用を媒介する、請求項32に記載の免疫グロブリン若しくは抗原結合フラグメント。
- 被験体の血液脳関門を横断する、請求項32に記載の免疫グロブリン若しくは抗原結合フラグメント。
- 被験体のβアミロイドペプチド(Aβ)負荷および神経炎性ジストロフィーの双方を低下させる、請求項32に記載の免疫グロブリン若しくは抗原結合フラグメント。
- (a)ヒト化L鎖が、配列番号2と呼称されるマウス3D6免疫グロブリンL鎖可変ドメインの対応する相補性決定領域からのアミノ酸配列を有する3種の相補性決定領域(CDR1、CDR2およびCDR3)、ならびにヒトL鎖可変領域枠組み配列からの可変領域枠組みを含んでなるが、但し、L1、L2、L36およびL46(Kabatの番号付け規約)よりなる第一の群から選択される最低1位置が、マウス3D6免疫グロブリンL鎖可変領域枠組みの同等な位置に存在する同一のアミノ酸残基により占有され;ならびに(b)ヒト化H鎖が、配列番号4と呼称されるマウス3D6免疫グロブリンH鎖可変ドメインの対応する相補性決定領域からのアミノ酸配列を有する3種の相補性決定領域(CDR1、CDR2およびCDR3)、ならびにヒトH鎖可変領域枠組み配列からの可変領域枠組みを含んでなるが、但し、H49、H93およびH94(Kabatの番号付け規約)よりなる第二の群から選択される最低1位置が、マウス3D6免疫グロブリンH鎖可変領域枠組みの同等な位置に存在する同一のアミノ酸残基により占有され、
該ヒト化免疫グロブリンが最低107M−1の結合親和性でβアミロイドペプチド(Aβ)に特異的に結合し、該3D6免疫グロブリンは配列番号2と呼称される可変ドメインをもつL鎖および配列番号4と呼称される可変ドメインをもつH鎖を有する、
ヒト化H鎖およびヒト化L鎖を含んでなるヒト化免疫グロブリン。 - ヒトL鎖可変領域枠組みがκ L鎖可変領域からである、請求項42に記載のヒト化免疫グロブリン。
- ヒトH鎖可変領域枠組みがIgG1 H鎖可変領域からである、請求項42に記載のヒト化免疫グロブリン。
- ヒト化L鎖可変領域枠組みが、Kabat ID 019230、Kabat ID 005131、Kabat ID 005058、Kabat ID 005057、Kabat ID 005059、Kabat ID U21040およびKabat I
D U41645よりなる群から選択されるL鎖からである、請求項42に記載のヒト化免疫グロブリン。 - ヒト化H鎖可変領域枠組みが、Kabat ID 045919、Kabat ID 000459、Kabat ID 000553、Kabat ID 000386およびKabat ID M23691よりなる群から選択されるH鎖からである、請求項42に記載のヒト化免疫グロブリン。
- ヒト化L鎖可変領域枠組みが、第一の群からの位置を除きKabat ID 019230のL鎖可変領域枠組み配列に同一であり、かつ、H鎖可変領域枠組みは、第二の群からの位置を除きKabat ID 045919のH鎖可変領域枠組み配列に同一である、請求項42に記載のヒト化免疫グロブリン。
- ヒト化L鎖がマウス3D6 H鎖の対応する相補性決定領域に同一である相補性決定領域を含んでなり、かつ、ヒト化H鎖がマウス3D6 H鎖の対応する相補鎖決定領域に同一である相補性決定領域を含んでなる、請求項42に記載のヒト化免疫グロブリン。
- 配列番号2として示される3D6の可変L鎖配列の相補性決定領域(CDR1、CDR2およびCDR3)を含んでなるヒト化抗体。
- 配列番号4として示される3D6の可変H鎖配列の相補性決定領域(CDR1、CDR2およびCDR3)を含んでなるヒト化抗体。
- マウス3D6抗体からの相補性決定領域(CDR)に対応するCDRを含んでなる可変領域を含んでなる、βアミロイドペプチド(Aβ)に特異的に結合するヒト化抗体若しくはその抗原結合フラグメント。
- (a)ネズミの3D6の相補性決定領域(CDR)のアミノ酸残基およびヒトVLサブグループIIの可変ドメイン枠組み領域(FR)のアミノ酸残基を含んでなるL鎖可変ドメイン;ならびに
(b)ネズミの3D6の相補性決定領域(CDR)のアミノ酸残基およびヒトVHサブグループIIIの可変ドメイン枠組み領域(FR)のアミノ酸残基を含んでなるH鎖可変ドメイン
を含んでなる、最低107M−1の結合親和性でβアミロイドペプチド(Aβ)を結合するヒト化抗体。 - 配列番号2若しくは配列番号4として示される3D6免疫グロブリン可変領域配列からの可変領域の相補性決定領域(CDR)、およびヒトアクセプター免疫グロブリンからの可変枠組み領域を含んでなるキメラ免疫グロブリン。
- 配列番号8に示されるところの可変H鎖領域および配列番号5に示されるところの可変L鎖領域を含んでなる免疫グロブリン若しくはその抗原結合フラグメント。
- 配列番号12に示されるところの可変H鎖領域および配列番号11に示されるところのL鎖領域を含んでなる免疫グロブリン若しくはその抗原結合フラグメント。
- 配列番号8に示されるところの可変H鎖領域、配列番号5に示されるところの可変L鎖領域およびIgG1からの定常領域を含んでなる免疫グロブリン。
- 配列番号12に示されるところの可変H鎖領域、配列番号11に示されるところのL鎖
領域およびIgG1からの定常領域を含んでなる免疫グロブリン。 - 請求項32〜52のいずれか1つに記載のヒト化免疫グロブリンの有効投薬量を患者に投与することを含んでなる、患者におけるアミロイド原性疾患の予防若しくは治療方法。
- 請求項32〜52のいずれか1つに記載のヒト化免疫グロブリンの有効投薬量を患者に投与することを含んでなる、患者におけるアルツハイマー病の予防若しくは治療方法。
- ヒト化免疫グロブリンの有効投薬量が1mg/kg体重である、請求項59に記載の方法。
- ヒト化免疫グロブリンの有効投薬量が10mg/kg体重である、請求項59に記載の方法。
- 請求項32〜52のいずれか1つに記載の免疫グロブリンおよび製薬学的担体を含んでなる製薬学的組成物。
- 配列番号2のアミノ酸24−39、配列番号2のアミノ酸55−61および配列番号2のアミノ酸94−102よりなる群から選択される配列番号2のフラグメントを含んでなる単離されたポリペプチド。
- 配列番号2のアミノ酸24−39、配列番号2のアミノ酸55−61および配列番号2のアミノ酸94−102を含んでなる単離されたポリペプチド。
- 配列番号4のアミノ酸31−35、配列番号4のアミノ酸50−66および配列番号4のアミノ酸99−107よりなる群から選択される配列番号4のフラグメントを含んでなる単離されたポリペプチド。
- 配列番号4のアミノ酸31−35、配列番号4のアミノ酸50−66および配列番号4のアミノ酸99−107を含んでなる単離されたポリペプチド。
- 配列番号2のアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチド。
- 配列番号4のアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチド。
- 最低1個の保存的アミノ酸置換を含んでなり、最低107M−1の結合親和性でのβアミロイドペプチド(Aβ)への特異的結合に導く能力を保持する、配列番号2のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドのバリアント。
- 最低1個の保存的アミノ酸置換を含んでなり、最低107M−1の結合親和性でβアミロイドペプチド(Aβ)を特異的に結合する能力を保持する、配列番号4のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドのバリアント。
- 配列番号2のアミノ酸配列の残基1−112を含んでなるか、若しくは配列番号4のアミノ酸配列の残基1−119を含んでなる、単離されたポリペプチド。
- 請求項1、3、4、6、8、10、、11、13、15および18のいずれか1つに記載のL鎖をコードする単離された核酸分子。
- 請求項2、5、7、9、12、14、16、19および20のいずれか1つに記載のH
鎖をコードする単離された核酸分子。 - 請求項64−71のいずれか1つに記載のポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
- 請求項32−57のいずれか1つに記載の免疫グロブリンをコードする単離された核酸分子。
- 配列番号1若しくは3のヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子。
- 請求項72−76のいずれかに記載の核酸分子を含んでなるベクター。
- 請求項72−76のいずれかに記載の核酸分子を含んでなる宿主細胞。
- 請求項45に記載の宿主細胞を抗体若しくはそのフラグメントが産生されるような条件下で培養すること、および前記抗体を宿主細胞若しくは培養物から単離することを含んでなる、抗体若しくはそのフラグメントの製造方法。
- 抗体若しくはそのフラグメントをコードする核酸分子を発現する宿主細胞を前記抗体若しくはフラグメントが産生されるような条件下で培養すること、および前記抗体若しくはフラグメントを宿主細胞若しくは培養物から単離することを含んでなり、前記抗体若しくはフラグメントが配列番号2のアミノ酸24−39、配列番号2のアミノ酸55−61および配列番号2のアミノ酸94−102を含んでなる、抗体若しくはそのフラグメントの製造方法。
- 抗体若しくはそのフラグメントをコードする核酸分子を発現する宿主細胞を前記抗体若しくはフラグメントが産生されるような条件下で培養すること、および前記抗体を宿主細胞若しくは培養物から単離することを含んでなり、前記抗体若しくはフラグメントが配列番号4のアミノ酸31−35、配列番号4のアミノ酸50−66および配列番号4のアミノ酸99−112を含んでなる、抗体若しくはそのフラグメントの製造方法。
- 解明された免疫グロブリン構造に基づき3D6可変領域の三次元構造をモデル化すること、および3D6免疫グロブリン可変領域のコンホメーション若しくは機能に影響を及ぼすことが可能な残基について前記モデルを解析してその結果置換の影響を受けやすい残基を同定することを含んでなる、ヒト化3D6免疫グロブリン可変枠組み領域中の置換の影響を受けやすい残基の同定方法。
- 3D6免疫グロブリン、3D6免疫グロブリン鎖若しくはそれらのドメインの三次元像の作製における配列番号2若しくは配列番号4として示される可変領域配列またはそのいずれかの部分の使用。
- (i)配列番号14として示される10D5免疫グロブリンL鎖可変領域配列からの可変領域の相補性決定領域(CDR)、および(ii)ヒトアクセプター免疫グロブリンL鎖配列からの可変枠組み領域を含んでなるが、但し、最低1個の枠組み残基がマウス10D5 L鎖可変領域配列からの対応するアミノ酸残基で置換され、該枠組み残基が:
(a)抗原を直接非共有結合する残基;
(b)CDRに隣接する残基;
(c)CDRと相互作用する残基;および
(d)VL−VH界面に参画する残基
よりなる群から選択される、ヒト化免疫グロブリンL鎖。 - (i)配列番号16として示される10D5免疫グロブリンH鎖可変領域配列からの可変領域の相補性決定領域(CDR)、および(ii)ヒトアクセプター免疫グロブリンH鎖からの可変枠組み領域を含んでなるが、但し、最低1個の枠組み残基がマウス10D5
H鎖可変領域配列からの対応するアミノ酸残基で置換され、該枠組み残基が:
(a)抗原を直接非共有結合する残基;
(b)CDRに隣接する残基;
(c)CDRと相互作用する残基;および
(d)VL−VH界面に参画する残基
よりなる群から選択される、ヒト化免疫グロブリンH鎖。 - CDRと相互作用する残基が、10D5 L鎖と最低70%の配列の同一性を共有するネズミの免疫グロブリンL鎖の解明された構造に基づき10D5 L鎖をモデル化することにより同定される、請求項84に記載のL鎖。
- CDRと相互作用する残基が、10D5 L鎖と最低80%の配列の同一性を共有するネズミの免疫グロブリンL鎖の解明された構造に基づき10D5 L鎖をモデル化することにより同定される、請求項84に記載のL鎖。
- CDRと相互作用する残基が、10D5 L鎖と最低90%の配列の同一性を共有するネズミの免疫グロブリンL鎖の解明された構造に基づき10D5 L鎖をモデル化することにより同定される、請求項84に記載のL鎖。
- CDRと相互作用する残基が、10D5 H鎖と最低70%の配列の同一性を共有するネズミの免疫グロブリンH鎖の解明された構造に基づき10D5 H鎖をモデル化することにより同定される、請求項85に記載のH鎖。
- CDRと相互作用する残基が、10D5 H鎖と最低80%の配列の同一性を共有するネズミの免疫グロブリンH鎖の解明された構造に基づき10D5 H鎖をモデル化することにより同定される、請求項85に記載のH鎖。
- CDRと相互作用する残基が、10D5 H鎖と最低90%の配列の同一性を共有するネズミの免疫グロブリンH鎖の解明された構造に基づき10D5 H鎖をモデル化することにより同定される、請求項85に記載のH鎖。
- (i)配列番号14として示される10D5免疫グロブリンL鎖可変領域配列からの可変領域の相補性決定領域(CDR)、および(ii)ヒトアクセプター免疫グロブリンL鎖配列からの可変枠組み領域を含んでなるが、但し、最低1個の枠組み残基がマウス10D5 L鎖可変領域配列からの対応するアミノ酸残基で置換され、該枠組み残基は10D5免疫グロブリンL鎖可変領域の三次元モデルの解析により同定されるところのL鎖可変領域のコンホメーション若しくは機能に影響を及ぼすことが可能な残基である、ヒト化免疫グロブリンL鎖。
- (i)配列番号16として示される10D5免疫グロブリンH鎖可変領域配列からの可変領域の相補性決定領域(CDR)、および(ii)ヒトアクセプター免疫グロブリンH鎖からの可変枠組み領域を含んでなるが、但し、最低1個の枠組み残基がマウス10D5
H鎖可変領域配列からの対応するアミノ酸残基で置換され、該枠組み残基は10D5免疫グロブリンH鎖可変領域の三次元モデルの解析により同定されるところのH鎖可変領域のコンホメーション若しくは機能に影響を及ぼすことが可能な残基である、ヒト化免疫グロブリンH鎖。 - 枠組み残基が、抗原と相互作用することが可能な残基、抗原結合部位に近接する残基、CDRと相互作用することが可能な残基、CDRに隣接する残基、CDR残基の6Å以内の残基、カノニカル残基、バーニア領域残基、鎖間充填残基、希少残基、および構造モデルの表面上のグリコシル化部位残基よりなる群から選択される、請求項92に記載のL鎖。
- 枠組み残基が、抗原と相互作用することが可能な残基、抗原結合部位に近接する残基、CDRと相互作用することが可能な残基、CDRに隣接する残基、CDR残基の6Å以内の残基、カノニカル残基、バーニア領域残基、鎖間充填残基、異常な残基、および構造モデルの表面上のグリコシル化部位残基よりなる群から選択される、請求項93に記載のH鎖。
- 枠組み残基が、10D5 L鎖と最低70%の配列の同一性を共有するネズミの免疫グロブリンL鎖の解明された構造に基づき10D5 L鎖をモデル化することにより同定される、請求項92若しくは94に記載のL鎖。
- 枠組み残基が、10D5 L鎖と最低80%の配列の同一性を共有するネズミの免疫グロブリンL鎖の解明された構造に基づき10D5 L鎖をモデル化することにより同定される、請求項92若しくは94に記載のL鎖。
- 枠組み残基が、10D5 L鎖と最低90%の配列の同一性を共有するネズミの免疫グロブリンL鎖の解明された構造に基づき10D5 L鎖をモデル化することにより同定される、請求項92若しくは94に記載のL鎖。
- 枠組み残基が、10D5 H鎖と最低70%の配列の同一性を共有するネズミの免疫グロブリンH鎖の解明された構造に基づき10D5 H鎖をモデル化することにより同定される、請求項93若しくは95に記載のH鎖。
- 枠組み残基が、10D5 H鎖と最低80%の配列の同一性を共有するネズミの免疫グロブリンH鎖の解明された構造に基づき10D5 H鎖をモデル化することにより同定される、請求項93若しくは95に記載のH鎖。
- 枠組み残基が、10D5 H鎖と最低90%の配列の同一性を共有するネズミの免疫グロブリンH鎖の解明された構造に基づき10D5 H鎖をモデル化することにより同定される、請求項93若しくは95に記載のH鎖。
- 最低1個の希少ヒト枠組み残基が、その位置でヒト可変L鎖配列に共通であるアミノ酸残基で置換されている、請求項84、86−88、92、94および96−98のいずれか1つに記載のL鎖。
- 最低1個の希少ヒト枠組み残基が、生殖系列可変L鎖配列からの対応するアミノ酸残基で置換されている、請求項84、86−88、92、94および96−98のいずれか1つに記載のL鎖。
- 生殖系列可変L鎖配列が、配列の同一な可変L鎖配列と最低70%の同一性を共有する免疫グロブリンのものである、請求項103に記載のL鎖。
- 生殖系列可変L鎖配列が、配列の同一な可変L鎖配列と最低80%の同一性を共有する免疫グロブリンのものである、請求項103に記載のL鎖。
- 生殖系列可変L鎖配列が、配列の同一な可変L鎖配列と最低90%の同一性を共有する免疫グロブリンのものである、請求項103に記載のL鎖。
- 最低1個の希少ヒト枠組み残基が、その位置でヒト可変H鎖配列に共通であるアミノ酸残基で置換されている、請求項85、89−91、93および99−101のいずれか1つに記載のH鎖。
- 最低1個の希少ヒト枠組み残基が、生殖系列可変H鎖配列からの対応するアミノ酸残基で置換されている、請求項85、89−91、93および99−101のいずれか1つに記載のH鎖。
- 生殖系列可変H鎖配列が、配列番号16の可変H鎖配列のものであるか、若しくはそれとの最低70%の同一性の共有している、請求項108に記載のH鎖。
- 生殖系列可変H鎖配列が、配列番号16の可変H鎖配列のものであるか、若しくはそれと最低80%の同一性の共有している、請求項108に記載のH鎖。
- 生殖系列可変H鎖配列が、配列番号16の可変H鎖配列のものであるか、若しくはそれと最低90%の同一性の共有している、請求項108に記載のH鎖。
- 希少枠組み残基が、L鎖可変領域サブグループのヒトL鎖可変領域配列の10%未満のその位置での存在に基づいて選択され、また、共通残基はL鎖可変領域サブグループの配列の50%以上のその位置での存在に基づいて選択される、請求項102−106のいずれか1つに記載のL鎖。
- 希少枠組み残基が、H鎖可変領域サブグループのヒトH鎖可変領域配列の10%未満のその位置での存在に基づいて選択され、また、共通残基はH鎖可変領域サブグループの配列の50%以上のその位置での存在に基づいて選択される、請求項107−111のいずれか1つに記載のH鎖。
- 請求項84、86−88、92、94および96−98のいずれか1つに記載のL鎖、ならびに請求項85、89−91および93ならびに99−101のいずれか1つに記載のH鎖を含んでなるヒト化免疫グロブリン、若しくは前記免疫グロブリンの抗原結合フラグメント。
- 最低10−7Mの結合親和性でβアミロイドペプチド(Aβ)に特異的に結合する、請求項114に記載の免疫グロブリン若しくは抗原結合フラグメント。
- 最低10−8Mの結合親和性でβアミロイドペプチド(Aβ)に特異的に結合する、請求項114に記載の免疫グロブリン若しくは抗原結合フラグメント。
- 最低10−9Mの結合親和性でβアミロイドペプチド(Aβ)に特異的に結合する、請求項114に記載の免疫グロブリン若しくは抗原結合フラグメント。
- H鎖のアイソタイプがγ1である、請求項114に記載の免疫グロブリン若しくは抗原結合フラグメント。
- 凝集したβアミロイドペプチド(Aβ)に結合する、請求項114に記載の免疫グロブリン若しくは抗原結合フラグメント。
- βアミロイドペプチド(Aβ)の食作用を媒介する、請求項114に記載の免疫グロブリン若しくは抗原結合フラグメント。
- 被験体の血液脳関門を横断する、請求項114に記載の免疫グロブリン若しくは抗原結合フラグメント。
- 被験体のβアミロイドペプチド(Aβ)斑負荷を低下させる、請求項114に記載の免疫グロブリン若しくは抗原結合フラグメント。
- (a)ヒト化L鎖が、配列番号14と呼称されるマウス10D5免疫グロブリンL鎖可変ドメインの対応する相補性決定領域からのアミノ酸配列を有する3個の相補性決定領域(CDR1、CDR2およびCDR3)、ならびにヒトL鎖可変領域枠組み配列からの可変領域枠組みを含んでなるが、但し、カノニカル残基、バーニア残基、充填残基および希少残基よりなる群から選択される最低1個の枠組み残基が、マウス10D5免疫グロブリンL鎖可変領域枠組みの同等な位置に存在する同一のアミノ酸残基により占有され;かつ(b)ヒト化H鎖が、配列番号16と呼称されるマウス10D5免疫グロブリンH鎖可変ドメインの対応する相補性決定領域からのアミノ酸配列を有する3個の相補性決定領域(CDR1、CDR2およびCDR3)、ならびにヒトH鎖可変領域枠組み配列からの可変領域枠組みを含んでなるが、但し、カノニカル残基、バーニア残基、充填残基および希少残基よりなる第二の群から選択される最低1個の枠組み残基が、マウス10D5免疫グロブリンH鎖可変領域枠組みの同等な位置に存在する同一のアミノ酸残基により占有され;最低10−7Mの結合親和性でβアミロイドペプチド(「Aβ」)に特異的に結合し、10D5免疫グロブリンは配列番号14と呼称される可変ドメインをもつL鎖および配列番号16と呼称される可変ドメインをもつH鎖を有する、
ヒト化H鎖およびヒト化L鎖を含んでなるヒト化免疫グロブリン。 - ヒトL鎖可変領域枠組みがκ L鎖可変領域からである、請求項123に記載のヒト化免疫グロブリン。
- ヒトH鎖可変領域枠組みがIgG1 H鎖可変領域からである、請求項123に記載のヒト化免疫グロブリン。
- L鎖可変領域枠組みが、10D5免疫グロブリンのL鎖配列との最低70%の配列の同一性を有するヒト免疫グロブリンL鎖からである、請求項123に記載のヒト化免疫グロブリン。
- H鎖可変領域枠組みが、10D5免疫グロブリンのH鎖配列との最低70%の配列の同一性を有するヒト免疫グロブリンH鎖からである、請求項123に記載のヒト化免疫グロブリン。
- ヒト化L鎖が、マウス10D5 H鎖の対応する相補性決定領域に同一である相補性決定領域を含んでなり、かつ、ヒト化H鎖は、マウス10D5 H鎖の対応する相補性決定領域に同一である相補性決定領域を含んでなる、請求項123に記載のヒト化免疫グロブリン。
- 配列番号14として示される10D5の可変L鎖配列の相補性決定領域(CDR1、CDR2およびCDR3)を含んでなるヒト化抗体。
- 配列番号16として示される10D5の可変H鎖配列の相補性決定領域(CDR1、
CDR2およびCDR3)を含んでなるヒト化抗体。 - マウス10D5抗体からの相補性決定領域(CDR)に対応するCDRを含んでなる可変領域を含んでなる、βアミロイドペプチド(Aβ)に特異的に結合するヒト化抗体若しくはその抗原結合フラグメント。
- 実質的に配列番号14若しくは配列番号16に示されるところの可変領域配列、およびヒト免疫グロブリンからの定常領域配列を含んでなるキメラ免疫グロブリン。
- 請求項114−131のいずれか1つに記載のヒト化免疫グロブリンの有効投薬量を患者に投与することを含んでなる、患者におけるアミロイド原性疾患の予防若しくは治療方法。
- 請求項114−131のいずれか1つに記載のヒト化免疫グロブリンの有効投薬量を患者に投与することを含んでなる、患者におけるアルツハイマー病の予防若しくは治療方法。
- ヒト化免疫グロブリンの有効投薬量が1mg/kg体重である、請求項134に記載の方法。
- ヒト化免疫グロブリンの有効投薬量が10mg/kg体重である、請求項134に記載の方法。
- 請求項114−131のいずれか1つに記載の免疫グロブリンおよび製薬学的担体を含んでなる製薬学的組成物。
- 配列番号2のアミノ酸24−39、配列番号2のアミノ酸55−61および配列番号2のアミノ酸94−102よりなる群から選択される配列番号2のフラグメントを含んでなる単離されたポリペプチド。
- 配列番号2のアミノ酸24−39、配列番号2のアミノ酸55−61および配列番号2のアミノ酸94−102を含んでなる単離されたポリペプチド。
- 配列番号4のアミノ酸31−37、配列番号4のアミノ酸52−67および配列番号4のアミノ酸100−112よりなる群から選択される配列番号4のフラグメントを含んでなる単離されたポリペプチド。
- 配列番号4のアミノ酸31−37、配列番号4のアミノ酸52−67および配列番号4のアミノ酸100−112を含んでなる単離されたポリペプチド。
- 配列番号14のアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチド。
- 配列番号16のアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチド。
- 最低1個の保存的アミノ酸置換を含んでなり、最低10−7Mの結合親和性でβアミロイドペプチド(Aβ)を特異的に結合する能力を保持する、配列番号14のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドのバリアント。
- 最低1個の保存的アミノ酸置換を含んでなり、最低10−7Mの結合親和性でのβアミロイドペプチド(Aβ)への特異的結合に導く能力を保持する、配列番号16のアミノ酸
配列を含んでなるポリペプチドのバリアント。 - 配列番号14のアミノ酸配列の残基1−112を含んでなるか、若しくは配列番号16のアミノ酸配列の残基1−123を含んでなる単離されたポリペプチド。
- 請求項84、86−88、92、94および96−98のいずれか1つに記載のL鎖をコードする単離された核酸分子。
- 請求項85、89−91、93および99−101のいずれか1つに記載のH鎖をコードする単離された核酸分子。
- 請求項139−146のいずれか1つに記載のポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
- 請求項114−132のいずれか1つに記載の免疫グロブリンをコードする単離された核酸分子。
- 配列番号13若しくは15のヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子。
- 請求項147−151のいずれかに記載の核酸分子を含んでなるベクター。
- 請求項147−151のいずれかに記載の核酸分子を含んでなる宿主細胞。
- 請求項153に記載の宿主細胞を抗体若しくはそのフラグメントが産生されるような条件下で培養すること、および前記抗体を該宿主細胞若しくは培養物から単離することを含んでなる、抗体若しくはそのフラグメントの製造方法。
- 抗体若しくはそのフラグメントをコードする核酸分子を発現する宿主細胞を前記抗体若しくはフラグメントが産生されるような条件下で培養すること、および前記抗体を該宿主細胞若しくは培養物から単離することを含んでなり、前記抗体若しくはフラグメントが配列番号2のアミノ酸24−39、配列番号2のアミノ酸55−61および配列番号2のアミノ酸94−102を含んでなる、抗体若しくはそのフラグメントの製造方法。
- 抗体若しくはそのフラグメントをコードする核酸分子を発現する宿主細胞を前記抗体若しくはフラグメントが産生されるような条件下で培養すること、および前記抗体を該宿主細胞若しくは培養物から単離することを含んでなり、前記抗体若しくはフラグメントが配列番号4のアミノ酸31−37、配列番号4のアミノ酸52−67および配列番号4のアミノ酸100−112を含んでなる、抗体若しくはそのフラグメントの製造方法。
- 解明された免疫グロブリンの構造に基づいて10Dの5可変領域の三次元構造をモデル化すること、および10D5免疫グロブリン可変領域のコンホメーション若しくは機能に影響を及ぼすことが可能な残基について前記モデルを解析して、その結果置換の影響を受けやすい残基を同定することを含んでなる、ヒト化10D5免疫グロブリン可変枠組み領域中の置換の影響を受けやすい残基の同定方法。
- 10D5免疫グロブリン、10D5免疫グロブリン鎖若しくはそれらのドメインの三次元像の作製における配列番号14若しくは配列番号16として示される可変領域配列またはそれらのいずれかの部分の使用。
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