ES2890073T3 - Métodos para detectar alfa-sinucleína fosforilada - Google Patents

Métodos para detectar alfa-sinucleína fosforilada Download PDF

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Abstract

Un método para detectar alfa-sinucleína fosforilada en la serina 129 (PS129 alfa-sinucleína), que comprende: (a) poner en contacto una muestra con un anticuerpo de captura que se une específicamente a un epítopo dentro de los residuos 124-134 de PS129 alfa-sinucleína y un anticuerpo reportero que se une específicamente a un epítopo dentro de los residuos 40-55 de alfa-sinucleína; en donde si PS129 alfa-sinucleína está presente en la muestra, el anticuerpo de captura y el anticuerpo reportero se unen a la PS129 alfa-sinucleína lo que forma un complejo sándwich; y (b) detectar el anticuerpo reportero que se une a la PS129 alfa-sinucleína en la etapa (a), si lo hay, para indicar la presencia o ausencia de la PS129 alfa-sinucleína.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos para detectar alfa-sinucleína fosforilada
Antecedentes
La patología cerebral por alfa-sinucleína es una característica notable de varias enfermedades neurodegenerativas denominadas sinucleinopatías. La alfa-sinucleína es el componente principal de los cuerpos de Lewy (LB) y las neuritas de Lewy, que son inclusiones intraneuronales.
Las sinucleinopatías incluyen la enfermedad de Parkinson (EP), la demencia con cuerpos de Lewy (DLB), la variante de la enfermedad de Alzheimer con cuerpos de Lewy (LBVAD), la enfermedad de cuerpos de Lewy difusa (DLBD), la atrofia de múltiples sistemas (MSA) y la neurodegeneración con acumulación de hierro en el cerebro tipo 1 (NBIA-1).
Las sinucleinopatías son una causa común de trastornos del movimiento y deterioro cognitivo en la población envejecida (Galasko y otros, Arch. Neurol. (1994) 51:888-95). Hasta la fecha estos trastornos no son curables ni prevenibles y la comprensión de las causas y la patogénesis de la EP es fundamental para el desarrollo de nuevos tratamientos (Tanner y otros, Curr. Opin. Neurol. (2000) 13:427-30). La causa de la enfermedad de Parkinson es controvertida y se ha propuesto que intervienen múltiples factores, incluidas diversas neurotoxinas y factores de susceptibilidad genética.
Varios estudios han demostrado que la alfa-sinucleína juega un papel central en la patogénesis de la EP porque: (1) esta proteína se acumula en los Lb (Spillantini y otros, Nature (1997) 388:839-40; Takeda y otros, J. Pathol. (1998) 152:367-72; Wakabayashi y otros, Neurosci. Lett. (1997) 239:45-8), (2) mutaciones en el gen de la alfa-sinucleína cosegregan con formas familiares raras de parkinsonismo (Kruger y otros, Nature Gen. (1998) 18:106-8; Polymeropoulos y otros, Science (1997) 276:2045-7) y, (3) su sobreexpresión en ratones transgénicos (Masliah y otros, Science (2000) 287:1265-9) y Drosophila (Feany y otros, Nature (2000) 404:394-8) imita varios aspectos patológicos de la EP. Por tanto, el hecho de que la acumulación de la alfa-sinucleína en el cerebro esté asociada con alteraciones morfológicas y neurológicas similares en especies tan diversas como seres humanos, ratones y moscas sugiere que esta molécula contribuye al desarrollo de la enfermedad de EP.
Se ha informado que la sinucleína fosforilada en el residuo de serina 129 (PS129) es una modificación patológica de la alfa-sinucleína que se encuentra en los cuerpos de Lewy y las neuritas de Lewy en la EP y en otras sinucleinopatías como la demencia con cuerpos de Lewy y la atrofia de múltiples sistemas (Anderson y otros, J. Biol. Chem. 281:29739-29752 (2006)). Aunque se ha informado que los niveles totales de alfa-sinucleína en el líquido cefalorraquídeo disminuyen en la enfermedad sinucleinopática, existe una superposición sustancial entre los niveles en sujetos con y sin enfermedad (Kang y otros, JAMA Neurol. 70(10): 1277-1287 (2013))). Se ha informado que los niveles en LCR de PS129 y las relaciones de PS129 a alfa-sinucleína total aumentan en los pacientes de Parkinson con relación a los controles (Wang y otros, Sci Transl Med. 201215 de febrero; 4(121): 121). El documento US-A-2013/0317199 describe métodos para detectar alfa-sinucleína, identifica epítopos preferidos de alfa-sinucleína para su uso en tal detección y proporciona anticuerpos que se unen específicamente a tales epítopos. El documento WO-A-2005/047860 describe métodos para detectar alfa-sinucleína, identifica epítopos preferidos de alfa-sinucleína para su uso en tal detección y proporciona anticuerpos que se unen específicamente a tales epítopos.
Resumen de la invención reivindicada
La invención proporciona un método para detectar alfa-sinucleína fosforilada en la serina 129 (PS129 alfa-sinucleína), que comprende: poner en contacto una muestra con un anticuerpo de captura que se une específicamente a un epítopo dentro de los residuos 124-134 de PS129 alfa-sinucleína y un anticuerpo reportero que se une específicamente a un epítopo dentro de los residuos 40-55 de alfa-sinucleína; en donde si la PS129 alfa-sinucleína está presente en la muestra, el anticuerpo de captura y el anticuerpo reportero se unen a la PS129 alfa-sinucleína, lo que forma un complejo sándwich; y detectar el anticuerpo reportero que se une a la PS129 alfa-sinucleína en la etapa (a), si lo hay, para indicar la presencia o ausencia de la PS129 alfa-sinucleína.
Opcionalmente, el anticuerpo de captura es 11A5 y el anticuerpo reportero es 23E8. Opcionalmente, el anticuerpo de captura se une al soporte mediante un enlazador. Opcionalmente, el método comprende además eluir el anticuerpo reportero del complejo sándwich antes de detectar el anticuerpo reportero. Opcionalmente, el anticuerpo reportero se marca con fluorescencia y se detecta mediante recuento de una sola molécula. Opcionalmente, la muestra se pone en contacto con el anticuerpo de captura, el anticuerpo de captura se une a PS129 alfa-sinucleína, el anticuerpo de captura unido a PS129 alfa-sinucleína se separa de otros componentes de la muestra y se resuspende en solución, que se pone en contacto con el anticuerpo reportero, que se une a la PS129 alfa-sinucleína, lo que forma el complejo sándwich, que se separa de otros componentes de la solución resuspendida, y el anticuerpo reportero se eluye del complejo sándwich y se detecta. Opcionalmente, el método se realiza cualitativamente. Opcionalmente, el método se realiza cuantitativamente para indicar una cantidad absoluta o relativa de la PS129 alfa-sinucleína. Opcionalmente, la muestra contiene guanidina 0,1-1,0 M. Opcionalmente, la muestra contiene guanidina 0,5 M. Opcionalmente, el anticuerpo de captura se une a una fase sólida antes de la etapa de contacto. Opcionalmente, la fase sólida son perlas magnéticas. Opcionalmente, el anticuerpo de captura se une a perlas magnéticas, que se separan del resto de la muestra o solución resuspendida mediante la aplicación de un campo magnético.
Opcionalmente, el método comprende además comparar una señal del anticuerpo reportero con una señal del anticuerpo reportero en una muestra de control que contiene una cantidad conocida de PS129 alfa-sinucleína para determinar la cantidad de PS129 alfa-sinucleína en la muestra. Opcionalmente, el método comprende además comparar una señal del anticuerpo reportero de una curva de calibración de la señal frente a la cantidad de PS129 alfa-sinucleína para determinar la cantidad de PS129 alfa-sinucleína en la muestra. Opcionalmente, una señal del anticuerpo reportero es proporcional a la cantidad de PS129 alfa-sinucleína en la muestra. Opcionalmente, el método comprende además poner en contacto el anticuerpo reportero con un anticuerpo marcado para generar una señal que indique la presencia del anticuerpo reportero y, por lo tanto, la presencia de PS129 alfa-sinucleína en la muestra. Opcionalmente, el método comprende además determinar un nivel de alfa-sinucleína total o alfa-sinucleína no fosforilada en la muestra y calcular una relación entre el nivel de alfa-sinucleína fosforilada y el nivel de alfa-sinucleína total o alfa-sinucleína no fosforilada.
Opcionalmente, la muestra se diluye en diluyente estándar Singulex que comprende Triton X-405 al 0,1 %. Opcionalmente, la muestra es una muestra de un ser humano. Opcionalmente, la muestra es de un ratón transgénico con un transgén que expresa la alfa-sinucleína humana. Opcionalmente, la muestra es un fluido corporal. Opcionalmente, la muestra es líquido cefalorraquídeo (LCR) de un ser humano. Opcionalmente, la muestra de LCR se diluye 1:4 en diluyente estándar Singulex que comprende Triton X-405 al 0,1 %. Opcionalmente, no hay reactividad cruzada con el monómero de sinucleína hasta 500 pg/mL. Opcionalmente, la muestra de LCR comprende <500 ng/mL de hemoglobina. Opcionalmente, la muestra de LCR comprende de 200 ng/mL a 500 ng/mL de hemoglobina. Opcionalmente, la muestra de LCR comprende <200 ng/mL de hemoglobina.
Opcionalmente, la muestra es un homogeneizado de cerebro de un animal humano o transgénico. Opcionalmente, la muestra es un medio usado para el cultivo de células. Opcionalmente, las células expresan alfa-sinucleína humana recombinante. Opcionalmente, el método detecta la presencia de PS129 alfa-sinucleína a un nivel de 0,1 pg/mL. Opcionalmente, el método detecta la presencia de PS129 alfa-sinucleína a un nivel de al menos 0,4 pg/mL. Opcionalmente, la presencia de PS129-alfa-sinucleína se usa para diagnosticar a un sujeto del que se obtuvo la muestra con la enfermedad con cuerpos de Lewy.
Algunos métodos se realizan varias veces en un sujeto con enfermedad con cuerpos de Lewy, en donde la cantidad de PS129 alfa-sinucleína disminuye con el tiempo, lo que indica una gravedad reducida de la enfermedad con cuerpos de Lewy. Opcionalmente, el método se realiza varias veces en un sujeto con enfermedad con cuerpos de Lewy, en donde la cantidad de PS129 alfa-sinucleína aumenta con el tiempo, lo que indica una mayor gravedad de la enfermedad con cuerpos de Lewy. Opcionalmente, el sujeto recibe inmunoterapia para la enfermedad con cuerpos de Lewy.
La invención proporciona además un kit que comprende un par de anticuerpos, en donde los anticuerpos son el anticuerpo 11A5 que tiene el número de acceso ATCC PTA-8222 y un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un epítopo dentro de los residuos 40-55 de alfa-sinucleína que comprende los CDR de Kabat de 23E8 (Número de acceso ATCC PTA-122711). Opcionalmente, el anticuerpo monoclonal 23E8 es quimérico, remodelado o humanizado.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra la sensibilidad de la detección de 11A5 como el anticuerpo de captura y 23E8 como el anticuerpo reportero con diferentes cantidades del anticuerpo de captura en los pocillos.
Las Figuras 2A-C: muestran la determinación, en un ensayo que usa diluyente estándar Singulex, de una curva de calibración que relaciona la señal con la concentración de PS129 alfa-sinucleína (A) Curva estándar de 12 puntos de PS129 alfa-sinucleína, B gráfico de valores reales de gama baja (promedio de detección de eventos) y C, gráfico lineal.
Las Figuras 3A-C muestran la determinación, en un ensayo que usa diluyente estándar Singulex que comprende Triton X-405 al 0,1 %, de una curva de calibración que relaciona la señal con la concentración de PS129 alfa-sinucleína (A) Curva estándar de 12 puntos de PS129 alfa-sinucleína, B gráfico de valores reales de gama baja (promedio de detección de eventos) y C, gráfico lineal.
Definiciones
La frase que un anticuerpo "se une específicamente" a una diana se refiere a una reacción de unión que es determinante de la presencia del anticuerpo en la presencia de una población heterogénea de otros productos biológicos. Por tanto, bajo las condiciones de inmunoensayo designadas, una molécula específica se une preferentemente a una diana particular y no se une en una cantidad significativa a otros productos biológicos presentes en la muestra. La unión específica de un anticuerpo a una diana bajo tales condiciones requiere que se seleccione el anticuerpo por su especificidad para la diana. La unión específica entre dos entidades significa una afinidad de al menos 106, 107, 108, 109 o 1010 M-1. Se prefieren las afinidades mayores que 108 M-1. La falta de unión específica significa la unión a una diana indistinguible de un anticuerpo de control irrelevante y/o una afinidad menor de 106 M-1.
El término "anticuerpo" incluye anticuerpos intactos y fragmentos de unión de los mismos. Típicamente, los fragmentos compiten con el anticuerpo intacto del que se derivaron por la unión específica a un fragmento de antígeno, que incluye las cadenas pesadas separadas, las cadenas ligeras Fab, Fab', F(ab')2, Fabc y Fv. Los fragmentos se producen mediante técnicas de ADN recombinante, o mediante separación enzimática o química de inmunoglobulinas intactas. El término "anticuerpo" también incluye una o más cadenas de inmunoglobulina que se conjugan químicamente a, o se expresan como, proteínas de fusión con otras proteínas. El término "anticuerpo" también incluye anticuerpo biespecífico. Un anticuerpo biespecífico o bifuncional es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadenas pesadas/ligeras diferentes y dos sitios de unión diferentes. Los anticuerpos biespecíficos pueden producirse mediante una variedad de métodos que incluyen la fusión de hibridomas o la unión de fragmentos Fab'. Ver, por ejemplo, Songsivilai y Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny y otros, J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992).
Los anticuerpos de la descripción son típicamente sustancialmente puros de contaminantes no deseados. Esto significa que un agente es típicamente al menos aproximadamente un 50 % p/p (peso/peso) de pureza, así como sustancialmente libre de proteínas y contaminantes que interfieren. Algunas veces los anticuerpos son al menos aproximadamente un 80 % p/p y, con mayor preferencia al menos 90 o aproximadamente 95 % p/p de pureza. Sin embargo, mediante el uso de técnicas convencionales de purificación de proteínas, pueden obtenerse anticuerpos homogéneos de al menos 99 % p/p.
El término "epítopo" o "determinante antigénico" se refiere a un sitio en un antígeno al que responden las células B y/o T. Los epítopos de células B puede formarse ambos de aminoácidos contiguos o aminoácidos no contiguos yuxtapuestos mediante el plegamiento terciario de una proteína. Los epítopos formados de aminoácidos contiguos o aminoácidos modificados postraduccionalmente se retienen típicamente en la exposición a solventes desnaturalizantes mientras que los epítopos formados mediante el plegamiento terciario se pierden típicamente en el tratamiento con solventes desnaturalizantes. Un epítopo incluye típicamente al menos 3, pero generalmente hablando de 5 a 10 aminoácidos en una conformación espacial única. Los métodos de determinación de la conformación espacial de epítopos incluyen, por ejemplo, la cristalografía de rayos X y la resonancia magnética nuclear bidimensional. Ver, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols en Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996). Los anticuerpos que reconocen el mismo epítopo pueden identificarse en un inmunoensayo simple que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno diana.
El término "fluido corporal" se refiere a aquellos fluidos de un mamífero huésped que se sospecha que contienen cantidades medibles de alfa-sinucleína o fragmentos de la misma, que incluyen específicamente sangre, líquido cefalorraquídeo (LCR), orina y líquido peritoneal. El término "sangre" se refiere a la sangre completa, así como a al plasma sanguíneo y suero.
Una enfermedad sinucleinopática significa una enfermedad caracterizada por cuerpos de Lewy, neuritas de Lewy u otros depósitos de alfa-sinucleína.
El ensayo cualitativo detecta la presencia o ausencia de un analito. Un ensayo cuantitativo detecta no solo la presencia o ausencia del analito sino que si está presente proporciona una cantidad absoluta o relativa del analito.
La inmunoterapia contra alfa-sinucleína significa inducir una respuesta inmune activa o pasiva contra alfa-sinucleína, tal como mediante la administración de un péptido de alfa-sinucleína inmunogénico para inducir un anticuerpo contra alfa-sinucleína o la administración de un anticuerpo contra alfa-sinucleína.
Las composiciones o métodos que "comprenden" uno o más elementos enumerados pueden incluir otros elementos no enumerados específicamente. Por ejemplo, una composición que comprende un péptido de alfa-sinucleína abarca tanto un péptido de alfa-sinucleína aislado y un péptido de alfa-sinucleína como un componente de una secuencia polipeptídica mayor.
Descripción detallada
La invención proporciona métodos para detectar PS129 alfa-sinucleína en muestras. Debido a que la PS129 alfasinucleína constituye típicamente sólo una pequeña fracción de la alfa-sinucleína total en tales muestras, una alta sensibilidad de detección por debajo de picomolar es ventajosa.
I. Anticuerpos usados en la detección
La invención proporciona métodos para detectar alfa-sinucleína mediante el uso de un anticuerpo de captura y un anticuerpo reportero. El anticuerpo de captura se une específicamente a la alfa-sinucleína de longitud completa fosforilada en el residuo 129 (PS129 alfa-sinucleína). El anticuerpo carece de unión específica a la alfa-sinucleína no fosforilada. El anticuerpo 11A5 es un ejemplo de un anticuerpo de captura adecuado.
El anticuerpo reportero se une a un epítopo dentro de los residuos 40-55 de alfa-sinucleína. El anticuerpo 23E8 es un ejemplo de un anticuerpo de este tipo. Se usan otros diversos anticuerpos como controles en los ejemplos.
La línea celular designada JH22.11A5.6.29.70.54.16.14, que produce el anticuerpo 11A5 que tiene el número de acceso ATCC PTA-8222, se ha depositado el 26 de febrero de 2007 en la ATCC. La línea celular designada JH19.23E8.2.32.22, que produce el anticuerpo 23E8 que tiene el número de acceso ATCC PTA-122711, se ha depositado el 9 de diciembre de 2015 en la ATCC. La descripción proporciona además formas humanizadas y quiméricas de monoclonales de ratón, particularmente las descritas anteriormente.
Cuando se dice que un anticuerpo se une a un epítopo dentro de residuos específicos, tal como la alfa-sinucleína 40­ 55, por ejemplo, lo que significa es que el anticuerpo se une específicamente a un polipéptido que consiste de los residuos especificados (es decir, la alfa-sinucleína 40-55 en este ejemplo). Tal anticuerpo no se pone en contacto necesariamente con todos los residuos de la alfa-sinucleína 40-55. Tampoco cada sustitución o deleción de un aminoácido dentro de la alfa-sinucleína 40-55 afecta necesariamente de manera significativa la afinidad de unión. La especificidad del epítopo de un anticuerpo puede determinarse, por ejemplo, mediante la evaluación de una colección de péptidos superpuestos de aproximadamente 15 aminoácidos que abarcan la secuencia de la alfa-sinucleína y difieren en incrementos de un pequeño número de aminoácidos (por ejemplo, 3 aminoácidos). Los péptidos se inmovilizan dentro de los pocillos de una placa de microtitulación. La inmovilización puede efectuarse mediante la biotinilación de un extremo de los péptidos. Opcionalmente, diferentes muestras del mismo péptido pueden biotinilarse en los extremos N y C e inmovilizarse en pocillos separados con fines de comparación. Lo cual es particularmente útil para identificar los anticuerpos específicos de extremos. Un anticuerpo se criba para la unión específica a cada uno de los diversos péptidos. El epítopo se define como el que ocurre dentro de un segmento de aminoácidos que es común a todos los péptidos a los que el anticuerpo muestra unión específica.
i. Características generales de las inmunoglobulinas
Se conoce que la unidad estructural básica del anticuerpo comprende un tetrámero de subunidades. Cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, cada par tiene una cadena "ligera" (aproximadamente de 25 kDa) y una cadena "pesada" (aproximadamente de 50-70 kDa). La porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento del antígeno. La porción carboxi-terminal de cada cadena define una región constante principalmente responsable de la función efectora.
Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta, o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes están unidas mediante una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, con la cadena pesada que también incluye una región "D" de aproximadamente 10 o más aminoácidos. (Ver en general, Fundamental Immunology, Paul, W., ed., 2a Edición Raven Press, N.Y., 1989, Cap. 7.
Las regiones variables de cada par de cadenas ligera/pesada forman el sitio de unión del anticuerpo. Por tanto, un anticuerpo intacto tiene dos sitios de unión. Excepto en los anticuerpos bifuncionales o biespecíficos, los dos sitios de unión son lo mismo. Todas las cadenas exhiben la misma estructura general de regiones marco relativamente conservadas (FR) unidas mediante tres regiones hipervariables, también llamadas regiones determinantes de la complementariedad o CDR. Las CDR de las dos cadenas de cada par están alineadas mediante las regiones marco, lo que permite la unión a un epítopo específico. Desde el extremo N-terminal al C-terminal, tanto la cadena ligera como la pesada comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos para cada dominio está de acuerdo con las definiciones de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 y 1991); Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); o Chothia y otros, Nature 342:878-883 (1989).
ii. Producción de anticuerpos no humanos
Pueden producirse anticuerpos de ratón u otros anticuerpos no humanos mediante la tecnología de hibridoma convencional. La especificidad de unión deseada puede impartirse mediante la selección del inmunógeno y/o el método de cribado. Para generar anticuerpos con una especificidad de epítopo entre los residuos 40 y 55, puede usarse un fragmento de la alfa-sinucleína que consiste de estos residuos (es decir, 40-55) un inmunógeno o un fragmento más largo que incluya estos residuos hasta la alfa-sinucleína de longitud completa. Los anticuerpos pueden cribarse mediante la unión a péptidos superpuestos como se describió anteriormente. Para la producción de un anticuerpo que se une preferentemente a la PS129 alfa-sinucleína puede usarse como el inmunógeno la PS129 alfasinucleína de longitud completa o un fragmento de la misma que incluye el residuo 129 y residuos suficientes a ambos lados para constituir un epítopo (por ejemplo, de 3-15 residuos contiguos que incluyen el residuo 129). Los anticuerpos se criban para la unión preferencial a la PS129 alfa-sinucleína frente a la alfa-sinucleína no fosforilada.
Los anticuerpos quiméricos y humanizados tienen la misma o similar especificidad y afinidad de unión que un anticuerpo de ratón u otro no humano que proporciona el material de partida para la construcción de un anticuerpo quimérico o humanizado. Los anticuerpos quiméricos son anticuerpos cuyos genes de cadena ligera y pesada se han construido, típicamente mediante ingeniería genética, a partir de segmentos de genes de inmunoglobulinas que pertenecen a diferentes especies. Por ejemplo, puede secuenciarse el ADN que codifica los dominios variables de un anticuerpo de ratón, y pueden construirse las construcciones de ADN que codifican los dominios variables unidos a segmentos humanos constantes (C), tales como IgG1 e IgG4. Se prefiere que las construcciones se expresen entonces para producir el anticuerpo humano isotipo IgG1. En algunos métodos, el isotipo del anticuerpo es IgG1 humana. Los anticuerpos IgM también pueden usarse en algunos métodos. Por tanto un anticuerpo quimérico típico es una proteína híbrida que consiste del dominio V o de unión al antígeno de un anticuerpo de ratón y el dominio C o efector de un anticuerpo humano.
Los anticuerpos humanizados tienen residuos del marco de la región variable sustancialmente de un anticuerpo humano o consenso de anticuerpos humanos (denominado anticuerpo aceptor) y algunas y normalmente las seis regiones determinantes de complementariedad sustancial o totalmente de un anticuerpo de ratón, (denominado como la inmunoglobulina donante). Ver, Queen y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989), WO 90/07861, la patente de EE.UU. No. 5,693,762, la patente de EE.UU. No. 5,693,761, la patente de EE.UU. No. 5,585,089, la patente de EE.UU. No. 5,530,101, y Winter, la patente de EE.UU. No. 5,225,539. La región o regiones constantes, si están presentes, también son sustancial o totalmente de una inmunoglobulina humana. Los dominios variables humanos se eligen normalmente a partir de anticuerpos humanos cuyas secuencias marco exhiben un alto grado de identidad de secuencia con los dominios de la región variable murina de los que se derivan las CDR. Los residuos del marco de la región variable de las cadenas pesada y ligera pueden derivarse de la misma o de diferentes secuencias de anticuerpos humanos. Las secuencias de anticuerpos humanos pueden ser las secuencias de anticuerpos humanos naturales o pueden ser secuencias consenso de varios anticuerpos humanos. Ver Carter y otros, documento WO 92/22653. Se seleccionan ciertos aminoácidos de los residuos del marco de la región variable humana para la sustitución en base a su posible influencia en la conformación de la CDR y/o unión al antígeno. La investigación de tales posibles influencias es mediante el modelado, el examen de las características de los aminoácidos en ubicaciones particulares, o la observación empírica de los efectos de la sustitución o mutagénesis de aminoácidos particulares.
Por ejemplo, cuando un aminoácido difiere entre un residuo del marco de la región variable murina y un residuo del marco de la región variable humana seleccionada, el aminoácido del marco humano debería sustituirse normalmente por el aminoácido del marco equivalente del anticuerpo de ratón cuando se espera razonablemente que el aminoácido: (1) se une directamente de forma no covalente al antígeno, (2) es adyacente a una región CDR, (3) de cualquier otra manera interactúa con una región CDR (por ejemplo, está dentro de aproximadamente 6 A de una región CDR), o (4) participa en la interfaz VL-VH.
Otros candidatos para la sustitución son los aminoácidos aceptores del marco humanos que son inusuales para una inmunoglobulina humana en esa posición. Estos aminoácidos pueden sustituirse con aminoácidos de la posición equivalente del anticuerpo donante de ratón o de las posiciones equivalentes de inmunoglobulinas humanas más típicas. Otros candidatos para la sustitución son los aminoácidos aceptores del marco humanos que son inusuales para una inmunoglobulina humana en esa posición. Los marcos de la región variable de las inmunoglobulinas humanizadas normalmente muestran al menos un 85 % de identidad de secuencia con una secuencia del marco de la región variable humana o consenso de tales secuencias.
iii. Anticuerpos humanos
Los anticuerpos humanos contra la alfa-sinucleína se proporcionan mediante una variedad de técnicas descritas a continuación. Los anticuerpos humanos también pueden cribarse para la especificidad hacia un epítopo particular mediante el uso de solo un fragmento de alfa-sinucleína como el inmunógeno, y/o mediante el cribado de anticuerpos frente a una colección de mutantes por deleción de la alfa-sinucleína. Los anticuerpos humanos tienen preferentemente IgG1 humana de especificidad de isotipo. Varios métodos están disponibles para la producción de anticuerpos humanos, incluido el método del trioma, Oestberg y otros, Hybridoma 2:361-367 (1983); Oestberg, patente de EE.UU. No. 4,634,664; y Engleman y otros, patente de EE.UU. No. 4,634,666; mamíferos no humanos transgénicos descritos en detalle mediante, por ejemplo, Lonberg y otros, el documento WO93/1222, la patente de EE.UU. No.
5,877,397, la patente de EE.UU. No. 5,874,299, la patente de EE.UU. No. 5,814,318, la patente de EE.UU. No.
5,789,650, la patente de EE.UU. No. 5,770,429, la patente de EE.UU. No. 5,661,016, la patente de EE.UU. No.
5,633,425, la patente de EE.UU. No. 5,625,126, la patente de EE.UU. No. 5,569,825, la patente de EE.UU. No.
5,545,806, Nature 148, 1547-1553 (1994)), Nature Biotechnology 14, 826 (1996), Kucherlapati, el documento WO 91/10741; y métodos de presentación de fagos Ver, por ejemplo, Dower y otros, el documento WO 91/17271 y McCafferty y otros, el documento WO 92/01047, la patente de EE.UU. No. 5,877,218, la patente de EE.UU. No.
5,871,907, la patente de EE.UU. No. 5,858,657, la patente de EE.UU. No. 5,837,242, la patente de EE.UU. No.
5,733,743 y la patente de EE.UU. No. 5,565,332.
iv. Selección de la región constante
Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de anticuerpos quiméricos, humanizados o humanos pueden unirse a al menos una porción de una región constante humana. La elección de la región constante depende, en parte, de si se desea el complemento dependiente de anticuerpos y/o una toxicidad mediada por células. Por ejemplo, los isotipos IgG1 e IgG3 tienen actividad complementaria y los isotipos IgG2 e IgG4 no. La elección del isotipo también puede afectar el paso del anticuerpo al cerebro. Se prefiere el isotipo IgG1 humano. Las regiones constantes de la cadena ligera pueden ser lambda o kappa. Los anticuerpos pueden expresarse como tetrámeros que contienen dos cadenas ligeras y dos pesadas, como cadenas pesadas separadas, cadenas ligeras, como Fab, Fab', F(ab')2, y Fv, o como anticuerpos de cadena simple en los que los dominios variables de las cadenas pesada y ligera están unidos a través de un espaciador.
v. Expresión de anticuerpos recombinantes
Los anticuerpos quiméricos, humanizados y humanos se producen típicamente mediante expresión recombinante. Las construcciones de polinucleótidos recombinantes incluyen típicamente una secuencia de control de la expresión operativamente unida a las secuencias codificantes de las cadenas de anticuerpos, que incluyen las regiones promotoras asociadas naturalmente o heterólogas. Preferentemente, las secuencias de control de la expresión son sistemas promotores eucariotas en vectores capaces de transformar o transfectar células huésped eucariotas. Una vez que el vector se ha incorporado en el huésped apropiado, el huésped se mantiene bajo condiciones adecuadas para la expresión a alto nivel de las secuencias de nucleótidos, y la recolección y purificación de los anticuerpos de reactividad cruzada.
Estos vectores de expresión son típicamente replicables en los organismos huésped como episomas o como una parte integral del ADN cromosómico del huésped. Comúnmente, los vectores de expresión contienen marcadores de selección, por ejemplo, resistencia a ampicilina o resistencia a higromicina, para permitir la detección de aquellas células transformadas con las secuencias de ADN deseadas.
E. coli es un huésped procariota particularmente útil para el clonaje de las secuencias de ADN de la presente descripción. Los microbios, tales como la levadura, también son útiles para la expresión. Saccharomyces es un huésped de levadura preferido, con vectores adecuados que tienen secuencias de control de la expresión, un origen de replicación, secuencias de terminación y similares según se desee. Los promotores típicos incluyen la 3-fosfoglicerato quinasa y otras enzimas glicolíticas. Los promotores de levadura inducibles incluyen, entre otros, promotores de alcohol deshidrogenasa, isocitocromo C y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa.
Las células de mamífero son un huésped preferido para expresar segmentos de nucleótidos que codifican inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas. Ver Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987). Se han desarrollado en la técnica varias líneas celulares huésped capaces de secretar proteínas heterólogas intactas, e incluyen líneas celulares CHO, diversas líneas celulares c Os , células HeLa, células L, células de riñón de embrión humano, y líneas celulares de mieloma. Preferentemente, las células no son humanas. Los vectores de expresión para estas células pueden incluir secuencias de control de la expresión, tales como un origen de replicación, un promotor, un potenciador (Queen y otros, Immunol. Rev. 89:49 (1986)), y los sitios necesarios de procesamiento de la información, tales como sitios de unión a ribosomas, sitios de corte y empalme del ARN, sitios de poliadenilación, y secuencias terminadoras de la transcripción. Las secuencias de control de la expresión preferidas son promotores derivados de genes endógenos, citomegalovirus, SV40, adenovirus, papilomavirus bovino y similares. Ver Co y otros, J. Immunol. 148:1149 (1992).
Alternativamente, las secuencias codificantes de anticuerpos pueden incorporarse en transgenes para su introducción en el genoma de un animal transgénico y su posterior expresión en la leche del animal transgénico (ver, por ejemplo, la patente de EE. UU. No. 5,741,957, la patente de EE. UU. No. 5,304,489, la patente de EE. UU. No. 5,849,992). Los transgenes adecuados incluyen secuencias codificantes para cadenas ligeras y/o pesadas en unión operable con un promotor y potenciador de un gen específico de la glándula mamaria, tal como caseína o beta lactoglobulina.
Los vectores que contienen los segmentos de ADN de interés pueden transferirse a la célula huésped mediante métodos bien conocidos, en dependencia del tipo de huésped celular. Por ejemplo, la transfección con cloruro de calcio se utiliza comúnmente para células procarióticas, mientras que el tratamiento con fosfato de calcio, electroporación, lipofección, biolística o transfección basada en virus pueden usarse para otros huéspedes celulares. Otros métodos usados para transformar células de mamíferos incluyen el uso de polibreno, fusión de protoplastos, liposomas, electroporación y microinyección (ver en general, Sambrook y otros, supra). Para la producción de animales transgénicos, los transgenes pueden microinyectarse en ovocitos fertilizados, o pueden incorporarse al genoma de células madre embrionarias, y los núcleos de tales células transferirse a ovocitos enucleados.
Una vez expresados, los anticuerpos pueden purificarse de acuerdo con los procedimientos estándar de la técnica, que incluyen la purificación por Hp l C, la cromatografía en columna, y la electroforesis en gel y similares (ver en general, Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982).
II. Alfa-sinucleína
La alfa-sinudeína se identificó originalmente en cerebros humanos como la proteína precursora del componente no pamiloide de (NAC) de las placas de la EA. (Ueda y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (23):11282-11286 (1993)). La alfa-sinucleína, también denominada el precursor del componente n-Ap de la EA amiloide (NACP), es un péptido de 140 aminoácidos. La alfa-sinucleína de longitud completa tiene la secuencia de aminoácidos:
(SEQ ID NO: 1)
MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVLYVGSKTKEGVVH GVATVAEKTKE QVTNVGGAVVT GVTAVAQ KTVEGAGSIAAATGFVKKDQL GKNEEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMPSEEGYQDYEPEA (Ueda y otros, Ibid.; número de acceso a GenBank: P37840).
A menos que se indique de cualquier otra manera, la referencia a la alfa-sinucleína significa la secuencia de aminoácidos humana natural indicada anteriormente así como las variantes alélicas y de especies naturales de la misma, que incluyen las formas completas y los fragmentos de las mismas que se encuentran en las muestras que son analizadas, así como las formas que se han sometido a una modificación postraduccional, tal como la fosforilación. Los fragmentos o variantes de alfa-sinucleína se numeran como en las secuencias ejemplificadas tal que a los residuos alineados se les asigna el mismo número.
III. Ensayos para detectar alfa sinucleína
La alfa-sinucleína se puede detectar mediante inmunoensayos en sándwich (ver Patentes de EE.UU. Nos. 4,376,110, 4,486,530, 5,914,241, y 5,965,375) en el que un anticuerpo se inmoviliza en una fase sólida (anticuerpo de captura) y otro anticuerpo en solución (anticuerpo reportero). Típicamente, el anticuerpo reportero se marca, ya sea directamente o mediante un reactivo de marcaje secundario, tal como un anticuerpo antiidiotípico. Los anticuerpos de captura y reportero tienen diferentes especificidades de unión, por lo que ambos pueden unirse a la alfa-sinucleína al mismo tiempo. Los anticuerpos de captura y reportero pueden ponerse en contacto con el antígeno diana en cualquier orden o simultáneamente. Si primero se pone en contacto el anticuerpo de captura, el ensayo se denomina ensayo directo. Por el contrario, si se pone en contacto primero con el anticuerpo reportero, el ensayo se denomina ensayo inverso. Si la diana entra en contacto con ambos anticuerpos simultáneamente, el ensayo se denomina ensayo simultáneo. Después de poner en contacto la diana con el anticuerpo, se incuba una muestra durante un período que puede variar de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 24 horas, pero típicamente es de aproximadamente 1-2 horas. Se puede realizar una etapa de lavado para eliminar componentes de la muestra que no se unan específicamente a la fase sólida. Cuando los anticuerpos de captura y reportero se unen en etapas separadas, se puede realizar un lavado después de una o ambas etapas de unión. Después del lavado, se detecta el anticuerpo reportero. El anticuerpo reportero puede detectarse mientras forma parte de un complejo sándwich de anticuerpo de captura, anticuerpo reportero de PS129 alfa-sinucleína o después de la elución de dicho complejo sándwich. El anticuerpo reportero se puede marcar directa o indirectamente mediante un anticuerpo marcado secundario que se une al anticuerpo reportero. Normalmente, para un par dado de anticuerpos de captura y reportero, se prepara una curva de calibración a partir de muestras que contienen concentraciones conocidas del antígeno diana. Las concentraciones del antígeno en las muestras que se analizan se leen luego mediante interpolación de la curva de calibración. El analito se puede medir a partir de la cantidad de anticuerpo reportero marcado que se une en el equilibrio o mediante mediciones cinéticas del anticuerpo en solución marcado unido en una serie de puntos de tiempo antes de que se alcance el equilibrio. La pendiente de dicha curva es una medida de la concentración de la diana en una muestra. Alternativamente, la cantidad de alfa-sinucleína en una muestra se puede determinar mediante la comparación de la señal del anticuerpo reportero de la unión a la alfa-sinucleína de la muestra con la señal del anticuerpo reportero de la unión a una cantidad conocida de alfa-sinucleína en una muestra de control.
Los marcadores detectables adecuados para su uso en los métodos anteriores incluyen cualquier resto que sea detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos, químicos u otros. Por ejemplo, los marcadores adecuados incluyen biotina para teñir con conjugado de estreptavidina marcado, tintes fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína, rojo Texas, rodamina, proteína verde fluorescente y similares), radiomarcadores (por ejemplo, 3H, 125I, 35S, 14C o 32P), enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y otras comúnmente usadas en un ELISA) y marcadores colorimétricos tales como oro coloidal o vidrio o plástico coloreado (por ejemplo, poliestireno, polipropileno, perlas de látex). Las patentes que describen el uso de tales marcadores incluyen las Patentes de EE.UU. Nos. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149; y 4,366,241. Ver también Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6ta edición, Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregónon.). Los radiomarcadores pueden detectarse mediante el uso de una película fotográfica o contadores de centelleo, los marcadores fluorescentes pueden detectarse mediante el uso de un fotodetector para detectar la luz emitida. Los marcadores enzimáticos se detectan típicamente al proporcionar a la enzima un sustrato y mediante la detección del producto de reacción producido por la acción de la enzima sobre el sustrato, y los marcadores colorimétricos se detectan mediante la visualización simple del marcador coloreado.
Los soportes adecuados para el uso en los métodos anteriores incluyen, por ejemplo, membranas de nitrocelulosa, membranas de nailon y membranas de nailon derivatizado, y también partículas, tales como agarosa, un gel a base de dextrano, varillas, partículas, microesferas, partículas magnéticas, tubos de ensayo, pocillos de microtitulación, SEPHADEX™ (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway NJ y similares. La inmovilización puede ser mediante absorción o por unión covalente. Opcionalmente, los anticuerpos pueden unirse a una molécula enlazadora, tal como biotina para unirse a una superficie.
Los solventes usados para extraer la alfa-sinucleína de muestras de tejido pueden disminuir la sensibilidad del ensayo (por ejemplo, guanidina 5 M, urea/tiourea/CHAPS, urea/tiourea, SDS al 1 %, SDS al 1 %/8 M, tampón de lisis celular). Se recomienda que tales solventes se eliminen o diluyan tal que representen menos del 1 % y preferentemente menos del 0,1 % del tampón usado para el ensayo.
El par de anticuerpos monoclonales para usar en un ensayo sándwich son un anticuerpo específico para PS129 alfasinucleína como el anticuerpo de captura y un anticuerpo que se une a un epítopo dentro de los residuos 40-55 de alfa-sinucleína como anticuerpo reportero. Dichos anticuerpos detectan la alfa-sinucleína fosforilada en la serina 129. Tales anticuerpos también detectan fragmentos de alfa-sinucleína que incluyen los residuos 40-55 y 129 y cualquier residuo adicional que complete el epítopo del anticuerpo específico para PS129 alfa-sinucleína. Por ejemplo, si el anticuerpo de captura se une a un epítopo de 127-131, se detectarían fragmentos que incluyen al menos del residuo 40 al residuo 131 de alfa-sinucleína.
La señal del ensayo reportero normalmente se puede atribuir a la PS-129 alfa-sinucleína de longitud completa y al fragmento o fragmentos de la misma presentes en la muestra como se indicó anteriormente. Por tanto, cuando se dice que el ensayo detecta la presencia o una cantidad de PS129 alfa-sinucleína, la PS129 alfa-sinucleína puede ser de longitud completa o fragmentos o ambos. Típicamente la señal no se resuelve entre la PS-129 alfa-sinucleína de longitud completa y sus fragmentos, pero sus respectivas contribuciones se pueden resolver mediante la elución del complejo sándwich y al someterlo a análisis adicionales, tales como por espectrometría de masas o electroforesis en gel o mapeo con otros anticuerpos.
Una implementación preferida del método tiene el anticuerpo de captura, preferiblemente 11A5, inmovilizado sobre partículas magnéticas, opcionalmente a través de un enlazador, tal como biotina. La muestra se pone en contacto primero con el anticuerpo de captura, que se une a la PS129 alfa-sinucleína (si está presente) en la muestra. Los complejos formados (si está presente la PS129 alfa-sinucleína) se pueden separar del resto de la muestra, incluidas las proteínas no unidas y otros contaminantes, mediante la aplicación de un campo magnético. Después de la separación y opcionalmente el lavado, los complejos de anticuerpo de captura-PS129 alfa-sinucleína unidos a las perlas se resuspenden en una solución nueva. A continuación, se suministra el anticuerpo reportero, preferiblemente 23E8. El anticuerpo reportero preferiblemente lleva un marcador fluorescente. El anticuerpo reportero se une a los complejos de anticuerpo de captura-PS129 alfa-sinucleína (si PS129 alfa-sinucleína está presente en la muestra) al completar el sándwich de anticuerpo de captura PS129 alfa-sinucleína y anticuerpo reportero. A continuación, el complejo sándwich se saca de la suspensión mediante la reaplicación del campo magnético. Los complejos se pueden lavar opcionalmente para eliminar cualquier reportero marcado no unido. El anticuerpo reportero se eluye de los complejos sándwich y se detecta. Preferiblemente, la detección se realiza mediante una técnica de recuento de una sola molécula, tal como una en la que las moléculas fluorescentes cruzan un rayo láser en una trayectoria de flujo capilar y se registran señales fluorescentes individuales (J Clin Invest. 2015; 125(5): 1979-1986. doi: 10.1172/JCI80743) Un formato preferido para esta tecnología es el sistema de inmunoensayo Erenna® (EMD Millipore, Billerica, MA).
En algunos métodos, la PS129 alfa-sinucleína estándar y la muestra se diluyen en diluyente estándar Singulex que comprende solución salina tamponada con fosfato y albúmina de suero bovino (BSA) al 0,1 %. En algunos métodos, la PS129 alfa-sinucleína estándar y la muestra se diluyen en diluyente estándar Singulex modificado que comprende solución salina tamponada con fosfato, albúmina de suero bovino (BSA) al 0,1 % y Triton X-405 al 0,1 %. En algunos métodos, se usa un tampón de ensayo Singulex que comprende el cóctel SMC Blocker, Triton X-100 al 0,3 % y NaCl 150 mM para diluir los anticuerpos y las partículas magnéticas. Se describen tampones ilustrativos en la Patente de Estados Unidos 7,572,640.
Algunos métodos también determinan la alfa-sinucleína total o la alfa-sinucleína no fosforilada para calcular una relación de alfa-sinucleína fosforilada a alfa-sinucleína total o alfa-sinucleína no fosforilada. La alfa-sinucleína total se refiere a la alfa-sinucleína independientemente del estado de fosforilación. Debido a que la PS129 alfa-sinucleína normalmente contribuye con menos del 10 % en masa o moles de la alfa-sinucleína total, los niveles de alfa-sinucleína total y alfa-sinucleína no fosforilada no suelen ser materialmente diferentes. La alfa-sinucleína total puede detectarse mediante cualquier método, incluidos los métodos descritos por el documento US 7,674,599. Opcionalmente, la detección se realiza con un par de anticuerpos que tienen una especificidad de epítopo igual o similar a la de los anticuerpos usados para detectar la PS129 alfa-sinucleína. Puede usarse la misma especificidad de anticuerpo reportero (es decir, la unión a un epítopo dentro de los residuos 40-55 de alfa-sinucleína. El anticuerpo de captura también puede unirse al mismo o similar epítopo (por ejemplo, un epítopo lineal que se extiende, adyacente o próximo al residuo 129) como el anticuerpo de captura usado para detectar PS129 alfa-sinucleína, pero no debe unirse preferentemente a PS129 alfa-sinucleína sobre la alfa-sinucleína no fosforilada. El anticuerpo puede unirse o no preferencialmente a la alfa-sinucleína no fosforilada sobre la PS129 alfa-sinucleína. Tal combinación de anticuerpos detecta alfa-sinucleína no fosforilada de longitud completa y cualquier fragmento de la misma, incluidos los sitios de unión del anticuerpo reportero y de captura. Si el anticuerpo de captura se une tanto a la PS129 alfa-sinucleína como a la alfa-sinucleína no fosforilada, dicha combinación de anticuerpos también detecta la alfa-sinucleína fosforilada de longitud completa y cualquier fragmento de la misma, incluidos los sitios de unión del anticuerpo reportero y el de captura.
En algunos métodos, no se observa reactividad cruzada con el monómero de sinucleína. En algunos métodos, no se observa reactividad cruzada con el monómero de sinucleína hasta 500 pg/mL.
IV. Aplicaciones
A. Fluidos corporales
La detección in vivo de PS129 alfa-sinucleína en muestras de pacientes puede usarse para el diagnóstico y monitoreo de enfermedades caracterizadas por cuerpos de Lewy u otros depósitos de alfa-sinucleína. Las enfermedades sinucleinopáticas incluyen la enfermedad de Parkinson (EP), la demencia con cuerpos de Lewy (DLB), la variante de la enfermedad de Alzheimer con cuerpos de Lewy (LBVAD), la atrofia multisistémica (MSA), la neurodegeneración con acumulación cerebral de hierro tipo 1 (NBIA-1), enfermedad con cuerpos de Lewy difusa (DLBD), y EP y enfermedad de Alzheimer (EA) combinada. Las muestras adecuadas de pacientes incluyen fluidos corporales, tales como sangre, LCR, orina y fluido peritoneal. La presencia de una enfermedad sinucleinopática se asocia generalmente con niveles significativamente alterados de PS129 alfa-sinucleína en el fluido (típicamente aumentados) cuando se comparan con los valores promedios en individuos normales, es decir, individuos que no padecen una enfermedad sinucleinopática. Un nivel se altera significativamente si se aparta en al menos una y preferentemente al menos dos desviaciones estándar del nivel medio en una población de individuos normales. En algunos métodos, también se determina un nivel de alfa-sinucleína total o alfa-sinucleína no fosforilada y opcionalmente se calcula una relación entre el nivel de alfa-sinucleína fosforilada y alfa-sinucleína total o alfa-sinucleína no fosforilada. Tal relación generalmente cambia en la misma dirección que la PS129 alfa-sinucleína (es decir, una relación aumentada indica la presencia o una mayor gravedad de la enfermedad).
En algunos métodos, los niveles de hemoglobina en una muestra de LCR se determinan como una medida de contaminación de glóbulos rojos para asegurar la medición de neurosinucleína y no de sinucleína de la sangre (Kang, JH y otros, JAMA Neurol. 2013; 70 1277-1287, Hong, Z. y otros, Brain 2010, 133:713-726; Barbour, R. y otros, Neurodegener Dis, 2008. 5:55-59). En algunos métodos, los niveles de hemoglobina en una muestra de LCR se determinan con un ensayo ELISA de hemoglobina humana, por ejemplo, el kit de cuantificación ELISA de hemoglobina humana (Bethyl Lab Inc., Montgomery, TX). En algunos métodos, los niveles de hemoglobina en una muestra de LCR son inferiores a 500 ng/mL. En algunos métodos, los niveles de hemoglobina en una muestra de LCR son de 200 ng/mL a 500 ng/mL. En algunos métodos, los niveles de hemoglobina en una muestra de LCR son menos de 200 ng/mL.
En algunos métodos, una muestra de LCR se diluye 1:4 en diluyente estándar Singulex modificado que comprende solución salina tamponada con fosfato, albúmina de suero bovino (BSA) al 0,1 % y Triton X-405 al 0,1 %.
Además del diagnóstico inicial de enfermedad sinucleinopática, opcionalmente en combinación con otros signos o síntomas de la enfermedad, la PS129 alfa-sinucleína o las relaciones discutidas anteriormente se pueden monitorear para seguir el progreso de la enfermedad mediante la medición de la PS129 alfa-sinucleína en múltiples momentos, tales como antes y durante el tratamiento, lo que sigue así la eficacia del tratamiento, tal como la inmunoterapia contra la alfa-sinucleína. Los niveles de PS129 alfa-sinucleína que revierten hacia el promedio en una población de individuos normales es una indicación de que el régimen de tratamiento es efectivo, y un nivel elevado de PS129 alfa-sinucleína es una indicación de que el tratamiento no es efectivo.
La presencia o los niveles de PS129 alfa-sinucleína o las relaciones relacionadas discutidas anteriormente también pueden usarse como un factor para determinar el tratamiento futuro. Los sujetos en los que PS129 alfa-sinucleína está presente o en un nivel que alcanza o supera un umbral están indicados como adecuados para el tratamiento o la profilaxis de la enfermedad con cuerpos de Lewy (por ejemplo, mediante inmunoterapia), mientras que los sujetos en los que PS129 alfa-sinucleína no está presente o está por debajo de un umbral se indica como no adecuado. Aunque la presencia o el nivel de PS129 alfa-sinucleína puede ser solo uno de varios signos o síntomas de la enfermedad con cuerpos de Lewy que afectan una decisión de tratamiento, los sujetos en los que PS129 alfa-sinucleína está presente o en el umbral o por encima del mismo tienen estadísticamente una mayor probabilidad de recibir tratamiento para una enfermedad con cuerpos de Lewy que los sujetos en los que PS129 alfa-sinucleína está ausente o por debajo del umbral.
B. Cultivo celular
El monitoreo in vitro de la PS129 alfa-sinucleína en medio de cultivo acondicionado de un cultivo celular adecuado puede usarse para analizar el procesamiento, fosforilación y secreción de PS129 alfa-sinucleína y el efecto de agentes potenciales sobre la misma. El monitoreo de la fosforilación de la alfa-sinucleína proporciona un medio para identificar las fosforilasas responsables de la misma. Los agentes que inhiben el procesamiento y/o la secreción de PS129 alfasinucleína tienen actividad farmacológica potencialmente útil para la profilaxis de la enfermedad sinucleinopática. Típicamente, la actividad inhibidora se determina mediante la comparación de los niveles de PS129 alfa-sinucleína en el medio de una célula tratada con un agente de prueba frente a una célula de control comparable no tratada con el agente.
Las células adecuadas incluyen células transfectadas con ácidos nucleicos que codifican alfa-sinucleína, preferentemente, alfa-sinucleína humana y células que expresan naturalmente alfa-sinucleína, también preferentemente humana. La alfa-sinucleína en las células transfectadas puede llevar una mutación, tal como S129A, S129D, A53T y A20P. Las células incluyen células PeakS, células SY5Y, células corticales humanas, líneas celulares de neuroglioma humano, células HeLa humanas, células endoteliales humanas primarias (por ejemplo, células HUVEC), fibroblastos o linfoblastos humanos primarios, células cerebrales mixtas primarias (incluidas neuronas, astrocitos y neuroglía), células de ovario de hámster chino (CHO) y similares. Las células SY5Y son células neuronales que pueden inducirse a diferenciarse mediante el tratamiento con ácido retinoico/BDNF (factor neurotrófico derivado del cerebro). Se prefieren las células transfectadas que expresan PS129 alfa-sinucleína a niveles mayores que las células humanas normales.
También pueden cribarse bibliotecas aleatorias de péptidos u otros compuestos por idoneidad. Pueden producirse bibliotecas combinatorias para muchos tipos de compuestos que pueden sintetizarse de manera paso a paso. Tales compuestos incluyen polipéptidos, miméticos de giro beta, polisacáridos, fosfolípidos, hormonas, prostaglandinas, esteroides, compuestos aromáticos, compuestos heterocíclicos, benzodiazepinas, glicinas oligoméricas N-sustituidas y oligocarbamatos. Pueden construirse grandes bibliotecas combinatorias de los compuestos mediante el método de bibliotecas sintéticas codificadas (ESL) descrito en Affymax, documento WO 95/12608, Affymax, WO 93/06121, Columbia University, documento WO 94/08051, Farmacopea, documento WO 95/35503 y Scripps, documento WO 95/30642. Las bibliotecas de péptidos pueden generarse también mediante métodos de presentación de fagos. Ver, por ejemplo, Devlin, documento WO 91/18980. Los compuestos de prueba se administran típicamente al medio de cultivo en una concentración en el intervalo de aproximadamente 1 nM a 1 mM, normalmente de aproximadamente 10 pM a 1 mM. Los compuestos de prueba que pueden inhibir la formación, el procesamiento o la secreción de alfasinucleína son candidatos para determinaciones adicionales en animales transgénicos y eventualmente para ensayos clínicos en humanos.
C. Animales transgénicos
Los anticuerpos de la descripción y los ensayos para detectarlos también pueden usarse para monitorear la producción, fosforilación y procesamiento de PS129 alfa-sinucleína en modelos animales transgénicos de enfermedad. Los modelos animales transgénicos de la enfermedad con cuerpos de Lewy son descritos por Masliah y otros Science 287:1265-1269 (2000); Masliah y otros, PNAS EE.UU. 98:12245-12250 (2001). La alfa sinucleína puede analizarse en fluidos corporales como se describió anteriormente para muestras humanas, o en muestras de tejido tomadas directamente del animal (ver el documento US60/423,012, presentado el 1 de noviembre de 2002,). Las muestras de tejido pueden clasificarse como cuerpos de Lewy, fracción particulada y fracciones solubles. Pueden realizarse ensayos sencillos como el cultivo celular para cribar agentes con la capacidad para inhibir la formación de PS129 alfasinucleína. Típicamente, la actividad inhibitoria se determina mediante la comparación del nivel de PS129 alfasinucleína del mismo en un fluido corporal particular o fracción a partir de una muestra de tejido de un animal transgénico tratado con el agente en comparación con el nivel de PS129 alfa-sinucleína en el mismo fluido corporal o fracción en un animal transgénico de control no tratado con el agente. La actividad inhibitoria se muestra mediante niveles reducidos de PS129 alfa-sinucleína del mismo en el animal tratado con relación al control.
Las muestras de tejido del cerebro de pacientes humanos pueden someterse a análisis similares. Sin embargo, como la obtención de muestras del cerebro de un paciente es un procedimiento indeseablemente invasivo, tales análisis normalmente se limitan a los cadáveres.
V. Kits
La invención proporciona además un kit que incluye un par de anticuerpos de captura y reportero, en donde los anticuerpos son 11A5 y 23E8. En algunos kits el anticuerpo de captura se preinmoviliza a una fase sólida, tal como una placa de microtitulación. Opcionalmente, también se incluyen en los kits reactivos de marcaje, tales como un anticuerpo antiidiotípico. El marcaje también puede incluir un gráfico u otro régimen de correspondencia que correlacione los niveles del marcador medido con los niveles de anticuerpos para la alfa-sinucleína. El término marcaje se refiere a cualquier material escrito o grabado que se adjunte a, o de cualquier otra manera acompañe un kit en cualquier momento durante su fabricación, transporte, venta o uso. Por ejemplo, el término marcaje abarca folletos y folletos publicitarios, materiales de empaque, instrucciones, casetes de audio o video, discos de computadora, así como escritura impresa directamente en los kits. Los kits pueden venderse, por ejemplo, como reactivos de investigación o diagnóstico.
A menos que sea evidente de cualquier otra manera por el contexto, cualquier modalidad, aspecto, característica o etapa puede usarse en combinación con cualquier otro. Si el contenido asociado con una cita o un número de acceso similar cambia con el tiempo, se pretende que la versión existente en la fecha de presentación efectiva de esta solicitud, la fecha de presentación efectiva sea la fecha de presentación real o la fecha de presentación anterior de una solicitud de prioridad que revele el número de acceso o citación.
Ejemplos
Los ejemplos usan los siguientes anticuerpos:
11A5 (JH22-11A5) epítopo AYEMP (fosfo) SEEGYQ(Syn124-134).
4B12 (pan alfa-sin) Epítopo comercial NEEGAP(Sin 103-108)
MJFR1 (pan alfa-sin) Epítopo comercial VDPDNE (Sin 118-123)
23E8 (JH19-23E8) epítopo VGSKTKEGVVHGVATV-GGC (Syn 40-55)
Ejemplo 1: Preparación de PS129 alfa-sinucleína recombinante estándar.
Se preparó PS129 alfa-sinucleína recombinante mediante el uso del siguiente método.
Fosforilación con PLK2 (Condiciones adaptadas de Salvi, M., Trashi, E., Cozza, G., Negro, A., Hanson, PI, Pinna, LA (2012). Biotechniques. Doi: 10.2144/000113866)
Materiales:
1) PLK2 (Carna Biosciences, Cat#05-158)
2) Alfa-sinucleína recombinante purificada expresada en proteína de E. coli preparada mediante el uso de un método de ebullición/intercambio aniónico o un método NiNTA/intercambio aniónico preparado sin calor
3) Tampón de reacción 10x PLK2 (recién preparado)
Tris 200 mM pH 7,5
MgCl2100 mM
DTT 10 mM
4) Stock de ATP (con un historial de congelación-descongelación muy limitado), 10 mM, (ATP de New England Biolabs)
Reacción:
1) Preparar alfa-sinucleína. (1,25 mg de alfa-sinucleína, preparada a una concentración de <3,5 mg/mL). El volumen de reacción final fue de 0,5 mL.
2) Alfa-sinucleína concentrada de intercambio de tampón en ddH2O.
3) Ensamblar la reacción. Para una reacción estándar de 0,5 mL, la mezcla de reacción final:
tampón PLK2 1x
ATP 25 pM
1,25 mg de alfa-sinucleína
5 pg de PLK2 (relación de cinasa: sustrato 1:250)
ddH2O a 0,5 mL
4) Incubar durante la noche a 30 °C.
5) Opcional: a la mañana siguiente, hervir la muestra para precipitar la cinasa (no es necesario si sigue la etapa de cromatografía. PLK2 se resolverá a partir de fosfo-sinucleína).
Separación cromatográfica de sinucleína fosforilada
Para la resolución de la sinucleína fosforilada de la mezcla de reacción de la cinasa, se usaron las siguientes condiciones: un gradiente salino lento en una columna Q HP HiTrap de 1 mL (GE Lifesciences), mediante el uso de un purificador AKTA. Mediante el uso de las condiciones siguientes, se resolvieron los picos proteináceos no fosforilados y fosforilados, y PLK2, así como el ATP y ADP no proteináceos.
Tampón A: Tris 20 mM pH 7,5
Tampón B: Tris 20 mM pH 7,5 con NaCl 1M
Muestra: Diluida 2:1 con tampón de carga (es decir, 2 veces el volumen de muestra añadido a la muestra) Velocidad de flujo: 1 mL/min
Lavar con tampón A 3 CV
Etapa al 20 % B, lavar con 3 CV
Gradiente: 20-55 % B sobre 35 CV
Por primera vez, puede ejecutar un gradiente más bajo y más lento para verificar una resolución exitosa.
Picos de elución por conductancia:
ADP: 16 mS/cm
ATP: 18,3 mS/cm
Sinucleína no fosforilada 25,7 mS/cm
Fosfo-sinucleína: 28,4 mS/cm
Se recogió el pico de fosfo-sinucleína y se dializó en PBS antes de congelarlo. Se corrió un control no fosforilado para verificar los picos de elución. El método resuelve la sinucleína fosforilada a partir de la sinucleína no fosforilada por carga, pero no de acuerdo con el sitio de fosforilación. La espectrometría de masas del material purificado mostró que la mayor parte de la fosforilación está en PS129 y una menor fosforilación secundaria en T33 y T81.
Ejemplo 2 Ensayo para detectar PS129 alfa-sinucleína.
Se usó la PS129 alfa-sinucleína recombinante preparada como en el Ejemplo 1 como una diana para la detección.
Se siguió un protocolo de viabilidad para determinar el intervalo de PS129 alfa-sinucleína determinado mediante diferentes combinaciones de anticuerpos. Brevemente, el protocolo incluyó curvas estándar diluidas 10 veces de 6 puntos para seis permutaciones de anticuerpos para probar el potencial de cada par y estimar las concentraciones de analito que se usarán en experimentos posteriores. Se mezclaron 100 pL de muestra de PS129 alfa-sinucleína estándar diluida en diluyente estándar Singulex (que comprende solución salina tamponada con fosfato y albúmina de suero bovino (BSA) al 0,1 %) con 100 pL de tampón de ensayo Singulex (que comprende el cóctel SMC Blocker, Triton X-100 al 0,3 % y NaCl 150 mM) que contienen partículas magnéticas recubiertas con el anticuerpo de captura y se incuban 120 min a 25 °C. El anticuerpo 11A5 se unió a partículas magnéticas mediante un enlazador de biotina. A continuación, el analito unido se lavó mediante el uso de separación magnética para mantener los MP aislados durante los procedimientos de lavado para asegurar que no se perdieran las perlas. Después de lavar y eliminar cualquier exceso de tampón, se añadieron 20 pL del anticuerpo de detección en tampón de ensayo Singulex y se incubó durante 60 min a 25 °C. Los complejos resultantes se lavaron cuatro veces mediante el uso de separación magnética, como antes. Se añadió tampón de elución Singulex (tampón de elución B, No. de catálogo 02-0297-00, EMD Millipore, Billerica, MA) y se incubó durante 5-10 min a 25 °C. El eluato se transfirió a una placa de 384 pocillos que contenía tampón de neutralización Singulex (Tampón D, No. de catálogo 02-0368-00, EMD Millipore, Billerica, MA). A continuación, se leyó la placa de 384 pocillos mediante el uso del sistema de inmunoensayo Erenna® que utiliza la tecnología de recuento de moléculas individuales (SMC™).
Las Tablas 1 y 2 muestran la sensibilidad de detección de diversas combinaciones de anticuerpo de captura y reportero. La combinación de 11A5 como el anticuerpo de captura y 23E8 como el anticuerpo reportero mostró una sensibilidad aproximadamente 10 veces mayor que cualquier otra combinación que tenga un límite inferior de cuantificación (LLOQ) de aproximadamente 0,1 pg/mL (~7fM).
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Los ensayos de cribado sugirieron el siguiente protocolo mediante el uso de 11A5 como el anticuerpo de captura y 23E8 como el anticuerpo reportero.
◦ Añadir 100 pL de PS129 alfa-sinucleína estándar 100 pL de partículas magnéticas (MP) recubiertas con el anticuerpo 11A5
◦ Incubar 120 min a 25 °C
◦ Lavar 1 vez mediante el uso de separación magnética
◦ Añadir 20 pL del anticuerpo de detección 23E8 e incubar 60 min a 25 °C
◦ Lavar 4 veces mediante el uso de separación magnética
◦ Añadir tampón de elución e incubar durante 5-10 min a 25 °C
◦ Transferir el eluato a una placa de 384 pocillos que contenga tampón de neutralización
◦ Leer la placa de 384 pocillos en Erenna
La Figura 1 y la Tabla 3 muestran la sensibilidad de la detección de 11A5 como el anticuerpo de captura y 23E8 como el anticuerpo reportero con diferentes cantidades del anticuerpo de captura en los pocillos. Se prefieren 5 pg de MP recubiertos con anticuerpo de captura por pocillo de anticuerpo de captura porque la pendiente resultante de la señal frente a la concentración de PS-129 alfa-sinucleína tiene una porción lineal extendida en el intervalo de alta sensibilidad.
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co
CL CO
J.QH
03
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PS129: Resumen y conclusiones
Un LLOQ de 0. Se detectó 1 pg de alfa-sinucleína fosforilada por mL con 11A5 a 5 pg de partículas magnéticas por pocilio recubierto a 12,5 pg de IgG por mg de partículas magnéticas y 23E8 a 2000 ng/mL. Mediante el uso de la combinación de anticuerpos preferida en sus cantidades preferidas, se determinó una curva de calibración que relaciona la señal con la concentración de PS129 alfa-sinucleína como se muestra en las Figuras 2A-C. La curva estándar tiene un intervalo de detección de 25 pg/mL-0,02 pg/mL.
La curva de 12 puntos de la Figura 2A se usa para interpolar los niveles de PS129 alfa-sinucleína de las muestras. Esto es una serie de diluciones (en este caso 2 veces para 11 puntos con un ancla cero). La sección resaltada es lo que se determinó como la sensibilidad del extremo inferior del ensayo, mientras que el límite inferior de cuantificación (LLOQ), que se define como el punto más bajo con <20 % CV y una recuperación entre el 80-120 % de lo esperado (y una señal de > 1,5 veces la señal de fondo (por ejemplo, el valor en el punto 0) que se muestra aquí como 0,1 pg/mL. La curva de gama baja (2B) es solo un área expandida del área de alta sensibilidad al mirar solo la señal DE del segmento lineal (por ejemplo <1000 DE) donde la señal DE es prácticamente una contribución del 100 % a la determinación de la concentración. La Figura 2C es una representación gráfica del área de alta sensibilidad que muestra la linealidad a través de las concentraciones más bajas (un gráfico de los datos de la parte superior derecha).
A continuación, se midieron los niveles de PS129 alfa-sinucleína en muestras de control neurológico de LCR con y sin adición de PS129 alfa-sinucleína (Tabla 4).
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Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Un método para detectar alfa-sinucleína fosforilada en la serina 129 (PS129 alfa-sinucleína), que comprende:
    (a) poner en contacto una muestra con un anticuerpo de captura que se une específicamente a un epítopo dentro de los residuos 124-134 de PS129 alfa-sinucleína y un anticuerpo reportero que se une específicamente a un epítopo dentro de los residuos 40-55 de alfa-sinucleína; en donde si PS129 alfa-sinucleína está presente en la muestra, el anticuerpo de captura y el anticuerpo reportero se unen a la PS129 alfa-sinucleína lo que forma un complejo sándwich; y
    (b) detectar el anticuerpo reportero que se une a la PS129 alfa-sinucleína en la etapa (a), si lo hay, para indicar la presencia o ausencia de la PS129 alfa-sinucleína.
  2. 2. El método de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo de captura es 11A5 que tiene el número de acceso ATCC PTA-8222 y el anticuerpo reportero es 23E8 que tiene el número de acceso ATCC PTA-122711; y/o en donde el anticuerpo de captura se une al soporte mediante un enlazador.
  3. 3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende además eluir el anticuerpo reportero del complejo sándwich antes de detectar el anticuerpo reportero; y/o
    en donde el anticuerpo reportero está marcado fluorescentemente y se detecta mediante recuento de una sola molécula; y/o
    en donde la muestra se pone en contacto con el anticuerpo de captura, el anticuerpo de captura se une a la PS129 alfa-sinucleína, el anticuerpo de captura unido a la PS129 alfa-sinucleína se separa de otros componentes de la muestra y se resuspende en solución, que se pone en contacto con el anticuerpo reportero, que se une a la PS129 alfa-sinucleína y forma el complejo sándwich, que se separa de otros componentes de la solución resuspendida, y el anticuerpo reportero se eluye del complejo sándwich y se detecta.
  4. 4. El método de cualquier reivindicación anterior, realizado cualitativamente; o
    realizado cuantitativamente para indicar una cantidad absoluta o relativa de la PS129 alfa-sinucleína.
  5. 5. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde la muestra contiene guanidina 0,1 -1,0 M, opcionalmente en donde la muestra contiene guanidina 0,5 M; y/o
    en donde el anticuerpo de captura se une a una fase sólida antes de la etapa de contacto; y/o
    en donde la fase sólida es perlas magnéticas, opcionalmente en donde el anticuerpo de captura se une a perlas magnéticas, que se separan del resto de la muestra o solución resuspendida mediante la aplicación de un campo magnético; y/o
    que comprende además: comparar una señal del anticuerpo reportero con una señal del anticuerpo reportero en una muestra de control que contiene una cantidad conocida de PS129 alfa-sinucleína para determinar la cantidad de PS129 alfa-sinucleína en la muestra; y/o
    que comprende además comparar una señal del anticuerpo reportero de una curva de calibración de la señal frente a la cantidad de PS129 alfa-sinucleína para determinar la cantidad de PS129 alfa-sinucleína en la muestra; y/o
    en donde una señal del anticuerpo reportero es proporcional a la cantidad de PS129 alfa-sinucleína en la muestra; y/o
    que comprende además poner en contacto el anticuerpo reportero con un anticuerpo marcado para generar una señal que indique la presencia del anticuerpo reportero y, por lo tanto, la presencia de PS129 alfasinucleína en la muestra; y/o
    que comprende además determinar un nivel de alfa-sinucleína total o alfa-sinucleína no fosforilada en la muestra y calcular una relación entre el nivel de alfa-sinucleína fosforilada y el nivel de alfa-sinucleína total o alfa-sinucleína no fosforilada; y/o
    en donde la muestra se diluye en diluyente estándar Singulex que comprende Triton X-405 al 0,1 %.
  6. 6. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde:
    (i) la muestra es un tejido de un ser humano; o
    (ii) la muestra es de un ratón transgénico con un transgén que expresa la alfa-sinucleína humana.
  7. 7. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde la muestra es un líquido corporal, opcionalmente en donde la muestra es líquido cefalorraquídeo (LCR) de un ser humano, opcionalmente en donde la muestra de LCR se diluye 1:4 en diluyente estándar Singulex que comprende Triton X-405 al 0,1 %.
  8. 8. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde no hay reactividad cruzada con el monómero de sinucleína hasta 500 pg/mL.
  9. 9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la muestra es líquido cefalorraquídeo (LCR) de un ser humano, en donde la muestra de LCR comprende <500 ng/mL de hemoglobina; o
    en donde la muestra de LCR comprende de 200 ng/mL a 500 ng/mL de hemoglobina; o
    en donde la muestra de LCR comprende <200 ng/mL de hemoglobina.
  10. 10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la muestra es un homogeneizado de cerebro de un animal humano o transgénico.
  11. 11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la muestra es un medio usado para cultivar células, opcionalmente en donde las células expresan alfa-sinucleína humana recombinante.
  12. 12. El método de cualquier reivindicación anterior, que detecta la presencia de PS129 alfa-sinucleína a un nivel de 0,1 pg/mL.
  13. 13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que detecta la presencia de PS129 alfa-sinucleína a un nivel de al menos 0,4 pg/mL.
  14. 14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6(i) o 7-13, en donde se usa la presencia de PS129 alfasinucleína para diagnosticar a un sujeto del que se obtuvo la muestra con enfermedad con cuerpos de Lewy.
  15. 15. Un kit que comprende un par de anticuerpos, en donde los anticuerpos son:
    un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un epítopo dentro de los residuos 40-55 de alfasinucleína, que comprende las CDR de Kabat del anticuerpo 23E8 que tiene el número de acceso ATCC PTA-122711, opcionalmente quimérico, remodelado o humanizado; y
    el anticuerpo 11A5 que tiene el número de acceso ATCC PTA-8222.
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