KR101661966B1 - 퇴행성 신경계질환에 유효한 오공을 포함하는 복합약침의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 복합약침 - Google Patents

Abstract

본 발명은 퇴행성 신경질환에 유효한 오공을 포함하는 복합약침의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 복합약침에 관한 것이다.
구체적으로는 왕지네 겔을 제조하는 단계; 왕지네 겔 혼합액을 제조, 추출 및 농축하는 단계; 왕지네 겔 혼합액을 1차 파쇄 및 균질화하는 단계; 왕지네 겔 혼합액을 2차 파쇄하는 단계; 왕지네 겔 혼합액을 여과하는 단계; 및 왕지네 겔 혼합액에 추가 소재를 혼합하는 단계;를 포함하는 퇴행성 신경질환에 유효한 오공을 포함하는 복합약침의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 복합약침에 관한 것이다.
본 발명은 상기 왕지네 겔 혼합액에 추가 소재를 혼합하는 단계에서 추가 소재는 봉독, 태반 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하고 있다.
본 발명의 방법으로 제조된 퇴행성 신경질환에 유효한 오공을 포함하는 복합약침은 왕지네 함유 성분의 추출 효율이 높으며, 특히 알라닌 함유율이 높음으로써 독성 및 부작용이 낮은 효과를 보유하고 있다.

Description

퇴행성 신경계질환에 유효한 오공을 포함하는 복합약침의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 복합약침{A METHOD OF MAKING INJECTION LIQUID COMPRISING SCOLOPENDRA SUBSPINIPES FOR NEURODEGENERATIVE DISEASE, AND THE INJECTION LIQUID MADE BY THE METHOD}

본 발명은 퇴행성 신경계질환에 유효한 오공을 포함하는 복합약침의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 복합약침에 관한 것이다.

구체적으로는 왕지네 겔을 제조하는 단계; 왕지네 겔 혼합액을 제조, 추출 및 농축하는 단계; 왕지네 겔 혼합액을 1차 파쇄 및 균질화하는 단계; 왕지네 겔 혼합액을 2차 파쇄하는 단계; 왕지네 겔 혼합액을 여과하는 단계; 및 왕지네 겔 혼합액에 추가 소재를 혼합하는 단계;를 포함하는 퇴행성 신경질환에 유효한 오공을 포함하는 복합약침의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 복합약침에 관한 것이다.

본 발명은 상기 왕지네 겔 혼합액에 추가 소재를 혼합하는 단계에서 추가 소재는 봉독, 태반 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하고 있다.

본 발명은 상기 왕지네 겔 혼합액을 농축하는 단계에서 2 ~ 5시간 동안 60 ~ 80℃에서 로타리 바큠 이바포레이터(rotary vacuum evaporator)를 사용하여 감압농축하는 것을 기술적 특징으로 하고 있다.

본 발명은 상기 왕지네 겔 혼합액을 여과하는 단계에서 막 직경 8 um 와트만 여과지로 2번 여과한 후, 막 직경 0.4 um 멤브레인 필터, 엔도톡신제거용 필터 및 막 직경 0.2 um 멤브레인 필터를 사용하는 순서로 여과하는 것을 기술적 특징으로 하고 있다.

본 발명의 방법으로 제조된 퇴행성 신경질환에 유효한 오공을 포함하는 복합약침은 왕지네 함유 성분의 추출 효율이 높으며, 특히 알라닌 함유율이 높음으로써 독성 및 부작용이 낮은 효과를 보유하고 있다.

왕지네(Scolopendra subspinipes mutilans)는 절지동물문에 속하는 지네류의 한 종류로, 한방에서는 오공(蜈蚣), 토충(土蟲) 또는 천룡(天龍)이라 한다.

왕지네는 개미산, 콜레스테롤, 용혈성 단백질 및 히스타민 등의 성분을 보유하고 있으며, 파상풍으로 인한 근육 경련이나 중풍으로 인한 마비, 염증성 피부 질환, 화상 등에 약효가 있고, 항경련작용, 소염작용 및 억균작용 등의 효능을 보유하는 것으로 알려져 있다.

또한 왕지네는 퇴행성 신경계질환에 유효한 것으로 알려져 있어, 퇴행성 관절염, 디스크, 류마티스 관절염, 신경통 등에 사용되고 있다.

본 출원인은 루게릭 동물모델인 hSOD1G93A 형질전환 마우스에서 오공약침 투여시, 운동신경의 소실을 막고, 미세아교세포(microglia)와 성상세포(astrocytes)의 염증을 억제하며, 뇌간과 척수에서 항산화 작용을 보여 퇴행성 신경계질환에 치료제로 이용될 수 있음을 발표한바 있다.(MuDan Cai, Sun-Mi Choi, Bong Keun Song, Ilhong Son, Sungchul Kim and Eun Jin Yang. Scolopendra subspinipes mutilans attenuates neuroinflammation in symptomatic hSOD1G93A mice. Journal of Neuroinflammation 2013, 10:131.)

그러나 왕지네는 독성이 있어 섭취시 위장 점막을 자극하여 오심, 구토, 복통 또는 변혈 등이 발생할 수 있고, 홍반, 소양(가려움증) 등이 발생할 수 있다.

이러한 부작용을 줄이기 위해 왕지네의 독성을 완화하는 방법에는 생강을 얇게 썰어 용기에 담고 왕지네를 생강 위에 놓은 후 생강이 연소될 때까지 가열하는 것을 3회 반복하는 방법이 있다.

그러나 상기 방법은 연소된 생강에서 발암물질인 벤조피렌이 발생할 수 있으며, 상기 생강 위에 배치된 왕지네에도 벤조피렌이 포함될 수 있는 문제점이 있다.

또한 왕지네에 열이 가해지므로 단백질 성분이 주를 이루는 왕지네 성분이 변성되며, 그에 따라 왕지네의 약효가 감소할 확률이 높다.

한편, 봉독은 꿀벌(Apis mellifera)의 독으로, 기관지천식, 신경통, 관절염 및 자가면역질환 등에 약효가 있으며, 진통, 항염, 항균 및 신경계 조절 작용 등의 효능을 보유하는 것으로 알려져 있다.

그러나 봉독은 독성이 있어 피부 소양, 두통, 메스꺼움, 무력감, 기면(嗜眠), 호흡곤란 및 심장마비 등의 부작용이 발생할 수 있다.

그러나 봉독의 독성을 완화하는 효과적인 방법이 아직 연구되어 있지 않아 봉독 독성에 따른 부작용이 발생했을시 환자가 부작용을 위한 별도의 치료를 받아야하는 실정이다.

왕지네 또는 봉독은 근래에 약침으로도 가공되어 사용되고 있는데, 약침은 혈관을 통하여 직접 약액이 투여되므로 복용, 도포 등 기타 투여 방식에 비하여 체내 흡수율이 높고 약효가 빠르게 나타난다는 장점이 있다.

그러나 왕지네 및 봉독은 모두 독성 물질이므로, 상기 왕지네 및 봉독을 약침으로 체내에 투여되었을 때 독성으로 인한 부작용이 나타날 수 있다.

따라서 독성을 감소시켜 부작용을 최소화한 왕지네 또는 봉독의 약침의 제조 방법이 절실하다 하겠다.

한편 ≪신농본초경≫에 따르면 "오공미신온(蜈蚣味辛溫), 주귀주고독(主鬼注蠱毒), 감제사충어독(敢諸蛇蟲魚毒), 살귀물노정온학(殺鬼物老精溫虐), 거삼충(去三蟲)."이라고 하여, 왕지네(오공)가 사독(뱀의 독), 충독(벌레의 독; 봉독 등), 어독(어류의 독; 복어독 등)에 중독되었을 때, 공독산결(사기(邪氣)를 제거하고 뭉친 것을 푸는 효능)하여 독성을 제거하는 해독제로 사용된다고 나타나있다.

≪본초강목≫에는 "왕지네(오공)를 사용할 때 불에 구워 머리와 발을 버리고 쓰거나 꼬리와 다리를 제거하고 박하엽에 싸서 구워 쓴다."고 하였다. 이는 독성을 갖는 성분이 왕지네의 머리, 다리 및 꼬리에 많이 포함되어 있기 때문에 이를 제거함으로써 독성을 줄이는 것이다.

이에 본 출원인은 왕지네와 봉독을 함께 유효성분으로 포함함으로써, 봉독의 유해한 독성을 왕지네가 해독하고, 왕지네의 머리, 다리 및 꼬리부분을 제거하여 사용함으로써 독성이 감소한 복합약침의 제조방법을 안출하였다.

한편 태반은 태아와 모체의 자궁벽을 연결하여 영양 공급, 가스교환, 노폐물 배출 등의 기능을 담당하는 기관으로, 한의학에서는 자하거(紫何車, Hominis placenta)라 하여 혈기가 쇠약하거나 간질, 정신이 몽롱한 증상 등에 효능이 있다고 알려져 있다.

또한 태반은 골관절염 등 만성 염증질환을 치료하는데 사용되어 왔으나, 효과 기전에 대해서는 자세하게 알려진 것이 없었다.

본 출원인은 LPS로 유발된 신경 염증에서 태반 약침 주입시, 미세아교세포(microglia)의 세포사멸이 감소하였으며, LPS 연관 활성 및 p42/44MAP kinase(ERK) 발현이 감소하고, iNOS와 COX-2 염증 단백질의 발현이 억제되었다는 실험 결과를 발표한바 있다.(Kang-Woo Lee, Hye Min Ji, Dong Woung Kim, Sun-Mi Choi, Sungchul Kim, Eun Jin Yang. Effects of Hominis placenta on LPS-induced cell toxicity in BV2 microglial cells. J Ethnopharmacol. 2013 May 20;147(2):286-292.)

따라서 태반 약침이 MAPK 신호 억제를 통한 신경보호작용과 신경독소에 대한 항염증 작용으로 신경 퇴행성 질환의 치료제로 사용될 수 있음을 확인하였으며, 이에 본 출원인은 상기 태반 약침과 오공을 결합한 복합약침을 제조함으로써, 본 발명을 완성하였다.

한편, 본 발명과 연관된 선행문헌을 살펴보면, 대한민국 등록특허공보 제10-1418881호 '면역증강, 염증치료 및 통증치료용 수지봉독과 이를 이용한 비경구 투여용 조성물 및 그 제조방법'이 있다.

위 선행문헌은 봉독을 수용성 용매와 지용성 용매를 이용하여 분별하고, 필터링, 혼합, 농축 및 건조하는 단계를 포함하여 이루어지는 수지봉독 조성물의 제조방법에 대하여 기재되어 있다.

그러나 위 선행문헌은 수지봉독 조성물이 접안 또는 비강투여 방식으로 투여되어, 통증부위에 직접 약침으로 투여하는 것보다 빠른 효과를 기대할 수 없다는 문제점이 있다.

또한 봉독의 독성을 제거하는 내용이 없어, 독성으로 인한 부작용이 유발될 수 있는 문제점이 있다.

대한민국 등록특허공보 제10-1399056호에는 '줄기세포-유래 미세소포체를 유효성분으로 포함하는 신경질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물'이 있다.

위 선행문헌은 간엽 줄기세포-유래 미세소포체를 유효성분으로 포함하는 신경 손상(neural injury), 신경 퇴행성 질환 및 허혈 또는 재관류에 의한 신경질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 신경질환(neural disease)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것으로, 상기 간엽 줄기세포의 한 유래로 태반을 이용한다.

위 선행문헌에 따른 약제학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 예를 들어 피하주입, 근육 주입, 경피 투여, 관절강내 주사, 척수강내 주사, 정맥주사, 뇌내 주사 등으로 투여할 수 있다.

또한 대한민국 공개특허공보 제10-2005-0007996호에는 글루코사민, 글루타민, 대두 추출물, 맥주 효모, 사상자 추출물, 원지 추출물, 백하수오 추출물로 구성된 그룹에서 적어도 2종 이상의 유효성분으로 구성되는 관절염 치료 조성물을 함유한 주사용 제제에 관하여 기재되어 있으며, 대한민국 공개특허공보 제10-2011-0019977호에는 힐초근 및 연자육을 유효성분으로 함유한 약침에 관하여 기재되어 있다.

그러나, 상기 선행문헌들은 약침으로 제조하였을 때, 현저한 효능이 나타나도록 하는 유효성분의 함량과, 소재의 독성을 줄이기 위한 공정을 알 수 없어, 약침 투여시 부작용이 일어날 수 있는 문제점이 있다.

대한민국 등록특허공보 제10-1418881호 (2014. 07. 07) 대한민국 등록특허공보 제10-1399056호 (2014. 05. 19) 대한민국 공개특허공보 제10-2005-0007996호 (2005. 01. 21) 대한민국 공개특허공보 제10-2011-0019977호 (2011. 03. 02)

MuDan Cai, Sun-Mi Choi, Bong Keun Song, Ilhong Son, Sungchul Kim and Eun Jin Yang. Scolopendra subspinipes mutilans attenuates neuroinflammation in symptomatic hSOD1G93A mice. Journal of Neuroinflammation 2013, 10:131. Kang-Woo Lee, Hye Min Ji, Dong Woung Kim, Sun-Mi Choi, Sungchul Kim, Eun Jin Yang. Effects of Hominis placenta on LPS-induced cell toxicity in BV2 microglial cells. J Ethnopharmacol. 2013 May 20;147(2):286-292.

본 발명의 목적은 왕지네 성분의 추출 효율이 높은 효과 및 알라닌 함유율이 높음으로써 독성 및 부작용이 낮은 효과를 보유한, 퇴행성 신경계질환에 유효한 오공을 포함하는 복합약침의 제조방법 및 상기 방법을 이용하여 제조된 복합약침을 제공하는데에 있다.

본 발명은 왕지네 겔을 제조하는 단계; 왕지네 겔 혼합액을 제조, 추출 및 농축하는 단계; 왕지네 겔 혼합액을 1차 파쇄 및 균질화하는 단계; 왕지네 겔 혼합액을 2차 파쇄하는 단계; 왕지네 겔 혼합액을 여과하는 단계; 및 왕지네 겔 혼합액에 추가 소재를 혼합하는 단계;를 포함하는, 퇴행성 신경계질환에 유효한 오공을 포함하는 복합약침의 제조방법 및 상기 방법을 이용하여 제조된 복합약침을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.

본 발명에 따른 방법으로 제조된 퇴행성 신경계질환에 유효한 오공을 포함하는 복합약침은 왕지네 성분의 추출 효율이 높은 효과 및 알라닌 함유율이 높아 독성 및 부작용이 낮은 효과를 보유하고 있으며, 근골격계 질환, 통증, 신경계통 질환 및 운동신경원질환, 근육영양장애, 샤르코마리투스 등 희귀난치성 신경근육질환을 치료하는 데에 사용될 수 있다.

도 1은 왕지네 겔을 제조하는 방법을 시계열적으로 나타낸 플로우 차트이다.
도 2는 오공을 유효성분으로 포함하는 복합약침의 제조방법을 시계열적으로 나타낸 플로우 차트이다.
도 3은 유기용매와 무기용매의 조성비를 4:6으로 설정하여 왕지네를 추출한 후, 15 ~ 30분 초음파파쇄하여 제조한 왕지네 겔 샘플 1의 성분을 분석한 표이다.
도 4는 유기용매와 무기용매의 조성비를 4:6으로 설정하여 왕지네를 추출한 후, 30 ~ 60분 초음파파쇄하여 제조한 왕지네 겔 샘플 2의 성분을 분석한 표이다.
도 5는 유기용매와 무기용매의 조성비를 3:7로 설정하여 왕지네를 추출한 후, 30 ~ 60분 초음파파쇄하여 제조한 왕지네 겔 샘플 3의 성분을 분석한 표이다.
도 6은 기존의 알코올 추출 방법으로 제조한 왕지네 추출물의 성분을 분석한 표이다.

본 명세서 및 청구 범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 안 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

따라서 본 명세서에 기재된 실시예, 참조예 및 도면에 기술된 사항은 본 발명의 가장 바람직한 일 예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

본 발명에 따른 복합약침의 제조방법은 오공을 유효성분으로 함유하되, 추가 소재로 봉독, 태반 또는 이들의 혼합물을 채용하여 복합약침을 제조한다.

도 1은 왕지네 겔을 제조하는 방법을 시계열적으로 나타낸 플로우 차트이며, 도 2는 오공을 유효성분으로 함유하는 복합약침의 제조방법을 시계열적으로 나타낸 플로우 차트이다.

실시예 1. 왕지네 및 봉독을 유효성분으로 함유하는 복합약침의 제조

(1) 왕지네 겔을 제조하는 단계

① 왕지네를 분쇄하는 단계

왕지네를 분쇄한다. 이 때 왕지네는 독성 성분이 많이 포함된 발과 머리 및 꼬리를 제거한 것을 사용할 수 있다.

왕지네는 크러셔 내벽에 반발판을 설치하여 타격 반발을 반복하는 방법으로 분쇄될 수 있으며, 크러셔 하부에 추가적으로 스크린 또는 그리드를 설치하여 분급할 수도 있다.

또는 터보밀, 슈퍼미크론밀, 포트밀, 튜브밀, 코니칼밀, 제트분쇄기, 디스크밀, 핀 밀, 스탬프밀, 슈레더, 해머밀, 해머 크러셔, 콘 크러셔, 조 크러셔, 커터밀, 에지런너, 롤러밀, 레이몬드밀 및 터보미크론 밀 또는 제트밀 등을 사용할도 수 있다.

② 유기용매 및 무기용매를 사용하여 왕지네를 추출하는 단계

유기용매 및 무기용매를 사용하여 왕지네 추출물을 제조한다.

왕지네 추출물을 제조하기 전후 단계에 세척, 탈수, 건조 또는 살균 등의 공정을 수행할 수 있으며, 각 공정의 순서는 설계에 따라 변동될 수 있다.

유기용매 및 무기용매를 사용하여 왕지네 추출물을 제조하는 단계는, 다양한 극성을 보유한 용매를 사용하여 왕지네 내 아미노산의 추출 효율성을 높이기 위하여 사용되었다.

왕지네의 추출은 유기용매 및 무기용매를 사용한 진공감압추출법을 사용하여 수행된다.

조건에 따라 이산화탄소 초임계 추출법, 수증기 증류법, 진공추출법, 감압추출법, 마이크로 웨이브 공정 추출법, 퍼콜레이션 추출법 등의 다양한 추출 방법이 사용될 수 있다.

진공감압추출법은 60 ~ 70℃에서 3 ~ 7시간 가수분해 교반되는 것으로 설정되며, 조건에 따라 온도와 시간이 다양하게 설정될 수 있다.

추출에 사용되는 유기용매는 에탄올, 메탄올, 지방유, 글리세린, 마유, 플로필렌글리콜, 에테르, 클로르포름, 석유에테르, 헥산, 벤젠, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 아세톤, 부탄올 및 이소프로판올 등에서 선택될 수 있으며, 추출에 사용되는 무기용매는 물, 액체암모니아, 삼염화안티몬 및 불화수소 등에서 선택될 수 있다.

유기용매 및 무기용매의 배합비는 3:7 ~ 4:6으로 조성되며 조건에 따라 다양하게 설정될 수 있다.

또한, 분배계수가 다른 2가지 이상의 용매를 동시에 사용하여 추출할 수도 있으며, 2가지 이상의 용매를 사용하여 2차 이상 추출할 수 있다.

추출 시간 역시 달라질 수 있으며, 2가지 이상의 추출 방법을 사용하여 2차 이상 추출할 수 있다.

③ 왕지네 추출물을 균질화하는 단계

왕지네 추출물을 균질화한다.

왕지네 추출물을 균질화할시 고속 호모게나이져를 사용하며, 조건에 따라 기계적 분산 및 계면 활성제를 가하여 유화 분산하는 방법 등을 사용할 수 있다.

고속 호모게나이져의 조건은 다양하게 설정될 수 있다.

④ 왕지네 추출물을 초음파파쇄하는 단계

왕지네 추출물을 초음파파쇄한다.

초음파파쇄 시간은 15 ~ 60분 동안 수행되며, 역시 조건에 따라 다양하게 설정될 수 있다.

초음파파쇄기는 초음파 특유의 공동 효과(cavitation)로 인하여 분자운동을 유발시키며, 상기 분자 운동이 활성화 에너지로 작용하여 추출, 농축 등의 공정 수행시 반응성을 향상시키는 효과를 보유하고 있으며, 단백질 생산 공정에도 도입되어 온 기기로써, 초음파파쇄기를 사용하여 시료를 파쇄하면 시료 내에 함유된 단백질의 생성률이 증진될 수 있다.

상기와 같은 초음파파쇄기의 특성을 이용하여 왕지네 성분을 효율적으로 추출하기 위하여 왕지네 추출물의 초음파파쇄를 수행한다.

왕지네 추출물의 파쇄 방법에는 조건에 따라 터보밀, 슈퍼미크론밀, 포트밀, 튜브밀, 코니칼밀, 제트분쇄기, 디스크밀, 핀 밀, 스탬프밀, 슈레더, 해머밀, 해머 크러셔, 콘 크러셔, 조 크러셔, 커터밀, 에지런너, 롤러밀, 레이몬드밀 및 터보미크론 밀 또는 제트밀 등 다양한 방법이 사용될 수 있다.

왕지네를 분쇄하는 단계, 유기용매 및 무기용매를 사용하여 오공을 추출하는 단계, 왕지네 추출물을 균질화하는 단계 및 왕지네 추출물을 초음파 파쇄하는 단계는 복수 회 수행될 수 있으며, 상기 단계들을 모두 수행한 후 소금 및/또는 산을 첨가할 수 있다. 산은 인산, 탄산, 아세트산, 구연산 및 붕산 등에서 1종 이상 선택될 수 있다.

또한 소금 및/또는 산의 중량비는 다양하게 설정될 수 있다.

(2) 왕지네 겔 혼합액을 제조하는 단계

왕지네 겔, 주사용수 및 알코올을 혼합하여 왕지네 겔 혼합액을 제조한다.

이 때 왕지네 겔과 주사용수의 조성비는 1 : 1000으로 조정되며, 왕지네 겔과 주사용수를 혼합한 액 1 중량부에 알코올 7 ~ 9 중량부를 혼합하여 오공교 혼합액 내의 알코올 비율이 70 ~ 90%가 되도록 할 수 있다.

상기 비율은 조건에 따라 다양하게 설정될 수 있다.

설계 조건에 따라, 교반기를 사용하여 왕지네 겔 혼합액을 교반할 수 있으며, 교반 시간은 2 ~ 4시간 수행된다. 교반 시간은 조건에 따라 다양하게 수행될 수 있다.

(3) 왕지네 겔 혼합액을 추출하는 단계

왕지네 겔 혼합액을 추출한다.

왕지네 겔 혼합액을 추출시 디컴프레셔를 이용한 감압추출이 수행되며, 조건에 따라 용매 추출법, 이산화탄소 초임계 추출법, 수증기 증류법, 진공추출법, 감압추출법, 마이크로 웨이브 공정 추출법, 퍼콜레이션 추출법 등의 다양한 추출 방법이 사용될 수 있다.

(4) 왕지네 겔 혼합액을 농축하는 단계

왕지네 겔 혼합액을 농축한다.

왕지네 겔 혼합액의 농축시 감압 농축법을 사용하며, 조건에 따라 증발 농축, 동결 농축, 건조 농축, 막 농축, 진공 농축 및 감압 농축 등의 다양한 방법이 사용될 수 있다.

농축 조건은 50 ~ 80℃에서 2 ~ 5시간 로타리 바큠 이바포레이터(rotary vacuum evaporator)를 사용하여 수행되며, 조건에 따라 다양하게 설정될 수 있다.

또한, 2가지 이상의 농축 방법을 사용하여 2차 이상 농축할 수 있다.

왕지네 겔 혼합액을 감압 농축함으로써, 왕지네 겔 혼합액을 주사용수와 혼합하는 단계에서 첨가된 알코올이 끓는점의 차이에 의한 추출법으로 증발되고 농축된 왕지네 겔 혼합액이 남게 된다.

(5) 왕지네 겔 혼합액을 1차 파쇄 및 균질화하는 단계

왕지네 겔 혼합액을 1차 파쇄 및 균질화한다.

왕지네 겔 혼합액을 1차 파쇄 및 균질화하는 단계는 왕지네 겔 혼합액 내의 왕지네 세포벽을 파쇄하여 성분을 효율적으로 수득하기 위하여 수행되었다.

왕지네 겔 혼합액의 파쇄시 고속 호모게나이져를 사용하며, 조건에 따라 커터밀, 슈레더, 해머밀, 에지런너, 롤러밀, 레이몬드밀 및 터보미크론 밀 등의 기계를 사용하여 자동으로 파쇄하는 방법과, 막자 및 막자 사발 등을 사용하여 수동으로 파쇄하는 방법을 사용할 수 있다.

또한 호모게나이져의 조건을 15,000 ~ 19,000 rpm으로 5 ~ 15분간 설정할 수 있으며, 조건에 따라 다양하게 설정할 수 있다.

(6) 왕지네 겔 혼합액을 2차 파쇄하는 단계

왕지네 겔 혼합액의 pH를 조절한 후 2차 파쇄한다.

왕지네 겔 혼합액의 2차 파쇄 역시 왕지네 겔 혼합액 내의 왕지네 세포벽을 2차 파쇄하여 성분을 더욱 효율적으로 수득하기 위하여 수행되었다.

왕지네 겔 혼합액을 2차 파쇄할시 1N NaOH 및 1N HCl를 용매로 사용하여 오공교 혼합 농축액의 pH를 6.8 ~7.2로 조절한 후, 초음파파쇄기를 사용하여 파쇄한다.

오공교 혼합 농축액의 pH를 중성으로 조절하여, 체내에 주입하였을시의 안전성을 위하여 pH를 6.8 ~ 7.2로 조절한다.

또한 초음파파쇄기의 사용 조건을 20 ~ 65℃에서 20 ~ 40분 동안 초음파 10 ~ 130 kHz 펄스(pulse)를 7 ~ 11초간 주입하고 1 ~ 5초간 휴지하는 것을 복수 회 수행하는 것으로 설정하며, 조건에 따라 커터밀, 슈레더, 해머밀, 에지런너, 롤러밀, 레이몬드밀 및 터보미크론 밀 등의 기계를 사용하여 자동으로 파쇄하는 방법과, 막자 및 막자 사발 등을 사용하여 수동으로 파쇄하는 방법 등 다양한 방법을 사용할 수 있다.

(7) 왕지네 겔 혼합액을 여과하는 단계

왕지네 겔 혼합액을 여과한다.

왕지네 겔 혼합액의 여과는 막 직경 8 um 와트만 여과지로 2번 여과한 후, 막 직경 0.4 um 멤브레인 필터, 엔도톡신제거용 필터 및 막 직경 0.2 um 멤브레인 필터를 여과하여 수행되며, 조건에 따라 크로마토크래피, 감압 여과 및 흡인 여과 등 다양한 방법이 사용될 수 있다.

이때 여과는 직경이 점차 작은 필터를 통하여 왕지네 겔 혼합액에 남아있는 큰 크기의 파쇄물들을 제거하며, 미세한 입자들만 남게 해 약침이 체내에 투입되었을 때 흡수가 용이하도록 한다.

또한 엔도톡신 제거용 필터를 이용하여 독성물질을 제거함으로써, 부작용을 일으키지 않는 복합약침을 제조할 수 있다.

필요에 따라 멸균 또는 살균 등의 과정이 각 단계 수행 전후에 수행될 수 있다. 멸균 또는 살균이 수행되는 횟수는 제한되지 않는다.

왕지네 겔 혼합액 멸균시 100 ~ 140℃, 10 ~ 20lb psi 압력 단위에서 10 ~ 20분간 고온고압멸균기를 사용하며, 조건에 따라 저온멸균 및 화염멸균 등 다양한 방법이 사용될 수 있다.

(8) 왕지네 겔 혼합액에 봉독 및 생리식염수를 혼합하는 단계

왕지네 겔 혼합액, 봉독 및 생리식염수를 혼합하여 복합약침을 제조한다.

이때 봉독은 4000 : 1로 희석되어 0.0025 g 10 cc 혼합되며, 왕지네 겔은 0.05 g 10 cc 혼합되고, 생리식염수는 100 cc 혼합된다.

봉독은 1000 : 1로 증량하여 0.01 g까지 증량될 수 있으며, 왕지네 겔은 0.2 g까지 증량될 수 있다.

또한 왕지네 겔 혼합액에 혼합되는 봉독은 핀셋을 이용하는 방법, 유리관을 이용하는 방법 및 전극을 이용하는 방법 등 다양한 방법으로 채취될 수 있다.

핀셋을 이용하는 방법은 핀셋에 얇은 고무판을 끼우고 꿀벌의 가슴 부분을 집을 때 벌이 분비하는 독액을 모세 피펫, 솜, 여지, 재물유리 및 덮개유리 등에 채취하는 것이다.

유리관을 이용하는 방법은 벌을 유리관에 넣고 에테르로 마취시켜 독액을 분비하게 한 후, 유리관을 물로 세척하여 상기 세척한 물을 거르고 투석하여 건조하는 것이다.

전극을 이용하는 방법은 유리판 위에 얇은 고무막을 씌우고 그 위에 2 ~ 3 cm 간격으로 구리줄을 설치한 장치를 벌통 안에 넣은 후, 벌들이 상기 장치에 모였을 때 3 ~ 6 V의 전류를 3 ~ 5초 간격으로 통과시키는 방법으로 벌들을 감전시켜 독액을 분비하게 하는 것이다.

실시예 2. 왕지네 및 태반을 유효성분으로 함유하는 복합약침의 제조

(1) 왕지네 겔을 제조하는 단계; (2) 왕지네 겔 혼합액을 제조하는 단계; (3) 왕지네 겔 혼합액을 추출하는 단계; (4) 왕지네 겔 혼합액을 농축하는 단계; (5) 왕지네 겔 혼합액을 1차 파쇄 및 균질화하는 단계; (6) 왕지네 겔 혼합액을 2차 파쇄하는 단계; 및 (7) 왕지네 겔 혼합액을 여과하는 단계는 상기 실시예 1의 제조방법과 동일한 과정으로 수행되었다.

(8) 왕지네 겔 혼합액에 태반을 혼합하는 단계

왕지네 겔 혼합액과 태반을 혼합하여 복합약침을 제조한다.

태반은 산가수분해 추출법으로 제조된 대한 약침학회의 자하거 약침액을 사용할 수 있다.

또는 태반을 효소를 이용하여 가수분해하거나, 산 또는 알칼리로 가수분해하는 방법으로 얻어진 태반 추출물을 이용할 수도 있다.

왕지네 겔 혼합액과 태반의 혼합 비율은, 왕지네 겔 혼합액 1 중량부 기준으로 태반 0.1 ~ 100 중량부 혼합될 수 있다.

실시예 3. 왕지네, 봉독 및 태반을 유효성분으로 함유하는 복합약침의 제조

(1) 왕지네 겔을 제조하는 단계; (2) 왕지네 겔 혼합액을 제조하는 단계; (3) 왕지네 겔 혼합액을 추출하는 단계; (4) 왕지네 겔 혼합액을 농축하는 단계; (5) 왕지네 겔 혼합액을 1차 파쇄 및 균질화하는 단계; (6) 왕지네 겔 혼합액을 2차 파쇄하는 단계; 및 (7) 왕지네 겔 혼합액을 여과하는 단계는 상기 실시예 1의 제조방법과 동일한 과정으로 수행되었다.

(8) 왕지네 겔 혼합액에 봉독 및 태반을 혼합하는 단계

왕지네 겔 혼합액과 봉독 및 태반을 혼합하여 복합약침을 제조한다.

봉독과 태반은 상기 실시예 1 및 2에 기재된 방법으로 얻은 것을 이용할 수 있다.

왕지네 겔 혼합액과 봉독 및 태반의 혼합 비율은, 왕지네 겔 혼합액 1 중량부 기준으로 봉독 0.1 ~ 100 중량부 및 태반 0.1 ~ 100 중량부 혼합될 수 있다.

실험예 1. 왕지네 겔 제조방법에 따른 성분 비교

본 실험예 1은 실시예 1에 기재된 과정으로 제조된 시료를 사용하여 수행하였다.

(1) 실험 과정

① 유기용매와 무기용매의 조성비를 각각 달리하고, 초음파파쇄를 수행하는 시간을 각각 달리한 왕지네 겔 시료를 3군 준비하고, 기존의 알코올추출 방법으로 추출한 왕지네 추출물 시료를 1군 준비하여 30 ul씩 건조하였다.

유기용매와 무기용매의 조성비 및 초음파파쇄 수행 시간 설정 시간에 따른 각 군의 분류는 다음과 같다.

샘플 번호	유기용매 중량비	무기용매 중량비	초음파 파쇄 시간(분)
1	4	6	15 ~ 30
2	4	6	30 ~ 60
3	3	7	30 ~ 60

② MeOH, H₂0, TEA 및 PITC(phenylisothiocyanate)를 혼합한 용액 20 ul씩을 시료에 주입하고 상온에서 30분간 반응시켜 유도체화하였다.

③ 시료를 건조시킨 후, 건조된 시료를 NaHAc, TEA, EDTA 및 CH3CN을 혼합하여 제조한 용매 200 ul 에 용해하였다.

④ 용해된 시료를 0.45μm 필터로 여과한 후, 미량원심분리(mircocentrifuge) 하였다.

⑤ 미량원심분리한 시료 상층액을 채취하여 HPLC의 오토샘플러(autosampler)에 안치한 후, HPLC를 수행하였다.

(2) 실험 결과

도 3은 유기용매와 무기용매의 조성비를 4:6으로 설정하여 왕지네를 추출한 후, 15 ~ 30분 초음파파쇄하여 제조한 왕지네 겔 샘플 1의 성분을 분석한 표이다.

도 4는 유기용매와 무기용매의 조성비를 4:6으로 설정하여 왕지네를 추출한 후, 30 ~ 60분 초음파파쇄하여 제조한 왕지네 겔 샘플 2의 성분을 분석한 표이다.

도 5는 유기용매와 무기용매의 조성비를 3:7로 설정하여 왕지네를 추출한 후, 30 ~ 60분 초음파파쇄하여 제조한 왕지네 겔 샘플 3의 성분을 분석한 표이다.

도 6은 기존의 알코올 추출 방법으로 제조한 왕지네 추출물의 성분을 분석한 표이다.

기존 왕지네 추출물의 분석 결과를 나타낸 도 6을 살펴본 결과, 기존의 알코올 추출 방법으로 제조한 왕지네 추출물의 총 영양 성분 함량은 8384.99 nmol/mL이었으나, 본 발명에 따른 왕지네 겔 제조방법으로 제조되어 용매의 조성비를 조정하고 파쇄시간을 달리하여 각각 제조한 왕지네 겔은 상기 왕지네 추출물보다 총 영양 성분 함량이 높았다.

본 발명에 따른 왕지네 겔 제조방법으로 제조한 왕지네 겔의 총 영양 성분 함량은 샘플 1의 분석 결과를 나타낸 도 3을 살펴본 결과 27291.32 nmol/mL였고, 샘플 2의 분석 결과를 나타낸 도 4를 살펴본 결과 22672.43 nmol/mL였으며, 샘플 3의 분석 결과를 나타낸 도 5를 살펴본 결과 30449.79 nmol/mL로 나타났다. 기존의 방법으로 제조한 왕지네 추출물 총 영양 성분 함량의 약 3배에 달하는 것을 관찰할 수 있었다.

한편 왕지네에 함유된 알라닌(Alanin)은 아미노산의 일종으로, 간 대사를 촉진하여 유해물질을 무독화하고, 간 내 모세혈관으로부터 간으로 질소를 운반하여 무독화하는 역할을 하는 단백질이다. 따라서 알라닌의 함량을 증진하면 독성 및 부작용을 완화시킬 수 있다.

알라닌 함량을 살펴보면, 기존 왕지네 추출물의 분석 결과를 나타낸 도6을 살펴본 결과 알라닌 함량이 1584.70 nmol/mL였으나, 본 발명에 따른 왕지네 겔 제조방법으로 제조된 왕지네 겔의 알라닌 함량은 샘플 1의 분석 결과를 나타낸 도 3을 살펴본 결과 5890.33 nmol/mL였고, 샘플 2의 분석 결과를 나타낸 도 4를 살펴본 결과 6074.17 nmol/mL였으며, 샘플 3의 분석 결과를 나타낸 도 5를 살펴본 결과 6383.95 nmol/mL로, 기존의 방법으로 제조한 왕지네 추출물 알라닌 함량의 약 3 ~ 4배에 달하는 것을 관찰할 수 있었다.

상기 살펴본 바와 같이 왕지네 겔의 총 영양 성분 함량 및 알라닌 함량이 기존의 알코올 추출 방법으로 제조한 왕지네 추출물에 비해 현저히 높은 것을 알 수 있으며, 이로써 본 발명에 따른 오공을 포함하는 복합약침의 총 영양 성분 함량 및 알라닌 함량이 현저히 높다는 결론을 도출할 수 있다.

Claims (5)

1. 왕지네 겔을 제조하는 단계; 왕지네 겔 혼합액을 제조, 추출 및 농축하는 단계; 왕지네 겔 혼합액을 1차 파쇄 및 균질화하는 단계; 왕지네 겔 혼합액을 2차 파쇄하는 단계; 왕지네 겔 혼합액을 여과하는 단계; 및 왕지네 겔 혼합액에 추가 소재를 혼합하는 단계;를 포함하되,
   상기 왕지네 겔을 제조하는 단계는, 왕지네를 분쇄하는 단계; 유기용매 및 무기용매를 사용하여 왕지네를 추출하는 단계; 왕지네 추출물을 균질화하는 단계; 및 왕지네 추출물을 초음파파쇄하는 단계를 포함하고,
   상기 왕지네 겔 혼합액은 왕지네 겔, 주사용수 및 알코올 혼합한 것이며,
   상기 추가소재는, 봉독, 태반 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 복합약침의 제조방법.
   
2. 삭제
3. 청구항 1에 있어서,
   상기 왕지네 겔 혼합액을 농축하는 것은 2 ~ 5시간 동안 60 ~ 80℃에서 로타리 바큠 이바포레이터(rotary vacuum evaporator)를 사용하여 감압농축하는 것을 특징으로 하는 복합약침의 제조방법.
   
4. 삭제
5. 청구항 1 또는 3에 기재된 방법으로 제조된 복합약침.

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