CN101265297B - α-突触核蛋白与Sph1的相互作用位点及其在筛选帕金森症药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分离的多肽(Syn12)，所述的多肽可用于筛选抑制α-突触核蛋白与Sph1蛋白相互作用的物质。本发明还公开了一种筛选抑制α-突触核蛋白与Sph1蛋白相互作用的物质的方法，该方法以α-突触核蛋白N-端的12个氨基酸残基作为筛选的靶点。本发明首次发现α-突触核蛋白N-端的12个氨基酸残基是真正决定α-Syn与Sph1相互作用的位点，从而为筛选抗Lewy包涵体形成的物质提供了更为明确的靶点。

Description

α-突触核蛋白与Sph1的相互作用位点及其在筛选帕金森症药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物化学和分子生物学的研究领域，具体涉及α-突触核蛋白与Synphilin-1蛋白的相互作用机制以及在药物开发中的应用。

背景技术

帕金森症(Parkinson’s disease)是一种常见的神经退行性疾病，在临床上，它主要表现为反应迟缓，震颤，机体僵硬，进一步失去平衡等症状。对PD病人脑组织研究发现，疾病患者中脑黑质多巴胺能神经元丧失，存活的神经元细胞质中有称为Lewy体(Lewy body，一种同心圆的玻璃样小体)的包涵体出现。帕金森症发病原因尚未完全明确，5-10％病人有家族史，可能与α-突触核蛋白(α-synuclein，α-Syn)和Parkin等的基因的异常有关；其它如氧化压力，线粒体功能障碍以及环境毒素等因素都可能引起类似帕金森症的表现，称为帕金森综合症。

Lewy包涵体已经成为帕金森病中变性神经元的标志性病变，研究表明，许多神经退行性疾病，包括阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease)、帕金森症和DLB症(Dementia with Lewy Body)等病人脑组织中都有Lewy包涵体形成。Lewy体中有多种异常积聚的蛋白质，主要包括α-Syn、泛素等，而这些蛋白质在正常神经元内都行使一定的功能。说明这类疾病与蛋白质(特别是α-Syn蛋白)的异常积聚密切相关。

1999年，Simone Engelender等人用酵母双杂交的方法找到了与α-Syn相互作用的蛋白，并命名为Synphilin-1(简称Sphl)，他们把α-Syn中间的NAC片段(α-Syn的61-95位序列)和Sph1共转染到HEK293细胞后发现有Lewy体样包涵体形成，然而后续的一些实验结果并不支持该结论。

综上，尽管本领域人员对于α-Syn以及Sph1的功能以及作用机制有所了解，然而，还需要进一步深入地研究α-Syn和Sph1的相互作用机制以及进一步验证它们与帕金森症的关系，以发掘它们的药用价值。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种可用于筛选抑制α-突触核蛋白与Sph1蛋白相互作用的物质的多肽，该多肽的编码基因以及应用。

本发明的另一目的在于提供一种筛选抑制α-突触核蛋白与Sph1蛋白相互作用的潜在物质的方法。所述方法以α-突触核蛋白(α-Syn)N-端的12个氨基酸残基作为筛选的靶点。

在本发明的第一方面，提供一种分离的多肽(Syn12)，所述的多肽具有SEQID NO：4所示的氨基酸序列。

在本发明的第二方面，提供一种分离的DNA，所述的DNA编码所述的多肽。

在本发明的另一优选例中，还包括一种载体，所述的载体含有所述的DNA。

在本发明的另一优选例中，还包括一种遗传工程化的细胞它含有所述的载体；或它的基因组中整合有所述的DNA。

在本发明的另一优选例中，所述的细胞中还含有：Sph1蛋白或其编码基因。

在本发明的第三方面，提供所述的多肽的用途，用于筛选抑制α-突触核蛋白与Sph1蛋白相互作用的潜在物质；或用于制备特异性结合该多肽的抗体或配体。

在本发明的第四方面，提供一种筛选抑制α-突触核蛋白与Sph1蛋白相互作用的潜在物质的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将候选物质与α-突触核蛋白元件和Sph1蛋白元件相互作用的体系接触，所述的α-突触核蛋白元件包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，但不是全长的α-突触核蛋白；所述的Sph1蛋白元件是Sph1蛋白全长或其活性片段；和

(b)检测候选物质对α-突触核蛋白元件和Sph1蛋白元件相互作用的影响；

其中，若所述候选物质可抑制α-突触核蛋白元件和Sph1蛋白元件相互作用，则表明该候选物质是抑制α-突触核蛋白与Sph1蛋白相互作用的潜在物质。

在本发明的另一优选例中，所述的Sph1蛋白元件包含SEQ ID NO：2所示序列中第349-556位氨基酸。

在本发明的另一优选例中，所述的α-突触核蛋白元件具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

在本发明的另一优选例中，所述方法包括：

(a’)在测试组中，在α-突触核蛋白元件和Sph1蛋白元件相互作用的体系中添加候选物质；和

(b’)检测α-突触核蛋白元件和Sph1蛋白元件相互作用情况，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的、α-突触核蛋白元件和Sph1蛋白元件相互作用的体系；

如果测试组中α-突触核蛋白元件和Sph1蛋白元件相互作用在统计学上弱于(优选显著弱于，如弱15％；更优选的，弱30％或更弱)对照组，就表明该候选物质是抑制α-突触核蛋白与Sph1蛋白相互作用的潜在物质。

在本发明的另一优选例中，通过观察α-突触核蛋白元件与Sph1蛋白元件形成Lewy包涵体的情况来确定候选物质对于α-突触核蛋白元件和Sph1蛋白元件相互作用的影响；如果候选物质使Lewy包涵体减少(优选显著减少，如减少15％；更优选的，减少30％或更多)，则表明该候选物质是抑制α-突触核蛋白与Sph1蛋白相互作用的潜在物质。

在本发明的另一优选例中，所述体系选自：溶液体系、细胞体系(如HEK293T细胞)、或组织体系。

在本发明的另一优选例中，所述的相互作用是结合。

在本发明的另一优选例中，所述的α-突触核蛋白与Sph1蛋白相互作用导致神经退行性疾病的发生。

在本发明的另一优选例中，所述的神经退行性疾病包括(但不限于)：帕金森症、阿尔茨海默症、和DLB症。

在本发明的第五方面，提供一种通过所述的方法筛选获得的抑制α-突触核蛋白与Sph1蛋白相互作用的潜在物质。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1.GST pull-down方法检测GB1-Sph1M与GST-α-Syn相互作用。

A：Sph1分段示意图。

B：GB1-Sph1N蛋白分别与GST-α-Syn和GST进行pull-down试验，未检测到相互作用。

C：GB1-Sph1M分别与GST-α-Syn和GST进行pull-down试验，检测到GB1-Sph1M与GST-α-Syn相互作用；其中，“*”所示条带表示Pulldown的二体条带，“←”所示条带表示Pulldown的条带，说明有相互作用。

D：GB1-Sph1C蛋白分别与GST-α-Syn和GST进行pull-down试验，未检测到相互作用。

图2.GB1-Sph1M与α-Syn N端12个氨基酸残基的相互作用。

A.GB1-Sph1M蛋白分别与GST-α-Syn65、GST-α-Syn95和GST进行pull-down，GB1-Sph1M蛋白与GST-α-Syn65、GST-α-Syn95都能相互作用；其中，“*”所示条带表示Pul ldown的二体条带。

B核磁共振化学位移干扰实验检验GB1-Sph1M与α-Syn65相互作用，¹⁵N-α-Syn65(200μM)¹⁵N-¹H HSQC图谱(绿色)与¹⁵N-α-Syn：GB1-Sph1M比例为1:3时，¹⁵N-α-Syn65¹⁵N-¹H HSQC图谱(红色)叠加，有7个点(绿色箭头表示)消失还有些点变弱，说明两者有相互作用。

Cα-Syn65上参与GB1-Sph1M相互作用的氨基酸残基，其中，方框内的氨基酸残基为α-Syn的N端12个氨基；1:1、1:2、1:3分别表示α-Syn65：GB1-Sph1M的比值；0：表示消失的点，*：表示峰值减弱的点。

DGB1-Sph1M蛋白分别与GST-α-Syn、N端缺失蛋白GST-α-SynΔN和GST pull-down，GST-α-Syn与GB1-Sph1M能相作用，N端缺失蛋白GST-α-SynΔN则丧失结合能力。

E GB1-Sph1M蛋白分别与GST-α-Syn65、N端缺失蛋白GST-α-Syn65ΔN和GST pull-down，GST-α-Syn65与GB1-Sph1M能相互作用，N端缺失蛋白GST-α-Syn65ΔN则丧失结合能力。

图3.Transfer-NOE技术解析与GB1-Sph1M相互作用及结合状态下蛋白syn12的构象。

A蛋白Syn12浓度为1mM，GB1-Sph1M浓度为0.1mM时NOESY谱。

B蛋白Syn12浓度为1mM时NOESY谱。

C，D与GB1-Sph1M相互作用及结合状态下蛋白Syn12的构象，表面电荷分布，其中，深蓝色区域表示携带正电荷。

图4.免疫荧光检测Sph1与α-Syn相互作用对于α-Syn积聚和Lewy体形成的影响。

Aα-Syn在HEK293T细胞中过量表达，转染38小时后加入MG-132处理10小时没有包涵体形成，DMSO处理细胞作为对照。

B Sph1在HEK293T细胞中过量表达，加入MG-132胞质中形成包涵体，转染38小时后加入MG-132处理10小时有包涵体形成，DMSO处理细胞则没有包涵体形成。

Cα-Syn和Sph1共转染到HEK293T细胞后，加入蛋白酶体抑制剂处理10小时，发现有Lewy体样包涵体形成，并且α-Syn和Sph1共定位在包涵体中(箭头所指，g-i)；而α-SynΔN和Sph1共转染到HEK293T细胞后发现有Sph1阳性的包涵体形成，但是α-SynΔN不定位在包涵体中。其中，Scale bar＝10μm。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现α-突触核蛋白(α-Syn)N-端的12个氨基酸残基是真正决定α-Syn与Sph1相互作用的位点。Sph1通过与α-突触核蛋白的N-端12个残基相互作用，从而促进α-突触核蛋白在细胞内形成Lewy包涵体。由于体内α-突触核蛋白的积聚和Lewy包涵体的形成与神经退行性疾病(如帕金森症)的发病密切相关，因此，该位点可以作为药物设计的靶点，用于筛选抑制α-Syn与Sph1相互作用、从而抑制体内α-突触核蛋白积聚和Lewy包涵体形成的物质。在此基础上完成了本发明。

α-突触核蛋白及其活性片段

α-突触核蛋白(α-Syn)是一种突触前神经末梢蛋白，它在脑中含量丰富，分布广泛，在人体的其他器官中也有表达。在发育过程中α-Syn由细胞体逐渐向神经末梢聚集。

中脑黑质多巴胺能神经元的丧失和神经元胞质中Lewy体(Lewy body)出现是帕金森症(PD)的病理特征，而α-Syn是Lewy体的主要组成成分。α-Syn蛋白在体外很容易积聚成纤维样结构，其形态与生理病变所导致的纤维物形态相似。已有研究表明，α-Syn的突变体，剪切产物以及它们的过量表达，都可以导致神经退行性疾病的症状出现(Agorogiannis EI等，Neuropathol ApplNeurobiol.30(3)：215-24(2004)；Bucciantini M等，Nature416：507-511(2002))，这表明α-Syn参与了PD病理过程。单体的α-Syn对多巴胺能神经细胞没有毒性，而它的积聚物(寡聚体和成熟纤维)对多巴胺能神经细胞具有毒性。蛋白质积聚后生成的寡聚体或原纤维的毒性最大，是致病的关键；成熟纤维的毒性较小，纤维的形成，或许是机体出于保护自身免受到伤害而从原纤维转化而成的。因此，研究α-Syn及其相互作用蛋白积聚，有助于了解帕金森症病理过程。

本发明提供了一种由α-Syn蛋白N端12个氨基酸残基组成的多肽，本发明人将之命名为Syn12，其具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

所述的Syn12多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选合成片段。所述的Syn12多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。本发明还提供了Syn12多肽的编码基因。所述的编码基因可以是单链的或是双链的。例如，所述的Syn12多肽的编码基因具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法或人工合成法来大批量地获得有关序列。重组法通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。考虑所述的Syn12多肽的序列较短，优选采用人工合成法来合成所述的Syn12多肽。多肽的人工合成技术是本领域人员所熟知的。

Sph1蛋白及其活性片段

Synphilin-1(简称Sph1)蛋白是一种可与α-Syn相互作用的蛋白。CaseyO’Farrell等人把Sph1转染到HEK293过量表达发现Sph1能够在胞质中形成包涵体。在PD患者脑组织Lewy包涵体中也发现有Sph1。Sph1的功能还不清楚，它包括若干介导蛋白质相互作用的结构域：锚蛋白(ankyrin)重复结构域和卷曲螺旋(coiled-coil)结构域，并且发现它能够与突触囊泡结合。在以往的研究中，Sph1在α-Syn积聚，Lewy体形成，PD病理过程中的作用还不确定。研究Sph1在神经元内异常的蛋白积聚过程中起的作用，有助于了解Lewy体的形成过程。

在本发明中，所用的Sph1蛋白可以是天然存在的，比如其可被纯化和分离自哺乳动物。优选的，所述天然存在的Sph1蛋白的氨基酸序列可以与登录号为Swiss Prot#Q9Y6H5提供的序列基本上相同。此外，所述的Sph1蛋白也可以是重组制备的，比如可以根据常规的基因重组技术来生产重组的Sph1蛋白。优选的，本发明采用重组的Sph1蛋白。此外，任何不影响Sph1蛋白的生物活性的变化形式都可用于本发明中，例如Sph1蛋白的活性片段、衍生物，只要其也具有与α-Syn相互作用的功能，且不会带来其它不良影响，如可以是含有Sph1蛋白第349-556位氨基酸的蛋白片段。

应用及筛选方法

在研究过程中，本发明人利用GST Pull-Down技术，检测GST-α-Syn65(含有α-Syn的前65位氨基酸残基)，GST-α-Syn95(含有α-Syn的前95位氨基酸残基)蛋白与GB1-Sph1M是否有相互作用。结果发现，GST-α-Syn65、GST-α-Syn95都能与GB1-Sph1M蛋白相互作用。本发明人还采用核磁共振化学位移干扰实验检验α-Syn缺失突变蛋白与GB1-Sph1M片段是否有相互作用。结果发现，用GB1-Sph1M滴定α-Syn65时，α-Syn65上V3，F4，M5，K6，G7，L8，S9谱峰消失，K12信号减弱，说明α-Syn65与GB1-Sph1M可发生相互作用。进一步地，本发明人利用GST Pull-Down技术，检测α-Syn的N端缺失蛋白与GB1-Sph1M是否可发生相互作用。结果显示，α-Syn的N端12个氨基酸缺失的蛋白GST-α-Syn13-140，GST-α-Syn13-65丧失结合能力。说明是α-Syn N端12个氨基酸残基介导与GB1-Sph1M的相互作用。

本发明人还利用TrNOE技术解析与GB1-Sph1M结合状态下多肽Syn12(含有α-Syn的N端12位氨基酸残基)的构象。结果发现，蛋白Syn12浓度为1mM时NOE谱，谱峰很少，这是因为Syn12没有与Sph1蛋白结合时在溶液中结构取向不固定，无法检测到核磁信号；当加入0.1mM GB1-Sph1M时，蛋白Syn12结合到较大的GB1-Sph1M蛋白上，结构稳定，NOE谱谱峰较多，通过比较两个谱的变化可以得出蛋白Syn12与GB1-Sph1M结合的结论。

基于本发明的新发现，对α-Syn或其活性片段与Sph1或其活性片段相互作用的研究有着多方面的用途，所述的用途包括(但不限于)：筛选抑制α-Syn或其活性片段与Sph1或其活性片段相互作用的物质，从而抑制lewy包涵体的形成，以预防或治疗神经退行性疾病(如帕金森症)。更优选的，以含有α-Syn蛋白的N端12个氨基酸残基的片段作为靶点，筛选抑制该片段与Sph1或其活性片段结合的物质。

在得知了α-Syn蛋白上用于介导与Sph1蛋白相互作用的靶点后，可以利用该靶点来筛选阻止α-Syn蛋白与Sph1蛋白相互作用的物质。利用该物质可以阻止α-突触核蛋白与Sph1蛋白相互作用，阻止Lewy包涵体的形成，从而可用于制备神经退行性疾病的药物。

因此，本发明提供了一种筛选抑制α-突触核蛋白与Sph1蛋白相互作用的潜在物质的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将候选物质与α-Syn蛋白元件和Sph1蛋白元件相互作用的体系接触；(b)检测候选物质对α-Syn蛋白元件和Sph1蛋白元件相互作用的影响；其中，若所述候选物质可抑制α-Syn蛋白元件和Sph1蛋白元件相互作用，则表明该候选物质是抑制α-突触核蛋白与Sph1蛋白相互作用的潜在物质。

作为一个必要条件，上面所述的α-突触核蛋白元件包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，但不是全长的α-突触核蛋白。

所述的Sph1蛋白元件可以是全长的Sph1蛋白，也可以是Sph1蛋白的活性片段，只要是该片段可以与α-突触核蛋白发生相互作用；优选的，所述的Sph1蛋白元件包含SEQ ID NO：2所示序列中第349-556位氨基酸。

作为本发明的优选方式，直接采用α-突触核蛋白N端12个氨基酸构成的序列(具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列)来与Sph1蛋白元件相互作用，并在该相互作用的体系中加入候选物质，检测候选物质对于该两种蛋白的相互作用的影响，如果该候选物质能够抑制两者的相互作用，则说明其是抑制α-突触核蛋白与Sph1蛋白相互作用的潜在物质。

在本发明中，所述的体系选自(但不限于)：溶液体系、细胞体系、亚细胞体系、组织体系、器官体系、或动物体系。作为本发明的优选实施方式，所述的体系为细胞体系；优选的，所述的细胞是HEK293T细胞。

另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的可抑制α-突触核蛋白与Sph1蛋白相互作用的物质。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于抑制α-突触核蛋白与Sph1蛋白相互作用，从而抑制Lewy包涵体的形成有用的药物。

此外，也可以针对α-Syn的N端12个氨基酸残基设计竞争性结合物质，例如特异性抗该位点的单克隆抗体，与该位点特异性结合的配体等，从而通过竞争性结合来达到阻止α-Syn的N端12个氨基酸残基介导的α-Syn与Sph1的结合。

目前，已知DNA序列，将该目的DNA序列引入到各种已知DNA分子(如载体)和细胞中是本领域中的常规技术，一般人员只要根据本发明的提示，都可以方便的进行操作。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。此外，将各种形式的突变引入到各种DNA分子中也是本领域熟知的技术。

用重组DNA转化宿主细胞也是本领域技术人员熟知的常规技术。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。可供选择的是用Mg Cl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。获得的转化子可以用常规方法培养，表达目的蛋白。

在本发明中，检测蛋白质与蛋白质之间相互作用以及相互作用的强弱可采用多种本领域技术人员熟知的技术，比如GST沉降技术(GST Pull-Down)、噬菌体展示技术、酵母双杂交系统或免疫共沉淀技术等等。本发明对于检测候选物质对α-突触核蛋白和Sph1相互作用的强弱的方法没有特别的限制，所述方法优选的是：GST沉降技术、核磁共振化学位移干扰实验，TrNOE技术等，所述方法的一些实施形式在本发明的实施例中有描述。通常可以设置不加入候选物质的对照，从而通过将测试组与对照组进行比较来确定候选物质是否对于抑制α-突触核蛋白和Sph1之间的相互作用是有用的。

本发明的主要优点在于：

(1)首次发现α-突触核蛋白(α-Syn)N-端的12个氨基酸残基是真正决定α-Syn与Sph1相互作用的位点，从而为筛选抗Lewy包涵体形成的物质提供了更为明确的靶点。

(2)只需要通过观察含有α-突触核蛋白N-端的12个氨基酸的片段与Sph1或其活性片段的相互作用情况即可确定候选物质是否可抑制α-突触核蛋白与Sph1的相互作用，大大简化了筛选操作过程。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1

GB1融合Synphilin-1缺失突变体与GST-α-Syn的表达与纯化

本实施例使用的Synphilin-1蛋白由919个氨基酸残基构成(SEQ ID NO：2)，直接克隆到pET-22b表达载体中不表达，本发明人根据登录号为Swiss Prot#Q9Y6H5提供的序列(即SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列)，将Synphilin-1全长蛋白分成三个片段来表达，希望能得到这三个片段然后再分别检测是否与α-Syn有直接相互作用。Synphilin-1蛋白的全长及其三个片段的设计情况见图1A。

采用常规的方法设计引物，通过PCR得到Synphilin1-348(Sph1N)，Synphilin349-556(Sph1M)，Synphilin557-919(Sph1C)基因片段，分别与GB1(其序列参见Goward，C.R.；Murphy，J.P.；Atkinson，T.；Barstow，D.A.Biochem J(1990)，267，171-177.；Y.Cheng等，An efficient system for smallprotein expression and refoding，Biochem.Biophys.Res.Commun.317(2004)401-405)融合表达。本发明人采取的GB1融合方式是N端GB1融合，GB1序列后面是凝血酶(Thrombin)酶切位点(LVPRGS)，之后是目的基因片段，并且在融合基因的5’端设置Nde I酶切位点，3’端设置Xho I酶切位点。用Nde I、Xho I双酶切基因片段和载体pET-22b(购自Novagen)，然后连接将融合基因插入载体pET-22b中。

将上述构建的重组质粒分别转化入BL21(DE3)菌株中。从平板上挑取单菌落接种于10ml LB(Amp⁺)培养基中，37℃振荡过夜培养。次日将过夜培养物按1：100比例转接到新的1LLB(Amp⁺)培养基中，37℃振荡培养约2.5-3小时，待OD₆₀₀值0.6-0.8时加入IPTG至终浓度0.2mM，22℃诱导过夜。以后的操作皆在冰上进行，5000rpm离心15分钟收菌，弃上清倒置1分钟使残余培养基流尽。用破菌缓冲液(50mM NaH₂PO₄，500mM NaCl，pH8.0)重悬沉淀，5000rpm×10分钟离心收菌，弃上清。取50ml破菌缓冲液加入到沉淀中并吹打均匀，1：200加入PMSF至终浓度为0.5μM，超声波破菌(3×5分钟)。细菌破碎液15000rpm×15分钟离心，取上清。上Ni-NTA柱纯化，样品缓慢滴下使蛋白更好地与柱子结合。上样完毕，先用破菌缓冲液洗5个柱体积，再用梯度洗脱缓冲液(50mMNaH₂PO₄，500mM NaCl，250mM咪唑，pH8.0)洗脱，咪唑浓度梯度为20mM，50mM，100mM，250mM。15％SDS-PAGE检测蛋白洗脱情况。收集含有目标蛋白的组分浓缩后用FPLC Superdex-75柱层析进一步纯化，可得到目的蛋白。

采用与前述相同的方法，制备GST-α-Syn融合蛋白，其中GST位于GST-α-Syn的N端，α-Syn的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

用Glutathione Sepharose4B柱子纯化GST-α-Syn，操作步骤与上述GB1融合Synphilin-1缺失突变体的蛋白纯化类似。

实施例2

确定Synphilin-1的中间部分与α-Syn的直接相互作用

GST pull-down方法分别检测GB1-Sph1N，GB1-Sph1M，GB1-Sph1C与GST-α-Syn是否有相互作用。

在1.5ml的Eppendorf管分别加入20微升的Glutathione Sepharose4Bbeads，然后在2000rpm，4℃离心2分钟，去上清。在管中分别加入1000微升TEN100(50mM Tris，0.1Mm EDTA，100mM NaCl，pH7.4)缓冲液冲洗beads，然后在2000rpm，4℃离心2分钟，去上清，如此反复洗三次，在最后一次离心去上清后，往管中分别加入20μl的GST(100μM)，100微升的GST-α-Syn(20μM)，然后补加TEN100缓冲液至300μl。4℃混匀器上转动1小时。2000rpm，4℃离心2分钟，去上清，分别往管中加入1000微升的TEN100缓冲液，4℃离心2分钟，去上清，如此反复洗三次。最后一次离心后去上清，往管中分别加入等量的GB1-Sph1N，GB1-Sph1M，GB1-Sph1C，补加TEN100缓冲液至300μl在4℃，混匀器上转动5小时。2000rpm离心10分钟，去上清，分别往管中加入1000微升的TEN100缓冲液，4℃离心2分钟，去上清，如此反复洗三次。最后一次离心去上清后分别向四管中加入20微升的5×的SDS凝胶加样缓冲液，在沸水中煮5min。15％SDS-PAGE检测。各管中蛋白的加入情况见图1B-D。

上述实验结果显示，GB1-Sph1M与GST-α-Syn有相互作用而与GST没有相互作用。三段蛋白都是N端GB1融合表达，而只有GB1-Sph1M与GST-α-Syn有相互作用，排除了GB1的影响，结果见图1B-D。本发明人还用纯化的GB1作为对照，发现GB1与GST-α-Syn，GST都没有相互作用。

实施例3

确定α-Syn上Synphilin-1的结合位点

采用常规的方法，对α-Syn进行缺失突变，再与GST相融合(GST位于融合蛋白的N端)，得到GST-α-Syn65(含有α-Syn的前65位aa)，GST-α-Syn95(含有α-Syn的前95位aa)蛋白。然后与GB1-Sph1M分别通过GST pull-down检测是否有相互作用。实验步骤及蛋白用量与前述相同。在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳行将结束后，将蛋白转移到PVDF膜上，100V2小时。5％脱脂牛奶封闭1小时。加入anti-His-tag抗体4℃过夜。PBST(1×PBS，0.01％Tween-20)洗三次，10分钟/次。然后加入anti-MouseIgG-HRP抗体室温1小时，PBST(1×PBS，0.01％Tween-20)洗三次，10分钟/次。在膜上滴加ECL发光液，X光片显影。结果见图2A，可见GB1-Sph1M蛋白与GST-α-Syn65、GST-α-Syn95都能相互作用。

核磁共振化学位移干扰实验检验α-Syn缺失突变蛋白与GB1-Sph1M片段是否有相互作用。用GB1-Sph1M滴定¹⁵N-α-Syn65(200μM)，在Varian INOVA600兆核磁仪上收集HSQC谱，通过¹⁵N-¹H HSQC图谱中谱峰化学位移的变化检测GB1-Sph1M与α-Syn65是否相互作用。用M9培养基，以¹⁵N-NH₄Cl为唯一氮源¹³C₆-D-glucose为唯一碳源表达¹⁵N/¹³C-标记的α-Syn65，样品纯化后，在VarianINOVA600兆核磁仪上收集HNCACB，CBCA(CO)NH谱。然后用Sparky(Goddardand Kneller)软件对图谱进行处理归属α-Syn65主链。¹⁵N-α-Syn65样品浓度：200μM，数据采集温度：25℃；样品缓冲液：20mM PBS，50mM NaCl，90％H₂O，10％D₂O，pH6.5。

GB1-Sph1M滴定α-Syn65时V3，F4，M5，K6，G7，L8，S9谱峰消失，K12信号减弱，见图2B-C。该结果说明Sph1与α-Syn65的相互作用位点在α-Syn65的N-端12个氨基酸残基。

GB1-Sph1M蛋白分别与GST-α-Syn、N端缺失蛋白GST-α-Syn13-140(GST-α-SynΔN，含有α-Syn的第13-140位aa)，GST-α-Syn13-65(GST-α-Syn65ΔN含有α-Syn13第13-65位aa)和GST进行pull-down。结果，GST-α-Syn，GST-α-Syn65与GB1-Sph1M能相互作用，N端缺失蛋白GST-α-Syn13-140，GST-α-Syn13-65则丧失结合能力，见图2D-E。说明α-Syn N端12个氨基酸残基即可介导与GB1-Sph1M的相互作用。

实施例4

解析与GB1-Sph1M结合状态下蛋白α-Syn12的构象

为了一步确定α-Syn N端12个氨基酸残基即可介导与GB1-Sph1M的相互作用，本发明人合成了多肽Syn12(即含有α-Syn第1-12位aa，SEQ ID NO：4)，用Transferred NOE(TrNOE)技术解析与GB1-Sph1M结合状态下蛋白syn12的构象。

蛋白Syn12的浓度为1mM，GB1-Sph1M浓度为0.1mM，数据采集温度：25℃，样品缓冲液：20mM PBS，50mM NaCl，90％H₂O，10％D₂O，pH6.5。在Varian INOVA600兆核磁仪上收集TOCSY、NOESY谱，用MARS(Markus Zweckstetter)和Sparky(Goddard and Kneller)软件对图谱进行处理归属Syn12主链，用ARIA(CNS)进行结构计算，得到小肽在结合状态下的结构。

蛋白Syn12浓度为1mM时NOE谱，谱峰很少，这是因为蛋白没有与蛋白结合时在溶液中结构取向不固定，无法检测到核磁信号(图3B)；当加入0.1mMGB1-Sph1M时，蛋白Syn12结合到较大的GB1-Sph1M蛋白上，结构稳定，NOE谱谱峰较多(图3A)，通过比较两个谱的变化可以认为多肽Syn12与GB1-Sph1M结合。与GB1-Sph1M相互作用及结合状态下蛋白syn12的构象，表面正电荷较多。结果见图3C-D。

此外，当本发明人采用α-Syn的全长或1-65等变体与GB1-Sph1M进行上述检测时，其氨基端的12位残基的谱峰状况基本相同。因此，采用Syn12进行筛选的结果是可靠的。

实施例5

Sph1与α-Syn相互作用对于α-Syn积聚和Lewy体形成的影响

在体外确定Sph1与α-Syn结合位点以后，通过一个适合的细胞模型来研究它们的相互作用对α-Syn积聚和Lewy体形成的影响。已有研究发现α-Syn和Sph1共转染到HEK293细胞后发现有Lewy体样包涵体形成。

本发明人将α-Syn转染到HEK293T细胞(购自ATCC)使其过量表达，转染38小时后加入10μM蛋白酶体抑制剂MG-132，DMSO作对照，处理10小时。然后收细胞，固定，加抗体，Hoechst染核，封片，激光共聚焦显微镜观察。发现α-Syn在HEK293T细胞中过量表达，加入MG-132也没有包涵体形成，见图4A。Sph1在HEK293T细胞中过量表达，加入MG-132胞质中形成包涵体，见图4B。α-Syn和Sph1共转染到HEK293T细胞后发现有Lewy体样包涵体形成，并且α-Syn和Sph1共定位在包涵体中，而α-SynΔN和synphilin-1共转染到HEK293T细胞后发现也有Lewy体样包涵体形成，但是α-SynΔN不定位在包涵体中，见图4C。

上述结果说明，在细胞内synphilin-1与α-Syn是相互作用的，HEK239T细胞内synphilin-1更容易积聚形成包涵体，α-Syn即使过量表达也不会形成包涵体。HEK239T细胞内源α-Syn非常丰富，α-Syn和synphilin-1共定位在包涵体中。α-SynΔN和synphilin-1共转染到HEK293T细胞后发现也有Lewy体样包涵体形成，但是α-SynΔN不定位在包涵体中。这些结果提示：是synphilin-1量增多促进这种包涵体的形成，然而，缺失N端12个氨基酸残基的α-Syn不能与synphilin-1结合并定位在包涵体中。

由于体内α-Syn的积聚以及包涵体的形成与帕金森症密切相关，因此阻止α-Syn的积聚以及包涵体的形成将有利于帕金森疾病的防治。

实施例6

筛选抑制α-Syn与Sph1结合的物质

(一)化学位移干扰法

测试组：添加候选物且含有Syn65和GB1-Sph1M蛋白的溶液体系。

对照组：未添加候选物且含有Syn65和GB1-Sph1M蛋白的溶液体系。

采用如实施例3所述相同的方法，采用化学位移干扰技术分析Syn12的谱峰变化，从而分析其与GB1-Sph1M的结合状况。

如果与不添加候选物质的对照组相比较，添加候选物质后Syn65中的N-端12个氨基酸残基的HSQC谱谱峰明显增强，则说明该候选物质是抑制α-Syn与Sph1结合的物质。

(二)TrNOE法

测试组：添加候选物且含有Syn12和GB1-Sph1M蛋白的溶液体系。

对照组：未添加候选物且含有Syn12和GB1-Sph1M蛋白的溶液体系。

采用如实施例4所述相同的方法，采用TrNOE技术分析Syn12的谱峰变化，从而分析其与GB1-Sph1M的结合状况。

如果与不添加候选物质的对照组相比较，添加候选物质后多肽Syn12的NOE谱谱峰明显减少，则说明该候选物质是抑制α-Syn与Sph1结合的物质。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>a-突触核蛋白与Synphilin-1的相互作用位点及其在筛选帕金森症药物中的应用

<130>070973

<160>4

<170>PatentIn version3.3

<210>1

<211>140

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

<210>2

<211>919

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>2

<210>3

<211>36

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>3

<210>4

<211>12

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>4

Claims (7)

1.多肽的用途，用于筛选抑制α-突触核蛋白与Sph1蛋白相互作用的潜在物质；

所述的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

2.一种筛选抑制α-突触核蛋白与Sph1蛋白相互作用的潜在物质的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)将候选物质与α-突触核蛋白元件和Sph1蛋白元件相互作用的体系接触，所述的α-突触核蛋白元件包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，但不是全长的α-突触核蛋白；所述的Sph1蛋白元件是Sph1蛋白全长或其活性片段；和

(b)检测候选物质对α-突触核蛋白元件和Sph1蛋白元件相互作用的影响；

其中，若所述候选物质可抑制α-突触核蛋白元件和Sph1蛋白元件相互作用，则表明该候选物质是抑制α-突触核蛋白与Sph1蛋白相互作用的潜在物质。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的α-突触核蛋白元件具有的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

(a’)在测试组中，在α-突触核蛋白元件和Sph1蛋白元件相互作用的体系中添加候选物质；和

(b’)检测α-突触核蛋白元件和Sph1蛋白元件相互作用情况，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的、α-突触核蛋白元件和Sph1蛋白元件相互作用的体系；

如果测试组中α-突触核蛋白元件和Sph1蛋白元件相互作用在统计学上弱于对照组，就表明该候选物质是抑制α-突触核蛋白与Sph1蛋白相互作用的潜在物质。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，通过观察α-突触核蛋白元件与Sph1蛋白元件形成Lewy包涵体的情况来确定候选物质对于α-突触核蛋白元件和Sph1蛋白元件相互作用的影响；如果候选物质使Lewy包涵体减少，则表明该候选物质是抑制α-突触核蛋白与Sph1蛋白相互作用的潜在物质。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述体系选自：溶液体系、细胞体系、或组织体系。

7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的α-突触核蛋白与Sph1蛋白相互作用导致神经退行性疾病的发生。

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