KR20130116552A - 줄기세포-유래 미세소포체를 유효성분으로 포함하는 신경질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 줄기세포-유래 미세소포체를 유효성분으로 포함하는 신경질환(neural disease) 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 조성물은 윤리적 문제 및 면역원성의 문제가 없는 세포치료제를 제공로써, 줄기세포를 직접 이용하는 종래의 방법과 비교하여 보다 안전하고 효과적인 치료 효과를 제공한다.

Description

줄기세포-유래 미세소포체를 유효성분으로 포함하는 신경질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물{Pharmaceutical Compositions For Preventing or Treating Neuronal Diseases Comprising Stem Cell-derived Microvesicles as Active Ingredient}

본 발명은 줄기세포-유래 미세소포체를 유효성분으로 포함하는 신경질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

간엽줄기세포(Mesenchymal Stem Cells; MSCs)는 자기-재생 및 중배엽 리니지(lineage) 및 내배엽 및 외배엽과 같은 다른 배아 리니지로 분화할 수 있는 능력을 갖는 줄기세포의 비균질 파퓰레이션을 갖는다.^1-4 또한, 간엽줄기세포는 면역조절기능 또는 항염증 및 영양(trophic)을 위한 효과를 갖는다.^5,6 배아줄기세포(Embryonic stem cells; ESCs), 유도만능줄기세포(induced Pluripotent Stem Cells; iPSCs) 및 다른 조직 특이적인 줄기세포와 비교하여, 간엽줄기세포는 우수한 이용가능성, 낮은 윤리적 문제 및 면역원성을 갖기 때문에, 재생의학의 임상적용을 위한 이상적인 후보이다. 간엽줄기세포는 뇌, 간, 폐, 태아혈, 제대혈, 신장, 지방 조직 및 태반으로부터 분리할 수 있다.⁷ 이러한 전신에 이르는 넓은 분포는 간엽줄기세포가 조직 항상성을 유지하는데 중요한 역할을 하는 것을 말한다.⁸ 수많은 연구는 간엽줄기세포의 골, 연골, 힘줄 및 지방과 같은 간엽 리니지 세포로의 생체 외 분화능을 보여준다.² 이는 골 및 연골 재생의 전임상 및 임상 연구에 치료제 가능성을 보여준다.⁹ 또한, 간엽줄기세포-기반 세포 치료제의 임상 연구는 알레르기성 골수이식 또는 조혈모세포 이식, 심근경식, 전신홍반성 낭창, 간경화증, 당뇨, 급성 신장손상 및 다양한 퇴행성 신경질환을 비롯해 대숙주성이식편명(Graft-versus-host disease; GvHD)를 포함하는 인간 질병의 넓은 스펙트럼에 가능한 치료제를 보여준다.^10-16

그러나, 간엽줄기세포의 재생능에 대한 근본적인 기작에 대해서는 밝혀져 있지 않다. 또한, 타겟 조직 외의 다른 결합 조직 및 장기과 같은 간엽줄기세포 이식의 부재에서 관찰되는 치료효과로 인해 간엽줄기세포-기반 세포 치료제의 효과도 의심스러운 실정이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 신경질환의 예방 또는 치료를 위한 세포치료제로, 윤리적 문제가 없고 면역원성을 갖지 않는 세포치료제를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 줄기세포 유래의 미세소포체를 이용하는 경우, 종래의 세포치료제에 대한 윤리적 문제 및 면역원성을 나타내지 않으면서 신경질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있음을 규명함으로써 본 발명은 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 신경질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 줄기세포-유래 미세소포체를 유효성분으로 포함하는 신경질환(neural disease) 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 신경질환의 예방 또는 치료를 위한 세포치료제로, 윤리적 문제가 없고 면역원성을 갖지 않는 세포치료제를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 줄기세포 유래의 미세소포체를 이용하는 경우, 종래의 세포치료제에 대한 윤리적 문제 및 면역원성을 나타내지 않으면서 신경질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있음을 규명하였다.

본 명세서에서, 용어“줄기세포-유래 미세소포체”는 줄기세포로부터 유래된 세포막 입자이다. 상기 미세소포체는 당업계에서 엑소솜(exosome), 순환 미세소포체 또는 미세소낭과 동일한 의미를 갖으며, 세포로부터 탈락된 50 ㎚ 내지 1000 ㎚의 원형질막을 갖는 프래그먼트를 말한다. 미세소포체는 세포 간의 mRNA, miRNA 및 단백질을 운송을 매개하고 세포 내의 상호작용에 중요한 역할을 한다. 미세소포체는 유래한 세포, 세포의 수, 세포의 크기 및 항원의 구성에 따라 비균질한 파퓰레이션을 나타낸다. 상기 “줄기세포”는 증식(자기-재생) 및 분화(가소성)할 수 있는 능력을 갖는 어떠한 미분화 세포 또는 부분적 미분화 세포를 포함한다. 이러한 줄기세포는 발생 과정 중 종점(endpoint) 단계의 세포인 특정 세포 리니지(lineage)의 성숙세포를 대체한다. 또한, 줄기세포는 무제한 자기-재생능 및 전분화능 가소성을 갖는 줄기세포 및, 다분화능 또는 단분화능 가소성을 갖는 전구세포를 포함한다.

바람직하게는, 상기 줄기세포는 간엽줄기세포이며, 상기 간엽줄기세포는 뇌, 간, 폐, 제대혈, 태아혈, 신장, 지방 조직, 태반 또는 골수로부터 유래한 간엽줄기세포이다.

바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 줄기세포-유래 미세소포체는 간엽줄기세포-유래 미세소포체이고, 보다 바람직하게는, 인간 골수로부터 분리한 간엽줄기세포-유래 미세소포체이다.

본 발명의 주요한 특징 중 하나는 줄기세포-유래 미세소포체의 프로테옴을 분석하여 신경질환의 예방 또는 치료 효과를 조사한 것이다. 본 발명자들은 줄기세포-유래 미세소포체의 LC-MS/MS(액체크로마토그래피-질량분석기, Liquid Chromatography-Mass Spectrometry) 분석을 통해 730개의 미세소포체 단백질을 규명하였다.

본 발명의 분석 결과에 따르면, 바람직하게는, 상기 미세소포체는 (a) CD13, CD29, CD44, CD73 및 CD105 표면항원에 대하여 양성의 면역학적 특성; 및 (b) CD10 및 CD90에 대하여 가변(variable)의 면역학적 특성을 갖는다.

바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 줄기세포-유래 미세소포체의 프로테옴은 줄기세포의 자기-재생 및 분화와 관련된 신호전달 경로의 분자를 포함한다. 간단히 요약하면, 첫째, 미세소포체 프로테옴은 KEGG 경로 데이터베이스 및 GOBP 신호전달경로에 근거한 간엽줄기세포의 자기-재생, 성장인자 수용체 및 Wnt 신호전달 경로에 관여하는 2가지 신호전달 경로와 관련된 13 단백질을 포함한다. 둘째, 간엽줄기세포의 분화, TGFβ, MAPK, PPAR 및 BMP 신호전달 경로에 관여하는 5 신호전달 경로와 관련된 38 단백질을 포함한다. Wnt 신호전달 경로는 간엽줄기세포의 자기-재생 및 분화에 관련되는 것으로 보고된다. 이러한 결과는 간엽줄기세포-유래 미세소포체가 간엽줄기세포의 특징을 갖으며 이러한 미세소포체는 신호전달 경로에 관여하는 단백질을 통해 자기-재생 및 분화에 영향을 줄 수 있음을 말해준다.

바람직하게는, 상기 미세소포체는 PDGFRB(β-type Platelet-Derived Growth Factor Receptor), EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor) 및 PLAUR(Plasminogen Activator, Urokinase Receptor)로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 간엽줄기세포 자기-재생관련 표면 수용체를 갖는다.

상기 PEGFRB는 PDGF(Platelet-Derived Growth Factor) 패밀리에 대한 세포 표면 티로신 키나제 수용체를 코딩한다. 이러한 성장인자는 간엽성 기원의 세포에 대한 미토겐이다. 상기 EGFR은 세포 외 단백질 리간드의 EGF(Epidermal Growth Factor) 패밀리에 대한 세포-표면 수용체이다. EGFR은 EGFR(ErbB-1), HER2/c-neu(ErbB-2), Her 3(ErbB-3) 및 Her 4(ErbB-4)와 같은 ErbB 패밀리 중 하나이다. 상기 PLAUR은 세포막에 묶인 다중도메인 당단백질이다.

바람직하게는, 상기 미세소포체는 RRAS(Ras-related protein R-Ras)/NRAS(Neuroblastoma RAS viral oncogene homolog), MAPK1(Mitogen-activated Protein Kinase 1), GNA13(Guanine Nucleotide-binding protein subunit Alpha-13)/GNG12(Guanine Nucleotide-binding protein G(I)/G(S)/G(O) subunit Gamma-12), CDC42(Cell Division Control protein 42 homolog) 및 VAV2(Guanine nucleotide exchange factor VAV2)로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 신호전달 분자를 갖는다.

상기 RRAS/NARS, MAPK1 및 VAV2는 RAS-MAPK(Ras/Mitogen-Activated Protein Kinase) 신호전달 경로에 관여하고, GNA13은 RHO(Rhodopsin) 신호전달 경로에 관여하며, GNG12 및 CDC42는 CDC42 신호전달 경로에 관여한다.

바람직하게는, 상기 미세소포체는 FN1(Fibronectin), EZR(Ezrin), IQGAP1(IQ motif containing GTPase Activating Protein 1), CD47, 인테그린 및 LGALS1(Galectin-1)/LGALS3(Galectin-3)으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 세포부착 분자를 갖는다.

상기 FN1은 인테그린이라 불리는 막-스패닝 수용체 단백질에 결합하는 세포외 기질의 고분자 당단백질이다. FN1은 콜라겐, 프브린 및 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(예컨대, 신데칸)과 같은 세포외 기질 요소와 결합한다. FN1은 이황화결합으로 연결된 동일 단량체로 이뤄진 이량체로 구성된다. 상기 EZR은 사이토빌린 또는 빌린-2로 알려진 인간 EZR 유전자를 코딩하는 단백질이다. EZR 유전자에 의해 코딩되는 세포질 주변막 단백질은 미세 융모에서 단백질-티로신 키나제 기질로 기능한다. ERM 단백질 패밀리의 한 종류로, EZR 단백질은 원형질막과 액틴 세포골격 간을 중개하는 역할을 한다. 상기 IQGAP1는 IQGAP1 유전자에 의해 코딩되고 편재하여 발현되는 단백질이다. IQGAP1은 액틴 세소골격의 조직, 전사 및 세포 주기를 조절하는 세포 부착에 이르는 다양한 세포 과정을 조절하는 스카프폴드 단백질이다. 상기 CD47은 세포외 기질에 세포부착 시, 세포 내의 칼슘 농도의 증가와 관련된 막 단백질이다. CD47은 또한 트롬보스폰딘의 C-말단 세포 결합도메인에 대한 수용체이고 막 수송 및 신호 변환에 중요한 역할을 한다. 인테그린은 세포와 그의 주변조직, 다른 세포 또는 세포외 기질 간의 부착을 중개하는 수용체이다. 상기 인테그린은 세포 신호전달 및 신호전달에 의한 세포의 모양, 운동성 및 세포 주기를 조절하는 역할을 한다. 상기 LGALS1 및 LGALS3은 베타-갈락토사이드-결합 단백질의 하나로 세포-세포 및 세포-기질 상호작용을 중개한다. LGALS1은 세포 증식을 조절하는 오토크라인(autocrine) 음성 성장인자로 작용한다.

바람직하게는, 상기 미세소포체는 CD9, CD63, CD81, CD109, CD151, CD248 및 CD276으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 간엽줄기세포-관련 항원을 갖는다.

상기 CD9, CD63, CD81 및 CD151은 테트라스패닌(tetraspanin) 패밀리로 알려진 막통과 4 수퍼패밀리 중 하나이다. 이러한 패밀리의 구성원은 소수성 도메인을 갖는 세포-표면 단백질이다. 상기 세포-표면 단백질은 세포 발생, 활성화, 성장 및 이동과 관련된 신호를 전달한다. 상기 CD109는 CD34+ 급성 골수성 백혈구 세포주, T-세포주, 활성형 T 림프아세포, 내피 세포 및 활성형 혈소판에 의해 발현되는 GPI-연결 세포 표면 항원이다. 상기 CD248은 XIV군의 하나로, 세포-세포 부착 과정 및 숙주 방어에 중요한 역할을 하는 C-형 렉틴 막통과 수용체의 하나이다. XIV군은 CD93 및 트롬보모듈린의 2 종류의 다른 구성원으로 구성된다. CD248은 배아, 자궁 및 종양 발생 및 성장에 있어 혈관생성과 관련된다.

본 발명의 줄기세포-유래 미세소포체를 유효성분으로 포함하는 조성물은 신경질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물이다.

바람직하게는, 상기 신경질환은 신경 손상(neural injury), 신경 퇴행성 질환, 및 허혈 또는 재관류에 의한 질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 신경질환이고, 보다 바람직하게는, 상기 신경 손상은 중추신경계 손상이며, 상기 신경 퇴행성 질환은, 알쯔하이머병, 헌팅톤 질병, 파킨슨씨 질병 및 근위축성 측삭 경화증으로 구성된 군으로부터 선택되는 신경 퇴행성 질환이고, 상기 허혈 또는 재관류에 의한 질환은 허혈성 뇌졸중이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 뇌졸중을 유발한 동물모델에서 간엽줄기세포-유래 미세소포체를 주입하는 경우, 뇌의 기능이 회복되고 경색 영역에 감소하는 것을 확인하였다.

본 발명의 조성물은 (a) 상술한 줄기세포-유래 미세소포체의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다.

본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 줄기세포-유래 미세소포체의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 예를 들어 피하 주입, 근육 주입, 경피 투여, 관절강내 주사, 척수강내 주사, 정맥주사, 뇌내 주사 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 뇌내 주사로 투여한다.

바람직하게는, 본 발명의 약제학적 조성물은 단회투여 또는 반복투여로 주입될 수 있으며, 보다 바람직하게는 반복투여이다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 1일 당 0.001-1000 ㎎이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 줄기세포-유래 미세소포체를 유효성분으로 포함하는 신경질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

(b) 본 발명의 조성물은 윤리적 문제 및 면역원성의 문제가 없는 세포치료제를 제공한다.

(c) 본 발명의 조성물은 줄기세포를 직접 이용하는 종래의 방법과 대량 생산 및 제조에 이써서 비용-효율적인 효과를 제공한다.

도 1은 인간 골수 간엽줄기세포-유래 미세소포체의 정제 및 특성 분석 결과를 보여준다. 도 1a는 간엽줄기세포의 방추형 형태를 보여준다(×100). 도 1b는 인간 골수-유래 간엽줄기세포의 면역아형검사로 전형적인 간엽줄기세포의 형태를 보여준다. 항-CD29, 항-CD44, 항-CD73, 항-CD90, 항-CD105, 항-CD31, 항-CD34, 항-CD45 및 CD106로 염색한 간엽줄기세포의 히스토그램을 아이소타입 대조군과 겹치게 보여준다. 도 1c는 간엽줄기세포의 다계열(multilineage) 분화를 보여준다. 지방세포성 분화는 오일 레드 O 로 지질 액포를 염색하여 분석하였다(맨 위, ×40 확대율); 연골세포성 분화는 사프라닌 O를 사용하여 프로테오글리칸을 양성염색하여 확인하였다(중간, ×200 확대율); 골세포성 분화는 본 코사(von Kossa) 염색으로 기질의 무기질화를 확인하였다(아래, ×40 확대율). 도 1d는 50 내지 200 ㎚ 범위의 다양한 사이즈를 갖는 정제 미세소포체를 전자현미경 이미지로 나타낸다. 시료는 세포 잔해 또는 단백질 응집체에 의해 오염되지 않았으며, 스케일 바는 200 또는 500 ㎚를 나타낸다. 도 1e는 전체-세포 용해물(간엽줄기세포) 및 정제된 간엽줄기세포의 미세소포체에서 갈렉틴-1, HSP90, β-액틴 및 CD63을 면역블럿으로 확인하였다.
도 2는 간엽줄기세포-유래 미세소포체로부터 확인한 단백질을 나타낸다. 도 2a는 간엽줄기세포-유래 미세소포체로의 스펙트라, 인증된 펩타이드 및 확인된 단백질의 총 수를 나타낸다. 도 2b는 3번의 독립적인 LC-MS/MS 분석으로 총 730의 단백질을 확인하였다. 도 2c는 간엽줄기세포-유래 미세소포체 프로테옴은 간엽줄기세포의 표면 마커 단백질을 포함하고, 간엽줄기세포의 자기-재생 및 분화와 관련되어 있음을 나타낸다.
도 3은 간엽줄기세포-유래 미세소포체 프로테옴의 기능 인리치먼트 분석을 보여준다. DAVID 소프트웨어를 사용하여 확인한 730 간엽줄기세포-유래 미세소포체 단백질을 GOBPs(Gene Ontology Biological Processes, 도 3a), GOMFs(Gene Ontology Molecular Functions, 도 3b) 및 GOCCs(Gene Ontology Cellular Components, 도 3c) 분석하였다(p<0.05).
도 4는 간엽줄기세포-유래 미세소포체 프로테옴과 간엽줄기세포-조건배지 프로테옴 및 분화 세포, 탈분화세포 및 인간 간엽줄기세포의 mRNA 자료를 통합한 결과를 보여준다. 도 4a는 인간 간엽줄기세포의 분화세포 및 분화세포의 탈분화를 도식화하여 보여준다. 화살표는 자기-재생(녹색) 및 분화(붉은색) 관련 유전자의 발현 정도의 변화를 나타낸다. 도 4b는 간엽줄기세포-유래 미세소포체 단백질과 자기-재생 및 분화-관련 유전자의 관계를 도표로 보여준다. 도 4c는 간엽줄기세포-유래 미세소포체, 간엽줄기세포-조건배지 프로테옴, 자기-재생 및 분화 관련 유전자를 비교하였다.
도 5는 후보 분자 및 그와 관련된 경로의 네트워크 모델을 보여준다. 마디는 색에 따라 미세소포체 단백질(주황색) 및 그의 상호작용(회색)을 나타낸다. 가장자리의 색은 단백질-단백질 상호작용(회색), 활성화(화살표), 억제(억제 표지) 및 직접(실선) 및 간접(점선) 상호작용을 나타낸다. 활성화 및 억제 정보는 KEGG 경로 데이터베이스의 “액틴 세포골격의 조절” 및 “초점접착역”으로부터 구하였다. 마디는 이러한 두 KEGG 경로에 기초하여 배열하였고, 동일한 GOBPs와 근접한 위치로 배치하였다. 파란색 경계는 선별된 후보 분자를 나타낸다.
도 6은 간엽줄기세포 및 간엽줄기세포-유래 미세소포체가 중대뇌동맥 영구폐색(permanent Mid Cerebral Artery occulusion; pMCAo)에 의한 허혈성 경색 후 행동에 관한 회복을 촉진한다는 결과를 나타낸다. 증가된 바디스윙 시험(Elevated body swing test), 평균대 시험(Beam balance test) 및 수정된 신경행동지수(modified Neurological Severity Score; mNSS)에 대한 행동 시험을 조건단계 동안 평가단계의 pMCAo 전과 후에 실시하였다. 도 6a는 증가된 바디스윙 시험의 결과를, 도 6b는 평균대 시험의 결과를, 도 6c는 수정된 신경행동지수의 결과를 나타낸다. 국소성 빈혈 48시간 후에 5 ×10⁵ 세포(간엽줄기세포 및 간엽줄기세포-유래 미세소포체, 각 n=8) 또는 대조군으로 PBS(Phosphate Buffered Saline, n=5)를 랫트에 주입하였다. 이식 후 7일 또는 pMCAo 후 14일에 각 시험에서 상당한 차이가 발견되었다. 데이터는 중간값±표준편차 값으로 나타내었다.
도 7은 국소성 빈혈 뇌의 뇌경색 분석 결과를 보여준다. 간엽줄기세포-처리군 및 간엽줄기세포-유래 미세소포체-처리군에서 경색의 정도(대측성의 동측의 %비)가 PBS군보다 상당히 감소함을 보여준다(*p<0.05, **p<0.01).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

재료 및 방법

시약 및 화학제품

DMEM(Dulbecco modified Eagle's medium-low glucose) 및 수크로즈, 젤라틴, 본 코사(von Kossa) 염색, 오일 레드 O, 사프라닌 O 및 HEPES는 시그마 케미칼 사로부터 구매하였다. 인슐린-트랜스페린-셀레늄(Insulin-Transferrin-Selenium; ITS)은 론자사로부터 구매하였다. FBS(Fetal Bovine Serum), 페니실린/스트렙토마이신, 2-머캅토에탄올(×1000), 트립신/EDTA(0.05%) 및 트리판 블루(0.4%)는 인비트로젠사로부터 구매하였다. TGF-β3는 펩로테크사로부터 구매하였다. 브래드포드 다이(dye)는 바이오래드사로부터, bFGF(basic Fibroblast Growth Factor)는 CHA 바이오메드사로부터 구매하였다. 옵티프렙(OptiPrep)은 액시스-쉘드사로부터 구매하였다.

인간 골수 샘플로부터 간엽줄기세포의 분리 및 특성분석

실험은 대한민국 연세대학교 세브란스 병원의 연구윤리심의위원회의 승인 하에 실시하였다. 정상인의 장골릉으로부터 골수세포를 수집하였다. 기증자의 동의하에 비여과 골수 수집백을 사용하였다. 골수 샘플로부터 단핵세포(Mononuclear Cells; MNCs)의 제조는 공지된 방법으로 실시하였다. 간단하게, 단핵세포를 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque) 밀도구배 원심분리(GE, 스웨덴)에 의해 분리하고, 저(low) 글루코오즈 DMEM, 10% FBS 및 페니실린-스트렙토마이신, 2-머캅토에탄올 및 FGF(4 ng/㎖)를 포함하는 간엽줄기세포 배지에 현탁하여 젤라틴-코팅 75 ㎠ 플라스크에 1×10⁶ 세포/㎠로 배양하였다. 3일 후에, 배양물을 PBS로 세척하여 비부착 세포를 제거하고 남아있는 부착세포의 단일층을 새로운 배지에서 70-85%의 컨플루언스(confluence)로 배양하였다. 세포에 트립신 처리하여 모은후, 5000 세포/㎠로 계대배양 하였다. 매 3일 간격으로 배지 교환하였으며, 세포 배양물은 70-85%의 컨플루언스로 계대하고 3-4번째 계대를 실험에 사용하였다.

간엽줄기세포의 면역표현형을 3 계대에서 조사하였다. 조사를 위해, 다음의 세포 표면 항원을 항-인간 항체 또는 적절한 마우스 아이소타입 항체(모두 BD-Pharmingen San Jose, 미국)로 염색하였다: CD29, CD31, CD34, CD44, CD45, CD73, CD90, CD105 및 CD106. 세포를 수집하고 유세포 분석기(Cytomic flow cytometer, Beckman Coulter, 미국)로 분석한 후, WinMDI를 사용하여 결과분석하였다.

3 계대의 세포에 분화유도배지를 처리하여 간엽줄기세포의 지방세포, 골세포 및 연골세포 분화능을 확인하기 위해 공지된 방법에 따라 실시하였다.³⁸ 간엽줄기세포를 골세포 및 연골세포 분화를 위해 12-웰에 플레이트 5×10⁴ 세포/웰로 씨딩(seeding)하고, 지방세포 분화를 위해, 1×10⁵ 세포/웰로 씨딩하였다. 연골세포화는 간엽줄기세포 단일층에 TGF-β3(10 ng/㎖)를 처리하여 배양하였다. 배양물은 2주 동안 95% 대기/5% CO₂의 37℃ 조건에서 3-4일 간격으로 배지 교환하여 배양하였다. 연골세포화는 사포라닌-O 염색을 실시하여 확인하였다. 골세포화는 광화(mineralized) 인산칼슘의 축적을 본 코사 염색을 통해 확인하였다. 지방세포화는 지질-풍부 액포의 세포내 축적을 오일 레드 O 염색을 통해 확인하였다. 기저배양배지로 배양한 세포를 대조군으로 사용하였다.

미세소포체의 분리

미세소포체(Microvesicles; MVs)를 공지된 방법을 수정하여 원심분리를 사용하여 조건 배지로부터 분리하였다.²³ bFGF(4 ng/㎖), 1× ITS 및 2-머캅토에탄올을 포함하는 무혈청(serum-free) 저글루코오즈 DMEM에서 배양 후, 24시간에 500 g로 10분, 800 g로 15분 2회 원심분리를 실시하여 조건배지를 수집하였다. 상층액을 100 kda 막의 미니메이트(Minimate) TFF 캡슐 시스템(PALL Corporation, 미국)을 이용하여 농축하였다. 고질의 미세소포체를 위해, 농축 상층액을 0.8 및 2.7 M 수크로오즈 쿠션을 포함하는 20 mM HEPES/150 mM NaCl 버퍼(pH 7.2)에 얹고 100000 g에서 2시간 동안 초고속원심분리를 실시하였다. 원심분리 후, 0.8 및 2.7 M 수크로오즈 쿠션의 사이부분을 PBS에 희석하여 수집하였다. 미세소포체의 추가적인 정제를 위해, 옵티프렙 밀도구배 초고속원심분리를 수행하였다. 간단하게, 수크로오즈-쿠션-풍부 미세소포체를 옵티프렙(최종 농도 30%)과 혼합하고 12 ㎖ 튜브의 바닥에 피펫으로 옮겼다. 다음, 20% 옵티프렙 3 ㎖ 및 5% 옵티프렙 2.5 ㎖을 포함하는 20 mM HEPES/150 mM NaCl 버퍼(pH 7.2)를 준비하고 층을 이룬 튜브를 200000 g로 3시간 동안 초고속 원심분리하였다. 동일한 부피의 10 분획을 튜브의 바닥으로부터 수집하여 9 ㎖ PBS로 희석하고 100000 g로 1시간동안 초고속 원심분리하였다. 마지막으로, 정제된 미세소포체를 증류수에 현탁하고 각 분획의 단백질 농도를 굴절계 측정 및 브래드포드 다이 분석으로 확인하였다. 모든 분획은 실험 시까지 -80℃에 보관하였다.

투과 전자현미경

정제 미세소포체를 글로우-배출 탄소-코팅 구리 그리드(EMS, 미국)에 적용하였다. 미세소포체를 8시간 동안 흡수시킨 후, PTA(Phosphor-Tungsten Acid) 염색을 10분 동안 실시하였다. 그리드를 증류수로 방울 세척하고 건조하였다. 투과 전자현미경 결과는 JEM 1011(Jeol, 일본)을 사용하여 가속전압 80 ㎸에서 기록하였다.

웨스턴블럿

각 샘플에 대한 전(whole) 세포 용해물(10-20 ㎍) 및 미세소포체(0.5-2 ㎍)을 SDS 폴리아크릴아마이드 젤에 로딩하였다. 전기영동을 통해 단백질을 분리시키고, PVDF 막으로 250 ㎃로 90분 동안 전송하여 5% 탈지분유에 블로킹하였다. 블로킹 한 막을 항-CD81(BD-Pharmingen), CD63 및 항-액틴(Santa cruz, 미국)과 반응하고 TBST 버퍼로 10분 동안 3차례 세척하였다. 다음, 막을 HRT 결합된 항-고트 또는 항-마우스 IgG로 반응하였다. TBST 버퍼로 10분 동안 3차례 세척하고 화학발광 기질(인트론, 대한민국)을 처리하여 X-선 필름에 감광하였다.

SDS - PAGE 및 인-젤 분해

각 분리한 간엽줄기세포-유래 미세소포체를 4-12% 구배 노벡스 비스-트리스 젤(인비트로젠)로 SDS-PAGE하여 분리하고 결과 단백질 밴드를 젤 코드 블루염색 시약(피어스, 미국)으로 염색하였다. 염색한 젤을 동일한 크기의 10 밴드로 슬라이스하고 인-젤 트립신 분해를 공지된 방법으로 수행하였다.³⁹

나노- LC - ESI - MS / MS 분석

인-젤 분해에 의해 제조한 펩타이드를 엑시젠트-나노-울트라-UPLC(Eksigent-Nano-Ultra Performance Liquid Chromatography, Eksigent Technologies, 미국)와 결합한 LTQ(Linear Trap Quadrupole) 질량 분광계(Thermo Finnigan, 미국)를 사용하여 분석하였다. 간단하게, 트립신 처리된 펩타이드를 C18 레귤러 5 ㎛ 사이즈 레진이 패킹된 자체제작 분석 컬럼(75 ㎛×11 ㎝)에 적용하였다.

97% 용액 A(증류수에 0.1% 포름산)에서 60% 용액 B(아세토니트릴(Acetonitrile)에 0.1% 포름산)로 유속 0.3 ㎕/의 조건에서 분선형 45분 구배를 실시하였다. 분리된 펩타이드 이온을 나노-ESI(ElectroSpray Ionization) 소스로 전기분무(electrospray)를 실시하였다. MS/MS 분석에 사용된 전기분무 전압은 1.9 ㎸이고, 표준화 충돌 에너지는 35%이다. 모든 MS/MS 스펙트라는 전체 MS 스캔을 단편으로 선별하여 가장 많은 5가지 스펙트라를 결과-의존 스캔으로 구하였다. 동적 배제에 대한 반복 계수는 1로, 반복 기간은 30초, 동적 배제 기간은 180초, 배제 질량 너비는 1.5 Da 및 동적 배제 리스트는 50으로 설정하였다.

펩타이드 및 단백질의 확인

S/MS 스펙트라 결과를 ipi.HUMAN.v3.76 데이터베이스(89 378 엔트리)에서 터보-SEQUEST 알고리즘(Thermo Finnigan, 미국)을 사용하여 검색하였다. 다음의 SEQUEST 검색 파라미터를 사용하였다: ±2 Da 및 ±1 Da의 전구체 및 프래그먼트 이온 질량 허용, 2 오절단(miscleavage) 허용, 가변 모디피케이션에 의한 Met(+16 Da)의 산화 및 고정 모디피케이션에 의한 Cys(+57 Da)의 카르바미도메틸레이션. 데이터베이스 검색 후, 스카프폴드2(Proteome Software, 미국)을 이용하여 확인된 펩타이드 및 단백질을 확인하였다. SEQUEST 검색으로부터 얻은 펩타이드 중, 0.95 이상의 펩타이드프로펫(PeptideProphet) 개연성을 갖는 한 세트의 펩타이드를 선별하였다.⁴⁰ 또한, 0.99 이상의 프로테인프로펫(ProteinProphet) 개연성 및 2개 이상의 고유 펩타이드를 갖는 단백질 리스트를 구하였다.

유전자 존재론( Gene Ontology ; GO ) 분석

단백질 또는 유전자 세트가 풍부한 GO 생물학적 과정, 분자적 기능 및 세포 기관을 확인하기 위해, DAVID(Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery)를 이용하였다.⁴¹

뇌졸중 동물모델의 제작과 인간골수 간엽 줄기세포 또는 간엽줄기세포 -유래 미세소포체의 치료효과 분석

실험동물은 오리엔트바이오에서 구매한 체중 200 g 전후의 스프라그-다우리 계통의 웅성 마우스을 사용하였으며, 물과 펠렛사료는 자유롭게 식이하도록 하였으며, 사육실의 온도는 20-24℃, 습도는 40-60%로 유지하고 주야 주기는 각 12시간으로 사육하였다. 모든 실험동물들은 실험실 환경에 2주 동안의 적응 후 실험에 사용하였으며 실험 시 사용한 흰쥐는 250-300g이다.

실험동물의 마취는 3% 이소푸루란(isoflurane, 하나약품, 대한민국)을 이용하여 수술중 적절한 마취상태가 유지되도록 한 다음 좌측 중뇌동맥 폐색을 유도하였다. 이를 위해 경부 중앙을 절개하여 우측 총경동맥을 노출시키고, 이어 내경동맥과 외경동맥을 노출시킨 다음, 끝부분을 둥글게 만든 수술용 실(나일론, 4-0)을 혈관벽을 약간 절개한 우측 외경동맥에서부터 내경동맥을 통해 중뇌동맥 기시부(Circle of Willis)까지 삽입하여 혈행을 영구적으로 차단하는 pMCAo법을 사용하였다. 이후 전경부의 피부를 봉합 및 소독하고 마취에서 깨어난 실험동물을 자유롭게 움직이도록 하였다.

뇌졸중을 유발한지 48시간 후 간엽줄기세포 또는 간엽줄기세포-유래 미세소포체를 이식할 실험군(각 n=8)과 PBS를 주입할 대조군(n=5)으로 쥐를 무작위로 분배하였다. 졸레틸(Virbac S.A., 프랑스, 투여량: 25 ㎎/㎏)로 흰쥐를 마취하고 뇌정위수술기에 고정한 후 50만개의 간엽줄기세포(5 × 10⁵ 세포/5 ㎕ PBS) 또는 50㎍/5 ㎕ PBS의 간엽줄기세포-유래 미세소포체를 뇌졸중 유발 반대 부위 선조체(AP +0.7, ML +2.0, DV -5.5)에 1 ㎕/분의 속도로 이식하였다. 대조군도 동일한 방법으로 PBS를 병변의 반대부위에 주입하였다. 세포 이식 후 모든 흰쥐에 매일 10 ㎎/㎏의 시클로스포린을 복강으로 투여하였다.

행동 실험

행동능력 검사는 뇌졸중 유발 시술을 시행하기 전 3일 동안 적응 훈련을 시행하여 이상 유무를 판별하였고, 시술 후 1, 4, 7, 14, 21, 및 28일에 각각 측정하였다.

(1) 증가된 바디스윙 시험( Elevated body swing test )

증가된 바디스윙 시험은 공지된 방법을 적용하였다(Borlongan,C. V.; Cahill, D. W.; Sanberg, P. R. Locomotor and passive avoidance deficits following occlusion of the middle cerebral artery. Physiol . Behav . 58:909-917; 1995). 랫트의 꼬리를 바닥에서 최대 10 ㎝의 높이로 들고 평측운동을 검사하였다. 왼쪽 또는 오른쪽 스윙의 빈도를 1분 동안 기록하였다. 값은 왼쪽 또는 오른쪽 스윙이 토르소 트위스트(torso twist)인 경우 0점, 30°이하의 비대칭 트위스트는 1점, 30°이상의 비대칭 트위스트는 2점으로 계산하였다. 토르소 트위스트의 차이는 경색 부위와 동일한 방향의 동측성 트위스트, 반대방향의 대측성 트위스트이다.

(2) 빔 균형 검사 ( Beam balance test )

동물 모델의 균형능력과 전정-운동 기능을 평가하기 위해 평균대 걷기 시험을 수행하였다(Goldstein, L. B.; Davis, J. N. Beam-walking in rats: studies towards developing an animal model of functional recovery after brain injury. J. Neurosci. Methods. 31:101-107; 1990). 마우스를 평균대(100 ㎝×5 ㎝×2 ㎝) 위에 올려놓고 다음의 6단계 점수로 평가하였다. 안정적 자세를 갖는 균형은 1점, 평균대의 측면을 발로 꽉 잡거나 휘청거리는 움직임은 2점, 평균대에서 하나 이상의 발이 떨어지면 3점, 평균대에서 균형을 잡다 추락하면 4점, 평균대에 몸을 걸치거나 낙하하면 5점, 균형을 잡으려는 시도를 하지 않고 평균대에서 추락하는 경우 6점으로 평가하였다.

(3) 수정된 신경행동지수 ( Modified neurological severity score ; mNSS )

신경 가혹 정도는 공지된 운동신경, 감각신경 및 반사신경 시험을 조합하였다(Longa, E. Z.; Weinstein, P. R.; Carlson, S.; Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke 20:84-91; 1989). 수정된 신신경행동지수는 토르소 트위스팅 시험, 평균대 시험, 프리헨슬(prehensile) 견인 시험, 열린 필드 시험(회전 빈도) 및 풋 폴트(foot fault) 시험을 기초로 한 운동신경, 감각신경 및 반사신경 시험의 결과를 조합하여 평가한 것이다. 완전한 상태를 0점, 반대쪽 앞발를 완전히 펴는데 어려움이 있는 경우 2점(3≤앞발의 결함<10), 반대쪽 앞발을 펴기 불가능한 경우 4점(앞발의 결함≥10), 반대쪽으로 가볍게 도는 경우에 6점(1≤회전 또는 비대칭 트위스트<5), 심하게 도는 경우는 8점(회전 또는 비대칭 트위스트≥5), 반대쪽으로 추락하는 경우에는 10점(프리헨슬 견인≤2)으로 계산하였다.

헤마톡실린 염색 및 경색 측정

뇌 절편을 헤마톡실린 염색하고 현미경(Zeiss, 독일)으로 관찰하였다. 상대적 경색 영역을 이미지 J 소프트웨어로 분석하였다. 반대쪽 반구 영역으로부터 동측 반구의 온전한 부분을 분리하여 간접병변 영역을 계산하였다. 상대적 경색 영역은 반대쪽 반구와 비교하여 간접 병변을 백분율로 나타내었다(Swanson, R. A.; Morton, M. T.; Tsao-Wu, G.; Savalos, R. A.; Davidson, C.; Sharp, F. R. A semiautomated method for measuring brain infarct volume. J. Cereb. Blood. Flow Metab. 10:290-293; 1990).

결과 및 토론

간엽줄기세포 -유래 미세소포체의 분리 및 분석

인간 골수-유래 간엽줄기세포로부터 미세소포체를 분리하기 전에, 간엽줄기세포를 확인하기 위해 유세포 분석법을 실시하였다. 세포는 균일한 방추형 파퓰레이션의 전형적인 간엽줄기세포 형태 및 CD29, CD44, CD73, CD90 및 CD105를 양성으로 CD31, CD34, CD45 및 CD106을 음성으로 발현하는 면역 특성을 나타내었다(도 1a 및 도 1a). 간엽줄기세포를 공지된 방법으로 지방세포, 연골세포 및 골세포로 다양한 리니지(lineage)로의 분화 가능성을 확인하여 줄기세포 특성을 확인하였다.³⁸ 간엽줄기세포로부터 미세소포체를 분리하기 위해, 세포를 bFGF 및 ITS를 포함하는 무혈청 DMEM에서 24시간 동안 배양하였다. 세포 및 세포 잔해를 제거한 후에, 조건 배지를 100-kDa 필터 및 수크로즈 구배를 이용한 연속적인 원심분리로 50배 농축하였다.²³ 투과 전자현미경으로 관찰한 결과, 정제된 미세소포체는 직경 50-200 ㎚의 둥근 소낭 형태였다(도 1d). 24시간 배양한 약 80 백만 서브-컨플루언트 세포의 배지로부터 소낭 단백질을 최대 10 ㎍ 수득하였다. 미세소포체는 CD63, β-액틴 및 HSP90과 같은 미세소포체에서 흔히 발견되는 단백질의 집합으로 구성된다(도 1e). 불용성 면역 복합체와 같은 단백질 복합체는 유세포 분석에 의한 미세소포체의 정량 및 초고속원심분리에 의한 정제에 영향을 주는 미세소포체의 생물물리학적 특성(크기, 빛 산란 및 퇴적)이 유사하다.⁴² 불용성 단백질 복합체의 오염 가능성을 줄이기 위해, 간엽줄기세포로부터 미세소포체를 분리하는데 무혈청 배지를 이용하였다.

간엽줄기세포 -유래 미세소포체의 단백질 프로테옴 분석

간연줄기세포-유래 미세소포체의 단백질 구성을 조사하기 위해, 미세소포체를 3회 독립적으로 분리하여 단백질 프로테옴 분석, 1D SDS-PAGE의 조합, 트립신에 의한 인-젤 분해 및 LC-MS/MS 분석을 실시하였다.²³ 3회 독립적으로 분리된 간엽줄기세포-유래 미세소포체 샘플을 각각 LC-MS/MS 분석하였다. 3회의 LC-MS/MS 분석은 샘플에 대하여 각각 98 067, 110 051 및 93 134 MS/MS 스펙트라를 나타내었다. 3회의 MS/MS 스펙트라를 SEQUEST 알고리즘을 이용하여 IPI 데이터베이스(v.3.76, 89 378 엔트리)에 대하여 검색하였다. 신뢰성 있는 단백질 확인을 위해, 0.95 이상의 펩타이드프로펫 개연성을 갖는 펩타이드 및 0.99 이상의 프로테인프로펫 개연성을 갖는 단백질을 확인하였다. 이러한 기준을 적용하여, 3회 독립적인 실험 중 최소 2회 특이적인 펩타이드로부터 총 730개의 미세소포체 단백질을 확인하였다(도 2a 및 도 2b). 730 미세소포체 단백질 가운데, 최소 2번의 LC-MS/MS로 424 단백질을 확인하고 3번의 분석으로 236 단백질을 확인하였다.

간엽줄기세포 -유래 미세소포체 특징

발명자들은 이전에 인간 결장암 복수 및 인간 HT29 결장암 세포로부터 미세소포체 단백질의 구성을 보고하였다.^42,23 간엽줄기세포-유래 미세소포체가 미세소포체의 특징을 나타내는지 조사하기 위해, 보고된 미세소포체 프로테옴과 간엽줄기세포-유래 미세소포체를 비교하였다. 730개의 간엽줄기세포-유래 미세소포체 단백질 가운데, 이전에 미세소포체 프로테옴에 보고된 420 단백질을 확인하였다. 미세소포체 프로테옴은 미세소포체 발생 및 운송과 같은 미세소포체의 본질적인 특성과 관련된 단백질을 포함한다.^44,45 이러한 발견과 일관되게, 420 단백질은 미세소포체의 도킹 및 융합의 조절뿐 아니라, 다양한 세포 소기관으로 미세소포체가 알맞게 타겟팅 하는 역할을 하는 15 RAB 단백질(예컨대, RAB1A, RAB2A, RAB5A/B/C, RAB7A 및 RAB8A)을 포함한다. 이러한 RAB 단백질은 원형질막에서 골지 전송, 그래뉼 분비, 융합막 형성 및 리간드 제거에 관련된다.

간엽줄기세포 -유래 미세소포체 프로테옴의 미세소포체적 특징

이전의 연구는 미세소포체 프로테옴이 그 유래 세포의 특성을 반영함을 보여준다.^{19,22-24,31,35,48} 그러므로, 간엽줄기세포-유래 미세소포체 프로테옴이 간엽줄기세포와 관련된 단백질을 포함하는지 조사하였다. Kolf et al.에 의해 정리된 간엽줄기세포의 표면 마커를 기초로 하여, 730 미세소포체 단백질이 간엽줄기세포에 대한 5 양성 마커(CD13, CD29, CD44, CD73 및 CD105) 및 2 가변 마커(CD10 및 CD90)를 포함하고 음성 마커는 조사되지 않았다. 또한, 간엽줄기세포-유래 미세소포체 프로테옴을 제대혈 유래 간엽줄기세포(UCB-hMSCs) 및 인간 간엽줄기세포의 프로테옴을 비교하고 122 단백질이 중복되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 본 발명의 미세소포체 분리 및 프로테오믹 분석의 유효성을 뒷받침한다. 미세소포체 프로테옴은 간엽줄기세포의 자기-재생 및 분화와 관련된 신호전달 경로의 분자를 포함한다(도 2C).⁴⁹ 첫째, 미세소포체 프로테옴은 KEGG 경로 데이터베이스 및 GOBP 신호전달경로에 근거한 간엽줄기세포의 자기-재생, 성장인자 수용체 및 Wnt 신호전달 경로에 관여하는 2가지 신호전달 경로와 관련된 13 단백질을 포함한다. 둘째, 간엽줄기세포의 분화, TGFβ, MAPK, PPAR 및 BMP 신호전달 경로에 관여하는 5 신호전달 경로와 관련된 38 단백질을 포함한다. Wnt 신호전달 경로는 간엽줄기세포의 자기-재생 및 분화에 관련되는 것으로 보고된다. 이러한 결과는 간엽줄기세포-유래 미세소포체가 간엽줄기세포의 특징을 갖으며 이러한 미세소포체는 신호전달 경로에 관여하는 단백질을 통해 자기-재생 및 분화에 영향을 줄 수 있음을 말해준다.

간엽줄기세포 -유래 미세소포체의 잠재적 기능

간엽줄기세포-유래 미세소포체 프로테옴과 다른 프로테옴의 비교 분석 결과는 간엽줄기세포-유래 미세소포체 프로테옴이 미세소포체 및 간엽줄기세포의 특징을 갖고 있음을 나타낸다. 그러나, 간엽줄기세포-유래 미세소포체의 잠재적 기능에 대해서는 밝혀지지 않았다.

간엽줄기세포-유래 미세소포체의 기능을 체계적으로 조사하기 위해, DAVID 소프트웨어를 사용하여, 730 미세소포체 단백질의 기능 인리치먼트 분석을 수행하였다.⁴¹ GOBPs(Gene Ontology Biological Processes, 도 3a)는 소낭-매개 전송(10.7%), 세포 부착(8.4%), 세포 주기 및 증식(7.9% 및 4.7%), 세포 이동(4.0%), 세포 형태 형성(4.1%) 및 발생과정(예컨대, 외배엽 및 표피 발생) 포함하는 미세소포체 프로테옴을 유의하게 나타낸다. 또한, GOMFs(Gene Ontology Molecular Functions, 도 3b)은 미세소포체 프로테옴이 뉴클레오타이드 결합(25.5%), 칼슘 이온 결합(11.9%), 세포골격 단백질 결합(11.0%) 및 GTPase 활성(9.1%)을 가짐을 보여준다. 마지막으로, 미세소포체의 주요한 GOCCs(Gene Ontology Cellular Components, 도 3c)는 원형질막(38.7%), 세포 골격(23.1%), 소낭(15.6%), 시토졸(27.1%) 및 세포외 부분(11.7%)을 포함한다. 세포 과정의 넓은 스펙트럼 및 분자 기능은 간엽줄기세포-유래 미세소포체의 치료효과를 예상할 수 있다.

간엽줄기세포의 자기-재생 및 분화의 mRNA 시그니쳐의 통합 및 간엽줄기세포 -조건 배지

간엽줄기세포-유래 미세소포체 프로테옴의 세포 과정에 의해 확인된 간엽줄기세포-유래 미세소포체의 치료효과를 알아보기 위해, 간엽줄기세포의 치료효과와 밀접한 관련이 있는 자기-재생 및 분화와 관련된 것으로 알려진 유전자를 통합하여 간엽줄기세포의 자기-재생 및 분화와 간엽줄기세포-유래 미세소포체 프로테옴의 잠재적 관계를 조사하였다.^50,51 Song et al.은 인간 간엽줄기세포, 인간 간엽줄기세포에서 분화된 3가지 세포(지방세포, 연골세포 및 골아세포) 및 분화세포로부터 탈분화된 세포의 유전자 발현 프로필을 구하였다. 간엽줄기세포의 분화동안 발현 정도가 감소하고 탈분화시 발현이 증가하는 자기-재생과 관련된 유전자를 확인하고 반대의 경향을 나타내는 간엽줄기세포 분화와 관련된 유전자를 확인하였다(도 4a). 730 간엽줄기세포-미세소포체 단백질 가운데, 미세소포체 단백질은 간엽줄기세포의 자기-재생 및 분화와 관련된 단백질과 각각 53(7.3%) 및 25(3.4%) 중복되었다(도 4b). 이러한 간엽줄기세포-유래 미세소포체의 잠재적 관계의 중복은 분자 수준에서의 비교보다 세포 과정 수준에서의 비교가 유의한 해석이 가능할 것이다.

세포 과정 수준에서 중복을 조사하기 위해, 자기-재생 및 분화와 관련된 유전자의 기능 엔리치먼트 분석을 실시하고 간엽줄기세포-유래 미세소포체 프로테옴의 것과 비교하였다(도 4c). 간엽줄기세포-유래 미세소포체 프로테옴 및 자기-재생-관련 유전자는 세포 증식, 세포 부착 및 이동, 액틴 세포골격 조직, 발생과정(표피, 외배엽 및 혈관 발생), Ras 신호전달 경로 및 호르몬 자극에 대한 반응을 공유한다. 반면에, 간엽줄기세포-유래 미세소포체 프로테옴 및 분화-관련 유전자는 산화정 스트레스에 대한 반응 및 공동인자 및 황 대사과정을 공유한다. 세포 부착 및 이동은 자기-재생 및 분화와 관련된 유전자를 공유한다. 이러한 결과는 간엽줄기세포-유래 미세소포체 프로테옴이 간엽줄기세포의 자기-재생 및 분화과정에 관여하는 단백질에 영향을 미침을 말한다.

간엽줄기세포-유래 미세소포체는 간엽줄기세포-유래 조건배지와 유사하게 심근허혈의 경색증 크기를 감소시키는 효과를 나타낸다.²⁰ 그러므로, 간엽줄기세포-유래 미세소포체와 인간 간엽줄기세포-조건배지 프로테옴을 비교하여 간엽줄기세포-유래 미세소포체-기반 치료적 측면에서 미세소포체 프로테옴의 잠재적 역할을 조사하였다.³¹ 730개의 간엽줄기세포-유래 미세소포체 단백질 중에서, 58 단백질(8.0%, 55 특이적 유전자 산물)은 간엽줄기세포-조건배지 프로테옴과 중복되었다. 자기-재생 및 분화와 관련된 유전자의 분석을 위해, 간엽줄기세포-조건배지 단백질의 기능 엔리치먼트 분석을 실시하였다. 단백질 및 유전자를 다음의 4 군으로 나눠 세포 과정을 비교하였다(도 4c): (1) 간엽줄기세포-유래 미세소포체 프로테옴; (2)자기-재생 및 (3) 분화-관련 유전자; 및 (4) 간엽줄기세포-조건배지 프로테옴. 단백질 및 유전자의 4 군에 대한 세포 과정의 중복 패턴은 다음의 5 군으로 분류하였다:(1군) 세포 부착, 세포 이동 및 호르몬 자극에 대한 반응에 관련된 4 군의 단백질 및 유전자 중복군 ; (2군) 액틴 세포골격 조직, Ras 신호전달 및 3 발생 과정(혈관, 표피 및 외배엽 발생) 및 자기-재생-관련된 간엽줄기세포-유래 미세소포체 및 조건배지 프로테옴의 중복군; (3군) 해당과정, 세포 산화환원 항상성, Rho 신호전달, 세포 형태, 칼슘이온에 대한 반응 및 콜라겐 섬유 조직에 관련된 간엽줄기세포-유래 미세소포체 및 조건배지 프로테옴의 중복군; (4군) 세포 증식, 상피 발생, 단백질 폴딩 및 핵산 생합성에 관련된 간엽줄기세포-유래 미세소포체 프로테옴 및 자기-재생-관련 유전가 중목군; (5군) 펩타이드/공인자/황 대사 과정 및 산화 스트레스에 대한 반응과 관련된 간엽줄기세포-유래 미세소포체 프로테옴 및 분화-관련 유전자의 중복군.

결과는 자기-재생-관련 과정(1군 및 2군) 및 다른 분화-관련 과정(1군 및 3군)을 통한 간엽줄기세포-유래 미세소포체 단백질 중 일부는 간엽줄기세포-유래 미세소포체의 치료적 효과와 관련될 수 있는 간엽줄기세포-유래 미세소포체 및 조건배지 프로테옴에 의해 공유되는 과정(1군, 2군 및 3군)을 포함함을 보여준다.

간엽줄기세포 -유래 미세소포체 및 간엽줄기세포의 허혈성 경색 회복 촉진

허혈성 뇌졸중에 대한 간엽줄기세포의 치료효과를 간엽줄기세포-유래 미세소포체가 대체할 수 있는지 조사하기 위해, 배양된 간엽줄기세포로부터 정제한 미세소포체를 영구적 뇌 허혈증을 갖는 랫트 모델의 경색 부위에 투여하였다.

미세소포체 또는 간엽줄기세포의 전신적 주입은 손상된 조직으로의 미숙한 회귀성으로 인해 치료효과가 제한적일 것이므로, 뇌정위적 심부삽입 에 의해 병변 부위로 직접 주입하는 방식을 이용하였다. pMCAo의 48시간 후, 간엽줄기세포(5×10⁵세포) 또는 간엽줄기세포-유래 미세소포체(50 ㎍)를 랫트의 반연부 선조체에 세포 희석을 최소화하기 위해 내뇌에 뇌정위적 심부삽입으로 직접 주입하였다. 대조군으로 PBS를 랫트의 동일한 위치에 주입하였다.

신경기능 시험

pMCAo 전, 모든 실험동물이 신경적 결함이 갖지 않는 것을 확인하였다(도 6). 그러나, pMCAo을 한 랫트는 24시간째에 뇌 빈혈을 갖는 실험군 간의 유의한 차이가 없이 심한 신경 결함을 나타내었다. 증가된 바디스윙 시험 및 평균대 시험에서, 4일(전체 관찰기간 28일)에서 PBS 대조군의 수행능과 비교하여 간엽줄기세포를 이식한 빈혈-유도 랫트의 기능적 결함이 유의하게 개선됨을 확인하였다(도 6a 및 도 6b). 간엽줄기세포-유래 미세소포체가 이식된 랫트는 pMCAo 이후 4일부터 PBS-주입군과 비교하여 신경 가혹 정도의 유의한 개선을 나타내었다. 4일째에 간엽줄기세포 및 간엽줄기세포-미세소포체군 간의 유의한 차이는 나타나지 않았다. 그러나, 14일 내지 28일에는 간엽줄기세포-이식군과 달리, 대조군과 비교하여 간엽줄기세포-미세소포체군에서는 덜 유의적인 기능적 회복을 나타내었다. 기능시험과 유사하게, 행동 과정에 기반한 수정된 신경 행동지수 (mNSS) 시험, 증가된 바디스윙 시험, 평균대 시험 및 프리헨슬 견인 시험에서도 간엽줄기세포가 이식된 랫트에서 대조군과 비교하여 상당한 기능적 회복을 나타내었다(도 6c). 대조적으로 간엽줄기세포-유래 미세소포체의 단회 주입은 단시간(최대 7일) 행동 회복을 유도하였다(도 6c).

조직학적 분석

pMCAo 후 28일에 랫트 뇌의 헤마톡실린 염색으로 확인한 경색 부위로 각 실험군의 조직 결함을 정의하였다(도 7). 경색 병변은 주로 피질 및 선조체에서 나타났다. 간엽줄기세포-이식 및 간엽줄기세포-유래 미세소포체-주입군에서 상대적인 경색 부위는 대조군(28.0±3.9)과 비교하여 감소하였다. 간엽줄기세포- 및 간엽줄기세포-유래 미세소포체의 처리군 간의 차이는 유의적이지 않았지만, 간엽줄기세포-이식 랫트(20.5±4.1)가 간엽줄기세포-유래 미세소포체를 주입한 랫트(23.1 ± 3.6)보다 더 감소된 결과를 나타내었다. 따라서, 행동 결핍의 개선은 경색 부위의 감소와 함께 수반된다.

pMCAo 상태의 랫트 뇌에서 간엽줄기세포 또는 간엽줄기세포-유래 미세소포체의 이식이 경색 부위를 감소시키고 신경 기능을 향상시킴을 입증하였다. 4주 관찰 동안 간엽줄기세포의 이식 및 간엽줄기세포-유래 미세소포체의 단회 주입은 국소허혈성 뇌졸중 랫트의 신경 결함을 상당히 향상시켰다. 그러나, 세포 트래킹 분석을 통해 이식된 간엽줄기세포가 허혈성 뇌에서 장기간의 생존능을 유지하지 못하는 것을 나타낸다. 특히, 세포이식 초기의 행동 회복은 이식된 세포가 숙주의 뇌의 신경조직과의 연결이 형성되기 전에 유도되는 것이므로, 이식세포 자체가 손상된 신경세포를 대체하여 숙주의 신경 네트워크를 회복하는 것이 아닌 것으로 판단된다. 즉, 뇌졸중 랫트에서, 간엽줄기세포 이식 및 간엽줄기세포-유래 미세소포체 주입을 통해 허혈성 뇌에서 주입된 세포 또는 미세소포체가 숙주 자체의 신경 네트워크를 재생을 촉진하는 성장인자를 제공하고 미세환경을 개선하는 초기 4일째에 유의한 기능적 개선을 유도하였다. 간엽줄기세포-유래 미세소포체의 주입은 간엽줄기세포 이식의 초기와 유사한 기능적 회복을 보여주었다. 따라서, 초기에 나타나는 기능적 회복은 이식된 세포에 의한 뇌 조직으로 세포의 도입 및 대체에 의한 결과는 아닐 것이다(Li, Y.; Chen, J.; Wang, L.; Lu, M.; Chopp, M. Treatment of stroke in rat with intracarotid administration of marrow stromal cells. Neurology 56:1666-1672; 2001). 이는 손실 세포가 회복되는데 세포가 대체되기 보다는 이식된 간엽줄기세포의 초기에 강력한 파라크린(paracrine) 영향/영양에 의한 기능적 회복으로 보인다(Kurozumi, K.; Nakamura, K.; Tamiya, T.; Kawano, Y.; Ishii, K.; Kobune, M.; Hirai, S.; Uchida, H.; Sasaki, K.; Ito, Y.; Kato K, ;Honmou O,; Houkin K,; Date I,; Hamada H. Mesenchymal stem cells that produce neurotrophic factors reduce ischemic damage in the rat middle cerebral artery occlusion model. Mol. Ther. 11:96-104; 2005; Chen, J. R.; Cheng, G. Y.; Sheu, C. C.; Tseng, G. F.; Wang, T. J.; Huang, Y. S. Transplanted bone marrow stromal cells migrate, differentiate and improve motor function in rats with experimentally induced cerebral stroke. J. Anat. 213:249-258; 2008). 이는 간엽줄기세포가 뇌의 미세환경, 예컨대, 염증 감소, 혈관형성의 향상 및/또는 내재적 신경발생의 유도를 조절하는 매개체를 생산하는 것으로 보인다(Chen, C. P.; Lee, Y. J.; Chiu, S. T.; Shyu, W. C.; Lee, M. Y.; Huang, S. P.; Li, H. The application of stem cells in the treatment of ischemic diseases. Histol. Histopathol. 21:1209-1216; 2006). 주입된 간엽줄기세포에 의해 생산되는 대부분의 인자는 내재적 신경발생을 유도하고 신경을 보호(neuroprotection)하는 것으로 보고되어 왔다(Niimura, M.; Takagi, N.; Takagi, K.; Mizutani, R.; Ishihara, N.; Matsumoto, K.; Funakoshi, H.; Nakamura, T.; Takeo, S. Prevention of apoptosis-inducing factor translocation is a possible mechanism for protective effects of hepatocyte growth factor against neuronal cell death in the hippocampus after transient forebrain ischemia. J. Cereb. Blood Flow Metab. 26:1354-1365; 2006). 허혈성 뇌졸중에서 간엽줄기세포로부터 생산되는 인자는 이러한 이식 또는 주입의 초기에 신경보호를 향상시킬 것이고, 그 후에 이식된 세포 또는 미세소포체, 조직-유래(내재적) 신경영양성 인자로부터 작용이 유도될 것이다(Kiprianova, I.; Freiman, T. M.; Desiderato, S.; Schwab, S.; Galmbacher, R.; Gillardon, F.; Spranger, M. Brain-derived neurotrophic factor prevents neuronal death and glial activation after global ischemia in the rat. J. Neurosci. Res. 56:21-27; 1999). 따라서, 이러한 신경보호 인자에 의한 신경 사멸의 억제 및 강력한 내재적 신경발생의 유도에 의해 경색 영역이 감소되는 것이다.

종합적으로, 간엽줄기세포-유래 미세소포체의 뇌내주입은 간엽줄기세포의 효과와 유사하게 내재적 신경발생을 위한 미세 환경을 매개함으로써 뇌의 기능이 회복되고 경색 부위가 감소하는데 기여한다. 세포치료제 측면에서, 이러한 간엽줄기세포-유래 미세소포체는 간엽줄기세포보다 유리하다. 미세소포체는 비-세포체이기 때문에, 종양 형성 및 면역 거부반응과 같은 세포의 직접이식과 관련되는 부작용의 위험이 없다. 또한, 미세소포체는 대량 제조 및 조작이 상대적으로 용이하고 비용-효율적이다. 이러한 측면에서, 줄기세포 또는 전구세포에서 유래한 미세소포체는 뇌졸중, 알쯔하이머병, 중추신경 손상 및 파킨슨씨 질병과 같은 퇴행성 신경질환 및 불치성 신경질환을 위한 이상적인 재생 치료제의 역할을 할 수 있다.

간엽줄기세포 -유래 미세소포체의 치료 효과와 관련된 후보 분자

1, 2 및 3군을 포함하는 미세소포체 단백질은 간엽줄기세포-유래 미세소포체의 치료 효과와 관련이 있다. 미세소포체 단백질 가운데, 다음의 후보 분자에 초점을 두었다: (1) 표면 수용체(PDGFRB, EGFR 및 PLAUR); (2) 신호전달 분자(RRAS/NRAS, MAPK1, GNA13/GNG12, CDC42 및 VAV2); (3) 세포 부착(FN1, EZR, IQGAP1, CD47, 인테그린 및 LGALS1/LGALS2); 및 (4) 간엽줄기세포-관련 항원(CD9, CD63, CD81, CD109, CD151, CD248 및 CD276).

첫째, 표면 수용체는 간엽줄기세포의 치료 잠재능을 촉진하였다. PDGFR 신호경로는 상처 재생 및 조직 재생에 중요한 간엽줄기세포의 보충 및 분화에 우세 경로이다.^52,53 또한, 간엽줄기세포에서 수용성 및 결박 EGFs의 치료는 간엽줄기세포의 증식 및 분화를 증가시킴으로써 간엽줄기세포의 치료능을 향상시킨다.⁵² 또한, PLAUR은 간엽줄기세포의 동원, 이동 및 분화를 매개하여 간엽줄기세포의 치료능을 향상시킨다.⁵⁴

둘째, 신호전달 분자는 다음의 3가지 신호전달 경로로 분류할 수 있다: RAS-MAPK(RRAS/NRAS, MAPK1 및 VAV2), RHO(GNA13) 및 CDC42(GNG12 및 CDC42) 경로. KEGG 경로 데이터베이스(hsa04810: 액틴 세포골격 조절)에 기초하여, 이러한 경로는 간엽줄기세포의 동원, 증식 및 분화를 촉진하는 표면 수용체의 다운스트림에 위치하며 이는 간엽줄기세포의 치료효과를 암시한다.

셋째, 세포 부착 분자는 간엽줄기세포-기반 조직 치료 및 재생과 관련된 특징은 긍정적인 효과를 나타내었다. 성장 인자의 부재 시, 피브로넥틴(fibronectin1;FN1)은 PDGF-의존 액틴 재조직의 인테그린-매개 활성을 통해 간엽줄기세포의 이동을 조절한다.⁵⁵ 인테그린 및 그와 관련된 분자(CD47, ITGA1/2/3/5/7/10/11/V 및 ITGB1/3/5)는 이러한 피브로넥틴-매개 MSC 이동(KEGG 경로: hsa04810)과 관련된다. 더욱이, Galectic-1(LGALS1)은 배아발생, 암 전이, 세포 증식, 분화, 이동, 부착, 상처 치유, 혈관 형성 및 면역 조절과 같은 다양한 과정을 조절한다.⁵⁶ 예를 들어, LGALS1은 인간 태아 간엽줄기세포에서 골격근 분화를 유도하고 근육 재생을 증가시킨다.⁵⁷ 이러한 분자와 달리, EZR 및 IQGAP1은 간엽줄기세포의 치료 효과와 어떠한 기능적 관련도 보고되지 않다. 그러나, 내피 세포 증식 및 혈관형성을 조절하는 것으로 이는 간엽줄기세포-기반 조직 재생의 잠재적 암시를 나타낸다.^58,59

마지막으로, 간엽줄기세포-관련 항원은 대개 간엽줄기세포의 치료 효과와 밀접한 관련을 갖는 세포 부착에 관련된다. 예컨대, CD9는 증식을 촉진하고, 인간 지방-유래 간엽줄기세포의 혈관형성 작용을 촉진되게 한다.⁶⁰ 또한, CD90은 신경 발생, 항-염증, 아폽토시스, 부착, 이동, 종양 억제 및 섬유아세포 증식에 있어, 세포-세포 및 세포-세포외기질 상호작용에 중요한 역할을 한다.⁶¹ 다른 항원에 대하여, 조직 재생동안 간엽줄기세포의 치료 효과의 직접적인 역할은 명백히 밝혀져 있지 않다. 그러나, 세포 부착의 관련성은 이러한 분자가 조직 치료 및 재생 동안 간엽줄기세포의 치료 잠재능을 조절할 수 있는 새로운 타겟으로써 역할을 할 것이라 말한다.

이러한 후보 분자(표면 수용체, 세포 부착 분자 및 신호전달 분자)는 관련된 경로를 통해 밀접하게 연결되어 있다. 후보 분자 및 이와 관련된 경로의 관계를 조사하기 위해, 단백질-단백질에 기초하여 후보 분자에 대한 네트워트 모델을 구축하였다(도 5). 네트워크 모델은 후보 분자 및 그와 관련된 경로의 작용 가능성을 보여준다. 이는, 성장 인자 수용체 및 피브로넥틴/인테그린은 RAS-MAPK, RHO 및 CDC42 경로 이전을 활성화시켜 세포 부착 및 이동에 적합하게 액틴 세포골격을 재조직한다. 증가된 세포 이동은 조직 치료 및 재생 동안 간엽줄기세포의 동원을 이끌 수 있다. 결과는 후보 분자가 간엽줄기세포 이동 효과를 통해 조직 재생에 기여 할 수 있음을 나타낸다.

미세소포체의 프로테옴 프로파일링은 간엽줄기세포-유래 미세소포체의 730 단백질을 제공한다. 몇몇 프로테옴 및 전사체의 간엽줄기세포-유래 미세소포체 프로테옴과의 통합은 다음을 나타낸다: (1) 간엽줄기세포-유래 미세소포체가 미세소포체의 특징 및 간엽줄기세포의 특징을 갖는다; (2) 간엽줄기세포-유래 미세소포체에 의해 나타나는 세포 과정은 자기-재생 및 분화의 간엽줄기세포-조건배지 및 유전자와 공유한다; (3) 미세소포체 단백질 후보 리스트는 간엽줄기세포의 치료효과와 관련 있으며 그와 관련된 경로는 간엽줄기세포의 치료효과를 촉진시킨다.

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이상으로 본 발의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어 러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (14)

1. 줄기세포-유래 미세소포체를 유효성분으로 포함하는 신경질환(neural disease) 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 줄기세포는 간엽줄기세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
3. 제 2 항에 있어서, 상기 간엽줄기세포는 뇌, 간, 폐, 제대혈, 태아혈, 신장, 지방 조직, 태반 또는 골수로부터 유래한 간엽줄기세포인 것을 특징으로 하는 조성물
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 미세소포체는 (a) CD13, CD29, CD44, CD73 및 CD105 표면항원에 대하여 양성의 면역학적 특성; 및 (b) CD10 및 CD90에 대하여 가변(variable)의 면역학적 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
5. 제 1 항에 있어서, 상기 미세소포체는 PDGFRB(β-type Platelet-Derived Growth Factor Receptor), EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor) 및 PLAUR(Plasminogen Activator, Urokinase Receptor)로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 간엽줄기세포 자기-재생관련 표면 수용체를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
6. 제 1 항에 있어서, 상기 미세소포체는 RRAS(Ras-related protein R-Ras)/NRAS(Neuroblastoma RAS viral oncogene homolog), MAPK1(Mitogen-activated Protein Kinase 1), GNA13/GNG12(Guanine Nucleotide-binding protein subunit Alpha-13/Guanine Nucleotide-binding protein G(I)/G(S)/G(O) subunit Gamma-12), CDC42(Cell Division Control protein 42 homolog) 및 VAV2(Guanine nucleotide exchange factor VAV2)로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 신호전달 분자를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
7. 제 1 항에 있어서, 상기 미세소포체는 FN1(Fibronectin), EZR(Ezrin), IQGAP1(IQ motif containing GTPase Activating Protein 1), CD47, 인테그린 및 LGALS1(Galectin-1)/LGALS3(Galectin-3)으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 세포부착 분자를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
8. 제 1 항에 있어서, 상기 미세소포체는 CD9, CD63, CD81, CD109, CD151, CD248 및 CD276으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 간엽줄기세포-관련 항원을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
9. 제 1 항에 있어서, 상기 신경질환은 신경 손상(neural injury), 신경 퇴행성 질환, 및 허혈 또는 재관류에 의한 질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 신경질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
10. 제 9 항에 있어서, 상기 신경 손상은 중추신경계 손상인 것을 특징으로 하는 조성물.
    
11. 제 9 항에 있어서, 상기 신경 퇴행성 질환은, 알쯔하이머병, 헌팅톤 질병, 파킨슨씨 질병 및 근위축성 측삭 경화증으로 구성된 군으로부터 선택되는 신경 퇴행성 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
    
12. 제 9 항에 있어서, 상기 허혈 또는 재관류에 의한 질환은 허혈성 뇌졸중인 것을 특징으로 하는 조성물.
    
13. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 단회투여 또는 반복투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
    
14. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 뇌내주사로 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.

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