MX2011000875A - Ensayo de anticuerpo de diagnostico. - Google Patents

Ensayo de anticuerpo de diagnostico.

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Abstract

La presente invención se refiere a ensayos de diagnóstico novedosos para la diagnosis de amiloidosis, en particular la enfermedad de Alzheimer, y aspectos relacionados. En particular, se proporcionan anticuerpos monoclonales y un ensayo de anticuerpo.

Description

ENSAYO DE ANTICUERPO PE DIAGNOSTICO La presente invención se refiere a ensayos de diagnóstico novedosos para la diagnosis de amiioidosis, un grupo de trastornos y anormalidades asociados con proteína amiloidea tal como enfermedad de Alzheimer y aspectos relacionados. En particular, se proporciona un ensayo de anticuerpo.
La amiioidosis no es una entidad de enfermedad individual sino más bien un grupo diverso de procedimientos de enfermedad progresiva caracterizados por depósitos de tejido extracelular de una proteína similar al almidón, cerosa llamada amiloide, que se acumula en uno o más órganos o sistemas del cuerpo. A medida que se acumulan los depósitos amüoides, empiezan a interferir con la función normal del órgano o el sistema dé cuerpo. Existen al menos 15 tipos diferentes de amiioidosis. Las formas principales son amiioidosis primaria sin antecedente conocido, amiioidosis secundaria siguiendo alguna otra condición, y amiioidosis hereditaria.
La amiioidosis secundaria ocurre durante la infección crónica o enfermedad inflamatoria, tal como tuberculosis, una infección bacteriana llamada fiebre mediterránea familiar, infecciones óseas (osteomielitis), artritis reumatoide, inflamación del intestino delgado (íleo granulomatoso), enfermedad de Hodgkin y lepra.
Los depósitos amiloides incluyen componente amiloide T (pentagonal) (AP), una glicoproteína relacionada con amiloide de suero norma! P (SAP), y glicosamoniglicanos sulfatados (GAG), carbohidratos complejos de tejido conectivo. Las fibrillas de proteína amiioide, que toman en cuenta aproximadamente 90% del material amiioide, comprenden uno de los varios tipos diferentes de proteínas. Estas proteínas son capaces de doblarse en fibrillas de lámina denominadas "beta-plegadas", una configuración de proteína única que exhibe sitios de unión para rojo Congo que resulta en las propiedades de tinción únicas de la proteína amiioide.
Muchas enfermedades del envejecimiento están basadas en o asociadas con proteínas similares a amiioide y están caracterizadas, en parte, por la acumulación de depósitos extracelulares de amiioide o material similar a amiioide que contribuyen a la patogénesis, así como el progreso de la enfermedad. Estas enfermedades incluyen, pero no están limitadas a, trastornos neurológicos tal como deficiencia cognitiva media (MCI), enfermedad de Alzheimer (AD), similares por ejemplo enfermedad de Alzheimer esporádica (S AD) o demencias de Alzheimer familiares (FAD) como Demencia Británica Familiar (FBD) y Demencia Danesa Familiar (FDD), neurodegeneración en síndrome de Down, demencia de cuerpo Lewy, hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis (tipo holandés); complejo de Parkinson Guam-demencia. Otras enfermedades que están basadas en o asociadas con proteínas similares a amiioide son parálisis supra nuclear progresiva, esclerosis múltiple; enfermedad de Creutzfeld Jacob, enfermedad de Parkinson, demencia relacionada con VIH, ALS (esclerosis lateral amiotrófica), inicio de diabetes adulta; amiloidosis cardíaca senil; tumores endocrinos, y otros, que incluyen degeneración macular.
Aunque la patogénesis de estas enfermedades puede ser diversa, sus depósitos característicos frecuentemente contienen muchos constituyentes moleculares compartidos. A un grado significativo, esto se puede atribuir a la activación local de trayectorias pro-inflamatorias con lo cual lleva a la deposición concurrente de componentes de complemento activado, réactivos de fase aguda, inmunomoduladores, y otros mediadores inflamatorios (McGeer y otros, Tohoku J Exp Med. 174(3): 269-277 (1994)).
Recientemente, la evidencia que se acumulado demuestra la participación de variantes de péptido Ap modificado de terminal N en la enfermedad de Alzheimer. Las biopsias directas presentan una presencia de ?ß 1-40 y ?ß 1-42 no únicamente en el cerebro de los pacientes de Alzheimer sino también en placas seniles de individuos no afectados. Sin embargo, ?ß ?3??-40/?ß N3pE-42 truncado de terminal N y modificado por piroGlu está casi exclusivamente implantado dentro de placas de pacientes de enfermedad de Alzheimer, lo que hace a esta variante ?ß un marcador de diagnóstico elegible y un objetivo potencial para el desarrollo de fármaco.
Actualmente, varios fabricantes comerciales ofrecen equipos de ELISA que permiten la detección de ?ß 1-40 / 1-42 y ?ß ?3??-40/?ß N3pE-42 en el rango de picogramo bajo (pg).
Los cerebros de pacientes de enfermedad de Alzheimer (AD) están morfológicamente caracterizados por la presencia de enredos de neurosis fibrillas y por depósitos de péptidos ?ß en estructuras de cerebro neocorticales (Selkoe, D.J. & Schenk, enfermedad de Alzheimer: el entendimiento molecular predice medicamentos basados en amiloide. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 43, 545-584 (2003)). Se liberan . péptidos ?ß de la proteína precursora amiloide (APP) después de la división secuencia! por ß- y ?-secretasa. La división y-secretasa resulta en la generación de péptidos A [3 1-40 y ?ß 1-42, que difieren en su C-terminales y exhiben diferentes potencias de agregación, formación de fibrilla y neurotoxicidad (Shin, R.W. y otros. Beta-proteína Amiloide (Abeta) 1-4 pero no ABeta 1-42 contribuye a la formación experimental de fibrillas amiloides de enfermedad de Alzheimer en el cerebro de rata. J. Neurosci. 17, 81-87-8193 (1997); Iwatsubo, T. y otros. Visualización de Abeta 42 (43) y Abeta 40 en placas seniles con monoclonales Abeta específicos de extremo: evidencia que una especie inicialmente depositada es Abeta 42(43). Neurona 13, 45-53 (1994); Iwatsubo, T., Mann, D.M., Odaka, A., Suzuki, N. & Ihara, Y. deposición de beta proteína amiloide (Abeta): Abeta 42(43) precede Abeta 40 en síndrome de Down. Ann. Neurol. 37, 294-299 (1995; Hardy, J.A. & Híggins, G.A. enfermedad de Alzheimer: la hipótesis de cascada amiloide. Ciencia 256, 184-185 (1992); Ropner, S., Uberham, U., Schliebs, R., Perez-Polo, J.R. & Bigl, V. La regulación de metabolismo de proteína precursora amiloide por mecanismos colinérgicos y señalización de receptor de neurotrofina. Prog.
Neurobiol. 56, 541-569 (1998)). Además de la variabilidad de terminal C, los péptidos ?ß terminalmente modificados N son abundantes (Saido, T.C. y otros, deposición dominante y diferencial de distintas especies de péptido beta-amiloide, Abeta N3 (pE), en placas seniles. Neurona 14, 457-466 (1995); usso, C. y otros. Mutaciones de presenilina-1 en enfermedad de Alzheimer. Nature 405, 531-532 (2000); Saido, T.C , Yamao, H.. Iwatsubo, T. & Kawashima, S. heterogénea Amino- y carboxil-terminal de péptido beta amiloides depositados en el cerebro humano. Neurosci. Lett. 215, 173-176 (1996)). Parece que una porción mayor de los péptidos ?ß se somete a truncamiento de N-terminal por dos aminoácidos, que expone un residuo de glutamato, que se somete a ciclos en piroglutamato (pE, que resulta en péptidos ?ß3(??)-42 (Saido, T.C. y otros. Deposición dominante y diferencial de distintas especies de péptido beta-amiloide, Abeta N3 (pE), en placas seniles. Neurona 14, 457-466 (1995); Saido, T.C, Yamao, H., Iwatsubo, T. & Kawashima, S. heterogeneidad amino- y carboxil-terminal de péptidos beta-amiloide depositados en el cerebro humano. Neurosci. Lett. 215, 173-176 (1996)). Alternativamente, pE formarse siguiendo la división ß' por BACE1, que resulta en ?ß N 11 (pE)-42 (Naslund, J. y otros. Abundancia relativa de variantes de péptido beta amiloide de Alzheimer A en enfermedad de Alzheimer y envejecimiento normal. Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 91, 8378-8382 (1994); Liu, K. y otros. Caracterización de deposición de péptido Abeta 11-40/42 en enfermedad de Alzheimer y cerebros jóvenes con síndrome de Down: implicación de especies Abeta N-terminalmente truncadas en la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer. Acta Neuropathol. 112, 163-174 (2006)). En particular ?ß N3(pE)-42 se ha mostrado para ser un constituyente mayor de depósitos ?ß en enfermedad de Alzheimer esporádica y familiar (FAD) (Saido, T.C. y otros. Deposición dominante y diferencial de distintas especies de péptido beta-amiloide, Abeta N3 (pE), en seniles. Neurona 14, 457-466 (1995); Miravalle, L. y otros. Especies de péptido Abeta amino-terminalmente truncadas son el componente principal de placas de lana de algodón. Bioquímica 44, 10810-10821 (2005)) Los péptidos ?ß N3pE-42 coexisten con péptidos ?ß 1-40/1-42 (Saido T.C. y otros. Deposición dominante y diferencial de distintas especies de péptido beta-amiloide, Abeta N3pE, en placas seniles. Neurona 14, 457-466 (1995); Saido T.C, Yamao, H., Iwatsubo, T. & kawashima, S. Heterogeneidad amino- y carboxil-terminal de péptidos beta-amiloide depositados en el cerebro humano. Neurosci. Lett. 215, 173-176 (1996)), y, basándose en un número de observaciones, podría jugar un papel prominente en la patogénesis de AD. Por ejemplo, se describió una neurotoxicidad particular de péptidos ?ß N3pE-42 (Russo, C. y otros. Beta-péptidos amiloides modificados por piroglutamato--Abeta N3 (pE)--afectan fuertemente la neurona cultivada y la supervivencia de astrocito. J. Neurochem. 82, 1480-1489 (2002) y la modificación de pE de péptidos ?ß N-truncados confiere la resistencia a degradación por la mayoría de aminopeptidasas así como endopeptidasas de degradación ?ß (Russo, C. y otros. Beta-péptidos arniloides modificados por piroglutamato--Abeta N3 (pE)--af ectan fuertemente neurona cultivada y supervivencia de astrocito. J. Neurochem. 82, 1480-1489 (2002); Saido, T.C. La enfermedad de Alzheimer como trastornos proteolíticos: anabolisimo y catabolismo de beta-amiloide. Neurobiol. Aging 19, S69-S75 (1998)). La composición cíclica de ácido glutámico en pE lleva a una pérdida de carga de N-terminal que resulta en una agregación acelerada de ?ß N3pE comparado con los péptidos ?ß no modificados (He, W. & Barrow, C.J. Los péptidos Abeta 3-piroglutamino y 11 -piroglutamilo encontrados en placas seniles tienen mayor formación de beta-lamina y propensiones de agregación in vitro que Abeta de longitud completa. Biochemistry 38, 10871-10877 (1999); Schilling, S. y otros. En el sembrado y olígomerización de péptidos pGlu-amiloide (in vitro). Biochemistry 45, 12393-12399 (2006)). De esa forma, la reducción de formación ?ß N3pE-42 debe desestabilizar los péptidos al hacerlos más accesibles a degradación y, a su vez, prevendrá la formación de agregados ?ß de mayor peso molecular y mejoran la supervivencia neurona!.
Sin embargo, por un periodo largo no se sabía como ocurría la modificación de pE de péptidos ?ß. Recientemente, se descubrió que glutaminil ciclasa (QC) es capaz de catalizar la formación de ?ß N3pE-42 bajo condiciones moderadamente ácidas y que los inhibidores de CQ específicos previenen la generación de ?ß N3pE-42 in vitro (Schilling, S., Hoffmann, T., Manhart, S., Hoffmann, M. & Demuth, H.-U. El glutaminil ciclasas de desdoblan la actividad de glutaminil ciclasa bajo condiciones acidas medias. FEBS Lett. 563, 191-196 (2004); Cynis, H. y otros. La inhibición de glutaminil ciclasa altera la formación de piroglutamato en células mamíferos. Biochim. Biophys. Acta 1764, 1618-1628 (2006)).
La demencia de cuerpo de Lewy (LBD) es un trastorno neurodegenerativo que puede ocurrir en personas mayores a los 65 años de edad, y típicamente causa síntomas de deterioro cognitivo (pensamiento) y cambios de comportamiento anormales. Los síntomas pueden incluir deterioro cognitivo, signos neurológicos, trastorno de sueño, y falla autónoma. El deterioro cognitivo es la característica de presentación de LBD en la mayoría de los casos. Los pacientes tienen episodios recurrentes de confusión que empeoran progresivamente. La fluctuación y la capacidad cognitiva frecuentemente están asociadas con grados cambiantes de atención y alteración. El deterioro cognitivo y las fluctuaciones de pensamiento pueden variar en minutos, horas, o días. Los cuerpos de Lewy están formados de proteínas de neurofilamento fosforiladas y no fosforiladas; contienen la alfa-sinuclei.na de proteína sináptica así como ubiquitina, que está involucrada en la eliminación de proteínas dañadas o anormales. Además de los cuerpos de Lewy, exones de Lewy, que son cuerpos de inclusión en los procedimientos celulares de las células nerviosas, también pueden estar presentes. Las placas amiloides pueden formarse en los cerebros de pacientes que padecen DLB, sin embargo tienden a ser menores que los observados en pacientes con enfermedad de Alzheimer. Los enredos de neurofibrillas, la otra marca distintiva micropatológica de AD, no son una característica principal de LBD pero frecuentemente están presentes además de las placas amiloides.
La esclerosis lateral amiotrofica (ALS) está caracterizada por degeneración de neuronas motrices superiores e inferiores. En algunos pacientes de ALS, puede estar presente demencia o afasia (ALS-D). La demencia es ' muy comúnmente una demencia frontotemporal (FTD), y muchos de estos casos tienen inclusiones positivas de ubiquitina, negativas de tao en neuronas de las circunvoluciones dentadas y las capas superficiales de los glóbulos frontales y temporales.
La miositis de cuerpo de inclusión (IBM) es una enfermedad paralizante usualmente encontrada en gente mayor a 50 años, en donde las fibras musculares desarrollan inflamación y empiezan a atrofiarse, pero en donde el cerebro está a salvo y los pacientes retienen su intelecto completo. Se encontraron dos enzimas involucradas en la producción de proteína amiloide-beta para aumentarse dentro de las células musculares de pacientes con esta enfermedad muscular progresiva muy común de gente mayor, en donde también aumentó amiloide-beta.
Otra enfermedad que está basada en o asociada con la acumulación y depósito de proteina similar a amiloide es la degeneración macular. La degeneración macular es una enfermedad ocular común que causa el deterioro de la mácula que es el área central de la retina (el tejido delgado como papel en la parte posterior del ojo en donde las células sensibles a la luz envían señales visuales al cerebro). La visión "directa" aguda, clara se procesa por la mácula. El daño a la mácula resulta en el desarrollo de puntos ciegos y visión borrosa o distorsionada. La degeneración macular relacionada con la edad (AMD) es una causa mayor de deterioro visual en los Estados Unidos y. para personas mayores a los 65 años es la causa principal de ceguera legal entre personas caucásicas. Aproximadamente 1.8 millones de estadounidenses de edad de 40 años y mayores tienen AMD avanzada, y otros 7.3 millones de personas con AMD intermedia están en riesgo sustancial de pérdida de visión. El gobierno estima que para el 2020 habrá 2.9 millones de personas con AMD avanzada. Victimas de AMD frecuentemente se ven sorprendidas y frustradas al encontrar que tampoco se conoce sobre las causas y el tratamiento de esta condición de ceguera.
Existen dos formas de degeneración macular: degeneración macular seca y degeneración macular húmeda. La forma seca, en donde las células de la mácula empiezan a dividirse lentamente, se diagnostican 85% de los casos de degeneración macular. Ambos ojos usualmente están afectados por AMD seca, aunque un ojo puede perder la visión mientras el otro ojo permanece no afectado. Las drusas, que son depósitos amarillos bajo la retina, son comúnmente los primeros signos de AMD seca. El riesgo de desarrollar AMD seca o AMD humedad avanzada aumenta a medida que aumenta el número o tamaño de las drusas. Esto es posible para AMD seca avanzar y causar la pérdida de visión sin cambiar a la forma húmeda de la enfermedad; sin embargo, también es posible que la AMD seca en la primera etapa cambie repentinamente a la forma húmeda.
La forma húmeda, aunque sólo representa el 15% de los casos, resulta en 90% de la ceguera, y se considera AMD avanzada (no existe ninguna primera etapa o intermedia de AMD húmeda). La AMD húmeda siempre está presidida por la forma seca de la enfermedad. A medida que la forma seca empeora, algunas personas empiezan a tener vasos sanguíneos anormales que crecen detrás de la mácula. Estos vasos son muy frágiles y empiezan a filtrar fluido y sangre (por lo tanto degeneración macular 'húmeda'), que causa daño rápido a la mácula.
La forma seca de AMD inicialmente causará de forma frecuente visión ligeramente borrosa. El centro de la visión en particular entonces puede volverse borroso y esta región crece más a medida que la enfermedad progresa. Puede ser que no se noten síntomas si solamente se ve afectado un ojo. En la AMD húmeda, las líneas rectas pueden parecer onduladas y la pérdida de visión puede ocurrir rápidamente.
La diagnosis de degeneración macular típicamente involucra un examen de ojo dilatado, una prueba de agudeza visual, y una observación de la parte trasera del ojo que utiliza un procedimiento llamado fundoscopía para ayudar, a diagnosticar AMD, y, sí se sospecha AMD húmeda, también puede realizarse angiografía de fluoresceína. Si la AMD seca llega a las etapas avanzadas, no existe tratamiento actual para prevenir la pérdida de visión. Sin embargo, una fórmula de alta dosis específica de antioxidantes y zinc puede retrasar o prevenir la AMD intermedia de progresar a la etapa avanzada.
Macugen® (inyección de sodio de pegaptanib)), fótocoagulación láser y terapia fotodinámica pueden controlar el crecimiento de vaso sanguíneo anormal y el sangrado en la mácula, que es útil para algunas personas que tienen AMD húmeda; sin embargo, la visión que ya se ha perdido no se restaurará por estas técnicas. Si la visión ya esta pérdida, existen auxiliares de baja visión que pueden ayudar a mejorar la calidad de la vida.
Uno de los primeros signos de la degeneración macular relacionada con la edad (AMD) es la acumulación de depósitos extracelulares conocidos como drusa entre la lámina basal del epitelio pigmentado retinal (RPE) y la membrana de Bruch's (BM). Los estudios recientes conducidos por Anderson y otros han confirmado que la drusa contiene amiloide beta. (Investigación ocular experimental 78 (2004) 243-256).
El propósito de la presente invención es establecer una técnica de detección altamente sensible y concomitantemente voluminosa que permita la determinación cuantitativa de variantes ?ß, en particular péptidos pGlu-A(3, en muestras biológicas, por ejemplo muestras de licor o suero, preferiblemente muestras de suero. Este es un reto enorme, tomando en cuenta la baja abundancia de péptidos ?ß en la sangre. Tener tal técnica de detección disponible es, sin embargo, un pre-requisito para estudiar la eficacia de inhibidores de molécula pequeña en programas de filtrado de fármaco.
La presente invención proporciona métodos y composiciones novedosas que comprenden anticuerpos altamente específicos y altamente efectivos, que incluyen anticuerpos quiméricos y fragmentos de los mismos, que incluyen anticuerpos parcial o completamente humanizados y fragmentos de los mismos, que tienen la capacidad de reconocer específicamente y unirse a epitopos específicos de un rango de antígenos beta-amiloides, en particular péptidos pGlu-?ß, que pueden presentarse al anticuerpo en una forma monomérica, dimérica, trimérica, etc., o una forma polimérica, en forma de un agregado, fibras, filamentos o en la forma condensada de una placa. Los anticuerpos permitidos por la enseñanza de la presente invención son particularmente útiles para diagnosis de amiloidosis, un grupo de enfermedades y trastornos asociados con formación de placa amiloide que incluye amiloidosis secundaria y amiloidosis relacionada con la edad que incluye, pero no se limita a, trastornos neurológicos tal como Enfermedad de Alzheimer (AD), demencia de cuerpo de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis (tipo holandés); complejo de Parkinson Guam-demencia; asi como otras enfermedades que están basadas en o asociadas con proteínas similares a amiloide tal como parálisis supranuclear progresiva, esclerosis múltiple; enfermedad de Creutzfeld Jacob, hemorragia cerebral hereditaria con tipo de amiloidosis holandés, enfermedad de Parkinson, demencia relacionada con VIH, ALS (esclerosis lateral amiotróf ica), Diabetes de inicio en adultos; amiloidosis cardiaca senil; tumores endocrinos, y otros, que incluyen degeneración macular, por nombrar sólo algunos.
Para satisfacer todas las demandas antes mencionadas, será específicamente preferible una técnica basada en ELISA. La tarea se inició con ELSA de ?ß N3pE, debido a que para esta variante de A|3 ya está comercialmente disponible un sistema de ELISA (equipo de Ensayo de Amiloide Beta Humano (N3pE)-IBL, Código No.- 27716), que se va a utilizar como referencia y control de calidad interno. La captura del péptido ?ß N3pE-40 se realizó con la ELISA ??ß (x-40) (HS) de TGC (The Genetics Company, Inc..Wagistrasse 23, 8952 Schlieren, área de Zurich (Suiza), que debe facilitar y expedir el procedimiento de desarrollo.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención se refiere en particular a anticuerpos o variantes de los mismos, que están caracterizados en que se unen a un ?ß-péptido con una alta afinidad. Dicha alta afinidad, significa en el contexto de la presente invención una afinidad de un valor kD de 10"7 M o mejor, preferiblemente un valor kD de 10"8 o mejor, e incluso más preferiblemente un valor kD de 10"9 M - 10"'2.
En particular el anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo monocional y se selecciona del grupo a continuación ?ß 5-5-6 ?ß 6-1-6 ?ß 17-4-3 ?ß 24-2-3 El anticuerpo de acuerdo con la presente invención es especialmente útil en un método de diagnóstico para detectar amiloidosis, en particular enfermedad de Alzheimer.
DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1 A) Detección de 10 ng/ml de N3pÉ-40 amiloide ß al aumentar concentraciones de anticuerpo pGlu-6166 (clon 12-1).
B) Determinación de la concentración más alta de anticuerpo pGlu-6166 (clon 12-1) requerido para detección de 10 ng/ml de N3pE-40 amiloide [3.
Figura 2 Análisis de tinción por puntos de sobrenadantes de cultivo de célula de hibridoma, de IgG individual que produce clones.
Figura 3 El análisis PepSpot de Clones de célula de hibridoma pGlu-6166 y anticuerpo IBL-?ß N3pE.
Figura 4 12% de SDS-PAGE de 20 pg de anticuerpo pGlu-6166 y sobrenadantes de cultivo de célula de hibridoma.
Figura 5 Análisis Biacore de sobrenadantes de cultivo de célula de hibridoma. Se ilustra gráficamente un diseño de cursos de unión verificados.
Figura 6 Sensogramas de interacción de clon 6-1-6 de anticuerpo anti-?ß?3?? con ?ß??3-40.
Figura 7 Sensogramas de interacción de clon 24-2-3 de anticuerpo anti-?ß?3?? con ?ß??3-40.
Figura 8 N3pE-ELISA para clon 6-1-6, curva estándar de ?ß??3-40.
Figura 9: Sensograma de clon 6-1-6 de anticuerpo N3pE.
Figura 10 Cuantif icación de ?ß??3-42 utilizando el método de neutralización por dilución 1:20 en regulador de pH de EIA, titulación de pH con 860 µ? de 3.5 M Tris.
Figura 11 Secciones de cerebro teñidas forman pacientes de enfermedad de Alzheimer (AD) (A) cerebro de un paciente de AD de esporádica (SAD) teñido con anticuerpo 6E10 anti-?ß, que reconoce ?ß total, (B) cerebro de un paciente de AD esporádica (SAD) teñido con clon 24-2-3 de anticuerpo N3Pe, que reconoce ?ß??3-?, (C) cerebro de un paciente de AD familiar (FAD) teñido con clon 24-2-3 de anticuerpo N3pE, que reconoce A|3pE3-x.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Definiciones El término "anticuerpos" se utiliza en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíf icos (por ejemplo, anticuerpos biespecíf icos) formados de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpo siempre y cuando exhiban actividad biológica deseada. El anticuerpo puede ser un IgM, IgG (por ejemplo IgG,, I g G2 , lgG3 o lgG4), IgD, IgA o. IgE, por ejemplo. Preferiblemente sin embargo, el anticuerpo no es un anticuerpo IgM.
"Fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, generalmente la unión de antígeno o región variable del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen Fab, Fab', F(ab')2, y fragmentos Fv: diacuerpos; moléculas de anticuerpo de cadena individual; y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpo.
El término "anticuerpo monoclonal" como se utiliza aquí hace referencia a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos substancialmente homogéneos, es decir los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto para mutaciones posibles que ocurren naturalmente que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, que están dirigidos contra un sitio antigénico individual. Además, en contraste con preparaciones de "anticuerpo policlonal" que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un determinante individual en el antigeno. Además de su especificación, los anticuerpos monoclonales frecuentemente pueden ser ventajosos ya que se sintetizan por el cultivo de hibridoma, no contaminado por otras inmunoglobulinas. El "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como siendo obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no para interpretarse como requiriendo producción del anticuerpo por cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a utilizar de acuerdo con la presente invención pueden hacerse por el método de hibridoma primero descrito por Kóhler y otros, Nature, 256:495 (1975), o puede hacerse por métodos de ADN recombinante generalmente bien conocidos. Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpo de Fargo al utilizar las técnicas descritas en Clackson y otros, Nature, 352:624-628 (1991) y Mark y otros, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1997), por ejemplo.
Los anticuerpos monoclonales aquí incluyen específicamente anticuerpos quiméricos (inmunoglobulinas) en donde una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenece a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras el resto de la cadena(s) es idéntico con u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase de anticuerpo o subclase, asi como fragmentos de tales en anticuerpos, siempre y cuando exhiban la actividad biológica deseada.
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murino) son inmunoglobulínas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tal como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras sub-secuencias de unión de antígeno de anticuerpos) que contienen una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulínas humanas (anticuerpo receptor) en donde los residuos de una región de determinación de complementariedad (CDR) del receptor se reemplazan por residuos de un CDR de una especie no humana (anticuerpo de donador) tal como ratón, rata o conejo que tienen la especificación, afinidad, y capacidad deseada. En algunos casos, los residuos de región de estructura Fv (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en la CDR importada o secuencias de estructura.
Estas modificaciones se hacen para de retinar y optimizar además ei desempeño de anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá substancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos dominios variables, en donde todas o substancialmente todas las regiones CDR corresponden a esas de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado óptimamente también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, ver Jones y otros, Nature, 321:522-525 (1986), Reichmann y otros, Nature. 332:323-329 (1988): y Presta, Curr. Op. Struct. Biel., 2:593-596 (1992). El anticuerpo humanizado incluye un anticuerpo Primatized™ en donde la región de unión de antígeno del anticuerpo se deriva de un anticuerpo producido al inmunizar monos macacos con el antígeno de interés.
Los fragmentos de anticuerpo de "Fv de cadena individual" o "sFv" comprenden los dominios VH y VL de anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una cadena de polipéptido individual. Generalmente, el polipéptido Fv además comprende un enlazador de polipéptido entre los dominios VH y VL que permite que el sFv forme la estructura deseada para la unión de antígeno. Para una revisión de sFv ver Pluckthun en la farmacología de anticuerpos monoclonales, vol. 113, Rosenburg y Moore eds. , ' Springer-Verlag, Nueva York, páginas 269-315 (1994).
El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión de antigeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VD) en la misma cadena de polipéptido (VH - VD). Al utilizar un enlazador que es demasiado corto para permitir la conexión entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se fuerzan a conectarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión de antígeno. Los diacuerpos se describen más completamente en Hollinger y otros, Proc. Nati. Acad. Sol. de E.U.A., 90:6444-6448 (1993).
Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirán con diagnóstico o uso terapéutico para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteínicos o no proteínicos. En modalidades preferidas, el anticuerpo se purificará (1) para ser mayor que 95% en peso del anticuerpo como se determinó por el método de Lowry, y muy preferiblemente mayor que 99% en peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15% de residuos de secuencia de aminoácido N-terminal o interna por uso de un secuenciador de copa giratoria, o (3) para homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones de reducción o no reducción al utilizar azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recom binantes ya que al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no estará presente. De forma ordinaria, sin embargo, el cuerpo aislado se preparará mediante al menos un paso de purificación.
Como se utiliza aquí, las expresiones "célula", "linea de célula", y "cultivo de célula" se utilizan intercambiablemente y todas esas designaciones incluyen progenie. De esa forma, las palabras "transformantes" y "células transformadas) incluyen la célula de sujeto primario y cultivo derivado de la misma sin importar el número de transferencias. También se entiende que toda la progenie puede no ser precisamente idéntica en contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la progenie muíante que tiene la misma función o actividad biológica como filtrada para estar en la célula originalmente transformada. En donde se pretenden designaciones distintas, esto será claro a partir del contexto.
Los términos "polipéptido" , "péptido", y "proteína", como se utilizan aquí, son intercambiables y se definen como una biomolécula compuesta de aminoácidos enlazados por un enlace de péptido.
Los términos "un", "uno" y "él" como se utiliza aquí se definen para significar "uno o más" e incluyen los plurales a menos que el contexto sea inapropiado.
El lenguaje "enfermedades y trastornos que se provocan por o están asociados con amiloide o proteínas similares a amiloide" incluye, pero no se limita a, enfermedades y trastornos causados por la presencia o actividad de proteínas similares a amiloide en estado monomérico, de fibrilla, o polimérico, o cualquier combinación de los tres. Tales enfermedades y trastornos incluyen, pero no están limitados a, amiloidosis, tumores endocrinos, y degeneración macular.
El término "amiloidosis" se refiere un grupo de enfermedades y trastornos asociados con formación de placa amiloide que incluye, pero no está limitado a, amiloidosis secundaria y amiloidosis relacionada con la edad tal como enfermedades que incluyen, pero no están limitadas a, trastornos neurológicos tal como enfermedad de Alzheimer (AD), que incluye enfermedades o condiciones caracterizadas por una pérdida de capacidad de memoria cognitiva tales como, por ejemplo, deterioro cognitivo medio (MCI), enfermedad de Alzheimer esporádica, demencia de cuerpo de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis (tipo holandés); complejo de Parkinson de Guam-demencia , formas familiares de enfermedad de Alzheimer como demencia británica familiar (FBD) y demencia danesa familiar (FDD); así como otras enfermedades que están basadas en o asociadas con proteínas similares a amiloide tal como parálisis supranuclear progresiva, esclerosis múltiple; enfermedad de Creutzfeld Jacob, enfermedad de Parkinson, demencia relacionada con VIH, ALS (esclerosis lateral amiotrófica); miocitis de cuerpo de inclusión (IBM), Diabetes de Inicio en Adultos, y amiloidosis cardiaca senil; y varias enfermedades oculares que incluyen degeneración macular, neuropatía óptica relacionada con drusa, y catarata debido a deposición de beta-a miloide.
"Amiloide |3, ?ß o /fj-amiloide" es un término reconocido en la técnica y se refiere a proteínas y péptidos amiloide ß, proteína precursora amiloide ß (APP), así como modificaciones, fragmentos y cualquiera de los equivalentes funcionales de los mismos. En particular, cualquier amiloide ß como se utiliza aquí se pretende para cualquier fragmento producido por división proteolitica de APP pero especialmente aquellos fragmentos que están involucrados en o asociados con las patologías amiloides que incluyen, pero no se limitan a, A ß ( .38 , A ß 1.40 , ?ß1 42. Las secuencias de aminoácido de estos péptidos ?ß son como a continuación: ?ß 1-42 (SEC ID NO. 1): Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-lle-lle-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-lle-Ala ?ß 1-40 (SEC ID NO. 2): Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly- Ser-As n-Lys-Gly- Ala-I le-lle-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val ?ß 1-38 (SEC ID NO. 3): Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gl -Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gl -Ala-lle-lle-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly "pGlu-?ß" o "?ß N3pE" se refiere a formas N-terminalmente truncadas de ?ß, que inician en el residuo de ácido glutámico en la posición 3 en la secuencia de aminoácido de A (3, y en donde dicho residuo de ácido glutámico se coloca en ciclo para formar un residuo de ácido piroglutámico. En particular, por pGlu-?ß como se utiliza aquí, se indican esos fragmentos que están involucrados en o asociados con las patologías amiloides que incluyen, pero no se limitan a, pGlu-Ap3.38, pGlu-Ap3.40, p-Glu-Ap3.42.
Las secuencias de las formas N-terminalmente truncadas de ß3.4?, Ap3.42 son como a continuación: ?ß 3-42 (SEC ID NO. 4): Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val- Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gl -Ala-lle-lle-Gly-Leu- Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-lle-Ala ?ß 3-40 (SEC ID NO. 5): Glu-Phe-Arg-Hís-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val- Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-lle-lle-Gly-Leu- Met-Val-Gly-Gly-Val-Val ?ß 3-38 (SEC ID NO. 6): Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe- he-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-lle-lle-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly En particular la presente invención pertenece a los siguientes artículos: 1. Anticuerpo, caracterizado porque se une a péptídos ?ß o variantes de los mismos, preferiblemente con alta afinidad. 2. Anticuerpo de acuerdo con el artículo 1. en donde dicha alta afinidad significa un valor constante de disociación (kD) de 10"7 , o mejor. 3. Anticuerpo de acuerdo con el artículo 1 ó 2, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. 4. Anticuerpo de acuerdo con los artículos precedentes, en donde la parte variable de la cadena ligera de dicho anticuerpo tiene una secuencia de nucleótido seleccionada de SEC ID NO: 49, 53, 57 y 61, o una secuencia de aminoácido seleccionadas de SEC ID NO: 50, 54, 58, y 62. 5. Anticuerpo de acuerdo con cualquiera de los artículos precedentes, en donde la parte variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada de SEC ID NO: 51, 55, 59 y 63, o una secuencia de aminoácido seleccionadas de SEC ID NO: 52, 56, 60 y 64. 6. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de los artículos precedentes, en donde la parte variable de la cadena ligera de dicho anticuerpo tiene la secuencia de nucleótido de SEC ID NO: 49 o la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 50, y en donde la parte variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo tiene la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 51, o la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 52. 7. Anticuerpo de acuerdo con cualquier de los artículos precedentes, en donde la parte variable de la cadena ligera de dicho anticuerpo tiene la secuencia de nucleótido de SEC ID NO: 53 o la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 54, y en donde la parte variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo tiene la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 55, o la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 56. 8. Anticuerpo de acuerdo con cualquiera de los artículos precedentes, en donde la parte variable de la cadena ligera de dicho anticuerpo tiene la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO. 57 o la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 58, y en donde la parte variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo tiene la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 59, o la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 60. 9. Anticuerpo de acuerdo con cualquiera dé los artículos precedentes, en donde la parte variable de la cadena ligera de dicho anticuerpo tiene la secuencia de nucleótido de SEC ID NO: 61 o la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 62, y en donde la parte variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo tiene la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 63, o la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 64. 10. Anticuerpo de acuerdo con cualquiera de los artículos precedentes, en donde dicho anticuerpo se selecciona del siguiente grupo: ?ß 5-5-6 (depósito No. DSM ACC 2923) ?ß 6-1-6 (depósito No. DSM ACC 2924) ?ß 17-4-3 (depósito No. DSM ACC 2928) ?ß 24-2-3 (depósito No. DSM ACC 2926) o variantes funcionales de los mismos. 11. Anticuerpo de acuerdo con cualquiera de los artículos precedentes, en donde dicho anticuerpo es Ap 6-1-6 (Depósito No. DSM ACC 2924). 12. Anticuerpo de acuerdo con cualquiera de los artículos precedentes, en donde dicho anticuerpo es ?ß 24-2-3 (Deposito No. DSM ACC 2926). 13. Anticuerpo de acuerdo con cualquiera de los artículos precedentes, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado o quimérico, o un fragmento de anticuerpo que retiene la alta afinidad. 14. Anticuerpo de acuerdo con cualquiera de los artículos precedentes para uso en la detección de péptido ?ß o variantes del mismo. 15. Anticuerpo de acuerdo con el articulo 14, en donde dichas variantes se seleccionan del siguiente grupo: pGlu-Ap3.x variantes, en donde x es un entero entre 10 y 42; preferiblemente 18 y 42, más preferiblemente 30 y 42. 16. Anticuerpo de acuerdo con cualquiera de los artículos precedentes, que es humano. 17. Anticuerpo de acuerdo con cualquiera de los artículos precedentes, que es un diacuerpo o un anticuerpo de cadena individual que retiene la alta afinidad. 18. Anticuerpo de acuerdo con cualquiera de los artículos precedentes, que se une al epítopo unido por anticuerpos definidos en el artículo 15. 19. Anticuerpo de acuerdo con cualquiera de los artículos precedentes, que tiene las regiones de determinación de complementariedad de los anticuerpos como se define en el artículo 15. 20. Anticuerpo de acuerdo con cualquiera de los artículos precedentes, que está etiquetado. 21. Anticuerpo de acuerdo con cualquiera de los artículos precedentes, que está inmovilizado en una fase sólida. 22. Anticuerpo obtenido de cualquiera de las líneas de célula de hibridoma, DSM ACC 2923, DSM ACC 2924, DSM ACC 2925, DSM ACC 2926. 23. Composición que comprende el anticuerpo como se define en cualquiera de los artículos precedentes. 24. Composición de acuerdo con el articulo 23 para el tratamiento, prevención o retraso de amiloidosis. 25. Composición de acuerdo con el artículo 23 ó 24, en donde dicha amiloidosis es una enfermedad neurovegetativa seleccionada del grupo que consiste de deterioro cognitivo medio, enfermedad de Alzheimer y neurodegeneración en síndrome de Down. 26. Composición de acuerdo con el artículo 23 ó 24, en donde dicha amiloidosis es enfermedad de Alzheimer esporádica o una demencia de Alzheimer familiar. 27. Composición de acuerdo con el artículo 26', en donde dicha demencia de Alzheimer familiar es demencia británica familiar o demencia danesa familiar. 28. Linea de célula de hibridoma DSM ACC 2923. 29. Línea de célula de hibridoma DSM ACC 2924. 30. Línea de célula de hibridoma DSM ACC 2925. 31. Línea de célula de hibridoma DSM ACC 2926. 32. El uso del anticuerpo como se define En cualquiera de los artículos 1 a 22 o la composición como se definen en cualquiera de los artículos 23 a 27 en un método de diagnóstico o terapéutico. 33. El uso de acuerdo con el artículo 32 para el diagnóstico de una enfermedad o condición asociada con amiloide. 34. El uso de acuerdo con el artículo 33, en donde dicha amiloidosis es una enfermedad neurodegenerativa seleccionada del grupo que consiste de deterioro cognitivo medio, enfermedad de Alzheimer y neurodegeneración en síndrome de Down. 35. El uso de acuerdo con el artículo 33, en donde dicha amiloidosis es, una enfermedad de Alzheimer esporádica o una demencia de Alzheimer familiar. 36. El uso de acuerdo con el artículo 35, en donde dicha demencia de Alzheimer familiar es demencia británica familiar o demencia danesa familiar. 37. El método de diagnóstico in vitro para el diagnóstico de una enfermedad o condición asociada con amiloide, en particular enfermedad de Alzheimer, que comprende los siguientes pasos: poner en contacto un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de los artículos 1 a 22 con una muestra de un sujeto que se sospecha que padece dicha enfermedad o condición, y detectar la unión del anticuerpo a una proteína pGlu-amiloide, preferiblemente un péptido pGlu-?ß de la muestra. 38. El equipo de diagnóstico, que comprende el anticuerpo como se define en cualquiera de los artículos 1 a 22, y las instrucciones para uso, y, ocasionalmente, (a) substancia(s) biológicamente activa adicional. 39. El equipo de diagnóstico del artículo 32, en. donde dicha substancia biológica adicional es un inhibidor de glutaminíl ciclasa. 40. Un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste de SEC ID NO: 23 a 48.
Los anticuerpos de la invención pueden ser útiles para el diagnóstico de amiloidosis.
Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse como agentes de purificación de afinidad. En este procedimiento, los anticuerpos se inmovilizan en una fase sólida tal como una resina Sephadex o papel de filtro, al utilizar métodos bien conocidos en la técnica. El anticuerpo inmovilizado se contacta con una muestra que contiene el ?ß-péptido (o fragmento del mismo) que se va a purificar, y después de eso el soporte se lava con un solvente adecuado que removerá substancialmente todo el material en la muestra excepto el ?ß- péptido, que se une al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro solvente adecuado, tal como regulador de pH de glicina, pH 5.0 que liberará el ?ß-péptido desde el anticuerpo.
Los anticuerpos anti-A -péptido también pueden ser útiles en ensayos de diagnóstico para ?ß-péptido, por ejemplo que detecta su ocurrencia en células, tejidos, o suero específico. De esa forma, los anticuerpos pueden utilizarse en el diagnóstico de amiloidosis, en particular una enfermedad neurodegenerativa seleccionada del grupo que consiste de deterioro cognitivo medio (MCI), enfermedad de Alzheimer (AD), como por ejemplo enfermedad de Alzheimer esporádico (SAD) o demencias de Alzheimer familiar (FAD) tal como demencia británica familiar (FBD) y Demencia Danesa Familiar (FDD) y neurodegeneración en síndrome de Down; preferiblemente enfermedad de Alzheimer.
Para aplicaciones de diagnóstico, el anticuerpo típicamente se etiquetará con una porción detectable. Están disponibles numerosas etiquetas que pueden agruparse generalmente en las siguientes categorías: (a) Los radioisótopos, tal como 35s, 14c, 125,, 3H, y 131,. El anticuerpo puede etiquetarse con el radioisótopo que utiliza las técnicas descritas en los Protocolos Actuales en Inmunología, volúmenes 1 y 2, Gütigen y otros, Ed., Wiley-lnterscience. Nueva York, Pubs., (1991) por ejemplo y radiactividad puede medirse al utilizar un conteo de titilación. (b) Las etiquetas fluorescentes tal como quelatos de tierra raros (quelatos de europio) o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, Lisamina, ficoeritrina y Rojo Texas están disponibles. Las etiquetas fluorescentes pueden conjugarse para el anticuerpo que utiliza la técnica descrita en Protocolos Actuales en Inmunología, anterior por ejemplo. La florescencia puede cuantificarse al utilizar un fluorímetro. (c) Están disponibles varias etiquetas de sustrato de enzima. La enzima generalmente cataliza una alteración química del sustrato cromogénico que puede medirse al utilizar varias técnicas. Por ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio de color en un sustrato, que puede medirse espectrof otométricamente. Alternativamente, la enzima puede alterar la florescencia o quimioluminiscencia del sustrato. Las técnicas para cuantificar un cambio en florescencia se describen anteriormente. El sustrato quimioluminiscente se estimula electrónicamente por una reacción química y entonces puede emitir luz que puede medirse (al utilizar un quimioluminómetro, por ejemplo) o dando energía a un aceptador fluorescente. Ejemplos de etiquetas enzimáticas incluyen luciferasas (por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana; la Patente de E.U.A. No. 4,737,456), luciferina, 2, 3-dihidroftalazineidones, malato hidrogenasa, ureasa, peroxidasa tal como peroxidasa de rábano (HRPO), fosfatasa alcalina. 0-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas de sacárido (por ejemplo, glucosa oxidasa, lactosa oxidasa, y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), oxidasas heterocíclicas (tal como uricasa y xantina oxidasas), lactoperoxidasa, microperoxidasa, y similares. Las técnicas para conjugar enzimas a anticuerpos se describen en O'Sullivan y otros, Métodos para la preparación de conjugados de anticuerpo de enzima para uso de inmunoensayo de enzima, en métodos en enzima (ed Langone & H. Van Vunakis), Nueva York, 73:147-166 (1981).
Los ejemplos de combinaciones de sustrato de enzima incluyen, por ejemplo: (i) peroxidasa de rábano (HRPO) con peroxidasa de hidrógeno como un sustrato, en donde la peroxidasa de hidrógeno oxida un precursor de tinte (por ejemplo, ortofenilen diamina (OPD) o clorhidrato de 3,3, 5, 5'-tetrametil bencidina (TMB)); (¡i) fosfatasa alcalina (AP) con para-Nitrofenil fosfato como sustrato cromogénico; y (iii) ß-D-galactosidasa (ß -D-Gal) con un sustrato cromogénico (por ejemplo p-nitrofenil- -D-galactosidasa) o el sustrato fluorogénico 4-metilumbeliferil-p -D-galactosidasa.
Numerosas otras combinaciones de enzima-sustrato están disponibles para aquellos expertos en la técnica.
Algunas veces, la etiqueta está indirectamente conjugada con el anticuerpo. El experto en la técnica estará consciente de varias técnicas lograr esto. Por ejemplo, el anticuerpo puede conjugarse con biotina y cualquiera de las tres categorías amplias de las etiquetas mencionadas anteriormente puede conjugarse con avidina, o viceversa. La biotina se une selectivamente a avidina, y de esa forma, la etiqueta puede conjugarse con el anticuerpo en esta forma indirecta. Alternativamente, para lograr la conjugación indirecta de la etiqueta con el cuerpo, el anticuerpo se conjuga con un pequeño apten (por ejemplo, digoxina) y uno de los diferentes tipos de etiquetas mencionados anteriormente se conjuga con un anticuerpo anti-hapten (por ejemplo, anticuerpo anti-digoxina). De esa forma, puede lograrse la conjugación indirecta de la etiqueta con el anticuerpo.
El anticuerpo ?ß necesita no estar etiquetado, y la presencia del mismo puede detectarse al utilizar un anticuerpo etiquetado, que se une al anticuerpo ?ß.
Los anticuerpos de la presente invención pueden emplearse en cualquier método de ensayo conocido, tal como ensayos de unión competitivos, ensayos de emparedado directo e indirecto, y ensayos de inmunoprecipitación. Zola, anticuerpos monoclonales un manual de técnicas, páginas 145-148 (CRC Press. Inc., 1987).
Los ensayos de unión competitivos confían en la capacidad de un estándar etiquetado para competir con el analito de muestra de prueba para unirse con una cantidad limitada de anticuerpo. La cantidad de péptido ?ß en la muestra de prueba es inversamente proporcional a la cantidad de estándar que se une a los anticuerpos. Para facilitar determinar la cantidad de estándar que se une, los anticuerpos generalmente son insolubilizados antes o después de la competencia, para que el estándar y el analito que se unen a los anticuerpos puedan separarse convenientemente del estándar y el analito que permanecen separados.
Los ensayos de emparedado involucran el uso de dos anticuerpos, cada uno capaz de unirse a una porción inmunogénica diferente, o epítopo, de la proteina que se va a detectar. En un ensayo de emparedado, el analito de muestra de prueba está unido por un primer anticuerpo que está inmovilizado en un soporte sólido, y después de eso un segundo anticuerpo se une al analito, formando de esa forma un complejo de tres partes insoluble. El segundo anticuerpo por sí mismo puede etiquetarse con una porción detectable (ensayos de emparedado directos) o puede medirse al utilizar un anticuerpo anti-inmunoglobulina que se etiqueta con una porción detectable (ensayo de emparedado indirecto). Por ejemplo, un tipo preferible de ensayo de emparedado es un ensayo ELISA, en cuyo caso la porción detectable es una enzima.
Para inmunohistoquímica, la muestra de tejido puede ser nueva o congelada o puede incorporarse en parafina y fijarse con un conservador tal como formalina, por ejemplo.
Equipos de diagnóstico Como un asunto de conveniencia, el anticuerpo de la presente invención puede proporcionarse en un equipo, es decir, una combinación empaquetada de reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones para realizar el ensayo de diagnóstico. En donde el anticuerpo se etiqueta con una enzima, el equipo incluirá sustratos y co-factores requeridos por la enzima (por ejemplo un precursor de sustrato que proporciona el cromóforo detectable de fluoróforo). Además, otras actividades pueden incluirse tal como estabilizadores, reguladores de pH (por ejemplo, un regulador de pH de bloque o regulador de pH de lísis) y similares Las cantidades relativas de los varios reactivos pueden variarse ampliamente para proporcionar concentraciones en solución de los reactivos que optimizan substancíalmente la sensibilidad del ensayo. Particularmente, los reactivos pueden proporcionarse como polvos secos, usualmente liofilizados, que incluyen excipientes que con la vez disolución proporcionarán una disolución de reactivo que tiene la concentración apropiada.
El equipo de diagnóstico de acuerdo con la invención puede contener una sustancia biológicamente activa adicional como se describe a continuación. Especialmente preferidos para el uso en el equipo de diagnóstico son los inhibidores de glutaminil ciclasa.
El equipo de diagnóstico de la invención es especialmente útil para la detección y diagnóstico de enfermedades asociadas con amiloide y condiciones, en particular enfermedades neurovegetativas particulares seleccionadas del grupo que consiste de deterioro cognitivo medio (MCI), enfermedad de Alzheimer (AD), como por ejemplo enfermedad de Alzheimer esporádica (SAD) o demencias de Alzheimer familiares (FAD) como demencia británica familiar (FBD) y demencia danesa familiar (FDD), neurodegeneración en síndrome de Down; preferiblemente enfermedad de Alzheimer.
La presente invención pertenece en particular a anticuerpos están caracterizados porque se unen al péptido A|3 con una alta afinidad. La presente invención también pertenece a anticuerpos que están caracterizados porque se unen a péptidos ?ß o variantes de los mismos con una alta afinidad. Dicha alta afinidad significa en el contexto de la presente invención una afinidad de un valor K0 de 10"7 M o mejor, preferiblemente un valor KD de 10"8 M o mejor, e incluso más preferiblemente un valor KD de 10"9 M - 10"12 M. Consecuentemente, los anticuerpos inventivos se unen al péptido A|3 con una afinidad superior a los anticuerpos previamente conocidos.
En particular el anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo monoclonal y se selecciona del grupo a continuación ?ß 5-5-6 (DSM ACC 2923) ?ß 6-1-6 (DSM ACC 2924) ?ß 17-4-3 (DSM ACC 2925) ?ß 24-2-3 (DSM ACC 2926) El anticuerpo de acuerdo con la presente invención es especialmente útil en un método de diagnóstico para detectar amiloidosis, en particular una enfermedad neurodegenerativa seleccionada del grupo que consiste de deterioro cognitivo medio (MCI), enfermedad de Alzheimer (AD), como por ejemplo enfermedad de Alzheimer esporádica (SAD) o demencias de Alzheimer familiares (FAD) como demencia británica familiar (FBD) y demencia danesa familiar (FDD), neurodegeneración en síndrome de Down; preferiblemente enfermedad de Alzheimer.
De acuerdo con una modalidad preferida, el anticuerpo puede ser humanizado o es un anticuerpo quimérico o es un anticuerpo humano.
Además, el anticuerpo como se seleccionó del grupo antes mencionado también puede ser una variante funcional de dicho grupo.
En el contexto de la presente invención, una variante de un péptido p-Glu-?ß es en particular pGlu-A 3.40, pGlu-Ap3.42 Variantes adicionales de péptidos ?ß son todas las variantes pGlu-Ap3.X) que se mostraron para acumularse en el. cerebro como una consecuencia de enfermedad de Alzheimer o enfermedad de Alzheimer precedente. X se define como un entero entre 10 y 42, por ejemplo en el pGlu-Ap3_ 2, anterior, "42" será el entero para "x".
En el contexto de la presente invención una "variante funcional" el anticuerpo inventivo es un anticuerpo que retiene las capacidades de unión, en particular capacidades de unión con alta afinidad a un péptido pGlu-AP;¾.x o variante funcional del mismo. La provisión de tales variantes funcionales se conoce en la técnica y abarca las posibilidades antes mencionadas, que se indican bajo la definición de anticuerpos y fragmentos de los mismos.
En una modalidad preferida, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, como se define anteriormente.
En una modalidad preferida adicional, el anticuerpo inventivo es un anticuerpo que se une al epítopo que está unido por los anticuerpos como se define anteriormente, en particular el anticuerpo 5-5-6, anticuerpo 6-1-6, anticuerpo 17-4-3 y anticuerpo 24-2-3.
En una modalidad preferida adicional, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo que tiene las regiones de determinación de complementariedad (CDR) de los anticuerpos antes definidos. Preferiblemente, el anticuerpo puede etiquetarse; etiquetas posibles son aquellas como se menciona anteriormente y todas aquellas conocidas por un experto en la técnica de usos de diagnóstico de anticuerpos en particular.
Preferiblemente, el anticuerpo está inmovilizado en una fase sólida.
La presente invención también se refiere a un anticuerpo que se puede obtener por la línea de célula de hibridoma 6-1-6 (DSM ACC 2924).
La presente invención también se refiere a una composición que comprende el anticuerpo como se define anteriormente. En particular, dicha composición es una composición para un uso de diagnóstico, especialmente para el diagnóstico de una enfermedad neurodegenerativa seleccionada del grupo que consiste de deterioro cognitivo medio (MCI), enfermedad de Alzheimer (AD), como por ejemplo enfermedad de Alzheimer esporádica (SAD) o demencias de Alzheimer familiares (FAD) como Demencia Británica Familiar (FBD) y Demencia Danesa Familiar (FDD), neurodegeneracion en síndrome de Down; preferiblemente enfermedad de Alzheimer; en particular por detección de péptido ?ß o variantes del mismo en una muestra biológica.
En otra modalidad, el anticuerpo de acuerdo con la invención y como se describe aquí anteriormente o un fragmento del mismo, exhibe una afinidad de unión a un oligómero ?ß, fibra, fibrilla o filamento que es al menos 2 veces, particularmente al menos 4 veces, particularmente al menos 10 veces, particularmente al menos 15 veces, más que particularmente al menos 20 veces, pero especialmente al menos 25 veces superior que la afinidad de unión a un monómero ?ß.
Incluso en otra modalidad, un anticuerpo o un fragmento del mismo o un anticuerpo quimérico o un fragmento del mismo, o un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo se proporciona como se describe aquí anteriormente, cuyo anticuerpo substancialmente se une a ?ß agregado, que incluye placas ?ß, en el mamífero, particularmente el cerebro humano, pero preferiblemente, no muestra ninguna reactividad cruzada con proteína de precursor amiloide (APP).
En otro aspecto de la' invención, el anticuerpo o un fragmento del mismo o el anticuerpo quimérico o un fragmento del mismo, o un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo se proporciona como se describe aquí anteriormente, cuyo anticuerpo substancialmente se une a un amiloide polimérico soluble, particularmente amiloide ß (?ß), que incluye monómeros ?ß, en el mamífero, particularmente el cerebro humano pero, preferiblemente, no muestra ninguna reactividad cruzada con proteína de precursor amiloide (APP).
La presente invención se refiere a formas humanizadas de los anticuerpos como se define anteriormente, composiciones que comprenden dichos anticuerpos humanizados y el uso de dichas composiciones para el tratamiento de amiloidosis, especialmente para el tratamiento de enfermedad neurodegenerativa en un mamífero, en particular en un humano. Dicha enfermedad neurodegenerativa es en particular seleccionada del grupo que consiste de deterioro cognitivo medio (MCI), enfermedad de Alzheimer (AD), como por ejemplo enfermedad de Alzheimer esporádica (SAD) o demencias de Alzheimer familiar (FAD) como demencia británica familiar (FBD) y demencia danesa familiar (FDD), neurodegeneración en síndrome de Down. Preferiblemente en dicha enfermedad neurodegenerativa es enfermedad de Alzheimer.
La presente invención también está dirigida a las siguientes líneas de células de hibridoma 5-5-6, 6-1-6, 17-4-3 y 24-2-3.
La presente invención también pertenece al uso del anticuerpo o la composición que comprende el anticuerpo, tanto como se define anteriormente, para uso en un método de diagnóstico in vitro. En particular, este método de diagnóstico está dirigido a diagnóstico de una enfermedad neurodegenerativa seleccionada del grupo que consiste de deterioro cognitivo medio (MCI), enfermedad de Alzheimer (AD), como por ejemplo enfermedad de Alzheimer esporádica (SAD) o demencias de Alzheimer familiar (FAD) como Demencia Británica Familiar (FBD) y Demencia Danesa Familiar (FDD), neurodegeneración en síndrome de Down; preferiblemente enfermedad de Alzheimer; especialmente al detectar un péptido ?ß o variantes del mismo en una muestra biológica.
Preferiblemente, dicha muestra es una muestra de suero.
De acuerdo con otra modalidad preferida, dicha muestra es un licor o muestra de fluido cerebroespinal (CSF).
En una modalidad particularmente preferida, la presente invención pertenece al siguiente método: Método de diagnóstico in vitro o in situ para el diagnóstico de una enfermedad o condición asociada con amiloide, preferiblemente enfermedad de Alzheimer, que comprende los siguientes pasos: poner en contacto un anticuerpo de acuerdo con la invención con una muestra, preferiblemente seleccionada de un suero, licor o muestra CSF, muy preferiblemente una muestra de suero; o una parte de cuerpo específica o área de cuerpo de un sujeto que se sospecha que padece dicha condición o enfermedad, y detectar la unión del anticuerpo a una proteína de amiloide pGlu, preferiblemente un péptido pGlu-?ß, de la muestra.
Más particularmente, la invención se refiera a un método de diagnóstico de una enfermedad o condición asociada con amiloide, preferiblemente enfermedad de Alzhetmer, que. comprende detectar la unión inmunoespecíf ica de un anticuerpo o un fragmento activo del mismo a una proteína de amiloide pGlu, preferiblemente péptido pGlu-Ap, en una muestra o in situ que incluye los pasos de, (a) llevar la muestra o una parte de cuerpo especifica o área de cuerpo que se sospecha que contiene la proteina amiloide en contacto con un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la invención, o un anticuerpo quimérico o un fragmento del mismo, o un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo de acuerdo co.n la invención y como se describe aquí anteriormente, y/o una parte funcional del mismo, cuyo anticuerpo se une a un péptido pGiu-Ap; (b) permitir que el anticuerpo y/o una parte funcional del mismo, se una al péptido pGlu-?ß para formar un complejo inmunológico; (c) detectar la formación del complejo inmunológico; y (d) correlacionar la presencia o ausencia del complejo inmunológico con la presencia o ausencia de péptido pGlu-?ß en la muestra o parte o área de cuerpo específica.
También comprendido está un método para determinar la extensión de carga de placa amiloidogénica en un tejido y/o fluidos corporales que comprende, (a) obtener una muestra representativa del tejido y/o fluidos corporales bajo investigación; (b) probar dicha, muestra para la presencia de proteína amiloide con un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la invención, o un anticuerpo quimérico o un fragmento del mismo, o un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo de acuerdo con la invención y como se describe aquí anteriormente, y/o una parte funcional del mismo; (c) determinar la cantidad de anticuerpo unido a la proteína; y (d) calcular la carga de placa en el tejido y/o fluidos corporales.
En particular, la invención se refiere a un método para determinar la extensión de carga de placa amiloidogénica en un tejido y/o fluidos corporales, en donde la formación del complejo inmunológico en el paso c) se determina para que la presencia o ausencia del complejo inmunológico se correlacione con la presencia o ausencia de proteína amiloide, en particular péptidos pGlu-?ß.
Incluso en otra modalidad, la invención se refiere a composición que comprende el anticuerpo de acuerdo con la invención, o un anticuerpo quimérico o un fragmento del mismo, o un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo de acuerdo con la invención y como se describe aquí anteriormente que incluye cualquier anticuerpo funcionalmente equivalente o cualquier derivado o partes funcionales del mismo, en una cantidad terapéuticamente efectiva, en particular una composición que es una composición farmacéutica que opcionalmente además comprende un portador farmacéuticamente aceptable.
En otra modalidad de la invención, dicha composición comprende el anticuerpo en una cantidad terapéuticamente efectiva. Además, comprendida por la invención está una mezcla que comprende un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la invención, o un anticuerpo quimérico o un fragmento del mismo, o un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo de acuerdo con la invención y como se describe aquí anteriormente que incluye cualquier anticuerpo funcionalmente equivalente a cualquier derivado o partes funcionales del mismo, en una cantidad terapéuticamente efectiva y, opcionalmente, una substancia biológicamente activa adicional y/o un portador farmacéuticamente aceptable y/o un diluyente y/o un excipiente.
En particular, la invención se refiere a una mezcla, en donde la substancia biológicamente activa adicional es un compuesto utilizado en la medicación de amiloidosis, un grupo de enfermedades y trastornos asociados con amiloide o proteína similar a amiloide tal como la proteína ?ß involucrada en enfermedades neurodegenerativas seleccionadas del grupo que consiste del deterioro cognitivo medio (MCI), enfermedad de Alzheimer (AD), similar como por ejemplo enfermedad de Alzheimer esporádico (SAD) o demencia de Alzheimer familiar (FAD) como demencia británica familiar (FBD) y Demencia Danesa Familiar (FDD), neurodegeneración en síndrome de Down; preferiblemente enfermedad de Alzheimer.
En otra modalidad de la invención, la otra substancia biológicamente activa o compuesto también puede ser un agente terapéutico que puede utilizarse en el tratamiento de amiloidosis causado por amiloide ß o puede utilizarse en el medicamento de los otros trastornos neurológicos.
La otra substancia biológicamente activa o compuesto puede ejercer su efecto biológico por un mecanismo igual o similar al anticuerpo de acuerdo con la invención o por un mecanismo no relacionado de acción o por una multiplicidad de mecanismos relacionados y/o no relacionados de acción.
Generalmente, el otro compuesto biológicamente activo puede incluir potenciadores de transmisión de neutrón, fármacos psicoterapéuticos, inhibidores de esterasa de acetil colinesterasa, bloqueadores de canal de calcio, aminas biogénicas, tranquilizantes de benzodiazepina, síntesis de acetilcolina, potenciadores de almacenamiento o liberación, agonistas de receptor de acetilcolina posinápticos, inhibidores de monoamina oxidasa-A o -B, antagonistas de receptor de N-metil-D-aspartato glutamato, fármacos antiinflamatorios sin esferoides, antioxidantes, y antagonistas receptores serotonérgicos. Más particularmente, la invención se refiere a una mezcla que comprende al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de compuestos efectivos contra tensión oxidante, compuestos anti-apoptóticos, quelatadores metálicos, inhibidores de reparación de ADN tales como pirenzepina y metabolitos, ácido 3-amino-1 -propansulfónico (3 APS), 1, 3-propandisuifanoto (1, 3PDS), activadores de a-secretasa, inhibidores de ß- y ?-secretasa, proteínas tau, neurotransmisor, interruptores de 3-lamina, atrayentes para eliminación beta amiloide/vaciado de componentes celulares, inhibidores de amiloide beta truncado N-terminal que incluye amiloide beta 3-42 piroglutamatado, tales como inhibidores de glutaminil ciclasa, moléculas anti-inflamatorias, o inhibidores de colinesterasa (ChEIs) tales como tacrina, rivastigmina, donepezil, y/o galantamina, agonistas MI y otros fármacos que incluyen cualquier amiloide o fármaco de modificación tau y complementos nutritivos, y complementos nutritivos, junto con un anticuerpo de acuerdo con la presente invención y, opcionalmente, un portador farmacéuticamente aceptable y/o un diluyente y/o un excipiente.
La invención además se refiere a una mezcla, en donde el compuesto es un inhibidor de colinesterasa (ChEIs), particularmente una mezcla, en donde el compuesto es uno seleccionado del grupo que consiste de tacrina, rivastigmina, donepezil, galantamina, niacina y memantina.
En una modalidad adicional, las mezclas de acuerdo con la invención pueden comprender niacina o memantina junto con un anticuerpo de acuerdo con la presente invención y, opcionalmente, un portador farmacéuticamente aceptable y/o un diluyente y/o un excipiente.
En una modalidad adicional, las mezclas de acuerdo con la invención pueden comprender un inhibidor de glutaminil ciclasa junto con un anticuerpo de acuerdo con la presente ' mención y, opcionalmente, un portador farmacéuticamente aceptable y/o un diluyente y/o un excipiente.
Los inhibidores preferidos de glutaminil ciclasa se describen en WO 2005/075436, en particular ejemplos 1-141 como se muestra en las páginas 31-40. La síntesis de los ejemplos 1-141 se muestra en las páginas 40-48 de WO 2005/075436. La descripción de WO 2005/075436 con respecto a los ejemplos 1-141, su síntesis y su uso como inhibidores de glutaminií ciclasa se incorpora aquí por referencia.
Los inhibidores preferidos adicionales de glutaminií ciclasa se describen en WO 2008/055945, en particular los ejemplos 1-473 como se muestra en las páginas 46-155. La síntesis de los ejemplos 1-473 se muestra en las páginas 156-192 de WO 2008/055949. La descripción de WO 2008/055945 con respecto a los ejemplos 1-473, su síntesis y su uso como inhibidores de glutaminií ciclasa se incorpora aquí por referencia.
Los inhibidores preferidos adicionales de glutaminií ciclasa se describen en WO 2008/055947, en particular los ejemplos 1-345 como se muestra en las páginas 53-118. La síntesis de los ejemplos 1-345 se muestra en las páginas 119-133 de WO 2008/055947. La descripción de WO 2008/055947 con respecto a los ejemplos 1-345, su síntesis y su uso como inhibidores de glutaminií ciclasa se incorpora aquí por referencia.
Los Inhibidores preferidos adicionales de glutaminií ciclasa se describen en WO 2008/055950, en circular los ejemplos 1-212 como se muestra en las páginas 57-120. La síntesis de los ejemplos 1-212 se muestra en las páginas 121-128 de WO 2008/055950. La descripción de WO 2008/055950 con respecto a los ejemplos 1-212, su síntesis y su uso como inhibidores de glutaminií ciclasa se incorpora aquí por referencia.
Los inhibidores preferidos adicionales de glutaminil ciclasa se describen en WO 2008/065141, en particular los ejemplos 1-25 como se muestra en las páginas 56-59. La síntesis de los ejemplos 1-25 se muestra en las páginas 60-67 de WO 2008/065141. La descripción de WO 2008/065141 con respecto a los ejemplos 1-25, su síntesis y su uso como inhibidores de glutaminil ciclasa se incorpora aquí por referencia .
Los inhibidores preferidos adicionales de glutaminil ciclasa se describen en WO 2008/110523, en particular los ejemplos 1-27 como se muestra en las páginas 55-59. La síntesis de los ejemplos 1-27 se muestra en las páginas 59-71 de WO 2008/110523. La descripción de WO 2008/110523 con respecto a los ejemplos 1-27, su síntesis y su uso como inhibidores de glutaminil ciclasa se incorpora aquí por referencia.
Los inhibidores preferidos adicionales de glutaminil ciclasa se describen en WO 2008/128981, en los ejemplos particulares 1-18 como se muestra En las páginas 62-65. La síntesis de los ejemplos 1-18 se muestra en las páginas 65-74 de WO 2008/128981. La descripción de WO 2008/128951 con respecto a los ejemplos 1-18, su síntesis y su uso como inhibidores de glutaminil ciclasa se incorpora aquí por referencia.
Los inhibidores preferidos adicionales de glutaminil ciclasa se describen en WO 2008/128982, en particular los ejemplos 1-44 como se muestra en las páginas 61-67. La síntesis de los ejemplos 1-44 se muestra en las páginas 68-83 de WO 2008/128982. La descripción de WO 2008/128982 con respecto a los ejemplos 1-44, su síntesis y su uso como inhibidores de glutaminil ciclasa se incorpora aquí por referencia.
Los inhibidores preferidos adicionales de glutaminil ciclasa se describen en WO 2008/128983, en particular los ejemplos 1-30 como se muestra en las páginas 64-68. La síntesis de los ejemplos 1-30 se muestra en las páginas 68-80 de WO 2008/128983. La descripción de WO 2008/128983 con respecto a los ejemplos 1-30, su síntesis y su uso como inhibidores de glutaminil ciclasa se incorpora aquí por referencia.
Los inhibidores preferidos adicionales de glutaminil ciclasa se describen en WO 2008/128984, en particular los ejemplos 1-36 como se muestra en las páginas 63-69. La síntesis de los ejemplos 1-36 se muestra en las páginas 69-81 de WO 2008/128984. La descripción de WO 2008/128984 con respecto a los ejemplos 1-36, su síntesis y su uso como inhibidores de glutaminil ciclasa se incorpora aquí por referencia.
Los inhibidores preferidos adicionales de glutaminil ciclasa se describen en WO 2008/128985, en particular los ejemplos 1-71 como se muestra en las páginas 66-76. La síntesis de los ejemplos 1-71 se muestra en las páginas 76-98 de WO 2008/128985. La descripción de WO 2008/128985 con respecto a los ejemplos 1-71, su síntesis y su uso como inhibidores de glutaminil ciclasa se incorpora aquí por referencia.
Los inhibidores preferidos adicionales de glutaminil ciclasa se describen en WO 2008/128986, en particular los ejemplos 1-7 como se muestra en las páginas 65-66. La síntesis de los ejemplos 1-7 se muestra en las páginas 66-76 de WO 2008/128986. La descripción de WO 2008/128986 con respecto a los ejemplos 1-7, su síntesis y su uso como inhibidores de glutaminil ciclasa se incorpora aquí por referencia.
Incluso en otra modalidad de la invención se proporcionan mezclas que comprenden "antipsicóticos atípicos" tal como, por ejemplo clozatina, ziprasidona, risperidona, aripiprasol u olanzapina para el tratamiento de síntomas psicóticos positivos y negativos que incluyen alucinaciones, ilusiones, trastornos de pensamiento (manifestados por incoherencia marcada, descarrilamiento, tangencialidad), y comportamiento bizarro o desorganizado, así como anhedonia, afecto disminuido, apatía, y aislamiento social, junto con un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la invención, pero particularmente un anticuerpo quimérico o un fragmento del mismo, o un anticuerpo humanizado a un fragmento del mismo de acuerdo con la invención y como se describe aquí y, opcionalmente, un portador farmacéuticamente aceptable y/o un diluyente y/o un excipiente.
En una modalidad específica de la invención, las composiciones y mezclas de acuerdo con la invención y como se describe aquí anteriormente comprenden el anticuerpo y la sustancia biológicamente activa, respecti amente, en una cantidad terapéuticamente efectiva.
Otros compuestos que pueden ser utilizados adecuadamente en mezclas en combinación con el anticuerpo de acuerdo con la presente invención se describen en WO 2008/065141 (ver especialmente páginas 37/38), que incluyen inhibidores de PEP (páginas 43/44), LiCI, inhibidores de dipeptidil aminopeptidasas , preferiblemente inhibidores de DP IV o enzimas similares a DP IV (ver páginas 48/49); inhibidores de acetil colinesterasa (ACE) (ver página 47), potenciadores de PIMT, inhibidores de beta secretasas (ver página 41), inhibidores de gama secretasa (ver páginas 41/42), inhibidores de endopeptidasa neutra, inhibidores de fosfodiesterasa-4 (PDE-4) (ver páginas 42/43), inhibidores TNFalfa, antagonistas de receptor M1 muscarínico (ver página 46), antagonistas de receptor N DA (ver páginas 47/48), inhibidores de receptor sigma-1, antagonistas de histamina H3 (ver página 43), agentes inmunomoduladores, agentes inmunosupresores o un agente seleccionado del grupo que consiste de antegren (natalizumab), Neurolan (fampridina-SR), campat (alemtzumab), IR 208, NB1 5788/MSP 771 (tiplimotida), paclitaxel, Anergix.MS (AG 284), SH 636, Diferina (CD 271, adapaleno), BAY 361677 (interleucina-4) , inhibidores de metaloproteinasa (por ejemplo, BB 76163), interferón-tau (trofoblastina) y SAIK-MS; anticuerpos de beta-amiloide (ver página 44), inhibidores de proteasa de cisteína (ver página 44); antagonistas MCP-1 (ver páginas 44/35), inhibidores de deposición de proteína amiloide (ver 42) e inhibidores de síntesis de beta amiloide (ver página 42), dicho documento se incorpora aquí por referencia .
En otra modalidad, la invención se refiere a una mezcla que comprende el anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal para la invención, o un anticuerpo quimérico o un fragmento del mismo, o un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo de acuerdo con la invención y como se describe aquí anteriormente y/o la sustancia biológicamente activa en una cantidad terapéuticamente efectiva.
La invención además se refiere al uso de un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la invención, pero particularmente un anticuerpo quimérico o un fragmento del mismo, o un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo de acuerdo con la invención y como se describe aquí anteriormente y/o una parte funcional del mismo y/o una composición farmacéutica, o una mezcla que comprende dicho anticuerpo, para la preparación de un medicamento para tratar o disminuir los efectos de amiloidosis, un grupo de enfermedades y trastornos asociados con formación de placa amiloide que incluye amiloidosis secundaria y amiloidosis relacionada con la edad tal como enfermedades que incluyen, pero no se limitan a, trastornos neurológicos tal como Enfermedad de Alzheimer (AD), demencia de cuerpo de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis (tipo holandés); el complejo de Parkinson de Guam-demencia; así como otras enfermedades que están basadas en o asociadas con proteínas similares a amiloide tal como parálisis supranuclear progresiva, esclerosis múltiple; enfermedad de Creutzfeld Jacob, enfermedad de Parkinson, demencia relacionada con VIH, ALS (esclerosis lateral amiotrófica), Diabetes de inicio en adulto; amiloidosis cardiaca senil; tumores endocrinos, y otros, que incluyen degeneración macular.
También comprendido por la presente invención está un método para la preparación de un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la invención, pero particularmente un anticuerpo quimérico o un fragmento del mismo, o un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo de acuerdo con la presente invención y como se describe aquí anteriormente y/o una parte funcional del mismo y/o una composición farmacéutica, una mezcla que comprende dicho anticuerpo y/o una parte funcional del mismo, particularmente en una cantidad terapéuticamente efectiva, para uso en un método de prevención, tratamiento o disminución de los efectos de amiloidosis, un grupo de enfermedades y trastornos asociados con formación de placa amiloide que incluye amiloidosis secundaria y amiloidosis relacionada con la edad tal como enfermedades que incluyen, pero no están limitadas a enfermedades neurodegenerativas tal como deterioro cognitivo medio (MCI), enfermedad de Alzheimer (AD), como por ejemplo enfermedad de Alzheimer esporádico (SAD) o demencia de Alzheimer familiar (FAD) como Demencia Británica Familiar (FBD) y Demencia Danesa Familiar (FDD), neurodegeneración en síndrome de Down; demencia de cuerpo de Lewy, hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis (tipo holandés); complejo de Parkinson de Guam-demencia; así como otras enfermedades que están basadas en o asociadas con proteínas similares a amiloide tal como parálisis supranuclear progresiva, esclerosis múltiple; enfermedad de Creutzfeld Jacob, enfermedad de Parkinson, demencia relacionada con VIH, ALS (esclerosis lateral amiotrófica), Diabetes de inicio en adulto; amiloidosis cardiaca senil; tumores endocrinos, y otros, que incluyen degeneración macular que comprende formular anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la invención, pero particularmente un anticuerpo quimérico o un fragmento del mismo, o un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo de acuerdo con la invención en una forma farmacéuticamente aceptable.
Además comprendido por la presente invención esta un método para prevenir, tratar o disminuir los efectos de amiloidosis, un grupo de enfermedades y trastornos asociados con formación de placa amiloide que incluye amiloidosis secundaria y amiloidosis relacionada con la edad tal como enfermedades que incluyen, pero no se limitan a, trastornos neurológicos tal como deterioro cognitivo medio (MCI), enfermedad de Alzheimer (AD), como por ejemplo enfermedad de Alzheimer esporádico (SAD) o demencias de Alzheimer familiar (FAD) cómo demencia británica familiar (FBD) y demencia danesa familiar (FDD), neurodegeneración en síndrome de Down; demencia de cuerpo de Lewy, hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis (tipo danés); el complejo de Parkinson de Guam- demencia; así como otras enfermedades que están basadas en o asociadas con proteínas similares a amiloide tal como parálisis supranuclear progresiva, esclerosis múltiple; enfermedad de Creutzfeld Jacob, enfermedad de Parkinson, demencia relacionada con VIH, ALS (esclerosis lateral amiotróf ica), diabetes de inicio en adultos; amiloidosis cardiaca senil; tumores endocrinos, y otros que incluyen degeneración macular al administrar un anticuerpo y/o una parte funcional del mismo, pero particularmente un anticuerpo humanizado y/o una parte funcional del mismo, o una composición o mezcla que comprende tal anticuerpo y/o una parte funcional del mismo, para un animal o un humano afectado con tal trastorno que comprende administrar el anticuerpo en una cantidad terapéuticamente efectiva.
También es un objeto de la invención proporcionar un método para el tratamiento de amiloidosis, un grupo de enfermedades y trastornos asociados con formación de placa amiloide que incluye amiloidosis secundaría y amiloidosis relacionada con la edad que incluye, pero no se limita a, enfermedades neurodegenerativas tal como deterioro cognitívo medio (MCI), enfermedad de Alzheimer (AD), como por ejemplo enfermedad de Alzheimer esporádico (SAD) o demencias de Alzheimer familiar (FAD) como demencia británica familiar (FBD) y demencia danesa familiar (FDD), neurodegeneracion en síndrome de Down; particularmente una enfermedad o condición caracterizada por una pérdida de capacidad de memoria cognítiva al administrar a un animal, particularmente un mamífero o un humano, un anticuerpo, particularmente una composición farmacéutica de acuerdo con la invención y como se describe aquí.
En una modalidad específica la invención proporciona un método para retener o aumentar la capacidad de memoria cognitiva pero, particularmente, para restaurar la capacidad de memoria cognitiva de un animal, particularmente un mamífero o un humano, que sufre de deterioro de memoria al administrar a un animal, particularmente un mamífero o un humano, un anticuerpo, particularmente una composición farmacéutica de acuerdo con la invención y como se describe aquí anteriormente.
Es un objeto adicional de la invención proporcionar una composición terapéutica y un método para producir tal composición así como un método para el tratamiento de amiloidosis, un grupo de enfermedades y trastornos asociados con formación de placa amiloide que incluye amiloidosis secundaria y amiloidosis relacionada con la edad que incluye, pero no se limita a, enfermedades neurodegenerativas tal como deterioro cognitivo medio (MCI), enfermedad de Alzheimer (AD), como por ejemplo enfermedad de Alzheimer esporádico (SAD) o demencias de Alzheimer familiares (FAD) como demencia británica familiar (FBD) y demencia danesa familiar (FDD), neurodegeneración en síndrome de Down; particularmente una enfermedad o condición caracterizada por una perilla de capacidad de memoria cognitiva, al utilizar un anticuerpo de acuerdo con la invención y como se describe aquí anteriormente.
En particular, la invención se refiere al tratamiento de un animal, particularmente un mamífero o un humano, que sufre de una condición asociada con amiloide caracterizada por una pérdida de capacidad de memoria cognitiva que lleva a la retención de capacidad de memoria cognitiva.
EJEMPLOS 1. Material y Métodos 1.1 Producción de anticuerpos Ratones Para la producción de hibridomas, se utilizaron ratones BALB/C hembra (Charles River) de 8 semanas de edad.
Línea de célula de mieloma Para la generación de los hibridomas, se utilizó la linea de célula de mieloma SP2/0-Ag14 de Deutsche Stammsammlung von Mikoorganismen und Zellkulturen.
Antigeno Se utilizó el péptido pGlu-6166 (secuencia pGlu-FRHDSGC SEC ID NO: 65) Estrategia Como un inmunógeno, el péptido se acopló a tiro globulina de bovino (BTG, SIGMA) a través de grupos de maleimid de tres diferentes eniazadores. Los tres eniazadores de diferente longitud se utilizaron de N-[e-male¡midocaproiloxi] succinimida áster (EMCS), succiminidil-4-(N-maleimidometil)-ciclohexan-1-carboxi-(6-amidocaproato) (LCSMCC) y N-[b-maleimidopropilox¡] succinimida éster (BMPS).
Para la detección de los anticuerpos generados, el mismo péptido se conjugó para albúmina de suero de bovino (BSA, SIG A) a través de grupos de maleimid de succ¡nimidil-6-[(b-maleimido-propionamido)hexanoato] (SMPH).
Métodos Conjugación del péptido para inmunización La conjugación se realizó en dos pasos a través de grupos SH del residuo de cisteína del péptido. 1. Maleoilación de la proteína de portador Se agregaron 2 a 5 mg del enlazador respectivo (50 mg/ml en N-metilpirrolidona, NPM) a 2 mi de la solución de proteína de portador (10 mg/ml en 0.1 mM de NaHC03, pH 8.0). La mezcla de reacción se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente (RT). La mezcla de reacción después de eso se desaló utilizando una columna Sephadex G-50 (1.5 * 14 cm), que se equilibró con 50 mM de fosfato de sodio, 250 mM de NaCI, pH 6.8. 2. Acoplamiento del BTG maleoílatado con el péptido Se mezclaron 250 µ? de la solución de péptido (10 mg/ml en Aqua bidest) con 2 m! de una solución que contiene las proteínas de portador maleoilatadas (2.5 mg/ml) en 50 mM de fosfato de sodio, 250 mi de NaCI, pH 6.8 y se incubaron durante 2 horas a 4°C y además 4 horas a RT. Los grupos de maieimida reaccionadas se bloquearon por adición de 2-mercaptoetanol hasta una concentración de 10 mM y una incubación durante la noche a 4°C. El conjugado resultante se dializó contra 10 mM de fosfato de sodio, 150 mM de NaCI, pH 7.5 a 4°C (intercambio de regulador de pH 3 veces, MW cortado 10.000).
Conjugación del péptido para ELISA La conjugación se realizó en dos pasos a través de grupos SH desde el residuo de cisteína del péptido. 1. Maleoilatación de la proteína de portador Se agregaron 2 mg de SMPH (50 mg/ml en N-metilpirrolidona, NMP) a 2 mi de la solución de proteína de portador (BSA, 10 mg/ml en 0.1 mM de NaC03, pH 8.0). La mezcla de reacción se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente (RT). Después de eso la mezcla de reacción se desaló utilizando una columna de Sephadex G-50 (1.5 * 14 cm), que se equilibró con 50 mM de fosfato de sodio, 250 mM de NaCI, pH 6.8. 2. Acoplamiento del BTG maleoilatado con el péptido - Se mezclaron 100 µ? de la solución de péptido (10 mg/ml en 50 mM de fosfato de sodio, 250 m de NaCI, pH 6.8) con 1 mi de una solución que contiene las proteínas de portador maleoilatado (2.5 mg/ml) en 50 mM de fosfato de sodio, 250 mi de NaCI, pH 6.8 y se incubó durante 2 horas a 4°C y además 4 horas a RT. Los grupos de maleimida no reaccionados se bloquearon por la adición de 2-mercaptoetanol hasta una concentración de 10 mM e incubación durante la noche a 4°C. El conjugado resultante se dializó contra 10 mM de fosfato de sodio, 150 mM de. NaCI, PH 7.5 a 4 °C (intercambio de regulador de pH 3 veces, MW cortado 10.000).
Inmunización Se inmunizaron cinco ratones intraperitonealmente durante 39 días. Para la inmunización, se utilizó una emulsión de agua en aceite que consiste de partes iguales de la solución de antígeno (que consiste de partes ¡guales de los tres conjugados de BTG de péptidos) y auxiliares de Freundt completos o incompletos.
Fusión Se sacrificaron tres de los ratones inmunizados mediante incubación de C02. Se tomaron los bazos y se homogeneizaron bajo condiciones estériles. Las células del bazo y las células de mieloma SP2/0 se lavaron varias veces en el medio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM, SIGMA) y se fusionaron en la relación de 2, 3 células de bazo: 1 SP2/0 células al utilizar polietilenglicol 3350 (1 mi 50% (p/v)). Se realizó un manejo adicional de los híbridos más fusionados de acuerdo con las metodologías estándares.
ELISA Se utilizó una ELISA dirigida de IgG para filtrar el sobrenadante de cultivo de célula. La prueba se realizó en placas de microtitulación de poliestirol de 96 cavidades (Greiner, Cat. No. 655061). Las placas se revistieron con el péptido BSA-pGlu-6166. Se agregaron 100 µ? de sobrenadante de cultivo de célula no diluido a cada cavidad y se incubaron durante 1 hora a RT. El sobrenadante de células SP2/0 se utilizó como control negativo. El sobrenadante de las células de bazo se utilizó como control positivo.
Las cavidades positivas se detectaron al utilizar IgG de antiratón, que se conjugó con fosfatasa alcalina. La densidad óptica (OD) se midió en un Lector de Microplaca Dynex Opsys MR a 405 nm.
Selección de anticuerpo estable que produce células de hibridoma Las células de las cavidades positivas se transfirieron a placas de 24 cavidades y se cultivaron durante varios días. Las células de nuevo se transfirieron y probaron para unión de BSA-pGlu-6199 y reactividad cruzada en la ELISA. Se utilizaron cavidades positivas para crio-conservación de las líneas de células de hibridoma.
Clonación a través de dilución limitada Se realizaron dos pasos de clonación consecutivos con el fin de separar el anticuerpo que produce células de células sin producción y para asegurar que las células seleccionadas son monoclonales. Ambos pasos de clonación se realizaron de acuerdo con el método de dilución limitado.
C rio-conservación Los hibridomas seleccionados fueron crio-conservados al utilizar DMSO y métodos estándares. 1.2. Ensayos de ELISA La captura de ?ß N3pE-40 se realizó al utilizar ???ß (x-40) ELISA (HS) de TGC (The GENETICS Company; Suiza), básicamente de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Se generaron anticuerpos de detección biotinilados para ?ß N3pE (pGlu-6166). En donde se indique, se utilizó el anticuerpo ?ß N3pE conjugado de IBL HRP como control positivo (disponible únicamente en combinación con el Equipo de ensayo de amiloide ß Humano IBL ELISA (N3pE)). Se sintetizaron péptidos ?ß N3pE-40 correspondientes (50 pg de alícuotas en hexaf luoroisopropranol (HFIP) almacenados a -80°C). Justo antes del uso, se evaporó HFIP y el péptido se diluyó con 100 mM de Tris/HCI pH 10,4 a 1 µ g/ I . Esta solución de abastecimiento se diluyó además con diluyente de anticuerpo TGC. La captura y detección subsecuente se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 1.3. Análisis PepSpot™ La especificación e integridad biológica de anticuerpos ?ß N3pE y sobrenadantes de cultivo de células se determinó al utilizar la tecnología PepSpot™ de JPT Peptide Technologies Gmbh, Volmerstrasse 5 (UTZ), 12489 Berlín, Alemania.
Se prepararon membranas PepSpot™ correspondientes en JPT. El principio de este método se introdujo y describió anteriormente por Kramer y otros 1997 Cell 91, 799-809.
Para análisis, se bloquearon las membranas durante dos horas con TBST-M (10mM de Tris-HCL, pH 7.5, 150 mM de NaCI, 0.005% de Tween20 + 5% de leche descremada) a temperatura ambiente con agitado suave. Se incubaron las membranas durante la noche a 4°C en una plataforma oscilante con los sobrenadantes de cultivo de células individuales diluidos en volúmenes iguales de TBST-M. Se utilizó un anticuerpo anti-ratón secundario conjugado con fosfatasa alcalina para detección de señal, siguiendo los procedimientos estándares. 1.4. Análisis de tinción por puntos Se realizó un protocolo de tinción por punto simple para obtener información sobre la sensibilidad del anticuerpo ?ß N3pE y los sobrenadantes de cultivo de célula hacia el péptido nativo respectivo. Con ese fin, se colocó como tinción el péptido Ap N3pE-40 en concentraciones descendentes (1000 ng-8 ng) en piezas pequeñas de membrana de nitrocelulosa, y se realizó un procedimiento experimental subsecuente como para las membranas PepSpot™. 1.5. SDS P AGE Se fundieron geles de 12% de SDS poliacrilamida siguiendo los protocolos estándares. Se separaron 15 µ? de sobrenadantes de cultivo de célula y 10 pg de anticuerpo biotinilado en un gel de 12% de SDS poliacrilamida. Se llevó a cabo electroforesis durante 2 horas a 100 V constante. 1.6. Análisis BIACORE Se acoplaron el péptido A|3 N3pE-40 (control positivo) y el péptido ?ß N3E-40 (control negativo) en un Chip Biacore CM5. Se utilizaron chips no modificados para determinar valores en blanco. La asociación y disociación de anticuerpo biotinilado diluido desde 20 pg/ml hasta 1 pg/ml en diluyente TGC se verificó para permitir la determinación subsecuente del valor KD respectivo. De esta forma también se determinaron las características de unión de los sobrenadantes de cultivo de célula individuales. 1.6.1 Afinidad de clon 6-1-6 y 24-2-3 de anticuerpo especifico ?ß?3?? El clon 6-1-6 de anticuerpo purificado se diluyó en regulador de pH HBS-EP (Biacore) hacia abajo hasta 100, 50, 30, 20, 15, 10, 7, 4, 2, 1 mM. La afinidad se determinó al utilizar un Biacore 3000 con CM5-Chip, en donde se inmovilizó el AppE3-40. El sistema se corrió con 30 µ?/min. Los efectos voluminosos medidos y la unión no especificada a la superficie de chips se corrigieron por la sustracción de la señal de la célula de flujo 4, en donde se inmovilizó el ?ß??3-40, y la célula de flujo vacía 3. La asociación (10 minutos) se obtuvo por inyección de 300 µ? de cada concentración. La disociación se observó durante 10 minutos. Las moléculas de anticuerpo restante se removieron por inyección de 5 µ? de 0.1 M HCL. Para cada concentración de anticuerpos se registró la asociación y disociación. La determinación del índice de asociación y disociación y la constante de disociación se realizó por un ajuste global simultáneo de fase de asociación y disociación para todas las concentraciones de anticuerpo registradas que utilizan el modelo de "analito bivalente". 1.7. Secuenciación de regiones variables de anticuerpo Cultivo de células de hibridoma: Se desarrollaron células de hibridoma, en D-MEM (+ L-Glutamina, + Na-Piruvato, 4, 5 g/l de glucosa, Gibco) con la adición de 15% de FBS, 1% de MEM-NEA (aminoácidos no esenciales, Gibco), 50 pg/ml de Gentamicina (Gibco) y 50 pm de ß-mercaptoetanol a 37°C y 5% de C02. El subcultivo ocurrió después de 3-4 días dependiendo de la densidad de célula. Las células se sembraron en una concentración de 0.5 ? 105 células/ml, la división ocurrió en una densidad de célula de 2-5 ? 105 células/ml.
Síntesis de ADNc y transcripción inversa: Se aisló ARN total de 2 « 105 células de acuerdo con el manual del Equipo de aislamiento de Nucleospin ARN (Macherey-Nagel). Se aplicaron 10 en eje de ARN para síntesis de ADNc al utilizar el iniciador Oligo (dt)15 (Promega) y Transcriptasa inversa SuperScript III (Invitrogen).
Amplificación PCR de regiones variables de cadena pesada y ligera: Se amplificaron regiones variables de cadena pesada a partir de ADNc de plantilla al utilizar polimerasa de ADN de alta fidelidad Phusion™ (NEW ENGLAND BioLabs) con el iniciador MHCG1 (en caso de clon 5-5-6 y 6-1-6) y HCG2B (17-4-3 y 24-2-3) en combinación con iniciadores MHV1-12. Para amplificación de regiones variables de cadena ligera el iniciador MKC en combinación con iniciadores MKV1 - KV1 se utilizaron. Las secuencias de iniciador se muestran en el cuadro 1.
Clonación de productos PCR en pJET1.2: Se clonaron regiones variables de cadena pesada y ligera, amplificadas por PCR en vector el pJETI 2/rasurado de acuerdo con el protocolo del Equipo de clonación de PCR CloneJET™ (Fermentas). El secuenciado ocurrió con iniciadores de secuencia pJETI .2.
Cuadro 1 : Secuencias de iniciador para amplificación PCR de regiones variables de cadena pesada y ligera Nombre Secuencia SEC ID NO.
MKV1 ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTG 23 MKV2 ATGGAGWCAGACACACTCCTGYTATGGGTG 24 MKV3 ATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCTGGSGTTG 25 MKV4 ATG AGGRCCCCTGCTC AGWTTYTTGGM WTCTTG 26 MKV5 ATGG ATTTWCAGGTGC AG ATTWTC AGCTTC 27 MKV6 ATGAGGTKCYYTGYTSAGYTYCTGRGG 28 MKV7 ATGGGCWTC AAG ATGG AGTC AC AKWY YCWGG 29 V8 ATGTGGGGA YCTKTTTYC TTTTTC AATTG 30 MKV9 ATGGTRTCCWCASCTCAGTTCCTTG 31 KV10 ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTCT 32 MKV11 ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCC 33 MKC ACTGGATGGTGGG AAG ATGG 34 MHV1 ATGAAATGCAGCTGGGGCATSTTCTTC 35 MHV2 ATG GG ATGG AGCTRTATC ATS YTCTT 36 MHV3 ATG A AGWTGTGGTTAAACTGGGTTTTT 37 HV4 ATGRACTTTGGGYTCAGCTTGRTTT 38 MHV5 ATGG ACTCC AGGCTC AATTTAGTTTTCCTT 39 MHV6 ATGGCTTGTCYTRGSGCTRCTCTTCTGC 40 MHV7 ATGG R ATGG AGCKGGRTCTTTMTCTT 41 MHV8 ATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTG 42 MHV9 ATGGMTTGGGTGTGGAMCTTGCTATTCCTG 43 MHV10 ATGGGCAGACTTACATTCTCATTCCTG 44 MHV11 ATGG ATTTTGGGCTG ATTTTTTTTATTG 45 MHV12 ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCTG 46 HCG1 CAGTGGATAGACAGATGGGGG 47 MHCG2b CAGTGGATAGACTGATGGGGG 48 1.8 Aplicación de clon 6-1-6 de anticuerpo para N3pE ELISA Se revistió una placa maxisorb de 96 cavidades (Nunc) con anticuerpo de captura por incubación de 100 µ? por cavidad de 2 pg/ml de anticuerpo 4G8 anti-?ß, diluido en D-PBS, durante la noche a 4°C. La placa se selló. La solución de revestimiento se removió y la superficie de la placa se bloqueó con 200 pl por cavidad de Bloqueador de ELISA libre de proteina PIERCE (sin Tween-20) durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de eso la placa se lavó 6 veces con TBS + 0.05 % (v/v) de Tween-20. La solución de lavado restante se removió por la utilización de la placa. El péptido estándar de ?ß??3-40 se diluyó en el Bloqueador de ELISA libre de proteína PIERCE (con Tween-20) hacia abajo hasta 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125 pg/ml. Se aplicaron por pipeta 100 µ? de cada concentración y 100 µ? de regulador de pH de dilución (en blanco) en la placa.
La placa se selló e incubo a 4°C durante 2 horas. Después de eso la placa se lavó 6 veces con TBS + 0.05% (v/v) de Tween-20. La solución de lavado restante se removió al utilizar la placa. Se aplicaron por pipeta en cada cavidad 100 µ? de la solución de conjugado de anticuerpo-enzima de detección, que contiende 1 pg/ml de ?ß?3?? de clon 6-1-6 de anticuerpo específico y 2 g/ml de conjugado estreptavidina-HR (Sigma) disuelto en Bloqueador de ELISA libre de proteína PIERCE (con Tween-20). La placa se selló e incubó a 4°C durante 1 hora. Después de eso la placa se lavó 6 veces con TBS + 0.05% (v/v) de Tween-20. La solución de lavado restante se removió por utilización de la placa. En cada cavidad se aplicaron por pipeta 100 µ? de solución de sustrato SureBlue (KPL) y la placa se incubó en la obscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos. La reacción se detuvo mediante la adición de 100 µ? por cavidad de 1 M de H2S04. La absorbencia se midió con TECAN Sunrise a 450 nm corregido por la absorbancia a 450 nm. 1.9 Investigación de reactividad cruzada, analizada a través de ELISA y resonancia de plasmón de superficie (SPR) ELISA: Se revistió una placa maxisorb de 96 cavidades (Nunc) con anticuerpo de captura por incubación de 100 µ? por cavidad de 2 µ?/??? de anticuerpo 4G8 anti-?ß, diluido en D-PBS, durante la noche a 4°C. La placa se selló. La solución de revestimiento se removió y la superficie de la placa se bloqueó con 200 µ? por cavidad de Bloqueador de Elisa libre de proteína PIERCE (sin Tween-20) durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de eso la placa se lavó 6 veces con TBS + 0.05 % (v/v) de Tween-20. La solución de lavado restante se removió por la utilización de la placa. El péptido estándar AppE3-40 y otros péptidos ?ß (2-40, 3-40, 4-40,. 1-42, 3-42 y pE11-40) se diluyeron en Bloqueador de ELISA libre de proteína PIERCE (con Tween-20) hacia abajo hasta 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12.5. 100 µ? de cada concentración y 100 µ? de regulador de pH de dilución (blanco) se agregaron mediante pipeta en la placa. La placa se selló e incubó a 4°C durante 2 horas. Después de eso la placa se lavó 6 veces con TBS + 0.05% (v/v) de Tween-20. La solución de lavado restante se removió por utilización de la placa. 100 pl de la solución de conjugado de anticuerpo-enzima de detección, que contiene 1 pg/ml de que clon 6-1-6 de anticuerpo específico ?ß?3?? y 2 pg/ml de conjugado de estreptavidina-HRP (Sigma) diluido en Bloqueador de Elisa libre de proteína PIERCE (con Tween-20), se agregó por pipeta en cada cavidad. La placa se selló e incubó a 4°C durante 1 hora. Después de eso la placa se lavó 6 veces con TBS + 0.05% (v/v) de Tween-20. La solución de lavado restante se removió tapando la placa. En cada cavidad se agregaron por pipeta 100 pl de solución de sustrato StarBIue (KPL) y la placa se incubó en la obscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos. La reacción se detuvo por adición de 100 pl por cavidad de un 1 M de H2S0 . La absorbancia se midió con TECAN Sunrise a 450 nm corregido por la absorbancia a 540 nm.
SPR: Además de las diferentes especies ?ß también se determinó la reactividad cruzada-a otro péptido pGlu, que ocurre en el anticuerpo humano. Esto se hizo mediante resonancia de plasmón de superficie. Los siguientes péptidos o la región N-terminal de ellos se inmovilizó en la superficie de C 5-Chips: MCP1, MCP2, gran gastrina, gonadoliberina, neurotensina, orexina A, fibronectina, colágeno 1 y TRH. Como control positivo también se analizó la unión a ?ß??3-40. Los clones 6-1-6 y 24-2-3 de anticuerpo N3pE se diluyeron en HBS-EP (Biacore) hacia abajo hasta 25 pg/ml. La unión se observó al utilizar un Biacore 3000 con varios CM5-Chips, en donde se inmovilizaron los péptidos respectivos (en la célula de flujo 2, 3 y 4). El sistema corrió con 20 µ?/min. Los efectos voluminosos medidos y la unión no especifica a la superficie de chips se corrigieron por la sustracción de la señal del la célula de flujo 2, 3 y 4, en donde se inmovilizaron los péptidos probados, y la célula de flujo vacía 1. La asociación (9 minutos) se obtuvo mediante inyección de 180 µ? de clones 6-1-6 y 24-2-3 de anticuerpo, respectivamente. La disociación se observó durante 9 minutos. Las moléculas de anticuerpo restante se removieron por inyección de 5 pl de 0.1 M HCL. Para cada interacción del anticuerpo con los diferentes péptidos se registró la asociación y disociación. Se determinó la reactividad cruzada mediante evaluación de la fase de asociación concerniente al índice y a la señal al final. Los valores para todos los péptidos pGlu se compararon con la señal para ?ß??3-40. 1.10 Optimización y validación de ELISA N3pE para análisis de cerebro Debe utilizarse ELISA N3pE para análisis de concentración ?ß??3-42 en el cerebro de ratones transgénicos. Generalmente, el hemisferio y el tronco cerebral se analizaron de forma separada concerniente al contenido ?ß??3-42. El cerebro del ratón se homogeneizó en 500 µ? de 2% de solución SDS con inhibidor de proteasa en un homogeneizador Precelly (Peqlab) utilizando perlas de cerámica. La suspensión se eliminó por pipeta de las perlas y se transfirió en un tubo de centrifugado. Las perlas se lavaron de nuevo con 250 µ? de 2% de solución SDS con inhibidor de proteasa y solución transferida en el tubo de centrifugado. Los, 750 µ? de suspensión de cerebro SDS se solidificaron en hielo colisionado durante 20 segundos. La muestra se centrifugó durante 1 hora a 4°C con 75,000 xg. Después de eso se removió el sobrenadante, se dividió en alícuotas y se almacenó hasta el análisis de ELISA a -80°C. La pella insoluble de SDS restante se mezcló con 150 µ? de 70% de ácido fórmico y se aplicó sonido en hielo colisionado durante 20 segundos. Inmediatamente después de la aplicación de sonido, la solución se neutralizó con 2850 µ? de una M Tris, que fue el método viejo, o 2850 µ? de regulador de pH El A (PBS + 10 mg/ml de BSA + 0.05% de Tween-20) + 860 µ? de 3.5 M Tris para neutralización, que representa el nuevo método. Las muestras de fracción de ácido fórmico se almacenaron hasta ELISA a -80°C. La ELISA de N3pE se realizó a través del siguiente protocolo: Una placa maxisorb de 96 cavidades (Nunc) se revistió con anticuerpo de captura mediante la incubación de 100 µ? por cavidad de 2 µ?/mililitro de anticuerpo 4G8 de anti-?ß, diluido en D-PBS, durante la noche a 4°C. La placa se selló. La solución de revestimiento se removió y la superficie de la placa se bloqueó con 200 µ? por cavidad de Btoqueador de ELISA libre de proteina PIERCE (sin Tween-20) durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de eso la placa se lavó 6 veces con TBS + 0.05% (v/v) de Tween-20. La solución de lavado restante se removió al tapar la placa. El péptido estándar ?ß??3-42 se diluyó en Bloqueador de ELISA libre de proteína PIERCE (con Tween-20) (viejo método) o regulador de pH EIA (nuevo método) hacia abajo hasta 10,029.2, 514.6, 257.3, 126.65, 64.32, 31.16, 16.08 pg/ml. Se agregaron por pipeta 100 µ? de cada concentración y 100 µ? de regulador de pH de dilución (en blanco) en la placa. Las muestras SDS se congelaron, diluyeron 1:25 y 1:100, respectivamente, en el Bloqueador de ELISA libre de Proteína PIERCE (con Tween-20) (viejo método) o regulador de pH EIA (nuevo método) y se agregaron con pipeta en la placa de ELISA. Las muestras de ácido fórmico (viejo método: ácido fórmico/Tris; nuevo método: ácido fórmico/regulador de pH de EIA/Tris) se descongelaron y no se diluyeron mediante pipeta en la placa ELISA. La placa se selló e incubó a 4°C durante 2 horas. Después de eso la placa se lavó 6 veces con TBS + 0.05% (v/v) de Tween-20. La solución de lavado restante se removió al tapar la placa. 100 µ? de la solución de conjugado de anticuerpo-enzima de detección, que contiene 1 pg/ml de clon 6-1-6 de anticuerpo específico de ?ß?3?? y 2 pg/ml de conjugado estreptavidina-HRP (Sigma) disuelto en Bloqueador de Elisa libre Proteína PIERCE (con Tween-20), se agregaron con pipeta en cada cavidad. La placa se selló e incubó a 4°C durante 1 hora. Después de eso la placa se lavó 6 veces con TBS + 0.05% (v/v) de Tween-20. La solución de lavado restante se removió a tapar la placa. En cada cavidad se aplicaron por pipeta 100 µ? de solución de sustrato SureBlue (KPL) y la placa se incubó en la obscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos. La reacción se detuvo para adición de 100 µ? por cavidad de un de H2S04.
La absorbancia se midió con TECAN Sunrise a 450 nm corregido por la absorbancia a 540 nm. 1.11 Aplicación de clones de anticuerpo N3pE para inmunohisto química Las secciones fijadas de formalina e incorporadas con parafina del cerebro humano (corteza) se trataron como a continuación: 1. secciones de desparafinación y rehidratación (inmovilizadas en portaobjetos): a. Incubación de portaobjetos en Histoclear o xileno durante 3 minutos b. Remover solución de limpieza c. Incubación de portaobjetos de nuevo en Histoclear o xileno durante 3 minutos d. Incubación de portaobjetos en Histoclear o xileno 1:1 con 100% de etanol durante 3 minutos e. Incubación de portaobjetos en 100% de etanol durante 3 minutos, remover solución f. Incubación de portaobjetos de nuevo el 100% de etanol durante 3 minutos g. Incubación de portaobjetos en 95% de etanol durante 3 minutos h. Incubación de portaobjetos en 70% de etanol durante 3 minutos i. Incubación de portaobjetos en 50% de etanol durante 3 minutos j. Incubación de portaobjetos en agua destilada durante 3 minutos 2. Apagar actividad de peroxidasa endógena: Incubación de portaobjetos con 99 mi de etanol + 1 mi de 30% de peróxido de hidrógeno durante 3 minutos a temperatura ambiente. 3. Lavar los portaobjetos con agua: 2 * 5 minutos 4. Remover agua en portaobjetos individuales y colocar portaobjetos en el estante de portaobjetos en una cámara de humedad para prevenir que las secciones se sequen.
Cubrir la sección con 88% de ácido fórmico a temperatura ambiente durante 10 minutos bajo capucha de humo. Enjuagar en agua varias veces y permitir agitar en un plato de tinción lleno con agua durante 10 minutos. 5. Bloquear en 10% de suero de caballo durante 10 minutos a temperatura ambiente. 6. Agitar (o aspirar) la solución de bloqueo y aplicar anticuerpo primario (clon 6 ó 24 de anticuerpo N3pE) durante la noche a 4°C. 7. Lavar los portaobjetos de forma separada con TBS durante 10 minutos para evitar el arrastre de una transparencia a otra. 8. La adición de anticuerpo secundario biotinilado (antiratón de cabra de Vector Laboratories): 9 mi de TBS, 1 mi de suero de cabra, 45 µ? de segundo anticuerpo). Incubar 30 minutos a temperatura ambiente. 9. Lavar portaobjetos de forma separada con TBS durante 10 minutos para evitar el arrastre de un portaobjeto a otro. 10. Adición de solución ABC (10 mi de TBS, 100 µ? de suero de caballo, 90 µ? de componente A, 90 µ? de componente B). Incubar 30 minutos a temperatura ambiente. 11. Lavar portaobjetos con 50 mM de Tris: 2 x 10 minutos 12. Reacción de color: incubación de secciones con solución DAB (20 mg de DAB de Sigma en 100 mi de 50 mM Tris, filtrado, y agregar 30 µ? de 33% de peróxido de hidrógeno). Utilizar microscopio para observar la reacción de color. El producto de reacción adquirió un color café. Detener la reacción al colocar los portaobjetos en platos de tinción que contienen agua. 13. Lavar los portaobjetos con agua durante 10 minutos 14. Contra teñir con hematoxilina, lavar con agua. 15. Deshidratar y limpiar: seguir el paso 1 en orden inverso (por ejemplo, agua, etanoles a 100% de histoclean) 16. Cubreobjetos con permount (Fisher Scientific). Secar los portaobjetos al aire. Limpiar los portaobjetos con una hoja de afeitar y etanol. 2. Resultados 2.1 Producción de anticuerpos Se aislaron 6 clones que producen establemente anticuerpos contra el péptido pGlu-6166-BSA: clones 1-8-12, 5-5-6, 6-1-6, 12-1-8, 17-4-3 y 24-2-3. Estos clones se sometieron a caracterización adicional. 2.2. Determinación de concentración de anticuerpo requerida: La intensidad de señales en los ensayos de ELISA no se correlaciona únicamente con la concentración de analito/variante de A (3 sino también fuertemente depende de la concentración de anticuerpo desplegado. Ya que las variantes A[3 únicamente están presentes a baja concentración en muestras de suero es necesario determinar las concentraciones de anticuerpos que son capaces de detectar bajas concentraciones de las variantes ?ß correspondientes. Los equipos de ELISA A(3 comercialmente disponibles tienen un límite de detección especificado hacia Ap en el bajo rango de pg. En curvas estándares la concentración más alta es usualmente 500 pg/ml. La información general sobre concentración de anticuerpo desplegada típicamente carece de hojas de datos/manuales de instrucción, sin embargo, debido a que la información es derivable de la literatura general 1 se utiliza 1 g/ml como predeterminado.
En una primera serie de experimentos no fue posible detectar 500 pg/ml de A (3 N3pE-40 con el anticuerpo conjugado de biotina pGlu-6166 12-1 correspondiente. De hecho, se requirieron concentraciones relativamente altas de ?ß N3pE (10 ng/ml) para obtener señales con 1 pg/ml de anticuerpo (ver Figura 1A: barra media). La intensidad de esta señal se mejoró de forma tremenda al aumentar la concentración de anticuerpo a 10 pg/ml (ver Figura 1A: barra izquierda). Hasta 20 Mg/m! de anticuerpo la intensidad de la señal puede elevarse adicionalmente (ver Figura 1B). Más allá de esta concentración no puede lograrse ningún aumento adicional en la intensidad de señal. Por lo tanto, se utilizaron 20 g/ml de anticuerpo para determinar el límite de detección para el anticuerpo pGlu-6166. 2.3. Análisis de tinción por puntos El anticuerpo pGlu-6166 de ?ß N3pE-x se eligió en el procedimiento de filtrado debido a que el clon de célula original (designado 12-1-8) exhibió una fuerte de unión hacia el péptido tomado para inmunización y muy baja reactividad cruzada (ver cuadro 2).
Cuadro 2: Resultado de clasificación que demuestran señales en ensayos de ELISA obtenidos con varios sobrenadantes de clon de célula de hibridoma.
No se ha incluido hasta ahora ningún paso de clasificación, que trata con el péptido Ap N3pE-40 de longitud completa, nativo. Por lo tanto, el grupo de clones de célula de hibridoma pGlu6166 disponible se filtró para clones que expresan anticuerpos que pueden exhibir una afinidad superior para el péptido ?ß N3pE-40 nativo.
Como se observa en la Figura 2, los clones de célula pueden identificarse que de hecho exhiben sensibilidad superior hacia el péptido Ap N3pE-40 de longitud completa, nativo. Mientras que el anticuerpo 12-1 de anticuerpo pGlu-6166 únicamente puede detectar 1 pg de péptido, clones 6-1-6 y 24-2-3 también proporcionan señales con tampoco como 8 ng de péptido. Por lo tanto, los clones 6-1-6 y 24-2-3 son 125 veces más sensibles. Con estos clones, puede obtenerse un límite de detección de pg/ml de péptido ?ß N3pE-40 en una ELISA correspondiente. 2.4. Análisis PepSpot La especificación se realizó después por el análisis PepSpot para comparar el anticuerpo ?ß N3pE-x de pGlu-6166 con clones de célula de hibridoma. En el cuadro 3, todos los péptidos se enlistaron que corresponden a puntos en la membrana PepSpot. Como se observa en la Figura 3 los clones 6-1-6 y 24-2-3 de pGlu-6166 no producen más señales cruzadas que el clon 12-1 de anticuerpo pGlu-6166. Todos los clones investigados reconocieron principalmente el número de punto 6 - ?ß N3pE-x específico (pEFRHD..., es decir SEC ID NO: 12), seguido por el número de punto 5 (EFRpD... SEC ID No: 11) y 7 (FRDH ... SEC ID No: 13). También se obtuvo una señal débil con el número de punto 4 (AEFR H D ... SEC ID No: 10).
Cuadro 3: Secuencias de péptidos ?ß como manchas en membranas PepSpot™ (JPT Peptide Technologies GmbH) y detección mediante clones de célula de hibridoma pGlu-6166 pE en el cuadro 3 significa pGlu, piroglutamato.
¡D en el cuadro 3 significa isoAsp, isoaspartato.
Análisis SDS-PAGE La integridad biológica del anticuerpo A|3-N3pE sobrenadantes de cultivo de células de hibridoma se determinó aproximadamente mediante análisis SDS-PAGE (para detalles ver Material y Métodos anteriormente).
Como se observa en la Figura 4, todas las muestras cargadas en el gel revelaron bandas agudas sin manchas, que indican la integridad del anticuerpo pGiu-6166 12-1 de sobrenadantes de clon de células de hibridoma. 2.6. Análisis BIACORE Con el análisis de tinción de puntos se diagnosticaron diferencias importantes en sensibilidad hacia el péptido ?ß N3pE-40 de sobrenadantes de clon de célula de hibridoma, comparadas con el anticuerpo pGlu-6166 biotinilado. Sin embargo, con este método únicamente se verifica un resultado de punto final. El análisis Biacore por otro lado permite la resolución en forma de tiempo del curso de unión de un anticuerpo dado.
Con el fin de revisar si la unión deficiente del anticuerpo pGlu-6166 12-1 fue un resultado de una baja asociación al péptido A(3 N3pE-40, se realizó un análisis Biacore como se describió en Materiales y Métodos, anteriormente.
La verificación de cursos de unión de concentraciones crecientes de anticuerpo pGlu-6166 permitió el cálculo de un valor KD de 30 mM. Una comparación del sobrenadante de clon de célula de hibridoma 12-1 con un sobrenadante de clon de célula 6-1-6 reveló diferencias de golpe en características de unión. La asociación de clon 6-1-6 fue aproximadamente 5 veces superior que lo observado con el clon 12-1. Sin embargo, de forma muy marcada, es la diferencia en comportamiento de disociación. Mientras que el clon 6-1-6 se disocia fuertemente del péptido ?ß N3pE-40, 12-1 se lava fácilmente dentro de algunos minutos. Sin embargo, la unión deficiente del clon 12-1 es muy probable que sea la consecuencia de "fuera de índice" observado. Esta suposición además se soporta por el hallazgo de que el clon 24-3-2, que proporciona particularmente resultados ventajosos en el análisis de tinción de puntos, exhibe una asociación muy lenta al péptido ?ß N3pE-40 pero, en contraste con 12-1, no tiene "fuera de índice" observable (ver también Figura 5). 2.6.1 Afinidad de clon 6-1-6 y 24-2-3 de anticuerpo específico ?ß?3?? Para el clon 6-1-6 de clon de anticuerpo N3pE el índice de asociación, índice de disociación y constante de disociación se calcularon por un ajuste global de todos los sensogramas mostrados en la Figura 6.
El índice de asociación se calculó con 1.67e5 M~1s~1, el índice de asociación con 2.63e4 s"1 y la constante de disociación con 1.57 nM.
Para el clon 24-2-3 de anticuerpo N3pE el índice de asociación, índice de disociación y constante de disociación se calcularon mediante 'un ajuste global para todos los sensogramas mostrados en la Figura 7.
El índice de asociación se calculó con 3.25e3 M"1s"1, el índice de disociación con 3.29e-4 s" y la constante de disociación con 101 nM. 2.7 Regiones variables de anticuerpo de secuenciado Se identificaron las siguientes secuencias: 2.7.1 Clon 5-5-6 Secuencia de nucleótido de cadena ligera de parte variable (SEC ID NO: 49) ATGGTGTCCTCAGCTCAGTTCCTGTTTCTGTTAGTGCTCTGGATTCAGGAAACCAACGGT GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCT ATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTATATAGTGATGGAAAAACCTATTTGAATTGG TTATTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAATGCGCCTAATCT ATCTGGTGTCT AAACTGGAC TCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGAACAGATTTTACACTGAAAATC AGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTACTGCGTGCAAGGTACACATTTTCCA TTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCÁCCAACTGTA TCCATCTTCCCACCAT Secuencia de proteína de cadena ligera de parte variable (SEC ID NO: 50) MV£3SAQFLFLLVL IQETNGDWMTQ PLTLSVTIGQPASI SCKSSQSLLYSDGKTYLNW LLQRPGQS PMRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCVQGTHFP FTFGSGT LE IKRADAAPTVS IFPP Secuencia de nucleótido de cadena pesada de parte variable (SEC ID NO. 51) ATGGGATGGAGCGGGGTCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGGAACTGCAGGTGTCCACTCTGAG GTCCAGCTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGAGCTTCAATGAAGATATCC TGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTATACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCAT GGAAAGAACCTTGAGTGGATTGGACTTATTAATCCTTACAGTGGTGTTACT GGTACAAC CAGAAATTCAAGGGCAAGGCCACATTAATTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATG GAGCTCCTCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTATTGTACAAGAGAGGCTAAA CGGGAGTGGGACGAGACTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAA ACGACACCCCCATCTGTCTA Secuencia de proteína de cadena pesada de parte variable (SEC ID NO: 52) MGWSGVFLFLLSGTAGVHSEVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMN VKQSH GKNLEWIGLINPYSGVTRYNQKFKGKATLIVDKS SSTAYMELLSLTSEDSAVYYCTREAK REWDETYWGQGTLVTVSAAKTTPPSV 2.7.2 Clon 6-1-6 Secuencia de nucleótido de cadena ligera de parte variable (SEC ID NO: 53) ATGGTGTCCACAGCTCAGTTCCTGTTTCTGTTAGTGCTCTGGATTCAGGAAACCAACGGT GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCT ATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTATATAGTGACGGAAAAACCTATTTGAATTGG TTATTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAATGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACTGGAC TCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGAACAGATTTTACACTGAAAATC AGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTACTGCGTGCAAGGTACACATTTTCCA TTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTA TCCATCTTCCCACCATCCAG Secuencia de proteína de cadena ligera de parte variable (SEC ID NO: 54) MVSTAQFLFLLVL IQETNGDWMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLNW LLQRPGQSPMRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCVQGTHFP FTFGSGTKLE IKRADAAPTVS IFPPS Secuencia de nucleótido de cadena pesada de parte variable (SEC ID NO: 55) ATGGGATGGAGCGGGGTCTTTATCTTCCTCCTGTCAGGAACTGCAGGTGTCCACTCTGAGGTCC AGCTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGAGCTTCAATGAAGATATCCTGCAAGGC TTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAACCTT GAGTGGATTGGACTTATTAATCCTTACAATGGTGTTACTAGGTACAACCAGAAGTTCAAGGGCA AGGCCACATTAATTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCGTCAGTCTGACATC TGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTACAAGAGAGGCTAAACGGGAGTGGGACGAGACTTACTGG GGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTG Secuencia de proteína de cadena pesada de parte variable (SEC ID NO: 56) MGWSGVFI FLLSGTAGVHSEVQLQQSGPE LVKPGASMKI SCKASGYSFTGYTMNWVKQSH GKNLE IGLINPYNGVTRYNQKF G ATLIVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCTREAK REWDETYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPL 2.7.3 Clon 17-4-3 Secuencia de nucleótido de cadena ligera de parte variable (SEC ID NO: 57) ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGGTGTTCTGGATTCCTGTTTCCAGCAGTGATGTTG TGATGACCCAGACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAG ATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTGATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCA GGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGT TCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCT GGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTG GAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGT Secuencia de proteína de cadena ligera de parte variable (SEC ID NO: 58) MKLPVRLLVLVFWI PVS SSDWMTQTPLSLPVSLGDQAS ISCRS SQSLVHSDGNTYLHWY LQ PGQSPKLLI YKVSNRFSGVPDRFSGSGSG DFTLKI SRVEAEDLGVYFCSQSTHVPP TFGGGT LE I RADAAPTVS IFPPSS Secuencia de nucleótido de cadena pesada de parte variable (SEC ID NO: 59) ATGGACTTTGGGCTCAGCTTACTTATTTTTGTCCTTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAG GTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCGGAAACTCTCC TGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTACGGAATGGCGTGGGTTCGACAGGCTCCA GGGAAGGGGCCTGAGTGGGTAGCATTCATTAGTAATTTGGCATATAGTATCTACTATGCA GACACTGTGACGGGCCGATTCACCATCTCTAGAGAGAATGCCAAGAACACCCTGTACCTG GAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACAGCCATGTACTACTGTGCAAGGTATGACTAC GATAATATCTTGGACTATGTTATGGAC ACTGGGGTCAAGGAACCTCAG CACCGTCTCC TCAGCCAAAACAACACCCCCATCAGTCTATCCACTG Secuencia de proteína de cadena pesada de parte variable (SEC ID NO: 60) MDFGLSLLIFVLILKGVQCEVKLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSDYGMAWVRQAP GKGPEWVAFISNLAYS IYYADTVTGR TI SRENAKNTLYLEMS SLRSEDTAMYYCARYDY DNILDYVMDYWGQGTSVTVS SAKTTPPSVYPL 2.7.4 Clon 24-2-3 Secuencia de nucleótido de cadena ligera de parte variable (SEC ID NO: 61) ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTCTGGATTCAGGAAACCAAGGGTGATGTTGTGCTGA CCCAGACTCCACTCACT TGTCGGTTACCATTGGACAACC GCCTCTATCTCTTGCAAGTCAAG TCAGAGCCTCTTATATAGTAATGGAAAAACCTATTTGAATTGGTTATTACAGAGGCCAGGCCAG TCTCCAAAGCGCCTAATCTATGTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTG GCAGTGGATCAGGAACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGT TTATTATTGCGTGCAAGGTAC CATTTTCCA TCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAA A AAACGGGCTGATGCTGCACCAACTG ATCCATCTTCCCACCATCCAGT Secuencia de proteína de cadena ligera de parte variable (SEC ID NO: 62) MKLPVRLLVLWIQETKGDVVLTQT LTLSVT IGQ ASI SCKSSQSLLYSNGKTYLNWLLQ RPGQS PKRLIYVVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKI SRVEAEDLGVY CVQGTHFPFTF GSGTKLE IKRADAAPTVS I FPPS S Secuencia de nucleótido de cadena pesada de parte variable (SEC ID NO: 63) ATGGGATGGAGCGGGGTCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGTAACTGAAGGTGTCCACTCCCAGGTTC AGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGTCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGC TTCTGGCTATATATTCAATAACTACTGGATAAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGTCAGGGTCTT GAGTGGATTGGACAGATTTATCCTGGAGATGGTGATACTAACTACAATGGGAAGTTCAAGGGTA AAGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTAACATC TGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAGAGGGATATATTGTTTATTGGGGCCAAGGGACT CTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTG Secuencia de proteina de cadena pesada de parte variable (SEC ID NO: 64) MGWSGVFLFLLSVTEGVHSQVQLQQSGAELVRPGSSV ISC ASGYIF YWI WVKQRP GQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKF GKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREGY IVY GQGTLV VSAA TTPPSVYPL 2.8 Aplicación de clon 6-1-6 de anticuerpo para ELISA N3pE El protocolo de ELISA N3pE final se probó concerniente al límite de cuantificación (LOQ) y relación de señal a ruido (S/N). La curva estándar de ELISA se muestra en la Figura 8. La forma de la curva estándar parece especialmente buena para el rango de baja concentración, que muestra una dependencia casi lineal de la absorbancia. Basándose en esta curva estándar el LOQ se determina con 3.125 pg/ml con un S/N = 1.3. 2.9 Investigación de reactividad cruzada, analizada a través de ELISA y SPR ELISA: La reactividad cruzada a otras variantes ?ß se determinó al utilizar nuestra N3pE-ELISA. La fecha natural se muestra en el cuadro 4.
Cuadro 4: Fecha natural de N3pE-ELISA con clon 6-1-6: prueba de reactividad cruzada Unicamente para ?ß??3-40 se observó una dependencia de la absorbancia de la concentración. Todas las variantes ?ß probadas mostraron reactividad cruzada bajo 1%, excepto de ?ß3-40. La señal (corregida por el espacio en blanco) para 800 pg/ml fue de aproximadamente 2.7% de la señal para ?ß??3-40. Este es un muy buen valor, considerando que el N-término de ambos péptidos tiene los mismos aminoácidos, excepto el primero, esto se coloca en el ciclo en el caso de ?ß??3-40. En general, el clon 6 de anticuerpo ?ß N3pE, que se utiliza generalmente para ELISA, es altamente específico para el término N de péptidos ?ß que inician con pGlu en la posición 3.
SPR: La reactividad cruzada de clones 6-1-6 y 24-2-3 a otros péptidos no ?ß se analizó por resonancia de plasmón de superficie.
En lugar de ?ß??3-40 que muestra un sensograma de unión típico, todos los otros péptidos pGlu probados mostraron casi ninguna interacción con los clones 6-1-6 y 24-2-3, respectivamente, ver también Figura 9 (datos únicamente mostrados para clon 6-1-6). Los sensogramas de los péptidos pGlu se compararon con el sensograma para ?ß??3-40. Las actividades cruzadas estimadas estuvieron bajo 1%. Se muestra un resumen de todos los péptidos analizados en el cuadro 5.
Cuadro 5: Reactividad cruzada estimada de clones 6-1-6 y 24-2-3 para otros péptidos pGlu Todos los experimentos han confirmado el hecho de que el clon 6-1-6 y 24-2-3 de anticuerpo N3pE son específicos para el epítopo N-terminal de ?ß??3-?. No se reconoció ningún otro N-término de pGlu ni otras variantes de péptido pGlu, que no soportan un residuo pE en N-terminal. 2.10 Optimización y validación de N3pE ELISA para análisis de cerebro La concentración de ?ß??3-42 en el tronco cerebral de ratón se analizó dependiendo del método utilizado. Las muestras se derivaron desde ratones transgénicos (tg) que sobre-expresan A(3Q3-42 humana del cerebro, que se coloca el ciclo por QC para ?ß??3-42. Se compararon muestras de ratones transgénicos de heterocigoto (tg het) y ratones transgénicos de homocigoto (tg hom) y de ratones no transgénicos, salvajes (wt). Los ratones utilizados para la generación de muestra se produjeron como se describió en WO2009034158.
Para todos los experimentos adicionales se diluyeron muestras y estándares en el regulador de pH EIA. En un siguiente paso, el método de neutralización para analizar muestras de fracción de ácido fórmico se optimizó, es decir, la neutralización fue N3pE ELISA. La N3pE ELISA resultante y aquí desarrollada trabaja bien, detectó niveles importantes de ?ß??3-42 en cerebros de los ratones tg hom, niveles significativamente inferiores de ?ß??3-42 humana en cerebros de los ratones tg het y ?ß??3-42 no humano en cerebros de los ratones wt (ver figura 10). La ELISA de acuerdo con la presente invención suministra señales altas y consecuentemente un LOQ muy aceptable y de esa forma es adecuado para análisis de muestras de ácido fórmico, en particular de muestras de cerebro de ácido fórmico. 2.11 Aplicación de clones de anticuerpo N3pE para inm ii nohisto química Con los anticuerpos N3pE de la presente invención, ?ß??3-? se tiñó en secciones de cerebro de pacientes en la última etapa de enfermedad de Alzheimer esporádico (SAD) y formas familiares de enfermedad de Alzheimer (FAD), es decir pacientes que soportan una mutación en el gen de presenilina 1 (PS1). Las secciones de cerebro teñidas se muestran en la Figura 11. La Figura 11 muestra que los anticuerpos N3pE de la presente invención son adecuados para inmunohistoquímica. Los anticuerpos específicamente detectan pGlu-?ß en el cerebro de pacientes de SAD y FAD. Los anticuerpos N3pE no muestran señales de antecedente en las imágenes, lo que prueba la unión especifica mostrada por análisis de ELISA y SPR. 3. Depósitos Se generaron anticuerpos monoclonales que reconocen específicamente Ap N3pE-x. Actualmente todos los anticuerpos monoclonales correspondientes que expresan líneas de célula de hibridoma 5-5-6, 6-1-6, 17-4-3, y 24-2-3 se depositaron de acuerdo con el Tratado de Budapest y están disponibles en Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), con una fecha de depósito del 17 junio, 2008, y con los miembros de depósitos respectivos: (clon 5-5-6): DSM ACC2923 (clon 6-1-6): DSM ACC2924 (clon 17-4-3): DSM ACC2925 (clon 24-2-3): DSM ACC2926.
Se puede confirmar la especificidad de esos anticuerpos para sus secuencias objetivo respectivas. Para ?ß N3pE-x. pueden identificarse clones de anticuerpo de alta afinidad que deben tener señales fuertes en una configuración de ELISA con un límite de detección esperado en el rango tg bajo. 4. Breve descripción El propósito principal de la presente invención fue el establecimiento de una técnica de detección altamente sensible y voluminosa que, permite la determinación cuantitativa de variantes ?ß en muestras biológicas.
Preferiblemente, debe seguirse una técnica basada en ELISA. La tarea se inició con ?ß N3pE ELISA, debido a que para esta variante ?ß ya está comercialmente disponible un sistema de ELISA apropiado (IBL). Este sistema se utilizó como control de referencia y de calidad interna.
Se investigó la aplicabilidad del anticuerpo pGlu-6166 en la configuración de ensayo de ELISA. Para obtener señales claramente medibles, se necesitan desplegar las altas concentraciones de anticuerpo (20 gg/ml). Pueden identificarse los clones de anticuerpo de alta afinidad ?ß N3pE-x. Puede lograrse un límite de detección en el rango pg bajo (3-8 pg/ml) con estos clones.

Claims (40)

REIVINDICACIONES
1.- Anticuerpo, caracterizado porque se une a péptidos A o variantes dé ios mismos, preferiblemente con alta afinidad.
2 - El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha alta afinidad significa un valor constante de disociación (kD) de 1 O"7 M , o mejor.
3.- El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
4.- El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la parte variable de la cadena ligera de dicho anticuerpo tiene una secuencia de nucleótido seleccionada de SEC ID NOs: 49, 53, 57 y 61, o una secuencia de aminoácido seleccionada de SEC ID NOs: 50, 54, 58, y 62.
5. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la parte variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo tiene una secuencia de' nucleótido seleccionada de SEC ID NOs: 51, 55, 59 y 63, o una secuencia de aminoácido seleccionada de SEC ID NOs: 52, 56, 60 y 64.
6.- El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la parte variable de la cadena ligera de dicho anticuerpo tiene la secuencia de nucleótido de SEC ID NO: 49 o la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 50, y en donde la parte variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo tiene la secuencia de nucleótido de SEC ID NO: 51, o la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 52.
7.- El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la parte variable de la cadena ligera de dicho anticuerpo tiene la secuencia del nucleótido de SEC ID NO: 53 ó la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 54, y en donde la parte variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo tiene la secuencia de nucleótido de SEC ID NO: 55, ó la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 56.
8.- El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la parte variable de la cadena ligera de dicho anticuerpo tiene la secuencia de nucleótido de SEC ID NO: 57 ó la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 58, y en donde la parte variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo tiene la secuencia del nucleótido de SEC ID NO: 59, ó la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 60.
9. - El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la parte variable de la cadena ligera de dicho anticuerpo tiene la secuencia de nucleótido de SEC ID NO: 61 ó la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 62, y en donde la parte variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo tiene la secuencia de nucleótido de SEC ID NO: 63, ó la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 64.
10. - El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho anticuerpo se selecciona del siguiente grupo: Ap 5-5-6 ; (Depósito No. DSM ACC 2923) ?ß 6-1-6 (Depósito No. DSM ACC 2924) ?ß 17-4-3 (Depósito No. DSM ACC 2925) ?ß 24-2-3 (Depósito No. DSM ACC 2926) o variantes funcionales de los mismos.
11. - El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las rei indicaciones precedentes, en donde dicho anticuerpo es ?ß 6-1-6 (Depósito DSM ACC 2924).
12. - El anticuerpo de acuerdó con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho anticuerpo es ?ß 24-2-3 (Depósito DSM ACC 2926).
13. - El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado o quimérico, o un fragmento de anticuerpo que retiene la alta afinidad.
14. - El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para usarse en la detección de péptido ?ß o variantes del mismo.
15 - El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 14, en donde dichas variantes se seleccionan del siguiente grupo: pGlu-Ap3.40 pGlu-A 3.42, y variantes de pGlu-Ap3_.,<, en donde x es un entero entre 10 y 42; preferiblemente 18 y 42, muy preferiblemente 30 y 42.
16.- El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, el cual es humano.
17.- El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, el cual es un diacuerpo o un anticuerpo de cadena individual que retiene la alta afinidad.
18. - El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que se une al epitopo unido por los anticuerpos definidos en la reivindicación 15.
19. - El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, el cual tiene las regiones de determinación de complementariedad de los anticuerpos como se define en la reivindicación 15.
20.- El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, el cual está etiquetado.
21 - El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, el cual está inmovilizado en una fase sólida .
22.- El anticuerpo que se puedo obtener de cualquiera de las líneas de hibridoma, DSM ACC 2923, DSM ACC 2924, DSM ACC 2925, DSM ACC 2926.
23.- Composición que comprende el anticuerpo como se definen en cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
24.- La composición de acuerdo con el articulo 23 para el tratamiento, prevención o retraso de amiloidosis.
25. - La composición de acuerdo con el articulo 23 ó 24, en donde dicha amiloidosis es una enfermedad neurodegenerati a seleccionada del grupo que consiste de deterioro cognitivo medio, enfermedad de Aizheimer y neurodegeneración en síndrome de Down .
26. - La composición de acuerdo con el artículo, 23 ó 24, en donde dicha amiloidosis es enfermedad de Aizheimer esporádica o una demencia de Aizheimer familiar.
27.- La composición de acuerdo con el articulo 26, en donde dicha demencia de Aizheimer familiar es demencia Británica familiar o demencia Danesa familiar.
28. - Línea de célula de hibridoma DSM ACC 2923.
29. - Linea de célula de hibridoma DSM ACC 2924.
30.- Línea de célula de hibridoma DSM ACC 2925.
31 - Línea de célula de hibridoma DSM ACC 2926.
32. - Uso del anticuerpo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 ó la composición como se define en cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27 en un método de diagnóstico o terapéutico.
33. - El uso de acuerdo con la reivindicación 32, para el diagnóstico de una enfermedad o condición asociada con amiloide.
34. - El uso de acuerdo con la reivindicación 33, en donde dicha amiloidosis es una enfermedad neurodegenerativa seleccionada del grupo que consiste de deterioro cognitivo medio. enfermedad de Alzheimer y neurodegeneración en Síndrome de Down.
35. - El uso de acuerdo con la reivindicación 33, en donde dicha amiloidosis es una enfermedad de- Alzheimer esporádica o una demencia de Alzheimer familiar.
36. - El uso de acuerdo con la reivindicación 35, en donde dicha demencia de Alzheimer familiar es demencia Británica familiar o demencia Danesa familiar.
37. - Un método de diagnóstico in vitro para la diagnosis de una enfermedad o condición asociada con amiloide, en particular enfermedad de Alzheimer, que comprende los siguientes pasos: poner en contacto un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 con una muestra de un sujeto que se sospecha que padece dicha enfermedad o condición, y detectar la unión del anticuerpo a una proteína pGlu-amiloide, preferiblemente un péptido pGlu-?ß de la muestra.
38. - Un equipo de diagnóstico, que comprende el anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, e' instrucciones para uso, y, opcionalmente, (a) una substancia(s) biológicamente activa adicional.
39. - El equipo de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 32, en donde dicha substancia biológica adicional es un inhibidor de una glutaminil ciclasa.
40. - Un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste de SEC ID NO: 23 a 48.
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