EA028427B1 - АНТИТЕЛО, СВЯЗЫВАЮЩЕЕСЯ С Aβ-ПЕПТИДАМИ ИЛИ ИХ ВАРИАНТАМИ, КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ЭТО АНТИТЕЛО, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ - Google Patents

Abstract

В изобретении рассмотрены новые диагностические анализы, предназначенные для диагностирования амилоидоза, в частности болезни Альцгеймера, и родственных состояний. В частности, рассмотрены моноклональные антитела и анализ на основе антител.

Description

Настоящее изобретение относится к новым диагностическим анализам, предназначенным для диагностирования амилоидоза, т.е. группы заболеваний и патологий, ассоциированных с амилоидным белком, таких как болезнь Альцгеймера и родственные состояния. В частности, предложен анализ на основе антител.

Амилоидоз представляет собой не отдельное заболевание, а скорее группу разнообразных прогрессирующих болезненных процессов, которые характеризуются внеклеточными отложениями в ткани воскообразного крахмалоподобного белка, называемого амилоидом, который накапливается в одном или нескольких органах или системах организма. После образования амилоидных отложений они начинают препятствовать нормальному функционированию органа или системы организма. Известно по меньшей мере 15 различных типов амилоидоза. Основными формами являются первичный амилоидоз, не имеющий известных предвестников (состояний-предшественников) заболевания, вторичный амилоидоз, сопровождающий определенное другое состояние, и наследственный амилоидоз. Вторичный амилоидоз возникает у людей, страдающих хроническим инфекционным или воспалительным заболеванием, таким как туберкулез, бактериальная инфекция, которую называют семейной средиземноморской лихорадкой, костные инфекционные заболевания (остеомиелит), ревматоидный артрит, воспаление тонкого кишечника (гранулематозный илеит), болезнь Ходжкина и проказа.

Амилоидные отложения включают такой компонент, как амилоид Р (пентагональный) (АР), гликопротеин, родственный амилоиду Р сыворотки здорового индивидуума (ЗАР), и сульфатированные гликозаминогликаны (ОАО), комплекс углеводов соединительной ткани. Фибриллы амилоидного белка, на долю которых приходится примерно 90% амилоидного материла, содержат один из нескольких различных типов белков. Эти белки обладают способностью складываться в фибриллы, имеющие так называемую бета-складчатую конформацию, уникальную конфигурацию белка, при которой сайты связывания становятся доступными для красителя конго красного, что приводит к уникальным особенностям окрашивания амилоидного белка.

Многие связанные с возрастом заболевания обусловлены или ассоциированы с амилоидоподобными белками и характеризуются, в частности, образованием внеклеточных отложений амилоида или амилоидоподобного материала, которые участвуют в патогенезе, а также в развитии заболевания. Такие заболевания включают (но, не ограничиваясь только ими) неврологические нарушения, такие как легкое (умеренное) когнитивное нарушение (МС1), болезнь Альцгеймера (АО), например, типа спорадической формы болезни Альцгеймера (8АО) или семейных деменций альцгеймеровского типа (РАО), таких как семейная британская деменция (ТВО) и семейная датская деменция (ТОО), нейродегенерация, связанная с синдромом Дауна, деменция, связанная с тельцами Леви, наследственная церебральная геморрагия с амилоидозом (голландского типа); комплекс деменций Гуама-Паркинсона. Другие заболевания, которые обусловлены или ассоциированы с амилоидоподобными белками, представляют собой прогрессирующий надъядерный паралич, рассеянный склероз; болезнь Крейцфельдта-Якоба, болезнь Паркинсона, связанную с ВИЧ деменцию, АЬ§ (амиотрофический боковой склероз), диабет взрослых; старческий сердечный амилоидоз; эндокринные опухоли и другие заболевания, включая дегенерацию желтого пятна.

Хотя патогенез этих заболеваний может быть различным, характерные для них отложения часто содержат многие сходные молекулярные компоненты. В значительной степени это может относиться к местной активации провоспалительных путей, приводя тем самым к конкурентному отложению компонентов активированного комплемента, реактантов острой фазы, иммуномодуляторов и других воспалительных медиаторов (МсОеег и др., 1994).

В настоящее время накоплены данные, демонстрирующие участие модифицированных на Ν-конце вариантов Ав-пептидов в развитии болезни Альцгеймера. С помощью целевых биопсий продемонстрировано присутствие Ав 1-40 и Ав 1-42 не только в головном мозге пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера, но также и в старческих бляшках, не пораженных заболеванием индивидуумов. Однако укороченный на Ν-конце и модифицированный с помощью пиро-О1и Ав Ν3ρΕ-40Μ.β Ν3ρΕ-42 практически исключительно связан с бляшками страдающих болезнью Альцгеймера пациентов, что позволяет выбрать этот вариант Ав в качестве пригодного диагностического маркера и потенциальной мишени при разработке лекарственных средств.

В настоящее время несколько производителей поставляет в продажу наборы для ЕЫ§А, которые позволяют выявлять Ав 1-40/1-42 и Ав Ν3ρΕ-40Μβ Ν3ρΕ-42 при их присутствии в концентрациях, находящихся в диапазоне низких пикограммовых (пг) значений.

Морфологическим отличием головного мозга пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера (АО), является присутствие нейрофибриллярных сплетений и отложений Ав-пептидов в неокортикальных структурах головного мозга (8е1кое 0.1. и §сйеик ϋ., АОкеипегА Фзеазе: то1еси1аг ип6ет81ап6шд ριτάΚΐδ ату1о1б-Ьа8е6 ΐЬе^аρеиΐ^С8. Аппи. Кеу. РЬагтасо1. Тохюо1. 43, 2003, с. 545-584). Ав-пептиды высвобождаются из амилоидного белка-предшественника (АРР) после последовательного расщепления в- и γсекретазой. Расщепление γ-секретазой приводит к образованию пептидов Ав 1-40 и Ав 1-42, которые отличаются их С-концами и характеризуются различной способностью к агрегации, образованию фибрилл и нейротоксичностью (8Ып Ρ.\ν. и др., Ату1оЛ Ьеΐа-ρ^оΐе^п (АЬе1а) 1-40 Ьи1 по! АЬе(а 1-42 сопйтЬ- 1 028427

Шез !о !йе е\рептеп1а1 Готтабоп оГ Акйе1тег б1зеазе ату1о1б бЪб1з ίη га! ЪгаЛ. ί. Ыеиго8С1. 17, 1997, с. 8187-8193; 1уа!зиЪо Т. и др., νίδηαΐί/αΐίοη оГ АЪе!а 42(43) апб АЪе!а 40 ίη зепйе р1адиез \\йй епб-зресЛс АЪе1а топос1опа1з: еу1бепсе !йа! ап 1тба11у берозйеб зретез 1з АЪе!а 42(43). Ыеигоп 13, 1994, с. 45-53; 1уа!зиЪо Т., Мапп Ό.Μ., Обака А., διιζιιΛ N. и Шага Υ., Ату1о1б Ъе1а рго!еЛ (АЪе!а) берозЛоп: АЪе!а 42(43) ргесебез АЪе1а 40 Л Эоуп зупбготе. Апп. №игок 37, 1995, с. 294-299; Нагбу кА. и Н1дд1п8 О.А., Акйе1тег'з б1зеазе: !йе ату1о1б сазсабе йуро!йез1з. 8с1епсе 256, 1992, с. 184-185; КоЪпег δ., ИеЪегйат и., 8сЬбеЪ8 К., Реге/-Ро1о кК. и В1д1 V., Тйе геди1абоп оГ атуЫб ргесигзог рго!еЛ те!аЪойзт Ъу сйойпегдю тесйатзтз апб пеигоборЫп гесер!ог з1дпайпд. Ргод. №игоЪю1. 56, 51998, с. 41-569). Помимо имеющих вариации С-концов, широко распространены модифицированные на Ν-конце Αβ-пептиды (8а1бо Т.С. и др., Пот1пап1 апб бШетепба1 берозЛоп оГ б1збпс! Ъе1а-ату1о1б рерббе зрес1ез, А Ъе1а Ν3φΕ), Л зепбе рккщез. №итоп 14, 1995, с. 457-466; Киззо С. и др., Ртезей1Л-1 ти!абопз Л Акйе1тег'з б1зеазе. №Циге 405, 2000, с. 531-532; 8а1бо Т.С., Υатаο Н., 1уа!зиЪо Т. и Кауазйта, δ. АтЛо- апб сатЪо\у1-1егтша1 йе!етодепейу оГ Ъе1а-ату1о1б рерббез берозйеб Л йитап ЪгаЛ. №игозск Ьей. 215, 1996, с. 173-176). Вероятно, основная часть Αβ-пептидов подвергается Ν-концевому укорочению, затрагивающему две аминокислоты, в результате чего становится доступным глутаматный остаток, который затем циклизуется с формированием пироглутамата (рЕ), что приводит к образованию пептидов Л(/3(рЕ)-42 (Ьа1бо Т.С. и др., Пот1пап1 апб бШетепба1 берозЛоп оГ б1збпс! Ъе1а-ашу1о1б рерббе зретез, А Ъе1а Ν3φΕ), Л зепйе рккщез. №итоп 14, 1995, с. 457-466; δа^бο Т.С., Υатаο Н., 1уа!зиЪо Т. и Кауазйта, δ. Атто- апб сагЪо\у1-!егтЛа1 йе!егодепейу оГ Ъе1а-ату1о1б рерббез берозйеб Л йитап Ъгаш. №игозт. Ьеб. 215, 1996, с. 173-176). В альтернативном варианте рЕ может формироваться в результате β'-расщепления с помощью ВАСЕ1, что приводит к образованию Αβ М1(рЕ)-42 (№з1ипб, 1. и др., Ке1абуе аЪипбапсе оГ Ά1ζйеипег А Ъе!а ату1о1б рерббе уабайз Л Акйе1тег б1зеазе апб погта1 адЛд. Ргос. №Л. Асаб. δ^. и. δ. А. 91, 1994, с. 8378-8382; Ьш К. и др., Сйа^асΐебζабοη оГ АЪе!а1 1-40/42 рерббе берозЛоп Л АййеЛгег'з б1зеазе апб уоипд йоуп'з зупбготе ЪгаЛз: шрбсабоп оГ ^!егтЛа11у бипса1еб АЪе!а зретез Л 1йе ра!йодепез1з оГ АййеЛгег'з б1зеазе. Ас1а №игора!йо1. 112, 2006, с. 163-174). В частности, установлено, что Αβ Ν3φΕ)-42 является основным компонентом отложений Αβ при спорадической и семейной болезни Альцгеймера (РАО) (Ьа1бо Т.С. и др., ОотЛап! апб бШетепба1 берозЛоп оГ б1збпс! Ъе1а-ату1о1б рерббе зретез, А Ъе1а Ν3φΕ), Л зет1е р1адиез. №игоп 14, 1995, с. 457-466; Миауайе Ь. и др., АтЛо-!егтЛа11у 1типса1еб АЪе!а рерббе зретез аге !йе таЛ сотропей оГ сойоп уоо1 рккщез. Вюсйет1збу 44, 2005, с. 10810-10821).

Пептиды Αβ И3рЕ-42 существует совместно с пептидами Αβ 1-40/1-42 ^аЛо Т.С. и др., ОотЛап! апб б1ГГетепба1 берозЛоп оГ б1збпс! Ъе1а-ату1оЛ рерббе зретез, АЪе1а ШрЕ, Л зей1е р1адиез. №игоп 14, 1995, с. 457-466; δа^бο Т.С., Υатаο Н., 1уа!зиЪо Т. и Кауазйта δ., АтЛо- апб сагЪо\у1-1егтЛа1 йе!егодепейу оГ Ъе1а-ату1оЛ рерббез берозйеб Л йитап ЪгаЛ №итозт. Ьей. 215, 1996, с. 173-176) и, как установлено в ряде исследований, они могут играть основную роль в патогенезе АО. Например, продемонстрирована нейротоксичность пептидов Αβ ШрЕ-42 (Киззо С. и др., Рутод1йата1е-тобЛеб ату1оЛ Ъе!арерббез-АЪе!а№(рЕ)-збопд1у аГГес! сийигеб пеигоп апб азбосу!е зшу1уак 1. №итосйет. 82, 2002, с. 14801489) и установлен тот факт, что рЕ-модификация укороченных на Ν-конце Αβ-пептидов обусловливает устойчивость к расщеплению большинством аминопептидаз, а также к Αβ-расщепляющими эндопептидазами (Киззо С. и др., Рутод1и1ата1е-тобЛеб ату1оЛ Ъе1а-рерббез-АЪе!а№(рЕ)-з!гопд1у аГГес! сийигеб пеигоп апб аз!госу!е зигу1уа1. 1. №итосйет. 82, 2002, с. 1480-1489; δа^бο Т.С. Акйешет'з б1зеазе аз рго!ео1убс б1зотбетз: апаЪобзт апб сайЪойзт оГ Ъе!а-ату1оЛ. №игоЪю1. АдЛд 19, 1998, с. 69-75). Циклизация глутаминовой кислоты с образованием рЕ приводит к потере Ν-концевого заряда, что обусловливает усиленную агрегацию Αβ ШрЕ по сравнению с немодифицированными Αβ-пептидами (Не и Ваггоу С.к, Тйе АЪе!а 3-ругод1и!ату1 апб 11-ругод1и!ату1 рерббез Гоипб Л зепйе рккще йауе дгеа!ег Ъе!а-зйее! ГогтЛд апб аддгедабоп ргорепзЛез Л уйто !йап Ги11-1епд!й А Ъе!а. Вюсйет1збу 38, 1999, с. 10871-10877; δΟΛΛίβ δ. и др., Оп !йе зеебЛд апб οйдοтебζабοη оГ рС1и-ату1о1б рерббез (Л уйто). Вюсйет1збу 45, 2006, с. 12393-12399). Таким образом, снижение образования Αβ Н3рЕ-42 должно дестабилизировать пептиды, делая их более чувствительными к расщеплению, и это, в свою очередь, предупреждает формирование более высокомолекулярных агрегатов Αβ и повышает продолжительность существования (выживаемость) нейронов.

Однако уже в течение продолжительного времени не удается выяснить, как происходит рЕмодификация Αβ-пептидов. В настоящее время установлено, что глутаминилциклаза (ОС) обладает способностью катализировать образование Αβ ШрЕ-42 в мягких кислотных условиях и что специфические ингибиторы ОС предупреждают формирование Αβ Н3рЕ-42 Л уйто (ЬсйЛпд δ., НоГГтапп Т., Мапйай δ., НоГГтапп М. и Оетйй Н.-Ц., О1йатЛу1 сус1азез ипГо1б д1и!ату1 сус1азе асбуйу ипбег тйб атб сопбЛопз. РΕΒδ Ьей. 563, 2004, с. 191-196; Сутз Н. и др., ЛйЪЛоп оГ д1йатЛу1 сус1азе а1!егз ругод1и!ата!е Гогтабоп Л таттайап се11з. Вюсйт. Вюрйуз. Ас!а 1764, 2006, с. 1618-1625).

Деменция, связанная с тельцами Леви (ЬВО), представляет собой нейродегенеративное нарушение, которое может возникать у индивидуумов старше 65 лет, и которое, как правило, вызывает симптомы когнитивного (мыслительного) нарушения и патологические изменения поведения. Симптомы могут включать когнитивное нарушение, неврологические признаки, нарушение сна и неспособность к само- 2 028427 стоятельным действиям. Когнитивное нарушение в большинстве случаев является характерной особенностью Ь-ВЭ. У пациентов происходят повторяющиеся случаи замешательства, которые прогрессивно усугубляются. Флуктуации когнитивной способности часто ассоциированы со сдвигом уровня внимания и бдительности. Когнитивное нарушение и флуктуации мыслительной способности могут варьироваться в течение минут, часов или дней. Тельца Леви образуются из фосфорилированных и нефосфорилированных нейрофиламентных белков; они содержат синаптический белок альфа-синуклеин, а также убикитин, который участвует в элиминации поврежденных или аномальных белков. Помимо телец Леви могут присутствовать также нейриты Леви, представляющие собой тельца включения, участвующие в клеточных процессах в нервных клетках. Амилоидные бляшки могут образовываться в головном мозге пациентов, пораженных ЬВО, однако, как правило, в меньшем количестве, чем у пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера. Наличие нейрофибриллярных сплетений, представляющих собой еще один микропатологический признак АО, не является главной отличительной особенностью ЬВО, но они часто присутствуют в дополнение к амилоидным бляшкам.

Амиотрофический боковой склероз (АЬ§) характеризуется дегенерацией верхних и нижних двигательных нейронов. У некоторых пациентов с АЬ§ может иметь место деменция или афазия (АЬ§-0). Деменция наиболее часто представляет собой лобно-височную деменцию (ΡΤΟ), и во многих таких случаях имеются убикитин-положительные, тау-отрицательные включения в нейронах зубчатой извилины медиальной и нижней поверхности полушария головного мозга и в поверхностных слоях лобной и височной долей головного мозга.

Миозит, связанный с тельцами включения (1ВМ), представляет собой калечащее заболевание, как правило, обнаруживаемое у людей старше 50 лет, при котором возникает воспаление мышечных волокон, и они начинают атрофироваться, но при этом головной мозг не нарушается, и пациенты полностью сохраняют свой интеллект. Обнаружено, что уровень двух ферментов, участвующих в производстве белка амилоида-β, повышен в мышечных клетках пациентов, страдающих этим часто встречающимся у пожилых людей прогрессирующим мышечным заболеванием, при этом повышается также уровень амилоида-β.

Еще одним заболеванием, обусловленным или ассоциированным с накоплением и отложением амилоидоподобного белка, является дегенерация желтого пятна. Дегенерация желтого пятна представляет собой обычное заболевание глаза, которое вызывает деградацию желтого пятна, т.е. центральной области сетчатки (тонкий слой ткани на задней части глаза, откуда светочувствительные клетки посылают зрительные сигналы в головной мозг). Желтое пятно опосредует острое, четкое, неискаженное зрение. Повреждение желтого пятна приводит к развитию слепых пятен и затуманенному или нарушенному зрению. Возрастная дегенерация желтого пятна (АМО) является основной причиной ухудшения зрения в Соединенных Штатах, и у людей старше 65 лет она представляет собой основную причину медицински подтвержденной слепоты среди лиц кавказской расы. Примерно 1,8 млн американцев в возрасте 40 лет и старше имеют развитую АМО, а еще у 7,3 млн людей с умеренной АМО имеется значительный риск потери зрения. По оценкам правительства к 2020 г. 2,9 млн людей будут иметь развитую АМО. Жертвы АМО часто бывают удивлены и расстроены, когда узнают, как мало известно о причинах и методах лечения этого состояния слепоты.

Существует две формы дегенерации желтого пятна: сухая дегенерация желтого пятна и влажная дегенерация желтого пятна. Сухая форма, при которой клетки желтого пятна медленно начинают разрушаться, диагностирована в 85% случаев дегенерации желтого пятна. Как правило, сухая АМО поражает оба глаза, хотя при этом один глаз может потерять зрение, а второй глаз может оставаться непораженным. Обычно ранними признаками сухой АМО являются друзы, которые представляют собой отложения желтого тела под сетчаткой. Риск возникновения развитой сухой АМО или влажной АМО повышается с увеличением количества или размера друз. Сухая АМО может прогрессировать и вызывать потерю зрения, не превращаясь во влажную форму заболевания; однако на ранней стадии сухая АМО может внезапно переходить во влажную форму.

Хотя на долю влажной формы приходится только 15% случаев АМО, в 90% из них она приводит к слепоте, и ее рассматривают как развитую АМО (не существует ранней или промежуточной стадии влажной АМО). Влажной АМО всегда предшествует сухая форма заболевания. При прогрессировании сухой формы у некоторых людей начинается патологический рост кровеносных сосудов позади желтого пятна. Эти сосуды являются очень хрупкими, и из них просачивается жидкость и кровь (отсюда название влажная дегенерация желтого пятна), приводя к быстрому повреждению желтого пятна.

Сухая форма АМО первоначально часто вызывает слегка затуманенное зрение. Затем, прежде всего, центральная часть зрительного поля может становиться затуманенной, и эта область увеличивается в размерах по мере прогрессирования заболевания. Если поражен только один глаз, то симптомы могут оставаться незамеченными. В случае влажной АМО прямые линии могут представляться волнистыми и при этом может быстро наступать потеря центрального зрения.

Для установления диагноза дегенерации желтого пятна, как правило, проводят исследование расширенного глаза (зрачка), тест на остроту зрения и обследование задней стенки глаза с использованием

- 3 028427 процедуры, называемой фундоскопией, помогающей установлению диагноза ΆΜΌ, и, если имеется предположение о наличии влажной ΛΜΌ, то может быть проведена ангиография с использованием флуоресцеина. В настоящее время отсутствуют средства лечения, позволяющие предупреждать потерю зрения, если сухая ΛΜΌ достигла развитой стадии. Однако применение определенной композиции, содержащей высокую дозу антиоксидантов и цинка, может замедлять или предупреждать прогрессирование промежуточной стадии ΛΜΌ, приводящее к переходу в развитую стадию. Применение Масидеи® (инъекция пегаптаниба натрия), лазерной фотокоагуляции и фотодинамической терапии позволяет контролировать патологический рост кровеносных сосудов и кровоизлияние в желтом пятне, что является полезным для определенной группы людей с влажной ΆΜΌ; однако зрение, если оно уже потеряно, не может быть восстановлено с помощью таких методов. Если зрение потеряно, то существуют средства для слабого зрения, которые могут помогать улучшать качество жизни.

Одним из самых ранних признаков связанной с возрастом дегенерации желтого пятна (ΛΜΌ) является накопление внеклеточных отложений, известных как друзы, в области, находящейся между базальным слоем пигментированного эпителия сетчатки (КРЕ) и базальной оболочкой Бруха (ВМ). Результаты современных исследований, проведенных Апбегкоп с соавторами, подтвердили, что друзы содержат амилоид-бета (Ехрег1теп!а1 Еуе КекеагсЬ 78, 2004, с. 243-256).

Задача, положенная в основу настоящего изобретения, заключается в создании высокочувствительного и одновременно робастного метода определения, который позволяет осуществлять количественное определение присутствия вариантов Αβ, прежде всего пептидов ρΟΙιι-Λβ. в биологических образцах, например, образцах жидкости или сыворотки, предпочтительно в образцах сыворотки. Это является огромной проблемой, учитывая низкий уровень присутствия Αβ-пептидов в крови. Однако наличие такого метода определения явилось бы предпосылкой для изучения эффективности низкомолекулярных ингибиторов в программах скрининга лекарственных средств.

В настоящем изобретении предложены новые способы и композиции, содержащие высокоспецифические и высокоэффективные антитела, включая химерные антитела и их фрагменты, включая частично или полностью гуманизированные антитела и их фрагменты, которые обладают способностью специфически распознавать и связываться со специфическими эпитопами широкого разнообразия антигенов βамилоида, в частности с пептидами рОк-Αβ, которые могут презентоваться антителу в мономерной, димерной, тримерной и т.д. или полимерной форме, в форме агрегата, волокон, филаментов или в конденсированной форме бляшки. Антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, наиболее предпочтительно применять для диагностики амилоидоза, группы заболеваний и нарушений, ассоциированных с образованием амилоидных бляшек, включая вторичный амилоидоз и связанный с возрастом амилоидоз, включая (но, не ограничиваясь только ими) неврологические нарушения, такие как болезнь Альцгеймера (ΑΌ), деменция, связанная с тельцами Леви, синдром Дауна, наследственная церебральная геморрагия с амилоидозом (голландского типа); комплекс деменции Гуама-Паркинсона, а также другие заболевания, которые обусловлены или ассоциированы с амилоидоподобными белками, такие как прогрессирующий надъядерный паралич, рассеянный склероз; болезнь Крейцфельдта-Якоба, наследственная церебральная геморрагия с амилоидозом голландского типа, болезнь Паркинсона, связанная с ВИЧ деменция, АЬ§ (амиотрофический боковой склероз), диабет взрослых; старческий сердечный амилоидоз; эндокринные опухоли и другие заболевания, включая дегенерацию желтого пятна.

Для удовлетворения всем указанным выше требованиям наиболее предпочтительным мог бы явиться метод на основе ЕЬТЗА. Решение задачи при создании изобретения начинали с применения ЕЬТЗА для Αβ ЫЗрЕ (Αβ ЫЗрЕ-ЕЫЗА), поскольку для этого варианта Αβ система ЕЬ1§А уже поступает в продажу (набор для анализа Нитап Ату1оЛ β (ЫЗрЕ), фирма ШЬ, код № 27716), которую можно применять в качестве эталона и внутреннего контроля качества. Для захвата пептида Αβ ЫЗрЕ-40 применяли Ι^Κχ40) ЕЬ1§А (Н§) от фирмы ТОС (фирма ТЬе ОепеИск Сотрапу, 1пс., ХУадЫга^е 23, 8952 Шлирен, кантон Цюрих, Швейцария), что должно было облегчить и ускорить процесс разработки.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к антителам или их вариантам, которые отличаются способностью связываться с высокой аффинностью с Αβ-пептидом. В контексте настоящего изобретения высокая аффинность означает, что значение К_с составляет 10^-7 М или менее, предпочтительно значение Кс составляет 10^-8 М или менее и еще более предпочтительно значение Кс составляет 10^-9-10^-12 М.

В частности, антитело предпочтительно представляет собой моноклональное антитело и его выбирают из следующей группы:

Αβ 5-5-6;

Αβ 6-1-6;

Αβ 17-4-3;

Αβ 24-2-3.

Αнтитело, предлагаемое в настоящем изобретении, наиболее целесообразно применять в диагностическом способе выявления амилоидоза, в частности болезни Αльцгеймера.

- 4 028427

Описание чертежей

На чертежах показано:

на фиг. 1А - выявление амилоида β Ν3ρΕ-40 в концентрации 10 нг/мл с использованием возрастающих концентраций антитела к рС1и-б1бб (клон 12-1); 1Б - определение наиболее высокой концентрации антитела к рС1и-б1бб (клон 12-1), необходимой для выявления амилоида β Ν3ρΕ-40 в концентрации 10 нг/мл;

на фиг. 2 - результаты, полученные с помощью анализа методом дот-блоттинга, супернатантов индивидуальных 1§О-продуцирующих клонов культуры клеток гибридомы;

на фиг. 3 - результаты, полученные с помощью Рер8ро1-анализа, клонов клеток гибридомы рОшб1бб и антитела фирмы 1ВЬ к Αβ И3рЕ;

на фиг. 4 - результаты, полученные с помощью 12% ДСН-ПААГ, антитела к рО1и-б1бб (20 мкг) и супернатантов культуры клеток гибридомы;

на фиг. 5 - результаты, полученные с помощью В1аеоте-анализа, супернатантов культуры клеток гибридомы. Графически проиллюстрированы наложение установленных процессов связывания;

на фиг. б - сенсограммы, описывающие взаимодействие антитела к Αβ И3рЕ (клон б-1-б) с АврЕЗ40;

на фиг. 7 - сенсограммы, описывающие взаимодействие антитела к Αβ ИЗрЕ (клон 24-2-3) с ΑβрЕ340;

на фиг. 8 - результаты, полученные с помощью И3рЕ-ЕЬ1§А, для клона б-1-б, стандартная кривая для ΑβрЕ3-40;

на фиг. 9 - сенсограммы, характеризующие антитело к И3рЕ (клон б-1-б);

на фиг. 10 - результаты количественной оценки ΑβрЕ3-42 с помощью метода нейтрализации с использованием разведения 1:20 в буфере для иммуноферментного анализа (Е1А-буфер), титрование рН с помощью 8б0 мкл 3,5 М Трис;

на фиг. 11 - окрашенные срезы головного мозга пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера (АО): А - головной мозг пациента, страдающего спорадической АО (§АО), окрашенный антителом к Αβ бЕ10, распознающим общий Αβ; Б - головной мозг пациента, страдающего спорадической АО (§АО), окрашенный антителом к И3рЕ (клон 24-2-3), распознающим ΑβрЕ3-х; В - головной мозг пациента, страдающего семейной АО (РАО), окрашенный антителом к И3рЕ (клон 24-2-3), распознающим ΑβрЕ3-х.

Подробное описание изобретения

Определения.

Понятие антитело в настоящем описании используется в наиболее широком смысле и, в частности, относится к моноклональным антителам, поликлональным антителам, мультиспецифическим антителам (например, биспецифическим антителам), образованным по меньшей мере из двух интактных антител, и фрагментам антител, в том случае, если они обладают требуемой биологической активностью. Антитела могут представлять собой, например, 1дМ, 1дО (например, 1§О1, 1§О2, 1§О3 или 1§О4), 1§О, 1дА или 1дЕ. Однако предпочтительно антитело не представляет собой антитело в виде 1дМ.

Понятие фрагменты антитела относится к части интактного антитела, как правило, к антигенсвязывающей или вариабельной области интактного антитела.

Примерами фрагментов антител являются РаЬ-, РаЬ'-, Р(аЬ')₂- и Ρν-фрагменты: димерные антитела (диантиатела); одноцепочечные молекулы антител; и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.

Понятие моноклональное антитело в контексте настоящего описания относится к антителу, полученному из популяции практически гомогенных антител, т.е. входящие в популяцию индивидуальные антитела идентичны за исключением возможных встречающихся в естественных условиях мутаций, которые могут присутствовать в небольших количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифическими и представляют собой антитела к одному антигенному сайту. Кроме того, в противоположность препаратам поликлональных антител, которые, как правило, включают различные антитела к различным детерминантам (эпитопам), мишенью каждого моноклонального антитела является только одна детерминанта антигена. Помимо их специфичности преимуществом моноклональных антител часто является тот факт, что их синтезируют с помощью культуры гибридомы, незагрязненной другими иммуноглобулинами. Прилагательное моноклональное свидетельствует о том, что антитело получено из практически гомогенной популяции антител, при этом не предполагается, что оно должно быть получено с помощью какого-либо конкретного метода. Например, моноклональные антитела, которые можно применять согласно настоящему изобретению, можно получать с помощью метода на основе гибридом, впервые описанного КоЫег и др., Иа1ите, 25б, 1975, с. 495, или их можно конструировать хорошо известными методами рекомбинантной ДНК. Моноклональные антитела можно выделять также из фаговых библиотек антител с помощью методик, описанных, например, у С1аск§ои и др., Иа1ите, 352, 1991, с. б24б28 и у Маткк и др., 1. Мо1. Вю1., 222, 1991, с. 581-597.

Моноклональные антитела в контексте настоящего описания включают, в частности, химерные

- 5 028427 антитела (иммуноглобулины), в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям антител, полученным из конкретных видов, или принадлежит к конкретному классу или подклассу антител, а остальной участок цепи(ей) идентичен или гомологичен соответствующим последовательностям антител, полученным из других видов, или принадлежит к другому классу или подклассу антител, включая фрагменты таких антител, в случае, если они обладают требуемой биологической активностью.

Гуманизированные формы антител животных кроме человека (например, мыши) представляют собой химерные иммуноглобулины, иммуноглобулиновые цепи или их фрагменты (такие как Ρν, РаЬ, РаЬ', Р(аЬ')₂, или другие антигенсвязывающие подпоследовательности антител), которые включают минимальную последовательность, полученную из иммуноглобулина животного кроме человека. Основная часть гуманизированных антител представлена человеческими иммуноглобулинами (антителореципиент), в которых остатки из гипервариабельного участка (ΟΌΚ) реципиента заменены остатками из ΟΌΚ антител из других видов кроме человека (антитело-донор), таких как мышь, крыса или кролик, обладающими требуемой специфичностью, аффинностью и потенциалом. В некоторых случаях остатки каркасного участка (РК) Ρν-области человеческого иммуноглобулина заменяют соответствующими остатками антител из других видов кроме человека. Кроме того, гуманизированные антитела могут включать остатки, которые не присутствуют ни в антителе-реципиенте, ни в импортируемых последовательностях ΟΌΚ- или каркасных участков.

Эти модификации осуществляют с целью дополнительного усовершенствования характеристик антитела. В целом гуманизированное антитело должно включать практически полностью по меньшей мере одну, а как правило две, вариабельных области, в которых все или практически все СПК-участки соответствуют ΟΌΚ-участкам указанных иммуноглобулинов других животных кроме человека, а все или практически все РК соответствуют последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело необязательно может включать также по меньшей мере часть константной области (Рс) иммуноглобулина, как правило, человеческого иммуноглобулина. Дополнительные более подробные данные см. у 1оие8 и др., ЫаШге, 321, 1986, с. 522-525; КеюЬтаии и др., Ыа1иге, 332, 1988, с. 323-329 и у Рге81а, Сигг. Ор. 81гис1. ΒίοΙ., 2, 1992, с. 593-596. Гуманизированное антитело включает антитело РптаП/еб™. в котором антигенсвязывающий участок антитела выведен из антитела, полученного путем иммунизации макак представляющим интерес антигеном.

Одноцепочечные Ρν- или δΡν''-фрагменты антител содержат ν_Η- и У[-области антител, причем эти области находятся в одной полипептидной цепи. Как правило, полипептид Ρν содержит также полипептидный линкер между ν_Η- и У[-областями, которые позволяют δΡν образовывать структуру, необходимую для связывания антигена. Обзор литературы, касающийся δΡν, представлен у Р1иск1Ьии в: ТЬе РЬагтасо1оду οί Мопос1опа1 ЛппЬоЫеь т. 113, под ред. КозеиЬигд и Мооге, изд-во 8ргтдег-Уег1ад, Цел Уогк, 1994, с. 269-315.

Понятие димерное антитело относится к небольшим фрагментам антител с двумя антигенсвязывающими центрами, указанные фрагменты содержат вариабельную область тяжелой цепи (νΗ), связанную с вариабельной областью легкой цепи (Уо) в одной и той же полипептидной цепи (ν_Η-Υο). С помощью линкера, который является слишком коротким для того, чтобы могло происходить спаривание между двумя областями на одной и той же цепи, происходит принудительное спаривание областей с комплементарными областями другой цепи и создаются два антигенсвязывающих центра. Димерные антитела более подробно описаны у НоШидег и др. Ргос. №·ιΐ1. Асаб. 8ск И8А, 90, 1993, с. 6444-6448.

Выделенное антитело представляет собой антитело, которое идентифицировано и отделено от и/или выделено из компонента его естественного окружения. Загрязнителями в его естественном окружении являются продукты, которые могут оказывать воздействие при диагностическом или терапевтическом применении антитела, и они могут включать ферменты, гормоны и другие, белковые или небелковые растворенные вещества. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения антитело должно быть очищено до (1) более 95% в пересчете на массу антитела, что определяют методом Лоури, и наиболее предпочтительно более 99 мас.%, до (2) степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков Ν-концевой или внутренней аминокислотной последовательности с помощью секвинатора с вращающейся чашкой или до (3) гомогенного состояния по данным ДСН-ПААГ в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях при окрашивании кумасси бриллиантовым голубым или предпочтительно при окрашивании серебром. К выделенному антителу относится антитело, находящееся ίη δίΐιι в рекомбинантных клетках, если в них не присутствует ни один компонент естественного окружения антитела. Однако, как правило, выделенное антитело должно быть получено с использованием по меньшей мере одной стадии очистки.

В контексте настоящего описания понятия клетка, клеточная линия и клеточная культура используют взаимозаменяемо, и они все включают также потомство. Таким образом, понятие трансформанты и трансформированные клетки включают, прежде всего, клетки, которые являются объектом изобретения, и выведенные из них культуры вне зависимости от количества переносов. Следует понимать также, что все потомство может не является точно идентичным по составу ДНК из-за преднамеренных или случайных мутаций. Под объем изобретения подпадает мутантное потомство, обладающее та- 6 028427 кой же функцией или биологической активностью, которое отобрано в процессе скрининга для исходной трансформированной клетки. Из контекста настоящего описания должны быть очевидны варианты, для которых возможны другие определения.

Понятия полипептид, пептид и белок в контексте настоящего описания применяют взаимозаменяемо, и они означают биологическую молекулу, состоящую из аминокислот, которые сцеплены пептидной связью.

В контексте настоящего описания понятия, употребляемые в единственном числе, могут предусматривать один или несколько, и включать множество, если из контекста не следует иное.

Фраза заболевания и нарушения, которые обусловлены или ассоциированы с амилоидом или амилоидоподобными белками включает (но, не ограничиваясь только ими) заболевания и нарушения, обусловленные присутствием или активностью амилоидоподобных белков в мономерном, фибриллярном или полимерном состоянии или в любом сочетании указанных трех состояний. Такие болезни и нарушения включают (но, не ограничиваясь только ими) амилоидоз, эндокринные опухоли и дегенерацию желтого пятна.

Понятие амилоидоз относится к группе заболеваний и нарушений, ассоциированных с образованием амилоидных бляшек, включая (но, не ограничиваясь только ими) вторичный амилоидоз и связанный с возрастом амилоидоз, включая такие болезни как (но не ограничиваясь только ими) неврологические нарушения, такие как болезнь Альцгеймера (ΑΌ), включая заболевания или состояния, характеризующиеся утратой когнитивной способности к запоминанию, такие, например, как легкое когнитивное нарушение (МС1), спорадическая болезнь Альцгеймера, деменция, связанная с тельцами Леви, синдром Дауна, наследственная церебральная геморрагия с амилоидозом (голландского типа); комплекс деменции Гуама-Паркинсона, семейные деменции альцгеймеровского типа, такие как семейная британская деменция (РВИ) и семейная датская деменция (ΡΌΌ); а также другие заболевания, которые обусловлены или ассоциированы с амилоидоподобными белками, такие как прогрессирующий надъядерный паралич, рассеянный склероз; болезнь Крейцфельдта-Якоба, болезнь Паркинсона, связанная с ВИЧ деменция, АЬ§ (амиотрофический боковой склероз), миозит, вызываемый тельцами включения (1ВМ), диабет взрослых и старческий сердечный амилоидоз; и различные глазные болезни, включая дегенерацию желтого пятна, связанную с друзами оптическую нейропатию и катаракту, связанную с отложениями бета-амилоида.

Понятие амилоид β, Αβ или β-амилоид имеет значение, известное в данной области, и относится к белкам или пептидам амилоида β, белку-предшественнику амилоида β (АРР), а также к их модификациям, фрагментам и любым функциональным эквивалентам. В частности, под понятие амидоид β в контексте настоящего описания подпадает любой фрагмент, полученный протеолитическим расщеплением АРР, но прежде всего фрагменты, которые участвуют или которые ассоциированы с амилоидной патологией, включая (но, не ограничиваясь только ими) Αβι_-38, Αβι_-40, Αβι_-42.

Аминокислотные последовательности этих Αβ-пептидов представлены ниже:

Αβ 1-42 (8ЕО 1Р ΝΟ. 1):

А5р-А1а-О1и-Р11е-Аг8-Н15-А5р-8ег-О1у-Туг-О1и-Уа1-Ндз-Н15-О1п-Еу5-Ьеи-Уа1-Р11еРЬе-А1а-С1и-Азр-Уа1-С1у-8ег-А5п-Еу5-С1у-А1а-Пе-11е-О1у-Ееи-Ме1-Уа1-О]у-О1уУа1-Уа1-11е-А1а

Αβ ί-40 (5ЕО ΙΡ ΝΟ. 2Е

Азр-А1а-СИи-РЬе-Аг8-Н18'Азр-8ег-О1у-Туг-О1и-Уа1-Н1Б-Н1з-О1п-Еуз-Ееи-Уа1-Р11еРЬе-А]а-01и-Азр-Уа1-01у'8ег-Азп-Еуз-01у-А1а-11е-Пе-01у-Ееи-Ме1-Уа1-01у-01уУа1-Уа1

Αβ 1-38 (8ЕО ΙΡ N0. ЗУ

Азр-А1а-О1и-Р(ге-Аг8-Н15-Азр-8ег-О1у-Туг-01и-Уа1-Н15-Н15-О1п-Еу5-Ееи-\^га1-РНеРЬе-А1а-С1и-А5р-Уа1-01у-8ег-А5П-Еу£-01у-А1а-11е-11е-01у-Ьеи-Ме1-Уа1-01у-01у ρΟ1υ-Αβ или ’Άβ Ν3ρΕ относится к укороченным на Ν-конце формам АД, которые начинаются на остатке глутаминовой кислоты в положении 3 в аминокислотной последовательности Αβ и в которых указанный остаток глутаминовой кислоты циклизован с образованием остатка пироглутаминовой кислоты. В частности, ρΟ1υ-Αβ в контексте настоящего описания означает те фрагменты, которые участвуют в или которые ассоциированы с амилоидными патологиями, включая (но, не ограничиваясь только ими) ρΟ1υ-Αβ3-3₈, ρΟ^-Άβ^ ρ-Ο1υΑβ3-42.

Ниже представлены последовательности укороченных на Ν-конце форм Αβ, Αβ_3-38, -^3-40, ^АД3-42^:

- 7 028427

Αβ 3-42 (5ΕΟ 1ΡΝΟ. 4):

О1и-РЬе-Аг@-Нк-Азр-Зег-С1у-Туг-СНи-Уа1-Шз-Ш5-61п-Еу5-Ееи-Уа1-РЬе-РЬе-А1аО! и-Акр-Уа1-О1у-8ег-Азп-Еуз-С]у-А]а-11е-11е-О]у-Ьеи-Ме1-Уа1-О1у-О]у-Уа1-Уа1Не-А1а

Αβ 3-40 (5ЕО ΙΡ ΝΟ. 5):

О1и-РЬе-Аг£-Н15-А5р-Зег-О1у-Туг-О1и-Уа1-Нк-Ш!5-О]п-Еуз-Ееи-Уа1-РЬе-РЬе-А1аО1и-Азр-Уа1-О1у-8ег-Азп-Еуз-О1у-А1а-11е-11е-(31у-Ееи-Ме1-Уа1-01у-С1у-Уа1-Уа1 Αβ 3-38 (5ΕΟ 1ΡΝΟ-6):

О1и-РЬе-Аг8-Н|5-Азр-8ег-О1у-Туг-01и-Уа1-Н1з-Н15-С1п-Еуз-Ееи-Уа1-РЬе-Рке-А1аО1и-Азр-Уа1-О1у-8ег-Азп-Еуз-О1у-А1а-11е-Ие-О1у-Ееи-Мег-Уа1-О1у-С1у

В частности, в настоящем изобретении предложено следующее.

1. Антитело, отличающееся тем, что связывается с Άβ-пептидами или их вариантами, предпочтительно с высокой аффинностью.

2. Антитело по п.1, где высокая аффинность означает, что значение константны диссоциации (К_с) составляет 10^-7 М или менее.

3. Антитело по п.1 или 2, где антитело представляет собой моноклональное антитело.

4. Антитело по одному из предыдущих пунктов, где вариабельная область легкой цепи антитела имеет нуклеотидную последовательность, выбранную из 8ЕС ГО N0: 49, 53, 57 и 61, или аминокислотную последовательность, выбранную из 8Е0 ГО N0: 50, 54, 58 и 62.

5. Антитело по одному из предыдущих пунктов, где вариабельная область тяжелой цепи антитела имеет нуклеотидную последовательность, выбранную из 8Е0 ГО N0: 51, 55, 59 и 63, или аминокислотную последовательность, выбранную из 8Е0 ГО N0: 52, 56, 60 и 64.

6. Антитело по одному из предыдущих пунктов, где вариабельная область легкой цепи антитела имеет нуклеотидную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 49, или аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 50, и где вариабельная область тяжелой цепи антитела имеет нуклеотидную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 51, или аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 52.

7. Антитело по одному из предыдущих пунктов, где вариабельная область легкой цепи антитела имеет нуклеотидную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 53, или аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 54, и где вариабельная область тяжелой цепи антитела имеет нуклеотидную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 55, или аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 56.

8. Антитело по одному из предыдущих пунктов, где вариабельная область легкой цепи антитела имеет нуклеотидную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 57, или аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 58, и где вариабельная область тяжелой цепи антитела имеет нуклеотидную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 59, или аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 60.

9. Антитело по одному из предыдущих пунктов, где вариабельная область легкой цепи антитела имеет нуклеотидную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 61, или аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 62, и где вариабельная область тяжелой цепи антитела имеет нуклеотидную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 63, или аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 64.

10. Антитело по одному из предыдущих пунктов, где антитело выбрано из следующей группы:

Αβ 5-5-6 (депозит № Р5М АСС 2923)

Αβ 6-1 -6 (депозит № ЭВМ АСС 2924)

Αβ 17-4-3 (депозит № Г)ВМ АСС 2925)

Αβ 24-2-3 (депозит Хе ЭВМ АСС 2926), или его функциональные варианты.

11. Антитело по одному из предыдущих пунктов, где антитело представляет собой Ав6-1-6 (депозит № Ό8Μ АСС 2924).

12. Антитело по одному из предыдущих пунктов, где антитело представляет собой Ав24-2-3 (депозит № Ό8Μ АСС 2926).

13. Антитело по одному из предыдущих пунктов, где антитело представляет собой гуманизированное или химерное антитело или фрагмент антитела, который сохраняет высокую аффинность.

14. Антитело по одному из предыдущих пунктов, предназначенное для применения с целью выявления Ав-пептида или его вариантов.

15. Антитело по п.14, где варианты выбраны из следующей группы:

- 8 028427 рО1и-А0з_з₈ рО1и-Лрз_₄0 рСг1и-Арз_42 и варианты рО1и-АРз__х> где х обозначает целое число от 10 до 42; предпочтительно от 18 до 42, более предпочтительно от 30 до 42.

16. Антитело по одному из предыдущих пунктов, где антитело является человеческим.

17. Антитело по одному из предыдущих пунктов, которое представляет собой димерное антитело или одноцепочечное антитело, сохраняющее высокую аффинность.

18. Антитело по одному из предыдущих пунктов, которое связывается с эпитопом, с которым связываются антитела по п.15.

19. Антитело по одному из предыдущих пунктов, которое имеет гипервариабельные участки антител по п.15.

20. Антитело по одному из предыдущих пунктов, которое является меченым.

21. Антитело по одному из предыдущих пунктов, которое иммобилизовано на твердой фазе.

22. Антитело, которое можно получать из любой из клеточных линий гибридом Ό8Μ АСС 2923, Ό8Μ АСС 2924, Ό8Μ АСС 2925, Ό8Μ АСС 2926.

23. Композиция, содержащая антитело по одному из предыдущих пунктов.

24. Композиция по п.23, предназначенная для лечения, предупреждения или замедления развития амилоидоза.

25. Композиция по п.23 или 24, где амилоидоз представляет собой нейродегенеративное заболевание, выбранное из группы, включающей легкое когнитивное нарушение, болезнь Альцгеймера и нейродегенерацию при синдроме Дауна.

26. Композиция по п.23 или 24, где амилоидоз представляет собой спорадическую болезнь Альцгеймера или семейную деменцию альцгеймеровского типа.

27. Композиция по п.26, где семейная деменция альцгеймеровского типа представляет собой семейную британскую деменцию или семейную датскую деменцию.

28. Клеточная линия гибридомы Ό8Μ АСС 2923.

29. Клеточная линия гибридомы Ό8Μ АСС 2924.

30. Клеточная линия гибридомы Ό8Μ АСС 2925.

31. Клеточная линия гибридомы Ό8Μ АСС 2926.

32. Применение антитела по одному из пп.1-22 или композиции по одному из пп.23-27 в диагностическом или терапевтическом методе.

33. Применение по п.32 для диагностирования связанного с амилоидом заболевания или состояния.

34. Применение по п.33, где амилоидоз представляет собой нейродегенеративное заболевание, выбранное из группы, включающей легкое когнитивное нарушение, болезнь Альцгеймера и нейродегенерацию при синдроме Дауна.

35. Применение по п.33, где амилоидоз представляет собой спорадическую болезнь Альцгеймера или семейную деменцию альцгеймеровского типа.

36. Применение по п.35, где семейная деменция альцгеймеровского типа представляет собой семейную британскую деменцию или семейную датскую деменцию.

37. Диагностический способ ίη νίΐτο для диагностирования ассоциированного с амилоидом заболевания или состояния, прежде всего болезни Альцгеймера, заключающий в том, что приводят в контакт антитело по одному из пп. 1 -22 с образцом из организма индивидуума, который, как предполагается, может быть поражен указанным заболеванием или состоянием, и определяют связывание антитела с рО1и-амилоидным белком, предпочтительно рО1и-Ав-пептидом из образца.

38. Диагностический набор, содержащий антитело по одному из пп.1-22 и инструкции по применению и необязательно (а) дополнительную(ие) биологически активную(ые) субстанцию(и).

39. Диагностический набор по п.32, в котором дополнительная биологическая субстанция представляет собой ингибитор глутаминилциклазы.

40. Олигонуклеотид, выбранный из группы, включающей 8ЕО ГО N0: 23-48.

Антитела, предлагаемые в изобретении, можно применять для диагностирования амилоидоза.

Антитела, предлагаемые в изобретении, можно применять в качестве агентов, используемых для очистки с помощью аффинной хроматографии. Для осуществления этого процесса антитела иммобилизуют на твердой подложке, такой как смола Сефадекс (8ерЬайех) или фильтровальная бумага, с помощью методов, хорошо известных в данной области. Иммобилизованное антитело приводят в контакт с образцом, содержащем Λβ-пептид (или его фрагмент), подлежащий очистке, и затем подложку отмывают приемлемым растворителем, который может удалять практически весь материал в образце за исключением Ав-пептида, который связан с иммобилизованным антителом. И, наконец, подложку отмывают другим

- 9 028427 приемлемым растворителем, таким как глициновый буфер с рН 5,0, который позволяет отделять Αβпептид от антитела.

Антитела к Ав-пептиду можно применять также в диагностических анализах, предназначенных для Ав-пептида, например, выявления его присутствия в конкретных клетках, тканях или сыворотке. Таким образом, антитела можно применять для диагностирования амилоидоза, в частности, нейродегенеративного заболевания, выбранного из группы, включающей легкое когнитивное нарушение (МС1), болезнь Альцгеймера (ΑΌ), например, типа спорадической болезни Альцгеймера (8ΑΌ) или семейных деменций альцгеймеровского типа (ΡΑΌ), таких как семейная британская деменция (ΡΒΌ) и семейная датская деменция (ΡΌΌ), и нейродегенерацию при синдроме Дауна; предпочтительно болезнь Альцгеймера.

Для диагностического применения антитело, как правило, метят с помощью выявляемого фрагмента. Многочисленные доступные метки, можно, как правило, сгруппировать по следующим категориям:

14 125 3 131 (а) радиоактивные изотопы, такие как 8, С, I, Н и I. Антитело можно метить радиоактивным изотопом с помощью методов, описанных, например, в СиггсШ Рто1осо1к ίη 1штипо1о§у, т. 1 и 2, под ред. СоНдеи и др., 1991, изд-во ХУПсу-ОИсгесюпсс. №\ν Уогк, №\ν Уогк, РиЬк., и радиоактивность можно оценивать с помощью сцинтилляционного счетчика;

(б) флуоресцентные метки, из которых доступными являются хелаты редкоземельных металлов (хелаты европия) или флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, дансил, лиссамин, фикоэритрин и краситель техасский красный (Техак Кеб). Флуоресцентные метки можно конъюгировать с антителом с помощью методов, описанных, например, в Ситгеи! Рто1осо1к ίη 1ттиио1оду, см. выше. Флуоресценцию можно оценивать количественно с помощью флуориметра;

(в) известны различные ферментно-субстратные метки. Фермент, как правило, катализирует химическое изменение хромогенного субстрата, что можно измерять с помощью различных методов. Например, фермент может катализировать изменение цвета субстрата, что можно оценивать спектрофотометрически. В другом варианте фермент может изменять флуоресцентность или хемилюминисценцию субстрата. Методы, предназначенные для количественной оценки изменения флуоресценции, описаны выше. В результате химической реакции хемилюминисцентный субстрат становится чувствительным к возбуждению электронами и может испускать свет, который можно оценивать (например, с помощью химилюминометра), или становится донором энергии для флуоресцентного акцептора. Примерами ферментных меток являются люциферазы (например, люцифераза светляка и бактериальная люцифераза; И8 4737456), люцеферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, малатдегидрогеназа, уреаза, пероксидаза, такая как пероксидаза из хрена (НКРО), щелочная фосфатаза, р-галактозидаза, глюкоамилаза, лизоцим, оксидазы сахаридов (например, глюкозооксидаза, галактозооксидаза и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа), оксидазы гетероциклических соединений (такие как уреказа и ксантиноксидаза), лактопероксидаза, микропероксидаза и т.п. Методы конъюгации ферментов с антителами описаны у Ο'8ιι11ίν;·ιη и др., Мебюбк Гог бю Ргератайои оГ Еп/уте-АпПЬобу СопщдШек Гог ике ίη Εη/уте 1ттииоа55ау, в Мебюбк ίη Εη/ут., под ред. б. Ьаидоие и ναη ^иакщ, изд-во Асабетю ргекк, №\ν Уогк, 73, 1981, с. 147-166.

Примерами комбинаций фермент-субстрат являются, например:

(I) пероксидаза из хрена (НКРО) и Н-пероксидаза в качестве субстрата, где Н-пероксидаза окисляет предшественник красителя (например, ортофенилендиамин (ΟΡΌ) или гидрохлорид 3,3',5,5'тетраметилбензидина (ТМВ));

(II) щелочная фосфатаза (АР) и паранитрофенилфосфат в качестве хромогенного субстрата; и (III) β-Ό-галактозидаза (β-Ό-ОаГ) и хромогенный субстрат (например, паранитрофенил-β-Όгалактозидаза) или флуорогенный субстрат 4-метилумбеллиферил-β-^-галактозидаза.

Специалистам в данной области известны многочисленные другие комбинации фермент-субстрат.

В некоторых случаях метку конъюгируют с антителом опосредовано. Специалисту в данной области известны пути достижения этой цели. Например, антитело можно конъюгировать с биотином, и любую метку из указанных выше трех широких категорий можно конъюгировать с авидином, и наоборот. Биотин связывается избирательно с авидином и в результате метку можно конъюгировать с антителом указанным опосредованным образом. В другом варианте для осуществления опосредованной конъюгации метки с антителом антитело конъюгируют с небольшим гаптеном (например, дигоксином) и одну из меток указанных выше различных типов конъюгируют с антителом к гаптену (например, антителом к дигоксину). Таким путем осуществляют опосредованную конъюгацию метки с антителом.

В другом варианте осуществления изобретения не требуется метить антитело к Αβ и его присутствие можно выявлять с помощью меченого антитела, с которым связывается антитело к Αβ

Антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять в любом известном методе анализа, таком как конкурентные анализы связывания, прямые и непрямые сэндвич-анализы и анализы на основе иммунопреципитации (2о1а, Моиос1оиа1 АиНЬобюк: А Маииа1 оГ ТесЬтдиек, изд-во СКС Ргекк, Ыс., 1987, с. 147-158).

Конкурентные анализы связывания основаны на способности меченого стандарта конкурировать с анализируемым тестируемым образцом за связывание с присутствующим в ограниченным количестве антителом. Количество Αβ-пептида в тестируемом образце обратно пропорционально количеству стан- 10 028427 дарта, которое связывается с антителами. Для облегчения определения количества связанного стандарта антитела, как правило, не солюбилизируют до или после конкурентного связывания, в результате стандартное и анализируемое антитело, связанное с антителами, можно легко отделять от оставшегося несвязанным стандартного и анализируемого антитела.

Сэндвич-анализы предусматривают применение двух антител, каждое из которых обладает способностью связываться с различной иммуногенной областью или эпитопом белка, который требуется выявлять. При осуществлении сэндвич-анализа тестируемый анализируемый образец связывают с первым антителом, которое иммобилизовано на твердой подложке, а затем второе антитело связывают с анализируемым образцом, получая тем самым нерастворимый состоящий из трех частей комплекс. Само второе антитело можно метить выявляемым фрагментом (прямые сэндвич-анализы) или его можно оценивать с помощью антитела к иммуноглобулину, которое метят выявляемым фрагментом (непрямой сэндвич-анализ). Например, одним из предпочтительных типов сэндвич-анализа является ЕЬ18А, в котором выявляемый фрагмент представляет собой фермент.

Для осуществления иммуногистохимии образец опухоли может быть свежеполученным или замороженным, или может быть залит в парафин и фиксирован с помощью консерванта, такого, например, как формалин.

Диагностические наборы.

Для удобства антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, может входить в состав набора, например, его можно упаковывать в сочетании с реагентами в предварительно определенных количествах вместе с инструкцией по осуществлению диагностического анализа. Если антитело метят с помощью фермента, но в состав набора должны входить субстраты и кофакторы, необходимые для фермента (например, предшественник субстрата, дающего выявляемый хромофор или флуорофор). Кроме того, в него могут входить другие добавки, такие как стабилизаторы, буферы (например, блокирующий буфер или буфер для лизиса) и т.п. Относительные количества различных реагентов могут варьироваться в широких пределах для получения концентраций в растворе реагентов, в значительной степени оптимизированных для требуемой чувствительности анализа. В частности, реагенты могут находиться в виде сухих порошков, как правило, лиофилизированных, включая эксципиенты, которые при растворении должны привести к образованию раствора реагента с соответствующей концентрацией.

Диагностический набор, предлагаемый в изобретении, может содержать дополнительную биологически активную субстанцию, описанную ниже. Наиболее предпочтительными для применения в составе диагностического набора являются ингибиторы глутаминилциклазы.

Диагностический набор, предлагаемый в изобретении, наиболее предпочтительно применять для выявления и диагностирования ассоциированных с амилоидом заболеваний и состояний, в частности, нейродегенеративных заболеваний, выбранных из группы, включающей легкое когнитивное нарушение (МС1), болезнь Альцгеймера (АО), например, типа спорадической болезни Альцгеймера (8АО) или семейных деменций альцгеймеровского типа (РАО), таких как семейная британская деменция (РВО) и семейная датская деменция (РОО), и нейродегенерацию при синдроме Дауна; предпочтительно болезнь Альцгеймера.

Настоящее изобретение относится, в частности, к антителам, которые отличаются тем, что они связываются с Αβ-пептидом с высокой аффинностью. Настоящее изобретение относится также к антителам, которые отличаются тем, что они связываются с Αβ-пептидами или их вариантами с высокой аффинностью. Указанная высокая аффинность в контексте настоящего описания означает аффинность, характеризующуюся значением К_с, составляющим 10^-7 М или менее, предпочтительно значением Кс, составляющим 10^-8 М или менее, и еще более предпочтительно значением Кс, составляющим 10^-9-10^-12 М. Таким образом, связывание антител, предлагаемых в изобретении, с Αβ-пептидом характеризуется более высокой аффинностью, чем аффинность известных антител. В частности, антитела предпочтительно представляют собой моноклональные антитела и их выбирают из следующей группы:

Αβ 5-5-6 (депозит № Ώ8Μ АСС 2923)

Αβ 6-1-6 (депозит №ϋ8Μ АСС 2924)

Αβ 17-4-3 (депозит № ϋ8Μ АСС 2925)

Αβ 24-2-3 (депозит № Ό3Μ АСС 2926).

Антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, наиболее предпочтительно применяют в диагностическом способе, предназначенном для выявления амилоидоза, в частности, нейродегенеративного заболевания, выбранного из группы, включающей легкое когнитивное нарушение (МС1), болезнь Альцгеймера (АО), например, типа спорадической болезни Альцгеймера (8АО) или семейных деменций альцгеймеровского типа (РАО), таких как семейная британская деменция (РВО) и семейная датская деменция (РОО), и нейродегенерацию при синдроме Дауна; предпочтительно болезнь Альцгеймера.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения антитело может представлять собой гуманизированное или химерное антитело или человеческое антитело.

Кроме того, выбранное из вышеуказанной группы, антитело может представлять собой также

- 11 028427 функциональный вариант антител из указанной группы.

В контексте настоящего изобретения вариант р-С1и-Ав-пептида представляет собой, в частности, ^ρΟ1π-Αβ;,-3_Χ. ^^^ββ-^ ^рС^1и-Ав3-42.

Другими вариантами Αβ-пептидов являются все варианты ρΟ1ιι-Λβ_3-.,. для которых установлено, что они накапливаются в головном мозге в результате болезни Альцгеймера или являются предвестниками болезни Альцгеймера. X обозначает целое число от 10 до 42, например, в вышеуказанном ρΟ1ιι-Αβ_3-42. 42 соответствует целому числу х.

В контексте настоящего изобретения функциональный вариант антитела, предлагаемого в изобретении, представляет собой антитело, которое сохраняет способность к связыванию, в частности, способность к связыванию с высокой аффинностью с пептидом ρΟ1υ-Αβ_3-χ или его функциональным вариантом. Особенности указанных функциональных вариантов известны в данной области и они включают вышеуказанные характеристики, которые описаны при определении антител и их фрагментов.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело представляет собой фрагмент антитела, как он определен выше.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, представляет собой антитело, которое связывается с эпитопом, который связывается с антителами, указанными выше, в частности антителом 5-5-6, антителом 6-1-6, антителом 17-4-3 и антителом 24-2-3.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, представляет собой антитело, которое имеет гипервариабельные участки (СОК) указанных выше антител. Предпочтительно антитело может быть меченым; возможные метки представляют собой метки, которые указаны выше, и все они известны, в частности, специалистам в области диагностических применений антител.

Предпочтительно антитело иммобилизовано на твердой фазе.

Настоящее изобретение относится также к антителу, которое можно получать с помощью клеточной линии гибридомы 6-1-6 (ΌδΜ АСС 2924).

Настоящее изобретение относится также к композиции, которая содержит указанное выше антитело. В частности, композиция представляет собой композицию для диагностического применения, прежде всего для диагностирования нейродегенеративного заболевания, выбранного из группы, включающей легкое когнитивное нарушение (МС1), болезнь Альцгеймера (АО), например, типа спорадической болезни Альцгеймера (8ΑΌ) или семейных деменций альцгеймеровского типа (РАО), таких как семейная британская деменция (ΡΒΌ) и семейная датская деменция (ΡΌΌ), и нейродегенерацию при синдроме Дауна; предпочтительно болезнь Альцгеймера; в частности для выявления Αβ-пептида или его варианта в биологическом образце.

В другом варианте осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении и описанное выше, или его фрагмент характеризуются аффинностью к связыванию с Αβ-олигомером, волокном, фибриллой или филаментом, превышающим по меньшей мере в 2 раза, предпочтительно по меньшей мере в 4 раза, предпочтительно по меньшей мере в 10 раз, предпочтительно по меньшей мере в 15 раз, более предпочтительно по меньшей мере в 20 раз, но особенно предпочтительно по меньшей мере в 25, аффинность к связыванию с Αβ-мономером.

Следующим вариантом осуществления изобретения является антитело или его фрагмент или химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент, как они описаны выше, где антитело обладает высокой способностью к связыванию с агрегированным Αβ, включая Αβбляшки, в организме млекопитающего, в частности в головном мозге человека, но предпочтительно не обладает никакой заметной перекрестной реактивностью с амилоидным белком-предшественником (АРР).

Следующим вариантом осуществления изобретения является антитело или его фрагмент или химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент, как они описаны выше, где антитело обладает высокой способностью к связыванию с растворимым полимерным амилоидом, в частности амилоидом β (АЩ включая мономеры Αβ, в организме млекопитающего, в частности в головном мозге человека, но предпочтительно не обладает никакой заметной перекрестной реактивностью с амилоидным белком-предшественником (АРР).

Настоящее изобретение относится также к гуманизированным формам антител, описанных выше, композициям, содержащим гуманизированные антитела, и к применению композиций для лечения амилоидоза, прежде всего для лечения нейродегенеративного заболевания у млекопитающего, в частности у человека. Указанное нейродегенеративное заболевание прежде всего представляет собой заболевание, выбранное из группы, включающей легкое когнитивное нарушение (МС1), болезнь Альцгеймера (АО), например, типа спорадической болезни Альцгеймера (8АО) или семейных деменций альцгеймеровского типа (РАО), таких как семейная британская деменция (ΡΒΌ) и семейная датская деменция (ΡΌΌ), и нейродегенерацию при синдроме Дауна. Предпочтительно нейродегенеративное заболевание представляет собой болезнь Альцгеймера.

- 12 028427

В настоящем изобретении предложены также следующие клеточные линии гибридом 5-5-6, 6-1-6, 17-4-3 и 24-2-3.

Настоящее изобретение относится также к применению антитела или композиции, содержащей антитело, как они все описаны выше, для применения в диагностическом способе ίη νίίτο. В частности, этот диагностический способ предназначен для диагностирования нейродегенеративного заболевания выбранного из группы, включающей легкое когнитивное нарушение (МС1), болезнь Альцгеймера (АО), например, типа спорадической болезни Альцгеймера (8ΑΌ) или семейных деменций альцгеймеровского типа (РАО), таких как семейная британская деменция (ΡΒΌ) и семейная датская деменция (ΡΌΌ), и нейродегенерацию при синдроме Дауна; предпочтительно болезнь Альцгеймера; прежде всего путем выявления Αβ-пептида или его вариантов в биологическом образце.

Предпочтительно образец представляет собой образец сыворотки.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения образец представляет собой образец жидкости (ликвора) или спинномозговой жидкости (СМЖ).

Конкретным предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является следующий способ:

Диагностический способ ίη νίίτο или ίη δίΐιι. предназначенный для диагностирования ассоциированного с амилоидом заболевания или состояния, предпочтительно болезни Альцгеймера, заключающийся в том, что осуществляют следующие стадии, на которых приводят в контакт антитело, предлагаемое в изобретении, с образцом, предпочтительно выбранным из образца сыворотки, ликвора или СМЖ, наиболее предпочтительно с образцом сыворотки; или специфической частью тела или областью тела индивидуума, который, как ожидается, может быть поражен указанным состоянием или заболеванием; и определяют связывание антитела с рО1и-амилоидным белком, предпочтительно с пептидом рС1иΑβ в образце.

Более конкретно изобретение относится также к способу диагностирования ассоциированного с амилоидом заболевания или состояния, предпочтительно болезни Альцгеймера, заключающемуся в том, что выявляют иммуноспецифическое связывание антитела или его активного фрагмента с рС1иамилоидным белком, предпочтительно пептидом ρΟ1ιι-Αβ, в образце или ίη $ιΙιι, включающему стадии, на которых:

(а) приводят в контакт образец или специфическую часть организма или область организма, которая, как ожидается, может содержать амилоидный белок, с антителом, прежде всего с моноклональным антителом, предлагаемым в изобретении, более предпочтительно с химерным антителом или его фрагментом, либо с гуманизированным антителом или его фрагментом, предлагаемым в изобретении и описанным выше, и/или его функциональным фрагментом, где антитело связывается с пептидом ρΟ1ιι-Αβ;

(б) дают возможность антителу и/или его функциональному фрагменту связаться с пептидом рС1иΑβ с образованием иммунологического комплекса;

(в) выявляют образование иммунологического комплекса; и (г) устанавливают корреляцию между присутствием или отсутствием иммунологического комплекса и присутствием или отсутствием пептида рС1и-Αβ в образце или специфической части или области организма индивидуума.

Кроме того, в изобретении предложен способ определения степени загрузки амилоидогенными бляшками ткани и/или общей воды организма, заключающийся в том, что:

а) получают образец, репрезентативный для изучаемой ткани и/или общей воды организма;

б) оценивают присутствие в образце амилоидного белка с помощью антитела, прежде всего моноклонального антитела, предлагаемого в изобретении, или химерного антитела или его фрагмента, или гуманизированного антитела или его фрагмента, предлагаемого в изобретении и описанного выше, и/или его функционального фрагмента;

в) определяют количество антитела, связанного с белком; и

г) рассчитывают загрузку бляшками ткани и/или общей воды организма.

В частности, изобретение относится к способу определения степени загрузки амилоидогенными бляшками ткани и/или общей воды организма, в котором образование иммунологического комплекса на стадии в) определяют таким образом, что присутствие или отсутствие иммунологического комплекса коррелирует с присутствием или отсутствием амилоидного белка, в частности пептидов рС1и-Αβ.

Еще одним вариантом осуществления изобретения является композиция, которая содержит антитело, предлагаемое в изобретении, или химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент, предлагаемое/предлагаемый в изобретении и описанное/описанный выше, включая любое функционально эквивалентное антитело или его производное или его функциональный фрагмент, в терапевтически эффективном количестве, в частности, композиция, которая представляет собой фармацевтическую композицию, необязательно содержащую дополнительный фармацевтически приемлемый носитель.

В другом варианте осуществления изобретения композиция содержит антитело в терапевтически

- 13 028427 эффективном количестве.

Кроме того, под объем изобретения подпадает смесь, содержащая антитело, прежде всего моноклональное антитело, предлагаемое в изобретении, или химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагментом, предлагаемое/предлагаемый в изобретении и описанное/описанный выше, включая любое функционально эквивалентное антитело или его производное или его функциональный фрагмент, в терапевтически эффективном количестве, и необязательно дополнительную биологически активную субстанцию и/или фармацевтически приемлемый носитель и/или разбавитель и/или эксципиент.

В частности, изобретение относится к смеси, в которой дополнительная биологически активная субстанция представляет собой соединение, применяемое для лечения амилоидоза, т.е. группы заболеваний и нарушений, ассоциированных с амилоидом или амилоидоподобным белком, таким как Άβ-белок, с которым связаны нейродегенеративные заболевания, выбранные из группы, включающей легкое когнитивное нарушение (МС1), болезнь Альцгеймера (ΑΌ), например, типа спорадической болезни Альцгеймера (8ΛΌ) или семейных деменций альцгеймеровского типа (ΡΑΌ), таких как семейная британская деменция (ΡΒΌ) и семейная датская деменция (ΡΌΌ), и нейродегенерацию при синдроме Дауна; предпочтительно болезнь Альцгеймера.

В следующем варианте осуществления изобретения другая биологически активная субстанция или соединение может представлять собой также терапевтическое средство, которое можно применять для лечения амилоидоза, обусловленного амилоидом р, или можно применять для медикаментозного лечения других неврологических нарушений.

Другая биологически активная субстанция или соединение может проявлять биологические действие посредством такого же или сходного механизма, что и антитело, предлагаемое в изобретении, или посредством неродственного механизма действия или сочетанием нескольких родственных и/или неродственных механизмов действия.

Как правило, другая биологически активная субстанция или соединение может представлять собой энхансеры нейронной трансмиссии, психотерапевтические лекарственные средства, ингибиторы ацетилхолинэстеразы, блокаторы кальциевых каналов, биогенные амины, транквилизаторы на основе бензодиазепинов, усилители синтеза, накопления или высвобождения ацетилхолина, агонисты постсинаптического рецептора ацетилхолина, ингибиторы моноаминоксидазы-Ά или -В, антагонисты рецептора Ν-метилΌ-аспартатглутамата (ΝΜΌΑ), нестероидные противовоспалительные лекарственные средства, антиоксиданты и антагонисты серотонергического рецептора.

Более конкретно, изобретение относится к смеси, которая содержит по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, включающей соединения против окислительного стресса, антиапоптозные соединения, хелаторы металлов, ингибиторы репарации ДНК, такие как пирензепин и метаболиты, 3амино-1-пропансульфоновую кислоту (3ΑΡ8), 1,3-пропандисульфонат (1,3ΡΌδ), активаторы α-секретаз, ингибиторы β- и γ-секретаз, тау-белки, нейромедиатор, разрушители β-складчатой конформации, аттрактанты для клеточных компонентов, участвующих в клиренсе/истощении амилоида бета, ингибиторы укороченного на Ν-конце амилоида бета, включая пироглутаматированный амилоид бета 3-42, такие как ингибиторы глутаминилциклазы, противовоспалительные молекулы или ингибиторы холинэстеразы (СНЕ!), такие как такрин, ривастигмин, донепезил и/или галантамин, агонисты М1 и другие лекарственные средства, включая любое модифицирующее амилоид или тау-белок лекарственное средство и пищевые добавки, и пищевые добавки в сочетании с антителом, предлагаемым в настоящем изобретении, и необязательно фармацевтически приемлемый носитель и/или разбавитель, и/или эксципиент.

Изобретение относится также к смеси, в которой соединение представляет собой ингибитор холинэстеразы (СНЕ1). прежде всего, к смеси, в которой соединение представляет собой соединение, выбранное из группы включающей такрин, ривастигмин, донепезил, галантамин, ниацин и мемантин.

В следующем варианте осуществления изобретения смеси, предлагаемые в изобретении, могут содержать ниацин или мемантин в сочетании с антителом, предлагаемым в настоящем изобретении, и необязательно фармацевтически приемлемый носитель и/или разбавитель, и/или эксципиент.

В следующем варианте осуществления изобретения смеси, предлагаемые в изобретении, могут содержать ингибитор глутаминилциклазы в сочетании с антителом, предлагаемым в настоящем изобретении, и необязательно фармацевтически приемлемый носитель и/или разбавитель, и/или эксципиент.

Предпочтительными ингибиторами глутаминилциклазы являются соединения, описанные в \УО 2005/075436, в частности в примерах 1-141 на с. 31-40. Синтез соединений, указанных в примерах 1-141, описан на сс, 40-48 \УО 2005/075436. Описание \УО 2005/075436, касающееся соединений, представленных в примерах 1-141, их синтеза и их применения в качестве ингибиторов глутаминилциклазы, включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Другие предпочтительные ингибиторы глутаминилциклазы описаны в \УО 2008/055945, в частности в примерах 1-473 на с. 46-155. Синтез соединений, указанных в примерах 1-473, описан на с. 156-192 \УО 2008/055945. Описание \УО 2008/055945, касающееся соединений, представленных в примерах 1473, их синтеза и их применения в качестве ингибиторов глутаминилциклазы, включено в настоящее

- 14 028427 описание в качестве ссылки.

Другие предпочтительные ингибиторы глутаминилциклазы описаны в \УО 2008/055947, в частности в примерах 1-345 на с. 53-118. Синтез соединений, указанных в примерах 1-345, описан на с. 119-133 \УО 2008/055947. Описание \УО 2008/055947, касающееся соединений, представленных в примерах 1345, их синтеза и их применения в качестве ингибиторов глутаминилциклазы, включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Другие предпочтительные ингибиторы глутаминилциклазы описаны в \УО 2008/055950, в частности в примерах 1-212 на с. 57-120. Синтез соединений, указанных в примерах 1-212, описан на с. 121-128 \УО 2008/055950. Описание \УО 2008/055950, касающееся соединений, представленных в примерах 1212, их синтеза и их применения в качестве ингибиторов глутаминилциклазы, включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Другие предпочтительные ингибиторы глутаминилциклазы описаны в \УО 2008/065141, в частности в примерах 1-25 на с. 56-59. Синтез соединений, указанных в примерах 1-25, описан на с. 60-67 \УО 2008/065141. Описание \УО 2008/065141, касающееся соединений, представленных в примерах 1-25, их синтеза и их применения в качестве ингибиторов глутаминилциклазы, включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Другие предпочтительные ингибиторы глутаминилциклазы описаны в \УО 2008/110523, в частности в примерах 1-27 на с. 55-59. Синтез соединений, указанных в примерах 1-27, описан на с. 59-71 \УО 2008/110523. Описание \УО 2008/110523, касающееся соединений, представленных в примерах 1-27, их синтеза и их применения в качестве ингибиторов глутаминилциклазы, включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Другие предпочтительные ингибиторы глутаминилциклазы описаны в \УО 2008/128981, в частности в примерах 1-18 на с. 62-65. Синтез соединений, указанных в примерах 1-18, описан на с. 65-74 \УО 2008/128981. Описание \УО 2008/128981, касающееся соединений, представленных в примерах 1-18, их синтеза и их применения в качестве ингибиторов глутаминилциклазы, включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Другие предпочтительные ингибиторы глутаминилциклазы описаны в \УО 2008/128982, в частности в примерах 1-44 на с. 61-67. Синтез соединений, указанных в примерах 1-44, описан на с. 68-83 \УО 2008/128982. Описание \УО 2008/128982, касающееся соединений, представленных в примерах 1-44, их синтеза и их применения в качестве ингибиторов глутаминилциклазы, включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Другие предпочтительные ингибиторы глутаминилциклазы описаны в \УО 2008/128983, в частности в примерах 1-30 на с. 64-68. Синтез соединений, указанных в примерах 1-30, описан на с. 68-80 \УО 2008/128983. Описание \УО 2008/128983, касающееся соединений, представленных в примерах 1-30, их синтеза и их применения в качестве ингибиторов глутаминилциклазы, включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Другие предпочтительные ингибиторы глутаминилциклазы описаны в \УО 2008/128984, в частности в примерах 1-36 на с. 63-69. Синтез соединений, указанных в примерах 1-36, описан на с. 69-81 \УО 2008/128984. Описание \УО 2008/128984, касающееся соединений, представленных в примерах 1-36, их синтеза и их применения в качестве ингибиторов глутаминилциклазы, включено в настоящее описание в качестве ссылки,

Другие предпочтительные ингибиторы глутаминилциклазы описаны в \УО 2008/128985, в частности в примерах 1-71 на с. 66-76. Синтез соединений, указанных в примерах 1-71, описан на с. 76-98 \УО 2008/128985. Описание \УО 2008/128985, касающееся соединений, представленных в примерах 1-71, их синтеза и их применения в качестве ингибиторов глутаминилциклазы, включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Другие предпочтительные ингибиторы глутаминилциклазы описаны в \УО 2008/128986, в частности в примерах 1-7 на с. 65-66. Синтез соединений, указанных в примерах 1-7, описан на с. 66-73 \УО 2008/128986. Описание \УО 2008/128986, касающееся соединений, представленных в примерах 1-7, их синтеза и их применения в качестве ингибиторов глутаминилциклазы, включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Еще одним вариантом осуществления изобретения являются смеси, которые содержат атипичные антипсихотические средства, такие, например, как клозапин, зипрасидон, рисперидон, арипипразол или оланзапин, предназначенные для лечения позитивных или негативных психотических симптомов, включая галлюцинации, бред, нарушения мышления (проявляющиеся в выраженной непоследовательности действий, психическом расстройстве, расстройстве ассоциативного мышления) и эксцентричное или неорганизованное поведение, а также ангедонию, пониженную эмоциональную реакцию, апатию и отказ от общества, в сочетании с антителом, прежде всего моноклональным антителом, предлагаемым в изобретении, но предпочтительно с химерным антителом или его фрагментом или гуманизированным антителом или его фрагментом, предлагаемым в изобретении и описанными выше, и необязательно фармацевтически приемлемый носитель, и/или разбавитель, и/или эксципиент.

В конкретном варианте осуществления изобретения композиции и смеси, предлагаемые в изобрете- 15 028427 нии и описанные выше, содержат антитело и биологически активную субстанцию соответственно в терапевтически эффективном количестве.

Другие соединения, которые можно применять в смесях в сочетании с антителом, предлагаемым в настоящем изобретении, описаны в \УО 2008/0б5141 (см. прежде всего с. 37/38), включая ингибиторы РЕР (с. 43/44), ЫС1, ингибиторы дипептидиламинопептидаз, предпочтительно ингибиторы ΌΡ IV или ΌΡ ίν-подобных ферментов (см. с. 48/49); ингибиторы ацетилхолинэстеразы (АСЬЕ) (см. с. 47), энхансеры Р1МТ (протеинизоаспартаткарбоксиметилтрансфераза), ингибиторы бета-секретаз (см. с. 41), ингибиторы гамма-секретаз (см. пп.41/42), ингибиторы нейтральной эндопептидазы, ингибиторы фосфодиэстеразы-4 (РОЕ-4) (см. с. 42/43), ингибиторы ТИР-альфа, антагонисты мускаринового М1-рецептора 9 (см. с. 4б), антагонисты ИМОА-рецептора 9 (см. с. 47/48), ингибиторы сигма-1-рецептора, антагонисты гистамина Н3 (см. с. 43), иммуномодуляторы, иммунодепрессанты, антагонисты МСР-1 или средство, выбранное из группы, включающей антегрен (натализумаб), неурелан (фампридин-δΚ), кампат (алемтузумаб), ΙΚ 208, ΝΒΙ 5788/М8Р 771 (типлимотид), паклитаксел, Апег§1х.М§ (АО 284), §Нб3б, дифферин (СО 271, адапален), ВАУ 3б1б77 (интерлейкин-4), ингибиторы матриксной металлопротеиназы (например, ВВ 7б1б3), интерферон-тау (трофобластин) и 8А1К-М8; антитела к бета-амилоиду (см. с. 44), ингибиторы цистеиновой протеазы (см. с. 44); антагонисты МСР-1 (см. с. 44/45), ингибиторы отложения амилоидного белка (см. с. 42) и ингибиторы синтеза бета-амилоида (см. с. 42), указанный документ включен в настоящее описание в качестве ссылки.

Другим вариантом осуществления изобретения является смесь, содержащая антитело, прежде всего моноклональное антитело, предлагаемое в изобретении, или химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент, предлагаемое/предлагаемый в изобретении и описанное/описанный выше, и/или биологически активную субстанцию в терапевтически эффективном количестве.

Изобретение относится также к применению антитела, прежде всего моноклонального антитела, предлагаемого в изобретении, но предпочтительно химерного антитела или его фрагмента, или гуманизированного антитела или его фрагмента, предлагаемого в изобретении и описанного выше, и/или его функционального фрагмента и/или фармацевтической композиции или смеси, содержащей указанное антитело, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения или облегчения воздействий амилоидоза, группы заболеваний и нарушений, ассоциированных с образованием амилоидных бляшек, включая вторичный амилоидоз и связанный с возрастом амилоидоз, включая (но не ограничиваясь только ими) неврологические заболевания, такие как болезнь Альцгеймера (АО), деменция, связанная с тельцами Леви, синдром Дауна, наследственная церебральная геморрагия с амилоидозом (голландского типа); комплекс деменции Гуама-Паркинсона, а также других заболеваний, которые обусловлены или ассоциированы с амилоидоподобными белками, таких как прогрессирующий надъядерный паралич, рассеянный склероз; болезнь Крейцфельдта-Якоба, болезнь Паркинсона, связанная с ВИЧ деменция, АЬ§ (амиотрофический боковой склероз), диабет взрослых; старческий сердечный амилоидоз; эндокринные опухоли и других заболеваний, включая дегенерацию желтого пятна.

Настоящее изобретение относится также к способу получения антитела, прежде всего моноклонального антитела, предлагаемого в изобретении, но более предпочтительно химерного антитела или его фрагмента, или гуманизированного антитела или его фрагмента, предлагаемого в изобретении и описанного выше, и/или его функционального фрагмента, и/или фармацевтической композиции, или смеси, содержащей указанное антитело и/или его функциональный фрагмент, предпочтительно в терапевтически эффективном количестве, для использования в способе предупреждения, лечения или облегчения воздействий амилоидоза, группы заболеваний и нарушений, ассоциированных с образованием амилоидных бляшек, включая вторичный амилоидоз и связанный с возрастом амилоидоз, включая (но не ограничиваясь только ими) неврологические заболевания, такие как легкое когнитивное нарушение (МС1), болезнь Альцгеймера (АО), например, типа спорадической болезни Альцгеймера (8АО) или семейных деменций альцгеймеровского типа (РАО), таких как семейная британская деменция (РВО) и семейная датская деменция (РОО), нейродегенерация при синдроме Дауна; деменция, связанная с тельцами Леви, наследственная церебральная геморрагия с амилоидозом (голландского типа); комплекс деменций ГуамаПаркинсона, а также других заболеваний, которые обусловлены или ассоциированы с амилоидоподобными белками, таких как прогрессирующий надъядерный паралич, рассеянный склероз; болезнь Крейцфельдта-Якоба, болезнь Паркинсона, связанная с ВИЧ деменция, АЬ§ (амиотрофический боковой склероз), диабет взрослых; старческий сердечный амилоидоз; эндокринные опухоли и других заболеваний, включая дегенерацию желтого пятна, заключающемуся в том, что приготавливают препарат антитела, прежде всего моноклонального антитела, предлагаемого в изобретении, но более предпочтительно химерного антитела или его фрагмента или гуманизированного антитела или его фрагмента, предлагаемого в изобретении, в виде фармацевтически приемлемой формы.

Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ предупреждения, лечения или облегчения воздействий амилоидоза, группы заболеваний и нарушений, ассоциированных с образованием амилоидных бляшек, включая вторичный амилоидоз и связанный с возрастом амилоидоз, включая (но не ограничиваясь только ими) неврологические заболевания, такие как легкое когнитивное нарушение (МС1), бо- 1б 028427 лезнь Αльцгеймера (АО), например, типа спорадической болезни Αльцгеймера (8АО) или семейных деменций альцгеймеровского типа (РАО), таких как семейная британская деменция (РВО) и семейная датская деменция (РОО), нейродегенерация при синдроме Дауна; деменция, связанная с тельцами Леви, наследственная церебральная геморрагия с амилоидозом (голландского типа); комплекс деменций ГуамаПаркинсона, а также других заболеваний, которые обусловлены или ассоциированы с амилоидоподобными белками, таких как прогрессирующий надъядерный паралич, рассеянный склероз; болезнь Крейцфельдта-Якоба, болезнь Паркинсона, связанная с ВИЧ деменция, АЬ§ (амиотрофический боковой склероз), диабет взрослых; старческий сердечный амилоидоз; эндокринные опухоли, и других заболеваний, включая дегенерацию желтого пятна, заключающийся в том, что вводят антитело и/или его функциональный фрагмент, но предпочтительно гуманизированное антитело и/или его функциональный фрагмент, или композицию или смесь, содержащую указанное антитело и/или его функциональный фрагмент, животному или человеку, пораженному указанным нарушением, при этом антитело вводят в терапевтически эффективном количестве.

Еще одним объектом изобретения является способ лечения амилоидоза, группы заболеваний и нарушений, ассоциированных с образованием амилоидных бляшек, включая вторичный амилоидоз и связанный с возрастом амилоидоз, включая (но не ограничиваясь только ими) неврологические заболевания, такие как легкое когнитивное нарушение (ΜΟ), болезнь Αльцгеймера (АО), например, типа спорадической болезни Αльцгеймера (8АО) или семейных деменций альцгеймеровского типа (РАО), таких как семейная британская деменция (РВО) и семейная датская деменция (РОО), нейродегенерация при синдроме Дауна; прежде всего заболевания или состояния, отличающегося потерей когнитивной способности к запоминанию, заключающийся в том, что вводят животному, прежде всего млекопитающему или человеку, антитело, прежде всего фармацевтическую композицию, предлагаемую в изобретении и представленную в настоящем описании.

Конкретным вариантом осуществления изобретения является способ сохранения или повышения когнитивной способности к запоминанию, но прежде всего восстановления когнитивной способности к запоминанию у животного, прежде всего млекопитающего или человека, который страдает нарушением памяти, заключающийся в том, что вводят животному, прежде всего млекопитающему или человеку, антитело, предпочтительно фармацевтическую композицию, предлагаемую в изобретении и описанную выше.

Следующим объектом изобретения является терапевтическая композиция и способ получения композиции, а также способ лечения амилоидоза, группы заболеваний и нарушений, ассоциированных с образованием амилоидных бляшек, включая вторичный амилоидоз и связанный с возрастом амилоидоз, включая (но не ограничиваясь только ими) неврологические заболевания, такие как легкое когнитивное нарушение (ΜΟ), болезнь Αльцгеймера (АО), например, типа спорадической болезни Αльцгеймера (8АО) или семейных деменций альцгеймеровского типа (РАО), таких как семейная британская деменция (РВО) и семейная датская деменция (РОО), нейродегенерация при синдроме Дауна; прежде всего заболевания или состояния, отличающегося потерей когнитивной способности к запоминанию, с использованием антитела, предлагаемого в изобретении и описанного выше.

В частности, изобретение относится к лечению животного, прежде всего млекопитающего или человека, который страдает ассоциированным с амилоидом состоянием, отличающимся потерей когнитивной способности к запоминанию, что приводит к сохранению когнитивной способности к запоминанию.

Примеры

1. Материал и методы.

1.1. Получение антител.

Мыши.

Для получения гибридом использовали самок мышей линии ВАЬВ/С (фирма СЬаг1е8 Ккег) 8недельного возраста.

Клеточная линия миеломы.

Для создания гибридом использовали клеточную линию миеломы §Р2/0-А§14 из Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур.

Αнтиген.

Использовали пептид рО1и-6166 (последовательность рО1и-РКНО§ОС, 8ЕЦ ГО N0: 65).

Стратегия.

Для создания иммуногена пептид сшивали с бычьим тиреоглобулином (БТГ, фирма δIОΜΑ) через малеимидные группы, присутствующие в трех различных линкерах. Применяли три линкера различной длины, таких как сложный ^[е-малеимидокапроилокси]сукцинимидный эфир (ЕΜСδ), сукцинимидил-4Щ-малеимидометил)циклогексан-1-карбокси(6-амидокапроат) (^СδΜСС) и сложный Ν-|όмалеимидопропилокси]сукцинимидный эфир (ΕΜΡδ).

Для выявления созданных антител этот же пептид конъюгировали с бычьим сывороточным альбумином (БСΑ, фирма δIОΜΑ) через малеимидную группу из сукцинимидил-6-[(Ьмалеимидопропионамидо)гексаноата] (8ΜΡΗ).

- 17 028427

Методы.

Конъюгация пептида с целью иммунизации.

Конъюгацию осуществляли с помощью двух стадий через δΗ-группы из остатков цистеина пептида.

1. Малеилирование белка-носителя.

Добавляли от 2 до 5 мг соответствующего линкера (50 мг/мл в Ν-метилпирролидоне, ΝΜΡ) к 2 мл раствора белка-носителя (10 мг/мл в 0,1 мМ ШНСОз, ρΗ 8,0). Реакционную смесь инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре (КТ). Затем реакционную смесь обессоливали с помощью колонки δеρЬаάеx О-50 (1,5х 14 см), которую уравновешивали 50 мМ фосфатом натрия, 250 мМ №С1, рН 6,8.

2. Сочетание малеилированного БТГ с пептидом.

250 мкл раствора пептида (10 мг/мл в дважды дистиллированной воде) смешивали с 2 мл раствора, содержащего малеилированные белки-носители (2,5 мг/мл) в 50 мМ фосфате натрия, 250 мл №С1, рН 6,8, и инкубировали в течение 2 ч при 4°С и еще в течение 4 ч при КТ. Непрореагировавшие малеимидные группы блокировали, добавляя 2-меркаптоэтанол вплоть до достижения концентрации 10 мМ, и инкубировали в течение ночи при 4°С. Образовавшийся конъюгат подвергали диализу в противотоке 10 мМ фосфата натрия, 150 мМ №С1, ρΗ 7,5 при 4°С (3-кратный обмен буфера, номинально отсекаемая ММ 10000).

Конъюгация пептида для осуществления ΕυδΛ.

Конъюгацию осуществляли с помощью двух стадий через δΗ-группы из остатков цистеина пептида.

1. Малеилирование белка-носителя.

мг 8МРН (50 мг/мл в Ν-метилпирролидоне, ΝΜΡ) добавляли к 2 мл раствора белка-носителя (БСА, 10 мг/мл в 0,1 мМ NаΗСОз, ρΗ 8,0). Реакционную смесь инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре (КТ). Затем реакционную смесь обессоливали с помощью колонки δеρЬаάеx О-50 (1,5x14 см), которую уравновешивали 50 мМ фосфатом натрия, 250 мМ №С1, ρΗ 6,8.

2. Сочетание малеилированного БТГ с пептидом.

100 мкл раствора пептида (10 мг/мл в 50 мМ фосфате натрия, 250 мМ №С1, ρΗ 6,8) смешивали с 1 мл раствора, содержащего малеилированные белки-носители (2,5 мг/мл) в 50 мМ фосфате натрия, 250 мл №С1, ρΗ 6,8, и инкубировали в течение 2 ч при 4°С и еще в течение 4 ч при КТ. Непрореагировавшие малеимидные группы блокировали, добавляя 2-меркаптоэтанол вплоть до достижения концентрации 10 мМ, и инкубировали в течение ночи при 4°С. Образовавшийся конъюгат подвергали диализу в противотоке 10 мМ фосфата натрия, 150 мМ №С1, ρΗ 7,5 при 4°С (3-кратный обмен буфера, номинально отсекаемая ММ 10000).

Иммунизация.

Пять мышей иммунизировали внутрибрюшинно в течение 39 дней. Для иммунизации использовали эмульсию типа вода-в-масле, состоящую из равных частей раствора антигена (состоящего из равных частей трех различных конъюгаюв пептид-БТГ) и полного или неполного адъюванта Фрейнда.

Слияние.

Трех иммунизированных мышей умерщвляли путем инкубации с использованием СО₂. Селезенки изымали и гомогенизировали в стерильных условиях. Спленоциты и клетки миеломы линии 8Р2/0 отмывали несколько раз в модифицированной по методу Дульбекко среде Игла (ΌΜΕΜ, фирма 81ОМА) и осуществляли слияние, применяя соотношение 2,3 спленоцита на 1 клетку линии 8Р2/0, с использованием полиэтиленгликоля 3350 (1 мл, 50% (мас./об.)). Дальнейшую обработку слитых гибридом осуществляли согласно стандартным методикам.

ΕΟδΑ

Для скрининга супернатанта клеточной культуры применяли 1дО- Ε^IδΛ. Опыт проводили в 96луночных титрационных микропланшетах из полистирола (фирма Огешег, каталожный № 655061). Планшеты сенсибилизировали пептидом БСА-ρО1и-6166. По 100 мкл неразведенного супернатанта клеточной культуры добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 1 ч при КТ. В качестве отрицательного контроля использовали супернатант ЭР2/0-клеток. Супернатант спленоцитов использовали в качестве положительного контроля.

Позитивные клетки выявляли с помощью козьего антитела к мышиному 1дО, конъюгированного со щелочной фосфатазой. Оптическую плотность (ОП) определяли с помощью ридера для микропланшетов Эупех Оρδуδ МК при 405 нм.

Селекция стабильных продуцирующих антитела клеток гибридом.

Клетки из позитивных лунок переносили в 24-луночные планшеты и культивировали в течение нескольких дней. Клетки вновь переносили и оценивали в отношении связывания БСА-ρО1и-6199 и перекрестной реактивности с помощью Ε^IδΛ. Позитивные лунки применяли для криоконсервации клеточных линий гибридом.

Клонирование посредством конечного разведения.

Осуществляли две последовательные стадии клонирования для отделения продуцирующих антите- 18 028427 ла клеток от непродуцирующих клеток и для гарантии того, что отобранные клетки являются моноклональными. Обе стадии клонирования осуществляли с помощью метода конечного разведения.

Криоконсервация.

Отобранные гибридомы подвергали криоконсервации с использованием ДМСО и стандартных методов.

1.2. ЕЫ8А-анализы.

Иммобилизацию Αβ Ν3ρΕ-40 осуществляли с использованием 1ιΛβ (х-40)-ЕЫ8А (Н8) фирмы ТОС (фирма ТЬе ΟΕΝΕΤΙί',’δ Сотраиу; Швейцария), в целом согласно инструкциям производителя.

Создавали биотинилированные идентифицирующие антитела к Αβ Ν3ρΕ (рО1и-6166). При необходимости конъюгированное с НКР-антитело к Αβ Ц3рЕ фирмы 1ВЬ использовали в качестве положительного контроля (доступно только в сочетании с набором для ЕЫ8А Нитаи Ату1о1б β (Ц3рЕ) фирмы 1ВЬ). Синтезировали соответствующие пептиды Αβ Ц3рЕ-40 (аликвоты массой 50 мкг в гексафторизопропаноле (ГФИП) хранили при -80°С). Непосредственно перед применением ГФИП выпаривали и пептид разводили с помощью 100 мМ Трис/НС1, рН 10,4 до концентрации 1 мкг/мкл. Этот маточный раствор разводили дополнительно с использованием растворителя для антител фирмы ТОС. Последующие иммобилизацию и идентификацию осуществляли согласно инструкциям производителя.

1.3. Рер8ро(™-анализ.

Специфичность и биологическую целостность антител к Αβ Ц3рЕ и супернатантов клеточных культур осуществляли с использованием технологии Рер8ро(™ фирмы 1РТ РерЬбе ТесЬпо1о§1е5 ОтЬН, Уо1тег51га55е 5 (ИТ2), 12489 Берлин, Германия.

Соответствующие мембраны для осуществления Рер8ро1™ получали от фирмы 1РТ. Принцип этого метода разработан и описан ранее у Кгатег и др., Се11 91, 1997, с. 799-809.

Для анализа мембраны блокировали в течение 2 ч с помощью ТВ8Т-М (10 мМ Трис-НС1, рН 7,5, 150 мМ ЦаС1, 0,005% Твин 20 + 5% обезжиренного молока) при комнатной температуре при осторожном встряхивании. Мембраны инкубировали в течение ночи при 4°С на качающейся платформе с супернатантами индивидуальных клеточных культур, разведенными равными объемами ТВ8Т-М. Для определения сигнала применяли вторичное антимышиное антитело, конъюгированное со щелочной фосфатазой, согласно стандартным процедурам.

1.4. Αнализ методом дот-блоттинга.

Осуществляли обычный протокол дот-блоттинга для получения информации о чувствительности антитела к Αβ Ц3рЕ и супернатантов клеточных культур к соответствующему нативному пептиду. Для этой цели пептид Αβ Ц3рЕ-40 в понижающихся концентрациях (1000-8 нг) наносили точками на небольшие кусочки нитроцеллюлозной мембраны и затем осуществляли экспериментальную процедуру, описанную для Рер8ро(™-мембран.

1.5. ДСН-ПΑΑГ.

Содержащие 12% ДСН полиакриламидные гели подготавливали согласно стандартным протоколам. 15 мкл супернатантов клеточных культур и 10 мкг биотинилированного антитела разделяли на 12% ДСН-полиакриламидном геле. Электрофорез осуществляли в течение 2 ч при постоянном напряжении 100 В.

1.6. В1АСОКЕ-анализ.

Пептид Αβ Ц3рЕ-40 (положительный контроль) и пептид Αβ Ц3Е-40 (отрицательный контроль) сшивали с чипом СМ5 фирмы В1асоге. Немодифицированные чипы применяли для определения контрольных значений. Оценивали ассоциацию и диссоциацию биотинилированного антитела, разведенного до концентрации от 20 до 1 мкг/мл растворителем фирмы ТОС, что позволяло далее определять соответствующее значение КО. Таким путем определяли также характеристики связывания супернатантов индивидуальных клеточных культур.

1.6.1. Αффинность Αβ Ц3рЕ-специфических антител клона 6-1-6 и 24-2-3.

Очищенное антитело клона 6-1-6 разводили в буфере НВ8-ЕР (фирма В1асоге) до 100, 50, 30, 20, 15, 10, 7, 4, 2, 1 нМ. Αффинность определяли с помощью системы В1асоге 3000 с использованием чипа СМ5, на котором иммобилизовывали ΑβрЕ3-40. Система работала при скорости потока 30 мкл/мин. Оцененные основные эффекты и неспецифическое связывание с поверхностью чипа корректировали путем вычитания сигнала в проточной ячейке 4, в которой иммобилизовывали Αβ рЕ3-40, и сигнала в незагруженной проточной ячейке 3. Αссоциацию (10 мин) определяли путем инъекции 300 мкл каждой концентрации. Диссоциацию определяли в течение 10 мин. Оставшиеся молекулы антитела удаляли путем инъекции 5 мкл 0,1 М НС1. Для каждой концентрации антитела оценивали ассоциацию и диссоциацию. Определение скорости ассоциации и диссоциации и константы диссоциации осуществляли путем глобального одновременного подбора фазы ассоциации и диссоциации для всех изученных концентраций антител с использованием модели ВЬгбеШ апа1у(е.

- 19 028427

1.7. Секвенирование вариабельных областей антител.

Культивирование клеток гибридом.

Клетки гибридом выращивали в среде Ό-ΜΕΜ (+ Ь-глутамин, + Να-пируват, 4,5 г/л глюкозы, фирма ОФсо), дополненной 15% РВ8, 1% ΜΕΜ-ΝΕΑ (заменимые аминокислоты, фирма ОФсо), 50 мкг/мл гентамицина (фирма ОФсо) и 50 мкМ β-меркаптоэтанолом, при 37°С и 5% СО₂. Пересев осуществляли после культивирования в течение 3-4 дней в зависимости от клеточной плотности. Клетки высевали в концентрации 0,5х10⁶ клеток/мл, расщепление имело место при клеточной плотности 2-5х10⁶ клеток/мл.

Синтез кДНК и обратная транскрипция.

Общую РНК выделяли из 2х10⁶ клеток согласно руководству к набору для выделения РНК №.1с1соδρίηΡΝΑ (фирма ΜαΛβι^-Να^βΙ). 100 нг РНК применяли для синтеза кДНК с использованием праймера олиго(дТ)₁₅ (фирма Рготеда) и обратной транскриптазы 8ирсг5спр1 III (фирма ΙηνίίΓΟβοη).

ПЦР-амплификация вариабельных областей тяжелых и легких цепей.

Вариабельные области тяжелых цепей амплифицировали на основе кДНК-матрицы с использованием высокоточной ДНК-полимеразы РЬикюп™ (фирма ΝΕ\ν ΕΝΟΕΑΝΏ ВюЬаЪк) с помощью праймера ΜΗ001 (в случае клонов 5-5-6 и 6-1-6) и ΜΗ002ϋ (клоны 17-4-3 и 24-2-3) в сочетании с праймерами ΜΗν1-12. Для амплификации вариабельных областей легких цепей применяли праймер МКС в сочетании с праймерами ΜΚν1-ΜΚν11. Последовательности праймеров представлены в табл. 1.

Клонирование ПЦР-продуктов в ρΙΕΤ1.2.

Вариабельные области тяжелых и легких цепей, амплифицированные с помощью ПЦР, клонировали в векторе р1ЕТ1.2/с тупым концом согласно протоколу для набора для ПЦР-клонирования С1опе1ЕТ™(фирма Регтейак). Для секвенирования использовали секвенирующие праймеры р1ЕТ1.2.

Таблица 1

Праймерные последовательности для ПЦР-амплификации вариабельных областей тяжелых и легких цепей

Название	Последовательность	5Е0 Ю ΝΟ
МКУ1	АТСААОТТСССТСТТАСОСТОТТССТОСТС	23
ΜΚΎ2	АТООА01УСАСАСАСАСТССТОУТАТСООТО	24
МКУЗ	АТОАОТОТССТСАСТСАООТССТООКОТТа	25
МКУ4	АТОАСОКССССТССТСАОЦ/ТТУТТСОМУ/ТСТТС	26
МКУ5	АТССАТТТЗУСАОСТОСАОАТТЗУТСАССТТС	27
МКУ6	ΑΤΟΑΟΟΤΚΟΥΥΤΟΥΤδΑΟΥΤΥ СТОКОВ	28
МКУ7	АТОООС\УТСААОАТООАОТСАСАКЗУ¥УС\УОС	29
МКУ8	АТОТООООАУСТКТТТУСММТТТТТСААТТО	30
МКУ9	АТООТКТССЗУСА5СТСАОТТССТТО	31
Μκνιο	АТСТАТАТАТСТТТСТТСТСТАТТТСТ	32
Μκνίΐ	АТООААОССССАОСТСАОСТТСТСТТСС	33
МКС	АСТССАТСОТСОСААСАТСО	34
МНУ1	АТОАААТССАССТСОООСАТ8ТТСТТС	35
МНУ2	АТОССАТООАОСТКТАТСАТ8УТСТТ	36
ΜΗνί	ΑΤΟΑΑΟΙΥΤΟΤΟΟΤΤΑΑΑΟΤΟΟΟΤΤΤΤΤ	37
МНУ4	АТОКАСТТТОООУТСАОСТТОКТТТ	38
МНУ5	АТОСАСТССАООСТСААТТТАСТТТТССТТ	39
МНУ6	АТООСТТОТСУТКОЗОСТКСТСТТСТОС	40
МНУ7	АТООЕ.АТСОАССКООКТСТТТМТСТТ	41
МНУ8	АТОАСАСТССТСАТТСТТТТОТО	42
МНУ9	АТСОМТТССОТСТООАМСТТОСТАТТССТС	43
МНУ10	АТОООСАОАСТТАСАТТСТСАТТССТО	44
МНУ11	АТОСАТТТТССОСТОАТТТТТТТТАТТО	45
МНУ12	АТОАТООТОТТААОТСТТСТОТАССТО	46
МНСС1	САСТОСАТАОАСАСАТООСОС	47
МНСО2Ь	САОТООАТАОАСТОАТООООО	48

1.8. Применение клона антитела 6-1-6 для осуществления ШрЕ-ЕЫ8А.

96-луночный планшет типа Μаx^8Ο^Ь (фирма №.тс) сенсибилизировали иммобилизованным антителом путем инкубации, используя 100 мкл на лунку (2 мкг/мл) антитела к Ав 4О8, разведенного в Ό-ЗФР, в течение ночи при 4°С. Планшет запечатывали. Раствор для сенсибилизации удаляли и поверхность планшета блокировали, используя по 200 мкл на лунку не содержащего белка блокатора для ЕЬ18А фирмы Р1ЕКСЕ (Рго1еш-1гее ЕЬ18А-В1оскег) (без Твин-20) в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем планшет отмывали 6 раз ТВ8+0,05 об.% Твин-20. Оставшийся раствор для отмывки удаляли, промокая планшет. Применяемый в качестве стандарта пептид АврЕ3-40 разводили с помощью не содержащего белка блокатора для ЕЬ18А фирмы Р1ЕКСЕ (с Твин-20) до концентрации 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125 пг/мл. По 100 мкл каждой концентрации и 100 мкл буфера для разведения (контроль) вносили в планшет с помощью пипетки. Планшет запечатывали и инкубировали при 4°С в течение 2 ч. Затем

- 20 028427 планшет отмывали 6 раз с помощью ТВ8 + 0,05 об.% Твин-20. Оставшийся раствор для отмывки удаляли, промокая планшет. В каждую лунку добавляли пипеткой по 100 мкл раствора конъюгата идентифицирующее антитело-фермент, который содержал 1 мкг/мл Ав Я3рЕ-специфического антитела (клон 6-16) и 2 мкг/мл конъюгата стрептавидин-ΗΚΡ (фирма 81дта), входящего в набор, включающий не содержащий белка блокатор для ЕЫ8А фирмы Р1ЕИСЕ (с Твин-20). Планшет запечатывали и инкубировали при 4°С в течение 1 ч. Затем планшет отмывали 6 раз с помощью ТВ8 + 0,05 об.% Твин-20. Оставшийся раствор для отмывки удаляли, промокая планшет. В каждую лунку вносили пипеткой по 100 мкл раствора субстрата 8игеВ1ие (КРЬ) и планшет инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин. Реакцию прекращали, добавляя в лунку по 100 мкл 1 М Η₂8Ο₄. Абсорбцию измеряли с помощью устройства ТЕСАЯ 8ипг18е при 450 нм с поправкой на абсорбцию при 540 нм.

1.9. Изучение перекрестной реактивности с помощью ЕЫ8А и резонанса поверхностного плазмона (8РИ).

ЕЫЗА.

96-луночный планшет типа Мах18ОгЬ (фирма Яипс) сенсибилизировали иммобилизованным антителом путем инкубации, используя по 100 мкл на лунку (2 мкг/мл) антитела к Ав 408, разведенного в ΌЗФР, в течение ночи при 4°С. Планшет запечатывали. Раствор для сенсибилизации удаляли и поверхность планшета блокировали, используя по 200 мкл на лунку не содержащего белка блокатора для ЕЫ8А фирмы Р1ЕИСЕ (без Твин -20) в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем планшет отмывали 6 раз ТВ8+0,05 об.% Твин-20. Оставшийся раствор для отмывки удаляли, промокая планшет. Применяемый в качестве стандарта пептид АврЕ3-40 и другие Λβ-пептиды (2-40, 3-40, 4-40, 1-42, 3-42 и рЕ11-40) разводили с помощью не содержащего белка блокатора для ЕЫ8А фирмы Р1ЕИСЕ (с Твин-20) до концентрации 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 пг/мл. По 100 мкл каждой концентрации и 100 мкл буфера для разведения (контроль) вносили в планшет с помощью пипетки. Планшет запечатывали и инкубировали при 4°С в течение 2 ч. Затем планшет отмывали 6 раз с помощью ТВ8 + 0,05 об.% Твин-20. Оставшийся раствор для отмывки удаляли, промокая планшет. В каждую лунку добавляли пипеткой по 100 мкл раствора конъюгата идентифицирующее антитело-фермент, который содержал 1 мкг/мл АвЯ3рЕ-специфического антитела (клон 6-1-6) и 2 мкг/мл конъюгата стрептавидин-НИР (фирма 8щта). входящего в набор, включающий не содержащий белка блокатор для ЕЫ8А фирмы Р1ЕИСЕ (с Твин-20). Планшет запечатывали и инкубировали при 4°С в течение 1 ч. Затем планшет отмывали 6 раз с помощью ТВ8 + 0,05 об.% Твин20. Оставшийся раствор для отмывки удаляли, промокая планшет. В каждую лунку вносили пипеткой 100 мкл раствора субстрата 8игеВ1ие (фирма КРЬ) и планшет инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин. Реакцию прекращали, добавляя в лунку по 100 мкл 1 М Η₂8Ο₄. Абсорбцию измеряли с помощью устройства ТЕСАЯ 8ипг18е при 450 нм с поправкой на абсорбцию при 540 нм.

8РИ.

Помимо изучения в отношении Ав различных видов оценивали также перекрестную реактивность с другим р01и-пептидом, который встречается в организме человека. Это осуществляли с помощью резонанса поверхностного плазмона. На поверхности СМ5-чипа иммобилизовывали следующие пептиды или их Ν-концевые области: МСР1, МСР2, большой гастрин, гонадолиберин, нейротензин, орексин А, фибронектин, коллаген типа 1 и ТИН. В качестве положительного контроля анализировали также связывание с АврЕ3-40. Антитело к Я3рЕ (клоны 6-1-6 и 24-2-3) разводили в НВ8-ЕР (фирма В1асоге) до концентрации 25 мкг/мл. Связывание исследовали с помощью системы В1асоге 3000 с использованием нескольких СМ5-чипов, на поверхности которых иммобилизовывали соответствующие пептиды (проточные ячейки 2, 3 и 4). Система работала прии скорости потока 20 мкл/мин. Оцененные основные эффекты и неспецифическое связывание с поверхностью чипа корректировали путем вычитания сигнала в проточных ячейках 2, 3 и 4, в которых иммобилизовывали тестируемый пептид, и сигнала в незагруженной проточной ячейке 1. Ассоциацию (9 мин) определяли путем инъекции 180 мкл антител клонов 6-1-6 и 242-3 соответственно. Диссоциацию определяли в течение 9 мин. Оставшиеся молекулы антитела удаляли путем инъекции 5 мкл 0,1 М НС1. Для каждого варианта взаимодействия антитела с различными пептидами оценивали ассоциацию и диссоциацию. Перекрестную реактивность определяли, оценивая фазу ассоциации с позиций скорости и концевого сигнала. Значения для всех р01и-пептидов сравнивали с сигналом, характерным для АврЕ3-40.

1.10. Оптимизация и валидация Я3рЕ-ЕЫ8А для анализа головного мозга.

Разработанный при создании настоящего изобретения метод анализа Я3рЕ-ЕЫ8А можно применять для определения концентрации АврЕ3-42 в головном мозге трансгенных мышей. В целом определяли содержание АврЕ3-42 индивидуально в полушарии и мозговом стволе. Головной мозг мышей гомогенизировали в 500 млк 2%-ного раствора ДСН с ингибитором протеаз с помощью гомогенизатора типа Ргесе11у (фирма Рес|1аЬ) с использованием керамических гранул. Суспензию гранул отбирали с помощью пипетки и переносили в центрифужную пробирку. Гранулы вновь отмывали с помощью 250 мкл 2%-ного раствора ДСН с ингибитором протеаз и раствор переносили в центрифужную пробирку. 750 мкг ДСНсуспензии головного мозга облучали ультразвуком на раскрошенном льду в течение 20 с. Образец центрифугировали в течение 1 ч при 4°С при 75000/д. Затем супернатант удаляли, разделяли на аликвоты и

- 21 028427 хранили до осуществления ЕЫ§А при -80°С. Оставшийся нерастворенный в ДСН дебрис смешивали с 150 мкл 70%-ной муравьиной кислоты и облучали ультразвуком на раскрошенном льду в течение 20 с. Немедленно после обработки ультразвуком раствор нейтрализовали с помощью 2850 мкл 1 М Трис, что соответствует старому методу, или 2850 мкл Е1А-буфера (ЗФР+10 мг/мл БСА + 0,05 % Твин-20) + 860 мкл 3,5 М Трис для нейтрализации, что соответствует новому методу. Фракции образцов, содержащие муравьиную кислоту, хранили до осуществления ЕЬРЗА при -80°С.

ЫЗрЕ-ЕШЗА осуществляли согласно следующему протоколу:

96-луночный планшет типа Мах18ОтЬ (фирма Νιιηο) сенсибилизировали иммобилизованным антителом путем инкубации, используя по 100 мкл на лунку (2 мкг/мл) антитела к Αβ 408, разведенного в ΌЗФР, в течение ночи при 4°С. Планшет запечатывали. Раствор для сенсибилизации удаляли и поверхность планшета блокировали, используя по 200 мкл на лунку не содержащего белка блокатора для ЕЬРЗА фирмы Р1ЕКСЕ (без Твин -20) в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем планшет отмывали 6 раз ΤΒδ+0,05 об.% Твин-20. Оставшийся раствор для отмывки удаляли, промокая планшет. Применяемый в качестве стандарта пептид ΑβрЕ3-42 разводили с помощью не содержащего белка блокатора для ЕЬ1§А фирмы Р1ЕКСЕ (с Твин-20) (старый метод) или Е1А-буфера (новый метод) до концентрации 1029,2,

514,6, 257,3, 128,65, 64,32, 31,16, 16,08 пг/мл. По 100 мкл каждой концентрации и 100 мкл буфера для разведения (контроль) вносили в планшет с помощью пипетки. Образцы с ДСН подвергали оттаиванию, разводили в соотношении 1:25 и 1:100 соответственно с использованием не содержащего белка блокатора для ЕЬ1§А фирмы Р1ЕКСЕ (с Твин-20) (старый метод) или Е1А-буфера (новый метод) и вносили с помощью пипетки в планшет для ЕЬРЗА. Образцы, содержащие муравьиную кислоту (старый метод: муравьиная кислота/Трис; новый метод: муравьиная кислота/Е1А-буфер/Трис), подвергали оттаиванию и вносили с помощью пипетки в неразбавленном виде в планшет для ЕЬРЗА. Планшет запечатывали и инкубировали при 4°С в течение 2 ч. Затем планшет отмывали 6 раз с помощью ΤΒδ + 0,05 об.% Твин-20. Оставшийся раствор для отмывки удаляли, промокая планшет. В каждую лунку добавляли пипеткой по 100 мкл раствора конъюгата идентифицирующее антитело-фермент, который содержал 1 мкг/мл ΑрβN3рЕ-специфического антитела (клон 6-1-6) и 2 мкг/мл конъюгата стрептавидин-НКР (фирма Зщта), входящего в набор, включающий не содержащий белка блокатор для ЕЬ1§А фирмы Р1ЕКСЕ (с Твин-20). Планшет запечатывали и инкубировали при 4°С в течение 1 ч. Затем планшет отмывали 6 раз с помощью ΤΒδ + 0,05 об.% Твин-20. Оставшийся раствор для отмывки удаляли, промокая планшет. В каждую лунку вносили пипеткой 100 мкл раствора субстрата διιΐΌΒ1ιιι; (фирма КРЬ) и планшет инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин. Реакцию прекращали, добавляя в лунку по 100 мкл 1 М Η₂δΟ₄. Абсорбцию измеряли с помощью устройства ΤЕСΑN διιηπδο при 450 нм с поправкой на абсорбцию при 540 нм.

1.11. Применение клонов антител к И3рЕ для иммуногистохимии.

Фиксированные формалином и залитые в парафин срезы человеческого головного мозга (кора) обрабатывали следующим образом.

1. Удаление парафина и регидратация срезов (прикрепленных к предметным стеклам):

а) инкубируют предметные стекла в НМоОсаг (агент для очистки) или ксилоле в течение 3 мин,

б) удаляют очищающий раствор,

в) инкубируют предметные стекла вновь в НМоОсаг или ксилоле в течение 3 мин,

г) инкубируют предметные стекла в НМоОсаг или ксилоле в соотношении 1:1 с 100% этаноле в течение 3 мин,

д) инкубируют предметные стекла в 100% этаноле в течение 3 мин, удаляют раствор,

е) инкубируют предметные стекла вновь в 100% этаноле в течение 3 мин,

ж) инкубируют предметные стекла в 95% этаноле в течение 3 мин,

з) инкубируют предметные стекла в 70% этаноле в течение 3 мин, и) инкубируют предметные стекла в 50% этаноле в течение 3 мин,

к) инкубируют предметные стекла в дистиллированной воде в течение 3 мин.

2. Гашение эндогенной пероксидазной активности.

Инкубируют предметные стекла в 99 мл метанола + 1 мл 30% пероксида водорода в течение 10 мин при комнатной температуре.

3. Отмывают предметные стекла водой: 2x5 мин.

4. Удаляют воду в индивидуальных предметных стеклах и помещают предметные стекла на подставку для предметных стекол в увлажняющей камере для предупреждения высыхания срезов. Наносят на срез 88%-ный раствор муравьиной кислоты при комнатной температуре в течение 10 мин в вытяжном шкафу. Смывают несколько раз водой и дают стряхнуться воде в заполненной водой чашке для окрашивания в течение 10 мин.

5. Блокируют в 10%-ном растворе лошадиной сыворотки в течение 20 мин при комнатной температуре.

6. Стряхивают (или отсасывают) блокирующий раствор и обрабатывают первичным антителом (антитело к У3рЕ, клон 6 или 24) в течение ночи при 4°С.

- 22 028427

7. Отмывают предметные стекла по отдельности ΤΒδ в течение 10 мин для того, чтобы избежать трения предметных стекол друг о друга.

8. Добавляют биотинилированное вторичное антитело (козье антимышиное антитело фирмы УесЮг БаЪогаЮпеЦ: 9 мл ΤΒδ, 1 мл козьей сыворотки, 45 мкл вторичного антитела). Инкубируют 30 мин при комнатной температуре.

9. Отмывают предметные стекла по отдельности в ΤΒδ в течение 10 мин для того, чтобы избежать трения предметных стекол друг о друга.

10. Добавляют АБС-раствор (10 мл ΤΒδ, 100 мкл лошадиной сыворотки, 90 мкл компонента А, 90 мкл компонента В). Инкубируют 30 мин при комнатной температуре.

11. Отмывают предметные стекла 50 мМ Трис: 2х 10 мин.

12. Цветная реакция: инкубируют среды с раствором ДАБ (диаминобензидин) (20 мг ДАБ фирмы δίβΐηα в 100 мл 50 мМ Трис, фильтруют и добавляют 33 мкл 33% пероксида водорода). Для выявления цветной реакции применяют микроскоп. Продукт реакции имеет коричневый цвет. Прекращают реакцию, помещая предметные стекла в чашки для окрашивания, содержащие воду.

13. Отмывают предметные стекла водой в течение 10 мин.

14. Осуществляют контрастное окрашивание гематоксилином, отмывают водой.

15. Дегидратация и очистка: осуществляют стадию 1 в обратном порядке (например, вода, этанолы различной крепости вплоть до 100%, НМосЕаг).

16. Покрывают пермаунтом (фирма ЕЦНег δс^еηι^Γ^с). Сушат предметные стекла на воздухе. Чистят предметные стекла бритвенным лезвием и этанолом.

2. Результаты.

2.1. Получение антител.

Выделяли 6 клонов, которые стабильно продуцируют антитела к пептиду рО1и-6166-БСА; клоны 18-12, 5-5-6, 6-1-6, 12-1-8, 17-4-3 и 24-2-3. Эти клоны подвергали дополнительной характеризации.

2.2. Определение требуемой концентрации антител.

Интенсивность сигналов в анализах ЕЫБА коррелирует не только с концентрацией анализируемого соединения/Αβ-варианта, но также в значительной степени зависит от концентрации применяемого антитела. Поскольку Αβ-варианты присутствуют в образцах сыворотки лишь в низких концентрациях, необходимо определять концентрации антител, которые могут выявлять низкие концентрации соответствующих вариантов Αβ. Поступающие в продажу наборы для Αβ-Ε^IδΑ характеризуются конкретным пределом обнаружения Αβ в диапазоне пикограммовых концентраций. На стандартных кривых наиболее высокая концентрация, как правило, составляет 500 пг/мл. Общая информация, касающаяся концентрации применяемого антитела, как правило, отсутствует в сводках данных/инструкциях по применению, однако исходя из дополнительной информации, которую можно почерпнуть из обычной литературы, можно предположить, что антитело применяют в концентрации 1 мкг/мл.

В первых сериях экспериментов не удалось выявить Αβ Ν3ρΕ-40 в концентрации 500 пг/мл с помощью соответствующего антитела к рО1и-6166 (клон 12-1), конъюгированного с биотином. Фактически требовались относительно высокие концентрации Αβ Н3рЕ (10 нг/мл) для получения сигнала при применении антитела в концентрации 1 мкг/мл (см. фиг. 1А: средний столбик). Интенсивность этого сигнала резко возрастала при повышении концентрации антитела до 10 мкг/мл (см. фиг. 1А: левый столбик). При применении антитела в концентрации вплоть до 20 мкг/мл интенсивность сигнала можно было дополнительно повышать (см. фиг. 1Б). При концентрации, превышающей указанную концентрацию, не удалось дополнительно увеличить интенсивность сигнала. Таким образом, антитело в концентрации 20 мкг/мл использовали для определения предела обнаружения для антитела к рО1и-6166.

2.3. Анализ методом дот-блоттинга.

Αβ ШрЕ-х-специфическое антитело к рО1и-6166 выбирали с помощью процесса скрининга, поскольку исходный клеточный клон (обозначенный как 12-1-8) характеризовался сильным связыванием с пептидом, применяемым для иммунизации, и очень низкой перекрестной реактивностью (см. табл. 2).

Таблица 2

Результаты скрининга, демонстрирующие уровень сигналов при ЕЫБА-анализах, которые были обнаружены в супернатантах нескольких клеточных клонов гибридом

Клон	ЮрЕ-БСА	ИзоИАЕ- БСА	ЫЗЕ-БСА	ΝΙΙΕ-БСА	N11 рЕ- БСА
1-8-12	1,787	0,012	0,142	0,011	0,005
5-5-6	1,649	0,015	0,126	0,004	0,006
6-1-6	1,377	0,013	0,125	0,007	0,014
12-1-8	2,123	0,005	0,009	0,001	0,005
17-4-3	1,915	0,007	0,320	0,003	0,004
24-2-3	1,768	0,014	0,218	0,003	0,002
Положительный контроль	1,824	1,227	1,596	1,243	1,346
Отрицательный контроль	0,045	0,005	0,008	0,001	0,003

- 23 028427

До настоящего времени в исследование не включали стадию скрининга с использованием полноразмерного нативного пептида Αβ Ν3ρΕ-40. Поэтому подвергали скринингу пул доступных клеточных клонов гибридом рО1и6166, экспрессирующих антитела, которые могли обладать более высокой аффинностью к нативному пептиду Αβ Ν3ρΕ-40.

Как видно из фиг. 2, удалось идентифицировать клеточные клоны, которые действительно обладали более высокой чувствительностью к полноразмерному пептиду Αβ Ν3ρΕ-40. В то время как антитело к рО1и-6166 (клон 12-1) могло обнаруживать только 1 мкг пептида, клоны 6-1-6 и 24-2-3 давали также сигналы при использовании пептида в количестве, составляющем всего лишь 8 нг. Следовательно клоны 61-6 и 24-2-3 оказались в 125 более чувствительными. При использовании этих клонов может оказаться возможным достигать предела обнаружения, составляющего 8 пг/мл пептида Αβ Ν3ρΕ-40 при применении соответствующего ΕυδΛ.

2.4. Ρеρδρоΐ-анализ.

Затем специфичность оценивали с помощью Ρеρδρоΐ-анализа с целью сравнения биоитинилированных Αβ ЮрЕ-х-специфических антител к ρΟ1ιι-6166 с клеточными клонами гибридом. В табл. 3 перечислены все пептиды, которым соответствовали пятна на Ρеρδρоΐ-мембране. Как видно из фиг. 3, клоны 6-1-6 и 24-2-3 антитела к ρΟ6166 не индуцировали более значительного перекрестного сигнала, чем клон 12-1 антитела к ρΟ6166. Все изученные клоны распознавали в наибольшей степени пятно № 6 пятно, специфическое для Αβ Ν3ρΕ-χ (ρΕΡΡΗΌ ..., т.е. δΕΟ ΙΌ NО: 12), далее в порядке снижения интенсивности сигнала следовали пятна № 5 (ΕΡΡΗΌ ... δΕΟ ΙΌ NО: 11) и № 7 (ΡΡΗΌ ..., δΕΟ ΙΌ NО: 13). Слабый сигнал обнаружен также для пятна № 4 (ΛΕΡΡΗ^ ..., δΕΟ ΙΌ NО: 10).

Таблица 3

Последовательности Αβ-пептидов, нанесенные в виде пятен на Ρеρδρоΐ™-мембраны (фирма ΙΡΤ ΡορΙίΗο ТссНпо1о§1С5 ОтЬН), и выявляемые клеточными клонами гибридом ρΟ1ιι-6166

ίΌ обозначает изо-А8ρ, изоаспартат. 2.5. Αнализ с помощью ДСН-ПΑΑГ.

Биологическую целостность антитела к Аβ-N3ρΕ и супернатантов клеточных культур гибридом грубо определяли с помощью анализа методом ДСН-ПΑΑГ (более подробно см. в разделе Материл и методы, выше).

Как видно из фиг. 4, все внесенные в гель образцы характеризовались отчетливыми полосами без пятен, что свидетельствует о целостности антитела к ρΟ1ιι-6166 (клон 12-1) и супернатантов клеточных клонов гибридом.

2.6. В1АСОКБ-анализ.

С помощью анализа метолом дот-блоттинга обнаружены существенные различия в чувствительности в отношении пептида Αβ Ν3ρΕ-40 супернатантов клеточных клонов гибридом по сравнению с биотинилированным антителом к ρΟ6166. Однако с помощью указанного метода оценивали только ко- 24 028427 нечный результат. С другой стороны, В1асоге-анализ позволяет осуществлять в зависимости от времени мониторинг связывания данного антитела. Для того, чтобы определить, является ли слабое связывания антитела к рО1и-6166 (клона 12-1) результатом низкой ассоциации с пептидом Αβ Н3рЕ-40, осуществляли В1асоге-анализ, описанный выше в разделе Материл и методы.

Мониторинг процесса связывания антитела к рО1и-6166 при его применении в возрастающих концентрациях позволил рассчитать значение КО, составляющее 30 нМ. Сравнение супернатанта клеточного клона гибридомы 12-1 с супернатантом клеточного клона гибридомы 6-1-6 продемонстрировало значительные различия в характеристиках связывания. Αссоциация клона 6-1-6 оказалась примерно в 5 раз выше по сравнению с уровнем, обнаруженным для клона 12-1. Однако более значительные различия обнаружены в характеристиках диссоциации. В то время как для клона 6-1-6 характерно затрудненное отделение посредством диссоциации от пептида Αβ И3рЕ-40, клон 12-1 легко отмывался в течение нескольких минут. Таким образом, слабое связывание клона 12-1 с большой вероятностью является результатом обнаруженной офф-скорости (скорость диссоциации). Это предположение дополнительно подтверждено данными, полученными для клона 24-3-2, для которого получены наиболее предпочтительные результаты при анализе методом дот-блоттинга, демонстрирующие очень слабую ассоциацию с пептидом Αβ И3рЕ-40, но в отличие от клона 12-1, выявлено отсутствие заметной скорости диссоциации (см. фиг. 5).

2.6.1. Αффинность Αβ ШрЕ-специфического антитела клона 6-1-6 и клона 24-2-3.

Для клона 6-1-6 антитела к И3рЕ рассчитывали скорость ассоциации, скорость диссоциации и константу диссоциации путем глобального подбора всех сенсограмм, представленных на фиг. 6.

Установлено, что значение скорости ассоциации составляет 1,67х10⁵ М^-1-с^-1, скорость диссоциации составляет 2,63х 10^-4 с^-1, константа диссоциации составляет 1,57 нМ.

Для клона 24-2-3 антитела к Н3рЕ значения скорости ассоциации, скорости диссоциации и константы диссоциации, рассчитанные путем глобального подбора всех сенсограмм, представлены на фиг. 7.

Установлено, что значение скорости ассоциации составляет 3,25х10³ М^-1-с^-1, скорость диссоциации составляет 3,29х 10^-4 с^-1, константа диссоциации составляет 101 нМ.

2.7. Секвенирование вариабельных областей антител.

Идентифицированы следующие последовательности.

2.7.1. Клон 5-5-6.

Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи (8ЕЦ ГО N0: 49) АТССТОТССТСАОСТСАОТТССТСТТТСТОТТАОТОСТСТСОАТТСАООАААССААСООТ ОАТСТТСТСАТСАСССАСАСТССАСТСАСТТТСТСООТТАССАТТООАСААССАОССТСТ АТСТСТТССААСТСААСТСАОАОССТСТТАТАТАСТСАТООАААААССТАТТТОААТТСО ТТАТТАСАСАССССАССССАСТСТССААТСССССТААТСТАТСТОСТСТСТАААСТаСАС ТСТСОАСТСССТСАСАООТТСАСТООСАОТСОАТСАООААСАОАТТТТАСАСТОААААТС АССАСАСТСОАОССТаАСОАТТТСССАОТТТАТТАСТОСОТОСААОаТАСАСАТТТТССА ТТСАСОТТСОССТСаССОАСАААОТТООАААТААААССОССТСАТССТССАССААСТСТА ТССАТСТТСССАССАТ

Белковая последовательность вариабельной области легкой цепи (8ЕЦ ГО N0: 50)

Μν55Α9ΡΤΡΕΕνΕν/ΐ9ΕΤΝαθννΜΤ(3ΤΡΕΤΕ5νΤ16<3ΡΑ5Ι$(:Κ55(351ΧΥ5θαΚΤΥΤΝ4ν

ЕЬ<ЗКРО<35РМКиУЬУЗКЬР5ОУРРКРТГО5О5ОТОГТ1К15КУЕАЕОЕОУУУСУ(}аТНРР

РТРСЗСТКЬЕ1ККАОААРТУ81РРР

Нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (8ЕЦ ГО N0: 51) АТСССАТССАССССССТСТТТСТСТТССТССТОТСАСОА АСТОСАССТСТССАСТСТСАС ОТССАОСТССААСАСТСТОСАССТОАССТСОТОААОССТОСАССТТСААТСААОАТАТСС ТССААСССТТСТССТТАСТСАТТСАСТОССТАТАССАТСААСТССОТСААССАОАСССАТ ССАААСААССТТОАСТООАТТОСАСТТАТТААТССТТАСАСТССТОТТАСТАОСТАСААС САСАААТТСААСООСААСОССАСАТТААТТСТАОАСААСТСАТССАОСАСАОССТАСАТС САССТССТСАСТСТСАСАТСТСАООАСТСТССАОТСТАТТАТТСТАСААСАСАСССТААА СОСОАСТОСОАСОАС АСТТАСТООООССААОООАСТСТООТСАСТОТСТСТОСАОССААА АССАСАСССССАТСТОТСТА

Белковая последовательность вариабельной области тяжелой цепи (8ЕЦ ГО N0: 52)

Μ0’ίνε0νΡΕΡΕΕ50ΤΑ0νΗ5Εν(3Ε(3<350ΡΕΕνΚΡ0ΑδΜΚΙ8εΚ.Α80Υ5ΡΤ0ΥΤΜΝ^,\ννΚς>3Η ΟΚΝΕΕν/Ι0Ε1ΝΡΥ30νΤΚΥΝ()ΚΡΚαΚΑΤΡΐνθΚ55δΤΑΥΜΕΕΕ3ΕΤ3ΕΟ5ΑνΥΥΟΤΙ<ΕΑΚ К.Е1УОЕТУ\УСОСТЬУТУ8ААКТТРР8 V

2.7.2. Клон 6-1-6.

Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи (8ЕЦ ГО N0: 53)

- 25 028427

АТООТОТССАСАОСТСАОТТССТОТТТСТОТТАОТОСТСТООАТТСАООАААССААСООТ О АТОТТОТОАТОАСССАОАСТССАСТСАСТТТОТСООТТАССАТ ТООАСААССАОССТСТ атстсттосааотсааотсаоассстсттататаотоасооааааасстатттоааттоо

ТТАТТАСАСАООССАСОССАСТСТССААТССОССТААТСТАТСТСОТСТСТАААСТаСАС тетоалстссстсАСАООТТСАСТООСАОТООАТСАООААСАОАТТТТАСАСТОААААТС АССАОАСТООАООСТОАООАТТТОСОАСТТТАТТАСТСССТССААССТАСАСАТТТТССА ТТСАСОТТСОасТССвОСАСАААСТТОСАААТААААСОСОСТОАТОСТаСАССЛАСТОТА ТССАТСТТСССАССАТССАО

Белковая последовательность вариабельной области легкой цепи (8Е0 ГО NО: 54)

Μν5ΤΑ()ΡυΡΕΕνΕν/Ι(3ΕΤΝΟθννΜΤρτΡίΤΕ5νΤΙΟ<3ΡΑ5Ι5(:Κ55ς>5ί.ΙΑ5θαΚ.ΤΥΕΝ'λ^ί

ΕΕφΚΡ0<35ΡΜΚΕΙΥΕν5ΚΕ05ανΡ0ΚΡΤ05050Τ0ΠΈΚ15ΚνΕΑΕ0Ε0νΥγ(;νρ0ΤΗΡΡ

ΡΤΡΟ8ΟΤΚΕΕ1ΚΚΑΟΑΑΡΤν51ΡΡΡ5

Нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (8Е0 ГО NО: 55) АТОООАТСОАОССОСОТСТТТАТСТТССТССТОТСАООААСТССАОСТОТССАСТСТОАООТ ССАОСТОСААСАОТСТСОАССТОАОСТООТОААОССТОаАОСТТСААТОААОАТАТССТССА АСОСТТСТОСТТАСТСАТТСАСТООСТАСАССАТОААСТСОСТСААОСАОАОССАТСОАААО ААССТТОАСТОаАТТООАСТТАТТААТССТТАСААТООТаТТАСТАСОТАСААССАОААОТТ СААОООСААООССАСАТТААТТОТАОАСААОТСАТССАОСАСАОССТАСАТООАОСТССТС АОТСТОАСАТСТОАСаАСТСТаСАСТСТАТТАСТСТАСААОАОАОССТАААССООАСТаас АСОАОАСТТАСТООООССААОООАСТСТйОТСАСТОТСТСТОСАОССААААСОАСАССССС АТСТСТСТАТССАСТС

Белковая последовательность вариабельной области тяжелой цепи (§ЕО ГО NО: 56)

МО'А/5О7Р1РЕЕ5ОТАСУН8ЕУ<ЗИ305ОРЕЕУКРСА5МК.15СКА8ОУ8РТ0УТММ1УУК(38Н ΟΚΝΕΕ ν/ΙΰΕΙΝΡΥΝανΤϋΥΝ0ΚΡΚαΚΑΤΕΐνθΚδ55ΤΑΥΜΕΕΕ5ΕΤ5ΕΟ8ΑνΥΥΟΤΚΕΑΚ ΚΕ\Υ0ΕΤΥνν090ΤΕντν5ΑΑΚΤΤΡΡ5νΥΡΕ

2.7.3. Клон 17-4-3.

Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи (8Е0 ГО NО: 57) АТОААОТТОССТОТТАООСТатТООТОСТООТСТТСТООАТТССТОТТТССАОСАОТОАТОТТ ОТОАТОАСССАОАСТССАСТСТСССТСССТСТСАСТСТТОСАОАТСААОССТССАТСТСТТСС АОАТСТАОТСАОАОССТТОТАСАСАОТОАТООАААСАССТАТТТАСАТТООТАССТОСАОАА СССАОСССАОТСТССАААССТССТОАТСТАСАААОТТТССААССОАТТТТСТООСОТСССАО асаооттсаотоосаотооатсаоооасаоатттсасастсааоатсассаоаотосаосс ТСАСОАТСТСаОАОТТТАТТТСТССТСТСАААСТАСАСАТОТТССТССОАСОТТСОаТООАО осассааостооааатсааасооостсатостссассаастотатссатсттсссассатсс ЛОТ

Белковая последовательность вариабельной области легкой цепи (8Е0 ГО NО: 58)

ΜΚΕΡνΚΕΕνΕνΡ\νΐΡν585ΠννΜΤ9ΤΡΕ5ΕΡν8Ε0η9Α5Ι8εΚ8508ΕνΗ5ΟΟΝΤΥΕΗ\νΥ

Ε(2ΚΡΟ98ΡΚΕΕΙΥΚν3ΝΚΡ5θνΡϋΚΡ3ΟδΟ5ΟΤΟΡΤΕΚΙ3Κ.νΕΑΕΟΕθνΥΡ08()8ΤΗνΡΡ

ТРСССТКЕЕ1ККАОААРТУ51РРР55

Нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (8Е0 ГО NО: 59) атооастттссостсассттасттатттттотссттаттттааааостотссаототоао ОТСААССТаСТСОАСТСТСООСОАСССТТАСТОСАСССТССАСССТСССССАААСТСТСС тотосаосстстссаттсастттсаотоастассоаатоосотосоттсоасаосстсса ОаОААООООССТОАОТООСТАОСАТТСАТТАОТААТТТСОСАТАТАОТАТСТАСТАТОСА сасастотоассосссоаттсассатстстасаоаоаатоссаасаасассстстассто оааатоассаотстоасотстсассасасасссатстастастстссаасотатоастас оатаататсттссастатоттатооастастоооотсааооаасстсаотсассстстсс тсаоссаааасаасасссссатсастстатссасто

Белковая последовательность вариабельной области тяжелой цепи (8Е0 ГО NО: 60)

- 26 028427

Μ0ΡΟί5ίΙ,]ΡνΕΙΕΚΌν(ϊ€ΕνΚ.ΕνΕ50Ο0Εν(2Ρ003Κ.ΚΕ50ΑΑ£ΟΡΤΡ80Υ0ΜΑ\ννΚ(3ΑΡ

ΟΚαΡΕ\ννΑΡΙ5ΝΕΑΥ8ΙΥΥΑΟΤνΤΟΚΡΤΓ5ΚΕΝΑΚΝΤΕΥΕΕΜ58ΕΚ8ΕΟΤΑΜΥΥΟΑΗΥΟΥ

ΟΝΙΕΟΥνΜΟΥ\νθ<3αΤ3νΤν58ΑΚΤΤΡΡ5νΥΡΕ

2.7.4. Клон 24-2-3.

Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи (δΕΟ ГО ΝΟ: 61) АТСААСТТОССТаТТАСОСТСТТССТОСТСТаСАТТСАССЛААССААСОСТОАТСТТатаСТ САСССАСАСТССАСТСАСТТТОТСООТТАССАТТООАСААССАОССТСТАТСТСТТССААСТС ААСТСАСАСССТСТТАТАТАОТААТООАААААССТАТТТОААТТООТТАТТАСАОАСОССАО СССАСТСТССАААСССССТААТСТАТСТСОТОТСТАААСТООАСТСТСОАСТСССТаАСАСС ТТСАСТСССАСТООАТСАССААСАОАТТТТАСАСТОААААТСАОСАСАСТООАООСТОАСС АТТТОООАСТТТАТТАТТОССТССААССТАСАСАТ'ГТТССАТТСАССТТССССТССОООАСА ААОТТООАААТААААСОООСТОАТОСТССАССААСТОТАТССАТСТТСССАССАТССАСТ

Белковая последовательность вариабельной области легкой цепи (δΕΟ ГО ΝΟ: 62)

МКЕРУК.ЕкУЕ'У ΙΟΕΤΚΟθννΕΤζ>ΤΡΕΤί8 УТЮрРАЗ [8ΓΚ58(38ΕΕΥ8ΝΟΚΤΥΕΜ ЬЕС)

ΚΡ045ΡΚΚ.Ε[Υνν5Κ.Ε05<3νΡΟΚ.ΡΤα5050Τ0ΡΤΕΚΙ&ΙίνΕΑΕ0ί,0νΥΥ<:ν(}0ΤΗΡΡΡΤΡ

О5ОТКЬЕ1ККАОААРТУ51РРР53

Нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (δΕΟ ГО ΝΟ: 63)

АТСООАТООАОСООООТСТТТСТСТТССТССТОТСАСТААСТОААООТОТССАСТСССАООТТСАССТС

САОСАОТСТООООСТОАОСТООТОАСОССТОООТССТСАОТОААОАТТТССТОСААООСТТСТООСТА

ТАТАТТСААТААСТАСТССАТАААСТСОСТСААССАСАОСССТОСТСАОССТСТТОАСТССАТТССАС

А«АТ1ТАТССТОСАОАТаСТОАТАСТААСТАСААТСООААОТТСААОООТАААОССАСАСТОАСТОСА оасааатсстссаослсаосстасатосасстсассаосстаасатстоаосастстссоотстатгт

СТОТаСААОАСАОССАТАТАТТСТТТАТТСОООССААООСАСТСТаОТСАСТОТСТСТОСАОССАААА

СОАСАСССССАТСТСТСТАТССАСТО

Белковая последовательность вариабельной области тяжелой цепи (δΕΟ ГО ΝΟ: 64)

Μθν/5θνΡΕΡΕΕ5νΤΕθνΗ5ί}ν<2ΙΛ}<55αΑΕΕνΚΡ055νΚΙ50ΚΑ5αΥΙΓΝΪ'! ΥλνίΝν/νΚφΚΡ ας>αΕΕ\ν[0ς>1ΥΡ00α0ΤΝΥΝαΚΡΚ0ΚΑΤΕΤΑ0Κ558ΤΑΥΜφΕ58ΕΤ5Ε03ΑνΥΓ0Αί4ΕαΥ ΐνΥ\νθΐ?ΟΤΕντν5ΑΑΚΤΤΡΡ3 νΥΡί

2.8. Применение клона 6-1-6 антитела для осуществления N3ρΕ-Ε^IδΛ.

Оценивали конечный протокол N3ρΕ-Ε^IδΛ в отношении предела количественного определения (ТОО) и отношение сигнала к шуму (δ/Ν). Стандартная кривая для Ε^IδΛ представлена на фиг. 8.

Форма стандартной кривой очень хорошо соответствует экспериментальным точкам прежде всего в диапазоне низких концентраций и свидетельствует о практически линейной зависимости абсорбции. На основе этой стандартной кривой установлено, что ЪОО составляет 3,125 пг/мл при этом δ/Ν = 1,3.

2.9. Исследование перекрестной реактивности с помощью анализов Ε^IδΛ и 8РК.

ΕΟδΑ

Перекрестную реактивность с другими вариантами Ав определяли с помощью разработанного при создании изобретения N3ρΕ-Ε^IδΛ. Необработанные данные представлены в табл. 4.

Таблица 4

Необработанные данные, полученные с помощью N3ρΕ-Ε^IδΛ, с использованием клона 6-1-6: оценка перекрестной реактивности

конце игр ация(пг/мл)	рЕЗ-40 (28.04.)	рЕЗ-40(21.04.)	2-40	3-40	4-40	1-42	3-42	рЕ1140
эоо	1,8280	1,806	0,048	0,090	0,055	0,053	0,052	0,047
400	0,8750	0,912	0,045	0,065	0.044	0,048	0,052	0,044
200	0,4350	0.484	0.044	0.057	0.046	0,048	0,049	0,048
100	0,2290	0,248	0,045	0,052	0.045	0,047	0,050	0,048
50	0,1330	0,143	0,044	0,048	0,044	0,050	0,045	0,045
25	0,0820	0,086	0,044	0,046	0,044	0,048	0,047	0,048
12,5	0,0570	0.063	0,039	0,042	0,040	0,043	0.042	0,046
0	0,0410	0,040	0,038	0,065	0,061	0,059	0,063	0,066

Зависимость абсорбции от концентрации была обнаружена только для АврЕ3-40. Для всех изученных вариантов Ав за исключением Ав3-40 обнаружена перекрестная реактивность ниже 1%. Сигнал (скорректированный относительно контроля), полученный для концентрации 800 пг/мл, составлял примерно 2,7% от сигнала, характерного для АврЕ3-40. Это является очень хорошим результатом с учетом того, что Ν-конец обоих пептидов имеет одинаковые аминокислоты за исключением первой аминокислоты, она является циклизованной в случае АврЕ3-40. В целом установлено, что Ав N3ρΕ-специфическое антитело (клон 6), которое создавали для применения в Ε^IδΛ. обладает очень высокой специфичностью

- 27 028427 в отношении Ν-конца Αβ-пептидов, начинающегося с рО1и в положении 3.

8РК.

Перекрестную реактивность клонов б-1-б и 24-2-3 с другими №^β рО1и-пептидами анализировали с помощью резонанса поверхностного плазмона. Вместо ΑβрЕ3-40, для которого обнаружена типичная сенсограмма связывания, для всех изученных пептидов рО1и не было обнаружено практически никакого взаимодействия с клонами б-1-б и 24-2-3 соответственно (см. также фиг. 9 (представлены данные только для клона б-1-б). Сенсограммы для пептидов рО1и сравнивали с сенсограммой для ΑβрЕ3-40. Установленная перекрестная реактивность во всех случаях составляли менее 1%. Обобщенные данные для всех проанализированных пептидов представлены в табл. 5.

Таблица 5

Установленная перекрестная реактивность клонов б-1-б и 24-2-3 с другими пептидами рО1и

Пептиды ρΟΙυ	перекрестная реактивность (%)
МСР-1	<1
МСР-2	<1
«Большой гастрин»	<1
гонадолиберин	<1
нейротензин	<1
орексин А	<1
фибронектин	<1
коллаген 1	<1
ТЕ.Н	<1

Все эксперименты подтвердили тот факт, что клоны б-1-б и 24-2-3 антитела к И3рЕ являются специфическими в отношении Ν-концевого эпитопа ΑβрЕ3-х. Ими не распознавались ни другие рО1и-Иконцы, ни другие варианты Αβ-пептида, которые не несли на Ν-конце остаток рЕ.

2.10. Оптимизация и валидация Л3рЕ-ЕЕ18А для анализа головного мозга.

Анализировали концентрацию ΑβрЕ3-42 в мозговом стволе мышей в зависимости от применяемого метода. Образцы получали из организма трансгенных мышей (1§), у которых в головном мозге происходит сверхэкспрессия человеческого А(1О3-42, который циклизуется с помощью ОС с образованием ΑβрЕ3-42. Осуществляли сравнение образцов из гетерозиготных трансгенных мышей (1§ Ье1) и гомозиготных трансгенных мышей (1§ Ьот) и из нетрансгенных мышей дикого типа (^ί). Для получения образцов использовали мышей, которых создавали согласно методу, описанному в \УО 2009034158.

Во всех дополнительных экспериментах образцы и стандарты разводили в Е1А-буфере. На следующей стадии оптимизировали метод нейтрализации для анализа фракции образцов в муравьиной кислоте, т.е. нейтрализацию осуществляли согласно Л3рЕ-Еи8А. Разработанный при создании настоящего изобретения метод Л3рЕ-Еи8А давал хорошие результаты, он позволял выявлять значительные уровни человеческого ΑβрЕ3-42 в головном мозге мышей линии 1д Ьот, существенно более низкие уровни человеческого ΑβрЕ3-42 в головном мозге мышей линии 1д Ье1 и отсутствие человеческого ΑβрЕ3-42 в головном мозге Μ-мышей (см. фиг. 10).

При осуществлении ЕЫ8А, предлагаемого в настоящем изобретении, получают сигналы высокого уровня и в результате очень хорошее значение ЬОО, и поэтому этот метод можно применять для анализа образцов, находящихся в муравьиной кислоте, прежде всего образцов головного мозга, находящихся в муравьиной кислоте.

2.11. Применение клонов антител к Л3рЕ для иммуногистохимии.

С помощью антител к Л3рЕ, предлагаемых в настоящем изобретении, окрашивали ΑβрЕ3-хв срезах головного мозга пациентов, страдающих поздней стадией спорадической болезни Альцгеймера (8АО) и семейными деменциями альцгеймеровского типа (РАО), т.е. пациентов, которые имели мутацию в гене пресенилина 1 (Р§1). Окрашенные срезы головного мозга представлены на фиг. 11. Из фиг. 11 видно, что антитела к Л3рЕ, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять для иммуногистохимии. Антитела специфически идентифицируют ρОIи-Αβ в головном мозге страдающих §АО и РАО пациентов. Для антител к Л3рЕ не обнаружены фоновые сигналы на изображениях, что свидетельствует о специфическом связывании, что продемонстрировано с помощью анализов ЕЫ8А и §РК

Депонирование.

Создавали моноклональные антитела, специфически распознающие Αβ Л3рЕ-х. В настоящее время все клеточные линии гибридомы 5-5-б, б-1-б, 17-4-3 и 24-2-3, экспрессирующие моноклональные антитела, депонированы согласно Будапештскому договору и находятся в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (О8М2), Брауншвейг, Германия, дата депонирования 17 июля 2008 г., под соответствующими регистрационными номерами

- 28 028427 (клон 5-5-6) (клон 6-1-6) (клон 17-4-3) (клон 24-2-3) ϋδΜ АСС2923 ПЗМ АСС2924 ОЗМ АСС2925 ϋ8Μ АСС2926.

Можно подтверждать специфичность указанных антител в отношении соответствующих им последовательностей-мишеней. Для Αβ Ν3ρΕ-χ идентифицированы обладающие высокой аффинностью клоны антител, которые дают сильные сигналы при осуществлении ЕЫ8А с ожидаемым уровнем обнаружения в диапазоне низких пикограммовых концентраций.

Заключение.

Основной задачей настоящего изобретения является разработка высокочувствительного и робастного способа, который позволяет осуществлять количественное определение вариантов Αβ в биологических образцах.

Предпочтительно предложен способ на основе ЕЫ8А. Решение задачи начинали с применения Αβ Ν3ρΕ-ΕυδΆ, поскольку система ЕЫ8А для этого варианта Αβ уже поступает в продажу (фирма ГВЬ). Эту систему применяли в качестве эталона и внутреннего контроля качества.

Исследовали применимость антитела к рО1и-6166 для осуществления выбранного анализа ЕЫ8А. Для получения четко измеряемых сигналов необходимо применять антитела в высоких концентрациях (20 мкг/мл). Удалось идентифицировать клоны антител, обладающих высокой аффинностью к Αβ Ν3ρΕх. При использовании этих клонов может быть достигнут предел обнаружения, расположенный в диапазоне низких пикограммовых концентраций (3-8 пг/мл).

- 29 028427

Перечень последовательностей

- 30 028427

- 33 028427 <400> 11

С1и РЬе Агд Нхз Азр	Зег	С1у	Туг	С1и	Уа1 10	НХЗ	НХЗ	С1п
1	5
<210>	12
<211>	13
<212>	РРТ
<213>	Ното	зархепз
<220>
<221>	М13С_	_ГЕАТОРЕ
<222>	(1) . ·	• (1)
<223>	пироглутамат
<400>	12
С1и РЬе	·. Агд	Нхз Азр	Зег	С1у	Туг	61и	\7а1	Нхз	Нхз	С1п
1		5					10

<210>	13
<211>	13
<212>	РРТ
<213>	Ното	зархепз
<400>	13
РЬе Агд	Нхз	Азр Зег С1у Туг С1и Уа1	Нхз Нхз 61п Ьуз
1		5	10

<210>	14
<211>	13
<212>	РРТ
<213>	Ното	зархепз
<400>	14
С1у Туг	С1и	Уа1 Нхз Нхз	С1п Ьуз Ьеи Уа1 РЬе РЬе А1а
1		5	10

<210> 15 <211> 13

- 34 028427

- 35 028427 <223> изоаспартат <400> 18

Азр А1а С1и РЪе Агд НЬз Азр Зег С1у Туг С1и Уа1 Шз
1	5	10

<210>	19
<211>	13
<212>	РЕТ
<213>	Нолю зарЬепз

<220>
<221>	М13С_ЕЕАТиЕЕ
<222>	(1)..(1)
<223>	изоаспартат
<4 0 0>	19
Азр Зег	61у Туг С1и Уа1	НЬз Ηί3 С1п Ьуз Ьеи Уа1 РЪе
1	5	10

<210>	20
<211>	13
<212>	РЕТ
<213>	Ното	зарЬепз
<400>	20
Ьеи \7а1	РЪе	РЪе А1а С1и Азр Уа1	С1у Зег Азп Ьуз С1у
1		5	10

<210>	21
<211>	13
<212>	РЕТ
<213>	Ното	зарЬепз
<400>	21
61у Зег	' Азп	Ьуз С1у А1а	Не 11е 61у Ьеи МеЪ Уа1 61у
1		5	10

- 36 028427

<210>	22
<211>	11
<212>	РКТ
<213>	Ното
<4 0 0>	22

А1а Не 11е С1у Ьеи МеЬ \7а1 С1у 61у Уа1 Уа1 1 5 10 <210> 23 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР-праймер <400> 23 аЬдаадЕРдс сЬдЕЕаддсР дЬРддРдсЬд 30 <210> 24 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР-праймер <400> 24 аЬддадмсад асасасЬссЬ. дуРаРдддЬд 30 <210> 25 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР-праймер <400> 25 аЬдадЬдРдс ЬсасЬсаддЬ ссЬддздЬЬд 30

- 37 028427 <210> 26 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР-праймер <400> 26 аРдаддгссс сРдсРсадмР РуРРддтмРс РРд 33 <210> 27 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР-праймер <400> 27 аРддаРРРмс аддрдсадар РмРсадсРРс 30 <210> 28 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР-праймер <400> 28 ардаддрксу урдурзадур усРдгдд 27

<210>	29
<211>	31
<212>	днк
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	ПЦР-праймер

- 38 028427 <400> 29 абдддсмбса адабддадбс асакмуусид д 31 <210> 30 <211> 31 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР-праймер <400> 30 абдбддддау сбкбббустт 1:1:1:6103361 д 31 <210> 31 <211> 25 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР-праймер <400> 31 абддбгбссм сазсбсадбб ссббд 25 <210> 32 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР-праймер <400> 32 абдбабабаб дбббдббдбс бабббсб 27 <210> 33 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

- 39 028427 <223> ПЦР-праймер <400> 33 аЪддаадссс садсбсадсЪ РсТсЬЪсс 28 <210> 34 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР-праймер <400> 34 асбдда-ЬддР дддаадабдд 20 <210> 35 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР-праймер <400> 35 аЪдаааЕдса дсЕддддсаЕ зЕЕсЪЕс 27 <210> 36 <211> 26 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР-праймер <400> 36 аРдддаЪдда дсЪгРаЪсаЪ зуЪсЬЪ 26 <210> 37 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность

- 40 028427 <220>

<223> ПЦР-праймер <400> 37 ардаадмрдр ддРРааасРд ддРРРРР 27 <210> 38 <211> 25 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР-праймер <400> 38 аРдгасРРРд ддуЕсадсРР дгРРР 25 <210> 39 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР-праймер <400> 39 аЪддасЕсса ддсРсааРРР ад+ЕЕЕссЕЕ 30 <210> 40 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР-праймер <400> 40 а^ддсРЕдЕс уРгдздсРгс РсРРсЕдс 28 <210> 41 <211> 26

- 41 028427 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР-праймер <400> 41 абддгабдда дскддгбсбб бтбсбб 26 <210> 42 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР-праймер <4 0 0>

абдададбдс бдаббсбббб дбд <210> 43 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР-праймер <400> 43 абддтббддд бдбддатсбб дсбаббссбд 30 <210> 44 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР-праймер <400>

абдддсадас ббасаббсбс аббссбд

- 42 028427 <210> 45 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР-праймер <400> 45 аРддаРРРРд ддсРдаРРРР РРРРаРРд 28 <210> 46 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР-праймер <400> 46 аРдаРддРдР РаадРсРРсР дРассРд 27 <210> 47 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР-праймер <400> 47 садРддаРад асадаРдддд д 21 <210> 48 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР-праймер <400> 48 садРддаРад асРдаРдддд д 21

- 43 028427

<210>	49
<211>	436
<212>	ДНК
<213>	Миз

<400> 49
аЪддЪдЪссЬ	садсЪсадЬЪ	ссЪдЪЪЪсЬд	ЫадЪдсЬсЪ	ддаЬЪсадда	аассаасддЪ	60
даЪдЫдЪда	Ъдасссадас	ЬссасЬсасЬ	ЪЪдЬсддЪЪа	ссаЬЪддаса	ассадссЬсЪ	120
аЬсЪсЪЪдса	адЬсаадЪса	дадссЬсЪЪа	ЪаЪадЪдаЪд	дааааассЪа	ЬЪЪдааЪЬдд	180
ЬЪаЬЬасада	ддссаддсса	дЬсЪссааЪд	сдссЪааЪсЪ	аЪсЪддЪдЪс	ЬааасЬддас	240
ЬсЪддадЪсс	сЪдасаддЪЪ	сасЪддсадЪ	ддаЪсаддаа	садаЫПас	асЪдааааЪс	300
адсададЪдд	аддсЬдадда	ЪЪЪдддадЫ;	ЪаЬЪасЬдсд	ЪдсааддЪас	асаНЬЬсса	360
ЫсасдЬЪсд	дсЪсддддас	ааадЬЪддаа	аЬаааасддд	сЬдаЪдсЪдс	ассаасЪдЪа	420
ЬссаЬсЪЪсс	сассаЪ					436

<210>	50
<211>	145
<212>	РЕТ
<213>	Миз

<400> 50

МеЬ Уа1 Зег Зег А1а С1п РЪе Ьеи РЪе Ьеи Ьеи Уа1 Ьеи Тгр Не С1п 15 10 15

С1и ТЪг Азп С1у Азр Уа1 Уа1 МеЪ ТЪг С1п ТЪг Рго Ьеи ТЪг Ьеи Зег 20 25 30

Уа1 ТЪг 11е С1у С1п Рго А1а Зег 11е Зег Суз Ьуз Зег Зег С1п Зег 35 40 45

Ьеи Ьеи Туг Зег Азр С1у Ьуз ТЪг Туг Ьеи Азп Тгр Ьеи Ьеи С1п Агд 50 55 60

- 44 028427

Рго 65

С1у

С1п

Зег

Рго

МеР 70

Агд

Ьеи

Не

Туг

Ьеи 75

Уа1

Зег

Ьуз

Ьеи

Азр 80

Зег

С1у

Уа1

Рго

Азр

Агд

РЬе

ТЬг

С1у

Зег

61у

Зег

61у

ТЬг

Азр

РЬе

85

90

95

ТЬг

Ьеи

Ьуз

Не

Зег

Агд

Уа1

С1и

А1а

С1и

Азр

Ьеи

С1у

Уа1

Туг

Туг

100

105

110

Суз

Уа1

61п

С1у

ТЬг

Ηί3

РЬе

Рго

РЬе

ТЬг

РЬе

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Ьуз

115

120

125

Ьеи

С1и

Не

Ьуз

Агд

А1а

Азр

А1а

А1а

Рго

ТЬг

Уа1

Зег

Не

РЬе

Рго

130

135

140

Рго

145 <210> 51 <211> 440 <212> ДНК <213> Миз лшзси1из <400> 51

аРдддаРдда	дсддддРсРР	РсРсРРссРс	сРдРсаддаа	сРдсаддРдР	ссасРсРдад	60
дРссадсРдс	аасадРсРдд	ассРдадсРд	дрдаадссрд	дадсРРсааР	даадаРаРсс	120
РдсааддсРР	сРддРРасРс	аРРсасРддс	РаРассаРда	асрдддрдаа	дсададссаР	180
ддааадаасс	РРдадРддаР	РддасРРаРР	ааРссРРаса	дрддрдррас	РаддРасаас	240
садаааРРса	адддсааддс	сасаРРааРР	драдасаадр	саРссадсас	адссРасаРд	300
дадсРссРса	дРсРдасаРс	РдаддасРсР	дсадРсРаРР	аРРдРасаад	ададдсРааа	360
сдддадрддд	асдадасРРа	сРддддссаа	дддасРсРдд	РсасРдРсРс	Рдсадссааа	420

- 45 028427 асдасасссс саРсРдРсРа

440

<210>	52
<211>	146
<212>	РКТ
<213>	Миз тизси1из

<400> 52

Мер С1у Тгр Зег С1у Уа1 РЬе Ьеи РЬе Ьеи Ьеи Зег С1у ТЬг А1а С1у 15 10 15

Уа1 НЬз Зег С1и Уа1 С1п Ьеи 61п С1п Зег С1у Рго С1и Ьеи Уа1 Ьуз 20 25 30

Рго 61у А1а Зег Мер Ьуз Не Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у Туг Зег РЬе 35 40 45

ТЬг С1у Туг ТЬг Мер Азп Тгр Уа1 Ьуз С1п Зег НЬз С1у Ьуз Азп Ьеи 50 55 60

61и Тгр 11е С1у Ьеи 11е Азп Рго Туг Зег С1у Уа1 ТЬг Агд Туг Азп 65 70 75 80

С1п Ьуз РЬе Ьуз С1у Ьуз А1а ТЬг Ьеи 11е Уа1 Азр Ьуз Зег Зег Зег 85 90 95

ТЬг А1а Туг Мер С1и Ьеи Ьеи Зег Ьеи ТЬг Зег С1и Азр Зег А1а Уа1 100 105 110

Туг Туг Суз ТЬг Агд С1и А1а Ьуз Агд С1и Тгр Азр С1и ТЬг Туг Тгр 115 120 125

С1у С1п С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег А1а А1а Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго 130 135 140

- 4б 028427

Зег Уа1 145 <210> 53 <211> 440 <212> ДНК <213> Миз тизси1из <400> 53 аЪддЪдЬсса садсЪсадЪЪ ссЪдЪНсЪд ЪЪадЪдсЪсЪ ддаЪЪсадда аассаасддЪ

даЪдПдЪда	Ьдасссадас	ЪссасЪсасЬ	ЪЪдЪсддЪЪа	ссаЫддаса	ассадссЪсЪ	120
аЪсЬсНдса	адЪсаадЪса	дадссЬсЪЪа	ЬаЬадЪдасд	дааааассЪа	ЪЪЪдааЪЪдд	180
ЫаНасада	ддссаддсса	дЪсЪссааЬд	сдсс'ЬааЪсЪ	аЪсЪддЪдЪс	ЪааасЬддас	240
ЬсЪддадЪсс	сЪдасаддЪЪ	сасЪддсадЬ	ддаЬсаддаа	садаЪНЬас	асЪдааааЪс	300
адсададЪдд	аддсЪдадда	ЪЪЪдддадЪЪ	ЬаНасЬдсд	ЪдсааддЬас	асаЫЪЪсса	360
ЪЪсасдИсд	дсЪсддддас	ааадЪЪддаа	аЬаааасддд	сЪдаЪдсЪдс	ассаасЪдЪа	420
ЪссаЪсЪЬсс	сассаЪссад					440

<210>	54
<211>	146
<212>	РРТ
<213>	Миз

<400> 54

МеЪ Уа1 Зег ТЪг А1а С1п РЪе Ьеи РЪе Ьеи Ьеи Уа1 Ьеи Тгр Не С1п 15 10 15

С1и ТЪг Азп С1у Азр Уа1 Уа1 МеЬ ТЪг С1п ТЪг Рго Ьеи ТЪг Ьеи Зег 20 25 30

Уа1 ТЪг 11е С1у С1п Рго А1а Зег 11е Зег Суз Ьуз Зег Зег С1п Зег 35 40 45

- 47 028427

Ьеи Ьеи Туг Зег Азр С1у Ьуз ТЪг Туг Ьеи Азп Тгр Ьеи Ьеи С1п Агд 50 55 60

Рго С1у С1п Зег Рго МеЪ Агд Ьеи Не Туг Ьеи Уа1 Зег Ьуз Ьеи Азр 65 70 75 80

Зег С1у Уа1 Рго Азр Агд РЪе ТЪг С1у Зег С1у Зег С1у ТЪг Азр РЪе 85 90 95

ТЪг Ьеи Ьуз Не Зег Агд \7а1 С1и А1а С1и Азр Ьеи 61у Уа1 Туг Туг 100 105 110

Суз Уа1 С1п С1у ТЪг НЬз РЪе Рго РЪе ТЪг РЪе С1у Зег С1у ТЪг Ьуз 115 120 125

Ьеи С1и 11е Ьуз Агд А1а Азр А1а А1а Рго ТЪг Уа1 Зег 11е РЪе Рго 130 135 140

Рго Зег

145 <210> 55 <211> 447 <212> ДНК <213> Миз шизси1из <400> 55

аЪдддаЪдда	дсддддЪсЪЪ	ЪаЪсЪЪссЪс	сЪдЪсаддаа	сЪдсаддЪдЪ	ссасЪсЪдад	60
дЪссадсЪдс	аасадЪсЪдд	ассЪдадсЪд	дЪдаадссЪд	дадсЪЪсааЪ	даадаЪаЪсс	120
ЪдсааддсЪЪ	сЪддЪЪасЪс	аЪЪсасЪддс	ЪасассаЪда	асЪдддЪдаа	дсададссаЪ	180
ддааадаасс	ЪЪдадЪддаЪ	ЪддасЪЪаН	ааЪссЪЪаса	аЪддЪдЪЪас	ЪаддЪасаас	240
садаадЪЪса	адддсааддс	сасаЪЪааЪЪ	дЪадасаадЪ	саЪссадсас	адссЪасаЪд	300
дадсЪссЪса	дЪсЪдасаЪс	ЪдаддасЪсЪ	дсадЪсЪаЫ	асЪдЪасаад	ададдсЪааа	360

- 48 028427 сдддадрддд асдадасРРа сРддддссаа дддасРсРдд РсасРдРсРс Рдсадссааа 420 асдасасссс саРсРдРсРа РссасРд 447 <210> 56 <211> 149 <212> РКТ

<213> Миз тизси1из

<400> 56

Мер

С1у

Тгр

Зег

С1у

Уа1

РЪе

11е

РЪе

Ьеи

Ьеи

Зег

С1у

ТЪг

А1а

61у

1

5

10

15

Уа1

Шз

Зег

С1и

Уа1

С1п

Ьеи

С1п

С1п

Зег

С1у

Рго

61и

Ьеи

Уа1

Ьуз

20

25

30

Рго

С1у

А1а

Зег

Мер

Ьуз

11е

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

61у

Туг

Зег

РЪе

35

40

45

ТЪг

С1у

Туг

ТЪг

МеР

Азп

Тгр

Уа1

Ьуз

С1п

Зег

Шз

С1у

Ьуз

Азп

Ьеи

50

55

60

С1и

Тгр

Не

С1у

Ьеи

11е

Азп

Рго

Туг

Азп

С1у

Уа1

ТЪг

Агд

Туг

Азп

65

70

75

80

С1п

Ьуз

РЪе

Ьуз

С1у

Ьуз

А1а

ТЪг

Ьеи

11е

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

Зег

Зег

85

90

95

ТЪг

А1а

Туг

Мер

С1и

Ьеи

Ьеи

Зег

Ьеи

ТЪг

Зег

61и

Азр

Зег

А1а

Уа1

100

105

110

Туг

Туг

Суз

ТЪг

Агд

С1и

А1а

Ьуз

Агд

С1и

Тгр

Азр

С1и

ТЪг

Туг

Тгр

115

120

125

С1у

С1п

С1у

ТЪг

Ьеи

Уа1

ТЪг

Уа1

Зег

А1а

А1а

Ьуз

ТЪг

ТЪг

Рго

Рго

130 135 140

- 49 028427

Зег Уа1 Туг Рго Ьеи 145 <210> 57 <211> 438 <212> ДНК <213> Миз тизси!из <400> 57

аЬдаадЬЬдс	сЬдЬЬаддсЬ	дЬЬддЬдсЬд	дЬдЬЬсРдда	НссЬдПЪс	садсадЬдаЬ	60
дЫдЬдаЕда	сссадасЬсс	асЬсЬсссЬд	ссЬдЬсадЬс	НддадаЬса	адссЬссаЬс	120
ЬсИдсадаЬ	сЬадЬсадад	ссНдЬасас	адЬдаЬддаа	асассЬаЬЬЬ	асаЬЬддЬас	180
сЬдсадаадс	саддсоадЬс	ЬссааадсЬс	сЬдаЬсЬаса	аадЫЬссаа	ссдаШШ	240
ддддЬсссад	асаддЬЪсад	ЬддсадЬдда	Ъсадддасад	аЬЫсасасЬ	саадаЬсадс	300
ададЬддадд	сЬдаддаЬсЬ	дддадЫЬаЬ	НсЬдсЬсЬс	ааадЬасаса	ЬдЬЬссЬссд	360
асдНсддЬд	даддсассаа	дсЬддаааЬс	ааасдддсЬд	аЬдсЬдсасс	аасРдЬаЬсс	420

аЬсНсссас саЬссадЬ

438

<210>	58
<211>	146
<212>	РЕТ
<213>	Миз

<400> 58

МеЬ Ьуз Ьеи Рго Уа1 Агд Ьеи Ьеи Уа1 Ьеи Уа1 РЬе Тгр Не Рго Уа1 15 10 15

Зег Зег Зег Азр Уа1 Уа1 Ме! ТЬг С1п ТЬг Рго Ьеи Зег Ьеи Рго Уа1 20 25 30

Зег Ьеи С1у Азр 61п А1а Зег 11е Зег Суз Агд Зег Зег С1п Зег Ьеи 35 40 45

- 50 028427

Уа1

Низ 50

Зег

Азр

С1у

Азп

ТНг 55

Туг

Ьеи

Низ

Тгр

Туг 60

Ьеи

61п

Ьуз

Рго

С1у

С1п

Зег

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

11е

Туг

Ьуз

Уа1

Зег

Азп

Агд

РНе

Зег

65

70

75

80

С1у

Уа1

Рго

Азр

Агд

РНе

Зег

С1у

Зег

С1у

Зег

61у

ТНг

Азр

РНе

ТНг

85

90

95

Ьеи

Ьуз

11е

Зег

Агд

Уа1

С1и

А1а

61и

Азр

Ьеи

61у

Уа1

Туг

РНе

Суз

100

105

110

Зег

С1п

Зег

ТНг

Нгз

Уа1

Рго

Рго

ТНг

РНе

С1у

С1у

С1у

ТНг

Ьуз

Ьеи

115

120

125

С1и

Не

Ьуз

Агд

А1а

Азр

А1а

А1а

Рго

ТНг

Уа1

Зег

11е

РНе

Рго

Рго

130 135 140

Зег Зег

145 <210> 59 <211> 456 <212> ДНК <213> Миз тизси1из <400> 59

абддасбббд	ддсбсадсбб	асббаббббб	дбссббаббб	бааааддбдб	ссадбдбдад	60
дбдаадсбдд	бддадбсбдд	дддаддсбба	дбдсадссбд	дадддбсссд	дааасбсбсс	120
бдбдсадссб	сбддаббсас	бббсадбдас	басддаабдд	сдбдддббсд	асаддсбсса	180
дддааддддс	сбдадбдддб	адсаббсабб	адбаабббдд	сабабадбаб	сбасбабдса	240
дасасбдбда	сдддссдабб	сассабсбсб	адададаабд	ссаадаасас	ссбдбассбд	300

- 51 028427

- 52 028427

Азр Туг Тгр 61у С1п С1у ТЬг Зег Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег А1а Ьуз ТЬг 130 135 140

ТЬг Рго Рго Зег Уа1 Туг Рго Ьеи 145 150 <210> 61 <211> 432 <212> ДНК <213> Миз тизсиЬиз <400> 61

аРдаадРРдс	сРдРРаддсР	дРРддРдсРс	РддаРРсадд	ааассааддд	РдаРдРРдРд	60
сРдасссада	сРссасРсас	РРРдРсддРР	ассаРРддас	аассадссРс	РаРсРсРРдс	120
аадРсаадРс	ададссРсРР	аРаРадРааР	ддааааассР	аРРРдааРРд	дРРаРРасад	180
аддссаддсс	адРсРссааа	дсдссРааРс	РаРдРддРдР	сРааасРдда	сРсРддадРс	240
ссрдасаддр	РсасРддсад	РддаРсадда	асадаРРРРа	сасрдаааар	садсададРд	300
даддсРдадд	аРРРдддадР	РРаРРаРРдс	дрдсааддра	сасаРРРРсс	аРРсасдРРс	360
ддсРсдддда	сааадррдда	ааРаааасдд	дсРдаРдсРд	сассаасрдр	аРссаРсРРс	420

ссассаРсса др

432

<210>	62
<211>	144
<212>	РКТ
<213>	Миз

<400> 62

Мер Ьуз Ьеи Рго Уа1 Агд Ьеи Ьеи Уа1 Ьеи Тгр 11е С1п С1и ТЬг Ьуз 15 10 15

С1у Азр Уа1 Уа1 Ьеи ТЬг С1п ТЬг Рго Ьеи ТЬг Ьеи Зег Уа1 ТЬг Не 20 25 30

- 53 028427

С1у

С1п

Рго 35

А1а

Зег

11е

Зег

Суз 40

Ьуз

Зег

Зег

С1п

Зег 45

Ьеи

Ьеи

Туг

Зег

Азп

С1у

Ьуз

ТЬг

Туг

Ьеи

Азп

Тгр

Ьеи

Ьеи

61п

Агд

Рго

61у

С1п

50

55

60

Зег

Рго

Ьуз

Агд

Ьеи

11е

Туг

Уа1

Уа1

Зег

Ьуз

Ьеи

Азр

Зег

С1у

Уа1

65

70

75

80

Рго

Азр

Агд

РЬе

ТЬг

С1у

Зег

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

Ьуз

85

90

95

11е

Зег

Агд

Уа1

С1и

А1а

С1и

Азр

Ьеи

С1у

Уа1

Туг

Туг

Суз

Уа1

С1п

100

105

110

С1у

ТЬг

ΗΪ5

РЬе

Рго

РЬе

ТЬг

РЬе

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

С1и

11е

115

120

125

Ьуз

Агд

А1а

Азр

А1а

А1а

Рго

ТЬг

Уа1

Зег

11е

РЬе

Рго

Рго

Зег

Зег

130 135 140

<210>	63
<211>	435
<212>	ДНК
<213>	Миз
<400>	63

аРдддаРдда	дсддддРсРР	РсРсРРссРс	сРдРсадРаа	сРдааддРдР	ссасРсссад	60
дррсадсрдс	адсадРсРдд	ддсРдадсРд	дрдаддссрд	ддРссРсадР	даадаРРРсс	120
РдсааддсРР	сРддсРаРаР	аРРсааРаас	РасРддаРаа	асРдддРдаа	дсададдссР	180
ддРсадддРс	РРдадРддаР	РддасадаРР	РаРссРддад	аРддРдаРас	РаасРасааР	240
дддаадРРса	адддРааадс	сасасрдаср	дсадасаааР	ссРссадсас	адссРасаРд	300
садсРсадса	дссРаасаРс	РдаддасРсР	дсддРсРаРР	РсРдРдсаад	ададддаРаР	360

- 54 028427 аРРдРРРаРР ддддссаадд дасРсРддРс асРдРсРсРд садссаааас дасассссса 420

РсРдРсРаРс сасРд 435

<210>	64
<211>	145
<212>	РКТ
<213>	Миз

<400> 64

Мер С1у Тгр Зег С1у \7а1 РЬе Ьеи РЬе Ьеи Ьеи Зег Уа1 ТЬг С1и С1у 15 10 15

Уа1 Ηίδ Зег С1п Уа1 С1п Ьеи С1п С1п Зег С1у А1а С1и Ьеи Уа1 Агд 20 25 30

Рго С1у Зег Зег \7а1 Ьуз 11е Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у Туг 11е РЬе 35 40 45

Азп Азп Туг Тгр 11е Азп Тгр Уа1 Ьуз С1п Агд Рго С1у С1п 61у Ьеи 50 55 60

С1и Тгр 11е С1у С1п 11е Туг Рго 61у Азр С1у Азр ТЬг Азп Туг Азп 65 70 75 80

С1у Ьуз РЬе Ьуз С1у Ьуз А1а ТЬг Ьеи ТЬг А1а Азр Ьуз Зег Зег Зег 85 90 95

ТЬг А1а Туг Мер С1п Ьеи Зег Зег Ьеи ТЬг Зег 61и Азр Зег А1а Уа1 100 105 110

Туг РЬе Суз А1а Агд С1и С1у Туг 11е Уа1 Туг Тгр С1у С1п С1у ТЬг 115 120 125

Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег А1а А1а Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Зег Уа1 Туг Рго 130 135 140

- 55 028427

Ьеи

145 <210> 65 <211> 8 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический пептид <220>

<221> ΜΟϋ_ΚΕ3 <222> (1)..(1) <223> Пирролидонкарбоновая кислота <400> 65

С1и РЬе Агд НЬз Азр Зег С1у Суз

5

Claims (34)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Антитело, отличающееся тем, что связывается с АД-пептидами, где вариабельная область легкой цепи антитела кодируется нуклеотидной последовательностью, выбранной из 3ΕΟ ГО N0: 49, 53, 57 и 61, или имеет аминокислотную последовательность, выбранную из 3ΕΟ ГО N0: 50, 54, 58 и 62, и вариабельная область тяжелой цепи антитела кодируется нуклеотидной последовательностью, выбранной из 3Ε0 ГО N0: 51, 55, 59 и 63, или имеет аминокислотную последовательность, выбранную из 3Ε-0 ГО N0: 52, 56, 60 и 64.
2. 2. Антитело по п.1, где антитело представляет собой моноклональное антитело.
3. 3. Антитело по п. 1 или 2, где вариабельная область легкой цепи антитела кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в 3Ε0 ГО N0: 49, или имеет аминокислотную последовательность, представленную в 3Ε0 ГО N0: 50, и где вариабельная область тяжелой цепи антитела кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в 3Ε0 ГО N0: 51, или имеет аминокислотную последовательность, представленную в 3Ε-0 ГО N0: 52.
4. 4. Антитело по п. 1 или 2, где вариабельная область легкой цепи антитела кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в 3Ε0 ГО N0: 53, или имеет аминокислотную последовательность, представленную в 3Ε0 ГО N0: 54, и где вариабельная область тяжелой цепи антитела кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в 3Ε0 ГО N0: 55, или имеет аминокислотную последовательность, представленную в 3Ε0 ГО N0: 56.
5. 5. Антитело по п. 1 или 2, где вариабельная область легкой цепи антитела кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в 3Ε0 ГО N0: 57, или имеет аминокислотную последовательность, представленную в 3Ε0 ГО N0: 58, и где вариабельная область тяжелой цепи антитела кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в 3Ε0 ГО N0: 59, или имеет аминокислотную последовательность, представленную в 3Ε0 ГО N0: 60.
6. 6. Антитело по п. 1 или 2, где вариабельная область легкой цепи антитела кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в 3Ε0 ГО N0: 61, или имеет аминокислотную последовательность, представленную в 3Ε0 ГО N0: 62, и где вариабельная область тяжелой цепи антитела кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в 3Ε0 ГО N0: 63, или имеет аминокислотную последовательность, представленную в 3Ε0 ГО N0: 64.
7. 7. Антитело по одному из предыдущих пунктов, где антитело выбрано из следующей группы:

   Αβ 5-5-6 (ϋδΜ АСС 2923),

   Αβ 6-1 -6 (ϋδΜ АСС 2924),

   Αβ 17-4-3 (Э8М АСС 2925), и

   Αβ 24-2-3 (Ώ8Μ АСС 2926).
8. 8. Антитело по п.7, где антитело представляет собой АД 6-1-6 (Ό5Μ АСС 2924).

   - 56 028427
9. 9. Αнтитело по п.7, где антитело представляет собой Αβ 24-2-3 (^δΜ ЛСС 2926).
10. 10. Лнтитело по одному из предыдущих пунктов, где антитело представляет собой гуманизированное или химерное антитело.
11. 11. Лнтитело по одному из предыдущих пунктов, где антитело является человеческим.
12. 12. Αнтитело по одному из предыдущих пунктов, которое представляет собой димерное антитело или одноцепочечное антитело.
13. 13. Λнтитело по одному из предыдущих пунктов, которое связывается с Αβ-пептидами.
14. 14. Λнтитело по п.13, где указанные Αβ-пептиды выбраны из следующей группы: рС1и-Аβз-з8, рС1и-Аβз-4ο, рС1и-Аβз_-42 и рС1и-Аβз-_x, где х обозначает целое число от 10 до 42.
15. 15. Λнтитело по одному из предыдущих пунктов, которое является меченым.
16. 16. Λнтитело по одному из предыдущих пунктов, которое иммобилизовано на твердой фазе.
17. 17. Αнтитело по пп.7-16, которое можно получать из любой клеточной линии гибридом ^δΜ ΑСС 2923, ^δΜ ΑίΧ.’ 2924, ^δΜ Α^ 2925, ^δΜ Α^ 2926.
18. 18. Композиция для лечения, предупреждения или замедления развития амилоидоза, содержащая антитело по одному из предыдущих пунктов в терапевтически эффективном количестве и по крайней мере один терапевтически приемлемый разбавитель или носитель.
19. 19. Композиция по п.18, где амилоидоз представляет собой нейродегенеративное заболевание, выбранное из группы, состоящей из легкого когнитивного нарушения, болезни Αльцгеймера и нейродегенерации при синдроме Дауна.
20. 20. Композиция по п.19, где амилоидоз представляет собой спорадическую болезнь Αльцгеймера или семейную деменцию альцгеймеровского типа.
21. 21. Композиция по п.20, где семейная деменция альцгеймеровского типа представляет собой семейную британскую деменцию или семейную датскую деменцию.
22. 22. Клеточная линия гибридомы, которая предназначена для продуцирования антитела по любому из пп.1-17, где указанная клеточная линия гибридомы выбрана из ^δΜ Α^ 2923, ^δΜ Α^ 2924, ^δΜ ΑίΧ.’ 2925 и ^δΜ ΑίΧ.’ 2926.
23. 23. Применение антитела по одному из пп.1-17 в способе диагностики амилоид-ассоциированного заболевания или состояния.
24. 24. Применение антитела по любому из пп.1-17 в терапевтическом способе лечения амилоидассоциированного заболевания или состояния.
25. 25. Применение по п.23, где указанный амилоидоз является нейродегенеративным заболеванием, выбранным из группы, включающей умеренное когнитивное нарушение, болезнь Λльцгеймера и нейродегенерацию, связанную с синдромом Дауна.
26. 26. Применение по п.23, где указанный амилоидоз является спорадической формой болезни Λльцгеймера или семейной деменцией альцгеймеровского типа.
27. 27. Применение по п.26, где указанная семейная деменция альцгеймеровского типа является семейной британской деменцией или семейной датской деменцией.
28. 28. Применение по п.24, где указанный амилоидоз представляет собой нейродегенеративное заболевание, выбранное из группы, состоящей из умеренного когнитивного нарушения, болезни Αльцгеймера и нейродегенерации, связанной с синдромом Дауна.
29. 29. Применение по п.24, где указанный амилоидоз представляет собой спорадическую болезнь Αльцгеймера или семейную деменцию альцгеймеровского типа.
30. 30. Применение по п.29, где семейная деменция альцгеймеровского типа представляет собой семейную британскую деменцию или семейную датскую деменцию.
31. 31. Применение антитела по одному из пп.1-17 для выявления Αβ-пептидов.
32. 32. Применение по п.31, где указанные Αβ-пептиды выбраны из следующей группы: рС1и-Аβз-з8, рС1и-Аβз-4ο, рС1и-Аβз_-42 и рС1и-Аβз-_x, где х обозначает целое число от 10 до 42.
33. 33. Способ диагностики ш νίΙΐΌ ассоциированного с амилоидом заболевания или состояния, включающий определение в образце иммунологического связывания антитела по любому из пп.1-17 с рС1иАβ пептидом, которое включает следующие этапы:

    (а) приведение в контакт антитела с образцом, который, как предполагается, содержит амилоидный пептид;

    (б) обеспечение возможности антителу связаться с рС1и-Аβ пептид с образованием иммунологиче- 57 028427 ского комплекса;

    (в) выявление формирования иммунологического комплекса; и (г) корреляция присутствия или отсутствия иммунологического комплекса с присутствием или отсутствием ρΟΙιι-Λβ пептида в образце, где наличие ρΟΙιι-Λβ пептида в образце является положительным индикатором амилоидассоциированного заболевания или состояния.
34. 34. Набор для диагностики ассоциированного с амилоидом заболевания или состояния, содержащий антитело по одному из пп.1-17, реагенты в предварительно определенных количествах и инструкции по применению.