CN101634656A - 人tdp-43的单抗包被酶标板的制法及elisa检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新的人TDP－43的单抗包被酶标板的制法及ELISA检测试剂盒，其关键技术之处主要在于，用基因工程方法制备特异性的鼠抗人单抗，并将此抗体纯化后包被的酶标板作为试剂盒的重要组成，然后与TDP－43的多抗、辣根过氧化物酶标记的二抗、TDP－43标准品、TDP－43阳性对照、样品稀释液、洗涤液、显色液、终止液组装为人源TDP－43的ELISA检测试剂盒；建立了敏感快捷的ELISA抗体捕获人血清或细胞、组织培养物中TDP－43浓度的测定方法，具有高特异性，高稳定性。试剂盒主要供一般性实验室或神经病理学临床研究使用。
Description
技术领域
本发明涉及一种新的生物制剂——抗人TDP-43的单抗，和一种用于人源TDP-43的ELISA检测试剂盒，适用于人组织、细胞培养物或血清中TDP-43的定量检测。
技术背景
TDP-43(TAR DNA-binding protein)即TAR DNA结合蛋白，广泛表达在人细胞核内，结合DNA和RNA，调节胞内核酸的转录和拼接，也参与细胞核内小RNA的合成、凋亡和细胞分裂。于1995年被首次发现之后，TDP-43的不正常表达在痴呆病人的血清和尸检中被大量检出。研究表明TDP-43在胞内表达量、定位情况、蛋白质长度、突变或过磷酸化、泛素化修饰均会造成脑组织部分功能的缺失或紊乱(Neumann，M.et al.Ubiquitinated TDP-43 infrontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis[J].Science，2006，314，130-133.)。
在体内，TDP-43表达量的升高通过影响神经胶质的功能而导致的脑神经元毒性。阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)亦称老年性痴呆，占总痴呆症的50-70％，阿尔茨海默病人脑部特征为一些关键位点大量神经元和神经突触的缺失，同时可见β-淀粉样肽斑块和神经纤维损伤，而TDP-43的错误折叠参与了阿尔茨海默病病理发生。
额颞痴呆症(Frontotemporal dementia)发病年龄小于60岁，病例少于阿尔茨海默病，同样不可被治愈。额颞痴呆症表现为肌肉和骨骼的恶性病变，含缬酪肽蛋白(valosin-containingprotein)的病变可导致额颞痴呆，但在FTDU-17型额颞痴呆症病人的尸检中发现，是TDP-43而不是含缬酪肽蛋白的泛素化包含体在患者脑部异常堆积，因此，TDP-43被认为是FTDU-17型额颞痴呆症的一个标识分子。
额颞叶变性(frontotemporal lobar degeneration)有2条蛋白质病理途径，一条为tau途径，另一条为TDP-43途径，后者被认为TDP-43从细胞核中转移，在神经元胞质中渐进累积所致。
运动神经元疾病(motor-neuron disease)也称为肌萎缩性脊髓侧索硬化症(Amyotrophiclateral sclerosis)或葛雷克氏症(Lou Gehrig’s disease)，其症状表现为运动神经元褪化所引起的肌肉渐进性衰弱和痉挛状态。TDP-43的过磷酸化、泛素化或者羧基端某个氨基酸的突变可导致运动神经元疾病。绝大多数运动神经元疾病为TDP-43异常所引起，由过氧化物歧化酶突变所致的病例只占到2％。因此，TDP-43被认为是运动神经元疾病的一个主要的标志蛋白。
佩里综合症(Perry syndrome)表现为体重减轻、情绪低落和肺换气不足，它的病理学特征为TDP-43免疫染色阳性，但与在额颞痴呆症和运动神经元疾病中TDP-43影响中枢神经系统神经元不同的是，TDP-43在佩里综合症影响了锥体外系统的皮层区域和运动神经元。
此外，亦有研究发现错误折叠的TDP-43参与了在帕金森病(Parkinson’s disease)、朊蛋白病(prion diseases)等神经性病理过程。
鉴于TDP-43为神经病理学的一个标记分子(Sleegers，K.and Broeckhoven，C.V.Rogue gene in thefamily[J].Nature，2009，458：415-417.)，该蛋白质异常表达的及时发现将有利于相关病症的早发现早治疗，减轻病人自身和家庭的负担，从而提高人类的生活质量。多数痴呆症平约发病年龄早于50岁，60岁以上人口中老年痴呆症患病比例约为5％，而80岁以上患病比例约为15％，这意味加强TDP-43的检测具有巨大的现实需求和实践意义(Selkoe，D.J.Alzheimer’s diseaseis a synaptic failure[J].Science，2002，298，789-791.)。
目前，国际上几大ELISA试剂盒生产商只是单一地生产TDP-43蛋白或抗体，而尚未有生产整套TDP-43ELISA试剂盒的报道，对TDP-43的研究通常使用TDP-43过表达或错义突变的模式物，如神经细胞、鸡胚或小鼠，而缺乏TDP-43在人的血液、组织或细胞中定量的研究。同时，国内厂家推出的少数几个产品处于初创阶段，甚至连个阳性对照和内参都无法提供，测量所得结果自然令人生疑。问题的原因一方面可能是厂家质量意识淡漠，另一方面，其捕获抗体和检测抗体的纯度和活性在技术上可能也难以达到试剂盒的相应要求。
发明内容
本发明的目的：提供一种新的用于人血清、组织或细胞中人源TDP-43定量检测的ELISA试剂盒。
本发明技术方案如下：
1、抗人TDP-43的特异性单抗包被反应板的制备，通过以下步骤：
(1)36KD TDP-43蛋白片段的获得：
①36KD TDP-43蛋白片段的原核表达：以BC001487 DNA(购自美国典型培养物保藏中心，ATCC)为模板，用一对特异性的正反引物，PCR扩增TDP-43DNA片段(88nt-870nt)，将所得片段克隆于载体pET28a(购自德国Merck公司)，转化BL21(DE3)(购自Merck)感受态大肠杆菌，根据卡那霉素抗性筛选阳性克隆。提取阳性克隆的质粒DNA进行鉴定，得到与目的片段分子量相一致的片段，初步判定为阳性。以PCR阳性克隆提取质粒DNA，进行测序，结果表明TDP-43 cDNA片段正确克隆至pET28a，为一个具有783bp的完整开放式阅读框，与GenBank中人源TDP-43基因100％同源，推算其表达的蛋白质分子量为36KD，PI为5.0。
②36KD TDP-43蛋白片段的鉴定：转化了重组质粒的大肠杆菌BL21经诱导后将菌体收集，超声波裂解，菌体蛋白经SDS-PAGE蛋白电泳及考马斯染色显示，在36KD附近新增一条带，经Western blotting鉴定，能与TDP-43的抗体发生强阳性反应，说明该36KD的TDP-43蛋白具有较强的免疫原性。
③36KD的TDP-43蛋白片段的制备与纯化：经大量培养、诱导、表达，使用Ni2+亲和层析柱(购自Pharmacia)纯化带有6×His标记的TDP-43蛋白，得到大量36KDTDP-43蛋白片段。
(2)制备抗TDP-43的单抗：
①TDP-43蛋白的动物免疫：将36KD的TDP-43蛋白片段与福氏佐剂混合并经充分乳化后，皮下注射，免疫鼠龄在8～12周的BALB/c健康小鼠(购自湖北省实验动物研究中心)3至4只，每次免疫间隔为2周，直至血清效价高于40000∶1。
②杂交瘤细胞的制备：在末次免疫后4天，分离鼠脾细胞，在PEG存在条件下选择与对数生长期的Sp2/0骨髓瘤细胞株(购自中国典型培养物保藏中心，CCTCC)以4∶1的比例融合，饲养细胞来自小鼠腹腔细胞。融合后的细胞以含HAT的培养基筛选，经有限稀释后选出高抗体分泌孔，将孔内细胞克隆，进行抗原特异的ELISA测定，挑选高分泌性细胞株扩大培养或冻存。
③单抗制备：将分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株进行小鼠腹腔接种，待产生明显腹水后收集腹水，用葡萄球菌A蛋白交联的亲和层析柱(购自Pharmacia公司)纯化单抗。抗体存于含55％甘油、0.1％BHA和0.01％硫柳汞的0.01mol/l、pH7.4的PBS之中。
(3)以所得单抗包被反应板：单抗用pH9.6的碳酸盐缓冲溶液稀释成适当浓度，包被96孔板，每孔100μl，置于4℃湿盒16-24小时，PBST洗涤3次，每次30秒，然后拍干，除尽孔内液体。
(4)封闭：用含8％小牛血清的pH7.4的PBS封闭，每孔200μl，37℃，2小时孵育后，PBST洗涤3次，干燥后密封；该板即为抗TDP-43的单抗包被的酶标反应板，可用于TDP-43的定量检测。
2、TDP-43标准品(全长的TDP-43蛋白溶液)的制备：
(1)全长的TDP-43蛋白的原核表达：以BC095435 DNA(购自ATCC)为模板，用一对特异性的正反引物，PCR扩增TDP-43(87nt-1331nt)目的基因，将所得基因克隆于载体pET28a，转化BL21(DE3)感受态大肠杆菌，根据卡那霉素抗性筛选阳性克隆。提取阳性克隆的质粒DNA进行鉴定，得到与目的片段分子量相一致的片段，初步判定为阳性。以PCR阳性克隆提取质粒DNA，进行测序，结果表明全长的TDP-43蛋白质的cDNA正确克隆至pET28a，为一个具有1245bp的完整开放式阅读框，与GenBank中TDP-43基因100％同源，推算其分子量为56KD，PI为6.5。
(2)全长的TDP-43蛋白的鉴定：转化了重组质粒的大肠杆菌BL21经诱导后将菌体收集，超声波裂解，菌体蛋白经SDS-PAGE蛋白电泳及考马斯染色显示，在56KD附近新增一条带，经Western blotting鉴定，能与TDP-43的抗体发生强阳性反应，说明全长的TDP-43蛋白具有较强的免疫原性。
(3)全长的TDP-43蛋白的制备与纯化：经大量培养、诱导、表达，使用Ni2+亲和层析柱纯化，得到大量全长的TDP-43蛋白。
(4)TDP-43标准品制备：将全长的TDP-43蛋白保存于含55％甘油、0.1％BHA和0.01％硫柳汞的0.01mol/l、pH7.4的PBS之中，并使TDP-43蛋白的终浓度为1mg/ml
3、TDP-43阳性对照样品的制备：将全长的TDP-43蛋白溶于含50％甘油、10％人血清、0.5％BSA、0.1％BHA和0.01％硫柳汞的0.01mol/l、pH7.4的PBS之中，并使TDP-43蛋白的终浓度为5μg/ml。
4、TDP-43的多抗的制备：
(1)动物免疫：取纯化好的全长的TDP-43蛋白与福氏佐剂混合并经充分乳化后，脊柱两侧、对称多点皮下注射，免疫3-4月龄、体重在1.7Kg以上的健康日本大耳白兔(购自湖北省实验动物研究中心)3至4只，每次免疫间隔为2周，免疫1月后再次免疫后第8天耳静脉取血测血清效价，直至血清效价高于40000∶1。
(2)血清获取：兔中耳动脉取血，每次40ml，静置30分钟后离心，3000rpm、5分钟，上清即为血清。
(3)多抗的纯化：用全长的TDP-43蛋白交联的亲和层析柱(购自Pharmacia)纯化，得到TDP-43的多抗，保存于含55％甘油、0.1％BHA和0.01％硫柳汞的0.01mol/l、pH7.4的PBS之中，多抗的终浓度为1mg/ml。
5、酶标二抗：购自美国R&D systems，为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的羊抗兔IgG。
6、本试剂盒对TDP-43的ELISA检测步骤包括：
(1)待测样品、标准样、阳性对照依次加入微孔中，进行孵育，TDP-43将与固相载体表面的捕获抗体——预先包被在孔内的抗体相结合。
(2)经过洗涤，将特异性的抗TDP-43的多抗加入孔内，在第二次孵育中，多抗扮演检测抗体，并与第一次孵育中被捕获的TDP-43结合。
(3)洗去多余的多抗，加入酶标二抗，在第三次孵育中，酶标二抗与上一步中的多抗——检测抗体相结合，形成一个4组分的夹心形状的结合物。
(4)洗去未结合的酶标二抗，加入酶的底物3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)，孔内液体在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，加入终止液，转化成黄色。颜色的深浅和样品中TDP-43的含量呈正相关。
(5)用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(O.D.值)，计算样品中TDP-43浓度。
这种新的TDP-43 ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由上述特异性的TDP-43的单抗包被的酶标板、TDP-43蛋白标准品、TDP-43的阳性对照样品、TDP-43的多抗、辣根过氧化物酶标记的二抗构成，具体组分为：(1)酶标板：由TDP-43的单抗包被；(2)样品稀释液：含8％小牛血清和1％抗人IgG的pH7.4的0.01mol/l PBS；(3)洗涤液；(4)TDP-43蛋白标准品；(5)TDP-43的阳性对照样品；(6)TDP-43的多抗；(7)辣根过氧化物酶标记的二抗；(8)显色液：TMB-H2O2系统；(9)终止液：2mol/l H2SO4溶液。
TDP-43结合DNA和RNA，调节胞内核酸的转录和拼接，也参与细胞核内小RNA的合成、凋亡和细胞分裂，其识别核酸的2个功能区位于蛋白质的第105个至257个之间，因此，我们选择性克隆了其N端的262个氨基酸片段，该片段包括了其抗原性、核酸识别的功能区。再采用原核表达的该蛋白制备特异性的单抗，进而采取夹心ELISA，简洁有效地检出人血清、组织和细胞培养物中TDP-43的浓度。本试剂盒所有指标符合美国R&D systems ELISA试剂盒各项指标的严格要求。目前，国外几大ELISA试剂盒生产商尚未有TDP-43的ELISA试剂盒的报道，而国内厂家的产品处于初创阶段，基本没有TDP-43的阳性内参，所得到的测量结论值得商榷。本试剂盒采用20个阴性样品的平均值加上2倍标准方差作为最低检出线，为0.1ng/ml，国内其它公司的TDP-43 ELISA检测试剂盒的最低检出线通常高于0.5mg/ml，本发明提高了检出精度。
本发明选取包含了全部的2个核酸识别功能区的TDP-43片段，并将其作为抗原免疫小鼠得到特异性的高纯度单抗。以此单抗作为捕获TDP-43的抗体，保证了检测结果的特异性，最大程度避免了假阳性。随后以特异性多抗作为检测抗体，进一步排除了假阳性；加入酶标二抗，形成一个4组分的夹心形状的结合物，最后加入底物显色液，将以上得到的正确信号有效放大，对比同步平行进行的标准品和内参实验，进一步排除实验中的试剂或操作误差，最终得到可信赖的结论。
本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：
1、应用范围广泛：适用于人血清、组织和细胞培养物；
2、检测速度快：仅约3小时；
3、使用便捷：不需要复杂仪器；
4、步骤简单；
5、所得结果准确可靠：通过多步特异性的抗原、抗体的亲和反应，层层有效地降低了非特异性反应；而且除提供标准品外，还提供阳性对照，确保所得数据排除了众多试剂、温度等因子的干扰。
具体实施方式
1、试剂：
(1)包被液(0.02mol/l，pH9.6的碳酸钠——碳酸氢钠缓冲液)：Na2CO3 0.6g，NaHCO3 1.16g，Na2N3 0.2g，加双蒸水至1000ml，调pH至9.6。
(2)标本稀释液(含8％小牛血清和1％抗人IgG的pH7.4的0.01mol/l PBS)：NaCl 8.0g，NaH2PO4·2H2O 0.3g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KCl 0.2g，硫柳汞0.1g，加双蒸水至1000ml，调pH至7.4。
(3)封闭液(8％小牛血清/PBS溶液)：小牛血清80ml，0.01mol/l pH7.4 PBS 920ml。
(4)洗涤液(pH7.4 PBST)：NaCl 8.0g，NaH2PO4·2H2O 0.3g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，Tween200.5g，硫柳汞0.1g，加双蒸水至1000ml，调pH至7.4。
(5)酶标二抗(HRP标记的羊抗兔多抗)：购自美国R&D systems，使用时用标本稀释液作1∶10000稀释。
(6)TDP-43蛋白标准品：全长415个氨基酸的TDP-43蛋白的0.01mol/l PBS溶液，pH7.4，含55％甘油、0.1％BHA和0.01％硫柳汞，TDP-43终浓度为1mg/ml，使用时用标本稀释液稀释至128、32、8、2、0.5、0ng/ml六个梯度。
(7)TDP-43的阳性对照样品：全长的TDP-43蛋白的0.01mol/l、pH7.4的PBS溶液，含50％甘油、10％人血清、0.5％BSA、0.1％BHA和0.01％硫柳汞，TDP-43的终浓度为5μg/ml，使用时用标本稀释液作1∶100稀释。
(8)抗TDP-43的多抗：多抗的PBS溶液，含55％甘油、0.1％BHA和0.01％硫柳汞的0.01mol/l、pH7.4，多抗的终浓度为1mg/ml，使用时用标本稀释液作1∶10000稀释。
(9)底物显色液(TMB-H2O2系统)：
①底物液A(3′，3′，5，5′-四甲基联苯胺tetramethyl benzidine，TMB)：TMB 200毫克，无水乙醇100ml，加双蒸水至990ml；
②底物液B(H2O2尿素)：Na2HPO4·12H2O 36.8g，柠檬酸9.3g，1％过氧化氢尿素4.8ml，加双蒸水至1000ml，调pH至5.2。
③加入酶标孔前10分钟将底物液A和底物液B两者1∶1混合，作为底物显色液。
(10)终止液(2mol/l H2SO4溶液)：烧杯内预先加入600ml双蒸水，将浓硫酸100ml缓慢滴加，不断搅拌，冷却至室温后定容至900ml。
2、主要仪器：
(1)酶标仪：BIO-RAD Model 680。
(2)ELISA反应板：美国Corning Incorporated costar R 96 Well EIA/RIA plate。
(3)水浴锅：购自美国Napco公司，Model 203。
3、方法：
(1)酶标二抗最适滴度的选择
①将100ng/ml兔IgG包被反应板，洗涤；
②将酶标二抗用标本稀释液作一系列稀释，加入孔内，37℃，孵育40分钟后，PBST洗涤3次；
③加入底物显色，20分钟后加入终止液；
④读取吸光值，取吸光值为1.0时的酶标二抗稀释度——1∶10000作为酶标二抗的最佳稀释度。
(2)棋盘法选择单抗的最佳包被滴度
①用包被液将单抗作一系列稀释后，4℃包被反应板16-24小时，PBST洗涤3次，除尽孔内液体；
②加入标准样和TDP-43阳性对照、阴性参考血清溶液，孵育，洗涤；
③加入多抗溶液，孵育，洗涤；
④加入酶标二抗，孵育，洗涤；
⑤加入底物显色，20分钟后加入终止液；
⑥读取吸光值，选取TDP-43阳性对照样吸光值为0.8至1.0，阴性对照的吸光值小于0.1的单抗包被稀释度——1∶10000作为最佳稀释度。
(3)单抗包被反应板的制备方法：
①以碳酸盐缓冲液稀释单抗，包被96孔板，每孔100μl，置于4℃湿盒16-24小时，PBST洗涤3次，每次30秒，然后拍干，除尽孔内液体；
②用含8％小牛血清的pH7.4的PBS封闭，每孔200μl，37℃，2小时，PBST洗涤3次，干燥后密封；该板即为抗TDP-43的单抗包被的酶标板，可用于TDP-43的特异性检测。
(4)试剂盒的构成：
所述试剂盒由特异性单抗包被反应板制得的酶标板、标本稀释液、洗涤液、酶标二抗、TDP-43标准品、TDP-43阳性对照样品、多抗、底物、终止液组成，具体组分为：
①酶标板：TDP-43的单抗包被的酶标板；
②标本稀释液：含8％小牛血清和1％抗人IgG的pH7.4的0.01mol/l PBS；
③洗涤液：pH7.4PBST；
④酶标二抗：HRP标记的羊抗兔IgG；
⑤TDP-43标准品：全长TDP-43蛋白的PBS溶液，TDP-43终浓度为1mg/ml；
⑥TDP-43阳性对照样品：全长TDP-43蛋白的PBS溶液，TDP-43终浓度为5μg/ml；
⑦多抗：多抗的PBS溶液，抗体终浓度为1mg/ml；
⑧底物显色液：TMB-H2O2系统；
⑨终止液：2mol/l H2SO4溶液。
(5)利用上述试剂盒检测组织或细胞培养物、血清中TDP-43浓度的方法：
①将待测样品、标准品、阳性对照样品进行处理：用标本稀释液将血清样品进行1∶10、细胞或组织裂解液1∶5、阳性对照1∶100稀释；标准品用标本稀释液稀释成128、32、8、2、0.5、0ng/ml六个梯度；
②将待测样品、标准样、阳性对照依次加入酶标孔中，每孔100μl，37℃孵育1小时，PBST洗涤3次，每次洗涤均拍干孔内液体；
③将抗TDP-43的多抗加入酶标孔内，每孔100μl，37℃孵育1小时，PBST洗涤3次；
④加入酶标二抗，每孔100μl，37℃孵育40分钟，PBST洗涤3次，每次洗涤均拍干孔内液体；
⑤加入酶的底物，每孔100μl，室温孵育20分钟后加入终止液，每孔50μl；
⑥用酶标仪在450nm波长下测定吸光度，制作不同浓度标准品的吸光值为Y轴、以其浓度的对数为X轴制得标准曲线。
⑦计算结果：如果阳性对照样品的测定值和标示值(5μg/ml)相比较，其变异系数小于15％，说明测定过程可靠，可依据标准曲线计算所测样品中TDP-43浓度。
Claims (2)
1、人TDP-43的单抗包被酶标板的制法，通过下列步骤制备而成：
(1)以BC001487DNA为模板，扩增TDP-43基因片段，与载体PET28a连接，转化BL21，表达大量36KD TDP-43蛋白片段；
(2)将36KD TDP-43蛋白免疫小白鼠，取其脾细胞与鼠骨髓瘤细胞融合，选择阳性杂交瘤细胞于鼠腹水中培养，纯化蛋白得到抗TDP-43的单抗；
(3)将所得单抗用pH9.6的碳酸盐缓冲溶液稀释后包被96孔板，100μl/孔，4℃16-24小时，PBST洗涤3次，每次30秒，然后除尽孔内液体；
(4)用含8％小牛血清的pH7.4的PBS封闭，每孔200μl，37℃，2小时，PBST洗涤3次，干燥后密封；该板即为抗TDP-43的单抗包被的酶标板，可用于TDP-43的特异性检测。
2、应用权利要求1所述的人TDP-43的单抗包被酶标板的ELISA检测试剂盒，其特征为：由权利要求1所述的抗TDP-43的单抗包被的酶标板、TDP-43标准品、TDP-43的阳性对照样品、抗TDP-43的多抗、样品稀释液、洗涤液、显色液、终止液构成，具体组分为：(1)酶标板：由TDP-43的单抗包被；(2)样品稀释液：含8％小牛血清和1％抗人IgG的pH7.4的0.01mol/l PBS；(3)洗涤液：pH7.4PBST；(4)酶标二抗：购自美国R&D systems的辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的羊抗兔IgG；(5)TDP-43标准品：全长TDP-43的PBS溶液，TDP-43终浓度为1mg/ml；(6)TDP-43阳性对照样品：全长TDP-43的PBS溶液，TDP-43终浓度为5μg/ml；(7)抗TDP-43的多抗：多抗的PBS溶液，多抗的终浓度为1mg/ml；(8)显色液：TMB-H2O2系统；(9)终止液：2mol/l H2SO4溶液。
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2009
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| WO2013061163A2 (en) * | 2011-10-28 | 2013-05-02 | Biogen Idec International Neuroscience Gmbh | Tdp-43 specific binding molecules |
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