KR20130054426A - 시뉴클레인 병증 및 아밀로이드 생성 질환의 예방 및 치료법 - Google Patents

시뉴클레인 병증 및 아밀로이드 생성 질환의 예방 및 치료법 Download PDF

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마누엘 제이. 버티니
타미 제이. 칠코트
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케이트 도라 게임스
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더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
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Abstract

본 발명은 환자의 뇌에 존재하는 알파-시뉴클레인의 루이체를 포함하는 시뉴클레인 병증 질환 치료용의 개선된 제제 및 방법을 제공한다. 이러한 방법은 루이체에 대하여 유리한 면역원성 반응을 유도하는 제제를 투여하는 것을 포함한다. 본 방법은 특히 파킨슨병의 예방 및 치료 방법에 유용하다.

Description

시뉴클레인 병증 및 아밀로이드 생성 질환의 예방 및 치료법{PREVENTION AND TREATMENT OF SYNUCLEINOPATHIC AND AMYLOIDOGENIC DISEASE}
관련 출원에 관한 상호 참조 문헌
본 출원은 2003년 10월 31일자 출원된 출원 번호 제10/699,517호 및 2003년 10월 31일자 출원된 동 제10/698,099호 출원[이 두 출원은 2002년 11월 1일자 출원된 출원 번호 제60/423,012호의 35 U.S.C. §119(e)하 이익을 주장함]의 부분 계속 출원인, 2004년 8월 9일자 출원된 출원 번호 제10/915,214호 출원의 부분 계속 출원인, 2005년 7월 19일자 출원된 출원 번호 제11/185907호의 부분 계속 출원이다. 상기 출원들은 본원에 모든 목적의 참고 문헌으로서 인용되어 있다.
알파-시뉴클레인(알파 SN) 뇌 병상은 몇몇 신경 퇴행성 질환 예를 들어, 파킨슨병(PD), 루이체 생성 치매(DLB), 변형 루이체 생성 알츠하이머병(LBVAD), 다계통 위축증(MSA) 및 제1형 뇌 철분 축적 신경 퇴행증(NBIA-1)의 대표적인 특징이다. 상기 질환들 모두에 공통된 시뉴클레인 병증(synucleinopathy)이란, 알파 SN을 주성분으로 하며, 아교 세포 및 뉴런 내에 생성되는 불용성 단백 봉입체(proteinaceous insoluble inclusion)가 생성되는 경우를 말한다.
루이체(Lewy body) 및 루이 신경 돌기(Lewy neurite)는 알파 SN을 주성분으로 하는 뉴런 내 봉입체(intraneuronal inclusion)이다. 루이체 및 루이 신경 돌기는 파킨슨병(PD)의 신경 병리학적 특징이다. PD 및 기타 시뉴클레인 병증 질환을 통틀어서 루이체 질환(LSD)이라 칭한다. LSD는 도파민계 퇴행, 운동 신경의 변형, 인지 손상 및 루이체(LB) 형성을 특징으로 한다[McKeith외 다수, Clinical and pathological diagnosis of dementia with Lewy bodies (DLB): Report of the CDLB International Workshop, Neurology (1996) 47:1113-24]. 기타 LBD로서는 확산성 루이체 질환(DLBD), 변형 루이체 생성 알츠하이머병(LBVAD), PD 및 알츠하이머병(AD)의 동시 발생 및 다계통 위축증을 포함한다. 루이체 생성 치매(DLB)는 LBD의 용어상의 차이점을 일치시키기 위해서 통합 사용되는 용어이다.
LB를 수반하는 질환은 노령 인구에 있어서 운동 장애 및 인지 장애를 일으키는 주요 원인이 되고 있다[Galasko외 다수, Clinical-neuropathological correlations in Alzheimer's disease and related dementias. Arch. Neurol. (1994) 51:888-95]. 비록 이러한 질환이 오늘날까지 계속 발생하여 그 발생률이 증가함으로 인해 공중 보건상 심각한 문제를 초래하고 있으며, 현재 치료 가능하지도 예방 가능하지도 않지만, PD의 원인과 병인을 이해하는 것은 새로운 치료법의 개발에 매우 중요한 부분을 차지한다[Tanner외 다수, Epidemiology of Parkinson's disease and akinetic syndromes, Curr. Opin. Neurol. (2000) 13:427-30]. PD의 원인에 관하여는 계속 논쟁중에 있으며, 여러 가지 요인들 예를 들어, 다양한 신경 독소 및 유전적 감수성 요인이 발병 원인 중 하나로서 지목되고 있다.
최근 들어, PD에 대한 병인의 이해에 있어서 새로운 희망이 생겨났다. 구체적으로 말하면, 몇몇 연구를 통하여 시냅스 단백질인 알파-SN이 PD 발병에 중심 역할을 하는 것으로 밝혀졌는데, 그 근거로는 (1) 상기 단백질이 LB로서 축적되는 것[Spillantini외 다수, Nature (1997) 388:839-40; Takedsi외 다수, AM. J. Pathol. (1998) 152:367-72; Wakabayashi외 다수, Neurosci. Lett. (1997) 239:45-8]; (2) 파킨슨증의 희귀 가족형과 알파-SN 유전자의 동시 분리에 있어서의 돌연 변이[Kruger외 다수, Nature Gen. (1998) 18:106-8; Polymeropoulos MH외 다수, Science (1997) 276:2045-7]; 및 (3) PD의 몇몇 병리학적 측면을 모의하는 트랜스제닉 마우스(transgenic mouse)[Masliah외 다수, Science (2000) 287:1265-9] 및 드로소필라(Drosophila)[Feany외 다수, Nature (2000) 404:394-8]에 있어서 상기 단백질의 과발현을 들고 있다. 그러므로, 뇌에 알파-SN이 축적되는 것은, 사람, 마우스 및 파리와 같이 여러 종에서 일어나는 유사한 형태학적 및 신경학적 변형과 관련되어 있으며, 이는 곧, 이 단백질 분자가 PD의 진행에 기여한다는 것을 시사하는 것이다.
AD 아밀로이드 플라크(AD amyloid plaque)를 구성하는 것으로 이미 규명되어 있는 알파-SN 단편을 AD 아밀로이드의 비-아밀로이드-베타(비-Aβ) 성분(NAC)이라고 명명하였다[Iwai A., Biochim. Biophys. Acta (2000) 1502:95-109); Masliah외 다수, AM. J. Pathol (1996) 148:201-10; Ueda외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90:11282-6]. 비록 NAC의 정확한 기능에 관하여는 알려져 있지 않지만, 이 NAC는 아마도 시냅스에서 일어나는 현상들 예를 들어, LBD, AD 및 기타 질환의 병리학적 상태 하에서 이 질환의 진행 중 신경 가소성(neuronal plasticity), 및 신경 말단부의 학습 및 퇴행에 중요한 역할을 할 것이다[Hasimoto외 다수, Alpha-Synuclein in Lewy body disease and Alzheimer's disease, Brain Pathol (1999) 9:707-20; Masliah외 다수(2000)].
AD, PD 및 루이체 생성 치매(DLB)는 노인에게 가장 흔히 발견되는 신경 퇴행성 질환이다. 이러한 질환은 오늘날까지 계속 발생하여 그 발생률이 증가함으로 인해 공중 보건상 심각한 문제를 초래하고 있으며, 현재 치료 가능하지도 예방 가능하지도 않다. 최근의 역학 조사 결과, AD와 PD 사이의 밀접한 임상학적 관계 즉, 알츠하이머병 환자의 약 30%가 PD도 발병되었다는 사실이 밝혀졌다. 나머지 노인들과 비교하였을 때, AD 환자는 거의 부수적으로 PD도 진행하게 된다. 더욱이, 치매가 발병된 PD 환자는 보통 통상적인 AD도 발병하였다. 비록 각각의 신경 퇴행성 질환이 뇌의 특정 부분과 세포군에 발생하기 더욱 쉬워서, 뚜렷한 병리학적 특징을 나타내지만, PD, AD, DLB 및 LBD는 또한 공통된 병리학적 특징을 공유한다. 가족 특유의 AD, 다운 증후군 또는 산발성 AD 환자는 편도체에 LB(PD의 통상적인 신경 병리학적 특징)가 생성된다. 뿐만 아니라, 각각의 질환은 뉴런의 퇴행, 뉴런 간 시냅스 연결로 인한 세포 사멸, 신경 전달 물질의 고갈, 그리고 미스 폴딩된 단백질 즉, 정상적인 중추 신경계 기능에 관여하는 전구체의 비정상적 축적과 관련되어 있다. 생화학적 연구를 통하여 AD, PD 및 DLB 사이의 연계성이 확인되었다.
AD의 통상적인 병리학적 특징인 신경 돌기 플라크는 베타 아밀로이드(Aβ) 펩티드와 비-베타 아밀로이드 성분(NAC) 펩티드를 함유한다. Aβ는 아밀로이드 전구체 단백질(APP)이라 불리는 더 큰 전구체 단백질로부터 유래하는 것이다. NAC는 APP의 비-베타 아밀로이드 성분이라 불리는 더 큰 전구체 단백질로부터 유래하는 것으로서, 현재는 알파-SN이라고 더 많이 칭하여진다. NAC는 알파-SN의 60∼87번 아미노산 잔기 또는 61∼95번 아미노산 잔기를 포함한다. Aβ 및 NAC는 둘 다 아밀로이드 플라크에서 전장 cDNA가 확인 및 클로닝된 각각의 전장 단백질의 단백 분해성 단편으로서 확인되었다.
알파-SN은 베타- 및 감마-시뉴클레인 및 시노렉틴을 포함하는 단백질의 거대 군의 일부이다. 알파-SN은 보통 상태에서 시냅스와 결합하여 발현되며, 신경 가소성, 학습 및 기억 활동에 기여하는 것으로 생각된다. 알파-SN의 응집을 촉진하는 인간(h) 알파-SN의 돌연 변이에 대하여 확인된바 있으며(Ala30Pro 및 Ala53Thr), 이 돌연 변이는 PD의 상 염색체 우성형의 희귀 형과 관련되어 있다. 이러한 돌연 변이가 알파-SN의 성향 즉, 응집하는 성향을 증가시키는 기작에 관하여는 알려진 바 없다.
다수의 돌연 변이가 군집 내 알파-SN 및 APP에서 발견될 수 있음에도 불구하고, 대부분의 AD 및 PD는 산발성이다. 이러한 질환의 가장 빈번한 산발성 형태는 각각 Aβ 및 알파-SN의 비정상적인 축적과 관련되어 있다. 그러나, 상기 단백질의 과축적의 원인에 관하여는 알려진 바 없다. Aβ는 뉴런으로부터 분비되어 세포외 아밀로이드 플라크에 축적된다. 또한 Aβ는 뉴런 내부에서 검출될 수 있다. 알파-SN은 LB라 불리는 뉴런 내 봉입체에 축적된다. 통상적으로 상기 2개의 단백질은 세포 외 신경 돌기 AD 플라크에서 함께 발견되지만, 경우에 따라서 이 단백질은 세포 내 봉입체에서 함께 발견되기도 한다.
알파-SN 축적이 PD의 신경 퇴행증과 기타 특징적인 증상을 유도하는 기작은 불명확하다. 그러나, 알파-SN 응집을 촉진 및/또는 차단하는 인자의 역할을 규명하는 것은 LBD 병인을 이해하고 그와 관련된 질환의 신규 치료법을 개발하는데에 중요하다. 치료법을 찾기 위한 연구는 알파-SN 응집을 감소시키는 화합물을 찾거나(Hashimoto외 다수), 또는 주로 발병하는 세포인 도파민 뉴런의 재생 및/또는 생존을 촉진할 성장 인자를 테스트하는 방향으로 진행되고 있다[Djaldetti외 다수, New therapies for Parkinson's disease , J. Neurol (2001) 248:357-62; Kirik외 다수, Long - term rAAV - mediated gene transfer of GDNF in the rat Parkinson's model: intrastriatal but not intranigral transduction promotes functional regeneration in the lesioned nigrostriatal system, J. Neurosci (2000) 20:4686-4700]. 트랜스제닉 AD 마우스 모델에 대한 최근 연구 결과, Aβ 1-42에 대한 항체는 뇌로부터 아밀로이드를 제거하는 것을 촉진 및 자극하여, AD-유사 병상을 개선시키고, 그 결과 인지 능력을 향상시킨다는 사실이 밝혀졌다[Schenk외 다수, Immunization with amyloid -β attenuates Alzheimer - disease - like pathology in PDAPP mouse, Nature (1999) 408:173-177; Morgan외 다수, A- beta peptide vaccination prevents memory loss in an animal model of Alzheimer's disease, Nature (2000) 408:982-985; Janus외 다수, A- beta peptide immunization reduces behavioral impairment and plaques in a model of Alzheimer's disease, Nature (2000) 408:979-82]. 알츠하이머병 환자의 뇌에서 발견되는 세포 외 아밀로이드 플라크와는 대조적으로, 루이체는 세포 내에 존재하는 것이며, 통상적으로 항체는 세포에 들어가지 않는다.
놀랍게도, 뇌 조직 내에 존재하는 LB의 세포 내 특성에 관하여, 발명자는 시뉴클레인으로 면역화된 트랜스제닉 마우스 내 봉입체의 수를 감소시키는데에 성공하였다. 본 발명은, 환자 체내에서 유익한 면역 반응을 나타내는 조건 하에, 시뉴클레인, 시뉴클레인 단편, 시뉴클레인 또는 이의 단편을 모의하는 항원, 또는 시뉴클레인의 임의의 에피토프에 대한 항체를 환자에 투여함으로써 PD 및 기타 LB 관련 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 발명자들은 또한 놀랍게도 Aβ로 면역화된 트랜스제닉 마우스에서 봉입체의 수를 감소시키는데에도 성공하였다. 본 발명은 환자 체내에서 유익한 면역 반응을 나타내는 조건 하에, Aβ, Aβ 단편, Aβ 또는 이의 단편을 모의하는 항원, 또는 Aβ의 임의의 에피토프에 대한 항체를 환자에 투여함으로써 PD 및 기타 LB 관련 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 그러므로 본 발명은 신경병증을 예방 또는 완화하는 치료 방법과, 몇몇 환자에서 PD 및 기타 LB 관련 질환과 관련된 인지 손상을 예방 또는 완화하는 치료 방법에 대한 오랜 요망을 충족시켜주는 것이다.
관련 출원 제09/585,817호(2000년 6월 1일 출원), 동 제60/137,010호(1999년 6월 1일 출원), 동 제09/580,015호(2000년 5월 26일 출원) 및 동 제10/698,099호(2003년 10월 31일 출원)은 본원에 모든 목적의 참고 문헌으로서 인용되어 있다.
발명의 개요
하나의 측면에서, 본 발명은 뇌에 루이체 또는 알파-SN이 응집되는 것을 특징으로 하는 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 알파-SN에 대하여 면역원성 반응을 유도하는 것을 포함한다. 이러한 유도는 면역원의 능동적 투여 또는 시뉴클레인에 대한 항체 또는 이 항체의 유도체를 수동적으로 투여함으로써 이루어질 수 있다. 몇몇 방법에서, 환자는 자각 증상이 없는 환자이다. 몇몇 방법에서, 환자는 질환이 발병하였으나 자각 증상이 없는 환자이다. 몇몇 방법에서, 환자는 질환에 대한 발병 소인을 가지되 자각 증상이 없는 환자이다. 몇몇 방법에서 이 질환은 파킨슨병이다. 몇몇 방법에서, 이 질환은 파킨슨병이며, 제제를 투여함으로써 환자의 운동성을 개선시킨다. 몇몇 방법에서, 이 질환은 파킨슨병이며, 환자의 운동성 악화를 방지하는 제제를 투여한다. 몇몇 방법에서, 환자는 알츠하이머병 환자가 아니다.
뇌에 루이체 또는 알파-SN이 응집되는 병을 앓고 있는 환자를 치료하기 위한 한 가지 치료 방법은 면역 반응을 유도하기 위해 일정한 투여량의 알파-SN 또는 이의 활성 단편을 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 몇몇 방법에서, 알파-SN 또는 이의 활성 단편은 6개월 이상의 기간에 걸쳐서 복수 회 투여된다. 상기 알파-SN 또는 이의 활성 단편은 예를 들어, 말초 혈관 내, 복강 내, 구강, 피하, 두개 내, 근육 내, 국소, 비강 내 또는 정맥 내 투여될 수 있다. 몇몇 방법에서, 알파-SN 또는 이의 활성 단편은 알파-SN에 대한 면역 반응을 촉진하는 애쥬반트 또는 이의 활성 단편과 함께 투여된다. 몇몇 방법에서, 면역원성 반응은 알파-SN 또는 이의 활성 단편에 대한 항체를 포함한다.
몇몇 방법에서, 제제는 알파-SN의 35∼65번 아미노산이다. 몇몇 방법에서, 제제는 알파-SN의 130∼140번 아미노산을 포함하며, 총 40개 미만의 아미노산을 보유한다. 몇몇 방법에서, 제제는 알파-SN의 130∼136번 아미노산을 포함하며, 총 40개 미만의 아미노산을 보유한다. 몇몇 방법에서, 제제의 C-말단 아미노산은 알파-SN의 C-말단 아민산이다. 상기 방법들 중 몇몇 방법에서, 알파-SN 또는 활성 단편은 알파-SN 또는 이의 활성 단편의 N-말단에서 담체와 결합된다. 몇몇 방법에서, 제제는 알파-SN의 1∼10번 아미노산을 포함하며, 총 40개 미만의 아미노산을 보유한다. 몇몇 방법에서, 제제의 N-말단 아미노산은 알파-SN의 N-말단 아미노산이다. 상기 방법들 중 몇몇 방법에서, 알파-SN 또는 활성 단편은 알파-SN 또는 활성 단편의 C-말단에서 담체와 결합된다. 상기 방법들 중 몇몇 방법에 있어서, 알파-SN 또는 이의 활성 단편은 담체 분자와 결합하여 컨쥬게이트를 형성한다. 몇몇 방법에서, 제제는 알파-SN 단편을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여함으로써 환자에게 투여된다.
뇌에 루이체 또는 알파-SN이 응집되는 병을 앓고 있는 환자를 치료하기 위한 하나의 치료 방법은 일정 투여량의 알파-SN 또는 이의 활성 단편에 대한 항체를 환자에게 투여하여 면역 반응을 유도하는 것을 포함한다. 사용된 항체는 인간의 것, 인간화된 것, 키메라 또는 플로클로날 항체일 수 있으며, 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수도 있다. 몇몇 방법에서, 항체의 이소타입(isotype)은 인간 IgG1이다. 몇몇 방법에서, 항체는 알파-SN 펩티드로 면역화된 사람으로부터 생성될 수 있으며, 사람은 이 항체로 치료될 환자일 수 있다. 몇몇 방법에서, 항체는 루이체를 보유하는 뉴런 세포의 바깥 표면에 결합하여 루이체를 분해할 수 있다. 몇몇 방법에서, 항체는 루이체를 보유하는 뉴런 세포 내에 흡수되어, 루이체를 분해할수 있다.
몇몇 방법에서, 항체는 약학 담체와 함께 약학 조성물로서 투여된다. 몇몇 방법에서, 항체는 0.0001∼100 ㎎/㎏(체중), 바람직하게는 1 ㎎/㎏(체중) 이상의 투여량으로 투여된다. 몇몇 방법에서, 항체는 장기간 예를 들어, 6개월 이상에 걸쳐서 복수 회 투여된다. 몇몇 방법에서, 항체는 지속 방출형 조성물로서 투여될 수 있다. 항체는 예를 들어, 말초 혈액 내, 복강 내, 구강, 피하, 두개 내, 근육 내, 국소, 비강 내 또는 정맥 내 투여될 수 있다. 몇몇 방법에서, 환자는 환자 혈중 투여된 항체의 수준에 대하여 관찰된다.
몇몇 방법에서, 항체는 하나 이상의 항체 사슬을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 환자에 투여함으로써 투여된다. 폴리뉴클레오티드는 환자 체내에서 발현되어 항체 사슬을 생성한다. 임의로, 폴리뉴클레오티드는 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하며, 폴리뉴클레오티드는 환자 체내에서 발현되어 중쇄 및 경쇄를 생성한다.
본 발명은 추가로 본원에 개시되어 있는 알파-SN에 대한 항체 중 임의의 것과 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 뇌에 루이체 또는 알파-SN이 응집되는 것을 특징으로 하는 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 알파-SN에 대한 면역원성 반응을 유도하는 제제를 환자에게 투여하는 것을 포함하고, Aβ에 대한 면역원성 반응을 유도하는 제2의 제제를 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 몇몇 방법에서, 이 제제는 Aβ 또는 이의 활성 단편이다. 몇몇 방법에서, 이 제제는 Aβ에 대한 항체이다.
다른 측면에서, 본 발명은 뇌에 루이체 또는 알파-SN이 응집되는 것을 특징으로 하는 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 Aβ에 대한 면역원성 반응을 유도하는 제제를 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 몇몇 방법에서, 이 제제는 Aβ 또는 이의 단편이다. 몇몇 방법에서, 이 제제는 Aβ에 대한 항체이다. 몇몇 방법에서, 상기 질환은 파킨슨병이다, 몇몇 방법에서, 환자는 알츠하이머병 환자가 아니며, 이의 발병 위험 인자도 보유하지 않는다. 몇몇 방법에서, 환자에서 파킨슨병의 징후 또는 증상을 관찰하는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 방법에서, 이 질환은 파킨슨병이며, 제제를 투여하면 파킨슨병의 징후 또는 증상을 개선시킬 수 있다.
본 발명은 추가로 상기 기술된 바와 같은 제제(환자 체내에서 루이체의 성분에 대해 면역원성 반응을 유도하는데 효과적인 제제) 및 약학적으로 허용 가능한 애쥬반트를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 몇몇 화합물에서, 이 제제는 알파-SN 또는 이의 활성 단편 예를 들어, NAC, 또는 본원에 개시된 C-말단 단편 중 임의의 것이다. 본 발명은 또한 루이체의 성분에 특이적인 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 환자 체내에서 아밀로이드 플라크의 시뉴클레인-NAC 성분에 대하여 면역 반응을 유도하는데 효과적인 제제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 몇몇 화합물에서, 이 제제는 알파-SN 또는 이의 활성 단편 예를 들어, NAC, 또는 본원에 개시된 알파 시뉴클레인의 C-말단 단편 중 임의의 것, 그리고 임의로는 애쥬반트이다. 다른 화합물에서, 이 제제는 알파-SN 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편, 그리고 임의로는 약학 담체이다.
다른 측면에서, 본 발명은 항체가 루이체와 관련된 질환을 예방 또는 치료 하는 활성에 대해서 항체를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 시뉴클레인을 발현하는 뉴런 세포와 항체를 접촉시키는 것을 포함한다. 이후, 항체와 접촉하지 않은 대조군 세포와 비교하여 세포가 항체와 접촉하였을 때 세포 내에 시뉴클레인이 축적되는 것을 감소시킬 수 있는지 여부를 측정한다.
다른 측면에서, 본 발명은 항체가 환자의 뇌에 루이체가 생성되는 질환을 예방 또는 치료하는 활성에 대해서 항체를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 알파-SN의 5개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 폴리펩티드와 항체를 접촉시키는 것을 포함한다. 이후, 항체가 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는지 여부를 측정하며, 이때 특이적으로 결합하면 그 항체는 이 질환을 치료하는 활성을 보유하고 있음을 나타내는 것이다. 본 발명은 추가로 뇌에 루이체 또는 알파-시뉴클레인이 응집되는 것을 특징으로 하는 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 본 방법은 질환이 발병되었거나 또는 발병 위험이 있는 환자에게 면역원성 반응을 유도하는데에 효과적인 알파-시뉴클레인의 면역원성 단편을 포함하는 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 상기 면역원성 반응은 인간 알파-시뉴클레인의 70∼140번 잔기(서열번호 1에 따라서 잔기에 번호가 매겨짐) 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체가 관여하므로, 이로써 상기 질환의 예방 또는 치료가 가능하다.
임의로, 알파-시뉴클레인의 면역원성 단편은 알파 시뉴클레인의 1∼69번 잔기(서열번호 1에 따라서 잔기에 번호가 매겨짐)가 존재하지 않는다. 임의로, 면역원성 반응은 SN83-101, SN107-125, SN110-128 및 SN124-140(서열번호 1에 따라서 잔기에 번호가 매겨짐)으로 이루어진 군으로부터 선택된 에피토프 내 인간의 알파 시뉴클레인에 특이적으로 결합하는 항체가 관여한다. 임의로, 상기 면역원성 반응은 선택된 에피토프의 외부에 존재하는 사람 알파 시뉴클레인의 잔기에 특이적으로 결합하는 항체가 존재하지 않는다. 임의로, 면역원성 단편은 알파 시뉴클레인의 70∼140번 위치 사이로부터 유래된 5∼20개의 연속 아미노산(서열번호 1에 따라서 잔기에 번호가 매겨짐)을 보유한다. 임의로, 면역원성 단편은 알파 시뉴클레인의 120∼140번 위치 사이로부터 유래된 5∼20개의 연속 아미노산(서열번호 1에 따라서 번호가 잔기에 매겨짐)을 보유한다. 임의로, 면역원성 단편은 SN87-97, SN111-121, SN114-124 및 SN128-136으로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 알파 시뉴클레인의 절편을 포함하며, 전체 알파 시뉴클레인 잔기 중 40개 미만의 연속적 잔기들(서열번호 1에 따라서 잔기에 번호가 매겨짐)을 함유한다. 임의로, 면역원성 단편은 SN125-140을 포함하며, 전체 알파 시뉴클레인 잔기 중 40개 미만의 연속적 잔기들(서열번호 1에 따라서 잔기에 번호가 매겨짐)을 함유한다. 임의로, 면역원성 단편은 SN130∼140을 포함하며, 전체 알파 시뉴클레인 잔기 중 40개 미만의 연속적 잔기들(서열번호 1에 따라서 잔기에 번호가 매겨짐)을 함유한다. 임의로, 면역원성 단편은 SN83∼140(서열번호 1에 따라서 잔기에 번호가 매겨짐)을 포함한다.
임의로 면역원성 단편은 서열번호 1에 따라서 번호가 매겨진 잔기들인, SN124-140, SN125-140, SN126-140, SN127-140, SN128-140, SN129-140, SN130-140, SN131-140, SN132-140, SN133-140, SN134-140, SN135-140, SN136-140, SN137-140, SN124-139, SN125-139, SN126-139, SN127-139, SN128-139, SN124-139, SN125-139, SN126-139, SN127-139, SN128-139, SN129-139, SN130-139, SN131-139, SN132-139, SN133-139, SN134-139, SN135-139, SN136-139, SN137-139, SN124-138, SN124-138, SN125-138, SN126-138, SN127-138, SN128-138, SN129-138, SN130-138, SN131-138, SN132-138, SN133-138, SN134-138, SN135-138, SN136-138, SN124-137, SN125-137, SN126-137, SN127-137, SN128-137, SN129-137, SN130-137, SN131-137, SN132-137, SN133-137, SN134-137, SN135-137, SN124-136, SN125-136, SN126-136, SN127-136, SN128-136, SN129-136, SN130-136, SN131-136, SN132-136, SN133-136, 및 SN134-136으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
임의로, 면역원성 반응은 서열번호 1에 따라서 번호가 매겨진 잔기들인, SN1 -20, SN2-21, SN2-23 및 SN1-40으로 이루어진 군으로부터 선택된 에피토프내에 존재하는 인간 알파 시뉴클레인에 특이적으로 결합하는 항체가 관여한다. 임의로, 면역원성 반응은 SN25-69, SN25-140, SN40-69, SN40-140 또는 SN70-140 영역내에 존재하는 인간 알파 시뉴클레인 잔기에 특이적으로 결합하는 항체가 관여하지 않는다. 임의로 면역원성 단편은 알파 시뉴클레인의 1∼40번 위치 사이로부터 유래된 5∼20개의 연속 아미노산으로부터 유래된 잔기(서열번호 1에 따라서 잔기에 번호가 매겨짐)를 보유한다. 임의로, 면역원성 단편은 알파 시뉴클레인의 1∼20번 위치로부터 유래된 5∼20개의 연속 아미노산과, 알파 시뉴클레인의 120∼140번 위치에서 유래된 5∼20개의 연속 아미노산으로부터 유래된 잔기(서열번호 1에 따라서 잔기에 번호가 매겨짐)를 보유한다. 임의로, 면역원성 단편은 전체 알파 시뉴클레인 중 40개 미만의 연속적 잔기(서열번호 1에 따라서 잔기에 번호가 매겨짐)를 함유한다.
임의로, 면역원성 반응은 인간 알파-시뉴클레인의 1∼20번 잔기 내에 존재하는 에피토프와 인간 알파-시뉴클레인의 70∼140번 잔기 내에 존재하는 에피토프 내에 존재하는 인간 알파 시뉴클레인에 특이적으로 결합하는 항체가 관여한다. 임의로, 면역원성 반응은 인간 알파-시뉴클레인의 1∼20번 잔기 내에 존재하는 에피토프와 인간 알파-시뉴클레인의 120∼140번 잔기 내에 존재하는 에피토프 내에 존재하는 인간 알파 시뉴클레인에 특이적으로 결합하는 항체가 관여한다. 임의로, 면역원성 반응은 인간 알파-시뉴클레인의 41∼119번 잔기 내에 존재하는 에피토프 내에 존재하는 인간 알파 시뉴클레인에 특이적으로 결합하는 항체가 관여하지 않는다.
임의로, 면역원성 단편은 담체에 결합하여 컨쥬게이트를 형성한다. 임의로, 폴리펩티드는 담체에 융합되는 면역원성 단편을 포함한다. 임의로, 면역원성 단편은 알파-시뉴클레인 단편의 C-말단에서 담체 분자와 결합된다. 임의로, 다수 개의 상기 단편 복사체는 다수 개의 담체 복사체와 상호 결합된다. 임의로, 면역원성 단편은 애쥬반트와 함께 투여된다. 임의로, 투여 단계는 루이체를 최소한 부분적으로나마 소멸시킨다. 임의로, 투여 단계는 루이체를 분해한다. 임의로, 투여 단계는 시냅스 내 알파 시뉴클레인 올리고머의 수준을 감소시킨다. 임의로, 투여 단계는 리소좀 경로를 활성화시켜 시뉴클레인을 제거한다.
임의로, 면역원성 반응은 단일 폴리펩티드 또는 융합 단백질의 투여에 의하여 유도된다. 임의로, 면역원성 반응은 하나 이상의 폴리펩티드(예를 들어, 2개의 폴리펩티드)를 투여함으로써 유도된다. 임의로, 면역원성 반응은 인간 알파-시뉴클레인의 1∼20번 잔기 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체가 관여하는 면역원성 반응을 유도하는데 효과적인 알파-시뉴클레인의 제1 면역원성 단편을 포함하는 제1 폴리펩티드를 투여하고, 인간 알파-시뉴클레인의 70∼140번 잔기, 바람직하게는 120∼140번 잔기 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체가 관여하는 면역원성 반응을 유도하는데 효과적인 알파-시뉴클레인의 제2 면역원성 단편을 포함하는 폴리펩티드를 투여함으로써 유도된다.
임의로, 면역원성 반응은 2개 이상의 폴리펩티드를 함께 투여함으로써 유도된다. 임의로, 2개 이상의 폴리펩티드는 공동 투여 및/또는 공동 제형화된다.
다른 관점에서, 본 발명은 알파-시뉴클레인의 제1 면역원성 단편을 포함하는 제1 폴리펩티드와, 알파-시뉴클레인의 제2 면역원성 단편을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공하는데, 여기서 상기 제1 면역원성 단편은 인간 알파-시뉴클레인의 1∼20번 잔기 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체가 관여하는 면역원성 반응을 유도하는데에 효과적이고, 알파-시뉴클레인의 제2 면역원성 단편은 인간 알파-시뉴클레인의 120∼140번 잔기 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체가 관여하는 면역원성 반응을 유도하는데 효과적이다. 임의로, 본 조성물은 알파-시뉴클레인의 25∼69번 잔기를 포함하는 알파-시뉴클레인의 면역원성 단편을 포함하지 않는다. 제1 및 제2 면역원성 단편은 (예를 들어, 컨쥬게이트 또는 융합 단백질의 형태로) 물리적으로 결합될 수 있다. 제1 및 제2 면역원성 단편은 공동 제형화될 수 있다.
본 발명은 추가로 루이체 또는 알파-시뉴클레인이 뇌에서 응집되는 것을 특징으로 하는 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 하나의 구체예에서, 본 방법은 질환이 발병하였거나 또는 발병 위험이 있는 환자에게 효과적인 방식으로 항체 즉, 서열번호 1에 따라서 번호가 매겨진 잔기들인, 인간 알파-시뉴클레인의 70∼140번 잔기 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 투여하는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 방법은 질환이 발병하였거나 또는 발병 위험이 있는 환자에게 효과적인 방식으로 항체 즉, 서열번호 1에 따라서 번호가 매겨진 잔기들인, 인간 알파-시뉴클레인의 1∼40번 잔기 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 방법은 질환이 발병하였거나 또는 발병 위험이 있는 환자에게 효과적인 방식으로 제1 항체 즉, 인간 알파-시뉴클레인의 1∼40번 잔기 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체와, 제2 항체 즉, 인간 알파-시뉴클레인의 70∼140번 잔기 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체(상기 잔기들은 모두 서열번호 1에 따라서 번호가 매겨짐)를 투여하는 것을 포함한다.
항체가 인간 알파-시뉴클레인의 70∼140번 잔기(서열번호 1에 따라서 잔기에 번호가 매겨짐) 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 경우, 임의로 이 항체는 인간 알파 시뉴클레인의 83∼140번 잔기(서열번호 1에 따라서 잔기에 번호가 매겨짐) 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 임의로, 항체는 인간 알파 시뉴클레인의 120∼140번 잔기 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 임의로, 항체는 SN83-101, SN107-125, SN110-128 및 SN124-140(서열번호 1에 따라서 잔기에 번호가 매겨짐)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 알파 시뉴클레인의 절편 내에 존재하는 에피토프 내에 특이적으로 결합한다.
항체가 인간 알파-시뉴클레인의 1∼40번 잔기(서열번호 1에 따라서 잔기에 번호가 매겨짐) 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 경우, 임의로 항체는 1∼20번 잔기, 또는 1∼10번 잔기(서열번호 1에 따라서 잔기에 번호가 매겨짐) 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합한다.
제1 항체가 인간 알파-시뉴클레인의 1∼40번 잔기 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하고, 제2 항체가 인간 알파-시뉴클레인의 70∼140번 잔기(서열번호 1에 따라서 잔기에 번호가 매겨짐) 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 경우, 임의로 제2 항체는 인간 알파-시뉴클레인의 120∼140번 잔기(서열번호 1에 따라서 잔기에 번호가 매겨짐) 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 임의로, 제1 항체와 제2 항체는 동시 투여된다. 임의로, 제1 항체와 제2 항체는 치료 과정 중 동일한 과정에 투여된다.
임의로, 항체는 모노클로날 항체이다. 임의로, 항체는 에피토프의 외부에 존재하는 알파 시뉴클레인의 잔기에 특이적으로 결합할 수 없는 항체의 폴리클로날 군집이다, 임의로, 항체는 인간화된 항체이다. 임의로, 항체는 인간의 항체이다. 임의로, 항체는 인간 IgG1 이소타입의 항체이다. 임의로, 항체는 약학 담체와 함께 약학 조성물로서 투여된다. 임의로, 항체는 0.0001∼100 ㎎/㎏(체중), 바람직하게는 1 ㎎/㎏(체중) 이상의 투여량으로 투여된다. 임의로, 항체는 6개월 이상에 걸쳐서 복수 회 투여된다. 임의로, 항체는 지연 방출형 조성물로서 투여된다. 임의로, 항체는 복강 내, 구강, 피하, 두개 내, 근육 내, 국소, 비강 내 또는 정맥 내 투여된다. 임의로, 항체는 루이체를 보유하는 뉴런 세포 내에 흡수되어, 루이체를 분해한다. 임의로, 항체는 루이체를 보유하는 뉴런 세포의 바깥 표면에 결합하여 루이체를 분해한다. 임의로, 항체는 뉴런 세포의 바깥 표면에 존재하는 알파 시뉴클레인에 결합하여 알파 시뉴클레인의 가교를 촉진한다. 여기서 투여 단계는 루이체를 분해시키게 된다. 임의로, 투여 단계는 시냅스 내 인간 알파 시뉴클레인 올리고머의 수준을 감소시킨다. 임의로, 투여 단계는 리소좀 경로를 활성화함으로써 인간 알파 시뉴클레인을 제거한다. 몇몇 방법에서, 질환은 파킨슨병이다, 임의로, 항체는 변성된 인간 알파-시뉴클레인에 특이적으로 결합하며, 이는 면역 블럿(immunoblot)에 의해 확인된다. 임의로, 항체는 변성된 인간 알파-시뉴클레인에 109 M-1 이상의 친화도로 특이적으로 결합한다. 임의로, 항체는 시냅스에 특이적으로 결합하며, 이는 조직 세포 화학적 방법으로 확인된다.
본 발명은 또한 뇌에 루이체 또는 알파-시뉴클레인이 응집되는 것을 특징으로 하는 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하며, 이 조성물은 인간 알파-시뉴클레인의 1∼20번 잔기(서열번호 1에 따라서 잔기에 번호가 매겨짐) 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 모노클로날 항체와, 인간 알파-시뉴클레인의 70∼140번 잔기(및 바람직하게는 120∼140번 잔기)(서열번호 1에 따라서 잔기에 번호가 매겨짐) 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 모노클로날 항체를 포함한다.
본 발명은 또한 뇌에 루이체 또는 알파-시뉴클레인이 응집되는 것을 특징으로 하는 질환의 예방 또는 치료용 키트를 제공하며, 이 키트는 인간 알파-시뉴클레인의 1∼20번 잔기(서열번호 1에 따라서 잔기에 번호가 매겨짐) 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 제1 용기와, 인간 알파-시뉴클레인의 70∼140번 잔기(및 바람직하게는 120∼140번 잔기)(서열번호 1에 따라서 잔기에 번호가 매겨짐) 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 제2 용기를 포함한다.
본 발명은 추가로 뇌에 루이체 또는 알파-시뉴클레인이 응집되는 것을 특징으로 하는 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 이 방법은 이러한 질환이 발병하였거나 또는 발병 위험이 있는 환자에게, 인간 알파 시뉴클레인의 70∼140번 잔기(서열번호 1에 따라서 잔기에 번호가 매겨짐) 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체가 관여하는 면역원성 반응을 유도하는 제제를 효과적인 방식으로 투여하여, 이 질환을 예방 또는 치료하는 것을 포함한다. 임의로, 상기 면역원성 반응은 인간 알파 시뉴클레인의 1∼69번 잔기(서열번호 1에 따라서 잔기에 번호가 매겨짐) 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체가 관여하지 않는다. 임의로, 면역원성 반응은 SN83-101, SN107-125, SN110-128 및 SN124-140(서열번호 1에 따라서 잔기에 번호가 매겨짐)으로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 알파 시뉴클레인의 절편 내에 특이적으로 결합하는 항체가 관여한다.
본 발명은 추가로 제제가 루이체 생성을 특징으로 하는 질환을 치료하는데 유용한 활성을 갖는지 여부에 대하여 스크리닝하는 방법을 제공한다. 본 방법은 이 제제를 인간을 제외한 트랜스제닉 동물과 접촉시켜 이 제제로 인하여 루이체 생성 질환의 특징을 발현시키는 단계; 및 이 제제가 인간을 제외한 대조군 트랜스제닉 동물에 비하여 상기 질환의 특징이 나타나는 정도 또는 속도에 영향을 미치는지 여부를 측정하는 단계를 포함한다. 이 제제는 (i) 인간 알파 시뉴클레인의 70∼140번 잔기(서열번호 1에 따라서 잔기에 번호가 매겨짐) 내에 존재하는 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 유도하는 알파 시뉴클레인의 단편이거나 또는 (ii) 인간 알파 시뉴클레인의 70∼140번 잔기(서열번호 1에 따라서 잔기에 번호가 매겨짐)를 보유하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체이다.
임의로, 인간을 제외한 트랜스제닉 동물은 인간 알파-시뉴클레인을 발현하는 트랜스유전자(transgene)를 포함한다. 임의로, 본 방법은 다수의 시험 항체들이 변성된 인간 알파 시뉴클레인에 결합하는지에 대하여 스크리닝하는 단계, 및 가장 많이 결합하는 항체를 제제로서 선택하는 단계를 추가로 포함한다. 임의로, 본 방법은 다수의 시험 항체들이 조직 검편 내의 시뉴클레인 침착물과 결합하는지 여부에 대해서 조직 세포 화학적 방법으로 스크리닝하여, 가장 많이 결합하는 항체들을 제제로서 선택하는 단계를 포함한다.
본 발명은 모노클로날 항체 8A5 또는 6H7을 인간화(humanizing)하는 방법을 추가로 제공하며, 이 방법은 모노클로날 항체의 CDR 영역의 아미노산 서열을 결정하는 단계; 수용 항체를 선택하는 단계; 및 모노클로날 항체로부터 유래된 CDR과, 수용 항체로부터 유래된 가변 영역 구조틀을 포함하는 인간화된 항체를 생산하는 단계를 포함한다.
본 발명은 추가로 모노클로날 항체인 8A5 또는 6H7의 키메라형을 생산하는 방법을 제공하며, 이 방법은 모노클로날 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 결정하는 단계; 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 선택하는 단계; 경쇄 불변 영역에 융합된 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄와, 중쇄 불변 영역에 융합된 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄를 포함하는 키메라 항체를 생산하는 단계를 포함한다.
정의
"실질적 상동성"이란 용어는 2개의 폴리펩티드 서열이 예를 들어, GAP 또는 BESTFIT 프로그램(디폴트 갭 가중치 이용)에 의해 최적으로 정렬되었을 때, 65 % 이상의 서열 상동성을, 바람직하게는 80 % 또는 90 % 이상의 서열 상동성을, 더욱 바람직하게는 95 % 이상의 서열 상동성(예를 들어, 99 % 서열 상동성 또는 그 이상)을 공유하는 것을 의미한다. 바람직하게, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하게 된다.
서열 비교를 위하여, 통상적으로 하나의 서열은 시험 서열(test sequence)이 비교되는 참고 서열(reference sequence)로서 작용을 한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 시험 및 참고 서열을 컴퓨터에 입력하면, 종속 서열에 해당하는 서열이 지정되고, 필요에 따라서 서열 알고리즘 프로그램 매개 변수가 지정된다. 이후 서열 비교 알고리즘은 참고 서열에 대한 시험 서열(들)의 % 서열 상동성을 지정된 프로그램 매개 변수를 바탕으로 하여 계산한다.
비교용 서열의 최적 정렬은 예를 들어, 스미스 & 워터맨(Adv. Appl. Math. 2:482 (1981))의 국소 상동성 알고리즘, 니들맨 & 운크(J. Mol. Biol. 48:443 (1970))의 상동성 정렬 알고리즘, 피어슨 & 립맨(Proc. Natl Acad. Sci. USA 85:2444 (1988))의 유사성 탐색법, 상기 알고리즘의 컴퓨터 실행(GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA; Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), 또는 시각적 관찰(일반적으로 Ausubel외 다수, 상동)에 의하여 수행될 수 있다. % 서열 상동성 및 서열 유사성을 측정하는데 적합한 알고리즘의 일례로서는 BLAST 알고리즘(Altschul외 다수, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990))이 있다. BLAST 분석법을 실행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립 생물 정보 센터(NCBI) 웹 사이트를 통하여 공중이 이용 가능하다. 통상적으로, 디폴트 프로그램 매개 변수는 서열 비교를 수행하기 위하여 사용될 수 있으나, 조정된 매개 변수도 사용될 수 있다. 아미노산 서열에 있어서, BLASTP 프로그램은 디폴트 값으로서, 단어 길이(W) = 3, 기대치(E) = 10 및 BLOSUM62 점수화 행렬(scoring matrix)[Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915 (1989) 참조]을 사용한다.
보존적 또는 비보존적 아미노산 치환의 분류를 위하여, 아미노산은 다음과 같은 군들로 분류된다: I군(소수성 측쇄): 노르루신, met, ala, val, leu, ile; II군(중성 친수성 측쇄): cys, ser, thr; III군(산성 측쇄): asp, glu; IV군(염기성 측쇄): asn, gln, his, lys, arg; V군 (사슬 배향에 영향을 미치는 잔기들): gly, pro; 및 VI군 (방향성 측쇄): trp, tyr, phe. 보존적 치환은 동일한 부류의 아미노산 사이에서 일어나는 치환이 관여한다. 비보존적 치환은 상기 부류 중 하나에 속하는 일원을 다른 부류에 속하는 일원으로 바꾸는 것으로 구성된다.
통상적으로 본 발명의 치료제는 목적으로 하지 않는 오염 물질이 존재하지 않고 실질적으로 순수하다. 이는 곧 이 제제의 순도가 통상적으로 약 50% w/w(중량/중량) 이상이고, 실질적으로는 방해 단백질 및 오염 물질이 존재하지 않음을 의미한다. 때때로 상기 제제의 순도는 약 80% w/w 이상이고, 더욱 바람직하게 90% w/w 이상이거나 또는 약 95% w/w이다. 그러나, 통상의 단백질 정제 기술을 사용하면 99% w/w 이상 균질한 펩티드를 얻을 수 있다.
분자가 표적에 "특이적으로 결합"한다는 어구는 기타 생물 분자의 이종 군집이 존재할 때 분자의 존재 여부를 결정짓는 결합 반응이 일어남을 의미한다. 그러므로, 지정된 면역 검정 조건 하에서, 특이 분자는 시료 내에 존재하는 특정 표적에 선호적으로 결합하고 기타 생물 분자들과는 거의 결합하지 않는다. 이러한 조건 하에서 표적에 대한 항체의 특이적 결합에는 표적에 대한 항체의 특이성에 대해 선택된 항체가 필요하다. 다수의 면역 검정 방식은 특정 단백질과 특이적으로 면역 반응하는 항체를 선택하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 고상 ELISA 면역 검정법은 통상적으로 단백질과 특이적으로 면역 반응성인 모노클로날 항체를 선택하는데 사용된다. 예를 들어, 특이 면역 반응성을 측정하는데 사용될 수 있는 면역 검정 방식 및 조건에 관하여 기술된 문헌[Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York]을 참조하시오. 2개의 분자 사이에 특이적으로 결합한다는 것은 친화도가 106, 107, 108, 109 또는 1010 M-1 이상임을 의미한다. 친화도가 108 M-1 이상인 것이 바람직하다.
"항체" 또는 "면역 글로불린"이라는 용어는 원상태의(intact) 항체와 이의 결합 단편을 포함하는 의미로 사용된다. 통상적으로 항원에 특이적으로 결합하도록 유도된 단편은 원상태의 항체와 경쟁한다. 단편은 각각의 중쇄, 경쇄, Fab, Fab' F(ab')2, Fabc 및 Fv를 포함한다. 단편은 재조합 DNA 기술, 또는 원상태의 면역 글로불린의 효소적 분리 또는 화학적 분리에 의해 생성된다. "항체"라는 용어는 또한 다른 단백질과의 융합 단백질에 화학적으로 컨쥬게이트화되거나, 또는 이와 같이 다른 단백질과의 융합 단백질로서 발현되는 하나 이상의 면역 글로불린 사슬을 포함한다. "항체"라는 용어는 또한 이중 특이적 항체를 포함한다. 이중 특이적(bispecific) 또는 이작용성(bifunctional) 항체는 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍과 2개의 상이한 결합 위치를 보유하는 인공 혼성 항체이다. 이중 특이적 항체는 다양한 방법 예를 들어, 하이브리도마 융합 또는 Fab' 단편의 결합에 의하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny외 다수, J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)]을 참조하시오. "항체"란 용어는 또한 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 스페이서를 통해 결합되어 있는 단일 사슬 항체를 포함한다.
APP695, APP751, 및 APP770은 각각 인간 APP 유전자에 의하여 암호화된 695, 751, 및 770개의 아미노산 잔기로 된 폴리펩티드를 의미한다. 문헌[Kang외 다수, Nature 325, 773 (1987); Ponte외 다수, Nature 331, 525 (1988); 및 Kitaguchi외 다수, Nature 331, 530 (1988)]을 참조하시오. 인간 아밀로이드 전구체 단백질(APP) 내에 존재하는 아미노산은 APP770 아종의 서열에 따라서 번호가 할당된다. Aβ39, Aβ40, Aβ41, Aβ42 및 Aβ43은 1∼39번, 1∼40번, 1∼41번, 1∼42번 및 1∼43번 아미노산 잔기를 함유하는 Aβ 펩티드를 의미한다.
"항원"은 항원이 특이적으로 결합하는 것이다.
"에피토프" 또는 "항원 결정기"란, B 세포 및/또는 T 세포가 반응하는 항원 상에 존재하는 위치를 의미한다. B-세포 에피토프는 단백질의 3차 폴딩에 의해 병렬된 연속적 아미노산 또는 불연속적 아미노산으로부터 생성될 수 있다. 연속적 아미노산으로 형성된 에피토프는 통상적으로 변성 용매에 노출시 잔류하는 반면에, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 통상적으로 변성 용매로 처리시 제거된다. 에피토프는 통상적으로 독특한 공간 형태에 3개 이상, 및 더욱 일반적으로는 5개 이상 또는 8∼10개의 아미노산을 포함한다. 에피토프의 공간 형태를 결정하는 방법으로서는 예를 들어, X-선 결정법 및 2-차원 핵 자기 공명법을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996)]을 참조하시오. 동일한 에피토프를 인지하는 항체는 하나의 항체가 표적 항원에 대한 다른 항체의 결합을 차단하는 능력을 나타내는 간단한 면역 검정법에서 확인할 수 있다. T-세포는 CD8 세포에 대하여 약 9개의 아미노산, 또는 CD4 세포에 대하여 약 13∼15개의 아미노산으로 이루어진 연속적 에피토프를 인지한다. 에피토프에 대응하여 프라이밍된 T-세포가 3H-티미딘과 통합하는지 여부를 측정하거나(Burke외 다수, J. Inf. Dis. 170, 1110-19 (1994)), 항원-의존성 사멸(세포 독성 T 림프구 검정법)(Tigges외 다수, J. Immunol. 156, 3901-3910)되는지 여부를 측정하거나 또는 시토킨이 분비되는지 여부를 측정함으로써, 항원-의존성 증식을 하는지 여부를 검사하는 시험관 내 검정법에 의해 이 에피토프를 인지하는 T-세포를 확인할 수 있다.
"면역학적" 또는 "면역" 반응이란 용어는, 수용체인 환자에서 아밀로이드 펩티드에 대해 유도되는 유익한 체액성(항체 매개) 및/또는 세포성(항원-특이적 T 세포 또는 이의 분비 생산물에 의해 매개) 반응을 의미한다. 이러한 반응은 항체 또는 프라이밍된 T-세포를 투여함으로써 유도되는 수동적 반응, 또는 면역원을 투여함으로써 유도되는 능동적 반응일 수 있다. 세포성 면역 반응은 I군 또는 II군 MHC 분자와 결합된 폴리펩티드 에피토프를 제시하여 항원-특이적 CD4+ T 조력 세포 및/또는 CD8+ 세포 독성 T-세포를 활성화함으로써 유도된다. 이 반응은 또한 단핵구, 대식 세포, NK 세포, 호염구, 수지상 세포, 성상 세포, 미세 아교 세포, 호산구 또는 기타 선천적 면역 성분의 활성화를 포함할 수도 있다. 세포-매개성 면역 반응의 유도 여부는 증식 검정법(CD4+ T 세포) 또는 CTL(세포 독성 T 림프구) 검정법(Burke, 상동; Tigges, 상동)에 의해 측정될 수 있다. 면역원의 보호적 효능 또는 치료적 효능에 대한 체액성 및 세포성 반응의 상대적 분포는 각각 면역화된 동일계 동물로부터 유래된 T-세포 및 항체를 분리하고, 제2 개체에서 보호 또는 치료 효과를 측정함으로써 구별할 수 있다.
"면역원성 제제" 또는 "면역원"이란, 이것이 포유 동물에 임의로는 애쥬반트와 함께 투여될 때 그것 자체에 대하여 면역 반응을 일으킬 수 있는 물질을 의미한다.
"모두-D(all-D)"란 용어는, 펩티드를 구성하는 아미노산의 ≥75%, ≥80%, ≥85%, ≥90%, ≥95%, 및 100%가 D-형 아미노산인 경우를 의미한다.
"네이키드 폴리뉴클레오티드"란 용어는, 콜로이드 물질과 복합체를 형성하지 않은 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 네이키드 폴리뉴클레오티드는 때때로 플라스미드 벡터 내에 클로닝된다.
"애쥬반트"란 용어는 항원과 함께 투여될 때 항원에 대한 면역 반응을 증가시키나, 단독으로 투여될 때에는 항원에 대한 면역 반응을 유도하지 않는 화합물을 의미한다. 애쥬반트는 몇몇 기작 예를 들어, 림프구 보충, B 세포 및/또는 T 세포의 자극, 및 대식 세포의 자극에 의하여 면역 반응을 증가시킬 수 있다.
"환자"란 용어는, 예방적 또는 치료적 처치를 받은 인간 및 기타 포유 동물 개체를 포함한다.
항체 간 경쟁은 공통된 항원 예를 들어, 알파-SN에 참고 항체가 특이적으로 결합하는 것을 시험중인 면역 글로불린이 억제하는 검정법에 의해 측정된다. 다수의 경쟁적 결합 검정법 예를 들어, 고상 직접 또는 간접 방사능 면역 검정법(RIA), 고상 직접 또는 간접 효소 면역 검정법(EIA), 샌드위치 경쟁 검정법(Stahli외 다수, Methods in Enzymology 9:242-253 (1983) 참조); 고상 직접 바이오틴-아비딘 EIA(Kirkland외 다수, J. Immunol. 137:3614-3619 (1986) 참조); 고상 직접 표지화 검정법, 고상 직접 표지화 샌드위치 검정법(Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988) 참조), I-125 사용 고상 직접 표지 RIA(Morel외 다수, Molec. Immunol. 25(1):7-15 (1988) 참조); 고상 직접 바이오틴-아비딘 EIA(Cheung외 다수, Virology 176:546-552 (1990)); 및 직접 표지화 RIA(Moldenhauer외 다수, Scand. J. Immunol. 32:77-82 (1990))이 공지되어 있다. 통상적으로, 이러한 검정법은 비 표지화 시험 면역 글로불린 및 표지화 참고 면역 글로불린중 어느 하나를 보유하는 세포 또는 고체 표면에 결합된 정제 항원을 사용하는 것을 포함한다. 경쟁적 억제는 시험 면역 글로불린의 존재 하에 세포 또는 고체 표면에 결합하는 표지의 양을 측정함으로써 관찰된다. 일반적으로, 시험 면역글로불린은 과량으로 존재한다. 경쟁적 검정법(경쟁적 항체)에 의하여 확인된 항체는 참고 항체의 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체와, 입체 장애가 발생하도록 참고 항체에 의해 결합된 에피토프에 충분히 근접하여 존재하는 인접 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다. 일반적으로, 경쟁적 항체가 과량으로 존재하면, 공통 항원에 대한 참고 항원의 특이적 결합은 50% 이상 또는 75% 이상까지 억제될 것이다.
"증상" 또는 "임상 증상"이란, 질환 예를 들어, 환자가 느끼기에 이상하게 느껴지는 변형된 보행(altered gait)에 대한 주관적인 증거를 의미한다. "징후"란, 전문의에 의하여 관찰된 질환의 객관적 증거를 의미한다.
2 이상의 항 인간 알파-시뉴클레인 항체(즉, 각각 상이한 에피토프를 인지하는 항체) 또는 인간 알파-시뉴클레인에 대한 항체 반응을 유도하는 2 이상의 폴리펩티드 또는 면역원을 투여함에 있어서 "~와 함께"란 어구의 의미는, 동시 투여하는 것 또는 동일한 치료 과정 중 투여하는 것을 포함한다. 제제의 동시 투여란, 융합 단백질 또는 컨쥬게이트(예를 들어, 물리적으로 상호 결합된 물질)의 형태로서 제제를 투여하는 것, 동시 투여하는 것(예를 들어, 제제를 투여형 예를 들어, 지연 방출형 또는 저장 제형(depot formulation)으로 배합 또는 화합하여 투여하는 것), 몇 분 간격으로 또는 2 시간 이내에 개별 조성물로서 각각 투여하는 것(공동 투여), 또는 동일한 날에 개별 조성물로서 투여하는 것을 포함한다. 동일한 치료 과정 중의 투여란, 동일한 증상을 치료 또는 예방하기 위해 두 제제를 환자에게 투여하는 것을 의미한다. 각각의 제제는 단일 회 또는 복수 회 투여될 수 있다. 예를 들어, 하나의 제제가 처음에 투여되고 두 번째 제제가 그 다음 날 또는 다음 주에 투여될 수 있다. 이와 유사하게, 2개의 제제는 각각 1회 이상 예를 들어, 연일 또는 하루 걸러서, 또는 한 주 걸러서 투여될 수 있거나, 또는 다른 스케쥴(예를 들어, 두 제제 중 어느 하나만을 투여함으로 인한 이점을 넘어설 것으로 예측되도록 환자에 유리한 스케쥴)에 따라서 투여될 수 있다.
SNx-y 형태로 지정된 단편은 아미노산 X로 시작하여 아미노산 Y로 끝나는 알파 시뉴클레인의 단편을 의미한다. 이러한 단편은 이종 폴리펩티드에 결합될 수 있지만, 인간 알파 시뉴클레인의 다른 아미노산에는 결합될 수 없으므로, 단편은 X 앞에서 시작하여 Y 다음에서 끝난다.
전술한 바와 같이 디폴트 매개 변수를 사용하여 알파-시뉴클레인 또는 이의 단편이 서열번호 1과 최대한으로 정렬될 경우, 알파-시뉴클레인 또는 이의 단편의 잔기는 서열번호 1에 따라서 번호가 매겨진다.
하나 이상의 인용된 요소를 "포함하는" 조성물 또는 방법은 특별히 인용되지 않은 기타 요소들도 포함할 수 있다. 예를 들어, 알파-SN 펩티드를 포함하는 조성물은 더욱 큰 폴리펩티드 서열의 성분으로서 분리된 알파-SN 펩티드 및 알파-SN 펩티드를 포함한다.
발명의 상세한 설명
1. 개론
본 발명은 환자의 뇌에 불용성인 덩어리로 응집된 알파-SN 펩티드의 침착물이 루이체의 형태로서 존재하는 것을 특징으로 하는 몇몇 질환 및 증상을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 질환을 총칭하여 루이체 형성 질환(Lewy Body disease; LBD)라 부르며, 이에는 파킨슨병(PD)을 포함한다. 이러한 질환은 β-병풍 시이트 구조를 띠고 티오플라빈-S 및 콩고-레드(Hasimoto, Ibid)로 염색되는 알파-SN의 응집체를 형성하는 것을 특징으로 한다. 본 발명은 알파-SN에 대한 면역원성 반응을 유도할 수 있는 제제를 사용하여 그러한 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 면역원성 반응은 뇌 세포에 시뉴클레인이 침착되는 것을 예방하거나 또는 이를 제거하는 역할을 한다. 비록 기작을 이해하는 것이 본 발명을 실시하는데 있어서 필수적인 것은 아니지만, 면역원성 반응은 세포 내에서 단독으로 또는 알파 시뉴클레인과 함께 흡수되는 시뉴클레인에 대한 항체로 인한 제거 현상을 유도할 수 있다. 실시예에 나타낸 결과들을 통하여, 알파 시뉴클레인에 대한 항체는 알파 시뉴클레인 침착물을 함유하는 세포 내에서, 단독으로 또는 알파 시뉴클레인과 함께, 혈뇌장벽을 통과하는 말초 혈관으로 투여되어 흡수됨을 알 수 있다. 흡수된 항체는 리소좀 경로 활성화를 통해 알파 시뉴클레인의 분해를 촉진할 수 있다. 변성된 형태로서 알파 시뉴클레인에 대해 친화성을 갖는 흡수된 항체는 또한 응집되지 않은 형태로 분자를 안정화시킬 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 항체는 세포 외부 계면 상에 시뉴클레인이 응집하는 것을 막을 수 있다. 예를 들어, 알파-시뉴클레인에 대한 항체는 뉴런 세포 표면에 비정상적으로 형성된 단백질을 인지하여 가교할 수 있다. 몇몇 방법에서, 제거 반응은 최소한 부분적으로 Fc 수용체 매개 식균 작용에 의해 실행될 수 있다. 시뉴클레인으로 인한 면역화는 뇌의 시냅스 및 뉴런 세포체에 시뉴클레인이 축적되는 것을 감소시킬 수 있다. 비록 기작을 이해하는 것이 본 발명을 실시하는데에 필수적인 것은 아니지만, 이러한 결과는 시뉴클레인에 대한 항체가 뉴런 세포(예를 들어, 시냅스 소포)에 의해 취하여지는 것으로써 설명될 수 있다.
임의로, 알파-SN에 대한 면역원성 반응을 유도시키는 제제는 Aβ에 대한 면역원성 반응을 유도시키는 제제와 함께 사용될 수 있다. 면역원성 반응은 Aβ 침착물이 생성된 개체(예를 들어, 알츠하이머병 및 파킨슨병이 모두 발병한 환자) 내에서 Aβ 침착물을 제거하는데 유용하지만; 면역원성 반응은 또한 시뉴클레인 침착물을 제거하는 활성을 보유한다. 그러므로, 본 발명은 이러한 제제를 단독으로, 또는 알츠하이머병이 발병하지 않았거나 또는 발병 위험이 있는 LBD 개체 내에서 알파-SN에 대한 면역원성 반응을 유도시키는 제제와 함께 사용한다.
본 발명은 추가로 아밀로이드 생성 질환의 예방 및 치료를 위한 약학 조성물 및 방법을 제공한다. 알파- 및 베타-시뉴클레인은 임의의 아밀로이드 생성 질환, 특히 알츠하이머병에서 아밀로이드 침착물의 핵심 생성(nucleation) 과정에 관여하는 것으로 파악된다(Clayton, D.F.외 다수, TINS 21(6): 249-255, 1998). 더욱 구체적으로, 알파- 및 베타-시뉴클레인(61∼95번 잔기)의 NAC 영역의 단편이 알츠하이머병 환자에 생성된 아밀로이드 플라크로부터 분리되었는데; 사실 이 단편은 황산 나트륨 도데실(SDS)로 용해한 후에 불용성으로 잔류하는 플라크 중 약 10%를 차지한다(George, J.M.외 다수 Neurosci. News 1: 12-17, 1995). 뿐만 아니라, 전장 알파-SN 및 이의 NAC 단편은 시험관 내에서 β-아밀로이드 펩티드를 불용성 아밀로이드로 응집하는 것을 가속화시키는 것으로 보고된 바 있다(Clayton, 상동). 아밀로이드 플라크의 NAC 성분은 이하에 기술된 바와 같이 본 발명의 면역학을 기초로 하는 치료법에서 표적으로 사용된다. 하나의 측면에 따르면, 본 발명은 환자의 체 내에서 아밀로이드 플라크의 시뉴클레인-NAC 성분에 대한 면역 반응을 유도하는데 효과적인 제제를 포함하는 약학 조성물을 포함한다. 이러한 조성물은 아밀로이드 생성 질환에서 플라크 침착을 예방, 지연 또는 감소시키는데에 효과적일 수 있다.
II . 알파 시뉴클레인에 대하여 면역원성 반응을 유도하는 제제
면역원성 반응은 면역원이 환자의 체내에서 알파-SN에 반응성인 항체를 생성하도록 투여될 때에 능동적일 수 있거나, 또는 항체가 환자의 체 내에서 알파-SN에 결합하도록 투여될 때 수동적일 수 있다.
1. 능동적 면역 반응을 유도하는 제제
치료제는 알파-SN 펩티드 내 임의의 에피토프에 대하여 특이적으로 유도되는 면역원성 반응을 유도한다. 바람직한 제제로서는 알파-SN 펩티드 자체 및 이의 단편이 있다. 미국 출원 제60/471,929호(2003년 5월 19일 출원) 및 PCT 특허 공보 WO 05/013889[상기 문헌 모두는 본원에 모든 목적의 참고 문헌으로서 인용됨]에는 치료제로서 사용될 수 있고, 임의로는 애쥬반트와 함께 사용될 수 있는 신규의 알파-시뉴클레인 단편에 관하여 개시되어 있다. 알파-SN 펩티드의 바람직한 에피토프에 대한 항체를 유도하고/유도하거나 가교 반응하는 천연 알파-SN 펩티드 단편의 변이체, 유사체 및 모의체도 사용될 수 있다. 미국 특허 출원 제 60/471,929호(2003년 5월 19일 출원) 및 PCT 특허 공보 WO 05/013889[상기 문헌 모두는 본원에 모든 목적의 참고 문헌으로서 인용됨]에는 시뉴클레인 병증 및 아밀로이드 생성 질환의 예방 및 치료 방법에 유용한 신규의 알파-시뉴클레인 단편을 제공한다. 임의로, 이러한 단편들은 애쥬반트와 함께 사용될 수 있다.
알파-시뉴클레인은 원래 인간의 뇌에서 AD 플라크의 비 β-아밀로이드 성분(NAC)의 전구체 단백질로서 확인된다[Ueda외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (23):11282-11286 (1993)]. 알파-SN은 또한 AD 아밀로이드의 비 Aβ 성분(NACP)의 전구체라고도 불리는데, 이는 140개의 아미노산으로 이루어진 펩티드이다. 알파-SN은 다음과 같은 아미노산 서열을 갖는다:
MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVLYVGSKTKEGVVHGVATVAEKTKEQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGSIAAATGFVKKDQLGKNEEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMPSEEGYQDYEPEA (서열번호 1) (Ueda 외 다수, Ibid.; GenBank 기탁 번호: P37840).
AD 아밀로이드의 비-Aβ 성분(NAC)은 알파-SN으로부터 유래된다. NAC 즉, 알파 시뉴클레인 내 고도의 소수성 영역은 28개 이상의 아미노산 잔기(60∼87번 잔기)(서열번호 3) 및 임의로는 35개의 아미노산 잔기(61∼95번 잔기)(서열번호 2)로 이루어진 펩티드이다. 도 1을 참조하시오. NAC는 베타-시이트 구조를 형성하는 경향을 보인다(Iwai외 다수, Biochemistry, 34:10139-10145). Jensen외 다수에 의하여, NAC는 다음과 같은 아미노산 서열을 보유하는 것으로 보고된 바 있다:
EQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGSIAAATGFV (서열번호 2) (Jensen외 다수, Biochem. J. 310 (Pt 1): 91-94 (1995); GenBank 기탁 번호: S56746).
Ueda외 다수에 의하여, NAC는 다음과 같은 아미노산 서열을 보유하는 것으로 보고된 바 있다:
KEQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGS (서열번호 3) (Ueda외 다수, PNAS USA 90:11282-11286 (1993)).
분해된 알파-SN 또는 이의 단편 예를 들어, NAC란, 단량체 펩티드 단위를 의미한다. 분해된 알파-SN 또는 이의 단편은 일반적으로 가용성으로서, 자가-응집하여 가용성 올리고머를 형성할 수 있다. 알파-SN 및 이의 단편의 올리고머는 일반적으로 가용성이며 흔히 알파-헬릭스 구조로서 존재한다. 단량체 알파-SN은 동결 건조된 펩티드를 순수한 DMSO 중에서 초음파로 분해함으로써 시험관 내에서 제조될 수 있다. 결과로 생성된 용액을 원심 분리하여 임의의 불용성 입자를 제거한다. 응집된 알파-SN 또는 이의 단편 예를 들어, NAC란, 불용성 베타-시이트 조립체로 회합되는 알파-SN 또는 이의 단편의 올리고머를 의미한다. 응집된 알파-SN 또는 이의 단편 예를 들어, NAC는 또한 섬유상 중합체를 의미한다. 섬유는 일반적으로 불용성이다. 몇몇 항체들은 가용성 알파-SN 또는 이의 단편, 또는 응집된 알파-SN 또는 이의 단편에 결합한다. 몇몇 항체들은 단량체 형태 또는 섬유형보다 더욱 강하게 알파-시뉴클레인 올리고머와 결합한다. 몇몇 항체들은 가용성 및 응집된 알파-SN 또는 이의 단편에 결합하고, 임의로 올리고머 형에 결합하기도 한다.
PD의 특징인 루이체의 주요 성분인 알파-SN과 이의 에피토프 단편 예를 들어, NAC, 또는 이 NAC 이외의 단편은 면역원성 반응을 유도하는데 사용될 수 있다. 바람직하게, 이러한 단편은 알파-SN 또는 이의 유사체의 4개 이상의 아미노산을 포함한다. 몇몇 활성 단편은 알파-SN의 C 말단에 또는 이에 인접하여 존재하는(70∼140번, 100∼140번, 120∼140번, 130∼140번 또는 135∼140번 아미노산 내에 존재하는) 에피토프를 포함한다. 몇몇 활성 단편에 있어서, 에피토프의 C 말단 잔기는 알파-SN의 C 말단 잔기이다. 루이체의 기타 성분 예를 들어, 신필린-1, 파킨, 유비퀴틴, 신경 미세 섬유, 베타-크리스탈린 및 이의 에피토프 단편도 또한 면역원성 반응을 유도하는데 사용될 수 있다.
주목할 만한 것은, 알파-시뉴클레인의 임의의 바람직한 단편은 C-말단 분자로부터 유래한다는 것이다. 이러한 단편은 인간 알파-시뉴클레인의 1∼69번 잔기가 결여되어 있다. 이러한 단편을 이용한 면역화는 인간 알파-시뉴클레인의 70∼140번 잔기 내에 존재하는 하나 이상의 에피토프에 대한 항체가 관여하는 면역원성 반응을 유도한다. 면역원성 C-말단 단편은 도 8에 나타낸 바와 같이 SN85-99, SN109-123, SN112-126 및 SN126-138을 포함하며, 이것들 중 하나와 상이한 기타 단편 즉, 양 말단부 중 어느 한쪽에 존재하는 2개 이상의 부가 아미노산 또는 그보다 적은 수의 아미노산으로 이루어진 단편을 포함한다. 기타 바람직한 단편 SN83-140은 이들 에피토프 모두를 포함한다. 알파 시뉴클레인의 몇몇 단편들은 인간 알파 시뉴클레인의 SN83-101, SN107-125, SN110-128 및 SN 124-140 중 하나 이상 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 생성한다. 일부 단편들은 상기 4개의 단편중 어느 하나 내에만 특이적으로 결합하는 항체를 생성한다. 예를 들어, 단편 SN83-101은 알파-시뉴클레인의 83번 잔기에서 시작되어 101번 잔기에서 종결되고, SN83-101에 특이적으로 결합하는 항체만을 생성한다.
몇몇 단편은 알파 시뉴클레인으로부터 유래된 연속적 잔기를 총 40개 미만 보유한다. 이러한 단편들 중 일부는 SN125-140, SN130-140, SNS87,97, SN111-121, SN114-124 또는 SN128-136을 포함한다. 몇몇 단편은 알파 시뉴클레인의 C 말단 절반부(즉, 70∼140번 잔기)로부터 유래된 연속적 아미노산을 총 5∼20개 보유한다. 몇몇 단편은 알파 시뉴클레인의 120∼140번 위치에서 유래된 연속적 아미노산을 5∼20개 보유한다. 특히 바람직한 단편으로서는 SN124-140, SN125-140, SN126-140, SN127-140, SN128-140, SN129-140, SN130-140, SN131-140, SN132-140, SN133-140, SN134-140, SN135-140, SN136-140, SN137-140, SN124-139, SN125-139, SN126-139, SN127-139, SN128-139, SN124-139, SN125-139, SN126-139, SN127-139, SN128-139, SN129-139, SN130-139, SN131-139, SN132-139, SN133-139, SN134-139, SN135-139, SN136-139, SN137-139, SN124-138, SN124-138, SN125-138, SN126-138, SN127-138, SN128-138, SN129-138, SN130-138, SN131-138, SN132-138, SN133-138, SN134-138, SN135-138, SN136- 138, S SN124-137, SN125-137, SN126-137, SN127-137, SN128-137, SN129-137, SN130- 137, SN131-137, SN132-137, SN133-137, SN134-137, SN135-137, SN124-136, SN125-136, SN126-136, SN127-136, SN128-136, SN129-136, SN130-136, SN131-136, SN132-136, SN133-136, 및 SN134-136을 포함한다.
뇌에 루이체를 형성하거나 알파-시뉴클레인이 응집되는 것을 특징으로 하는 질환(예를 들어, 파킨슨병)을 예방 또는 치료하는데 유용한 알파-시뉴클레인의 기타 단편은 상기 분자의 N-말단부로부터 유래된다. 이러한 단편에 의한 면역화는 1∼20번 잔기 내 하나 이상의 에피토프 또는 1∼10번 잔기 내 하나 이상의 에피토프에 대한 항체가 관여하는 면역원성 반응을 유도한다. 실시예 IX에 나타낸 바와 같이, 6H7 즉, 알파-시뉴클레인의 아미노 말단을 인지하는 항체를 투여하면, 인간 알파-시뉴클레인을 과발현하는 트랜스제닉 마우스의 뇌에 형성된 알파-시뉴클레인 응집체가 제거되는 것을 알 수 있었다. 알파-시뉴클레인 아미노 말단부를 포함하는 알파-시뉴클레인 단편으로 면역화하면 응집체를 제거하고/제거하거나 응집체 형성을 예방하게 될 것으로 기대된다.
그러므로, 하나의 측면에서 본 발명은 뇌에 루이체 또는 알파-시뉴클레인 응집체가 형성되는 것을 특징으로 하는 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 이러한 질환이 발병하였거나 또는 발병의 위험이 있는 환자에게 서열번호 1에 따라서 번호가 매겨지는 잔기인, 인간 알파-시뉴클레인의 1∼40번 잔기, 1∼20번 잔기 또는 1∼10번 잔기 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체가 관여하는 면역원성 반응을 유도하는데 효과적인 알파-시뉴클레인의 면역원성 단편을 포함하는 폴리펩티드를 투여함으로써 실시된다. 하나의 구체예에서, 알파-시뉴클레인의 면역원성 단편은 알파 시뉴클레인의 70∼140번 잔기가 결여되어 있다. 하나의 구체예에서, 면역원성 단편은 알파-시뉴클레인의 41∼140번 잔기가 결여되어 있다. 하나의 구체예에서, 면역원성 단편은 알파 시뉴클레인의 25∼140번 잔기가 결여되어 있다.
뇌에 루이체 또는 알파-시뉴클레인 응집체가 형성되는 것을 특징으로 하는 질환을 예방 또는 치료하는 데에 적당한 면역원으로서는 알파 시뉴클레인의 아미노 말단으로부터 유래된 5∼20개의 연속 아미노산 잔기를 포함하는 단편을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 구체예에서, 단편은 알파 시뉴클레인의 제1(아미노 말단) 잔기를 포함한다. 그러므로, 대표적인 단편으로서는 서열번호 1의 1∼Na 잔기[여기서, 상기 Na는 5∼20 임]로 된 서열, 예를 들어, MDVFMKGLSKAKEGVVAAAE; MDVFMKGLSKAKEGVVAAA; MDVFMKGLSKAKEGVVAA; MDVFMKGLSKAKEGVVA; MDVFMKGLSKAKEGVV; MDVFMKGLSKAKEGV; MDVFMKGLSKAKEG; MDVFMKGLSKAK; MDVFMKGLSKA; MDVFMKGLSK; MDVFMKGLS; MDVFMKGL; MDVFMKG; MDVFMK; 및 MDVFM을 포함한다. 기타 바람직한 구체예에서, 상기 단편은 알파-시뉴클레인의 아미노-말단 잔기를 포함하지 않지만, 알파-시뉴클레인의 두 번째 및/또는 세 번째 잔기를 포함한다. 그러므로, 대표적인 단편은 서열번호 1의 2∼Nb 잔기, 및 3∼Nc 잔기[여기서, 상기 Nb는 6∼21이고, Nc는 7∼22임]로 이루어진 서열, 예를 들어, DVFMKGLSKAKEGVVAAAEK; DVFMKGLSKAKEGVVAAAE; DVFMKGLSKAKEGVVAAA; DVFMKGLSKAKEGVVAA; DVFMKGLSKAKEGVVA; DVFMKGLSKAKEGVV; DVFMKGLSKAKEGV; DVFMKGLSKAKEG; DVFMKGLSKAK; DVFMKGLSKA; DVFMKGLSK; DVFMKGLS; DVFMKGL; DVFMKG; DVFMK, VFMKGLSKAKEGVVAAAEKT; VFMKGLSKAKEGVVAAAEK; VFMKGLSKAKEGVVAAAE; VFMKGL SKAKEGWAAA; VFMKGLSKAKEGWAA; VFMKGLSKAKEGWA; VFMKGLSKAKEGW; VFMKGLSKAKEGV; VFMKGLSKAKEG; VFMKGLSKAK; VFMKGLSKA; VFMKGLSK; VFMKGLS; VFMKGL; 및 VFMKG를 보유한다. 이하에 기술된 바와 같이, 전술한 단편들은 담체 분자(예를 들어, 컨쥬게이트 또는 융합 단백질, 섹션 II(3) 참조)에 결합될 수 있다. 대안적으로, 이하에 기술된 바와 같이, 상기 단편은 개체를 상기 단편을 암호화하는 핵산으로 백신화시켜 투여될 수 있다(섹션 II(4) 참조).
알파-SN을 참고로 하였을 때, 이는 상기된 바와 같은 천연 인간 아미노산 서열과 유사체 예를 들어, 대립 형질성 종류 및 유도된 변이체, 전장 형태 및 이의 면역원성 단편을 포함한다. 서열번호 1과 동일한 아미노산 서열 또는 이의 대립형질성 변이체를 보유하는 단백질을 의미하는 인간 알파 시뉴클레인은 모든 구체예에서 바람직하다. 유사체는 통상적으로 천연 생성된 펩티드와는 한 군데, 두 군데 또는 여러 군데의 위치에 차이가 있으며, 종종 보존적 치환이 발생하기도 한다. 유사체는 통상적으로 천연 펩티드와는 80% 이상 또는 90% 이상의 서열 상동성을 나타낸다. 천연 알파 시뉴클레인의 유사체 내에 존재하는 아미노산 위치는 유사체 및 천연 알파 시뉴클레인이 최대한으로 정렬될 때 천연 알파 시뉴클레인 중에 존재하는 해당 아미노산의 번호로 할당된다. 몇몇 유사체는 또한 한 군데, 두 군데 또는 여러 군데의 위치에서 N 말단 또는 C 말단이 변형된 아미노산 또는 비 천연 아미노산을 포함한다. 예를 들어, 알파-SN의 139번 위치의 천연 글루타민산 잔기는 이소-아스파르트산으로 치환될 수 있다. 비천연 아미노산의 예로서는 D, 알파, 알파-이중 치환 아미노산, N-알킬 아미노산, 락트산, 4-히드록시프롤린, 감마-카복시글루타메이트, 엡실론-N,N,N-트리메틸리신, 엡실론-N-아세틸리신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-히드록시리신, 오메가-N-메틸아르기닌, 베타-알라닌, 오르니틴, 노르루신, 노르발린, 히드록시프롤린, 티록신, 감마-아미노 부티르산, 호모세린, 시트룰린 및 이소아스파르트산이 있다. 치료제는 또한 알파-SN 단편의 유사체를 포함한다. 본 발명의 몇몇 치료제로서는 모든 D 펩티드 예를 들어, 모든 D 알파-SN 또는 모든 D NAC, 및 모든 D 펩티드 유사체가 있다. 유사체는 천연 인간 알파 시뉴클레인에 대한 항체의 폴리클로날 군집에 특이적으로 결합한다. 단편 및 유사체는 이하에 기술된 바와 같이 미처리 또는 위약 대조구와 비교하면서 트랜스제닉 동물 모델에서 예방 또는 치료 효능에 대하여 스크리닝 될 수 있다.
알파-SN, 이의 단편 및 유사체는 고상 펩티드 합성법 또는 재조합 발현에 의하여 합성될 수 있거나, 또는 천연 공급원으로부터 얻을 수 있다. 자동 펩티드 합성기는 다수의 공급처 예를 들어, 캘리포니아 포스터 시티에 소재하는 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)로부터 시판되고 있다. 재조합 발현은 박테리아 예를 들어, 대장균(E. coli), 효모, 곤충 세포 또는 포유 동물 세포 내에서 실현될 수 있다. 재조합 발현 방법에 관하여는 문헌[Sambrook외 다수, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (C.S.H.P. Press, NY 2d ed., 1989]에 기술되어 있다. 알파-SN 펩티드의 일부 유형들은 또한 예를 들어, 바켐(BACHEM) 및 아메리칸 펩티드 컴파니, 인코포레이티드(American Peptide Company, Inc.)에서 시판중에 있다.
치료제는 또한 예를 들어, 알파-SN 펩티드의 활성 단편을 기타 아미노산과 함께 포함하는 더욱 긴 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, 바람직한 제제는 이종 아미노산 서열에 대하여 조력 T-세포 반응을 유도함으로써 알파-SN 절편에 대한 B-세포 반응을 유도하는, 이종 아미노산 서열에 융합된 알파-SN의 절편을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 이러한 폴리펩티드는 이하에 기술된 바와 같이 미처리 또는 위약 대조구와 비교하면서 동물 모델에서 예방 또는 치료 효능에 대하여 스크리닝 될 수 있다. 알파-SN 펩티드, 유사체, 활성 단편 또는 기타 폴리펩티드는 결합된 형태 또는 다량체 형태 또는 분해된 형태로 투여될 수 있으며, 치료제는 또한 단량체 면역원성 제제로 이루어진 다량체를 포함하기도 한다. 본 발명의 치료제는 폴리리신 서열을 포함할 수 있다.
추가의 변형에 있어서, 면역원성 펩티드 예를 들어, 알파-SN의 단편은 바이러스 또는 박테리아에 의해서 면역원성 조성물의 일부분으로서 제공될 수 있다. 면역원성 펩티드를 암호화하는 핵산은 바이러스 또는 박테리아의 게놈 또는 에피좀 내에 통합된다. 임의로, 핵산은 면역원성 펩티드가 분비형 단백질로서 발현되거나 또는 박테리아의 경막 단백질 또는 바이러스의 외부 표면 단백질과의 융합 단백질로서 발현되어 펩티드가 디스플레이되는 방식으로 통합된다. 이러한 방법에 사용되는 바이러스 또는 박테리아는 비병원성이거나 또는 약독성이어야 한다. 적당한 바이러스로서는 아데노바이러스, HSV, 베네주엘라 돼지 뇌염 바이러스 및 기타 알파 바이러스, 구내염 바이러스, 및 기타 래비도(rhabido) 바이러스, 백시니아 및 계두 바이러스를 포함한다. 적당한 박테리아로서는 살모넬라(Salmonella) 및 쉬겔라(Shigella)를 포함한다. HBV의 HBsAg에 대한 면역원성 펩티드의 융합체가 특히 적당하다.
치료제는 또한 알파-SN과의 아미노산 서열 유사성이 크지는 않지만, 알파-SN의 모의체로서 사용되어 유사한 면역 반응을 유도하는 기타 화합물 및 펩티드를 포함한다. 예를 들어, 베타-병풍형 시이트를 형성하는 임의의 펩티드 및 단백질은 적합성에 대하여 스크리닝될 수 있다. 알파-SN 또는 기타 루이체 성분에 대한 모노클로날 항체에 대하여 생성된 항 유전자형 항체도 사용될 수 있다. 이러한 항-Id 항체는 항원을 모의하고 이 항원에 대한 면역 반응을 유도한다[Essential Immunology, Roit ed., Blackwell Scientific Publications, Palo Alto, CA 6th ed., p. 181 참조]. 알파-SN 이외의 제제는 상기 나열한 알파-SN(예를 들어, NAC)의 바람직한 절편 중 하나 이상에 대한 면역 반응을 유도해야 한다. 바람직하게, 이러한 제제는 알파-SN의 기타 절편에 대하여 유도되지 않고 상기 절편 중 하나에 대해 특이적으로 유도되는 면역원성 반응을 유도한다.
펩티드 또는 기타 화합물의 랜덤한 라이브러리도 또한 적합성에 대하여 스크리닝될 수 있다. 조합형 라이브러리는 다양한 종류의 화합물 즉 단계별 방식으로 합성될 수 있는 화합물에 대해서 제조될 수 있다. 이러한 화합물로서는 폴리펩티드, 베타-선회 모의체, 다당류, 인지질, 호르몬, 프로스타글란딘, 스테로이드, 방향족 화합물, 복소환 화합물, 벤조디아제핀, N-치환 글리신의 올리고머 및 올리고카바메이트를 포함한다. 상기 화합물의 큰 조합형 라이브러리는 WO 95/12608(Affymax), WO 93/06121(Affymax), WO 94/08051(Columbia University), WO 95/35503(Pharmacopeia) 및 WO 95/30642(Scripps)[상기 문헌들은 각각 모든 목적으로 본원에 참고 문헌으로서 인용됨]에 개시된, 암호화 합성 라이브러리(ESL) 방법에 의해 구성될 수 있다. 펩티드 라이브러리는 또한 파아지 디스플레이 방법에 의해 제조될 수도 있다. 예를 들어, WO 91/18980(Devlin)을 참조하시오.
조합형 라이브러리 및 기타 화합물은 이것이 알파-SN 또는 기타 루이체 성분에 특이적인 것으로 공지된 항체 또는 림프구(B 또는 T)에 결합하는 능력을 측정함으로써 적합성에 대하여 처음 스크리닝된다. 예를 들어, 초기 스크리닝은 알파-SN 또는 이의 단편에 대한 임의의 폴리클로날 혈청 또는 모노클로날 항체를 이용하여 수행될 수 있다. 라이브러리는 인간 알파 시뉴클레인의 1∼20번 잔기 또는 70∼140번 잔기 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체와 결합하는 능력에 대하여 스크리닝 되는 것이 바람직하다. 이후 화합물은 알파-SN(예를 들어, SN1-20, SN83-101, SN107-125, SN110-128 및 SN124-140) 내에 존재하는 특이 에피토프에 특이적으로 결합하는지 여부에 대하여 스크리닝될 수 있다. 화합물은 항체 에피토프 특이성을 맵핑하는 것과 동일한 방법으로 시험될 수 있다. 이후, 이러한 스크리닝에 의하여 확인된 화합물은 추가로 알파-SN 또는 이의 단편에 대한 항체 또는 반응성 림프구를 유도하는 능력에 대해 분석된다. 예를 들어, 혈청의 복수 회 희석물은 알파-SN 또는 이의 단편으로 예비 코팅된 미세 역가 평판 상에서 시험될 수 있으며, 표준적인 ELISA는 알파-SN 또는 이의 단편에 대한 반응성 항체에 대하여 시험하기 위해 수행될 수 있다. 이후 화합물은 실시예에 기술된 바와 같이, 루이체와 관련된 질환의 소인을 갖도록 만든 트랜스제닉 동물에서 예방적 및 치료적 효능에 대해 시험될 수 있다. 이러한 동물로서는 예를 들어, WO 98/59050(Masliah외 다수, Science 287: 1265-1269 (2000)) 및 문헌[van der Putter외 다수, J. Neuroscience 20: 6025-6029 (2000)]에 기술된 바와 같이, 알파-SN 또는 이의 돌연 변이체(예를 들어, 53번 위치의 알라닌이 트레오닌으로 치환된 경우)를 과발현하는 트랜스제닉 마우스, 또는 APP 또는 이의 돌연 변이체를 과발현하는 트랜스제닉 마우스를 포함한다. 특히 바람직한 것으로는 문헌[Games외 다수, Nature 373, 523 (1995)]에 기술된 바와 같이 APP의 717 돌연변이가 발생한 시뉴클레인 트랜스제닉 마우스와 문헌[ McConlogue외 다수, 미국 특허 제5,612,486호 및 Hsiao외 다수, Science 274, 99 (1996); Staufenbiel외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 13287-13292 (1997); Sturchler-Pierrat외 다수, Proc. Natl Acad. Sci. USA 94, 13287-13292 (1997); Borchelt외 다수, Neuron 19, 939-945 (1997)]에 기술된 바와 같이 APP의 670/671 스웨덴 돌연변이가 발생한 마우스를 포함한다. 이러한 시뉴클레인/APP 트랜스제닉 동물의 예는 WO 01/60794에 제공되어 있다. 부가의 PD 동물 모델로서는, 6-히드록시도파민, 로테논 및 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘(MPTP) 동물 모델[M. Flint Beal, Nature Reviews Neuroscience 2:325-334 (2001)]을 포함한다. 전술한 바와 같은 알파-SN 및 알파-SN의 단편과 기타 루이체 성분 및 이의 유사체 또는 단편을 포함하는 더욱 긴 펩티드의 기타 유효한 유사체에 대하여도 동일한 스크리닝 방법을 사용할 수 있다.
i. 알파- 시뉴클레인의 양 말단부에 존재하는 에피토프에 대한 면역 반응을 개시하는 능동적 면역화
본원에 기술된 바와 같이, 알파-시뉴클레인의 아미노 말단부 및 카복시 말단부에 존재하는 에피토프를 인지하는 항체(즉, 8A5 및 6H7)를 투여하면, 인간의 알파-시뉴클레인을 과발현하는 트랜스제닉 마우스의 뇌에 알파-시뉴클레인 응집체가 생성되는 것을 감소시킬 수 있다(예를 들어, 실시예 IX 참조). 부분적으로 이러한 발견을 바탕으로 했을 때, 알파-시뉴클레인의 양 말단에 존재하는 에피토프에 대한 면역 반응을 유도하는 것은 예방 및 치료 방법에 이점을 제공할 수 있다. 그러므로, 하나의 측면에서, 본 발명은 뇌에 루이체 또는 알파-시뉴클레인 응집체가 생성되는 것을 특징으로 하는 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하며, 이 방법은 인간 알파-시뉴클레인의 1∼20번 잔기, 또는 대안적으로 1∼10번 잔기 내에 존재하는 에피토프와, 인간 알파-시뉴클레인의 70∼140번 잔기 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체가 관여하는 면역원성 반응을 유도함으로써 실시된다. 바람직한 구체예에서, 면역원성 반응은 인간 알파-시뉴클레인의 1∼20번 잔기 및 인간 알파-시뉴클레인의 120∼140번 잔기 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체가 관여한다. 단백질의 양 말단 부위에 존재하는 에피토프에 대한 항체가 관여하는 면역 반응을 "이중(dual)" 면역 반응이라 칭할 수 있다. 이중 면역 반응은 다수의 방식으로 유도될 수 있으며, 본 발명은 이러한 반응을 개시하는 임의의 특정 방법에 한정되지 않는다.
이중 면역 반응은 인간 알파-시뉴클레인의 1∼20번 잔기내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 및 인간 알파-시뉴클레인의 70∼140번 잔기 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체가 관여하는 면역원성 반응을 유도하는데 효과적인 단일의 폴리펩티드로 백신화함으로써 유도될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 항체는 인간 알파-시뉴클레인의 1∼10번 잔기 및/또는 120∼140번 잔기 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 인간 알파-시뉴클레인의 최소한 25∼69번 잔기, 인간 알파-시뉴클레인의 최소한 30∼110번 잔기, 또는 인간 알파-시뉴클레인의 최소한 21∼119번 잔기가 결여된 폴리펩티드를 사용할 수 있다. 이러한 폴리펩티드가 사용될 때, 면역원성 반응은 인간 알파-시뉴클레인의 25∼69번 잔기 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하지 않는다.
하나의 폴리펩티드가 인간 알파-시뉴클레인의 1∼20번 잔기 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체와, 인간 알파-시뉴클레인의 70∼140번 잔기 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체가 관여하는 면역원성 반응을 유도하는 경우, 이중 면역 반응은 또한 2개(또는 그 이상의) 폴리펩티드와 함께 백신화 함으로써 유도될 수도 있다. 바람직한 구체예에서, 항체는 인간 알파-시뉴클레인의 1∼10번 잔기 및/또는 120∼140번 잔기 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 그러므로, 치료법 또는 예방법은, 인간 알파-시뉴클레인의 1∼20번 잔기 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체가 관여하는 면역원성 반응을 유도하는 알파-시뉴클레인의 제1 면역원성 단편과, 인간 알파-시뉴클레인의 70∼140번 잔기(또는 120∼140번 잔기) 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체가 관여하는 면역원성 반응을 유도하는 제2 면역원성 단편을 투여함으로써 실시될 수 있다. 인간 알파-시뉴클레인의 단편은 전술한 바와 같이 조합적 방식으로 투여될 수 있다[예를 들어, 융합 단백질 또는 컨쥬게이트로서 투여하거나, 공동 제형화 하거나, 또는 동일한 치료 과정 중에 투여함].
ii . 조성물 및 키트
본 발명은 알파-시뉴클레인의 양 말단부에 존재하는 에피토프에 대한 면역 반응을 개시하는데에 유용한 조성물을 제공한다. 하나의 폴리펩티드가 인간 알파-시뉴클레인의 1∼20번 잔기 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체와, 인간 알파-시뉴클레인의 70∼140번 잔기 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체가 관여하는 면역원성 반응을 유도하는 경우, 조성물은 전술한 바와 같이 2 이상의 폴리펩티드를 함유하는 투여형 및 제형을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 인간 알파-시뉴클레인의 1∼10번 잔기 및/또는 120∼140번 잔기 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 유도한다. 대표적인 제형(공동 제형화 폴리펩티드(co-formulating polypeptide)로서 적합한 제형)은 당 업계에 공지되어 있으며, 이하 섹션 VII("치료 방법")에 기술된 것들을 포함한다.
본 발명은 또한 알파-시뉴클레인의 양 말단부에 존재하는 에피토프에 대한 면역 반응을 개시하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 인간 알파-시뉴클레인의 1∼20번 잔기 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체와, 인간 알파-시뉴클레인의 70∼140번 잔기 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체가 관여하는 면역원성 반응을 유도하는 2개 이상의 제제를 포함한다. 상기 제제는 동시 사용을 위해 단일 제제에 배합될 수 있다. 상기 제제는 각각 동시 사용, 연속 사용 또는 별도 사용될 상이한 폴리펩티드를 함유하는 별도의 용기(예를 들어, 바이알, 시린지, 튜브 등)에 담길 수 있다. 이와 같은 본 발명의 제제는 루이체 생성 질환의 치료에 최소한 부분적으로나마 유효한 기타 제제와 함께 임의로 투여될 수 있다. 키트는 또한 환자에게 투여될 본 발명의 제제가 혈뇌장벽을 통과하는 량을 증가시키는 제제와, 기타 애쥬반트 및 물질을 포함할 수도 있다.
2. 수동적 면역 반응용 제제
본 발명의 치료제는 또한 알파-SN 또는 기타 루이체 성분에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 본 발명은 또한 아밀로이드 플라크의 시뉴클레인-NAC 성분에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 알파-SN에 면역 반응성인 항체에 관하여는 공지되어 있다[예를 들어, Arima외 다수, Brian Res. 808: 93-100 (1998); Crowther외 다수, Neuroscience Lett. 292: 128-130 (2000); Spillantini외 다수 Nature 388: 839-840 (1997) 참조]. 이러한 항체는 모노클로날이거나 또는 폴리클로날일 수 있다. 이러한 항체중 몇몇은 가용성 단량체 형태에 특이적으로 결합하지 않고서 알파-SN의 불용성 응집체에 특이적으로 결합한다. 일부는 불용성 응집형에 결합하지 않고 가용성 단량체 형태에 특이적으로 결합한다. 일부는 응집형 및 가용성 단량체 형태 둘 다에 특이적으로 결합한다. 이러한 항체의 일부는 천연 생성 전장 알파-SN에 결합하지 않고 알파-SN의 천연 생성 단형(예를 들어, NAC)에 특이적으로 결합한다. 몇몇 항체는 단형에 결합하지 않고 장형에 특이적으로 결합한다. 몇몇 항체는 LB의 기타 성분에 결합하지 않고 알파-SN에 특이적으로 결합한다. 몇몇 항체는 아밀로이드 플라크의 기타 성분에 특이적으로 결합하지 않고 알파-SN에 특이적으로 결합한다. 원상태 알파-시뉴클레인에 특이적으로 결합하지 않고 알파-시뉴클레인의 단편에 특이적으로 결합하는 말단-특이적 항체에 관하여 개시되어 있는, PCT 특허 출원 공보 WO 05/0138889 및 미국 특허 출원 제60/471,929호(2003년 5월 19일자 출원)[본원에 모든 목적의 참고 문헌으로서 인용됨]를 참조하시오. 이러한 항체들은 시뉴클레인 병증 및 아밀로이드 생성 질환의 예방 및 치료 방법에 유용하다.
본 발명의 지원 하에 수행된 실험에서, 예측적 생체 외 검정법(실시예 VII)을 이용하여 시뉴클레인-NAC에 특이적으로 결합하는 항체가 소멸되는지 여부에 관하여 시험하였다. NAC에 대한 항체를 아밀로이드 플라크와 미세 아교 세포를 함유하는 뇌 조직 시료와 접촉시켰다. 토끼 혈청을 대조구로서 사용하였다. 추후 관찰한 결과, 항체의 소멸 활성의 지표가 되는 플라크의 수와 크기가 눈에 띄게 감소하였음을 알 수 있었다.
상기 데이터를 통하였을 때, 알츠하이머병과 기타 아밀로이드 생성 질환과 관련된 아밀로이드 플라크 농도는 NAC의 에피토프에 대해 생성된 면역 시약을 투여함으로써 상당히 감소될 수 있으며, 여기서 상기 시약은 아밀로이드 플라크 농도를 감소시키는데에 효과적이다. 다양한 항체가 이러한 조성물에 사용될 수 있다는 사실도 이해할 수 있다. 전술한 바와 같이, 미국 특허 출원 제60/471,929호(2003년 5월 19일 출원)에는 원상태의 알파-시뉴클레인에 특이적으로 결합하지 않고 알파-시뉴클레인의 단편에 특이적으로 결합하는 말단-특이적 항체에 관하여 개시되어 있다.
일반적으로 치료 방법에 사용된 항체는 원상태의 불변 영역 즉, 최소한 Fc 수용체와 상호 작용하기에에 충분한 불변 영역을 보유한다. 인간 이소타입 IgG1은 식세포 상에 존재하는 FcRI 수용체에 대한 인간 이소타입의 친화도가 가장 높기때문에 바람직하다. 항체의 한쪽 팔(arm)은 알파-SN에 대해 특이성을 보유하고, 다른 쪽 팔은 Fc 수용체에 대해 특이성을 보유하는, 이중 특이적 Fab 단편도 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, SDS로 처리되었을 때, 일부 항체들은 알파-SN에 약 106, 107, 108, 109 또는 1010 M-1의 친화도로 결합(임의로는 변성된 형태로 결합)한다. 면역 세포 화학적 방법에 따라 측정한 바에 의하면, 본 발명의 몇몇 항체는 시냅스 또는 뉴런 세포체에 존재하는 인간 알파 시뉴클레인에 특이적으로 결합함을 알 수 있다.
폴리클로날 혈청은 통상적으로 알파-SN의 길이 방향으로 존재하는 몇몇 에피토프에 결합하는 항체의 혼합 군집을 포함한다. 그러나, 폴리클로날 혈청은 알파-SN의 특정 절편 예를 들어, NAC에 특이적일 수 있다. 특정 절편에 특이적인 폴리클로날 혈청은 이 절편에 특이적으로 결합하는 항체를 함유하고, 알파-SN의 기타 절편에 특이적으로 결합하는 항체는 결여되어 있다. 모노클로날 항체는 입체적(conformational) 또는 비 입체적(nonconformational) 에피토프일 수 있는 알파-SN 내에 존재하는 특이적 에피토프에 결합한다. 알파-SN이 SDS로 변성될 때 비 입체적 에피토프는 잔류하게 된다. 항체의 예방적 및 치료적 효능은 본 발명의 실시예에 기술된 트랜스제닉 동물 모델 실험을 통하여 시험될 수 있다. 몇몇 모노클로날 항체는 NAC 내에 존재하는 에피토프에 결합한다. 몇몇 방법에서, 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 다수의 모노클로날 항체가 사용된다. 이러한 항체는 연속적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 알파-SN 이외에 루이체 성분에 대한 항체도 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체는 신경 미세 섬유, 유비퀴틴 또는 신필린에 대해 생성될 수 있다. 치료제는 또한 알파-SN 유사체 및 이의 단편에 대하여 생성된 항체를 포함하기도 한다. 본 발명의 일부 치료제는 모두 D 펩티드(all-D peptide)로서 예를 들어, 모두-D 알파-SN이거나 모두-D NAC이다.
항체가 특정 잔기 예를 들어, 알파-SN1∼5 내에 존재하는 에피토프에 결합함은, 이 항체가 이러한 특정 잔기(즉, 이 경우에는 알파-SN 1∼5)를 함유하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 것을 의미한다. 이러한 항체는 알파-SN 1∼5 내에 존재하는 모든 잔기와 결합해야 하는 것은 아니다. 뿐만 아니라, 알파-SN 1∼5에서 발생하는 모든 단일 아미노산 치환 또는 결실이 반드시 결합 친화도에 영향을 미치는 것도 아니다. 항체의 에피토프 특이성은 예를 들어, 상이한 일원들이 알파-SN의 상이한 종속 서열을 디스플레이하는 파아지 디스플레이 라이브러리(phage display library)를 형성함으로써 측정될 수 있다. 이후 파아지 디스플레이 라이브러리는 시험 중인 항체에 특이적으로 결합하는 일원에 대하여 선택된다. 서열 군이 분리된다. 통상적으로, 이러한 군은 공통의 중심 서열을 함유하며, 이 서열의 측접 서열 길이는 일원마다 상이하다. 항체에 특이적으로 결합하는 가장 짧은 중심 서열은 항체에 의해 결합되는 에피토프를 한정한다. 항체는 또한 에피토프 특이성이 이미 결정되어 있는 항체를 사용하는 경쟁 검정법에서 에피토프 특이성에 대해 시험 될 수도 있다.
본 발명의 일부 항체는 NAC 내 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 항체는 시뉴클레인의 22-킬로달톤 글리코실화 형태 예를 들어, P22-시뉴클레인(H. Shimura외 다수, Science 2001 JuI 13:293(5528):224-5) 내부에 있는 에피토프에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 몇몇 항체는 알파-SN의 N-말단에서 에피토프[예를 들어, 서열번호 1에 따라서 번호가 매겨진 알파-시뉴클레인의 1∼20번 아미노산 또는 1∼10번 아미노산 내에 존재하는 에피토프]와 결합한다. 몇몇 항체는 에피토프의 N-말단 잔기가 전장 알파-SN의 N-말단 잔기인 에피토프에 결합한다. 이러한 항체는 1번 잔기가 결실된 알파 시뉴클레인의 결실 돌연 변이에 결합하지 않는다. 이러한 항체들 중 일부는 N-말단 아미노산이 이종 폴리펩티드에 결합되어 있는 전장 알파 시뉴클레인에 결합하지 않는다. 본 발명의 일부 항체는 인간 알파-시뉴클레인의 1∼69번 잔기 또는 1∼20번 잔기 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 항체는 인간 알파-시뉴클레인의 1∼20번 잔기 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 항체는, 서열번호 1의 1∼Na번 잔기[여기서, Na는 5∼20]; 서열번호 1의 2∼Nb번 잔기[여기서, Nb는 6∼21]; 또는 서열번호 1의 3∼Nc번 잔기[여기서, Nc는 7∼22]로부터 선택된 인간 알파-시뉴클레인의 절편을 보유하는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 몇몇 항체는 SN1-5, SN1-6, SN1-7, SN1-8, SN1-9, SN1-10, SN1-11, SN1-12, SN1-13, SN1-14, SN1-15, SN1-16, SN1-17, SN1-18, SN1-19, 및 SN1-20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 알파 시뉴클레인의 절편 내에 존재하는 에피토프와 결합한다.
몇몇 항체는 알파-SN의 C-말단 또는 그 근처(예를 들어, 70∼140, 100∼140, 120∼140, 130∼140 또는 135∼140번 아미노산)에서 에피토프와 결합한다. 몇몇 항체는 에피토프의 C-말단 잔기가 (전장) 알파-SN의 C-말단 잔기인 에피토프에 결합한다. 이러한 항체는 140번 잔기가 결실된 알파 시뉴클레인의 결실 돌연 변이와 결합하지 않는다. 몇몇 항체중 일부는 C-말단 아미노산이 이종 폴리펩티드에 결합되어 있는 전장 알파 시뉴클레인에 결합하지 않는다. 몇몇 방법에서, 항체는 전장 알파-SN에 결합하지 않고 NAC와 특이적으로 결합한다.
본 발명의 몇몇 항체는 인간 알파 시뉴클레인의 70∼140번 잔기 또는 83∼140번 잔기 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 몇몇 항체는 인간 알파-시뉴클레인의 120∼140번 잔기 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 몇몇 항체는 83∼101번, 107∼125번, 110∼128번 및 124∼140번으로부터 선택된 인간 알파-시뉴클레인의 절편을 보유하는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 몇몇 항체는 SN124∼140, SN125∼140, SN126∼140, SN127∼140, SN128∼140, SN129∼140, SN130∼140, SN131∼140, SN132∼140, SN133∼140, SN134∼140, SN135∼140, SN136∼140, SN137∼140, SN124∼139, SN125∼139, SN126∼139, SN127∼139, SN128∼139, SN124∼139, SN125∼139, SN126∼139, SN127∼139, SN128∼139, SN129∼139, SN130∼139, SN131∼139, SN132∼139, SN133∼139, SN134∼139, SN135∼139, SN136∼139, SN137∼139, SN124∼138, SN124∼138, SN125∼138, SN126∼138, SN127∼138, SN128∼138, SN129∼138, SN130∼138, SN131∼138, SN132∼138, SN133∼138, SN134∼138, SN135∼138, SN136∼138, SN124∼137, SN125∼137, SN126∼137, SN127∼137, SN128∼137, SN129∼137, SN130∼137, SN131∼137, SN132∼137, SN133∼137, SN134∼137, SN135∼137, SN124∼136, SN125∼136, SN126∼136, SN127∼136, SN128∼136, SN129∼136, SN130∼136, SN131∼136, SN132∼136, SN133∼136, 및 SN134∼136로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 알파 시뉴클레인의 절편 내에 존재하는 에피토프에 결합한다.
C-말단 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체는 인간 알파 시뉴클레인에 대하여 고 친화도 예를 들어, 108, 109 또는 1010 M-1 이상의 친화도로 결합하는 것이 바람직하다.
알파-SN의 다른 영역에 특이적으로 결합하지 않고 알파-SN의 바람직한 절편에 특이적으로 결합하는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체는, 다른 영역에 결합하는 모노클로날 항체 또는 원상태 알파-SN에 대한 폴리클로날 혈청에 비하여 다수의 이점을 갖는다. 첫 번째, 동량 투여에 있어서, 바람직한 절편에 특이적으로 결합하는 항체의 투여량은 아밀로이드 플라크를 제거하는 데에 유효한 항체를 높은 몰 농도의 투여량으로 함유한다. 두 번째, 바람직한 절편에 특이적으로 결합하는 항체는 원상태 알파-SN에 대한 제거 반응을 유도하지 않고, 부작용의 발생 가능성을 감소시킴으로써, LB에 대한 제거 반응을 유도할 수 있다.
임의로, 항체는 전술한 바와 같이 LB 질환에 걸린 트랜스제닉 동물에 있어서 예방적 활성 또는 치료적 활성에 대해 스크리닝할 수 있다. 임의로, 항체는 변성 인간 알파 시뉴클레인 또는 이의 단편에 상대적으로 결합하는 특성에 대해 예비 스크리닝하여 수집된다. 상대적 결합 친화도는 면역블럿에 있어서 시그널의 상대적 세기를 통해 측정될 수 있다. 평균 이상의 상대적 결합 친화도를 갖는 항체, 또는 바람직하게 시험된 결합 친화도가 가장 높은 항체는 트랜스제닉 마우스에서 추가로 스크리닝되어 선택된다. 유사한 예비 스크리닝을 수행하여 면역 조직 화학적 방법에 의해 조직 검편 내에 존재하는 알파-시뉴클레인의 응집체와 항체가 결합하는지 여부를 시험할 수 있다. 조직 검편은 발병한 환자 또는 트랜스제닉 동물 모델의 뇌로부터 얻을 수 있다.
하나의 구체예에서, 6H7로 명명된 항체, 또는 알파-시뉴클레인에 특이적으로 결합하는 6H7과 경쟁하는 항체가 수동적 면역화에 사용된다. 하나의 구체예에서, 8A5로 명명된 항체, 또는 알파-시뉴클레인에 특이적으로 결합하는 8A5와 경쟁하는 항체가 수동적 면역화에 사용된다. 몇몇 구체예에서, 6H7 또는 8A5는 각각 함께 사용되거나, 또는 다른 항 알파 시뉴클레인 항체와 함께 사용된다.
i. 알파- 시뉴클레인의 양 말단부에 존재하는 에피토프에 대한 면역 반응을 개시하는 능동적 면역화
본원에 기술된 바와 같이, 알파-시뉴클레인의 아미노 말단부 및 카복시 말단부에 존재하는 에피토프를 인지하는 항체(즉, 8A5 및 6H7)를 투여하면 인간의 알파-시뉴클레인을 과발현하는 트랜스제닉 마우스의 뇌에 알파-시뉴클레인 응집체가 생성되는 것을 감소시킬 수 있다(예를 들어, 실시예 IX 참조). 부분적으로 이러한 발견을 바탕으로 했을 때, N-말단 에피토프를 인지하는 항체(예를 들어, 상기와 같음)와, C-말단 에피토프를 인지하는 항체(예를 들어, 상기와 같음)를 함께 투여하면 예방 및 치료에 특히 유효할 것이다. 그러므로, 하나의 측면에서, 본 발명은 뇌에 루이체 또는 알파-시뉴클레인 응집체를 생성하는 것을 특징으로 하는 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하며, 이 방법은 인간 알파-시뉴클레인의 1∼20번 잔기 (서열번호 1에 따라 번호가 매겨짐)내에 존재하는 에피토프와 특이적으로 결합하는 제1 항체와, 인간 알파-시뉴클레인의 70∼140번 잔기 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 항체를, 질환이 발병하였거나 또는 발병 위험이 있는 환자에게 효과적인 방법으로 조합 투여함으로써 실시된다. 바람직하게, 상기 제1 항체는 서열번호 1의 1∼Na번 잔기[여기서, Na는 5∼20]; 서열번호 1의 2∼Nb번 잔기[여기서, Nb는 6∼21]; 및/또는 서열번호 1의 3∼Nc번 잔기[여기서, Nc는 7∼22]로 이루어진 서열 내에 존재하는 알파-시뉴클레인의 에피토프에 결합한다. 바람직하게, 상기 제2 항체는 인간 알파-시뉴클레인의 120∼140번 잔기 내에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 상기 제1 및 제2 항체는 동시에(예를 들어, 공동 제형화), 같은 날, 같은 달 및/또는 치료의 동일한 과정의 일부로서 투여될 수 있다.
ii . 조성물 및 키트
본 발명은 뇌에 알파-시뉴클레인 응집체 또는 루이체 생성을 특징으로 하는 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는데, 이 조성물은 알파-시뉴클레인의 말단부에서 예를 들어, 전술한 바와 같은 특이성으로 결합하는 하나 이상의 항체를 포함한다. 조성물은 2 이상의 항체를 함유하는 투여형 및 제형을 포함한다. 대표적인 제형(공동 제형화 항체에 적합한 제형)은 당 업계에 공지되어 있으며, 이는 이하 섹션 VII("치료 방법")에 기술된 것들을 포함한다.
본 발명은 또한 뇌에 루이체 또는 알파-시뉴클레인 응집체가 생성되는 것을 특징으로 하는 질환의 예방 또는 치료용 키트를 제공한다. 이 키트는 제1 항체가 인간 알파-시뉴클레인의 N-말단에서 에피토프와 결합하고, 제2 항체가 인간 알파-시뉴클레인의 C-말단에서 에피토프와 결합하는 경우, 2개(또는 그 이상)의 항체를 포함한다. 상기 항체는 동시 사용을 위한 단일 제제 또는 키트로서 배합될 수 있다. 대안적으로, 항체는 동시, 연속 또는 개별 사용을 위한 키트 내 개별 용기(예를 들어, 바이알, 시린지, 튜브 등)에 담길 수 있다. 이러한 항체는 임의로는 루이체 생성 질환의 치료에 최소한 부분적으로나마 유효한 기타 제제와 함께 투여될 수도 있다. 키트는 또한 환자에게 투여될 본 발명의 항체가 혈뇌장벽을 통과하는 양을 증가시키는 제제, 애쥬반트 및 기타 물질을 포함할 수도 있다.
iii . 면역 글로불린의 일반적인 특징
기본적 항체 구조 단위는 서브유닛의 사량체인 것으로 공지되어 있다. 각각의 사량체는 동일한 폴리펩티드 사슬 쌍 2개로 이루어져 있으며, 각 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25 kDa) 및 하나의 "중쇄"(약 50∼70 kDa)를 보유한다. 각 사슬의 아미노 말단 부분은 주로 항원 인지에 관여하는 약 100∼110개 또는 그 이상의 아미노산으로 이루어진 가변 영역을 포함한다. 각 사슬의 카복시 말단부는 주로 효과기 기능에 관여하는 불변 영역 영역을 한정한다.
경쇄는 카파 또는 람다로서 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 입실론으로 분류되며, 항체의 이소타입을 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로서 각각 한정한다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 영역 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산으로 이루어진 "J" 영역에 의해 결합되어 있으며, 여기서 상기 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산으로 이루어진 "D" 영역을 포함한다[Fundamental Immunology, Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N. Y., 1989, Ch. 7 참조; 본원에 자체로서 모든 목적을 위하여 인용됨].
각각의 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 항체 결합 위치를 형성한다. 그러므로, 원상태의 항체는 2개의 결합 위치를 보유한다. 이작용성 또는 이중 특이적 항체를 제외하고, 상기 2개의 결합 위치는 동일하다. 사슬은 모두 3개의 고도 가변 영역에 의해 결합된 비교적 보존적인 구조틀 영역(FR)(상보성 결정부 또는 CDR이라고도 칭함)의 동일한 일반 구조를 나타낸다. 각 쌍의 2개의 사슬로부터 유래된 CDR은 구조틀 영역에 의해 정렬되어 있으며, 이로써 특이적 에피토프에 결합할 수 있다. N-말단에서 C-말단에 이르기까지, 경쇄 및 중쇄 둘 다는 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4 영역을 포함한다. 각 영역에 할당된 아미노산은 문헌[Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 및 1991); Chothia & Lesk, J Mol. Biol. 196:901-917 (1987); 또는 Chothia외 다수, Nature 342:878-883 (1989)]에 정의된 바에 따른다
iv . 인간 이외의 동물의 항체 생산
키메라 항체 및 인간화된 항체는 키메라 항체 또는 인간화된 항체를 구성하기 위한 출발 물질을 제공하는 마우스 또는 기타 인간 이외의 동물의 항체와 동일하거나 유사한 결합 특이성과 친화도를 갖는다. 키메라 항체는 경쇄 및 중쇄 유전자가 통상적으로 유전자 조작에 의하여 상이한 종에 속하는 면역 글로불린 유전자 절편으로부터 구성된 항체이다. 예를 들어, 마우스 모노클로날 항체로부터 유래된 유전자의 가변 영역(V) 절편은 인간 불변 영역(C) 절편 예를 들어, IgG1 및 IgG4에 결합할 수 있다. 인간 이소타입 IgG1이 바람직하다. 몇몇 방법에서, 이 항체의 이소타입은 인간의 IgG1이다. IgM 항체는 또한 다른 방법에서 사용될 수 있다. 그러므로, 통상의 키메라 항체는 마우스 항체로부터 유래된 V 영역 또는 항원-결합 영역과 인간 항체로부터 유래된 C 영역 또는 효과기 영역으로 이루어진 혼성 단백질이다.
인간화된 항체는 실질적으로 인간 항체(수용 항체라고도 함)로부터 유래된 가변 영역 구조틀 잔기와, 실질적으로 마우스-항체(공여 면역 글로불린이라고도 함)로부터 유래된 상보성 결정 부위를 갖는다. 문헌[Queen외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989), WO 90/07861, 미국 특허 제5,693,762호, 동 제5,693,761호, 동 제5,585,089호, 동 제5,530,101호, 및 동 제 5,225,539호(Winter)(상기 각각은 본원에 모든 목적을 위해 참고용으로 인용됨)]을 참조하시오. 존재한다면, 불변 영역(들)는 실질적으로 또는 전체적으로 인간 면역 글로불린으로부터 유래된다. 인간 가변 영역은 일반적으로 구조틀 서열과 CDR이 유래된 쥐과 동물의 가변 영역 영역의 서열 상동성이 높은 인간의 항체로부터 선택된다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역 영역 구조틀 잔기는 동일하거나 또는 상이한 인간 항체 서열로부터 유래될 수 있다. 인간 항체 서열은 천연 생성 인간 항체의 서열일 수 있거나, 또는 몇몇 인간 항체의 공통 서열(consensus sequence)일 수 있다. WO 92/22653(카터 외 다수)를 참조하시오. 인간 가변 영역 구조틀 잔기로부터 유래된 임의의 아미노산은 이 아미노산이 CDR 형태 및/또는 항원에의 결합에 미칠 수 있는 영향을 바탕으로 하여 치환용으로 선택된다. 이러한 가능한 영향력은 특정 위치의 아미노산의 특징을 모델링 및 관찰하거나, 또는 특정 아미노산의 치환 또는 돌연 변이 유도 효과를 실험을 통해 관찰함으로써 확인된다.
예를 들어, 쥐과 동물 가변 영역 구조틀 잔기와 선택된 인간 가변 영역 구조틀 잔기 사이의 아미노산이 상이할 때, 인간 구조틀 아미노산은 일반적으로 마우스 항체로부터 유래된 동등한 구조틀 아미노산에 의해 치환되어야 하며, 이때 상기 아미노산은 (1) 항원과 직접적으로 비공유 결합하거나, (2) CDR 부위와 인접하거나, (3) 그렇지 않은 경우 CDR 영역과 상호 작용하거나(예를 들어, CDR 영역의 약 6Å 이내에 존재), 또는 (4) VL-VH 계면 형성에 관여하는 것이 적당할 것으로 예상된다.
치환을 위한 다른 후보 아미노산으로서는 특정 위치에서 인간 면역 글로불린에 특별히 존재하는 수용 인간 구조틀 아미노산이 있다. 상기 아미노산은 마우스 공여 항체의 동등한 위치로부터 유래된 아미노산 또는 더욱 통상적인 인간 면역 글로불린의 동등한 위치로부터 유래된 아미노산으로 치환될 수 있다. 치환에 대한 기타 후보 아미노산으로서는 인간 면역 글로불린의 특정 위치에서는 거의 존재하지 않는 수용 인간 구조틀 아미노산이 있다. 인간화된 면역 글로불린의 가변 영역 구조틀의 서열 상동성은 일반적으로 인간 가변 영역 구조틀 서열 또는 이 서열의 공통 서열에 대하여 85% 이상이다.
몇몇 인간화된 항체는 마우스 모노클로날 항체 mAb 6H7 또는 마우스 모노클로날 항체 mAb 8A5로부터 유래된 상보성 결정부(CDR) 서열을 포함한다. 항체 6H7을 생산하며 JH17.6H7.1.54.28로 명명된 세포주는 부다페스트 조약에 따라서 2005년 8월 4일자로 미국 모식균 배양 수집소(ATCC, Manassas, VA 20108)에 ATCC 기탁 번호 PTA-6910으로 기탁되어 있다. 항체 8A5를 생산하며 JH4.8A5.25.7.36으로 명명된 세포주는 2005년 8월 4일자로 ATCC 기탁 번호 PTA-6909로 기탁되어 있다.
전술한 바와 같이, 항체-발현 세포주(예를 들어, 하이브리도마)를 이용하여 키메라 항체 및 인간화된 항체를 제조하는 방법에 관하여는 다수 공지되어 있다. 예를 들어, 마우스 8A5 및/또는 6H7 항체의 면역 글로불린 가변 영역은 널리 공지된 방법에 의해 클로닝 및 서열 결정될 수 있다. 하나의 방법(예시를 위한 것이지 이 방법에 한정되는 것은 아님)에서, 중쇄 가변 VH 영역은 하이브리도마 세포로부터 제조된 mRNA를 이용하여 RT-PCR에 의해 클로닝된다. 공통 프라이머는 5' 프라이머로서 번역 개시 코돈을 둘러싸고 있는 VH 영역 리더 펩티드와 3' 프라이머에 특이적인 g2b 불변 영역에 사용된다. 대표적인 프라이머에 관하여는 미국 특허 공보 US 2005/0009150[Schenk외 다수(이하 "Schenk")]에 개시되어 있다. 다수의 독립적으로 유래된 클론으로부터 얻어진 서열은 증폭 동안에 변이가 도입되지 않았는지 확인하기 위하여 비교될 수 있다. VH 영역의 서열은 또한 5' RACE RT-PCR 방법 및 3' g2b 특이 프라이머에 의해 얻어진 VH 단편을 서열 결정함으로써 측정 또는 확인될 수 있다.
8A5 또는 6H73 D6의 경쇄 가변 VL 영역은 VH 영역의 경우와 유사한 방식으로 클로닝될 수 있다. 하나의 방법에서, 쥐과 동물 VL 영역을 증폭시키기 위해 디자인된 공통 프라이머 세트는 번역 개시 코돈을 둘러싸고 있는 VL 영역과, V-J 결합 영역의 쥐과 동물 Ck 영역 하류에 특이적인 3' 프라이머에 혼성화되도록 디자인된다. 두 번째 방법에서, 5'RACE RT-PCR 방법은 cDNA를 암호화하는 VL을 클로닝하는데 사용된다. 대표적인 프라이머에 관하여는 문헌(Schenk)에 기술되어 있다. 이후 클로닝된 서열은 인간의 불변 영역을 암호화하는 서열과 결합한다.
하나의 방법에서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 재조작되어 각각 VDJ 또는 VJ 이음부의 스플라이싱 공여 서열 하류를 암호화하고, 중쇄의 경우에는 포유 동물 발현 벡터 예를 들어, pCMV-hγ1으로 클로닝되며, 경쇄의 경우에는 pCMV-hκ1으로 클로닝된다. 이러한 벡터는 인간의 γ1 및 Cκ 불변 영역을 삽입 가변 영역 카세트의 엑손 단편 하류로서 암호화한다. 서열 확인 후, 중쇄 및 경쇄 발현 벡터는 COS 세포와 함께 형질 감염되어 키메라 항체를 생산할 수 있다. 형질 감염 후 48 시간 경과시에 조건을 맞춘 배지를 수집하여, 이를 항체 생산 여부에 대해서는 웨스턴 블럿으로, 그리고 항원 결합 여부에 대해서는 ELISA로 검정하였다. 키메라 항체는 전술한 바와 같이 인간화된다.
v. 인간 항체
이하 기술된 다양한 방법에 의하여 알파-SN에 대한 인간 항체가 제공된다. 경쟁적 결합 실험을 통해 특정 마우스 항체 예를 들어, 실시예 IX에 개시된 마우스 모노클로날 항체 중 하나로서 동일한 에피토프 특이성을 갖는 몇몇 인간 항체를 선택한다. 인간 항체는 또한 면역원으로서 알파-SN 단편만을 사용하고/사용하거나, 알파-SN의 결실 돌연 변이를 수집하여 이에 대한 항체를 스크리닝함으로써 특정 에피토프 특이성에 대해서도 스크리닝할 수도 있다. 바람직하게, 인간 항체는 이소타입 특이성 인간 IgG1이다.
(1) 트리오마(trioma) 방법
기본적인 접근 수단이면서 대표적인 세포 융합 파트너인 SPAZ-4를 이용하는 연구법에 관하여는 문헌[Oestberg외 다수, Hybridoma 2:361-367 (1983); Oestberg, 미국 특허 제4,634,664호; 및 Engleman외 다수, 미국 특허 제4,634,666호(상기 문헌은 각각 본원에 모든 목적을 위한 참고용으로 인용되어 있음)]에 기술되어 있다. 본 방법에 의해 얻어진 항체-생산 세포주는 3개의 세포 즉 2개의 인간 세포 및 하나의 마우스 세포로부터 유래되었기 때문에, 이들 세포주를 트리오마(trioma)라고 칭한다. 처음에, 마우스 골수종 세포주를 인간 B-림프구와 융합하여 항체 비 생산 이종 발생 하이브리드 세포 예를 들어, 문헌(Oestberg; 상동)에 개시되어 있는 SPAZ-4 세포주를 얻을 수 있다. 이후, 상기 이종 발생 세포를 면역화된 인간 B-림프구와 융합시켜 항체-생산 트리오마 세포주를 얻을 수 있다. 트리오마는 인간 세포로부터 제조된 보통의 하이브리도마보다 더욱 안정적으로 항체를 생산하는 것으로 파악된다.
면역화된 B-림프구를 인간 공여체의 혈액, 비장, 림프절 또는 골수로부터 얻는다. 특이 항원 또는 에피토프에 대한 항체가 바람직하면, 면역화에 이의 항원 또는 에피토프를 사용하는 것이 바람직하다. 면역화는 시험관 내 또는 생체 내에서 이루어질 수 있다. 생체 내 면역화에 있어서, B 세포는 통상적으로 알파-SN, 이의 단편, 알파-SN 또는 이의 단편을 함유하는 더욱 큰 폴리펩티드, 또는 알파-SN에 대한 항체에 대한 항-유전자형 항체로 면역화된 인간으로부터 분리된다. 몇몇 방법에서, B 세포는 궁극적으로 항체 요법을 적용한 동일한 환자로부터 분리된다. 시험관 내 면역화에 있어서, B-림프구는 통상적으로 10% 인간 혈장이 보충된 배지 예를 들어, RPMI-1640(Engleman(상동) 참조) 중에서 7∼14일 동안에 항원에 노출된다.
면역화된 B-림프구는 널리 공지된 방법에 의해 이종 발생 하이브리드 세포 예를 들어, SPAZ-4에 융합된다. 예를 들어, 세포는 분자량 1000∼4000인 40∼50% 폴리에틸렌 글리콜로, 약 37℃에서 5∼10 분 동안 처리된다. 융합 혼합물로부터 세포를 분리해서 이를 목적 하이브리드에 대해 선택적인 배지(예를 들어, HAT 또는 AH) 중에서 증식시킨다. 알파-SN 또는 이의 단편에 결합하는 능력에 대해서 트리오마 배양 배지를 검정함으로써 필요로 하는 결합 특이성을 보유하는 항체를 분비하는 클론을 확인한다. 목적으로 하는 특이성을 보유하는 인간 항체를 생산하는 트리오마는 한계 희석 기법(limiting dilution technique)에 의해 서브클로닝되어 배양 배지 중에서 시험관 내 생장하게 된다. 이후 얻어진 트리오마 세포주를 이것이 알파-SN 또는 이의 단편에 결합하는 능력을 갖는지 여부에 대해 시험한다.
비록 트리오마가 유전적으로 안정하다고 하지만, 이 트리오마는 항체를 높은 수준으로 생산하지는 않는다. 트리오마로부터 유래된 항체 유전자를 하나 이상의 발현 벡터에 클로닝하고, 이 벡터를 통상의 포유 동물, 박테리아 또는 효모 세포주에 형질전환시킴으로써 발현 수준을 증가시킬 수 있다.
(2) 인간을 제외한 트랜스제닉 포유 동물
인간 면역 글로불린 위치에 존재하는 최소한의 절편을 암호화하는 트랜스 유전자를 갖는 인간 이외의 트랜스제닉 포유 동물로부터 알파-SN에 대한 인간 항체가 생산될 수 있다. 일반적으로, 이러한 트랜스제닉 포유 동물의 내인성 면역 글로불린 위치는 기능적으로 불활성화된 상태이다. 바람직하게, 인간 면역 글로불린 위치의 절편은 중쇄 및 경쇄 성분의 정렬되지 않은 서열들을 포함한다. 내인성 면역 글로불린 유전자의 불활성화와 외인성 면역 글로불린 유전자의 도입은 둘 다 표적화된 상동성 재조합법, 또는 YAC 염색체 도입법에 의하여 이루어질 수 있다. 이러한 과정을 통하여 생성된 트랜스제닉 포유 동물은, 내인성 면역 글로불린 유전자를 발현하지 않고, 면역 글로불린 구성 서열을 기능적으로 재배열할 수 있으며, 또한 인간 면역 글로불린 유전자에 의하여 암호화된 다양한 이소타입의 항체 군을 발현할 수 있다. 이러한 특성을 갖는 포유 동물의 생산 및 특성에 관하여는 예를 들어, 문헌[WO 93/1222(Lonberg외 다수), 미국 특허 제5,877,397호, 동 제5,874,299호, 동 제5,814,318호, 동 제5,789,650호, 동 제5,770,429호, 동 제5,661,016호, 동 제5,633,425호, 동 제5,625,126호, 동 제5,569,825호, 동 제5,545,806호, Nature 148, 1547-1553 (1994), Nature Biotechnology 14, 826 (1996), Kucherlapati, WO 91/10741(이들은 각각 그 자체로서 모든 목적을 위해 참고용으로 인용됨)]에 상세히 기술되어 있다. 트랜스제닉 마우스가 특히 적당하다. 항-알파-SN 항체는 문헌[Lonberg or Kucherlapati(상동)]에 기술된 바와 같이, 인간 이외의 트랜스제닉 포유 동물을 알파-SN 또는 이의 단편으로 면역화함으로써 얻어진다. 모노클로날 항체는 종래의 콜러-밀스타인 기법(Kohler-Milstein technology)을 사용하여 예를 들어, 이러한 포유 동물로부터 유래된 B-세포를 적당한 골수종 세포주에 융합시킴으로써 생산된다. 인간의 폴리클로날 항체는 또한 면역원성 제제로 면역화된 인간으로부터 유래된 혈청의 형태로서 제공될 수도 있다. 임의로, 이러한 폴리클로날 항체는 친화성 시약으로서 알파-SN 또는 기타 아밀로이드 펩티드를 사용하여 친화도 정제에 의해 농축될 수 있다.
(3) 파아지 디스플레이 방법
인간 항-알파-SN 항체를 얻는 또 다른 방법은 문헌[Huse외 다수, Science 246:1275-1281 (1989)]에 의하여 요약된 일반적 방법에 따라서 인간 B 세포로부터 유래된 DNA 라이브러리를 스크리닝하는 방법이다. 트리오마 방법에 기술된 바와 같이, 이러한 B 세포는 알파-SN, 단편, 알파-SN 또는 이의 단편 또는 항-유전자형 항체를 함유하는 더욱 긴 폴리펩티드로부터 얻을 수 있다. 임의로, 이러한 B 세포는 궁극적으로 항체 치료를 받는 환자로부터 얻어진다. 알파-SN 또는 이의 단편에 결합하는 항체를 선택한다. 이후 이러한 항체(또는 결합 단편)를 암호화하는 서열을 클로닝하여 증폭시킨다. 휴즈에 의해 제안된 방법은 파아지-디스플레이 기법과 병행하였을 때 더욱 효과적이다. 예를 들어, WO 91/17271(Dower외 다수) 및 WO 92/01047(McCafferty외 다수), 미국 특허 제5,877,218호, 동 제5,871,907호, 동 제 5,858,657호, 동 제5,837,242호, 동 제5,733,743호 및 동 제5,565,332호(이들은 각각 모든 목적을 위하여 그 자체로서 참고용으로 인용됨)를 참조하시오. 상기 방법들에서, 파아지 라이브러리는 일원들이 그들의 외부 표면에 상이한 항체를 디스플레이하도록 생산된다. 항체는 일반적으로 Fv 또는 Fab 단편으로서 디스플레이된다. 목적으로 하는 특이성을 보유하는 파아지 디스플레이 항체는 알파-SN 펩티드 또는 이의 단편에 대하여 친화도 증량법에 의해 선택된다.
파아지-디스플레이 방법의 변형법에서, 선택된 쥐과 동물의 항체에 대해 결합 특이성을 갖는 인간 항체가 생산될 수 있다. WO 92/2079(Winter)을 참조하시오. 본 방법에서, 선택된 쥐과 동물의 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 출발 물질로서 사용한다. 예를 들어, 경쇄 가변 영역이 출발 물질로서 선택되면, 파아지 라이브러리를 그 일원이 동일한 경쇄 가변 영역(즉, 쥐과 동물의 출발 물질)와 상이한 중쇄 가변 영역을 디스플레이하도록 구성한다. 중쇄 가변 영역은 재배열된 인간 중쇄 가변 영역 라이브러리로부터 얻어진다. 알파-SN에 특이적으로 강하게 결합한(예를 들어, 108 M-1 이상 및 바람직하게는 109 M-1 이상의 친화도로 결합) 파아지를 선택한다. 이후 본 파아지로부터 유래된 인간 중쇄 가변 영역은 추가의 파아지 라이브러리를 구성하기 위한 출발 물질로서 사용된다. 이 라이브러리 내에서, 각각의 파아지는 동일한 중쇄 가변 영역(즉, 제1 디스플레이 라이브러리로부터 확인된 영역) 및 상이한 경쇄 가변 영역을 디스플레이한다. 경쇄 가변 영역은 재배열된 인간 경쇄 가변 영역의 라이브러리로부터 얻어진다. 또한, 알파-SN에 대해 강한 결합 특이성을 나타내는 파아지를 선택한다. 이러한 파아지는 완전한 인간 항 알파-SN 항체의 가변 영역을 디스플레이한다. 이러한 항체들은 일반적으로 쥐과 동물의 출발 물질과 동일하거나 또는 유사한 에피토프 특이성을 갖는다.
vi . 불변 영역의 선택
키메라, 인간화 또는 인간 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 인간 불변 영역의 최소한의 일부에 결합할 수 있다. 불변 영역의 선택은 부분적으로는 항체-의존성 보체 및/또는 세포 매개성 독성이 바람직한지 여부에 따라 달라진다. 예를 들어, 이소타입인 IgG1 및 IgG3은 보체 활성을 보유하지만, 이소타입인 IgG2 및 IgG4는 보유하지 않는다. 이소타입의 선택은 또한 항체가 뇌로 통과하는 것에 영향을 미칠 수도 있다. 인간의 이소타입인 IgG1이 바람직하다. 경쇄 불변 영역은 람다 또는 카파일 수 있다. 항체는 2개의 경쇄와 2개의 중쇄를 별개의 중쇄, 경쇄 예를 들어, Fab, Fab' F(ab')2 및 Fv로서 보유하는 사량체, 또는 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 스페이서에 의해 결합되어 있는 단일 사슬 항체로서 발현될 수 있다.
vii . 재조합 항체의 발현
키메라, 인간화 및 인간 항체는 통상적으로 재조합 발현법에 의해 생산된다. 재조합 폴리뉴클레오티드 구조체는 통상적으로 원래 결합되어 있는 프로모터 영역 또는 이종 프로모터 영역을 포함하는, 항체 사슬의 암호화 서열에 작동 가능하도록 결합된 발현 대조구 서열을 포함한다. 바람직하게, 상기 발현 대조구 서열은 진핵 숙주 세포를 형질전환시키거나 또는 형질 감염시킬 수 있는 벡터 내에 존재하는 진핵 생물 프로모터 시스템이다. 일단, 벡터가 적당한 숙주에 통합되면, 숙주는 뉴클레오티드 서열을 고 수준으로 발현시키고, 가교 반응을 하는 항체를 수집 및 정제하는데에 적당한 조건하에서 유지된다.
상기와 같은 발현 벡터는 통상적으로 숙주 염색체 DNA의 에피좀 또는 완전한 부분으로서 숙주 유기체 내에서 복제 가능하다. 통상적으로, 발현 벡터는 선별 마커 예를 들어, 암피실린-내성 또는 하이그로마이신-내성 마커를 함유하여, 목적으로 하는 DNA 서열로 형질전환된 세포들을 확인할 수 있다.
대장균은 본 발명의 DNA 서열을 클로닝하는데 특히 유용한 원핵 생물 숙주의 하나이다. 미생물 예를 들어, 효모도 또한 발현용으로 유용하다. 사카로마이세스(Saccharomyces)는 바람직한 효모 숙주로서, 목적으로 하는 바와 같이 발현 조절 서열, 복제 기원, 종결 서열 등을 보유하는 적당한 벡터를 보유한다. 통상의 프로모터는 3-포스포글리서레이트 키나제 및 기타 당 분해 효소를 포함한다. 유도성 효모 프로모터로서는 알콜 탈수소효소, 이소시토크롬 C 및 말토즈와 갈락토즈 활용에 관여하는 효소 유전자로부터 유래된 프로모터를 포함한다.
포유 동물 세포는 면역 글로불린 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 절편을 발현하는데 바람직한 숙주이다. 문헌[Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987)]을 참조하시오. 원상태의 이종 단백질을 분비할 수 있는 다수의 적당한 숙주 세포주는 당 업계에 개발되어 있으며, 그 예로서는 CHO 세포주, 다양한 COS 세포주, HeLa 세포, L 세포, 인간 배아 신장 세포 및 골수종 세포주를 포함한다. 바람직하게, 상기 세포는 인간을 제외한 동물의 세포이다. 이러한 세포들에 대한 발현 벡터는 발현 조절 서열 예를 들어, 복제 기원, 프로모터, 인핸서(Queen외 다수, Immunol. Rev. 89:49 (1986)), 및 필요한 가공 정보 위치 예를 들어, 리보좀 결합 위치, RNA 스플라이싱 위치, 폴리아데닐화 위치 및 전사 종결 서열을 포함한다. 바람직한 발현 조절 서열은, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus), SV40, 아데노바이러스, 소 파필로마 바이러스 등의 내인성 유전자로부터 유래된 프로모터가 있다. 문헌[Co외 다수, J. Immunol. 148:1149 (1992)]을 참조하시오.
대안적으로, 항체 암호화 서열은 트랜스제닉 동물의 게놈에 도입되어 트랜스제닉 동물의 우유 중에 발현시키기 위하여 트랜스 유전자에 통합될 수 있다[예를 들어, 미국 특허 제5,741,957호, 동 제5,304,489호, 동 제5,849,992호 참조]. 적당한 트랜스 유전자는 유선 특이 유전자 예를 들어, 카세인 또는 베타 락토글로불린 유전자로부터 유래된 프로모터 및 인핸서와 작동 가능하도록 결합되어 있는 경쇄 및/또는 중쇄에 대한 암호화 서열을 포함한다.
목적 DNA 절편을 함유하는 벡터는 숙주 세포의 유형에 따라서 널리 공지된 방법으로 숙주 세포에 이전될 수 있다. 예를 들어, 염화 칼슘 형질 감염법은 일반적으로 원핵 세포용으로 이용되는 반면에, 인산칼슘 처리법, 전기 천공법, 리포팩션(lipofection), 바이오리스틱(biolistic) 또는 바이러스 계 형질 감염법은 기타 숙주 세포에 사용될 수 있다. 포유 동물 세포를 형질전환 시키는데 사용되는 기타 방법으로서는 폴리브렌을 이용하는 방법, 원형질체 융합법, 리포좀 형성법, 전기 천공법 및 미세 주입법을 포함한다(일반적으로, Sambrook외 다수(상동) 참조). 트랜스제닉 동물을 생산하는데 있어서, 트랜스 유전자는 수정된 난모 세포에 미세 주입될 수 있거나, 또는 배아 줄기 세포의 게놈과, 제핵 난모 세포에 이전된 세포들의 핵에 통합될 수 있다.
일단 발현되면, 항체는 당 업계의 표준적인 방법 예를 들어, HPLC 정제법, 컬럼 크로마토그래피법, 겔 전기 영동법 등에 따라서 정제될 수 있다[일반적으로 Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982)참조].
3. 컨쥬게이트
면역 반응을 유도하는 일부 제제는 LB에 대한 면역 반응을 유도하되 면역원성을 유도시키기에는 작은 적당한 에피토프를 함유한다. 이러한 경우, 펩티드 면역원은 적당한 담체 분자에 결합하여 면역 반응을 유도하는 것을 도와주는 컨쥬게이트를 형성할 수 있다. 적당한 담체는 혈청 알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 면역글로불린 분자, 티로글로불린, 오발부민, 파상풍 독소 또는 기타 병원성 박테리아 예를 들어, 디프테리아, 대장균(E. coli), 콜레라 또는 에이치.파이로리(H. pylori)로부터 유래된 독소, 또는 기타 약독화 독소 유도체를 포함한다. T 세포 에피토프는 또한 적당한 담체 분자이다. 일부 컨쥬게이트는 본 발명의 제제를 면역 촉진성 중합체 분자[예를 들어, 트리팔미토일-S-글리세린 시스테인(Pam3Cys), 만난(만노즈 중합체), 또는 글루칸(베타 1→2 중합체)], 시토킨(예를 들어, IL-1, IL-1 알파 및 베타 펩티드, IL-2, 감마-INF, IL-10, GM-CSF), 및 케모킨(예를 들어, MIP1 알파 및 베타, 및 RANTES)과 결합시킴으로써 생성될 수 있다. 문헌[O'Mahony, WO 97/17613 및 WO 97/17614]에 기술된 바와 같이, 면역원성 제제는 또한 조직을 통과하는 운송 작용을 촉진하는 펩티드에 결합될 수도 있다. 면역원은 스페이서 아미노산(예를 들어, gly-gly)을 보유하거나 또는 보유하지 않는 담체에 결합될 수 있다.
몇몇 컨쥬게이트는 본 발명의 제제를 하나 이상의 T 세포 에피토프에 결합시킴으로써 생성될 수 있다. 일부 T 세포 에피토프는 무작위적인 것인 반면에, 다른 T 세포 에피토프는 보편적인 것이다. 무작위적인 T 세포 에피토프는 다양한 유형의 HLA를 디스플레이하는 여러 개체에서 T 세포 면역성 유도를 강화할 수 있다. 이와 같이 무작위적인 T 세포 에피토프와는 대조적으로, 보편적인 T 세포 에피토프는 상이한 HLA-DR 대립 형질에 의해 암호화되는 다양한 HLA 분자를 나타내는 개체의 T 세포 면역성 유도를 고비율로 예를 들어, 75% 이상으로 강화할 수 있다.
다수의 천연 생성 T-세포 에피토프는 예를 들어, 파상풍 독소(예를 들어, P2 및 P30 에피토프), B형 간염 바이러스 표면 항원, 백일해 독소, 홍역 바이러스 F 단백질, 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomitis)의 주요 외부 막 단백질, 디프테리아 독소, 플라스모디움 팔시파룸 서컴스포로자이트 T(Plasmodium falciparum circumsporozite T), 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum) CS 항원, 쉬스토소마 만소니(Schistosoma mansoni) 트리오즈 포스페이트 이성체, 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli) TraT, 및 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA)에 존재한다. 본 발명의 면역원성 펩티드는 또한 문헌[Sinigaglia F.외 다수, Nature, 336:778-780 (1988); Chicz R.M.외 다수, J. Exp. Med, 178:27-47 (1993); Hammer J.외 다수, Cell 74:197-203 (1993); Falk K.외 다수, Immunogenetics, 39:230-242 (1994); WO 98/23635; 및 Southwood S.외 다수 J. Immunology, 160:3363-3373 (1998) (상기 문헌은 각각 본원에 모든 목적의 참고 문헌으로서 인용됨)]에 기술된 T-세포 에피토프에 컨쥬게이트화될 수도 있다. 추가의 예로서는 다음과 같은 것을 포함한다:
인플루엔자 헤마토글루티닌: HA307 -319 PKYVKQNTLKLAT (서열번호 4)
말라리아 CS: T3 에피토프 EKKIAKMEKASSVFNV (서열번호 5)
B형 간염 표면 항원: HBsAg19 -28 FFLLTRILTI (서열번호 6)
열 충격 단백질 65: hsp65153 -171 DQSIGDLIAEAMDKVGNEG (서열번호 7)
칼메트-게랭 균(bacille Calmette-Guerin) QVHFQPLPPAVVKL (서열번호 8)
파상풍 독소: TT830 -844 QYIKANSKFIGITEL (서열번호 9)
파상풍 독소: TT947 -967 FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (서열번호 10)
HIV gp120 T1 : KQIINMWQEVGKAMYA (서열번호 11)
대안적으로, 상기 컨쥬게이트는 본 발명의 제제를 하나 이상의 인공 T-세포 에피토프(II군 MHC 분자의 큰 부분에 결합할 수 있음) 예를 들어, pan DR 에피토프("PADRE")에 결합시킴으로써 제조될 수 있다. PDRE에 관하여는 문헌[미국 특허 제5,736,142호, WO 95/07707, 및 Alexander J외 다수, Immunity, 1:751-761 (1994)(상기 문헌은 각각 본원에 모든 용도의 참고용으로 인용됨)]에 개시되어 있다. 바람직한 PADRE 펩티드는 AKXVAAWTLKAAA(서열번호 12)(공통 잔기는 굵은 글씨로 표시함) [여기서 X는 바람직하게는 시클로헥실알라닌, 티로신 또는 페닐알라닌이고, 이들 중 시클로헥실알라닌이 가장 바람직함]이다.
면역원성 제제는 화학 가교에 의하여 담체에 결합될 수 있다. 담체에 면역원을 결합시키는 기술은 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜-티오)프로피오네이트(SPDP) 및 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카복실레이트(SMCC)를 사용하여 이황화 결합을 형성하는 것을 포함한다[펩티드가 설프히드릴기를 가지지 못하면, 이황화 결합은 시스테인 잔기를 첨가함으로써 제공될 수 있음]. 이러한 시약은 자신들과 하나의 단백질에 존재하는 펩티드 시스테인 잔기 사이에 이황화 결합을 형성하거나, 리신 상 엡실론-아미노, 또는 기타 아미노산에 존재하는 다른 유리 아미노기를 통해 아미드 결합을 형성한다. 이와 같이 다양한 이황화/아미드-형성 제제에 관하여는 문헌[Immun. Rev. 62, 185 (1982)]에 기술되어 있다. 기타 이작용성 커플링 제제는 이황화 결합 보다는 티오에테르 결합을 형성한다. 이와 같은 티오-에테르-형성 제제 중 다수는 시판중에 있으며, 그 예로서는 6-말레이미도카프론산, 2-브로모아세트산 및 2-요도아세트산, 4-(N-말레이미도-메틸)시클로헥산-1-카복실산의 반응성 에스테르를 포함한다. 상기 카복실기는 상기 제제와 숙신이미드 또는 1-히드록시-2-니트로-4-설폰산, 나트륨 염과 화합함으로써 활성화될 수 있다.
본 발명의 Th 에피토프 및 펩티드 면역원 사이에 스페이서 잔기(예를 들어, Gly-Gly)를 부가하면 면역원성이 개선될 수 있다. B 세포 에피토프(즉, 펩티드 면역원)으로부터 유래된 Th 에피토프를 물리적으로 분리시키는 이외에, 글리신 잔기는 Th 에피토프와 펩티드 면역원을 결합함으로써 생성되는 임의의 인공 2차 구조를 파괴할 수 있으며, 이로써 T 세포 및/또는 B 세포 반응 사이의 충돌을 없앨 수 있다. 그러므로, 조력 에피토프 및 항체 생성 영역 사이를 형태적으로 분리시키면, 제시된 면역원과 적당한 Th 세포 및 B 세포 사이에 더욱 유효한 상호 작용이 일어날 수 있다.
본 발명의 제제에 대하여 다양한 유형의 HLA를 디스플레이하는 개체의 대부분에서 T 세포 면역성 유도를 강화하기 위하여, 상이한 Th 세포 에피토프와의 컨쥬게이트 혼합물이 제조될 수 있다. 이 혼합물은 상이한 Th 세포 에피토프를 보유하는 2개 이상의 컨쥬게이트 혼합물, 상이한 Th 세포 에피토프를 보유하는 3개 이상의 컨쥬게이트 혼합물, 또는 상이한 Th 세포 에피토프를 보유하는 4개 이상의 컨쥬게이트 혼합물을 함유할 수 있다. 이 혼합물은 애쥬반트와 함께 투여될 수 있다.
면역원성 펩티드는 또한 담체(즉, 이종 펩티드)를 보유하는 융합 단백질로서 발현될 수도 있다. 상기 면역원성 펩티드는 아미노 말단, 카복시 말단 또는 상기 두 말단 모두에서 담체와 결합할 수 있다. 임의로, 면역원성 펩티드의 다수의 반복부는 융합 단백질에 존재할 수 있다. 임의로, 면역원성 펩티드는 예를 들어, 펩티드의 N 말단 및 C 말단 둘 다에서 이종 펩티드의 다수의 복사체와 결합할 수 있다. 몇몇 담체 펩티드는 담체 펩티드에 대하여 조력 T-세포 반응을 유도하는데 사용된다. 이에 따라서, 상기 유도된 조력 T-세포는 담체 펩티드에 결합된 면역원성 펩티드에 대하여 B-세포 반응을 유도한다.
본 발명의 몇몇 제제는 알파-SN의 N-말단 단편이 이의 C-말단에서 담체 펩티드와 결합되어 있는 융합 단백질을 포함한다. 이러한 제제에서, 알파-SN 단편의 N-말단 잔기는 융합 단백질의 N-말단 잔기를 구성한다. 따라서, 이러한 융합 단백질은 알파-SN의 N-말단 잔기가 유리된 형태로 존재하여야 하는 에피토프에 결합하는 항체를 유도하는데 효과적이다. 본 발명의 몇몇 제제는 C-말단에서 하나 이상의 담체 펩티드 복사체에 결합된 NAC 반복부를 다수 개 포함한다. 몇몇 융합 단백질은 알파-SN의 상이한 절편을 전후 일렬로 포함한다.
본 발명의 몇몇 제제는 알파-SN의 C-말단 단편이 이의 N-말단에서 담체 펩티드와 결합되어 있는 융합 단백질을 포함한다. 이러한 제제에서, 알파-SN 단편의 C-말단 잔기는 융합 단백질의 C-말단 잔기를 구성한다. 따라서, 이러한 융합 단백질은 알파-SN의 C-말단 잔기가 유리된 형태로 존재하여야 하는 에피토프에 결합하는 항체를 유도하는데 효과적이다. 본 발명의 몇몇 제제는 다수의 C-말단 펩티드 반복부 예를 들어, N-말단부에서 담체 펩티드의 하나 이상의 복사체에 결합된 SN125-140을 다수 개 포함한다. 몇몇 융합 단백질은 알파-SN의 상이한 절편을 전후 일렬로 포함한다.
몇몇 융합 단백질에서, NAC는 이의 N-말단부에서 이종 담체 펩티드와 융합된다. NAC는 C-말단 융합체와 함께 이용될 수 있다. 몇몇 융합 단백질은 NAC의 N-말단부 또는 C-말단부에 결합된 이종 펩티드를 포함하는데, 이 펩티드는 하나 이상의 알파-SN의 부가 NAC 절편과 전후 일렬로 결합되어 있다. 몇몇 융합 단백질은 전술한 바와 같이 C-말단부 알파 시뉴클레인 펩티드 복사체를 다수 개 포함하고, 상호 결합된 이종 펩티드 복사체를 다수 개 포함한다.
본 발명에 사용하기에 적당한 융합 단백질의 몇몇 예를 이하에 기술하였다. 이들 융합 단백질 중 일부는 예를 들어, 미국 특허 제5,196,512호, 유럽 특허 제378,881호 및 유럽 특허 제427,347호에 기술된 바와 같은 파상풍 독소 에피토프에 결합되어 있는 알파-SN의 절편(전술한 단편들 중 임의의 것 포함)을 포함한다. 몇몇 융합 단백질은 하나 이상의 PADRE에 결합되어 있는 알파-SN의 절편을 포함한다. 몇몇 이종 펩티드는 무작위적인 T-세포 에피토프인 반면에, 기타 이종 펩티드는 보편적인 T-세포 에피토프이다. 몇몇 방법에서, 투여 제제는 알파-SN 절편이 이종 절편에 선형으로 결합되어 있는 간단한 단일 융합 단백질이다. 본 발명의 치료제는 공식에 따라서 제공될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 방법에서, 상기 제제는 식 2X[식 중, X는 1∼5의 정수임]로 제시되는 융합 단백질의 다량체이다. 바람직하게 상기 X는 1, 2 또는 3이고, 가장 바람직하게는 2 이다. X가 2이면, 이러한 다량체는 MAP4라 칭하여지는 바람직한 형태로 결합된 4개의 융합 단백질을 갖게 되는 것이다[미국 특허 제5,229,490호 참조].
MAP4의 형태를 이하에 나타내었는데, 여기서 분지형 구조는 리신의 N 말단 및 측쇄 아민 둘 다에서 펩티드 합성을 개시함으로써 형성된다. 리신은 배수만큼 서열에 통합되어, 분지화될 수 있으며, 결과로 형성된 구조는 다수의 N 말단부를 제공할 것이다. 본 예에서, 4개의 동일한 N 말단은 분지형 리신-함유 중심부에 형성되었다. 이와 같이 반복함으로써 같은 계통의 B세포의 반응성을 강화한다.
Figure pat00001
여기서 Z는 상기 섹션 1.2에 기술된 바와 같이, 알파-SN의 NAC 펩티드, NAC 펩티드의 단편 또는 기타 활성 단편을 의미한다. Z는 예를 들어, 이하와 같이 하나 이상의 활성 단편을 나타낼 수 있다:
Z = 알파-SN 60-72 (NAC 영역) 펩티드 = NH2-KEQVTNVCGGAVVT-COOH (서열번호 13)
Z = 알파-SN 73-84 (NAC 영역) 펩티드 = NH2-GVTAVAQKTVECG-COOH (서열번호 14)
Z = 알파-SN 102-112 펩티드 = NH2-C-아미노-헵타논산-KNEEGAPCQEG-COOH (서열번호 15)
알파-SN 128-140 펩티드.
융합 단백질의 기타 예로서는 다음과 같은 것들을 포함한다:
Z-파상풍 독소 830-844(MAP4 형):
Z-QYIKANSKFIGITEL(서열번호 16)
Z-파상풍 독소 947-967(MAP4 형):
Z-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (서열번호 17)
Z-파상풍 독소830 -844(MAP4 형):
Z-QYIKANSKFIGITEL (서열번호 18)
Z-파상풍 독소830 -844 + 파상풍 독소947 -967(선형):
Z-QYIKANSKFIGITELFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (서열번호 19)
PADRE 펩티드(모두 선형)[여기서, X는 바람직하게는 사이클로헥실알라닌, 티로신 또는 페닐알라닌이고, Z는 사이클로헥실알라닌이 가장 바람직함]:
AKXVAAWTLKAAA-Z (서열번호 20)
3Z-PADRE 펩티드:
Z-Z-Z-AKXVAAWTLKAAA (서열번호 21)
융합 단백질의 추가 예로서는 다음과 같은 것들을 포함한다:
AKXVAAWTLKAAA-Z-Z-Z-Z (서열번호 22)
Z-AKXVAAWTLKAAA (서열번호 23)
Z-ISQAVHAAHAEINEAGR (서열번호 24)
PKYVKQNTLKLAT-Z-Z-Z (서열번호 25)
Z-PKYVKQNTLKLAT-Z (서열번호 26)
Z-Z-Z-PKYVKQNTLKLAT (서열번호 27)
Z-Z-PKYVKQNTLKLAT (서열번호 28)
Z-PKYVKQNTLKLAT-EKKIAKMEKASSVFNV-QYIKANSKFIGITEL-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-Z-Z-Z-Z-QYIKANSKFIGITEL-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (서열번호 29)
Z-QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-Z-QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-Z (서열번호 30)
Z-QYIKANSKFIGITEL (서열번호 31)(2 분지형 수지상에 존재)
Figure pat00002
EQVTNVGGAISQAVHAAHAEINEAGR (서열번호 32)
(MAP-4형인 시뉴클레인 단편 융합 단백질)
동일하거나 유사한 담체 단백질 및 결합 방법은 수동 면역화에 사용될 알파-SN에 대한 항체의 생성에 사용되는 면역원을 생성시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 알파-SN 또는 담체에 결합된 이의 단편은 알파-SN에 대한 모노클로날 항체의 생성시 실험용 동물에 투여될 수 있다.
4. 치료제를 암호화하는 핵산
루이체에 대한 면역 반응은 또한 수동 면역화에 사용되는 알파-SN 펩티드 절편을 암호화하는 핵산과 이의 단편, 기타 펩티드 면역원, 또는 항체 및 항체를 구성하는 사슬을 투여함으로써 유도될 수 있다. 이러한 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 면역원을 암호화하는 핵산 절편은 통상적으로 조절 요소 예를 들어, 환자의 의도로 하는 표적 세포내에 존재하는 DNA 절편을 발현시킬 수 있는 프로모터 및 인핸서에 결합되어 있다. 혈액 세포 내에서 발현시키기 위하여, 면역 반응을 유도하는데 바람직한, 경쇄 또는 중쇄 면역글로불린 유전자로부터 유래된 프로모터 및 인핸서 요소 또는 CMV 주요 중개성 초기 프로모터(CMV major intermediate early promoter) 및 인핸서는 발현을 유도하는데에 적합하다. 결합된 조절 요소 및 암호화 서열은 종종 벡터내에 클로닝된다. 이중 사슬 항체 투여를 위하여, 2개의 사슬은 동일한 벡터 또는 별도의 벡터내에 클로닝될 수 있다. 본 발명의 치료제를 암호화하는 핵산은 또한 하나 이상의 T 세포 에피토프를 암호화할 수도 있다. 본원에는 애쥬반트를 사용하는 것과 뮤타티스 뮤탄디스(mutatis mutandis)를 본 발명의 치료제를 암호화하는 핵산과 함께 사용하는 것에 관하여 개시되어 있다.
레트로바이러스계[예를 들어, Lawrie and Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3, 102-109 (1993) 참조]; 아데노바이러스 벡터[예를 들어, Bett외 다수, J. Virol. 67, 5911 (1993) 참조]; 아데노-관련 바이러스 벡터[예를 들어, Zhou외 다수, J. Exp. Med. 179, 1867 (1994) 참조], 백시니아 바이러스 및 조류 천연두 바이러스를 포함하는 천연두 바이러스(pox virus) 군으로부터 유래된 바이러스 벡터, 예를 들어, 신드비스 및 셈리키 포레스트 바이러스(Sindbis and Semliki Forest Viruses)(예를 들어, Dubensky외 다수, J. Virol. 70, 508-519 (1996) 참조), 베네주엘라 말 뇌염 바이러스(미국 특허 제5,643,576호 참조) 및 래비도바이러스 예를 들어, 수포성 구내염 바이러스(WO 96/34625 참조) 및 파필로마 바이러스(Ohe외 다수, Human Gene Therapy 6, 325-333 (1995); Woo외 다수, WO 94/12629 및 Xiao & Brandsma, Nucleic Acids. Res. 24, 2630-2622 (1996))와 같이 알파 바이러스 속에 속하는 바이러스로부터 유래된 바이러스 벡터를 포함하여 다수의 바이러스 벡터 계를 사용할 수 있다.
면역원을 암호화하는 DNA, 또는 이를 함유하는 벡터는 리포좀으로 패키징될수 있다. 적당한 지질 및 관련 유사체에 관하여는 미국 특허 제5,208,036호, 동 제5,264,618호, 동 제5,279,833호 및 동 제5,283,185호에 개시되어 있다. 면역원을 암호화하는 DNA 및 벡터는 또한 입자형 담체(예를 들어, 폴리메틸 메타크릴레이트 중합체 및 폴리락티드 및 폴리(락티드-코-글리콜리드를 포함하는 입자형 담체)(예를 들어, McGee외 다수, J. Micro Encap. 참조)에 흡착되거나 또는 결합될 수도 있다.
유전자 요법용 벡터 또는 네이키드형 DNA는 환자 개인에게 투여함으로써 생체 내 운반될 수 있으며, 이때 통상적인 투여 방법으로서는 전신 투여(예를 들어, 정맥 내, 복강 내, 비강 내, 위 내, 피 내, 근육 내, 피하 또는 두개 내 주입) 또는 국소 투여(미국 특허 제5,399,346호 참조)를 포함한다. 이러한 벡터는 추가로 촉진제 예를 들어, 부피바카인(예를 들어, 미국 특허 제5,593,970호 참조)을 포함할 수 있다. DNA는 또한 유전자 총을 사용하여 투여될 수도 있다. 문헌[Xiao & Brandsma(상동)]을 참조하시오. 면역원을 암호화하는 DNA는 극미한 금속 비드 표면에 침전된다. 유전자 총에 충격파 또는 팽창성 헬륨 가스를 가하여 가속화시켜, 몇 겹의 세포 층들을 관통하는 정도의 깊이로 조직을 뚫고 들어간다. 예를 들어, 위스콘신주 미들타운에 소재하는 아가세투스, 인코포레이티드(Agacetus, Inc.) 제품인 액셀™ 유전자 전달 장치(Accel™ Gene Delivery Device)가 적합하다. 대안적으로, 네이키드형 DNA는 화학적 또는 기계적 자극을 주어 DNA를 피부에 간단히 찔러 넣음으로써 이 DNA가 피부를 관통하여 혈류로 들어가게 할 수 있다[WO 95/05853 참조].
다른 변형예에 있어서, 면역원을 암호화하는 벡터는 세포[예를 들어, 환자 개인으로부터 외부 이식한 세포(예를 들어, 림프구, 골수 흡인물, 및 조직 생검편) 또는 보편적 공여 조혈 줄기 세포]에 세포 외 방법으로 전달된 다음, 이 세포를 (보통 벡터가 통합된 세포를 선택한 이후) 환자에 다시 이식함으로써 전달될 수 있다.
III . Aβ에 대한 면역원성 반응을 유도하기 위한 제제
Aβ(β-아밀로이드 펩티드라고도 알려짐) 또는 A4 펩티드[미국 특허 제4,666,829호 참조; Glenner & Wong, Biochem. Biophys. Res. Commun. 120, 1131 (1984)]는 39∼43개의 아미노산으로 이루어진 펩티드로서, 알츠하이머병의 특징적인 플라크의 주성분이다. Aβ는 2개의 효소(β 및 γ 세크라타제)에 의해 보다 큰 단백질인 APP를 가공함으로써 생성된다[Hardy, TINS 20, 154 (1997) 참조]. 알츠하이머병과 관련된 APP에 있어서 공지된 돌연변이는 β 또는 γ 세크라타제 위치에 근접한 위치에서 발생하거나, 또는 Aβ 내에서 발생한다. 예를 들어, 717번 위치는 Aβ로의 가공 과정 중에서 γ 세크라타제로 절단되는 APP 중 위치에 인접하여 존재하고, 670/671번 위치는 β-세크라타제 절단 위치에 인접하여 존재한다. Aβ를 생성하여 이 생성된 Aβ의 42/43번 아미노산의 양을 증가시키는 절단 반응과 상호 작용함으로써 돌연 변이는 AD를 유도시키는 것으로 생각된다.
Aβ는 통상적이고 대안적인 보체 케스케이드를 활성화 및 고정시킬 수 있는 특별한 성질을 갖는다. 특히, 상기 Aβ는 처음에 C1q에 결합하고 최종적으로는 C3bi에 결합한다. 이와 같이 결합함으로써 B 세포를 활성화시키는 대식 세포와의 결합히 촉진된다. 뿐만 아니라, C3bi는 더욱 파괴되어, T 세포 의존 방식으로 B 세포 상에 존재하는 CR2에 결합하게 되며, 결과적으로는 이 세포를 10,000배 활성화 시킨다. 이 기작은 Aβ가 면역 반응을 다른 항원의 면역 반응보다 더 많이 유도시키도록 만든다.
Aβ는 몇몇 천연 형성 형태를 띤다. Aβ의 인간형을 각각 Aβ39, Aβ40, Aβ41, Aβ42 및 Aβ43이라고 칭한다. 상기 펩티드의 서열들 및, 이 서열들과 APP 전구체와의 관계를 도 1에 나타내었다(Hardy외 다수, TINS 20, 155-158 (1997)). 예를 들어, Aβ42는 다음과 같은 서열을 갖는다:
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAΠGLMVGGVVIAT (서열번호 33)
Aβ41, Aβ40 및 Aβ39는 C-말단부에 Ala, Ala-Ile 및 AIa-Ile-Val이 각각 결여되어 있다는 점에서 Aβ42와 상이하다. Aβ43은 C-말단에 Thr 잔기가 있다는 점에서 Aβ42와 상이하다.
알파-SN에 관하여 전술한 바와 유사한 제제에 관하여는 Aβ에 대하여 설명한 부분에서 이미 기술하였다[WO 98/25386 및 WO 00/72880 참조; 상기 두 문헌은 본원에 모든 목적을 위하여 참고용으로 인용됨]. 이와 같은 제제는 Aβ 및 이의 활성 단편, Aβ의 컨쥬게이트 및 Aβ 활성 단편의 컨쥬게이트, Aβ 및 이의 활성 단편에 대한 항체(예를 들어, 마우스, 인간화, 인간 및 키메라 항체), 및 항체 사슬을 암호화하는 핵산을 포함한다. Aβ의 N-말단 절반부로부터 유래된 활성 단편이 바람직하다. 바람직한 면역원성 단편의 예로서는 Aβ1-5, 1-6, 1-7, 1-10, 3-7, 1-3 및 1-4를 포함한다. 예를 들어, Aβ1-5는 Aβ의 1∼5번 잔기를 포함하고 Aβ의 다른 잔기는 포함하지 않는 단편을 의미하는 것이다. Aβ의 1∼3번 잔기에서 시작하고 Aβ의 7∼11번 잔기에서 끝나는 단편이 특히 바람직하다.
능동 면역 반응을 유도하는 제제, 수동 면역 반응을 유도하는 제제, 컨쥬게이트, 및 치료제를 암호화하는 핵산(상기 섹션 II의 1, 2, 3 및 4 참조)에 관하여 본원에 개시된 바에 의하면, Aβ 및 이의 절편을 사용함에 있어서 뮤타티스 뮤탄디스를 이용한다. 능동 면역 반응을 유도하는 제제, 수동 면역 반응을 유도하는 제제, 컨쥬게이트, 및 치료제를 암호화하는 핵산(상기 섹션 II의 1, 2, 3 및 4 참조)에 관하여 본원에 개시된 바에 의하면, Aβ 및 이의 절편을 사용함에 있어서 뮤타티스 뮤탄디스를 이용한다. 치료법과 치료 방식에 효과를 볼 수 있는 환자(이하, 섹션 IV 및 V 참조)에 관하여 본원에 개시된 바에 의하면, Aβ 및 이의 절편을 사용함에 있어서 뮤타티스 뮤탄디스를 이용한다.
분해된 Aβ 또는 이의 단편이란 단량체 펩티드 단위를 의미한다. 분해된 Aβ 또는 이의 단편은 일반적으로 가용성이며, 자발적으로 응집하여 가용성 올리고머를 형성할 수 있다. Aβ 및 이의 단편으로 이루어진 올리고머는 일반적으로 가용성이고 주로 알파-나선형 코일 또는 랜덤한 코일의 형태로 존재한다. 응집된 Aβ 또는 이의 단편이란, 불용성 베타-시이트 조립체로 조립된 알파-SN 또는 이의 단편으로 이루어진 올리고머를 의미한다. 응집된 Aβ 또는 이의 단편이란, 또한 섬유질 중합체를 의미한다. 섬유질은 일반적으로 불용성이다. 몇몇 항체는 가용성 Aβ 또는 이의 단편, 또는 응집된 Aβ 또는 이의 단편에 결합한다. 몇몇 항체는 가용성 Aβ 또는 이의 단편과, 응집된 Aβ 또는 이의 단편에 결합한다.
컨쥬게이트의 몇몇 예로서는 다음과 같은 것들을 포함한다:
AN90549 (Aβ1-7-파상풍 독소 830-844, MAP4 형): (서열번호 34)
DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL
AN90550 (Aβ1-7-파상풍 독소 947-967, MAP4 형):
DAEFRHD-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (서열번호 35)
AN90542 (Aβ1-7-파상풍 독소 830-844 + 947-967, 선형):
DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (서열번호 36)
AN90576:(Aβ3-9)-파상풍 독소 830-844, MAP4 형):
EFRHDSG-QYIKANSKFIGITEL (서열번호 37)
PADRE 펩티드(모두 선형)[여기서, X는 바람직하게는 사이클로헥실알라닌, 티로신 또는 페닐알라닌이고, 이것들 중 사이클로헥실알라닌이 가장 바람직함]:
AN90562 (PADRE-Aβ1-7):
AKXVAAWTLAAA-DAEFRHD (서열번호 38)
AN90543 (3 PADRE-Aβ1-7):
DAEFRHD - DAEFRHD - DAEFRHD-AKXVAAWTLKAAA (서열번호 39)
융합 단백질의 기타 예(Aβ의 면역원성 에피토프는 굵은 글씨로 나타냄)로서는 다음과 같은 것들을 포함한다:
AKXVAAWTLKAAA-DAEFRHD - DAEFRHD - DAEFRHD (서열번호 40)
DAEFRHD-AKXVAAWTLKAAA (서열번호 41)
DAEFRHD-ISQAVHAAHAEINEAGR (서열번호 42)
FRHDSGY-ISQAVHAAHAEINEAGR (서열번호 43)
EFRHDSG-ISQAVHAAHAEINEAGR (서열번호 44)
PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD - DAEFRHD - DAEFRHD (서열번호 45)
DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD (서열번호 46)
DAEFRHD - DAEFRHD - DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT (서열번호 47)
DAEFRHD - DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT (서열번호 48)
DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-EKKIAKMEKASSVFNVQYIKANSKFIGITEL- FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-DAEFRHD (서열번호 49)
*DAEFRHD - DAEFRHD - DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELNNFTVSFWLR VPKVSASHLE (서열번호 50)
DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (서열번호 51)
DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-DAEFRHD (서열번호 52)
DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL (서열번호 53)(2개의 분지형 수지상에 존재)
Figure pat00003
바람직한 모노클로날 항체는 Aβ의 1∼10번 잔기 내에 존재하는 에피토프에 결합한다(천연 Aβ의 N 말단으로부터 첫 번째 잔기를 1로 지정함). 몇몇 바람직한 모노클로날 항체는 1∼5번 아미노산 내에 존재하는 에피토프와 결합하고, 몇몇 바람직한 모노클로날 항체는 5∼10번 아미노산 내에 존재하는 에피토프와 결합한다. 몇몇 바람직한 항체는 1∼3번, 1∼4번, 1∼5번, 1∼6번, 1∼7번 또는 3∼7번 아미노산 내에 존재하는 에피토프와 결합한다. 몇몇 바람직한 항체는 Aβ의 1∼3번 잔기에서 시작하고 7∼11번 잔기에서 끝나는 에피토프와 결합한다. 기타 항체로서는 13∼280번 잔기를 갖는 에피토프와 결합하는 항체(예를 들어, 모노클로날 항체 266)를 포함한다. 바람직한 항체는 인간 IgG1 이소타입을 보유한다.
IV . 제거 활성에 대한 항체의 스크리닝
본 발명은 루이체 또는 임의의 기타 항원, 또는 관련된 생물학적 실체를 제거하는 활성에 대해서 항체를 스크리닝하는 방법 즉, 목적으로 하는 제거 활성을 갖는 항체를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 루이체에 대한 활성에 관하여 스크리닝하기 위해, PD 환자 또는 파킨슨병의 특징적인 병상을 나타내는 동물 모델의 뇌에서 유래된 조직 시료를 Fc 수용체를 보유하는 식세포 예를 들어, 미세아교 세포, 그리고 시험관 내 배지 중에 보관해 둔 시험 항체와 접촉시킨다. 식세포는 1차 배양물 또는 세포주 예를 들어, BV-2, C8-B4 또는 THP-1일 수 있다. 몇몇 방법에서, 성분들은 현미경 슬라이드 상에서 혼합되어 현미경 관찰을 돕는다. 몇몇 방법에서, 다수의 반응들이 미세 역가 접시의 웰 내에서 동시에 수행된다. 이러한 방법에 있어서, 별도의 축소 현미경 슬라이드는 개별 웰에 적재될 수 있거나, 또는 비 현미경 관찰 방법 예를 들어, 알파-SN의 ELISA 관찰 방법이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 반응이 진행되기 이전에 기준 수치를 측정하는 것을 시작으로 하여 반응 진행 동안에 하나 이상의 시험 결과의 수치를 측정함으로써, 시험관 내 반응 혼합물 중 루이체의 양을 연속적으로 측정한다. 항원은 예를 들어, 형광 표지된 항체로 LB의 알파-SN 또는 기타 성분에 염색함으로써 관찰될 수 있다. 염색에 사용된 항체는 제거 활성에 대해 시험된 항체와 같은 것 일 수 있거나 또는 같은 것 일 수 없다. LB 반응 진행 중 기준선에 비하여 LB의 양이 감소 되었음은 곧, 시험 중인 항체가 제거 활성을 갖는다는 것을 나타낸다. 이러한 항체는 PD 및 기타 LBD를 예방 또는 치료하는데 유용할 것이다.
다른 종류의 생물학적 실체를 제거하는 활성에 대하여 항체를 스크리닝하는 데에는 유사한 방법이 사용될 수 있다. 이 검정법은 실질적으로 임의의 종류의 생물학적 실체에 대한 제거 활성을 관찰하는데 사용될 수 있다. 통상적으로, 생물학적 실체는 인간 또는 동물의 질환에 있어서 몇 가지 요인이 된다. 생물학적 실체는 조직 시료로서 제공되거나 또는 분리된 형태로 제공될 수 있다. 조직 시료로서 제공되는 경우, 조직 시료는 고정되지 않아서 조직 시료의 성분과 쉽게 접촉되고, 고정 중에 흔히 생기는 성분의 형태가 파괴되는 것을 피할 수 있는 것이 바람직하다. 본 검정법에서 시험될 수 있는 조직 시료의 예로서는 암 조직, 전암 조직, 양성 신생물 예를 들어, 사마귀나 종기를 포함하는 조직, 병원성 미생물로 감염된 조직, 염증 세포가 침습한 조직, 세포간 병원성 기질을 보유하는 조직(예를 들어, 섬유상 심막염), 이상 항원을 보유하는 조직, 및 상처 조직을 포함한다. 사용될 수 있는 분리된 생물학적 실체의 예로서는 알파-SN, 바이러스 항원 또는 바이러스, 단백당(proteoglycan), 기타 병원성 미생물의 항원, 종양 항원 및 부착 분자를 포함한다. 이러한 항원은 천연 공급원, 재조합 발현 또는 화학적 합성법 등을 통하여 얻을 수 있다. 조직 시료 또는 분리된 생물학적 실체는 Fc 수용체를 보유하는 식세포 예를 들어, 단핵구 또는 미세아교 세포, 그리고 배지 내에서 시험 될 항체와 접촉된다. 항체는 시험중인 생물학적 실체에 대하여 유도되거나 또는 이 실체와 관련된 항원에 대하여 유도될 수 있다. 항체가 생물학적 실체와 관련된 항원에 대하여 유도될 경우, 그 목적은 이 생물학적 실체가 항원에 의해 간접적으로 먹히게 되는지 여부를 시험하는 것이다. 일반적으로(반드시 그런 것은 아니지만), 항체 및 생물학적 실체(때로는 관련 항원과 함께)는 식세포를 첨가하기 이전에 상호 접촉된다. (존재한다면 배지에 잔류하는) 생물학적 실체 및/또는 관련 항원의 농도는 이후에 관찰된다. 배지 내에 존재하는 항원 또는 관련 생물학적 실체의 양 또는 농도가 감소한다는 사실은 곧, 식세포와 연합하여 항체가 항원 및/또는 관련 생물학적 실체에 대한 제거 반응을 나타냄을 의미하는 것이다.
항체 또는 기타 제제는 또한 실시예 II에 기술된 시험관 내 검정법을 이용하여 루이체를 제거하는 활성에 대해 스크리닝 될 수도 있다. 시뉴클레인을 발현하는 발현 벡터로 형질 감염된 뉴런 세포는 현미경을 통하여 눈으로 확인할 수 있는 시뉴클레인 봉입체를 형성한다. 이러한 봉입체를 제거하는데 있어서 항체 또는 기타 제제의 활성은, 제제로 처리된 형질 감염 세포 내에 시뉴클레인이 생성되었는지 여부 또는 그의 수준와 제제로 처리되지 않은 대조구 세포 내에 시뉴클레인이 생성되었는지 여부 또는 그의 수준을 비교함으로써 측정될 수 있다. 시뉴클레인 봉입체의 크기 또는 농도의 감소나, 시뉴클레인 수준의 감소는 시뉴클레인 제거 활성이 있음을 나타내는 것이다. 이 활성은 시뉴클레인 봉임체를 현미경을 통해 눈으로 관찰하거나 또는 겔 상에 세포 추출물을 전개시켜 시뉴클레인 밴드를 눈으로 확인함으로써 관찰될 수 있다. 실시예 1의 섹션 2에 기술한 바와 같이, 시뉴클레인 수준의 변화는 추출물을 세포질 분획 및 막 분획으로 구분하고, 막 분획을 분석할 때 가장 눈에 띄었다.
항체 또는 기타 제제는 또한 실시예 IX에 기술된 생체 내 검정법을 이용하여 루이체를 제거하는 활성에 대해 스크리닝될 수도 있다. 간단히 말해서, 시험 항체를 인간 α-시뉴클레인을 과발현하고 뉴런 내 α-시뉴클레인 응집체가 생성된 트랜스제닉 마우스의 신피질에 주입한다. 하나의 방법에서, 사용된 동물은 PDGF 프로모터의 전사 조절 하에, 뇌에서 인간의 야생형 α-시뉴클레인을 과발현하는 4∼8월령의 이종 접합 트랜스제닉 마우스이다[Maliah, 2000, Science 287:1265-69 참조]. 시험 항체 및 대조구(예를 들어, 관련성이 없는 이소타입-매칭 대조구 항체)는 마우스에 주입하기 위하여 적당한 용액(예를 들어, 멸균 인산염 완충 염수 용액)에 용해된다. 각각의 마우스를 마취시키고, 이 마우스에 2㎎/㎖ 항체 2㎕를 정위적으로 우뇌 반구의 두정엽 신피질의 심층에 주입한다(동 측면). 좌뇌 반구(반대 측)는 각 마우스에 대한 기준 대조구로서 사용된다. 주입 위치를 봉합하고 마우스가 마취에서 깨어날 때까지 관찰하였다. 주입후 2주 경과시, 마우스를 안락사시키고, 마우스 뇌를 꺼내어 4% 파라포름알데히드 중에서 48 시간 동안 고정하고, 이를 40㎛ 두께로 잘라냈다. 주입 위치 주변의 검편들을 α-시뉴클레인 항체(예를 들어, ELADW-47, 115∼122번 α-시뉴클레인 아미노산 인지)로 염색한다. 각각의 검편에 대해서, 뉴런 내 α-시뉴클레인 응집체는 동 측 반구에 존재하는 주입 위치 주변으로 4 현미경장(microscopic field)(배율 = 20배)을 차지하는 것으로 측정되었으며, 반대 측 대조구 반구에서도 4 현미경장을 차지하였다. 각각의 동물에 있어서, 2개의 검편에 존재하는 α-시뉴클레인 응집체 수를 더하고, 상기 2개의 반구에 생성된 α-시뉴클레인 응집체 총 수의 차로써 각각의 마우스 개체에 대한 응집체 제거에 미치는 시험 항체의 효과를 측정하였다. 처리된 반구 내 α-시뉴클레인 응집체의 총 수가 감소하였음은 항체 또는 기타 제제가 루이체 제거 활성을 갖는다는 것을 나타낸다. 10% 이상 감소하는 것이 바람직하다. 20% 이상, 40% 이상, 60% 이상 또는 80% 이상 감소하는 것이 바람직하다.
V. 항- 루이체 성분 치료 방법에 영향을 받는 환자
치료에 영향을 받는 환자로서는 시뉴클레인 병증 질환의 발병 위험이 있으나, 그 증상은 나타내지 않는 환자와, 현재 그 증상을 나타내는 환자를 포함한다. 치료에 영향을 받는 환자로서는 또한 LBD가 발병할 위험이 있지만 그 증상은 나타내지 않는 환자와, 현재 그 증상을 나타내는 환자를 포함한다. 이러한 질환으로서는 파킨슨병(예를 들어, 특발성 파킨슨병), DLB, DLBD, LBVAD, 순수한 자율신경 부전증, 루이체 연하 장애, 우발성 LBD, 선천성 LBD(예를 들어, 알파-SN 유전자의 돌연 변이, PARK3 및 PARK4) 및 다계통 위축증[예를 들어, 올리브 다리 소뇌 위축증(olivopontocerebellar atrophy), 줄무늬체 흑질 변성(striatonigral degeneration) 및 샤이-드래거 증후군(Shy-Drager syndrome)]을 포함한다. 그러므로, 본 발명은 LBD의 유전적 발병 위험이 있는 것으로 알려진 사람에게 예방적 차원에서 투여될 수 있다. 이러한 사람들로서는 이 질환을 앓은 적이 있는 친척이 있는 사람과, 유전자 마커 또는 생화학적 마커 분석에 의해 이러한 질환의 발병 위험이 있는 것으로 판명된 사람을 포함한다. PD 발병 위험이 있는 유전적 마커로서는 시뉴클레인 또는 파킨(Parkin), UCHLI 및 CYP2D6 유전자의 돌연 변이; 구체적으로, 시뉴클레인 유전자의 53번 위치에서의 돌연 변이를 포함한다. 현재 파킨슨병을 앓고 있는 환자들은 안정시 진전(resting tremor), 근육 경직, 운동 완만(bradykinesia) 및 자세 불안정성(postural instability)를 포함하는 임상적 발현으로써 감별될 수 있다.
몇몇 방법에서, 환자들은 임의의 아밀로이드 생성 질환의 임상적 증상, 징후 및/또는 위험 요인을 갖지 않으면서도, 하나 이상의 시뉴클레인 병증 질환을 앓고 있다. 몇몇 방법에서, 환자는 세포 외 아밀로이드 침착을 특징으로 하는 임의의 질환에 대한 임상적 증상, 징후 및/또는 위험 요인을 갖지 않는다. 몇몇 방법에서, 환자는 Aβ 펩티드의 아밀로이드 침착을 특징으로 하는 질환을 앓고 있지 않다. 몇몇 방법에서, 환자는 알츠하이머병의 임상적 증상, 징후 및/또는 위험 요인을 갖지 않는다. 몇몇 방법에서, 환자는 알츠하이머병, 인지 장애, 경도 인지 장애 및 다운증후군의 임상적 증상, 징후 및/또는 위험 요인을 갖지 않는다. 몇몇 방법에서, 환자는 루이체 생성을 특징으로 하는 질환 및 알츠하이머병이 동시에 발생하였다. 몇몇 방법에서, 환자는 시뉴클레인 축적을 특징으로 하는 질환과 알츠하이머병이 동시에 발병하였다. 몇몇 방법에서, 환자는 알츠하이머병과 파킨슨병이 동시에 발병하였다.
자각 증상이 없는 환자에 있어서, 치료는 임의의 연령(예를 들어, 10세, 20세, 30세)의 환자들을 대상으로 개시할 수 있다. 그러나, 일반적으로, 환자가 40세, 50세, 60세 또는 70세가 될 때까지는 치료를 개시할 필요가 없다. 치료 방법은 통상적으로 일정 기간에 걸쳐 복수 회 투약하는 것을 포함한다. 항체, 또는 활성화된 T-세포 또는 B-세포 반응을 치료제(예를 들어, 알파-SN 펩티드 또는 Aβ, 또는 둘 다)에 대하여 관찰함으로써 치료 결과를 관찰할 수 있다. 반응이 미약해지면, 추가로 증량 투약해준다.
임의로, 증상의 발생 여부, 질환의 징후 또는 위험 요인은 치료를 시작하기 이전에 측정한다.
VI . 항-아밀로이드 성분 치료 방법에 영향을 받는 환자
치료에 영향을 받는 환자들은 발병 위험은 있지만 증상을 나타내지 않는 환자와, 현재 아밀로이드증 증상을 나타내는 환자를 포함한다. 알츠하이머병의 경우에, 환자가 충분히 오래 생존하면 실질적으로 그 환자는 알츠하이머병의 발병 위험이 있게 되는 것이다. 그러므로, 본 발명의 방법은 발병 위험이 있는 대상 환자인지 여부를 따로 평가할 필요가 없이, 일반 군집에 예방 차원에서 투여될 수 있다. 본 발명의 방법은 알츠하이머병 또는 기타 유전적 아밀로이드 생성 질환의 유전적 발병 소인이 공지된 개체에 특히 유용하다. 이러한 개체로서는 이 질환을 앓은 적이 있는 친척이 있는 사람과, 유전자 마커 또는 생화학적 마커 분석에 의해 이러한 질환의 발병 위험이 있는 것으로 판명된 사람을 포함한다. 알츠하이머병 발병 위험 유전자 마커로서는 APP 유전자 돌연 변이, 특히 717번 위치 및 670번 위치 및 671번 위치에서의 돌연 변이[하디 및 스웨디시 돌연변이(Hardy and Swedish mutations)라고도 칭함]를 포함한다[Hardy, TINS(상동) 참조]. 기타 위험 마커로서는 프리세닐린 유전자인 PS1 및 PS2의 돌연 변이와, ApoE4 돌연 변이, AD에 대한 가족력, 고콜레스테롤증 또는 죽상 동맥경화증이 있다. 현재 알츠하이머병을 앓고 있는 환자는 특징적인 치매와, 전술한 위험 요인을 가지고 있는 것으로써 감별될 수 있다. 뿐만 아니라, AD 환자를 확인하기 위하여 다수의 진단 시험이 가능하다. 이러한 시험으로서는 CSF tau 및 Aβ 수준을 측정하는 방법을 포함한다. tau 수준 증가와 Aβ42 수준 감소는 AD가 발병하였음을 나타내는 것이다. 알츠하이머병을 앓고 있는 환자들은 또한 실시예 섹션에 기술된 바와 같은 MMSE 또는 ADRDA 기준에 의해 진단될 수도 있다. 자각 증상이 없는 환자에 있어서, 치료는 임의의 연령(예를 들어, 10세, 20세, 30세)의 환자들을 대상으로 개시할 수 있다. 그러나, 일반적으로, 환자가 40세, 50세, 60세 또는 70세가 될 때까지는 치료를 개시할 필요가 없다. 치료 방법은 통상적으로 일정 기간에 걸쳐 복수 회 투약하는 것을 포함한다. 이하 "VIII. 관찰 및 진단 방법"에 기술된 바에 따라서, 경시적으로 항체, 또는 활성화된 T-세포 또는 B-세포 반응을 치료제(예를 들어, NAC)에 대해 관찰함으로써 치료 결과를 관찰할 수 있다. 반응이 미약해지면, 추가로 증량 투약해준다.
VII . 치료 방식
일반적으로 치료 방식은 알파-SN에 대해 면역원성 반응을 유도하는 데에 효과적인 제제 및/또는 Aβ에 대한 면역원성 반응을 유도하는데 효과적인 제제를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 예방적 처치에 있어서, 약학 조성물 또는 약품은 LBD 또는 기타 시뉴클레인 병증 질환 발병 가능성이 있는 환자 또는 발병 위험이 있는 환자에게 투여되는데, 이 처치는 병의 생리적, 생화학적, 해부학적 및/또는 행동학적 증상과, 질환의 진행중에 나타나는 합병증 및 중간의 병리학적 표현형을 포함하여, 발병 위험을 없애거나 줄이고, 심각성을 완화하거나, 또는 발병을 지연시키는데 충분한 조성물 또는 약품을 일정량과 일정 횟수로 투여하는 단계를 포함한다. 치료 방법에 있어서, 조성물 또는 약품을 치료중에 있는 질환이 발병하였다고 의심이 되거나, 또는 이미 발병한 환자에게 투여하는데, 이 방법은 질환의 진행중에 나타나는 합병증 및 중간의 병리학적 표현형을 포함하여, 질환의 증상(생리적, 생화학적, 해부학적 및/또는 행동학적 증상)을 치료하거나, 또는 최소한 부분적으로나마 지연시키는 데에 충분한 조성물을 일정량과 일정 횟수로 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 몇몇 방법에서, 치료는 루이체를 최소한 부분적으로나마 없애고, 루이체를 최소한 부분적으로나마 분해하며/하거나 시냅스내 알파-시뉴클레인 올리고머의 수준을 감소시키게 된다. 치료적 또는 예방적 처치를 수행하기에 적당한 양은 치료학적 또는 예방학적 유효량으로서 정해져 있다. 치료적 또는 예방적 처치를 수행하기에 적당한 양과 투여 횟수를 어떻게 조합하는가는 치료학적 또는 예방학적 유효 방식으로서 정해져 있다. 예방적 및 치료적 방식에 있어서, 제제는 일반적으로 충분한 면역 반응이 나타날 때까지 수 회에 나누어져서 투여된다. 통상적으로, 면역 반응이 시작되면 그것이 종결될 때까지 조성물 또는 약품은 상태를 관찰하면서 반복 투여된다.
몇몇 방법에서, 제제를 투여하면 응집된 시뉴클레인의 세포 내 수준은 감소하게 된다. 몇몇 방법에서, 제제를 투여하면 LBD의 임상 증상 예를 들어, 파킨슨병의 경우 운동 기능이 향상된다. 몇몇 방법에 있어서, 응집된 시뉴클레인의 세포 내 수준이 감소하거나 질환의 임상 증상이 개선되는지 여부는 제제 투여 후 일정한 간격으로 관찰된다.
전술한 증상의 치료용인 본 발명의 조성물의 유효 투여량은 다수의 요인 예를 들어, 투여 수단, 표적 위치, 환자의 생리적 상태, 환자가 사람인지 동물인지 여부, 투여된 기타 약품과, 처치가 예방적 차원에서 이루어진 것인지 치료적 차원에서 이루어진 것인지 여부에 따라서 달라진다. 일반적으로, 환자는 사람이지만, 트랜스제닉 포유 동물을 포함하여 인간 이외의 포유 동물도 환자일 수 있다. 치료용 투여량은 안전성과 효능을 최적화하기 위해 적정할 필요가 있다. 면역원의 양은 애쥬반트가 투여되었는지 여부에 따라서 달라지며, 애쥬반트가 없을 경우에는 보다 많은 양의 면역원을 투여해야 한다. 투여를 위한 면역원의 양은 때때로 환자 1인당 1∼500 ㎍이고, 더욱 일반적으로는 사람에 투여되는 주입 1회당 5∼500 ㎍이다. 경우에 따라서, 주입 1회당 1∼2㎎ 더 많이 투여되기도 한다. 통상적으로는 사람에게 주입 1회당 약 10, 20, 50 또는 100 ㎍ 투여된다. 면역원의 양은 또한 면역원 중에 존재하는 면역원성 에피토프의 질량 : 전체적인 면역원의 질량의 비율에 따라서 달라진다. 통상적으로, 면역원 1㎍에 대하여 면역원성 에피토프 10-3∼10-5 μM이 사용된다. 주입 시기는 하루에 한번에서부터, 1년에 한번, 10년에 한번에 이르기까지 상당히 다양할 수 있다. 일정 투여량의 면역원이 투여되는 임의의 날에, 애쥬반트가 함께 투여될 경우 투여량은 환자 1인당 1㎍ 이상이고 일반적으로는 환자 1인당 10㎍ 이상이며, 애쥬반트가 투여되지 않을 경우 투여량은 환자 1인당 10㎍ 이상이고 일반적으로는 100㎍이상이다. 통상적인 방식은 면역화 이후 일정한 시간 간격(예를 들어, 6주 간격)으로 면역원을 증량 투여(booster injection)하는 것이다. 다른 방식은 면역화 이후 1개월, 2개월 및 12개월 이후에 면역원을 증량 투여하는 것이다. 다른 방식은 평생 동안 2달에 한 번씩 주입하는 것을 포함한다. 대안적으로, 증량 투여는 면역 반응을 관찰하면서 경우에 따라 불규칙적으로 수행될 수 있다.
항체를 이용한 수동적 면역화에 있어서, 투여량은 숙주 체중 1㎏ 당 약 0.0001∼100㎎이고, 더 일반적으로는 0.01∼5 ㎎이다. 예를 들어, 투여량은 체중 1㎏ 당 1㎎이거나 10㎎, 또는 1∼10 ㎎으로서, 즉 체중 70㎏인 환자의 경우 각각 70㎎이거나 700 ㎎, 또는 70∼700㎎이다. 대표적인 치료 방법은 2주마다 1회씩 투여하는 것, 또는 한 달에 1회씩 투여하는 것, 또는 3∼6개월 마다 1회씩 투여하는 것을 포함한다. 몇몇 방법에 있어서, 결합 특이성이 상이한 2개 이상의 모노클로날 항체는 동시에 투여되는데, 그러한 경우 투여된 각 항체의 투여량은 지정된 범위 내에 속한다. 항체는 일반적으로 복수 회 투여된다. 단일 투여 간 간격은 1주일 간격, 한 달 간격 또는 1년 간격일 수 있다. 간격은 또한 환자 체내 알파-SN에 대한 항체의 혈중 수준을 측정하면서 경우에 따라 불규칙적일 수도 있다. 몇몇 방법에 있어서, 투여량은 혈장 항체 농도 1∼1000㎍/㎖가 되도록 맞출 수 있으며, 몇몇 방법에 있어서는 25∼300㎍/㎖가 되도록 맞출 수 있다. 대안적으로, 항체는 지연 방출 제형으로서 투여될 수 있는데, 이 경우 투여 횟수를 줄여야 한다. 투여량 및 투여 횟수는 환자의 체내 항체 반감기에 따라서 달라진다. 일반적으로, 인간 항체는 반감기가 가장 길고, 그 다음으로는 인간화된 항체, 키메라 항체 및 인간 이외의 동물의 항체의 순이다. 투여량 및 투여 횟수는 치료가 예방적 차원에서 행하여 졌는지 아니면 치료적 차원에서 행하여 졌는지 여부에 따라서 달라질 수 있다. 예방적 방법에 있어서는, 장기간에 걸쳐 비교적 적은 횟수로 비교적 소량이 투여된다. 몇몇 환자는 여생 동안 계속 치료를 받는다. 치료적 방법에 있어서는, 질환의 진행이 지체되거나 종결될 때까지, 바람직하게는 환자의 질환 증상이 부분적으로 또는 완전히 경감될 때까지 비교적 단기간의 간격을 두고 비교적 다량이 투여된다. 이후 환자는 예방적 차원에서 투여될 수 있다.
면역원을 암호화하는 핵산의 투여량은 환자 1인당 DNA 약 10ng에서 1g, 100ng에서 100㎎, 1㎍에서 10㎎, 또는 30∼300㎍이다. 감염성 바이러스 벡터의 투여량은 1회 투여당 10∼100개 이상의 비리온(virion) 만큼의 양이다.
면역반응을 유도하는 제제는 예방 및/또는 치료적 처치용 비 경구, 국소, 정맥 내, 경구, 피하, 동맥 내, 두개 내, 초 내, 복강 내, 비강 내 또는 근육 내 수단으로 투여될 수 있다. 면역원성 제제의 가장 통상적인 투여 경로로서는 피하 투여가 있으나, 기타 투여 경로도 동일하게 유효할 수 있다. 그 다음으로 통상적인 경로는 근육 내 주입이다. 이 유형의 주입법은 통상적으로 팔이나 다리 근육에 실시된다. 몇몇 방법 예를 들어, 두개 내 주입법에 있어서, 제제는 침착물이 축적된 특정 조직에 직접 주입된다. 근육 내 주입법 또는 정맥 내 주입법도 항체 투여시 바람직하다. 몇몇 방법에 있어서, 특정 치료용 항체는 두개에 직접 주입된다. 몇몇 방법에 있어서, 항체는 지연 방출형 조성물 또는 장치 예를 들어, 메디패드™(Medipad™) 장치를 통하여 투여된다.
전술한 바와 같이, 알파-SN 및 Aβ 각각에 대하여 면역 반응을 유도하는 제제는 함께 투여될 수 있다. 이 제제는 동시, 연속 또는 별도 사용을 위한 단일 제제 또는 키트 내에서 혼합될 수 있다. 이 제제는 제제 또는 키트 내에 있는 별도의 바이알에 담길 수 있거나, 또는 단일 바이알 내에 혼합되어 존재할 수 있다. 본 발명의 제제는 임의로 LBD 치료에 최소한 부분적으로나마 유효한 기타 제제와 함께 투여될 수도 있다. LB가 뇌에 생성되는 파킨슨병 및 다운 증후군의 경우, 본 발명의 제제는 또한 본 발명의 제제가 혈뇌 장벽을 통과하는 양을 증가시키는 기타 제제와 함께 투여될 수도 있다.
본 발명의 면역원성 제제 예를 들어, 펩티드는 때때로 애쥬반트와 함께 투여된다. 다수의 애쥬반트는 펩티드 예를 들어, 알파-SN과 함께 사용되어, 면역 반응을 유발시킬 수 있다. 바람직한 애쥬반트는 반응의 정성학적 동태에 영향을 주는 면역원의 형태를 변화시키지 않고 면역원에 대한 내인적 반응을 증가시킬 수 있다. 바람직한 애쥬반트로서는 수산화알루미늄 및 인산알루미늄, 3-De-O-아실화 모노포스포릴 지질 A(MPL™)[GB 2220211 (RIBI ImmunoChem Research Inc., Hamilton, Montana, now part of Corixa) 참조]를 포함한다. 스티뮬론™(Stimulon™) QS-21은 남아프리카에서 발견되는 퀼라자 사포나리아 모리나 나무(Quillaja Saponaria Molina tree)의 수피에서 분리된 사포닌 또는 트리터펜 글리코시드이다[Kensil외 다수, in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach(eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); 미국 특허 제5,057,540호 참조(Aquila BioPharmaceuticals, Framingham, MA)]. 기타 애쥬반트로서는 수중유 유액(예를 들어, 스쿠알렌 또는 피넛 오일)이 있으며, 임의로는 면역 촉진제 예를 들어, 모노포스포릴 지질 A[Stoute외 다수, N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997) 참조), 플루론산 중합체(pluronic polymers) 및 사멸된 마이코박테리아(mycobacteria)가 있다. 다른 애쥬반트로서는 CpG(WO 98/40100)가 있다. 대안적으로, 알파-SN 또는 Aβ는 애쥬반트와 커플링될 수 있다. 그러나, 이러한 커플링은 면역 반응의 본질에 영향을 미치지 않도록 알파-SN의 형태를 실질적으로 변형시키지 않아야 한다. 애쥬반트는 치료 조성물의 성분으로서 활성 제제와 함께 투여될 수 있거나, 또는 치료제 투여 이전, 투여와 동시에 또는 이후에 별도로 투여될 수 있다.
애쥬반트의 바람직한 부류로서는 알루미늄 염(알룸) 예를 들어, 수산화알룸, 인산알룸, 황산알룸이 있다. 이러한 애쥬반트는 기타 특이적 면역 촉진제 예를 들어, MPL 또는 3-DMP, QS-21, 중합체 또는 단량체 아미노산 예를 들어, 폴리글루탐산 또는 폴리리신과 함께 사용될 수 있거나 또는 이것들 없이 사용될 수 있다. 애쥬반트의 다른 부류로서는 수중유 유액 제제가 있다. 이러한 애쥬반트는 기타 특이적 면역 촉진제 예를 들어, 뮤라밀 펩티드(예를 들어, N-아세틸뮤라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP), N-아세틸-노르뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타민(nor-MDP, N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-히드록시포스포릴옥시)-에틸아민(MTP-PE), N-아세틸글루코사미닐-N-아세틸뮤라밀-L-Al-D-이소글루-L-Ala-디팔미톡시 프로필아미드(DTP-DPP)테라미드TM), 또는 기타 박테리아 세포벽 성분과 함께 사용될 수 있거나 또는 이것들 없이 사용될 수 있다. 수중유 유액으로서는 (a) 예를 들어 모델명 110Y 미세 유체화기(Microfluidics, Newton, MA)와 같은 미세 유체화기를 사용하여 초미세 입자로 제형화된, 5% 스쿠알렌, 0.5% Tween 80 및 0.5% Span 85(임의로는 다양한 양의 MTP-PE 함유) 함유 MF59(WO 90/14837), (b) 초미세 유액으로 미세 유체화되었거나 또는 와류되어 입자 크기가 보다 큰 유액으로 제조된, 10% 스쿠알렌, 0.4% Tween 80, 5% 플루론산 차단 중합체 L121 및 thr-MDP 함유 SAF, 및 (c) 2% 스쿠알렌, 0.2% Tween 80 및, 모노포스포릴지질 A(MPL), 트레할로즈 디미콜레이트(TDM) 및 세포벽 골격(cell wall skeleton)(CWS), 바람직하게는 MPL + CWS (Detox™)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 박테리아 세포벽 성분 함유 리비™(Ribi™) 애쥬반트 시스템(RAS)(Ribi ImmunoChem, Hamilton, MT)를 포함한다.
바람직한 애쥬반트의 다른 부류로서는 사포닌 애쥬반트 예를 들어, 스티뮬론™(Stimulon™)(QS-21, Aquila, Framingham, MA) 또는 이로부터 생성된 입자 예를 들어, ISCOMs(면역 촉진 복합체) 및 ISCOMATRIX가 있다. 기타 애쥬반트로서는 RC-529, GM-CSF 및 완전 프룬트 애쥬반트(CFA) 및 불완전 프룬트 애쥬반트(IFA)를 포함한다. 기타 애쥬반트로서는 시토킨 예를 들어, 인터루킨(예를 들어, IL-I, IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL13, 및 IL-15), 대식 세포 콜로니 자극 인자(M-CSF), 과립구-대식 세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 및 종양 괴사 인자(TNF)를 포함한다. 애쥬반트의 다른 부류로서는 당지질 유사체 예를 들어, N-글리코실아미드, N-글리코실우레아 및 N-글리코실카바메이트가 있으며, 이것들은 각각 당 잔기 내에서 면역 조절제 또는 애쥬반트로서 아미노산으로 치환된다[미국 특허 제4,855,283호 참조]. 열 충격 단백질 예를 들어, HSP70 및 HSP90도 애쥬반트로서 사용될 수 있다.
애쥬반트는 면역원과 함께 단일의 조성물로서 투여될 수 있거나, 또는 면역원 투여 이전에, 투여와 동시에 또는 이후에 투여될 수 있다. 면역원과 애쥬반트는 포장되어(packaged) 동일한 바이알내에 공급될 수 있거나, 또는 별도의 바이알 내에 포장되어 사용전에 혼합될 수 있다. 면역원 및 애쥬반트는 통상적으로 의도로 하는 치료에 적용되는 것을 나타내는 표지로 포장된다. 만일 면역원과 애쥬반트가 별도로 포장되면, 포장은 통상적으로 사용 전 혼합하라는 지시도 포함한다. 애쥬반트 및/또는 담체의 선택은 애쥬반트를 함유하는 면역원성 제형, 투여 경로, 투여 스케쥴, 백신화되는 개체 종에 대한 애쥬반트의 효능에 따라서 달라지며, 인간에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 애쥬반트는 지속적 규제 당국에 의해 인간에의 투여가 승인되었거나 또는 승인 가능한 것이어야 한다. 예를 들어, 완전 프룬트 애쥬반트는 인간에 투여하는데 적합하지 않다. 알룸(Alum), MPL 및 QS-21이 바람직하다. 임의로는, 2개 이상의 상이한 애쥬반트가 동시에 사용될 수도 있다. 바람직한 조합으로서는 알룸과 MPL을 함께 투여하는 것, 알룸과 QS-21을 함께 투여하는 것, MPL과 QS-21을 함께 투여하는 것, MPL 또는 RC-529와 GM-CSF를 함께 투여하는 것, 그리고 알룸, QS-21 및 MPL을 함께 투여하는 것을 포함한다. 뿐만 아니라, 불완전 프룬트 애쥬반트가 사용될 수도 있으며(Chang외 다수, Advanced Drug Delivery Reviews 32, 173-186 (1998)), 임의로는 알룸, QS-21 및 MPL과, 이들을 모두 조합하여 함께 투여할 수도 있다.
본 발명의 제제는 종종 활성 치료제 즉, 기타 약학적으로 허용 가능한 성분을 다수 포함하는 약학 조성물로서 투여된다. 문헌[Remington's Pharmaceutical Science(15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1980)]을 참조하시오. 그러므로, 임의의 제제(예를 들어, 알파 시뉴클레인 또는 이 알파 시뉴클레인에 특이적으로 결합하는 항체)는 시뉴클레인 병증 질환의 치료용인 약품의 제조에 사용될 수 있다. 바람직한 제형은 의도로 하는 투여 방식과 치료 방법에 따라서 달라진다. 조성물은 또한 목적으로 하는 제형에 따라서, 약학적으로 허용 가능하고, 비 독성인 담체 또는 희석제를 포함할 수도 있는데, 이러한 담체 또는 희석제는 동물 또는 인간 투여용 약학 조성물을 제형화 하는데에 일반적으로 사용되는 비히클로서 정의된다. 희석제는 조합물의 생물 활성에 영향을 미치지 않도록 선택된다. 이러한 희석제의 예로서는 증류수, 생리적 인산염 완충 염수, 링거 용액, 덱스트로즈 용액 및 행크 용액이 있다. 뿐만 아니라, 약학 조성물 또는 제형은 기타 담체, 애쥬반트, 또는 비 독성, 비 치료성, 비 면역원성인 안정화제 등을 포함할 수도 있다.
약학 조성물은 또한 크기가 크고, 느리게 대사화되는 거대 분자 예를 들어, 단백질, 다당류 예를 들어, 키토산, 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 공중합체(예를 들어, 세파로즈(TM), 아가로즈, 셀룰로즈 등으로 가능화된 라텍스), 중합체 아미노산, 아미노산 공중합체, 및 지질 응집체(예를 들어, 오일 적 또는 리포좀)을 포함할 수도 있다. 뿐만 아니라, 이러한 담체들은 면역 촉진제(즉, 애쥬반트)로서도 작용할 수 있다.
비경구 투여에 있어서, 본 발명의 제제는 멸균 액체 예를 들어, 물/오일, 염수, 글리세롤 또는 에탄올일 수 있는 약학 담체를 포함하여, 생리적으로 허용 가능한 희석제 중의 물질의 현탁액 또는 용액으로서 주입 가능한 투여량만큼 투여할 수 있다. 뿐만 아니라, 보조 물질 예를 들어 습윤제 또는 유화제, 계면 활성제, pH 완충 물질 등도 본 발명의 조성물 중에 존재할 수 있다. 약학 조성물의 기타 성분으로서는 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 오일 예를 들어, 땅콩 오일, 대두 오일 및 광유를 들 수 있다. 일반적으로, 글리콜 예를 들어, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜이 액상 담체로서 바람직하며, 특히 주입 가능한 용액이 바람직하다. 항체는 활성 성분을 지연 방출시킬 수 있는 방식으로 제형화될 수 있는 저장형 주입물에 의하거나 또는 임플란트 제제의 형태로서 투여될 수 있다. 대표적인 조성물은 모노클로날 항체 5㎎/㎖를 포함하며, 이는 50 mM L-히스티딘, 150 mM NaCl로 이루어졌으며 HCl로 pH를 6.0으로 조정한 수성 완충액 중에 제형화된다. 통상적으로 비경구 투여용 조성물은 실질적으로 멸균되었고, 실질적으로 등장성이며 FDA 또는 유사 당국의 GMP 조건하에서 제조된 것이다. 예를 들어, 생물학적 물질을 함유하는 조성물은 통상적으로 필터 살균에 의해 살균된 것이다, 조성물은 단일 투여용으로서 제형화될 수 있다.
통상적으로, 조성물은 액상 용액 또는 현탁액으로서 주입 가능하도록 제조되며; 주입 전에 액체 비히클 중 용액 또는 현탁액으로서 적합한 고체 형으로도 제조 가능하다. 이 제제는 또한 전술한 바와 같이, 유화되거나 또는 리포좀이나 극미립자 예를 들어, 폴리락티드, 폴리글리콜리드 또는 애쥬반트 효능이 강화된 공중합체 내에 캡슐화될 수도 있다[Langer, Science 249, 1527 (1990) 및 Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28, 97-119 (1997) 참조]. 본 발명의 제제는 활성 성분을 지연 방출 또는 맥동적 방출시킬 수 있는 방식으로 제형화될 수 있는 저장형 주입물 또는 임플란트 제제의 형태로 투여될 수 있다. 조성물은 단위 투여형(즉, 환자 1인당 1회 투여하기에 충분한 양의 활성 성분을 함유하는 제형)으로 제형화될 수 있다.
기타 투여 방식에 적당한 부가의 제형으로서는 경구, 비강 내 및 폐내 제형, 좌제, 및 경피 투여형을 포함한다.
좌제에 있어서, 결합제 및 담체로서는 예를 들어, 폴리알킬렌 글리콜 또는 트리글리세리드를 포함하는데; 이러한 좌제는 활성 성분을 0.5∼10%, 바람직하게는 1∼2% 함유하는 혼합물로 제조될 수 있다. 경구 투여형은 부형제 예를 들어, 약제용 등급의 만니톨, 락토즈, 녹말, 스테아르산마그네슘, 소듐 사카린, 셀룰로즈 및 탄산마그네슘을 포함한다. 이러한 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 알약, 캡슐, 지연 방출형 제형 또는 분말의 형태를 취할 수 있으며, 활성 성분을 10∼95%, 바람직하게는 25∼70% 함유한다.
국소 투여로써는 경피 또는 내피 전달이 가능하다. 국소 투여는 제제와 콜레라 독소 또는 이의 해독된 유도체나 서브유닛, 또는 기타 유사한 박테리아 독소와 함께 투여함으로써 촉진될 수 있다[Glenn외 다수, Nature 391, 851 (1998) 참조]. 동시 투여는 성분들을 혼합물의 형태로, 또는 화학 가교 결합에 의하거나 융합 단백질의 형태로 발현시킴으로써 결합된 분자의 형태로 사용하여 이루어질 수 있다.
대안적으로, 경피 전달은 피부 경로 또는 트랜스퍼로좀(transferosome)을 사용하여 이루어질 수 있다[Paul외 다수, Eur. J. Immunol. 25, 3521-24 (1995); Cevc외 다수, Biochem. Biophys. Acta 1368, 201-15 (1998)].
VIII . 관찰 방법 및 진단 방법
본 발명은 LBD 발병 환자 또는 발병 위험이 있는 환자에 있어서 알파-SN 펩티드 및/또는 Aβ 펩티드에 대해 면역 반응을 확인하는 방법을 제공한다. 이 방법은 환자에게 적용될 치료 경로를 관찰하는데 특히 유용하다. 이 방법은 발병 조짐이 있는 환자에 대한 치료적 처치 결과와 발병 조짐이 없는 환자에 대한 예방적 처치 결과를 관찰하는데 사용될 수 있다. 이 방법은 능동적 면역화의 결과(예를 들어, 면역원 투여에 따른 항체의 생성 여부)와 수동적 면역화의 결과(예를 들어, 투여된 항체의 수준 측정)를 관찰하는데 유용하다.
1. 능동적 면역화
몇몇 방법은 일정 투여량의 제제를 투여하기 이전에 환자에게 일어난 면역 반응의 기준 수치를 측정하고, 이를 치료 후의 면역 반응 수치과 비교하는 것을 포함한다. 면역 반응 수치가 상당히 증가하였음은[즉, 면역 반응 수치가 동일한 시료의 반복적 측정 수치에서 생길 수 있는 실험적 오차의 통상적 한계 값(측정 수치들의 평균으로부터 구하여진 하나의 표준 편차로서 표현됨)보다 컸음은] 곧, 치료 결과가 긍정적임을[즉, 제제를 투여함으로써 면역 반응을 유도시키거나 또는 증가시킴을] 나타내는 것이다. 면역 반응 수준이 그다지 많이 바뀌지 않거나 또는 감소 된다면, 치료 효과가 부정적임을 나타내는 것이다. 일반적으로, 면역원성 제제를 이용한 초기 치료 과정의 진행 중에 있는 환자가 연속적 투여로 인하여 면역 반응이 강화되는 것으로 예상된다면, 이는 궁극적으로 안정 수준에 도달함을 나타내는 것이다. 일반적으로 제제는 면역 반응이 강화될 때 계속 투여된다. 안정 수준에 도달하였음은 곧 적용된 치료법이 불연속적이거나 또는 투여량이나 투여 횟수가 줄어들 수 있음을 의미하는 것이다.
다시 말하면, 면역 반응의 대조구 수치(즉, 평균 및 표준 편차)는 대조군에 대해 측정된다. 통상적으로, 대조군에 속하는 개체는 이전에 치료를 받지 않았다. 치료제가 투여된 이후의 환자에 있어서 면역 반응의 측정 수치는 대조구 수치과 비교된다. 측정 수치가 대조구 수치에 비하여 상당히 증가하였음은(예를 들어, 평균으로부터 얻어진 하나의 표준 편차보다 컸음은) 치료 결과가 긍정적임을 나타내는 것이다. 측정 수치가 거의 증가하지 않았거나 또는 감소하였음은 치료 결과가 부정적임을 나타내는 것이다. 일반적으로 면역 반응 수치가 대조구 수치에 비하여 증가할 때 제제를 계속 투여한다. 이전과 같이, 대조구 수치에 비하여 안정 수준에 도달하였음은 곧, 적용된 치료법을 중단할 수 있거나 또는 투여량이나 투여 횟수가 줄어들 수 있음을 나타내는 것이다.
다른 방법에서, 면역 반응의 대조구 수치(예를 들어, 평균 및 표준 편차)는 치료제로써 치료를 진행하고 있으며 면역 반응이 치료에 반응하여 안정 수준에 도달한 개체들의 대조군으로부터 측정된다. 환자의 면역 반응에 대한 측정 수치는 대조구 수치과 비교된다. 환자로부터 측정된 수준이 대조구 수치과 유의적으로 상이하지 않으면(예를 들어, 하나의 표준 편차 이상이면), 치료는 중단될 수 있다. 환자로부터 측정된 수준이 대조구 수치보다 상당히 낮으면, 제제를 계속 투여한다. 환자로부터 측정된 수준이 계속해서 대조구 수치 이하이면, 예를 들어, 상이한 애쥬반트를 사용한다든지 하여 치료 방법을 바꾼다.
다시 말해서, 현재 치료를 받지 않고 있으나 이전에 치료를 받은 적이 있는 환자의 면역 반응을 관찰하여 치료 재개가 필요한지 여부를 결정한다. 환자로부터 측정된 면역 반응 수치는 이전에 치료를 받은 적이 있는 환자에 있어서 이미 발생한 면역 반응 수치과 비교될 수 있다. 이전 측정 수준에 비하여 그 수준이 상당히 감소하였음은[즉, 동일한 시료의 반복된 측정 수치에서 생길 수 있는 실험적 오차의 통상적 한계 값보다 컸음은] 곧, 치료가 재개될 수 있음을 의미하는 것이다. 대안적으로, 환자로부터 측정된 값은 치료 과정이 진행중인 환자의 군집에서 측정된 대조구 수치(평균 + 표준 편차)와 비교될 수 있다. 대안적으로, 환자로부터 측정된 값은 질환의 증상을 나타내지 않는 환자를 예방 차원에서 처치한 군집의 대조구 수치, 또는 질환의 증상이 완화된 환자를 치료 차원에서 처치한 군집의 대조구 수치과 비교될 수 있다. 이러한 모든 경우에 있어서, 대조구 수준에 비하여 그 수준이 상당히 감소하였음은[즉, 표준 편차 이상이었음은], 치료가 환자에서 재개되어야 함을 나타내는 것이다.
분석용 조직 시료로서는 통상적으로 환자로부터 채취한 혈액, 혈장, 혈청, 점액 또는 뇌척수액이 있다. 이 시료는 알파-SN, 통상적으로 NAC 또는 Aβ 중 임의의 형태의 것에 대하여 면역 반응을 나타내는지 여부에 대해 분석된다. 면역 반응은 예를 들어, 알파-SN 또는 AB에 특이적으로 결합하는 T-세포 또는 항체의 존부로부터 측정될 수 있다. 알파-SN에 특이적인 항체를 검출하는 ELISA 방법은 실시예 섹션에 기술되어 있다. 반응성 T-세포를 검출하는 방법은 전술되어 있다["정의" 부분 참조]. 몇몇 방법에서, 면역 반응은 제거 검정법(clearing assay) 예를 들어, 상기 섹션 III에 기술된 방법을 이용하여 측정된다. 이러한 방법에서, 치료받을 환자로부터 얻어진 조직 또는 혈액 시료를 LB(예를 들어, 시뉴클레인/hAPP 트랜스제닉 마우스 유래) 및 Fc를 보유하는 식세포와 접촉시킨다. 이후 LB가 제거되는지 여부를 관찰한다. 제거 반응이 일어났음과 그 정도는 시험중인 환자의 조직 시료 중에 알파-SN을 제거하는데 효과적인 항체의 존재 여부와 그 수준에 대한 지료를 제공한다.
*2. 수동적 면역화
일반적으로, 수동적 면역화를 관찰하는 방법은 전술한 능동적 면역화를 관찰하는 방법과 유사하다. 그러나, 수동적 면역화 이후의 항체 프로필은 통상적으로 항체 농도에 있어서는 최고 수준에 인접하는 값을 나타냈다가, 지수적으로 감소하였다. 추가로 투여하지 않았을 경우, 그 수준은 갑소하여 투여된 항체의 반감기에 따라서 수일에서 수개월까지의 기간 이내에 예비 처리하였을 때의 수준에 이르게 된다. 예를 들어, 몇몇 인간 항체의 반감기는 20일이다.
몇몇 방법에 있어서, 환자의 알파-SN에 대한 항체의 기준 측정 수치는 투여 이전에 측정되고, 2차 측정은 항체 수준이 최고에 도달하였음을 확인한 이후에 행하여 지며, 그 이후로 일정 간격을 두고 1회 이상 더 측정하여 항체 수준이 감소하는지 여부를 관찰한다. 항체 수준이 기준선, 또는 이 기준선 미만인 최고 수준의 몇 %(예를 들어, 50%, 25% 또는 10%)로 감소할 때, 항체를 추가 투여한다. 몇몇 방법에서, 최고 수준, 또는 기본 수치 미만인 추후 측정 수준을 미리 측정해 둔 참고 수준와 비교하여 다른 환자에게도 유리한 예방적 또는 치료적 처치 방법을 구성한다. 측정된 항체 수준이 참고 수준보다 상당히 적으면(예를 들어, "치료 효과를 보고 있는 환자의 군집으로부터 얻은 평균 - 참고 수준의 표준 편차 중 하나의 값" 미만이면), 항체를 추가로 투여해야 함을 의미한다.
3. 진단 키트
본 발명은 전술한 진단 방법을 수행하기 위한 진단 키트를 추가로 제공한다. 통상적으로, 이러한 키트는 알파-SN에 대한 항체에 특이적으로 결합하는 제제를 함유한다. 이 키트는 또한 표지도 포함한다. 알파-SN에 대한 항체를 검출하기 위하여, 이 표지는 통상적으로 표지화된 항-유전자형 항체의 형태를 갖는다. 항체를 검출하기 위해서, 제제를 예를 들어, 미세 역가 접시의 벽과 같은 고체상에 공급하여 이에 예비적으로 결합시킨다. 통상적으로 키트는 또한 키트의 사용 지침을 제공하는 표지를 포함한다. 이 표지는 또한 알파-SN에 대한 항체의 수준와 측정된 표지의 수준이 상관된 기타 대응 상황 또는 차트를 포함한다. 표지란 용어는, 키트의 제조, 운반, 판매 또는 사용 중 임의의 시기에 키트에 부착되거나, 또는 이에 들어있는, 문자화되었거나 또는 기록된 임의의 자료를 의미한다. 예를 들어, 표지란 용어는 광고용 전단지와 소책자, 포장 재료, 지시서, 오디오 또는 비디오 카세트, 컴퓨터 디스크와, 키트에 직접 인쇄된 정보를 포함한다.
본 발명은 또한 생체내 이미지화를 수행하기 위한 진단용 키트를 제공한다. 이러한 키트는 통상적으로 알파-SN의 에피토프, 바람직하게는 NAC 내에 존재하는 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다. 바람직하게, 상기 항체는 표지화되었거나, 또는 2차 표지화 시약은 이 키트 내에 포함된다. 바람직하게, 이 키트는 생체 내 이미지화 검정법을 수행하기 위한 지침으로 표지화되어 있다.
IX . 생체 내 이미지화
본 발명은 환자 내 LB를 생체 내 이미지화하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 PD, 또는 뇌에 LB가 생성되는 기타 관련 질환, 또는 이 질환에 대한 감수성을 진단 또는 확인하는데 유용하다. 예를 들어, 본 방법은 치매 증상을 보이는 환자에게 사용될 수 있다. 그 환자가 LB를 보유하면, 이 환자는 예를 들어, PD를 앓고 있을 것이다. 본 방법은 또한 자각 증상이 없는 환자에도 사용될 수 있다. 아밀로이드가 비정상적으로 침착되었음은 장래 질환의 증상을 나타내기 쉬움을 의미하는 것이다. 본 방법은 또한 이전에 파킨슨병이라고 진단받은 환자에 있어서 질환의 진행 및/또는 치료에 대한 반응을 관찰하는데 유용하다.
본 방법은 시약 예를 들어, 환자 체내 알파-SN에 결합하는 항체를 투여한 후, 이 항체가 결합한 후에 제제를 확인함으로써 수행된다. 바람직한 항체는 전장 NACP 폴리펩티드에 결합하지 않고 환자의 체내 알파-SN 침착물에 결합한다. NAC에 존재하는 알파-SN의 에피토프에 결합하는 항체가 특히 바람직하다. 원한다면, 제거 반응은 전장 불변 영역이 흠결된 항체 단편 예를 들어, Fab를 사용함으로써 차단될 수 있다. 몇몇 방법에서, 동일한 항체는 치료용 시약 및 진단용 시약으로서 사용될 수 있다. 일반적으로, 알파-SN의 에피토프 N-말단에 결합하는 항체는 에피토프 C-말단에 결합하는 항체만큼 강한 신호를 나타내지 않을 것인데, 이는 아마도 N-말단 에피토프가 LB에 접근할 수 없기 때문일 것이다[Spillantini외 다수 PNAS, 1998]. 따라서, 이러한 항체는 그다지 바람직하지 않다.
진단 시약은 환자의 체내에 정맥 내 주입에 의하여 투여될 수 있거나, 또는 두개 내 주입에 의하여 뇌에 직접 투여될 수 있는데 즉, 두개골에 드릴로 구멍을 뚫어서 직접 투여될 수 있다. 시약의 투여량은 치료 방법에 있어서의 투여 범위와 동일한 범위 이내이어야 한다. 통상적으로, 시약은 표지화되며, 비록 몇몇 방법에서는, 알파-SN에 대한 친화성을 갖는 1차 시약은 표지화되지는 않지만, 2차 표지화 제제는 1차 시약과 결합하는데에 사용된다. 표지의 선택은 검출 방법에 따라 다르다. 예를 들어, 형광 표지는 광학적 검출 방법에 적당하다. 상자성 표지는 수술이 개입되지 않는 단층 촬영 검출 방법에 사용하기에 적당하다. 방사성 표지는 또한 PET이나 SPECT를 사용하여 검출될 수 있다.
진단은 표지된 위치의 수, 크기 및/또는 밀도를 기준치의 그것과 비교함으로써 행하여 진다. 기준치는 발병되지 않은 개체군의 평균 수준을 나타낼 수 있다. 기준치는 또한 동일한 환자에 대해 미리 측정된 수준을 나타낼 수도 있다. 예를 들어, 기준치는 치료 시작 이전에 환자에 대해 측정될 수 있으며, 이후 측정된 수준은 기준치와 비교된다. 기준치에 비하여 그 수준이 감소되었음은 치료에 대해 긍정적인 효과를 나타냄을 의미한다.
도 1은 2개의 NAC 아미노산 서열인 서열번호 2 및 서열번호 3과 함께 정렬된 알파-SN의 아미노산 서열(서열번호 1)을 나타내는 것이다.
도 2는 비 트랜스제닉 마우스의 뇌 검편(패널 A, E 및 I), 애쥬반트만으로 면역화한 알파-SN 트랜스제닉 마우스의 뇌 검편(패널 B, F, J), 및 알파-SN에 대한 항체가 저역가(패널 C, G 및 K) 및 고역가(패널 D, H 및 I) 알파-SN으로 면역화된 알파-SN 트랜스제닉 마우스의 뇌 검편을 면역조직학적으로 염색한 결과를 나타내는 것이다. 검편을 성상아교 세포 마커인 아교 섬유 산성 단백질(Glial Fibrillary Acidic Protein; GFAP)에 대하여, 항-알파-시뉴클레인 항체로 염색하여 시뉴클레인 수준을 확인하였으며(패널 A∼D), 항-IgG 항체로 염색하여 검편 중에 존재하는 총 IgG 수준을 측정하였다(패널 E∼H).
도 3은 광학 현미경에 의하여 관찰된, 형질감염 GT1-7 세포 내 시뉴클레인 응집에 항-mSYN 폴리클로날 항체가 미치는 영향을 나타내는 것이다.
도 4는 분석 이전 48 시간 동안 전 면역 혈청(preimmune sera) 및 67-10 항체를 (1:50)의 농도로 처리한 GT1-7 α-syn 세포의 세포질(C) 및 막(P)에 존재하는 시뉴클레인 수준에 관한 웨스턴 블럿 결과이다.
도 5는 비 트랜스제닉 마우스, SYN, APP 및 SYN/APP 트랜스제닉 마우스의 뇌에 침착된 Aβ1-42 면역화 아밀로이드 침착물이 미치는 영향에 대한 연구 결과를 나타내는 것이다. APP 및 SYN/APP 마우스에서 검출 가능한 아밀로이드 수준은 Aβ1-42 면역화에 의해 감소된다.
도 6은 비 트랜스제닉 마우스, SYN, APP 및 SYN/APP 트랜스제닉 마우스의 뇌에 시뉴클레인 봉입체가 형성될 때 Aβ1-42 면역화가 미치는 영향을 연구한 결과를 나타내는 것이다. SYN 및 SYN/APP 마우스에서 검출된 시뉴클레인 봉입체는 Aβ1∼42 면역화에 의해 감소된다.
도 7은 항체가 알파-SN 응집을 방해하는 직접적 및 간접적 기작을 나타내는 것이다.
도 8은 항체 에피토프 맵핑 결과를 나타내는 것이다. 고역가 및 고친화도 항-인간 α-시뉴클레인 항체를 생성하는 마우스에서 유래된 항체를 ELISA 기술을 사용하여 맵핑하였다. 백신화된 마우스로부터 유래된 대부분의 항-혈청 시료에서, 인지된 에피토프는 인간 α-시뉴클레인의 C-말단 영역 내에 존재한다. CFA 처리된 대조군으로부터 유래된 혈청에는 에피토프가 관찰되지 않았다.
도 9는 인간 α-시뉴클레인 면역반응성 및 신경 퇴행의 기타 마커에 대한 수준을 분석한 이미지 분석 결과를 나타내는 것이다. (A) 측두 피질에 존재하는 hα-시뉴클레인 양성 봉입체의 평균 수. 인간 α-시뉴클레인으로 백신화하면 대조구에 비하여 봉입체의 수가 상당히 감소하게 된다. 이러한 효과는 I군과는 달리 II군에 속하는 마우스에서 더욱 뚜렷이 나타났다. (B) 전두 피질 내에 존재하는 시냅토파이신-면역반응성 말단부가 점유하는 신경모의 표면적 %. CFA만으로 처리된 트랜스제닉(tg) 마우스에서, 시냅토파이신 면역 표지화된 말단부의 수는 20%까지 감소한 반면에, 시냅스 당 시냅토파이신 면역반응성의 수준은 변함없었다. (C) 측두 피질에서의 CD45 면역반응성(미세아교 세포 마커)의 수준은 인간 α-시뉴클레인 백신화 마우스의 뇌에서 보다 높았다. (D) 측두 피질내에 존재하는 인간 α-시뉴클레인 면역 반응성 말단부에 의해 점유된 신경모의 표면적 %. 인간 α-시뉴클레인으로 백신화된 tg 마우스에서, 시냅토파이신-면역반응성 말단부 중의 α-시뉴클레인 축적량이 감소하였다. * = CFA 만으로 처리된 인간 α-시뉴클레인 tg 마우스와 비교하였을 때의 유의차(p < 0.05, 스튜던트 T 검정).
도 10은 백신화된 동물 내에서 인간 α-시뉴클레인 및 시냅토파이신 면역반응성의 수준에 대한 워스턴 블럿 분석 결과를 나타내는 것이다. CFA 만으로 처리된 tg 마우스의 뇌(래인 1∼3)에 비하여, hα-시뉴클레인 백신화 tg 마우스의 뇌(래인 4∼6)에서는 인간 α-시뉴클레인 올리고머 및 단량체 둘 다의 수준이 감소하였으며(상부 패널), 반면에 hα-시뉴클레인 백신화 tg 마우스 군에서는 시냅토파이신 면역반응성 수준이 증가하였다(하부 패널).
도 11은 항-α-시뉴클레인 항체를 두개 내 주입한 후 뉴런 내 α-시뉴클레인 응집체에 대하여 분석한 결과를 나타내는 것이다. C-말단 항체 8A5 및 N-말단 항체 6H7은 제거 효과를 나타내었다. IgG1, IgG2a 및 IgG2b는 이소타입 대조구였다. 수평 막대는 중앙값을 나타내는 것이다.
도 12는 모노클로날 항체 8A5가 주입된 마우스의 반대 측(좌측 패널; 구역 내 갈색의 둥근 점은 α-시뉴클레인 응집체임) 및 동 측(우측 패널) 검편을 나타내는 것이다. α-시뉴클레인에 대한 폴리클로날 항체로 면역염색을 실시하였다. 반대 측의 뉴런 내 α-시뉴클레인 응집체를 동그라미로 표시하였다.
실시예 I: 인간 알파- 시뉴클레인으로 인간 알파- 시뉴클레인 트랜스제닉 마우스를 면역화시킨 결과, 혈뇌장벽을 통과하는 항-알파- 시뉴클레인 항체가 고역가로 생산된다.
전장 재조합 인간 알파-SN을 1× 인산염 완충 염수(PBS) 중에 1㎎/㎖의 농도로 재현탁시켰다. 각각의 주입시, 알파-SN은 50㎕ 주입하였으며; 1회 주입시 1× PBS 150㎕당 최종 농도를 50㎍으로 만들었다. 이후 완전 프룬트 애쥬반트(CFA)를 알파-SN 또는 PBS만을 포함하고 있는 용액(대조구)에 1:1의 비율로 첨가한 다음, 이를 와류 및 초음파 처리하여 유액을 완전히 재현탁하였다. 처음 주입시, D 라인에 속하는 인간 알파-SN 트랜스제닉(tg) 단일 트랜스제닉 마우스 8 마리(4∼7월령)[Masliah외 다수 Science 287:1265-1269 (2000)]에 CFA 중 인간 알파-SN을 주입하고, 대조구로서는 D 라인에 속하는 인간 알파-SN tg 마우스 4 마리에 CFA 중 PBS를 주입하였다. 마우스에 총 6회 주입하였다. 3회는 2주 간격으로 주입하였고, 이후 3회는 1개월 간격으로 주입하였다. 실험 개시후 5개월 경과시 동물의 인도주의적 취급에 관한 NIH 가이드라인에 따라서 동물을 죽였다. 항체 역가를 측정하기 위해 혈액 시료를 채취한 후, 뇌를 4일 동안 PBS 중 4% 파라포름알데히드에 침지시켜 고정하였다. 인간 알파-SN에 대한 항체의 수준(ELISA로 측정)를 표 1에 나타내었다. 처치된 마우스들을 역가별로 2개의 그룹으로 나누었다. 첫 번째 그룹은 역가가 중간 정도(2∼8,000)에 이르렀다. 두 번째 그룹은 역가가 높았다(12000∼30000). 대조구 마우스들에게서는 역가가 측정되지 않았다. 신경 병리학적 분석 결과, 역가가 높았던 마우스는 시뉴클레인 봉입체의 크기가 상당히 줄어들었음을 알 수 있었다. 중간 정도의 역가를 나타내는 마우스는 봉입체의 크기가 이보다 덜 줄어들었다. 도 2(패널 a∼d)는 각각 비 트랜스제닉 마우스(a), CFA만을 처리한 트랜스제닉 마우스(b), 중간 정도의 역가를 나타내는, CFA 및 알파 시뉴클레인으로 면역화된 트랜스제닉 마우스(c), 그리고 고도의 역가를 나타내는, CFA 및 알파 시뉴클레인으로 면역화된 트랜스제닉 마우스(d)를 나타내는 것이다. 시료를 항-인간 알파-SN 항체로 면역 염색하여 눈으로 관찰하였다. 도 2는 시뉴클레인 봉입체가 패널 (b)에는 생성되었으나 패널 (a)에는 생성되지 않았음을 보여준다. 패널 (c) 즉, 처리된 마우스(중간 정도의 역가를 나타내는 마우스)에서는 봉입체의 농도가 어느 정도 감소하였다. 패널 (d)에서는 봉입체의 농도가 상당히 감소하였다. 패널 (e)∼(h)는 두개 내의 항-IgG 수준이 각각 패널 (a)∼(d)의 4마리 마우스와 동일함을 나타낸다. IgG는 패널 (g)에 존재하고 패널 (h)에서는 더 많이 존재함을 알 수 있다. 이 데이터는 말초 혈관을 통해 투여된 알파-SN에 대한 항체가 혈뇌 장막을 통과하여 뇌에 도달함을 보여주는 것이다. 패널 (i)∼(l)은 GAP(즉, 별아교 세포의 마커)을 염색한 결과를 나타내며 반면에, 도면의 처음 두 줄에 해당하는 4마리의 마우스와 동일하게 처리하였다. 패널 (k) 및 (l)은 패널 (i) 및 (j)와 비교하였을 때 염색 농도가 약간 증가하였음을 나타낸다. 이러한 데이터를 통하여, 시뉴클레인 침착물은 경미한 별아교 세포 및 미세 아교 세포 반응에 의하여 제거됨을 알 수 있다.
그룹 유전자형 n= 안락사
당시의
마우스
연령
(월령)		 처리/기간 역가 Syn(+)
봉입체/
㎟
I Syn Tg 4 10∼13 a-syn+CFA
50㎍/
3개월 동안
주입
3개월 경과후 안락사		 2,000
∼ 8,000		 15∼29
II Syn Tg 4 10∼13 a-syn+CFA
50㎍/
3개월 동안
주입
3개월 경과후 안락사		 12,000
∼ 30,000		 10∼22
III Syn Tg 4 10∼13 3개월 동안
PBS+ CFA 주입
3개월 경과후 안락사		 0 18∼29
실시예 II : 시뉴클레인 봉입체를 제거하는 항체에 대한 시험관 내 스크리닝
GT1-7 뉴런 세포(Hsue외 다수 Am. J. Pathol. 157:401-410 (2000))를, 쥐의 알파-SN을 발현하는 pCR3.1-T 발현 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA)로 형질 감염시킨 후, 발현 벡터만으로 형질 감염된 세포와 비교하였다[도 3의 패널 B 및 A]. 벡터만으로 형질 감염된 세포(패널 A)는 섬유 아세포의 형태를 띠었으며, 반면에 알파-SN으로 형질 감염된 세포는 둥근 형태를 띠었고, 이때 봉입체는 광학 주사 현미경과 공초점 주사 현미경을 통하여 상기 세포들의 표면에서 관찰할 수 있었다. 이후 형질 감염된 세포들을 토끼의 예비 면역화 혈청(패널 C) 또는 67-10 즉, 쥐 알파-SN C-말단 잔기(131-140번 잔기)에 대하여 친화도 정제된 토끼의 폴리클로날 항체로 처리하였다(Iwai외 다수, Neuron 14:467 (1995))(패널 D). 봉입체의 염색 정도는 패널 C보다 패널 D가 덜 강하였는데, 이는 곧 알파 시뉴클레인에 대한 항체가 봉입체를 제거하거나 또는 이의 형성을 예방하는데에 효과적이었음을 나타내는 것이다. 도 4는 토끼의 예비 면역 혈청과 67-10 폴리클로날 항체로 처리된 GT1-7 형질 감염 세포질 분획 및 미립자에 대한 겔 분석 결과를 나타내는 것이다. 세포질 분획 중 시뉴클레인 수준은 알파-SN에 대한 항체 또는 예비 면역 혈청으로 처리하더라도 크게 바뀌지 않음을 알 수 있다. 그러나, 알파-SN에 대한 항체로 처리된 GT1-7 세포의 막 분획 중에서는 알파-SN 밴드가 사라졌다. 이 데이터를 통하여 알파 시뉴클레인 항체 활성이 세포막과 결합된 시뉴클레인을 제거함을 알 수 있다.
면역 조직 화학적 분석법, 광학 현미경 분석법(도 3), 또는 겔 분석법(도 4)에 의한 검출 방법을 통해, 형질 감염된 GT1-7 세포를 사용하여 시뉴클레인 봉입체를 제거하는 활성에 대하여 항체를 스크리닝할 수 있다.
실시예 III . 알파- 시뉴클레인을 이용한 면역화의 예방적 및 치료적 효능
i. 인간 알파- 시뉴클레인 tg 마우스의 면역화
본 연구를 위하여, 이종 접합성 인간 알파-SN 트랜스제닉(tg) 마우스(라인 D)(Masliah외 다수, 2000, Science 286:1265-69) 및 비 트랜스제닉(non tg) 대조구를 사용한다. 실험 동물을 3개의 그룹으로 나눈다. 제I 그룹에 있어서, 생후 2개월부터 실험을 시작하여 8개월 동안 마우스를 면역화함으로써, 초기 면역화의 예방적 효능을 시험하였다. 제II 그룹에 있어서, 어린 성체 마우스를 생후 6개월부터 실험을 시작하여 8개월 동안 백신화한 후, 일단 병상이 완화되면 면역화가 질환의 진행을 억제하였는지 여부를 측정한다. 제III 그룹에 있어서, 더 성숙된 마우스를 생후 12개월부터 실험을 시작하여 4개월 동안 면역화한 후에도, 병상이 여전히 지속되면 면역화가 증상의 중증도를 감소시킬 수 있는지 여부를 측정한다. 모든 그룹에 있어서, 마우스를 재조합 인간 알파-SN + CFA로, 또는 CFA만으로 면역화하였으며, 각각의 실험에 있어서는, 20 마리의 tg 마우스와 10 마리의 비 tg 마우스를 사용하였다. 이 마우스들 중에서, 10 마리의 tg 마우스는 인간 알파-SN + CFA로 면역화하였으며, 나머지 10마리의 tg 마우스는 CFA만으로 면역화한다. 이와 유사하게, 5 마리의 비 tg 마우스는 인간 알파-SN + CFA로 면역화하고, 나머지 5마리는 CFA만으로 면역화한다. 간단히 말해서, 면역화 과정은 처음에 CFA 중 정제된 재조합 인간 알파-SN(2 ㎎/㎖)을 주입하여 면역화한 후, 1개월 경과시 인간 알파-SN과 IFA를 다시 주입하는 단계로 이루어져 있다. 이후, 마우스를 상기 혼합물로 1개월에 1회씩 재주입한다. 인간 알파-SN tg 마우스(n은 각각 3; 6월령) 및 비 tg 마우스(n은 각각 3; 6월령)의 소단위 하부 세트에 있어서, 부가 실험은 쥐(m) 알파-SN, 인간 베타 시뉴클레인 또는 돌연 변이(A53T) 인간 알파-SN으로 면역화하는 단계들을 포함한다.
웰 당 0.4 ㎍의 정제된 전장 알파-SN으로 코팅된 96-웰 미세 역가 평판을 밤새도록 4℃에서 탄산나트륨 완충액(pH9.6) 중에서 항온 처리하여 알파-SN 항체의 수준을 측정한다. 웰을 0.1% Tween을 함유하는 PBS 200㎕씩으로 4회 세척한 후, 37℃의 PBS-1% BSA 중에서 1 시간 동안 블로킹(blocking)시켰다. "웰 내(in-well)"에서 1:3의 비율로 혈청 시료를 연속적으로 희석시켰으며, 이때 A 열에서 시작하여 1:150∼1:328,050배의 희석률로 희석시켰다. 대조구 실험에 있어서는, 마우스 모노클로날 항체 시료를 알파-SN이 존재하는 경우, 단백질이 존재하지 않는 경우 및 완충액만 존재하는 경우(블랭크)에 대해서 각각 전개시켰다. 이 시료를 40℃에서 밤새도록 항온 처리한 후, 염소 항-마우스 IgG 알칼리성 포스파타아제-컨쥬게이트화 항체(1:7500, Promega, Madison, WI)로 2 시간 동안 항온 처리하였다. 이후, 아토-포스®(Atto-phos®) 알칼리성 포스파타아제 형광 기질을 첨가하고 실온에서 30분 동안 방치하였다. 평판을 여기 파장 450㎚ 및 방사 파장 550㎚에서 해독하였다. 결과를 반로그 그래프(semi-log graph)[세로축 = 상대적 형광 단위 ; 가로축 = 혈청 희석률]상에 나타내었다. 항체 역가는 항체의 최대 결합 양의 50%가 감소하는 때의 희석률로서 정의된다.
각각의 그룹에 있어서, 처리의 마지막 단계에, 문헌[Masliah외 다수 (2000)]에 기술된 바와 같이 로타 로드(rotarod)에서의 운동성 평가를 수행하였다. 분석 후, 마우스를 안락사시키고 뇌를 꺼내어 이하에 기술된 바와 같이 신경 화학적 분석 및 신경 병리학적 분석을 행하였다. 간단히 말하면, 우측 뇌의 반구를 동결시켜 균질화한 다음에, 웨스턴 블럿에 의해 응집된, 그리고 응집되지 않은 인간 알파-SN의 면역 반응성을 측정하였다(Masliah외 다수 (2000)). 좌측 뇌의 반구를 4% 파라포름알데히드 중에 고정시키고, 진동 절단기(vibratome)를 사용하여 연속적으로 생검 절편을 만들어 면역 세포 화학 및 초미세 구조 분석을 준비하였다.
ii . 면역 세포 화학적 및 신경 병리학적 분석
면역화가 약화되었는지 여부를 측정하기 위하여, 인간 알파-SN 응집체 검편을 인간 알파-SN에 대한 토끼의 폴리클로날 항체로 면역 염색한다(1:500). 4℃에서 밤새도록 항온 처리한 후, 검편을 바이오틴화된 항-토끼 2차 항체 → 아비딘 D-호오스래디쉬 퍼옥시다제(HRP) 복합체(1:200, ABC Elite, Vector)로 항온 처리한다. 검편을 또한 바이오틴화된 항-토끼, 마우스 또는 인간 2차 항체만으로 면역 염색한다. 항-마우스 2차 항체를 이용하는 본 실험은 인간 알파-SN에 대한 항체가 뇌를 통과하는지 여부를 측정하기 위한 것이다. 본 반응은 0.001%의 H2O2와 함께, 50 mM Tris-HCl(pH7.4) 중 0.1% 3,3-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드(DAB)를 이용하여 눈으로 관찰되며, 이후 검편은 엔텔란(Entellan) 하 슬라이드 상에 적재된다. 면역 반응성의 수준은 퀀티멧(Quantimet) 570C를 이용하는 광학 밀도계를 통해 반정량적으로 평가된다. 이러한 검편들은 또한 이미지 분석에 의해 연구되어 알파-SN 면역 반응성 봉입체의 수를 측정할 수 있으며, 이러한 알파-SN 응집체의 신뢰성 있는 측정치는 백신화의 항-응집 효과에 대한 중요한 지수로서의 역할을 한다[Masliah외 다수 (2000)].
신경 퇴행의 패턴 분석은, 시냅토파이신 및 미세소관-결합 단백질 2(MAP2)에 대해 이중으로 면역 표지화된 진동 절단 검편을 이용하여 해마, 전두엽, 측두엽 및 기저핵 내 시냅스 및 수지상 밀도를 분석함으로써 수행 가능하며, LSCM으로써 관찰 가능하다. 전술한 바와 같이, 코도푸타멘(caudoputamen) 및 중뇌 흑색질(substantia nigra;SN) 중에서 티로신 하이드록실라제(TH) 면역 반응성을 측정함으로써 신경 퇴행에 대한 추가 분석을 실시하였다[Masliah외 다수 (2000)]. 검편은 LSCM으로 이미지화될 것이며, 각각의 이미지는 상호 한계치에 이르러 픽셀 강도가 비례하는 TH-면역 반응성 말단이 포함된다. 단위는 픽셀:㎛ 비율로 측정하도록 맞추어진다. 이후, 이 정보는 TH-면역 반응성 말단부로 덮여진 신경모의 표면적 %를 계산하는데 사용된다. 상기 동일한 검편들은 또한 SN 중 TH 뉴런의 수를 계산하는데 이용된다.
면역화에 대한 면역 반응의 패턴을 평가하기 위해, 재조합 인간 알파-SN 및 대조구 면역원으로 면역화된 비 tg 마우스 및 알파-SN tg 마우스의 뇌 검편 중에서 인간 GFAP, 제II군 MCH, Mac1, TNF-알파, IL1 베타 및 IL6에 대한 항체를 이용하여 면역 세포 화학적 및 초미세 구조 분석법을 수행한다.
iii . 행동 분석
전술한 바와 같이, 마우스의 운동 능력을 분석하기 위하여 마우스를 2일 동안 로타 로드(San Diego Instruments, San Diego, CA)에 놓아둔다(Masliah외 다수 (2000)). 첫날, 마우스를 5회 훈련시켰는데; 처음에는 10 rpm에서, 두 번째는 20 rpm에서, 그리고 세 번째에서 다섯 번째는 40 rpm에서 훈련을 시켰다. 이튿날, 40 rpm에서 7회 훈련시켜 마우스를 시험하였다. 마우스를 개별적으로 원통에 집어넣고, 240초에 걸쳐서 회전 속도를 0에서 40 rpm으로 증가시킨다. 마우스가 얼마나 오랫동안 막대 위에서 견디는지 그 시간(추락 지연 시간; fall Latency)을 기록하여 이를 운동 기능의 척도로서 이용한다.
실시예 IV : 알파- 시뉴클레인 단편을 이용한 면역화
인간 알파-SN 트랜스제닉 마우스(10∼13월령)를 알파-SN의 9개의 상이한 부분으로 면역화시켜 어느 에피토프가 유효한 반응을 나타내는지를 측정한다. 9개의 상이한 면역원 및 하나의 대조구를 전술한 바와 같이 복강 내 주입한다. 면역원은 4개의 인간 알파-SN 펩티드 컨쥬게이트를 포함하는데, 이들 모두는 시스틴 결합을 통해 양의 항-마우스 IgG와 커플링되어 있다. 알파-SN 및 PBS는 각각 양성 및 음성 대조구로서 사용된다. 전술한 바와 같이 역가를 관찰한 후, 마우스를 주입후 3∼12개월 경과시 안락사시킨다. 조직 화학적 분석, 알파-SN 수준 분석및 독성학적 분석은 사후 실시한다.
i. 면역원의 제조
가교 시약인 설포-EMCS를 이용하여 알파-SN 펩티드에 가하여진 인공 시스테인을 통하여 커플링시킴으로써, 커플링된 알파-SN 펩티드:H 알파-SN 펩티드의 컨쥬게이트 제제를 제조한다. 알파-SN 펩티드 유도체를 다음과 같은 최종 아미노산 서열로 합성한다. 각각의 경우, 삽입된 시스테인 잔기의 위치는 밑줄을 그어 표시한다.
알파-시뉴클레인 60-72 (NAC 영역) 펩티드:
NH2-KEQVTNVCGGAVVT-COOH (서열번호 54)
알파-시뉴클레인 73-84 (NAC 영역) 펩티드:
NH2-GVTAVAQKTVECG-COOH (서열번호 55)
알파-시뉴클레인 102-112 펩티드:
NH2-C-아미노-헵타논산-KNEEGAPCQEG-COOH (서열번호 56)
알파-시뉴클레인 128-140 펩티드:
Ac-NH-PSEEGYQDYEPECA-COOH (서열번호 57)
커플링 반응을 준비하기 위해, 10㎎의 양 항-마우스 IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories)을 밤새도록 10mM 붕산 나트륨 완충액(pH8.5)에 대해 투석시킨다. 이후, 아미콘 센트리프렙 튜브(Amicon Centriprep tube)를 이용하여 투석된 항체를 부피 2㎖가 될 때까지 농축시킨다. 10㎎의 설포-EMCS[N(ε-말레이미도쿠프로일옥시)숙신아미드](Molecular Sciences Co.)를 1㎖의 탈이온수에 용해시킨다. 40배 몰 과량의 설포-EMCS를 양 항-마우스 IgG에 교반하면서 적가한 다음, 이 용액을 10분 더 교반한다. 활성화된 양 항-마우스 IgG를, 0.1 M NaPO4, 5 mM EDTA(pH 6.5)로 평형화시킨 10㎖들이 겔 여과 컬럼(Pierce Presto Column, Pierce Chemicals 제품)에 통과시켜 정제 및 완충액 교환한다. 소멸 계수로서 OD 당 1.4 ㎎으로 하여, 280㎚에서의 흡광도로 동정한 항체 함유 분획을 모아서, 이를 농도 약 1㎎/㎖로 희석시킨다. 40배 몰 과량의 알파-SN 펩티드를 10 mM NaPO4(pH 8.0) 20 ㎖ 중에 용해시키되, 단, 알파-SN 펩티드는 우선 10㎎을 0.5 ㎖의 DMSO에 용해시키고, 그 다음 10 mM의 NaPO4 완충액을 이용하여 20 ㎖로 희석시킨다. 펩티드 용액을 각각 활성화된 양 항-마우스 IgG 10㎖에 첨가하고, 이를 실온에서 4 시간 동안 진탕시킨다. 결과로 생성된 컨쥬게이트를 아미콘 센트리프렙 튜브를 이용하여 최종 부피 10㎖ 미만이 되도록 농축시킨 후, 이를 PBS에 대해 투석하고, 완충액을 교환하여 유리된 펩티드를 제거한다. 이 컨쥬게이트를 공극 크기 0.22㎛인 필터에 통과시켜 살균한 다음, 1㎎씩 분취하여 이후 -20℃에 동결 보관한다. 표준 곡선에 대해 말 IgG를 이용하여 BCA 단백질 검정법(Pierce Chemicals)으로 컨쥬게이트의 농도를 측정한다. 활성화된 양 항-마우스 IgG의 분자량 증가 정도에 대한 컨쥬게이트화 펩티드의 분자량 증가 정도를 측정하여 컨쥬게이트화 되었는지 여부를 확인한다.
실시예 V: 알파- 시뉴클레인에 대한 항체를 이용한 수동적 면역화
이하에 나타낸 바와 같이, 각각의 인간 알파-SN 마우스에 PBS 중 항-알파-SN 모노클로날 항체 0.5 ㎎을 주입한다. 모든 항체 제제를 정제하여 내독소 수준을 낮춘다. 알파-SN 단편 또는 이보다 긴 형태의 것을 마우스에 주입하고, 하이브리도마를 제조한 다음, 알파-SN과 중첩되지 않는 다른 단편에 결합하지 않고 알파-SN의 목적 단편에 특이적으로 결합하는 항체에 대한 하이브리도마를 스크리닝하여, 모노클로날 항체를 단편에 대하여 제조할 수 있다.
4개월에 걸쳐 필요에 따라 마우스에 복강 내 주입하여, ELISA 역가에 의해 측정되는 순환 항체 농도를 1:1000 이상(알파-SN 또는 기타 면역원에 대하여 ELISA에 의해 정의됨)으로 유지시킨다. 전술한 바와 같이 역가를 관찰하고, 6개월간 주입 후 마우스를 안락사시킨다. 조직 화학, 알파-SN 수준 및 독성학적 분석은 사후 실시한다.
실시예 VI . Syn / APP 트랜스제닉 마우스의 Aβ 면역화
본 실험에서는 3가지 유형의 트랜스제닉 마우스 즉, 알파 시뉴클레인 트랜스유전자(SYN)를 보유하는 트랜스제닉 마우스, APP 트랜스유전자를 보유하는 APP 마우스(Games외 다수) 및 단일 트랜스제닉 마우스와 교배하여 생산된 이중 트랜스제닉 SYN/APP 마우스에 대한 Aβ 면역화 효과를 비교한다. 이중 트랜스제닉 마우스에 관하여는 문헌[Masliah외 다수, PNAS USA 98:12245-12250 (2001)]에 기술되어 있다. 이 마우스는 알츠하이머병과 파킨슨병이 모두 발병된 개체의 모델이다. 표 2는 본 연구에 사용된 마우스의 상이한 그룹, 연령, 처리 방법 및 Aβ에 대한 항체의 역가를 나타내는 것이다. 3가지 유형의 마우스 모두에서 역가가 상당히 높았음을 알 수 있다. 도 5는 뇌에 존재하는 Aβ의 아밀로이드 플라크에 의해 덮인 표면적 %(처리된 개체로부터 얻은 뇌 검편을 현미경을 통해 관찰하여 측정)을 나타내는 것이다. 상당량의 침착물이 APP 및 SYN/APP 마우스에 축적되나, SYN 마우스나 비 트랜스제닉 대조구에는 축적되지 않는다. 침착물은 SYN/APP 이중 트랜스제닉 마우스 중에서 더욱 많이 축적된다. Aβ1-42로 인한 면역화는 APP 및 SYN/APP 마우스 중 침착물의 양을 감소시킨다. 도 6은 공초점 레이저 주입 및 광학 현미경으로 관찰된, 다양한 마우스 그룹에서의 시뉴클레인 침착 정도를 나타내는 것이다. 시뉴클레인 침착물은 CFA만으로 처리된 SYN 및 SYN/APP 마우스에 축적된다. 그러나, Aβ1-42 및 CFA로 처리된 동일 유형의 마우스에 있어서는 시뉴클레인 침착 수준이 상당히 감소된다. 이러한 데이터는 Aβ로 처리하면 Aβ 침착물을 제거하는 것뿐만 아니라, 시뉴클레인 침착물도 제거하는데 효과적임을 나타내는 것이다. 그러므로, Aβ 또는 이에 대한 항체로 치료하는 것은 알츠하이머병과, 알츠하이머병 및 파킨슨병의 동시 발병, 그리고 알츠하이머병은 발병하지 않은 파킨슨병 환자를 치료하는데 유용하다. SYN/APP 마우스에서의 항Aβ 항체의 역가는 시뉴클레인 봉입체 생성의 감소와 상관되어 있다(r=- 0.71, p < 0.01).
그룹 n= 나이(월령) 처리/처리 기간 항체 역가
SYN 4 12∼20 50 ㎍ 항체 주입/6개월 10,000∼58,000
SYN 2 12∼20 염수 주입/6개월 0
APP 2 12∼20 50 ㎍ 항체 주입/6개월 25,000
APP 2 12∼20 염수 주입/6개월 0
SYN/APP 4 12∼20 50 ㎍ 항체 주입/6개월 1,000∼50,000
SYN/APP 2 12∼20 염수 주입/6개월 0
실시예 VII : 아밀로이드 침착물에 대한 항체의 활성에 대한 세포 외 스크리닝 검정법
플라크 제거에 대한 항체의 효과를 관찰하기 위하여, 1차 미세 아교 세포를, PDAPP 마우스 또는 인간 AD 뇌의 고정하지 않은 저온 유지 검편과 함께 배양하여 세포 외 검정법을 수행하였다. 미세 아교 세포를 신생 DBA/2N 마우스(생후 1∼3일)의 대뇌 피질로부터 얻었다. 상기 대뇌 피질을 50 ㎍/㎖의 DNaseI(Sigma)으로 HBSS-(Hanks' Balanced Salt Solution, Sigma) 중에서 기계적으로 분해하였다. 분해된 세포를 100㎛의 세포 거르기(Falcon)으로 여과하고, 1000 rpm에서 5 분 동안 원심 분리하였다. 펠렛을 생장 배지(고 농도 글루코즈 DMEM, 10% FBS, 25ng/㎖ rmGM-CSF) 중에 재현탁하고, 세포를 T-75 플라스틱 배양 플라스크당 2개 뇌 해당분의 밀도로 도말하였다. 7∼9일 경과후, 이 플라스크를 궤도 진탕기(orbital shaker)상에서 200 rpm으로 2 시간 동안 37℃에서 회전시켰다. 세포 현탁액을 1000 rpm에서 원심 분리하고 검정 배지 중에 재현탁하였다.
PDAPP 마우스 또는 인간 AD 뇌(사후 3 시간 미만)의 10㎛ 두께의 저온 유지 검편을 해동시켜 폴리-리신 코팅된 둥근 모양의 유리 커버 슬립(coverslip) 위에 놓고 이를 24-웰 조직 배양 평판의 웰 안에 넣었다. 이 커버 슬립을 H-SFM(무 하이브리도마-혈청 배지, Gibco BRL)과 1% FBS, 글루타민, 페니실린/스트렙토마이신, 및 5 ng/㎖의 rmGM-CSF(R&D)로 이루어진 검정용 배지로 2회 세척하였다. 대조구 또는 항-Aβ 항체를 2× 농도(최종 5㎍/㎖)가 되도록 1 시간 동안 첨가하였다. 이후, 미세 아교 세포를 0.8 ×106 세포/㎖의 밀도로 검정용 배지에 접종하였다. 이 배양액을 가습 항온 처리기(37℃, 5% CO2)에 24 시간 이상 동안 넣어 두었다. 항온 처리 마지막 단계에, 배양액을 4% 파라포름알데히드로 고정하고, 0.1% Triton-XlOO으로 투과시켰다. 이 검편을 바이오틴화된 3D6 → 스트렙타비딘/Cy3 컨쥬게이트(Jackson ImmunoResearch)로 염색하였다. 외인성 미세 아교 세포를 핵 염색(DAPI)하여 시각화하였다. 배양액을 역상 형광 현미경(Nikon, TE300)으로 관찰하고, SPOT 디지털 카메라[SPOT 소프트웨어 사용(Diagnostic instruments)]로 현미경 사진을 찍었다. 웨스턴 블럿 분석을 위해, 이 배양액을 8M 우레아로 추출하고, 환원 트리신 시료 완충액 중에 1:1로 희석하여 이를 16% 트리신 겔(Novex) 상에 로딩하였다. 이모빌론(immobilon)에 옮긴 후, 블럿을 5㎍/㎖의 pabAβ42 → HRP-컨쥬게이트화 항-마우스 항체에 노출시킨 다음, ECL(Amersham)로 현상하였다.
NAC에 대한 항체의 존재 하에 PDAPP 뇌 검편으로 검정법을 수행할 때, 플라크의 수와 크기가 눈에 띄게 감소하였는데, 이는 곧 항체의 제거 활성이 나타났음을 의미하는 것이다. 전술한 바와 같이, NAC에 대한 항체를 아밀로이드 플라크와 미세 아교 세포를 함유하는 뇌 조직 시료와 접촉시켰다. 토끼 혈청을 대조구로 사용하였다.
Aβ에 대한 몇몇 항체의 존재 하에 PDAPP 뇌 검편을 사용하여 동일한 검정법을 수행하였다. 수동 수송 연구에서, 항체가 세포 외 검정법에서 식세포 작용을 유도하는 능력과 생체 내 플라크 양을 감소시키는 능력을 비교하였다. 그 결과, 생체 내 효능은 CNS 내에 생성되는 플라크가 항체를 매개로 하여 제거되고, 세포 외 검정법은 생체 내 효능을 예측하는 수단임을 알 수 있다(WO 00/72880 중 실시예 XIV의 표 16 및 17; 및 WO 0072876 중 실시예 XIV의 표 16 참조(상기 문헌은 모두 모든 목적을 위하여 참고용으로 인용됨)].
실시예 VIII : 알파- 시뉴클레인으로 인한 능동적 면역화
A. 재료 및 방법
hα- 시뉴클레인 tg 마우스의 백신화
본 연구를 위하여, 혈소판-유래 생장 인자-β(PDGFβ) 프로모터[Maliah, 2000, Science 287:1265-69]의 조절하에 hα-시뉴클레인을 발현하는 이종 접합 tg 마우스(라인 D)를 사용하였다. 이 마우스에서는 LBD의 임의의 측면과 유사한 운동 손상, 신경 퇴행을 나타내고, 두개 내 hα-시뉴클레인 면역 반응성 봉입체가 생성되기 때문에 실험 동물로서 선택하였다. 실험 동물을 2개의 그룹으로 나누었다. 첫 번째 그룹에서는, 총 20마리의 어린(3 월령) tg 마우스를 8개월 동안 재조합 hα-시뉴클레인(n=10) 또는 애쥬반트 만으로(n=10) 면역화하였다. 두 번째 그룹에서는, 총 20 마리의 젊은 성체(6 월령) tg 마우스를 8개월 동안 재조합 hα-시뉴클레인(n=10) 또는 애쥬반트 만으로(n=10) 면역화하였다. 면역화 과정은 맨 처음, 재조합 hα-시뉴클레인(80㎍/㎖; 100㎕)과 완전 프룬트 애쥬반트(CFA)를 주입하는 것으로 시작된다. 2주 경과 후, 마우스에 또 hα-시뉴클레인(80㎍/㎖; 100㎕)와 불완전 FA를 주입한 다음, 다시 한 달에 한 번씩 7개월 동안 인산염-완충 염수 중 hα-시뉴클레인(80㎍/㎖; lO0㎕)을 재주입하였다. 문헌[Masliah외 다수, 2005, Neuron 46:857-68]에 기술된 바에 따라서, 재조합 hα-시뉴클레인을 제조 및 정제한 후, 내독소에 대해 시험하였다.
hα- 시뉴클레인에 대한 항체 역가 및 상대적 친화도의 측정
웰 당 0.4 ㎍의 정제된 전장 α-시뉴클레인으로 코팅된 96-웰 미세 역가 평판을 이용하여 혈장 중 hα-시뉴클레인 항체 수준을 측정하였다. 이 시료를 4℃에서 밤새도록 항온 처리한 후, 염소 항-마우스 IgG 알칼리성 포스파타아제 컨쥬게이트화 항체(1:7500, Promega, Madison, WI)로 세척 및 항온 처리하였다. 이 평판을 여기 파장 450㎚ 및 방사 파장 550㎚에서 판독하였다. 결과를 반로그 그래프(semi-log graph)[세로축 = 상대적 형광 단위 ; 가로축 = 혈청 희석률]상에 나타내었다. 항체 역가는 항체의 최대 결합 양의 50%가 감소한 수치에서의 희석률로서 정의된다.
백신화된 마우스에 생성된 항체에 의하여 hα-시뉴클레인에 대한 상대적 친화도를 측정하기 위하여, 2개의 실험 세트를 수행하였다. 첫 번째 세트에서, 비-면역화 hα-시뉴클레인 tg 마우스로부터 얻은 뇌 균질물을 여러 개의 통로가 존재하는 장치인 미니 겔(Invitrogen, Carlsbad, CA) 상에 전개시켰다. 각 통로를 각각의 마우스에서 유래된 희석 혈청으로 항온 처리하고, 이를 니트로셀룰로즈 상에 블럿화시킨 다음, 2차 토끼 항-마우스 항체 → I125 태깅 단백질 A와 함께 항온 처리하였다(Alford외 다수, J. Histochem. Cytochem 42:283-287 (1994)). 인광 이미지 형성기(PhosphoroImager)(Molecular Dynamics, Piscataway, NJ)를 이용하여 블럿을 이미지화시키고 분석하였다. 이미지퀀트 소프트웨어(ImageQuant software; Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)를 이용하여 면역 반응성 밴드를 정량화하였다. 두 번째 실험 세트에서, 비-면역화 hα-시뉴클레인 tg 마우스로부터 유래된 일련의 진동 절단 검편을, 처리된 마우스 각각에서 얻은 희석 혈청 → 바이오틴화된 말 항-마우스 IgG(1:100, Vector) → 아비딘 D-호오스래디쉬 퍼옥시다제(HRP, 1:200, ABC Elite, Vector) 중에서 항온 처리한 다음, 0.001% H2O2 함유 디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드(DAB)와 반응시켰다. 현미경으로 관찰한 후, 표지화된 세포 구획(뉴런 세포체, 시냅스 및 봉입체)과 면역 반응성의 정도(0= 무반응; 1= 매우 경미함, 2= 경미함, 3= 중간, 4= 강)에 따라서 검편에 점수를 메겼다.
hα- 시뉴클레인 항체의 에피토프 맵핑
전체 hα-시뉴클레인 서열을 덮고있는 중첩 선형 펩티드에 대한 항체의 결합 여부를 측정하는 ELISA에 의하여 hα-시뉴클레인 항체로 인지된 에피토프를 측정하였다. hα-시뉴클레인 서열로 C-말단이 바이오틴화된 펩티드(Mimotopes, San Diego, CA)[즉, 펩티드 당 12개의 잔기가 중첩되고 그 뒤로 3개의 잔기가 따르는 15개 아미노산(aa) 길이의 펩티드]를 제조하였다. 총 43개의 펩티드를 사용하여, 13 aa가 중첩되고 그 뒤로 2 aa가 따르는, 마지막 펩티드를 보유하는 hα-시뉴클레인의 전체 140개 아미노산으로 된 서열에 대해 워킹(walking)을 실시하였다. 뿐만 아니라, 마지막 3개의 펩티드에 대해서는 반복 수행하되, 단 이 펩티드는 N-말단을 바이오틴화시켰다. 이로써 항체에 의하여 펩티드의 C-말단으로의 접근성을 개선시켰으며, 그 결과 유리 C-말단 특이 항체를 확인할 수 있었다. 뿐만 아니라, 본 검정법에 기타 특징도 가하여, 항체와 hα-시뉴클레인의 비 아밀로이드 β(Aβ) 성분(NAC) 영역(61-95) 사이의 상호 작용을 보다 철처하게 관찰할 수 있었다. 본 검정법에서 21번째 펩티드는 NAC 영역의 유리 N-말단을 이미 포함하고 있기 때문에, NAC 영역의 유리 C-말단을 함유하는 하나의 부가 N-말단 바이오틴화 펩티드를 첨가하여 총 47개의 펩티드를 이용하는 검정법을 종결하였다.
본 검정법을 진행하기 위하여, 스트렙타비딘(Pierce, Rockford, IL)으로 예비 코팅된 ELISA 평판 상에 상기와 같은 바이오틴화 펩티드를 밤새도록 5 nM의 농도로 코팅시켰다. 이후, 이 평판을 세척한 다음, 역가 6으로 희석시킨 혈청 시료를 첨가하여 1 시간 동안 항온 처리하였다. 본 항온 처리를 위해 역가가 5,000 이하인 혈청 시료를 1:1000으로 희석시켰다. 다시 세척한 후, 비색계 ELISA 포맷에서 HRP에 컨쥬게이트화된 종-특이적 2차 항체를 이용하여, 결합되어 있는 항체를 확인하였다.
조직 처리:
마우스를 안락사시키고, 뇌를 꺼내어 이하에 기술된 바와 같이 신경 화학적 및 신경 병리학적 분석을 실시하였다. 간단히 말해서, 우측 뇌 반구를 동결시키고, 응집 및 응집되지 않은 hα-시뉴클레인의 면역 반응성을 웨스턴 블럿에 의해 측정하였다[Masliah외 다수, 2000(상동)]. 좌측 뇌 반구는 4% 파라포름알데히드(PFA) 중에 고정시키고, 면역 세포 화학적 분석(ICC) 및 초미세 구조 분석을 위해 진동 절단기(Leica, Wetzlar, Germany)를 사용하여 연속적으로 절편화하였다.
시냅토좀 제조 및 면역 블럿 분석:
tg 마우스 뇌에서 α-시뉴클레인 축적에 대한 백신화의 효과를 확인하기 위하여, 수크로즈 구배를 주어 시냅토좀 분획을 준비하여, 이를 10% 트리스-아세테이트 폴리아크릴아미드 겔(NuPAGE™, Invitrogen) 상에서 SDS-PAGE로 분석하였다. 면역 블럿을 hα-시뉴클레인에 대한 1차 항체(LB509, 1:1000, Transduction Laboratories, San Diego, CA) 및 시냅토파이신(1:20, Chemicon, Temecula, CA), 그리고 HRP로 태깅된 2차 염소 항-마우스 IgG(1:5000, SantaCruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)로 프로빙하고, 강화된 화학 발광법으로 시각화한 다음에, 베르사독 XL(Versadoc XL) 이미지화 장치(BioRad, Hercules, CA)로 분석하였다.
신경 병리학적 및 면역 세포 화학적 분석법
요약하면, 전술한 바와 같이(Masliah외 다수, 2000(상동)) hα-시뉴클레인 축적에 백신화가 미치는 영향을 관찰하기 위해, 연속적으로 절편화된, 자유 부유성인(free-floating) 블라인드-암호화(blind-coded) 진동 절단 검편을 4℃에서 친화도 정제된 항-hα-시뉴클레인 특이 항체(72-10, 토끼, 폴리클로날 항체, 1:500)[101∼124개의 아미노산으로 이루어진 합성 hα-시뉴클레인 펩티드로 토끼를 면역화시켜 전술한 바와 같이 제조(Masliah외 다수, 2000, 상동)]와 함께 밤새도록 항온 처리하였다. 1차 항체 → 바이오틴화된 염소 항-토끼 IgG (1:100, Vector) → 아비딘 D-HRP(1:200, ABC Elite, Vector)로 항온 처리한 후, 0.001% H2O2 함유 DAB 테트라하이드로클로라이드와 반응시켰다. 검편을 퀀터멧 570C (Leica)로 분석하여, 신피질 내 hα-시뉴클레인 면역 반응성 봉입체의 수를 측정하였다. 각각의 경우에 있어서, 3개의 검편을 분석하고, 그 결과를 평균 내어 1㎟ 당 갯 수로 나타내었다. 검편을 아교 마커 예를 들어, CD45(1:1000, DakoCytomation, Carpinteria, CA)와 아교 섬유상 산성 단백질(GFAP, 1:500, Chemicon)에 대한 항체와 면역 반응시켜 추가의 면역 세포 화학적 분석을 수행하였다.
전술한 바와 같이(Hashimoto외 다수,, Neuron 32:213-223 (2001)) 이중-면역 세포 화학적 분석법을 수행하여, 신경 말단부의 밀도와 시냅스 내 hα-시뉴클레인 축적에 백신화가 미치는 영향을 측정하였다. 이러한 목적으로, 진동 절단 검편을 hα-시뉴클레인에 대한 폴리클로날 항체(1:1000)와, 시냅토파이신(Chemicon)에 대한 모노클로날 항체로 이중-표지화하였다. 플루오세인 이소티오시아네이트(FITC)로 태깅된 말 항-마우스 IgG와 함께 시냅토파이신 및 티라미드 레드(Tyramide Red)(1:2000, Roche)를 사용하여 hα-시뉴클레인을 검출하였다. 각각의 경우에 있어서, 2개의 검편을 면역 표지화하여, 레이저 주사 공초점 현미경(LSCM)과 NIH Image 1.43 소포트웨어로 분석함으로써, hα-시뉴클레인이 존재하는 시냅토파이신-면역 반응성 말단부의 비율과, 신피질 내 시냅토파이신-면역 반응성 말단부로 덮여있는 신경모의 표면적 %(Mucke외 다수, J. Neurosci 20:4050-4058 (2000))을 계산하였다. 1차 항체의 특이성을 확인하기 위하여, 1차 항체의 부재 하에(결실), 48 시간 동안 20배 과량의 대응 펩티드로 예비 흡착시킨 1차 항체, 또는 예비 면역 혈청으로 검편을 밤새도록 항원 처리함으로써 대조 실험을 수행하였다.
모든 검편을 동일한 조건 하에서 동시에 처리하고, 실험은 2회씩 수행하여 결과가 재현될 수 있는지 여부를 평가하였다. 검편을 MRC1024 LSCM 시스템[BioRad, Wattford, UK]이 장착된 액시오버트 35(Axiovert 35) 현미경(Zeiss, Germany) 상에서 자이스 63X(Zeiss 63X)(N.A. 1.4)로 이미지화하였다[Masliah외 다수, 2000(상동)].
통계학적 분석:
2-말단 비대칭 스튜던트 t-테스트(two-tailed unpaired Student's t-test)를 이용하여 그룹들간을 통계학적으로 비교하였다. 선형 회귀 분석을 수행하여 변수 간 관계를 파악하였다. 본페로니 보정(Bonferroni correction)을 적용하여 다수의 비교 결과를 분석하였다.
B. 결과
항체 역가 , 친화도 및 에피토프 맵핑의 특성 규명
3 회의 시점에서(백신화 이후 2주 경과시, 6개월 경과시 및 9개월 경과시) 2개의 실험 군에 대해 항체의 역가를 분석하였다. 항체 역가는 마우스에 따라서 상당히 달랐는데, 그룹 I에 속하는 동물에서는, hα-시뉴클레인으로 면역화된 마우스 간 항체 역가가 200∼20,000이었다(표 3).
α-시뉴클레인 역가 및 면역 블럿 친화도에 관한 요약(역가에 대해 보정)
그룹 미니 블럿에
의한
항체 친화도		 시냅스에
대한
항체 친화도		 봉입체에
대한
항체 친화도		 항체 역가
(1차 채혈)		 항체 역가
(2차 채혈)		 항체 역가
(3차 채혈)
그룹I/
α- syn 		109147 ±
2700		 1.9 ± 0.73 1.2 ± 0.4 2332 ±
500		 2772 ±
1176		 3644 ±
2365
그룹I/
CFA 		113 ± 113 0.4 ± 0.1 0 19 ± 6.7 30 ± 12 7 ± 4
그룹 II /
α- syn 		235747 ±
74000		 4.1 ± 0.9 2.8 ± 1.0 3813 ±
1200		 2926 ±
976		 1468 ±
641
그룹 II /
CFA 		400 ± 358 0.3 ± 0.2 0.1 ± 0.1 23 ± 9 21 ± 14 0.6 ± 0.6
상기 그룹에서 평균 역가는 시간이 경과함에 따라서 약간 증가하였다. 이와 유사하게, 그룹 II에 있어서, hα-시뉴클레인으로 면역화된 동물의 경우 역가는 200∼13,000이었다(표 3). 그러나, 평균 역가 수준은 처음 측정시 보다 높았고, 그 다음 시간이 경과함에 따라서 감소하였다. 면역 블럿 분석 결과는 또한 마우스마다 hα-시뉴클레인을 인지하는 능력에 차이가 상당히 차이가 있었다. 전반적으로, 친화도에 대한 항체의 수준은 그룹 I의 면역화 마우스에 비하여 그룹 II의 마우스가 더 높았다(표 4).
면역 블럿 친화도, 신경 병리학 및 역가 사이의 상관 관계 요약
신경병리학적
마커		 미니블럿에 의한
항체 친화도		 시냅스에
대한
항체 친화도		 봉입체에
대한
항체 친화도
 뉴런에 대한
항체 친화도		 항체 역가
(1차 채혈)
α-syn (+)
봉입체의 수		 -0.11 0.04 0.12 -0.21 0.1
신경모
α-syn (+)
시냅스의
표면적 %		 -0.46
(p = 0.003)		 -0.41
(p = 0.009)		 -0.43
(p = 0.005)		 0.06 -0.47
(p = 0.007)
신경모
시냅토파이신
(+) 시냅스의
표면적 %		 0.06 0.35
(p = 0.04)		 0.01 0.04 0.12
미니블럿에
의한
항체 친화도		 - 0.74
(p = 0.0001)		 0.70
(p = 0.0001)		 -0.16 0.85
(p = 0.0001)
항체 역가
(1차 채혈)		 0.85
(p= 0.0001)		 0.62
(p = 0.0001)		 -0.18 0.81
(p = 0.0001)		 -
ICC에 의하여, hα-시뉴클레인으로 백신화된 마우스로부터 얻은 혈청에서 뉴런의 표지화, 뉴런내 봉입체 형성 및 전시냅스 말단부를 확인할 수 있었다. 이와는 반대로, 애쥬반트만으로 처리된 마우스는 세포체가 흩어져 비 특이적으로 경미하게 염색되었다. 그룹 II에 속하는 마우스로부터 얻은 혈청은 그룹 I로부터 얻은 면역화 마우스에 비하여 tg 마우스의 시냅스 및 뉴런 내 hα-시뉴클레인을 인지하는 친화도가 보다 높았다(표 4).
에피토프 맵핑 연구 결과, hα-시뉴클레인으로 백신화된 마우스에 있어서, 항체는 hα-시뉴클레인의 C-말단 영역 내 펩티드 에피토프를 가장 많이 인지하였음을 알 수 있었다(도 8). 뿐만 아니라, 부가의 에피토프에 대한 항체는 또한 드물게 인지하었다. 이와는 반대로, CFA 만으로 처리된 마우스의 혈청에서는 반응성 또는 항체 에피토프를 확인할 수 없었다.
면역화는 tg 마우스 뇌 내 hα- 시뉴클레인 축적을 감소시키고 시냅스 밀도를 보존한다.
hα-시뉴클레인 축적에 대한 면역요법의 효능을 측정하기 위하여, 검편을 hα-시뉴클레인에 대한 항체로 표지화하고, 이를 명시야 현미경 또는 LSCM으로 분석하였다. tg 마우스에 있어서, 신경모 및 뉴런 내 봉입체에서 hα-시뉴클레인 면역 반응성이 강한 것으로 관찰되었다. CFA만으로 처리된 tg 마우스에 비하여, 2개의 면역화된 그룹의 마우스는 측두엽에 형성되는 봉입체의 수가 상당히 감소(약 25%)하였음을 알 수 있었다(도 9A). 뿐만 아니라, 면역화 결과, 신경모 내 hα-시뉴클레인의 면역 반응성은 감소하였다. CFA만으로 처리된 tg 마우스와 비교하였을 때, 이러한 효과는 그룹 I에 속하는 마우스보다 그룹 II에 속하는 마우스가 더 크게 나타났다(도 9A). 항체가 뉴런의 hα-시뉴클레인 축적을 감소시키는 능력 또는 이러한 효과를 차단하는 능력과 면역화 효과가 실제로 관련이 있는지 여부를 측정하기 위하여, CFA 만으로 백신화된 tg 마우스와 hα-시뉴클레인으로 백신화된 tg 마우스의 β' 시뉴클레인 면역 반응성 수준을 비교하여 대조구 실험을 수행하였다. α-시뉴클레인과 가까운 상동체인 β' 시뉴클레인(Iwai외 다수, Neuron 14:467-475 (1994))의 공지된 분포와 마찬가지로, 전시냅스 말단부에 결합된 신경모 내 β-시뉴클레인의 면역 반응성은 매우 컸으며, 뉴런 세포체에서는 미약하게 면역 표지화되었으나 봉입체에는 그렇지 않았다. CFA 만으로 처리된 tg 마우스에 비하여, hα-시뉴클레인으로 면역화된 마우스에서는 β-시뉴클레인의 패턴 및 수준에 차이가 없었다. hα-시뉴클레인 항체의 효과에 대한 특이성을 더 관찰하기 위하여, CFA만으로 백신화된 tg 마우스와 hα-시뉴클레인으로 백신화된 마우스에서의 쥐(m) α'-시뉴클레인 면역 반응성의 수준을 상호 비교하였다. hα'-시뉴클레인과 유사하게, mα'-시뉴클레인의 면역 반응성은 신경 말단부에 결합되어 있는 신경모에서 강하게 나타났으나, 뉴런 세포체 및 봉입체에서는 나타나지 않았다. CFA 및 hα-시뉴클레인으로 면역화된 마우스 둘 다에서, mα'-시뉴클레인의 패턴과 수준을 비교하였다. 모든 사실을 종합하였을 때, 이러한 연구를 통하여, 백신화는 hα-시뉴클레인에 특이적으로 영향을 미치지만, 다른 관련 시냅스 분자들에는 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다.
신경모의 완전성에 대한 면역 요법의 효과를 더 자세히 확인하기 위하여, 검편을 시냅토파이신에 대한 항체로 면역 염색하거나, 또는 전자 현미경으로 관찰하였다. 비-트랜스제닉(nontg) 마우스에 비하여, CFA만으로 처리된 tg 마우스는 시냅토파이신 면역 표지화 말단부의 수가 평균 20% 감소하였으며, 시냅스 당 시냅토파이신 면역 반응성의 수준은 변함이 없었다(도 9B). 이와는 반대로, 두 그룹에 속하는 면역화된 마우스의 시냅토파이신 면역 반응성 수준은 non tg 대조구와 거의 비슷하였다(도 9B). 아교 세포 마커 예를 들어, GFAP 및 CD45에 대한 항체를 이용하여 추가의 면역 세포 화학적 분석법을 수행한 결과, hα-시뉴클레인으로 백신화된 tg 마우스의 뇌에 있어서의 면역 반응성은 증가하는 경향을 보였다(도 9C). 이러한 관찰 결과와 마찬가지로, 초미세 구조 분석 결과, hα-시뉴클레인으로 면역화된 tg 마우스의 뇌에 있어서, 신경모는 잘 보존되었으며, 원상태의 전시냅스 말단부와 수지 돌기 그리고 신경 말단부는 투명한 낭포를 함유하고 있었으며, 후시냅스를 밀집시켰다. 전자 고밀도 응집체만이 때때로 신경 돌기를 형성하는 것으로 확인되었으며, 전체적으로 미토콘드리아와 미엘린은 잘 보존되었다.
시냅스에 있어서 hα-시뉴클레인 응집체에 백신화가 미치는 영향을 보다 명확하게 특성 규명하기 위하여, 시냅토좀 제제를 이용한 웨스턴 블럿 분석법 및 이중 면역 세포 화학 분석법을 수행하였다. 생리적 조건 하에서, hα-시뉴클레인은 주로 전시냅스 보턴(presynaptic boutons)에 위치하였으며(Iwai외 다수, 1994, 상동), LBD 및 tg 마우스에 있어서는, 시냅스 내 hα-시뉴클레인의 축적량이 증가하였는데, 이는 기능상 장애와 시냅스 소실과 관련이 있다(Hashimoto외 다수, 2001, 상동). 신경 말단부에 있어서 hα-시뉴클레인의 축적에 백신화가 미치는 영향을 확인하기 위하여, 전시냅스 말단 마커 시냅토파이신 및 hα-시뉴클레인에 대한 항체를 이용한 이중 면역 표지화 연구와, 시냅토좀 제제를 이용한 WB 분석법을 수행하였다. 이중 표지화된 검편의 공초점 이미지화 결과, CFA만으로 백신화된 hα-시뉴클레인 tg 마우스(도 9D)에 비하여, hα-시뉴클레인을 주입한 마우스가 신피질 내 시냅토파이신-면역 반응성 신경 말단부에 hα-시뉴클레인이 덜 축적되었음을 알 수 있었다(도 9D).
면역 세포 화학적 연구와 마찬가지로, 면역 블럿 분석법을 통하여, CFA만으로 처리된 tg 마우스에서는 고 분자량의 밴드가 다량 존재하였음을 알 수 있었는데, 이는 아마도 시냅스 내에 hα-시뉴클레인 면역 반응성 봉입체가 축적되었음을 반영하는 것일 수 있다(도 10). 면역화된 마우스에서, hα-시뉴클레인의 고 분자량 밴드와 천연 상태에서 형성되는 밴드는 거의 축적되지 않았으나, mα-시뉴클레인의 수준에는 어떠한 영향도 미치지 않았음이 관찰되었다. 뿐만 아니라, CFA만으로 처리된 tg 마우스에 비하여, 시냅토파이신 면역 반응성의 수준은 면역화된 마우스의 시냅토좀 제제의 면역 반응성 수준보다 더 높았다(도 10). 모든 사실을 종합하였을 때, 이러한 결과는 곧, 면역 요법이 잠재적으로 독성인 hα-시뉴클레인 올리고머가 시냅스 내에 축적되는 것을 감소시킴으로써 tg 마우스의 뇌에 일어나는 신경 손상을 완화할 수 있음을 시사하는 것이다.
면역화의 효과는 시냅스 말단부를 인지하는 항체의 상대적 친화도에 의존적이다
어느 인자가 면역 요법의 효능을 예측하는지 보다 자세히 이해하기 위하여, 신경 병리학적 마커인 hα-시뉴클레인 축적 및 항체 역가 그리고 친화도에 대하여 선형 회귀 분석법을 수행하였다. 분석 결과, 면역 블럿에 의한 상대작 항체 친화도와 시냅스 내 hα-시뉴클레인 면역 반응성의 수준은 상당한 상관성을 갖지만, 뉴런 봉입체의 수와는 상관성이 없음을 알 수 있었다. 이와 유사하게, ICC에 의하여 시냅스를 인지하는 항체의 상대적 친화도는 시냅스 내 hα-시뉴클레인의 수준와는 역의 상관 관계에 있으며, 시냅토파이신-표지화 신경 말단부가 차지하는 표면적 %과 직접적으로 상관 관계에 있지만, 뉴런 봉입체의 수와는 상관 관계가 없음을 알 수 있었다. 면역 블럿 및 ICC에 의하여 측정된 항체 반응성 수준은 ELISA로 측정된 항체 역가와 강한 상관 관계에 있었다. 항체 역가는 또한 항-hα-시뉴클레인 항체로 표지화된 신경모의 표면적 %와 상관 관계에 있으나, 뉴런 내 봉입체 수와는 상관 관계가 없었다(표 4). 이러한 사실들을 종합하였을 때, 상기 결과를 통하여, 항-인간 α-시뉴클레인 항체의 상대적 면역 블럿 반응성과 어느 정도의 항체 ELISA 역가는 뉴런 인간 α-시뉴클레인 축적량의 감소와 상관 관계에 있음을 알 수 있다.
항-인간 α- 시뉴클레인 항체는 흡수되어 tg 마우스 내 시냅스 및 봉입체-함유 뉴런에 결합한다.
수송된 항체가 특징적인 뉴런 위치 즉, tg 마우스의 뇌에 인간 α-시뉴클레인이 축적되는 위치를 인지하는지 여부를 측정하기 위하여, 말 항-마우스 IgG 항체를 사용하여 단일 및 이중 면역 세포 화학적 분석법을 수행하였다. 이 항체는 면역화된 동물 중에 생성되는 항-인간 α-시뉴클레인을 인지하는 것으로 추정되지만, CFA 대조구 중에 생성되는 항-인간 α-시뉴클레인은 인지하지 않을 것으로 생각된다. 면역 표지화된 검편을 명시야 디지탈 현미경으로 관찰한 결과, hα-시뉴클레인으로 면역화된 마우스에 있어서는 바이오틴화된 항-마우스 IgG가 신경모 내 뉴런 세포체와 신경 돌기를 흩어져서 표지화하였음을 알 수 있었다. CFA만으로 처리된 tg 동물의 경우는 혈관을 미약하게 표지화하였으며, 때때로 미세 아교 세포를 닮은 세포도 표지화하였다. 이중 면역 염색 실험 결과, 백신화된 마우스에 있어서, 항-마우스 IgG로 태깅된 FITC로 표지화된 뉴런 세포체는 hα-시뉴클레인 면역 반응성을 나타내었음을 확인할 수 있었다. CFA만으로 처리된 tg 마우스에 비하여, hα-시뉴클레인으로 백신화된 마우스의 몇몇 뉴런에 있어서, 항-마우스 IgG 및 hα-시뉴클레인 면역 반응성은 세포체의 주변에서 공동으로 나타났으며, 다른 지역에 있어서는 신경 돌기 및 시냅스에서 2개의 표지가 관찰되었다. 뿐만 아니라, 몇몇 인간 α-시뉴클레인 함유 뉴런에 있어서는 세포 이하의 구상 구조물(평균 직경 = 0.4∼0.8㎛) 내에 2개의 마커가 관찰되었다. 추가의 이중 표지화 실험 결과, 이러한 구상 구조물은 카텝신 D 면역 반응성을 나타내었는데, 이는 곧 내부에 흡수된 항-인간 α-시뉴클레인 항체가 리소좀 내 시뉴클레인과 반응함을 시사하는 것이다. 이러한 관찰 결과와 마찬가지로, 초미세 구조 분석 결과, 인간 α-시뉴클레인으로 백신화된 마우스 뉴런 중 일부에 있어서, 리소좀과 탐식 리소좀이 존재한다는 증거인 전자 고밀도 적층형 구조물이 확인되었다. 이러한 사실들을 종합하였을 때, 상기 결과들을 통하여, 인간 α-시뉴클레인으로 백신화되면 리소좀 경로를 활성화하여 상기 분자의 분해를 촉진할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 IX . α- 시뉴클레인 항체를 투여함으로 인한 생체 내 α- 시뉴클레인 응집체의 제거
본 실시예는 뉴런 내 α-시뉴클레인 응집체를 이 α-시뉴클레인의 말단부를 인지하는 모노클로날 항-α-시뉴클레인 항체로 제거하는 것에 관하여 기술하고 있다. 모노클로날 항체를 인간 α-시뉴클레인을 과발현하고 뉴런 내에 α-시뉴클레인 응집체가 생성된 트랜스제닉 마우스의 신피질에 주입하였다. 2개의 항체 즉, α-시뉴클레인의 N-말단에 대하여 유도된 항체와, α-시뉴클레인의 C-말단에 대하여 유도된 항체는 무관한 대조구 항체에 비하여 뉴런 내 α-시뉴클레인 응집체 수를 80% 이하까지 감소시켰다(도 11).
방법:
α-시뉴클레인 분자의 상이한 에피토프를 인지하는 모노클로날 항체와, 무관한 이소타입-매칭 대조구 항체를, 마우스 주입용으로서, 멸균 인산염-완충-염수 용액 중에 용해시켰다(표 5). 사용된 동물은 PDGF 프로모터의 전사 조절 하에 뇌에서 인간 야생형 α-시뉴클레인을 과발현하는 4∼8 월령된 이형 접합 트랜스제닉 마우스였다. 각각의 항체에 대하여는 4∼6개의 상이한 트랜스제닉 마우스를 사용하였다.
뉴런 시뉴클레인 병증의 트랜스제닉 모델 중 두개 내 주입에 사용되는
α-시뉴클레인 항체 및 대조구
모노클로날 항체 에피토프/특이성 이소타입
11A5 α-시뉴클레인 포스포SER129 IgG1
8A5 α-시뉴클레인 C-말단 IgG1
9G5 α-시뉴클레인 91-96 IgG1
23E8 α-시뉴클레인 40-55 IgG1
6H7 α-시뉴클레인 N-말단 IgG1
4B1 α-시뉴클레인 C-말단 IgG2a
5C12 α-시뉴클레인 109-120 IgG2b
27-1 대조구 IgG1
TY11-15 대조구 IgG2a
5B7 대조구 IgG2b
각각의 마우스를 마취시키고, 이 마우스에 2㎎/㎖ 항체 2㎕를 정위적으로 우뇌 반구의 두정엽 신피질의 심층에 주입하였다(동 측면). 좌뇌 반구(반대 측)은 각 마우스에 대한 기준 대조구로서 사용되었다. 주입 위치를 봉합하고 마우스가 마취에서 깨어날 때까지 관찰하였다. 주입한 관찰자에게는 각각의 시기에 어느 항체를 주입하였는지를 가르쳐 주지 않았다. 주입 후 2주 경과시, 연구 기관의 지침에 따라서 마우스를 안락사시켰다. 마우스 뇌를 꺼내어 4% 파라포름알데히드 중에서 48 시간 동안 고정하고, 라이카 진동 절단기를 사용하여 상기 뇌를 40㎛ 두께로 잘라냈다. 동물 1마리당 (주입 위치 주변의) 검편 2개를 폴리클로날 α-시뉴클레인 항체(예를 들어, ELADW-47, 115∼122번 α-시뉴클레인 아미노산 인지)를 사용하는 면역 퍼옥시다제 염색으로 염색하였다. 각각의 검편에 대해서, 뉴런 내 α-시뉴클레인 응집체는 동 측 반구에 존재하는 주입 위치 주변으로 4 현미경장(microscopic field)(배율 = 20배)를 차지하는 것으로 측정되었으며, 반대 측 대조구 반구에서도 4 현미경장을 차지하였다. 2개 검편에 해당하는 α-시뉴클레인 응집체 수를 각 뇌 반구에 대하여 합하였다. 마지막으로, 각 동물에 있어서, 2개의 반구에서 계수한 총 α-시뉴클레인 응집체 갯 수의 차를 계산하고, 이를 반대 측 및 동 측 반구 사이의 % 차로서 나타내었으며, 이로써 각각의 마우스 개체에 대한 응집체의 제거에 미치는 α-시뉴클레인 항체의 효과를 측정하였다. 검편을 블라인드-암호화하고, 분석이 종결되었을 때 그 암호를 해독하였다.
마우스를 주입된 항체에 따라서 다음과 같이 3개의 그룹으로 분류할 수 있다:
그룹 1: 11A5, 8A5 또는 IgG1 대조구가 주입된 마우스.
그룹 2: 9G5, 23E8, 6H7, 또는 IgG1 대조구가 주입된 마우스.
그룹 3: 4B1, 5C12, IgG2a 또는 IgG2b 대조구가 주입된 마우스
결과:
본 연구의 결과를 도 11 및 도 12에 나타내었다. 뉴런 내 α-시뉴클레인 응집체는 2개의 모노클로날 항체 즉, 8A5(JH4.8A5라고도 칭함) 및 6H7(JH17.6H7라고도 칭함)에 의하여 제거되었으며, 상기 두 항체는 PCT 특허 공보 WO 05047860A2 ("Antibodies to Alpha-Synuclein" 2005년 5월 26일 출원)와 공동 계류 특허 출원 제10/984192호에 개시되어 있다[상기 문헌들은 참고용으로 인용됨]. MAb 6H7을 대장균에서 발현된 재조합 인간 α-시뉴클레인에 대해 생성시켰는데, 이는 인간 및 마우스 α-시뉴클레인의 아미노 말단을 인지한다. 이 항체는 α-시뉴클레인의 처음 3개의 아미노산을 포함하는 에피토프를 인지한다. MAb 6H7은 tag 단백질이 시뉴클레인의 N-말단에 융합된 시뉴클레인의 융합 단백질을 인지할 수 있는데, 이는 곧 (유리 아미노말단이 바람직할 수도 있지만) 유리 아미노 말단이 절대적으로 필요한 것은 아님을 의미하는 것이다. MAb 8A5를 정제된 소의 시뉴클레인(α 및 β의 혼합물)에 대해 생성시켰는데, 이는 인간 및 마우스의 α-시뉴클레인의 카복시 말단에 있는 에피토프를 인지한다. MAb 8A5는 139번 아미노산에서 종결되는 절단형 시뉴클레인에 결합할 수 있다. 예비 실험 결과, 8A5는 바이오틴에 컨쥬게이트화된 C-말단에 비하여 유리 C-말단을 보유하는 시뉴클레인과 4∼5배 더 잘 결합함을 알 수 있다. mAb 6H7 및 mAb 8A5는 또한 베타-시뉴클레인도 인지한다. MAb 4B1은 시뉴클레인의 C-말단 영역을 인지하고 웨스턴 블럿 상의 시뉴클레인과 결합하지만, 용액 중 시뉴클레인은 인지하지 않는다[즉, mAb 4B1은 시뉴클레인을 면역 침전시키지 않음]. 도 12는 8A5가 주입된 마우스의 반대 측(좌측 패널; 검편 내 둥근 모양의 갈색 점은 α-시뉴클레인 응집체임) 및 동 측(우측 패널) 검편을 나타내는 것이다. 8A5-주입된 마우스와 IgG1-주입된 대조구 사이의 차는 통계학적으로 유의 수준이었다[크러스컬-월리스(Kruskall-Wallis) 비모수 → 던(Dunn) 전후 인과 테스트, p<0.05]. 상기 결과들은, α-시뉴클레인의 C-말단 및/또는 N-말단을 표적화하는 것은 시뉴클레인 병증 예를 들어, PD 및 DLB에 대하여 치료학적으로 유효하다는 것을 나타내는 것이다. 시험된 기타 항-α-시뉴클레인 항체를 투여하였을 경우에는(도 11, 표 5), 응집체를 제거하지 못하였다.
당업자는 본 발명에 첨부된 청구의 범위의 사상과 범위를 벗어나지 않고 본 발명에 다수의 변형 및 수정을 가할 수 있음을 파악하게 될 것이다. 명세서 중 달리 언급하지 않는 한, 임의의 단계, 특징, 구체예 또는 측면은 기타 다른 사항들과 함께 사용될 수 있다. 본 명세서에 언급된 모든 공보와 특허 출원은, 각각의 공보 또는 특허 출원이 특이적이고 개별적으로 참고용으로 인용되는 것과 같은 정도로 본원에 참고용으로 인용된 것이다.
ATCC PTA-6909 20050804 ATCC PTA-6910 20050804
SEQUENCE LISTING <110> Elan Pharmaceuticals, Inc. Regents of the University of California Schenk, Dale B. Masliah, Eliezer Buttini, Manuel Chilcote, Tamie Rockenstein, Edward Games, Dora <120> PREVENTION AND TREATMENT OF SYNUCLEINOPATHIC DISEASE <130> 015270-008950KR <140> KR <141> 2005-08-09 <150> WO 00/000,000 <151> 2005-08-09 <150> US 11/185,907 <151> 2005-07-19 <150> US 10/915,214 <151> 2004-08-09 <150> US 10/699,517 <151> 2003-10-31 <150> US 10/698,099 <151> 2003-10-31 <150> US 60/423,012 <151> 2002-11-01 <160> 57 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 140 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val 1 5 10 15 Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys 20 25 30 Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val 35 40 45 Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr 50 55 60 Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys 65 70 75 80 Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys 85 90 95 Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile 100 105 110 Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro 115 120 125 Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala 130 135 140 <210> 2 <211> 35 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Glu Gln Val Thr Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala 1 5 10 15 Val Ala Gln Lys Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr 20 25 30 Gly Phe Val 35 <210> 3 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Lys Glu Gln Val Thr Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr 1 5 10 15 Ala Val Ala Gln Lys Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser 20 25 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 4 Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr 1 5 10 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Plasmodium sp. <400> 5 Glu Lys Lys Ile Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe Asn Val 1 5 10 15 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 6 Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile 1 5 10 <210> 7 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Asp Gln Ser Ile Gly Asp Leu Ile Ala Glu Ala Met Asp Lys Val Gly 1 5 10 15 Asn Glu Gly <210> 8 <211> 14 <212> PRT <213> Mycobacterium bovis <400> 8 Gln Val His Phe Gln Pro Leu Pro Pro Ala Val Val Lys Leu 1 5 10 <210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 9 Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu 1 5 10 15 <210> 10 <211> 21 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 10 Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser 1 5 10 15 Ala Ser His Leu Glu 20 <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 11 Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala 1 5 10 15 <210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X is preferably cyclohexylalanine, tyrosine or phenylalanine <400> 12 Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala 1 5 10 <210> 13 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <400> 13 Lys Glu Gln Val Thr Asn Val Cys Gly Gly Ala Val Val Thr 1 5 10 <210> 14 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <400> 14 Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys Thr Val Glu Cys Gly 1 5 10 <210> 15 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X is amino-heptanoic acid <400> 15 Xaa Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Cys Gln Glu Gly 1 5 10 <210> 16 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X is NAC peptide <400> 16 Xaa Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu 1 5 10 15 <210> 17 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X = NAC peptide <400> 17 Xaa Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val 1 5 10 15 Ser Ala Ser His Leu Glu 20 <210> 18 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X = NAC peptide <400> 18 Xaa Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu 1 5 10 15 <210> 19 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X= NAC peptide <400> 19 Xaa Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu 1 5 10 15 Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser 20 25 30 Ala Ser His Leu Glu 35 <210> 20 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X = cyclohexylalanine, tyrosine or phenylalanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> X= NAC peptide <400> 20 Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Xaa 1 5 10 <210> 21 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(3) <223> X = NAC peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X= cycloheylalanine, tyrosine, or phenylalanine <400> 21 Xaa Xaa Xaa Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala 1 5 10 15 <210> 22 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X= cycloheylalanine, tyrosine, or phenylalanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(17) <223> X=NAC peptide <400> 22 Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa <210> 23 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X=NAC peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X= cycloheylalanine, tyrosine, or phenylalanine <400> 23 Xaa Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala 1 5 10 <210> 24 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X=NAC <400> 24 Xaa Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala 1 5 10 15 Gly Arg <210> 25 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(16) <223> X = NAC peptide <400> 25 Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 <210> 26 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X= NAC peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> X= NAC peptide <400> 26 Xaa Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Xaa 1 5 10 15 <210> 27 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(3) <223> X = NAC Peptide <400> 27 Xaa Xaa Xaa Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr 1 5 10 15 <210> 28 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> X = NAC Peptide <400> 28 Xaa Xaa Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr 1 5 10 15 <210> 29 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(106) <223> X = NAC peptide <400> 29 Xaa Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Glu Lys 1 5 10 15 Lys Ile Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe Asn Val Gln Tyr 20 25 30 Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Phe Asn Asn 35 40 45 Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His 50 55 60 Leu Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile 65 70 75 80 Gly Ile Thr Glu Leu Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg 85 90 95 Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu 100 105 <210> 30 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(77) <223> X = NAC peptide <400> 30 Xaa Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu 1 5 10 15 Cys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val 20 25 30 Ser Ala Ser His Leu Glu Xaa Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe 35 40 45 Ile Gly Ile Thr Glu Leu Cys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp 50 55 60 Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Xaa 65 70 75 <210> 31 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X = NAC peptide <400> 31 Xaa Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu 1 5 10 15 <210> 32 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <400> 32 Glu Gln Val Thr Asn Val Gly Gly Ala Ile Ser Gln Ala Val His Ala 1 5 10 15 Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg 20 25 <210> 33 <211> 43 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr 35 40 <210> 34 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conjugate <400> 34 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe 1 5 10 15 Ile Gly Ile Thr Glu Leu 20 <210> 35 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conjugate <400> 35 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp 1 5 10 15 Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu 20 25 <210> 36 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conjugate <400> 36 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe 1 5 10 15 Ile Gly Ile Thr Glu Leu Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu 20 25 30 Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu 35 40 <210> 37 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conjugate <400> 37 Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe 1 5 10 15 Ile Gly Ile Thr Glu Leu 20 <210> 38 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conjugate <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X= cycloheylalanine, tyrosine, or phenylalanine <400> 38 Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Asp Ala Glu 1 5 10 15 Phe Arg His Asp 20 <210> 39 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conjugate <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> X= cycloheylalanine, tyrosine, or phenylalanine <400> 39 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala 1 5 10 15 Glu Phe Arg His Asp Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala 20 25 30 Ala Ala <210> 40 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X= cycloheylalanine, tyrosine, or phenylalanine <400> 40 Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Asp Ala Glu 1 5 10 15 Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg 20 25 30 His Asp <210> 41 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> X= cycloheylalanine, tyrosine, or phenylalanine <400> 41 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu 1 5 10 15 Lys Ala Ala Ala 20 <210> 42 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <400> 42 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His 1 5 10 15 Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg 20 <210> 43 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <400> 43 Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His 1 5 10 15 Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg 20 <210> 44 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <400> 44 Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His 1 5 10 15 Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg 20 <210> 45 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <400> 45 Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Asp Ala Glu 1 5 10 15 Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg 20 25 30 His Asp <210> 46 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <400> 46 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu 1 5 10 15 Lys Leu Ala Thr Asp Ala Glu Phe Arg His Asp 20 25 <210> 47 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <400> 47 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala 1 5 10 15 Glu Phe Arg His Asp Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu 20 25 30 Ala Thr <210> 48 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <400> 48 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Pro Lys 1 5 10 15 Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr 20 25 <210> 49 <211> 79 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <400> 49 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu 1 5 10 15 Lys Leu Ala Thr Glu Lys Lys Ile Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser 20 25 30 Val Phe Asn Val Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile 35 40 45 Thr Glu Leu Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro 50 55 60 Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Asp Ala Glu Phe Arg His Asp 65 70 75 <210> 50 <211> 56 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <400> 50 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala 1 5 10 15 Glu Phe Arg His Asp Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly 20 25 30 Ile Thr Glu Leu Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro 35 40 45 Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu 50 55 <210> 51 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <400> 51 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe 1 5 10 15 Ile Gly Ile Thr Glu Leu Cys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp 20 25 30 Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu 35 40 <210> 52 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <400> 52 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe 1 5 10 15 Ile Gly Ile Thr Glu Leu Cys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp 20 25 30 Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Asp Ala Glu Phe 35 40 45 Arg His Asp 50 <210> 53 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <400> 53 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe 1 5 10 15 Ile Gly Ile Thr Glu Leu 20 <210> 54 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Lys Glu Gln Val Thr Asn Val Cys Gly Gly Ala Val Val Thr 1 5 10 <210> 55 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys Thr Val Glu Cys Gly 1 5 10 <210> 56 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X = amino-heptanoic acid <400> 56 Xaa Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Cys Gln Glu Gly 1 5 10 <210> 57 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION X= Aecylated proline <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X = Aecylated proline <400> 57 Xaa Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Cys Ala 1 5 10

Claims (6)

  1. ATCC PTA-6909에 의해 생산되는 8A5 항체 또는 8A5의 CDR을 갖는 인간화된 8A5 항체 또는 키메라 8A5 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체는 인간 IgG1 이소타입인 것인 항체.
  3. 제1항의 항체를 포함하는 약학 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 파킨슨 병(PD), 루이체 생성 치매(DLB), 확산성 루이체 질환(DLBD), 변형 루이체 생성 알츠하이머 병(LBVAD), PD 및 알츠하이머 병(AD)의 동시 발병, 다계통 위축증(MSA), 제1형 뇌 철분 축적 신경 퇴행증(NBIA-1), 순수한 자율신경 부전증, 특발성 파킨슨 병, 루이체 연하 장애, 우발성 LBD, 선천성 LBD, 올리브 다리 소뇌 위축, 줄무늬체 흑질 변성 또는 샤이-드래거 증후군의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 것인 약학 조성물.
  5. 모노클로날 항체 8A5 (ATCC 기탁 번호 PTA-6909)의 인간화 방법으로서,
    모노클로날 항체의 CDR 영역의 아미노산 서열을 결정하는 단계;
    수용 항체를 선택하는 단계; 및
    모노클로날 항체로부터 유래된 CDR과, 수용 항체로부터 유래된 가변 영역 구조틀을 포함하는 인간화된 항체를 생산하는 단계를 포함하는 방법.
  6. 모노클로날 항체 8A5(ATCC PTA-6909)의 키메라 형을 생산하는 방법으로서,
    경쇄 및 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 결정하는 단계;
    중쇄 및 경쇄 불변 영역을 선택하는 단계; 및
    경쇄 불변 영역에 융합된 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄와 중쇄 불변 영역에 융합된 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄를 포함하는 키메라 항체를 생산하는 단계를 포함하는 방법.
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