KR20160074263A

KR20160074263A - 파킨슨 질환에서 중간엽 줄기세포에서 유래된 갈렉틴-1의 ｃｍｅ 억제를 통한 알파시뉴클레인의 유입억제 효과

Info

Publication number: KR20160074263A
Application number: KR1020140183367A
Authority: KR
Inventors: 이필휴; 김하나; 신진영
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2014-12-18
Filing date: 2014-12-18
Publication date: 2016-06-28
Also published as: KR101698067B1

Abstract

본 발명은 α-시누클레인의 응집과 관련된 파킨슨 질환을 치료할 수 있는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 중간엽 줄기세포 유래의 갈렉틴-1을 이용하여 세포 표면의 N-메틸-D-아스파테이트(NMDA) 수용체를 조절함으로써 세포외 α-시누클레인의 클라트린 매개 엔토시토시스를 방해하여 α-시누클레인 응집체 형성을 억제 함으로써 α-시누클레인의 응집에 의해 유발되는 파킨슨 병증을 포함하는 질환을 치료 또는 예방할 수 있다.

Description

파킨슨 질환에서 중간엽 줄기세포에서 유래된 갈렉틴-1의 ＣＭＥ 억제를 통한 알파시뉴클레인의 유입억제 효과{Galectin-1 secreted from mesenchymal stem cells modulates extracellular α-synuclein by inhibiting transmission via clathrin-mediated endocytosis}

본 발명은 중간엽 줄기세포에서 유래된 갈렉틴-1의 클라트린-매개 엔도시토시스(clathrin-mediated endocytosis, CME) 억제를 통하여 α-시누클레인의 응집과 관련된 파킨슨 질환을 치료할 수 있는 방법에 관한 것이다.

α-시누클레인은 140여 개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 뉴런의 시냅스 말단에서 펼쳐진 상태의 세포기질 단백질로서 발견된다. 그러나 α-시누클레인이 과발현되면 정상적인 세포기능을 방해하여 신경돌기의 성장과 세포접착을 감소시킨다. 모노머성/올리고머성 중간체 또는 섬유상 형태로 이루어진 α-시누클레인 응집체는 파킨슨 질환과 다계통 위축증이나 루이제 치매와 같은 질환의 발병과 연관이 있다.

파킨슨 질환(PD) 환자의 뇌척수액 및 혈장 샘플에서 올리고머 형태 및 모노머 형태의 α-시누클레인이 모두 발견된 것은 작은 α-시누클레인 응집체가 세포외 공간에 접근할 수 있음을 시사한다. 종래의 동물실험 및 임상실험 데이터에 의하면, 잘못 폴딩된 α-시누클레인이 엑소시토시스에 의해 세포로부터 방출된 후, 세포간 전달에 의해 뇌의 한 영역에서 다른 영역으로 전달될 수 있다고 보고된 바 있다[(a) Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 11, 301-307 (2010); (b) J. Clin. Invest. 121, 715-725(2011)]. 정확한 α-시누클레인의 전달 메커니즘은 아직 알려지지 않았지만, 엔도시토시스에 있어 운반되는 단백질은 언제나 세포 표면에 존재하는 특정 수용체에 의해 인식되므로, α-시누클레인이 아직까지 밝혀지지 않은 세포 표면상의 수용체와 상호작용을 하는 것을 추정해볼 수 있다.

이에, 뇌에서 상승된 수준의 α-시누클레인에 대해 환자를 치료하기 위한 방법의 개발 및 메커니즘을 규명하는 것이 필요하다.

α-시누클레인 응집체의 분해에 관한 이전의 연구들에서는 리팜피시(rifampicin)과 그 외 작은 화합물에 의한 α-시누클레인 응집체를 가용성 올리고머의 형태나 모노머 형태의 축적을 감소시키도록 유도시키는 방향으로 연구되어 왔다. 그러나 불용성 α-시누클레인 복합체를 제거할 수 없었고, 분해된 α-시누클레인의 자가-응집(self-aggregation)을 억제할 수 없었다. 또한 외부의 생물학적 이용도가 가능한 화합물을 투여하더라도 인간 실험과정에서 혈액-뇌-장벽(blood-brain-barrier)의 통과하기 어려워 뇌로 도달하기 어렵다.

이에, 본 발명은 α-시누클레인의 클라트린 매개 엔도시토시스(clathrin-mediated endocytosis, CME)를 억제함으로써 파킨슨 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 상기한 문제를 해결하기 위하여, 갈렉틴-1을 유효성분으로 포함하여 세포외 α-시누클레인의 세포간 전달을 억제하는 α-시누클레인의 클라트린 매개 엔도시토시스 저해용 조성물을 제공한다.

여기서, 갈렉틴-1은 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cells)에서 유래된 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 갈렉틴-1을 유효성분으로 포함하는 파킨슨 질환 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.

상기 갈렉틴-1은 세포 표면의 N-메틸-D-아스파테이트(NMDA) 수용체에 작용하여 세포외 α-시누클레인의 클라트린 매개 엔도시토시스를 억제함으로써 α-시누클레인의 세포간 전달 또는 응집체 형성을 방해하여 세포 생존능을 회복시킬 수 있다.

또한 본 발명은 갈렉틴-1을 처리하여 α-시누클레인 응집체의 형성을 억제하는 방법을 제공한다.

상기 갈렉틴-1은 세포 표면의 N-메틸-D-아스파테이트(NMDA) 수용체에 작용하여 세포외 α-시누클레인의 클라트린 매개 엔토시토시스를 억제함으로써 α-시누클레인의 내재화를 방지할 수 있는데, 이를 통해 α-시누클레인 응집체의 형성이 억제될 수 있다.

본 발명에 따른 갈렉틴-1을 유효성분으로 포함하는 조성물은 α-시누클레인의 응집에 의해 유발되는 질환, 바람직하게는 파킨슨 질환을 예방 또는 치료하는 효과를 제공한다.

도 1은 MSC의 세포외 α-시누클레인의 내재화와 세포간 전달을 억제하는 것을 보여주는 그림으로서,
도 1a는 세포를 α-시누클레인으로 처리하거나 MSC와 함께 배양한 후 면역염색을 통해 확인한 내재화된 α-시누클레인을 확인한 이미지이다((αS, 녹색) 스케일바 = 10 μm),
도 1b는 α-시누클레인 만으로 처리하거나(상단 이미지) MSC와 함께 배양한(하단 이미지) 후 도너 세포(녹색 화살표)로부터 이와 연결된 억셉터 세포(적색 화살표)로의 도너-억셉터 공배양법에 의한 α-시누클레인의 전달(흰색 상자로 표시한 영역)을 확인한 도이다(스케일바 = 10 μm).
도 1c는 α-시누클레인 처리군, MSC 공배양군 및 바필로마이신 처리 MSC군(각 군의 n = 3)의, 세포질에 내재화된 α-시누클레인 및 배양배지 내의 세포외 α-시누클레인을 정량화한 그래프이다.
도 1d은 바필로마이신 처리한 후 MSC와 함께 배양한 신경세포 또는 MSC에 다이나소어 처리한 후 신경세포와 함께 배양한 후 세포 내에 내재화된 표지된 α-시누클레인을 면역염색을 통해 확인한 결과이다(스케일바 = 10 μm).
도 1e는 α-시누클레인군, MSC 공배양군 및 바필로마이신 처리 MSC군(각 군의 n = 3)의 세포생존능을 정량화한 결과이다. 모든 데이터는 평균 ± s.e.로 표시하였다(독립표본 t 검정). *P < 0.05, **P < 0.01
도 2는 MSC의 세포 표면 NMDA 수용체의 조절을 통해 세포외 α-시누클레인 원섬유의 CME를 억제하는 효과를 나타낸 것으로서,
도 2a 및 2b는 각각 α-시누클레인만으로 처리하거나, MSC와 함께 배양하거나 MK-801로 처리한 후(각 군의 n = 3) 클라트린의 웨스턴블롯 결과 및 면역염색 결과이다(스케일바 = 10 μm).
도 2c 및 2d는 각각 α-시누클레인만으로 처리하거나, MSC와 함께 배양하거나 다이나소어로 처리한 후(각 군의 n = 3) EEA1의 웨스턴블롯 결과 및 면역염색 결과이다(스케일바 = 10 μm).
도 2e 및 2f는 각각 α-시누클레인만으로 처리하거나, MSC와 함께 배양하거나 MK-801로 처리한 후(각 군의 n = 3) NR1의 웨스턴블롯 결과 및 면역염색 결과이다(스케일바 = 10 μm).
도 2g 및 2h는 각각 α-시누클레인만으로 처리하거나, MSC와 함께 배양하거나 MK-801로 처리한 후(각 군의 n = 3) NR2A의 웨스턴블롯 결과 및 면역염색 결과이다(스케일바 = 10 μm).
모든 데이터는 평균 ± s.e.로 표시하였다(독립표본 t 검정). *P < 0.05, **P < 0.01.
도 3a 및 3b는 각각 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 및 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화-비행시간 질량분광(MALDI-TOF/MS)를 이용하여 MSC로부터 분비되는 단백질을 확인한 결과이다.
도 4는 MPTP를 처리하여 파킨슨 질환이 유도된 동물모델에 MSC를 정맥주사하여 처리한 후의 MSC에서 분비하는 갈렉틴-1 단백질의 면역염색 결과이다(스케일바 = 20 μm).
도 5는 MSC를 정맥주사한 파킨슨 질환이 유도된 동물모델에서 갈렉틴-1 단백질의 발현량을 정량화한 그래프이다.
도 6a는 신선한 배지, MSC-CM(MSC-conditioned medium), Gal-1 또는 Gal-1 siRNA로 처리된 MSC으로 처리한 후 신경세포 내의 클라트린, EEA1 및 세포 표면 NR1 및 NR2A를 면역염색한 결과이다(스케일바 = 10 μm).
도 6b는 Gal-1 또는 Gla-1 siRNA 처리된 MSC으로 처리한 후 신경세포 내의 클라트린, EEA1 및 세포 표면 NR1 및 NR2A에 대한 웨스턴블롯 결과를 신선한 배지 및 MSC-CM과 비교한 결과이다(각 군의 n = 3).
도 6c는 α-시누클레인 원섬유를 Gal-1 또는 Gla-1 siRNA 처리된 MSC-CM으로 처리한 후 신경세포의 생존률을 신선한 배지 및 MSC-CM과 비교한 결과이다(각 군의 n = 5).
모든 데이터는 평균 ± s.e.로 표시하였다(독립표본 t 검정). *P < 0.05, **P < 0.01.
도 6d는 MSC에서 Gal-1의 RT-PCR 분석 결과로, Gal-1 siRNA로 처리한 MSC에서 Gal-1 mRNA의 내인성 발현이 감소되었다.
도 7은 Alexa Fluor 488로 표지한 α-시누클레인 원섬유를 마우스의 피질 내로 정위접종한 이미지이다.
도 8은 α-시누클레인을 접종한 동물모델에서 MSC와 Gal-1에 따른 세포외 α-시누클레인의 세포간 전달감소 효과를 확인하기 위한 것으로, 모든 데이터는 평균 ± s.e.로 표시하였다(독립표본 t 검정). *P < 0.05, **P < 0.01.
도 8a는 Alexa 488로 표지된 α-시누클레인의 면역염색 결과로, MSC, MSC-CM 또는 Gal-1을 투여한 마우스의 경우 같은 쪽 및 반대쪽 반구 내에서 전달된 α-시누클레인의 밀도와 범위가 α-시누클레인만을 투여한 경우에 비해 크게 감소하였다 (스케일바 = 10 μm). 화살촉 부분은 접종부위 부근 피질영역 내의 Alexa 488 표지된 α-시누클레인을 나타낸다. .
도 8b는 MSC, MSC-CM 또는 Gal-1을 투여한 마우스의 같은 쪽 및 반대쪽 반구 내의 세포질 내 α-시누클레인을 정량한 결과를 α-시누클레인만을 투여한 경우와 비교한 그래프이다(각 군의 n = 5).
도 8c는 MSC, MSC-CM 또는 Gal-1을 투여한 마우스의 같은 쪽 및 반대쪽 반구 내의 인산화된 α-시누클레인(p-αS)의 웨스턴블롯 분석결과를 α-시누클레인만을 투여한 경우와 비교한 그래프이다(각 군의 n = 5).
도 8d 내지 8g는 각각 MSC, MSC-CM 또는 Gal-1을 투여한 마우스의 같은 쪽 및 반대쪽 반구 내의 클라트린(8d), EEA(8e), NR1 서브유닛(8f) 및 NR2A 서브유닛(8g)의 웨스턴블롯 분석결과를 α-시누클레인만을 투여한 경우와 비교한 그래프이다(각 군의 n = 5).
도 8h 및 8i는 각각 MSC, MSC-CM 또는 Gal-1을 투여한 마우스의 프로카스파제 및 분리된 카스파제-3의 웨스턴블롯 결과(8h) 및 TUNEL 면역염색 결과(8i)를 α-시누클레인만을 투여한 경우와 비교한 결과이다(스케일바 = 20 μm).
도 9는 각각 MSC, MSC-CM 또는 Gal-1을 투여한 마우스의 α-시누클레인과 (a) 클라트린, (b) EEA1, (c) NR1 및 (d) NR2A의 반응성을 확인한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

α-시누클레인은 응집/축적되어 작은 세포간 응집체를 형성하는 경향이 있는데, 이로 인하여 다양한 유형의 α-시누클레인 병증에서 세포독성과 세포사멸이 증가하게 된다. 최근 연구에 의해 α-시누클레인이 세포에서 세포로 전달된다는 것이 확인되었다. α-시누클레인과 그 응집체는 엑소시토시스에 의해 신경세포로부터 방출되며, 뉴런과 신경교세포는 엔도시토시스에 의해 세포외 α-시누클레인 응집체를 내재화할 수 있다. 세포외 α-시누클레인 응집체는 프리온과 유사한 거동을 보이므로 α-시누클레인 병증의 발병과 전파에 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. 따라서 세포외 α-시누클레인 전달의 조절을 통해 파킨슨 질환과 같은 α-시누클레인 병증의 치료가 임상적으로 유효할 것으로 예상하였다.

이에, 본 발명의 발명자들은 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell; 이하, 'MSC' 라 한다)로부터 분비되는 생체분자인 갈렉틴-1이 α-시누클레인과 N-메틸-D-아스파르테이트(N-methyl-D-aspartate, 이하 'NMDA'라 한다) 수용체 사이의 상호작용을 조절하여 α-시누클레인의 세포간 전달을 억제할 수 있는 것을 밝혀냄으로써 완성하게 되었다.

구체적으로, 미리 형성된 α-시누클레인 응집체를 in virto에서 MSC-조정배지(mesenchymal stem cell conditioned medium, 이하 'MSC-CM'이라 한다)에서 배양하면, 도너 세포로부터 억셉터 세포로의 α-시누클레인 전달을 크게 감소시켜, 세포외 α-시누클레인의 뉴런 내재화를 억제할 수 있고, 이를 통해 뉴런의 생존능을 크게 향상시킬 수 있다.

엔도시토시스에 있어 운반되는 단백질은 세포 표면에 존재하는 특정 수용체에 의해 인식될 수 있는데, 본 발명에 의하면, MSC를 처리하는 경우, 세포 표면에 존재하는 NMDA 수용체와 상호작용을 하여 클라트린의 면역반응성이 크게 감소하여 클라트린 매개 엔도시토시스(clathrin-mediated endocytosis, 이하 'CME'라 한다)를 억제할 수 있고, 이를 통해 α-시누클레인의 뉴런 세포 내 내재화를 방지하고, 세포간 전달을 억제함으로써 α-시누클레인의 응집에 따른 질환, 바람직하게는 파킨슨 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명에서는 단백질 분석을 통해, 갈렉틴-1(Galectin-1, 이하 'Gal-1'이라 한다)이 α-시누클레인의 조절 및 클라트린 면역반응과 관련된 MSC 유래의 가용성 인자 중 하나라는 것을 보여준다. Gal-1의 처리는 α-시누클레인의 전달을 억제하였고, 클라트린 단백질의 발현을 크게 감소시켰다.

본 발명에서 Gal-1은 갈락토스 결합 렉틴으로, 세포접착, 세포증식 및 세포 사멸의 조절에 관여하는 다기능성 분자이다. 신경계와 관련하여 Gal-1은 신경줄기세포의 증식, 신경돌기의 성장, 세포의 산화환원 상태에 대한 적응 및 NR1 서브유닛과의 상호작용을 통한 글루타메이트 독성의 조절에 관여한다.

본 연구에서의 결과 데이타는 MSC 유래의 Gal-1이 파킨슨 질환이 유도된 환경에서 α-시누클레인의 클라트린 매개 엔도시토시스를 방해함으로써 α-시누클레인 응집체 형성을 억제할 수 있음을 시사한다. 이러한 발견을 토대로 본 발명은 α-시누클레인 응집과 관련된 파킨슨 질환을 치료 또는 예방할 수 있는 방법을 제공한다. 구체적으로 갈렉틴-1(Galectin-1, Gal-1)을 이용하여 세포외 α-시누클레인의 세포간 전달을 억제하는 α-시누클레인의 클라트린 매개 엔도시토시스 저해용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 갈렉틴-1을 유효성분으로 포함하여 α-시누클레인 응집체과 관련된 파킨슨 질환을 치료할 수 있는 조성물 및 파킨슨 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 구체적으로, 세포외 α-시누클레인의 클라트린 매개 엔도시토시스를 방해함으로써 α-시누클레인의 세포 내재화를 억제하여 α-시누클레인 응집체 형성을 방지함으로써 질환을 치료 또는 예방할 수 있는 방법을 제안한다.

본 발명에 따른 조성물은 비경구로 투여될 수 있으며, 특히 주사제로서 제작되어 복강, 정맥 또는 동맥 등으로 투여될 수 있으며, 경피 투여도 가능하다.

MSC 배양을 위한 조성은 DMEM에 10% fetal bovine serum 과 1% antibiotic mixture of penicillin and streptomycin를 섞은 배지로 배양하며 다른 세포 배양과 동일한 방법을 가진다. 3일간의 배양을 거친 MSC 배양 배지는 다양한 분비 단백질을 함유하고 있으며 그 예로 neurotrophic growth factors, chemokines, cytokines, and extracellular matrix protein이 다량 함유되어 있으며 이 안에 MMP protein도 포함되어 있다. MSC가 분비한 단백질로 인한 신경보호효과를 지닌다는 보고가 많이 있다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

α- 시누클레인 응집체의 제조 및 형광 염색 표지

재조합 α-시누클레인(PBS 중 200 μM)을 37 ℃(250 rpm) 에서 14 일 동안 교반하였다. 간단한 초음파 처리 후, 상기 단백질을 다시 7일간 인규베이션하였다. 응집된 단백질을 200000 × g에서 1시간 동안 원심분리시켜 회수하고, 펠렛을 간단 초음파로 재현탁시켰다. α-시누클레인 응집체의 Alexa Fluor 488 표지를 제조업자의 지시(Invitrogen)에 따라 수행하였다. 간단히, 응집체 단백질을 실온에서 1시간동안 Alexa Fluor 488의 24-배 과량으로 항온처리하였다. 과량의 비결합된 Alexa Fluor 488 염색을 탈염 칼럼을 통하여 통과시켜 제거하였다.

MSCs 와 SH - SY5Y 배양

동결상태의 2회 계대배양하여 특성규명된 인간 MSCs의 동결된 바이알을 세브란스 병원 세포 치료센터(대한민국, 서울)에서 입수하였다. 인간 신경아세포종 세포주, SH-SY5Y를 Korean Cell Line Bank (Seoul, South Korea)에서 입수하였다. MSCs 와 SH-SY5Y 세포들은 모두 10% 태아소혈청(HyClone) 및 페니실린과 스트렙토마이신(1%; HyClone)의 항생제 혼합물로 보충된 둘베코 개질 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium: DMEM; HyClone)에서 유지하였다. 이러한 세포들은 70-80% 콘플루언스가 되면, 트립신화시키고, 계대배양시켰다. 이 세포들을 37 ℃의 5% CO₂ 에서 사용전에 습윤화 항온배양기에서 배양하였다. in vitro 실험을 위하여, SH-SY5Y를 1.5×10⁴/cm²의 밀도로 플레이트하고, 조정배지(conditioned medium, CM)로 처리하였다.

분화를 위하여 SH-SY5Y를 5×10⁵/cm²의 밀도로 플레이팅한 후 DMEM 내에서 단층으로 성장시켰다. 1일 후에, 세포를 10 μM 레티노산(Sigma)이 첨가된 신선한 DMEM 내에서 인큐베이션하였다. 2일에 한 번씩 배지를 교환하면서 2주 동안 분화가 진행되도록 한 후 α-시누클레인(1 μM) 또는 Gal-1(100 ng)으로 2시간 동안 처리하였다. 또한, 직접적 접촉 없이 함께 배양하여 분화된 SH-SY5Y에 대한 MSC의 영향을 Costar 트랜스웰(Corning)을 사용하여 시험하였다. MSC는 Costar 트랜스웰의 투과막 상에 배양하였고, 분화된 SH-SY5Y 세포는 플레이트의 바닥에 위치하도록 하였다. α-시누클레인의 제거를 막기 위하여, α-시누클레인을 포함하는 배지에 바필로마이신 A1(50 nM, Sigma)을 가하였다. 엔도시토시스를 억제하기 위하여, 보충배지를 2시간 동안 다이나소어(80 μM, Sigma)로 전처리하였다. 또한, 엔도시토시스의 억제를 위해 보충배지를 3시간 동안 MK-801 수소말레산염(50 μM, Sigma)으로 전처리하였다. 모든 실험은 3회 반복 수행하였다.

플라스미드 트랜스펙션

트랜스펙션은 Superfect(Bioneer)를 사용하여 제조업체의 지시에 따라 수행하였다. 분화된 SH-SY5Y 세포를 10% FBS가 첨가된 OPTI-MEM 배지에 넣고 37 ºC에서 인큐베이션하였다. 트랜스펙션하기 24시간 전에 세포를 플레이팅한 후 80~90%의 컨플루언스로 성장시켰다. 세포의 트랜스펙션은 Lipofectamine 2000(Invitrogen)을 사용하여 제조업체의 지시에 따라 수행하였다. 도너 및 억셉터 세포의 배양을 위해, 억셉터 세포를 mCherry(적색)로 표지된 엔도좀 Rab5로 트랜스펙션하였다. 도너 세포는 Alexa Fluor 488 표지된 α-시누클레인으로 3시간 동안 인큐베이션하였다. PBS로 세척하고 트립신으로 처리한 후, 도너 세포 억셉터 세포 상에서 24시간 동안 함께 배양하였다(배양접시 당 각 세포 수 40,000(1:1)).

세포조건배지의 제조

조건배지는 다음과 같이 제조하였다. 컨플루언스 80%의 5계대 MSC에 무혈청 DMEM을 공급하였다. MSC의 배지는 다양한 분비분자를 포함하는 것으로 간주하였다. 생체 내 투여를 위해, 1×10⁶개의 세포로부터 얻은 CM을 원심분리하여 세포잔해물을 제거한 후 VIVASPIN6 원심여과장치(Sartorius Stedim)를 사용하여 4 ℃에서 1시간 동안 농축하였다.

2D- PAGE

2D-PAGE는 기본적으로 이전에 보고한 방법에 따라 수행하였다. 200 μg의 단백질 추출액을 비선형의 pH 4~10 구배 IPG 스트립(Genomine Corp.)을 사용하여 등전집속에 의해 1차 분리한 후, 도데실황산나트륨 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동법(SDS-PAGE, 26×20-cm format)에 의해 2차 분리하였다. 단백질은 이전에 보고한 방법에 따라 알칼리 은염색에 의해 검출하였다. 단백질 스팟의 이미지 분석과 정량화는 PDQuest 소프트웨어(Bio-Rad)를 이용하여 수행하였다. 각 스팟 내의 단백질 양을 총 유효 스팟 강도에 대해 표준화하였다.

질량 분석법에 의한 단백질 동정

펩티드 질량 핑거프린팅(PMF)에 의하여 단백질을 동정하기 위하여, 단백질 스팟을 절단하여 트립신(Promega)으로 처리하고, 50% 아세토니트릴/0.1% 트리플루오로아세트산 중 α-시아노-4-히드록시신남산과 혼합한 후, Microflex LRF 20 (Bruker Daltonics)를 사용하여 보고된 방법에 따라 matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF/MS) 분석을 수행하였다. 600~3000의 m/z 영역에 대하여 스팟당 300 개의 스펙트럼을 얻은 후, 트립신 자가소화 피크를 이용하여 2점 내부 보정에 의하여 계산하였다. Flex 분석 3.0(Bruker Daltonics)을 이용하여 피크 리스트를 작성하였다. 피크를 얻기 위한 임계값은 단동위질량의 최소 분해능 5000, S/N 2.5로 하였다. Profound 프로그램(http://prowl.rockefeller.edu/prowl-cgi/profound.exe)을 사용하여 인체 NCBInr 데이터베이스에서 단백질의 정체를 확인하였다. 데이터베이스 검색에 사용한 파라미터는 다음과 같았다. 절단효소는 트립신, 최대 허용 절단오차는 1, 완전수식을 위한 알킬화제는 요오드아세트아미드, 부분수식은 산화, 단동위질량, 질량 허용오차는 ±0.1 Da으로 하였다. PMF 판정은 확률을 기준으로 하였다.

세포생존능 분석

SH-SY5Y 세포를 수거하여 96웰 폴리스티렌 플레이트(Corning) 상에 웰 당 배지 100 μL, 세포 수 1.5×10⁴으로 플레이팅하였다. 플레이트를 37 ℃에서 24시간 동안 인큐베이션하여 세포가 접착되도록 하였다. 24시간 후에, 배지를 α-시누클레인과 CM으로 프리인큐베이션한 혼합액 100 μL로 교환하거나 SH-SY5Y 세포를 직접 α-시누클레인으로 처리하였다. 동일 부피의 DMEM를 대조군 배양액에 가하였다. 이어, 플레이트를 37 ℃에서 24시간 및 48시간 동안 더 인큐베이션하였다. 세포생존능은 보고된 방법에 따라 3-[4,5-디메틸티아졸-2-릴]-2,5-디페닐테트라졸리늄 브로마이드(MTT) 환원분석에 의해 측정하였다. 간략히 설명하면, 세포를 다양한 배지 샘플과 함께 인큐베이션한 후 최종농도가 0.5 mg/mL가 되도록 MTT를 가하였다. 37 ℃에서 3시간 동안 인큐베이션한 다음, 원심분리 후 배지를 각 웰에서 제거하였다. ELISA 마이크로플레이트리더(VersaMax)를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존능은 샘플을 포함하는 각 웰의 (백그라운드에 대해 보정한) 흡광도를 배지만을 포함하는 웰의 (백그라운드에 대해 보정한) 흡광도로 나누어 계산하였다.

역전사 중합효소 연쇄반응( RT - PCR )

MSC 세포 내의 Gal-1을 넉다운시키기 위하여, Gal-1 siRNA 컨스트럭트(Santa Cruz)를 구입하여 넉다운 효율을 시험하였다. MSC를 1×10⁵/cm²의 밀도로 플레이팅한 후 10 μL의 Lipofectamine 2000(Invitrogen)을 포함하는 100 μL의 Opti 최소필수배지(Gibco) 내에서 8 μL의 20 μM의 siRNA(최종농도 40 nM)와 함께 인큐베이션하였다. 72시간 후에, TRIzol® 시약(Invitrogen)을 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 MSC로부터 총 RNA를 추출하였다. 각 실험마다 동량(1 μg)의 RNA를 amfiRivert cDNA 합성 프리믹스(GenDEPOT)를 사용하여 역전사하였다. 이어, 2 μL의 cDNA를 템플릿으로 사용하여 amfiRivert 1-Step RT-PCR 키트(GenDEPOT) 상에서 RT- PCR 분석을 수행하였다. PCR은 10 pmol의 인체 Gal-1 프라이머(Forward 5'- GCAACCTGAATCTCAAACC -3', Reverse 5'- GGCCACACATTTGATCTTG -3')를 사용하여 수행하였다. 먼저 95 ℃에서 2분 동안 변성한 후, 변성(1분, 95 ℃), 어닐링(1분, 49.8 ℃), 연장(1분, 72 ℃), 최종연장(5분, 72 ℃) 단계로 구성되는 사이클을 30회 실시하여 PCR을 수행하였다. 얻어진 PCR 생성물을 2% 아가로스 겔(Intron) 상에서 전기영동하여 분리하고 에티디움 브로마이드(Sigma)로 염색한 후 UV 조사 하에 관찰하였다(Bio Imaging Systems). Image Gauge v.4.0 소프트웨어(Fujifilm Science Laboratory)를 이용하여 밀도를 측정하였다.

동물실험

모든 동물실험 절차는 연세대학교의료원 동물실험윤리위원회(IACUC)의 실험동물의 관리 및 사용에 관한 규정을 따랐다. 수컷 C57BL/6 마우스(Orient Bio)를 기후가 통제되는 실험실에서 12시간의 명암 사이클로 1주간 적응시켰다. 6주령의 마우스에게 α-시누클레인(5 μg/마리)를 단독으로 또는 다이나소어(80 μM/마리)와 함께 신피질 내로 투여하였다. 약물 투여는 이전에 보고한 방법에 약간의 변경을 가하여 실시하였다. 마우스를 이소플루란(Baxter)으로 마취한 후, 10 μL Hamilton 마이크로주사기(Hamilton)에 장착된 스테인리스강 주사바늘(26-gauge)을 사용하여 양쪽으로 천천히 주입하였다(브레그마 후방 0.4 mm, 중앙선에서 측면으로 -1.3 mm, 뇌 표면 쪽으로 -0.6 mm). 주사바늘을 10분 동안 정위치에 위치시킨 후 천천히 뽑았다. 마우스는 랜덤하게 다음과 같이 세 군으로 나누었다(각 군의 n = 5): (1) 대조군; (2) α-시누클레인군; (3) α-시누클레인+MSC군. MSC군의 마우스는 꼬리정맥 내로 MSC를 정위주사에 의해 동시 투여하였다(1 × 10⁶ cells /200 μL). 3일 후에 모든 마우스를 희생시켰다. 마우스를 랜덤하게 다음과 같이 네 개의 군으로 나누었다(각 군의 n = 5): (1) 제어군; (2) 신선한 배지군; (3) MSC-CM군; (4) Gal-1군. 1일 후에 각 군의 마우스에게 약물을 투여하였고 4일 후에 모든 마우스를 희생시켰다. 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘(MPTP) 유도 PD의 동물모델을 만들기 위하여, 마우스에 MPTP(복강내 투여(I.P.), 30 mg/kg, 5일간 매일, 각 군의 n = 5)를 투여하였다. 최종 MPTP 주사 후 3일째에, 꼬리정맥 내로 MSC를 주사하였다(1 × 10⁶ cells /200 μL).

뇌 샘플 제조

면역화학 분석을 위하여, 모든 마우스를 클로랄 하이드레이트 깊게 마취시킨 후(I.P., 0.4 g/kg; Fluka) 0.1 M 인산염완충액(pH 7.4)에 용해시킨 4% 파라포름알데히드(Sigma)로 관류하였다. 뇌를 파라핀에 포매한 후 4 μm 두께의 관상 박편으로 제작하여 슬라이드 상에 위치시켰다.

면역세포화학 및 면역조직화학 분석

SH-SY5Y 세포와 파라핀을 제거한 조직박편 상의 뇌 박편을 PBS로 2회 세척한 후 0.2% Triton X-100(Sigma) 내에서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 30분 동안 0.5% 우혈청 알부민(BSA; Sigma)으로 블로킹한 후, 0.5 % BSA로 3회 헹구고 4 ℃에서 특이적 1차항체와 함께 밤새 인큐베이션하였다. 사용한 1차항체는 마우스 항-α-시누클레인(Millipore), 토끼 항-EEA1(Abcam), 마우스 항-클라트린(Sigma), 마우스 항-NuMA(Millipore), 그리고 토끼 항-Gal-1(Abcam)이었다. 세포 표면 NR1 및 NR2A 서브유닛의 검출을 위해, 세포와 조직을 Triton X-100 처리 없이 마우스 항-NR1(Abcam) 및 토끼 항-NR2A(Millipore)와 함께 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 면역형광 표지를 위하여, 세포를 토끼 항- IgG Alexa Fluor-555(Invitrogen), 마우스 항-IgG Cy-3(Chemicon) 및 토끼 항-IgG FITC(AP132F, 녹색; Chemicon)와 함께 인큐베이션하였다. 세포핵은 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI; Invitrogen)으로 대조염색하였다. 면역염색된 세포를 명시야 현미경법으로 분석하고 Zeiss LSM 700 공초점 이미지시스템(Zeiss)을 이용하여 관찰하였다. 이중염색된 샘플에서 항체의 위치를 분석하기 위하여, 동일한 조직박편을 이용하여 면역형광 이미지를 얻은 후 Zeiss ZEN 소프트웨어(Zeiss)를 이용하여 합성하였다.

웨스턴블롯 분석

Qproteome 세포구획키트(QIAGEN)를 사용하여 제조업체의 지시에 따라 막단백질을 추출하였다. 세포와 뇌조직을 얼음물로 식힌 RIPA 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM 염화나트륨, 1.0% Igepal CA-630, 0.5% 소듐 데옥시콜레이트, 0.1% 도데실황산나트륨)(Sigma)과 프로테아제 억제제 칵테일(Sigma)에 용해하였다. 용해물을 4 ℃에서 20분 동안 원심분리한 후(14 000 × g) 현탁액을 새 시험관으로 옮겼다. 얼음 상에서 15분 동안 추출한 다음 세포추출액을 14000 × g에서 10분 동안 원심분리한 후 현탁액(수용성 분획)을 얻었다. 간략하게 설명하면, SDS 겔 전기영동에 의해 단백질을 분리한 후 소수성 PVDF 막(GE Healthcare)으로 옮겼다. 이어, 막을 탈지유(BD)로 블로킹하고 다음과 같은 1차항체로 프로빙하였다: 토끼 항-α-시누클레인 (Millipore), 토끼 항- α-시누클레인(phospho S129, Abcam), 토끼 항-EEA1(Abcam), 마우스 항-클라트린(Sigma), 마우스 항-NR1(Abcam), 토끼 항-NR2A(Millipore), 토끼 항-Gal-1(Abcam), 토끼 항-카스파제-3(Cell Signaling), 마우스 항-액틴(Santa Cruz). 2차항체로서 1:10000으로 희석한 양고추냉이 과산화효소로 컨주게이션한 염소 항-토끼 항체(GenDEPOT)와 항-마우스 항체(GenDEPOT)를 사용하였다. 항원-항체 복합체를 화학발광 시스템(Santa Cruz)을 사용하여 가시화한 후 X-선 필름(Fuji Film)에 노출시켰다. 반정량적 분석을 위하여, 면역블롯 밴드의 밀도를 컴퓨터 이미지로부터 측정하였다.

TUNEL 분석

사멸한 세포 내의 단편화된 DNA를 Fluorescein 12-dUTP를 가하여 검출하였다(인시튜 세포사멸 검출키트, Roche). 슬라이드를 37 ℃의 암실조건에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, PBS로 3회 세척하고 DAPI로 염색하였다. 관찰된 적색형광을 DNA 단편에 매칭하였다. 세포사멸의 정량적 측정을 위하여, 총 세포 수 중에서 사멸한 세포의 수를 퍼센트로 구하였다. 다음의 식을 이용하였다:

TUNEL 표지지수(LI) = TUNEL 양성 세포의 수 × 100 / 총 핵 수

각 지수에 대하여 샘플 당 랜덤하게 8개의 200× 필드를 선택하였고 각 샘플 당 대략 1000개의 세포를 카운트하였다.

α- 시누클레인의 측정

α-시누클레인의 양은 샌드위치 ELISA 키트(AnaSpec)를 사용하여 측정하였다. 희석된 각 샘플 10 μL와 키트에 포함된 표준용액을 α-시누클레인을 특이적으로 인식하는 항체가 코팅된 마이크로리터 플레이트에 가하였다. 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하고 세척한 후, 효소에 간접적으로 연결된 검출항체를 가하였다. 인큐베이션 및 세척한 후, 세척된 용액 350 μL를 각 웰에 가하고 습기가 보이지 않을 때까지 플레이트를 가열하여 건조시켰다. 이어, 기질을 가하고 37 ℃에서 15분 동안 인큐베이션한 다음, 정지용액을 가하여 반응을 정지시켰다. 파장 450 nm로 설정된 자동 ELISA 마이크로플레이트리더(BIOTECH)를 사용하여 색반응을 측정하였다. 소프트웨어(Bio Rad)를 이용하여 표준곡선을 작성하고 샘플의 농도를 계산하였다.

통계분석

각 군의 평균을 Mann-Whitney U-검정과 Kruskal-Wallis 분석을 이용하여 비교하였다. P 값이 0.05 미만인 경우를 통계적으로 유의한 것으로 보았다. 통계분석은 상용화된 소프트웨어(버전 12.0; SPSS Inc.)를 이용하여 수행하였다.

결과

MSC 의 α- 시누클레인 내재화 및 세포간 전달 억제 효과

MSC 및 신경세포를 이용하여 α-시누클레인 내재화 및 세포간 전달 억제효과를 측정하였다. SH-SY5Y 세포를 Alexa 488로 표지된 α-시누클레인 원섬유와 함께 인큐베이션하자, 세포질 내에서 반점이 있는 소낭 형태의 α-시누클레인이 관찰되었다. 이를 MSC와 함께 배양하였더니 도 1a에 나타낸 바와 같이, 표지된 α-시누클레인 원섬유의 내재화가 크게 감소하였다. 그러나 신경세포와 함께 배양한 경우에는 α-시누클레인의 내재화에 영향을 미치지 않았다.

도너-억셉터 공배양법을 이용하여 실험한 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이 α-시누클레인 처리군에서 도너 세포로부터 이와 연결된 억셉터 세포로의 α-시누클레인 전달이 확인되었다. 이에 비해, MSC와 함께 배양한 군에서는 도너 세포로부터 억셉터 세포로의 α-시누클레인 전달이 적게 관찰되었다. 즉, MSC와 함께 배양한 경우, 세포질 내에 내재화된 α-시누클레인의 농도가 α-시누클레인 처리군에 비해 크게 감소하며 이와 함께 배양배지 내의 세포외 α-시누클레인 농도가 증가하였으며, 이를 도 1c에 나타내었다.

SH-SY5Y에 의한 α-시누클레인의 리소좀 내 분해와 MSC에 의한 α-시누클레인의 내재화를 배제하기 위하여, 리소좀 억제제(바필로마이신)와 엔도시토시스 차단제(다이나소어)를 SH-SY5Y 및 MSC 공배양액에 각각 가하였다. 도 1c 및 1d에 나타낸 바와 같이, 이들 약물은 α-시누클레인의 내재화에 영향을 주지 않았으며 세포외 α-시누클레인의 농도를 변화시키지 않았으므로 MSC로부터 분비되는 수용성 인자가 α-시누클레인의 내재화를 조절하는 것으로 생각되었다. α-시누클레인 원섬유를 24시간 및 48시간 동안 인큐베이션하자 SH-SY5Y의 세포생존능이 감소하였다. 그러나 도 1e에 나타낸 바와 같이, MSC와 함께 배양하자 α-시누클레인에 의해 감소된 세포생존능이 회복되었다.

MSC 의 세포 표면상의 NMDA 수용체 조절을 통한 세포외 α- 시누클레인 원섬 유의 CME 억제 확인

α-시누클레인의 내재화와 관련된 CME의 역할을 확인하기 위하여 클라트린의 발현과 면역반응성을 조사하였다.

SH-SY5Y 세포 내에서 α-시누클레인 원섬유를 인큐베이션한 경우, 클라트린의 발현이 대조군에 비해 상당히 증가하였다. 그러나, MSC와 함께 배양하거나 비경쟁적 NMDA 수용체 길항제인 MK-801로 처리한 경우에는 도 2a에 나타낸 바와 같이, α-시누클레인에 의한 클라트린 발현 증가가 상당히 약화되었다. 이를 공초점현미경으로 분석한 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이, α-시누클레인 처리된 신경세포를 MSC와 함께 배양하거나 MK-801로 처리한 경우 클라트린의 면역반응성이 크게 감소하였음을 확인하였다.

한편, α-시누클레인으로 처리한 신경세포는 대조군에 비해 초기 엔도좀 항원 1(EEA1)의 발현이 상당히 증가하였다. 그러나, MSC와 함께 배양하거나 다이나소어로 처리한 경우에는 도 2c에 나타낸 바와 같이, EEA1의 발현이 상당히 감소하였으며 엔도시토시스 억제제로 처리한 경우와 유사하였다. 이를 공초점 현미경으로 분석한 결과, 도 2d에 나타낸 바와 같이,α-시누클레인으로 처리한 신경세포를 MSC와 함께 배양하거나 다이나소어로 처리한 경우 EEA1의 면역반응성이 크게 감소하였음을 확인하였다.

다음으로, MSC가 α-시누클레인과 NMDA 수용체의 상호작용을 저해하는지를 세포 표면막 추출액을 사용하여 확인하였다. SH-SY5Y 세포를 α-시누클레인으로 처리하자 세포 표면에서 NR1 및 NR2A 서브유닛의 발현이 대조군에 비해 상당히 감소하였다. 그러나, MSC와 함께 배양하거나 MK-801로 처리한 경우, 도 2e 및 2g에 나타낸 바와 같이, α-시누클레인에 의해 감소하였던 NR1 및 NR2A 서브유닛의 발현이 상당히 증가하였다.

또한, 면역세포화학 분석 결과, 도 2f 및 2h에 나타낸 바와 같이, α-시누클레인으로 처리한 경우 세포 표면의 NR1 및 NR2A 서브유닛의 면역반응성이 증가한 반면, MSC 또는 MK801로 처리한 경우 α-시누클레인과 세포 표면의 NR1 및 NR2A 서브유닛의 면역반응성이 감소하는 것으로 나타났다.

MSC 유래 인자의 확인 및 특성분석

MSC로부터 분비되는 단백질의 확인을 위하여, 신선한 배지, SH-SY5Y-CM, MSC-CM의 세 샘플을 사용하여 2차원 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(2D-PAGE) 분석과 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화-비행시간 질량분광(MALDI-TOF/MS) 단백질분석을 수행하였으며, 이를 도 3에 나타내었다.

도 3a에 나타낸 바와 같이, 신선한 배지는 6종의 폴리펩티드를, SH-SY5Y-CM은 87종과 96종의 폴리펩티드를, MSC-CM은 189종과 157종의 폴리펩티드를 포함하였다. 특히, MSC-CM에서는 신선한 배지 또는 SH-SY5Y-CM에 비해 2배 이상의 확연한 발현도 차이를 보이는 스팟이 47개 검출되었다. 도 3b에 나타낸 바와 같이, 노란색 상자로 표시한 영역을 확대한 결과, 확대된 이미지에서 Gal-1 등의 단백질을 검출하였으며, 이를 노란색 원으로 표시하였다. 벤다이어그램으로부터 MSC-CM이 신선한 배지와 SH-SY5Y-CM에는 없는, Gal-1을 포함한 32개의 스팟을 포함함을 알 수 있다.

MSC-CM에서만 발현된 단백질들 중에서 Gal-1을 α-시누클레인 조절의 후보물질로 선정하였다. 또한, Gal-1이 MPTP 유도 동물모델에 정맥주사된 MSC 내에서 발현됨을, 인간 특이적 핵 유사분열 구조단백질(NuMA)에 대하여 양성을 보이는 세포들이 Gal-1에 의해 면역염색되었고(도 4), MSC로 처리한 동물 내에서 이 단백질의 발현이 상당히 증가한 것으로부터 확인하였다(도 5).

다음으로, Gal-1이 α-시누클레인의 세포간 전달을 조절할 수 있는지를 조사하였으며, 이를 도 6a 내지 6c에 나타내었다.

α-시누클레인으로 처리한 신경세포를 Gal-1으로 처리하자 표지된 α-시누클레인의 내재화가 감소하였고, 이와 함께 클라트린과 EEA1의 발현은 감소하고 NR1 및 NR2A의 발현은 증가(도 6a, 6b)하였으며, 뉴런의 생존률도 증가(도 6c)하였다.

한편, MSC를 Gal-1 siRNA로 처리하자(도 6d) Gal-1 siRNA가 MSC의 NMDA 수용체에 의한 α-시누클레인의 CME 억제효과를 상쇄하였다(도 6a,b). 또한, Gal-1 siRNA로 처리한 MSC-CM 존재 하에서는 SH-SY5Y의 세포생존능이 현저하게 감소하였다(도 6c).

Gal -1에 의한 α- 시누클레인의 세포간 전달 감소 효과 확인

Alexa Fluor 488로 표지한 α-시누클레인 원섬유를 마우스의 피질 내로 정위접종하였다.

세포질 내에 내재화된 α-시누클레인이 형광색 반점 형태로 관찰되었는데, α-시누클레인은 접종부위 근처의 피질영역에 밀집되어 있었으나, 같은 쪽의 피질에서부터 반대쪽 반구에 이르기까지 광범위하게 관찰되었다. 그러나, MSC로 처리하자 같은 쪽 및 반대쪽 반구 모두에서 내재화된 α-시누클레인의 밀도가 크게 감소하였다(도 8a).

ELISA 분석 결과, MSC로 처리한 경우 α-시누클레인으로만 처리한 마우스에 비해 같은 쪽 및 반대쪽 반구 모두에서 세포질 내 α-시누클레인의 발현이 상당히 감소한 것으로 확인되었다(도 8b).

또한, 도 8c를 참고로 하면, α-시누클레인을 접종한 뇌를 MSC로 처리한 경우 인산화된 α-시누클레인의 발현이 상당히 감소하였는데, 이로부터 MSC가 외래성 α-시누클레인에 의한 α-시누클레인 병증의 유도를 조절함을 알 수 있다. MSC-CM 또는 Gal-1으로 처리한 경우에도 이와 비슷하게 α-시누클레인 전달의 억제가 관찰되었다.

다음으로, MSC의 투여가 세포 표면 NMDA 수용체의 조절을 통한 세포외 α-시누클레인 원섬유의 CME를 조절하는지를 조사하였다. α-시누클레인 원섬유를 접종하자 같은 쪽 및 반대쪽 반구 모두에서 클라트린의 발현이 증가하였으나, MSC로 처리하자 이 단백질의 발현이 상당히 감소하였다(도 8d).

면역조직화학 분석 결과, MSC로 처리한 경우 같은 쪽 및 반대쪽 반구 모두에서 표지된 α-시누클레인과 클라트린의 면역반응성이 감소한 것으로 확인되었다(도 9).

α-시누클레인을 접종한 마우스에 MSC를 투여한 경우, CME 억제로 인해 같은 쪽 및 반대쪽 반구 모두에서 EEA1의 발현과(도 8e) 표지된 α-시누클레인과 클라트린의 면역반응성이 상당히 감소하였다(도 9). 또한, MSC를 투여한 경우, α-시누클레인을 접종한 마우스의 같은 쪽 및 반대쪽 반구 모두에서 α-시누클레인에 의해 감소하였던 세포 표면 NR1 및 NR2A 서브유닛의 발현이 상당히 증가하였고(도 8f 및 8g) 세포 표면 NR1 및 NR2A 서브유닛의 면역반응성이 감소하였다(도 9). 이와 유사하게, MSC-CM 또는 Gal-1을 처리한 경우 세포 표면 NMDA 수용체의 조절을 통한 세포외 α-시누클레인 원섬유의 CME가 억제되었다. 그러나, Gal-1을 처리한 경우에는 세포 표면 NR2A 서브유닛과의 상호작용이 크지 않았다(도 8d 내지 8g 및 도 9). 결과적으로, α-시누클레인을 접종한 경우 같은 쪽 반구에서 분리된 카스파제-3의 발현과 말단 디오시뉴클레오티틸 트랜스퍼라제 매개 dUTP 닉 말단 라벨링(TUNEL)의 면역반응성이 대조군에 비해 크게 증가하였다. 그러나, MSC 또는 Gal-1으로 처리한 경우 분리된 카스파제-3의 발현과 TUNEL 양성 뉴런의 수가 확연하게 감소하였다(도 8h 및 8i).

상기와 같은 결과들은 α-시누클레인 모델에서 MSC가 세포외 α-시누클레인 응집체를 수용성 형태로 분리하며, 세포간 전달의 조절에 의한 α-시누클레인의 전달을 억제하여 뉴런의 생존을 촉진하는 효과가 있음을 입증한다. 또한, MSC 유래의 수용성 인자인 Gal-1이 세포외 α-시누클레인의 전달 조절에 있어 중요한 역할을 하고 있음을 입증하였다.

구체적으로 MSC가 α-시누클레인과 NMDA 수용체 사이의 상호작용 조절을 통해 세포외 α-시누클레인 원섬유의 CME를 억제할 수 있음을 확인하였고, α-시누클레인을 접종한 동물모델을 이용한 실험에서, MSC로 처리한 경우 같은쪽 및 반대쪽 반구에서 모두 내재화된 α-시누클레인과 인산화된 형태의 병원성 α-시누클레인이 밀도가 크게 감소한 것을 확인하였다. 또한, α-시누클레인을 접종한 마우스에 MSC를 투여한 경우, 클라트린의 발현이 상당량 감소하였고, EEA1의 발현 및 α-시누클레인과 NMDA 수용체인 NR1 및 NR2A 사이의 상호작용도 감소하여, 결과적으로 뉴런의 생존을 촉진하는 효과가 있었다.

특히, MSC 유래 인자 중 Gal-1을 처리하자 세포질에 내재화된 α-시누클레인의 농도가 상당히 감소하였으며, 이와 함께 클라트린과 EEA1의 발현이 감소하고 NR1의 발현이 증가한 것을 확인하였다. 또한, 생체 내 실험 데이터로부터 Gal-1이 정맥주사된 MSC 내에서 발현됨이 확인되었으며, Gal-1을 처리하자 α-시누클레인과 세포 표면 NMDA 수용체 사이의 상호작용 억제에 의해 세포외 α-시누클레인 원섬유의 CME가 차단되었다. 따라서, 상기와 같은 결과를 통해 MSC 유래 인자인 Gal-1이 CME 조절을 통해 세포외 α-시누클레인의 병원성 미세환경을 조절할 수 있음을 입증하였다.

Claims

갈렉틴-1을 유효성분으로 포함하여 세포외 α-시누클레인의 세포간 전달을 억제하는 α-시누클레인의 클라트린 매개 엔도시토시스 저해용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 갈렉틴-1은 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cells)에서 유래된 것을 특징으로 하는 α-시누클레인의 클라트린 매개 엔도시토시스 저해용 조성물.
갈렉틴-1을 유효성분으로 포함하는 파킨슨 질환 치료 또는 예방용 조성물.
제3항에 있어서,
상기 갈렉틴-1은 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cells)에서 유래된 것을 특징으로 하는 조성물.
제3항에 있어서,
상기 갈렉틴-1은 세포 표면의 N-메틸-D-아스파테이트(NMDA) 수용체에 작용하여 세포외 α-시누클레인의 클라트린 매개 엔도시토시스를 억제함으로써 α-시누클레인의 세포간 전달 또는 응집체 형성을 방해하여 세포 생존능을 회복시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
갈렉틴-1을 이용하여 α-시누클레인 응집체의 형성을 억제하는 방법.
제6항에 있어서,
상기 갈렉틴-1은 중간엽 줄기세포에서 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서,
상기 갈렉틴-1은 세포 표면의 N-메틸-D-아스파테이트(NMDA) 수용체에 작용하여 세포외 α-시누클레인의 클라트린 매개 엔토시토시스를 억제함으로써 α-시누클레인의 내재화를 방지하는 것을 특징으로 하는 방법.