ES2203620T3 - Procedimientos para la identificacion de los inhibidores de la produccion del peptido beta-amiloide. - Google Patents
Procedimientos para la identificacion de los inhibidores de la produccion del peptido beta-amiloide.Info
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Abstract
EL PEPTIDO AMILOIDE (BETA) SOLUBLE ((BETA)AP) ES MEDIDO EN FLUIDOS BIOLOGICOS A CONCENTRACIONES MUY BAJAS, TIPICAMENTE EN EL MARGEN DESDE 0,1 NG/ML HASTA 10 NG/ML. LA MEDICION DE LAS CONCENTRACIONES DE (BETA)AP EN ANIMALES EN MEDIO CONDICIONADO A PARTIR DE CELULAS CULTIVADAS, PUEDE SER USADO PARA INVESTIGACION DE MEDICAMENTOS, EN CUYA PRUEBA SON ADMINISTRADOS COMPUESTOS A LOS ANIMALES O EXPUESTOS A CELULAS CULTIVADAS Y OBSERVADA LA ACUMULACION DE (BETA)AP EN EL ANIMAL O EN EL MEDIO DE CULTIVO. SE HA ENCONTRADO QUE NIVELES ELEVADOS DE (BETA)AP EN LOS FLUIDOS CORPORALES, TALES COMO SANGRE Y FLUIDO CEREBROESPINAL, ESTAN ASOCIADOS CON LA PRESENCIA DE UNA CONDICION RELACIONADA CON EL (BETA)AP EN UN PACIENTE, TAL COMO LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER. LOS METODOS PARA DIAGNOSTICAR Y CONTROLAR LAS CONDICIONES RELACIONADAS CON EL (BETA)AP, COMPRENDEN LA MEDICION DE LOS NIVELES DEL (BETA)AP EN TALES FLUIDOS CORPORALES PROCEDENTES DE UN PACIENTE.
Description
Procedimientos para la identificación de los
inhibidores de la producción del péptido
\beta-amiloide.
La presente invención se refiere generalmente a
procedimientos y composiciones para detectar el péptido
\beta-amiloide soluble (\betaAP) en muestras
líquidas. Más particularmente, la presente invención se refiere a
procedimientos de detección para la identificación de inhibidores de
producción de \betaAP, en los que \betaAP se detecta in
vitro o in vivo y a procedimientos de diagnóstico en los
que \betaAP se detecta en muestras de pacientes.
La enfermedad de Alzheimer (AD) es un trastorno
degenerativo del cerebro caracterizado clínicamente por la pérdida
progresiva de memoria, conocimiento, razonamiento, juicio y
estabilidad emocional que conduce gradualmente a un deterioro
mental profundo y finalmente a la muerte. AD es una causa muy
frecuente de insuficiencia mental progresiva (demencia) en personas
mayores y se cree que representa la cuarta causa de muerte médica
más frecuente en los Estados Unidos. La AD se ha observado en razas
y grupos étnicos de todo el mundo y presenta un problema principal
de salud pública actual y futuro. Se estima que la enfermedad
afecta actualmente alrededor de dos a tres millones de personas
sólamente en los Estados Unidos. La AD es incurable en la
actualidad. No se conoce actualmente ningún tratamiento que evite
eficazmente la AD o anule sus síntomas y evolución.
Los cerebros de pacientes con AD presentan
lesiones características denominadas placas seniles (o amiloides),
angiopatía amiloide (depósitos amiloides en los vasos sanguíneos) y
nudos neurofibrilares. Un buen número de estas lesiones,
particularmente las placas amiloides y los nudos neurofibrilares,
se hallan generalmente en varias áreas del cerebro humano
importantes para la función de la memoria y del conocimiento en
pacientes con AD. El menor número de estas lesiones en una
distribución anatómica más restringida se encuentra también en los
cerebros de las personas de más edad que no padecen AD clínica. Las
placas amiloides y la angiopatía amiloide caracterizan asimismo los
cerebros de pacientes con trisomía 21 (síndrome de Down) y la
hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis de tipo holandés
(HCHWA-D). En la actualidad, un diagnóstico
definitivo de AD requiere observar las lesiones antes mencionadas
en el tejido cerebral de pacientes que han muerto de la enfermedad
o, en raras ocasiones, en pequeñas muestras de biopsia de tejido
cerebral tomadas durante un procedimiento neuroquirúrgico
traumático.
El principal constituyente químico de las placas
amiloides y de los depósitos amiloides vasculares (angiopatía
amiloide) característico de AD y de otros trastornos mencionados
anteriormente es una proteína de aproximadamente 4,2 kilodalton
(kD) de aproximadamente 39 a 43 aminoácidos denominada péptido
\beta-amiloide (\betaAP) o a veces A\beta,
A\betaP o \beta/A4. \betaAP fue purificado en primer lugar y
una secuencia parcial de aminoácidos fue descrita por Glenner y
Wong (1984) Biochem. Biophys. Res. Commun.
120:885-890. El procedimiento de aislamiento y los
datos de la secuencia para los primeros 28 aminoácidos se describen
en la patente U.S. nº 4.666.829.
Los análisis biológicos moleculares y químicos de
la proteína realizados durante los últimos seis años han demostrado
que \betaAP es un fragmento pequeño de una proteína precursora
mucho mayor, denominada proteína precursora
\beta-amiloide (APP), que es producida
generalmente por células en muchos tejidos de diversos animales,
incluyendo el ser humano. El conocimiento de la estructura del gen
que codifica APP ha demostrado que \betaAP surge como un
fragmento de péptido que se escinde de APP mediante enzimas hasta
ahora desconocidas (proteasas). Se desconoce actualmente el
mecanismo bioquímico exacto mediante el cual el fragmento \betaAP
se escinde de APP y se deposita posteriormente como placas
amiloides en el tejido cerebral, en las paredes del cerebro y en
los vasos sanguíneos de las meninges.
Varías líneas de pruebas indican que la
deposición cerebral progresiva de \betaAP representa un papel
fundamental en la patogénesis de AD y puede preceder a los síntomas
cognitivos durante años o décadas (para consulta, véase Selkoe
(1991) Neuron 6:487). La única línea más importante de prueba
es el descubrimiento en 1991 que estas mutaciones sin sentido del
ADN en el aminoácido 717 de la isoforma de 770 aminoácidos de APP
se pueden encontrar en miembros afectados pero no en miembros sin
afectar de diversas familias con una forma genéticamente
determinada (familiar) de AD (Goate et al. (1991)
Nature 349:704-706; Chartier Harlan et
al. (1991) Nature 353:844-846; y Murrell
et al. (1991) Science 254:97-99) y se
denomina variante sueca. Una mutación doble que cambia
lisina^{595}-metionina^{596} por
asparagina^{595}-leucina^{596} (en relación con
la isoforma 695) descubierta en una familia sueca se describió en
1992 (Mullan et al. (1992) Nature Genet.
1:345-347). El análisis de unión genética han
demostrado que estas mutaciones, así como otras determinadas
mutaciones en el gen de APP, son la causa molecular específica de
AD en los miembros afectados de tales familias. Además, una
mutación en el aminoácido 693 de la isoforma de 770 aminoácidos de
APP se ha identificado como la causa de la enfermedad de deposición
de \betaAP, HCHWA-D y un cambio de alanina por
glicina en el aminoácido 692 parece producir un fenotipo que reúne
AD en algunos pacientes pero HCHWA-D en otros. El
descubrimiento de éstas y otras mutaciones en APP en casos de AD
basados genéticamente demuestra que la alteración de APP y la
posterior deposición de su fragmento \betaAP puede producir
AD.
Esch et al. (1990) Science
248:1122-1124 se refiere a un estudio
centrado en la unión entre el tratamiento de la APP aberrante y la
deposición amiloide. Específicamente, la escisión inapropiada de
APP, bien extracelular o intracelularmente, en el terminal NH_{2}
de \betaAP se cree que representa un suceso patógeno clave.
A pesar del progreso que se ha llevado a cabo en
la comprensión de los mecanismos indicados de AD y de otras
enfermedades relacionadas con \betaAP, subsiste una necesidad de
desarrollar procedimientos y composiciones para el diagnóstico y el
tratamiento de la(s) enfermedad(es). Los
procedimientos de tratamiento podrían estar basados ventajosamente
en fármacos que son capaces de inhibir la generación de \betaAP
in vivo. Para identificar tales fármacos, sería deseable
proporcionar análisis de identificación para fármacos potenciales
que pueden inhibir la generación de \betaAP en modelos in
vivo e in vitro. Además sería deseable proporcionar
procedimientos y composiciones para el diagnóstico de las
enfermedades relacionadas con \betaAP, en las que el diagnóstico
se base en la identificación de \betaAP en muestras fluidas del
paciente. Los análisis específicos para la identificación de
\betaAP serían capaces de identificar \betaAP en muestras
fluidas a muy bajas concentraciones así como de distinguir entre
\betaAP y otros fragmentos de APP que pueden estar presentes en
la muestra.
Glenner y Wong (1984) Biochem. Biophys. Res.
Commun. 120:885-890 y la patente U.S. nº
4.666.829, se tratan anteriormente. La patente anterior sugiere la
utilización de un anticuerpo en el fragmento \betaAP de 28
aminoácidos para identificar "polipéptido amiloide de
Alzheimer" en una muestra del paciente y para diagnosticar AD.
No se presentó ningún dato que demuestre la identificación o el
diagnóstico.
Haass et al. (1992) Nature
359: 322-325 describe que en la producción
del péptido \beta-amiloide soluble (\betaAP) y
de la forma truncada de \betaAP (aproximadamente 3 Kd) se han
detectado medios de cultivo celulares en condiciones normales.
Numerosos estudios bioquímicos al microscopio
electrónico e inmunoquímicos han descrito que \betaAP es muy
insoluble en soluciones fisiológicas a pH normal. Véase, por
ejemplo, Glenner y Wong (1984) Biochem. Biophys. Res.
Commun. 122:1131-1135; Masters et al.
(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
82:4245-4249; Selkoe et al. (1986) J.
Neurochem. 46:1820-1834; Joachim et al.
(1988) Brain Research 474:100-111; Hilbich et
al. (1991) J. Mol. Biol. 218:149-163; Barrow y
Zagorski (1991) Science 253:179-182; y
Burdick et al. (1992) J. Biol. Chem.
267:546-554. Además, esta insolubilidad se predijo
y es coherente con la secuencia de aminoácidos de \betaAP que
incluye un segmento de aminoácidos hidrófobos que constituyen parte
de la zona que ancla la proteína precursora (APP) en las membranas
de lípido de las células. Se predice que las proteínas hidrófobas
que se anclan a lípidos, tales como \betaAP, permanecen asociadas
con membranas celulares o fragmentos de membranas y por tanto no
están presentes en los fluidos extracelulares fisiológicos. Los
estudios mencionados anteriormente y muchos otros han descrito la
insolubilidad en solución fisiológica de \betaAP naturales
purificadas a partir de depósitos amiloides cerebrales de AD o de
péptidos sintéticos que contienen la secuencia de \betaAP. La
extracción de \betaAP a partir de depósitos amiloides
cerebrales y su solubilización posterior ha requerido la utilización
de disolventes y desnaturalizantes fuertes, no fisiológicos.
Soluciones salinas fisiológicas tamponadas que simulan fluidos
extracelulares de tejidos humanos han fracasado igualmemente para
solubilizar \betaAP.
Se han acometido asimismo intentos independientes
para detectar APP o fragmentos de ésta en el plasma del CSF. Se ha
descubierto un fragmento grande segregado de APP que no contiene la
zona de \betaAP íntegra en el líquido cerebroespinal humano
Palmert et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86:6338-6342; Weidemann et al. (1989) Cell
57:115-126; Henriksson et al. (1991) J.
Neurochem. 56:1037-1042; y Palmert et al.
(1990) Neurology 40:1028-1034); y en el plasma
(Podlisny et al. (1990) Biochem. Biophys. Res. Commun.
167:1094-1101). La identificación de fragmentos de
la porción carboxi-terminal de APP en el plasma se
ha descrito asimismo (Rumble et al. (1989) N. Engl. J.
Med. 320:1446-1452) que presenta insuficiencia
para detectar tales fragmentos (Schlossmacher et al. (1992)
Neurobiol. Aging 13:421-434).
A pesar de la aparente insolubilidad del
\betaAP natural y sintético, se ha especulado que el \betaAP
podría aparecer en fluidos corporales, tales como el fluido
cerebroespinal (CSF) o en el plasma (Wong et al. (1985)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:8729-8732;
Selkoe (1986) Neurobiol. Aging 7:425-432;
Pardridge et al. (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun.
145:241-248; Joachim et al. (1989)
Nature 341:226-230; Selkoe et al.
(1989) Neurobiol. Aging 10:387-395).
Se han descrito varios intentos para medir
\betaAP en el CSF y en el plasma mediante procedimientos de
radioinmunoanálisis (Pardridge et al. (1987) Biochem.
Biophys. Res. Commun., supra, y en el documento WO 90/12870
publicado el 1 de noviembre de 1990) y mediante ELISA en
sandwich (Wisniewski en Alzheimer's Disease, eds.
Becker y Giacobini, Taylor y Francas, N.Y. pág. 206, 1990; Kim y
Wisniewski en Techniques in Diagnostic Pathology, eds.
Bullock et al., Academic Press, Boston pág 106; y el
documento WO 90/12871 publicado el 1 de noviembre de 1990).
Mientras estos informes detectaron niveles muy bajos de
inmunorreactividad de \betaAP en los fluidos corporales, no se
prosiguieron los intentos para purificar y caracterizar
directamente esta inmunorreactividad adicional y determinar si
representa a \betaAP y se abandonaron los esfuerzos. No se
consideró ni se demostró la posibilidad de producción de \betaAP
por células cultivadas. Retrospectivamente, la incapacidad para
detectar fácilmente \betaAP en fluidos corporales se debió
probablemente a la presencia de fragmentos de precursor amiloide
con zonas o fragmentos solapantes de \betaAP que oscurecían las
mediciones y a falta de anticuerpos completamente específicos para
el \betaAP íntegro. De hecho, los descubrimientos anteriores
tanto de Pardridge et al. como de Kim et al.
describieron concentraciones de \betaAP cuatro a cinco veces
inferiores a las mostradas en la presente invención. Esto es
supuestamente debido a que los anticuerpos utilizados por ambos
grupos interrelacionarían con otros fragmentos de APP que contienen
parte del \betaAP que se sabe que está presente en el CSF
interfiriendo de este modo con la medición, si existe, del
\betaAP íntegro. La presente invención supera estas dificultades
mediante la utilización de anticuerpos monoclonales específicos
para el epítopo en la zona de unión central del \betaAP
íntegro.
Seubert et al. (1992) Nature
359:325-327 da a conocer un análisis
inmunoadsorbente ligado a la enzima de tipo sandwich para
detectar \betaAP en fluidos biológicos basado en la utilización
de anticuerpos monoclonales surgidos contra el fragmento que está
compuesto por los aminoácidos 13 a 28.
El documento WO 92/00521 da a conocer un
procedimiento para controlar la respuesta de un paciente con AD que
implica la medición de los derivados solubles de ^{-}25 kD y de
^{-}125 kD del precursor de la proteína beta amiloide
(\betaAPP) en una muestra de fluido cerebroespinal.
El documento EP 444.856 proporciona medios de
diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer utilizando un
inmunoanálisis de sandwich para "la proteína relacionada
con la enfermedad de Alzheimer" (ADAP). ADAP se define como un
material reactivo con el anticuerpo monoclonal denominado Alz50,
descrito originalmente por Wolozin et al. (1986)
Science 232:648-650. Se ha mostrado más
recientemente que Alz50 reacciona específicamente con formas
fosforiladas de tau (Ksiezak-Reder et al.
(1988) J. Biol. Chem. 263:7943-7947; Ueda
et al. (1990) J. Neuroscience
10:3295-3304; Lee et al. (1991)
Science 251:675-578). Por lo tanto, ADAP
representan formas fosforiladas de tau y no están relacionadas con
la proteína precursora amiloide de \betaAP descrita en la
presente invención.
El documento WO 91/19810 da a conocer la
utilización de animales transgénicos que expresan APP de tipo
natural para la identificación de fármacos y contempla que los
puntos finales deseados de tal análisis deberían tener la capacidad
de un fármaco para reducir la cantidad de placas formadas dentro
del cerebro de un animal.
La presente invención proporciona un
procedimiento in vitro para identificar el inhibidor de
producción del péptido \beta-amiloide (\betaAP),
procedimiento que comprende dicho el cultivo de células de mamífero
en un medio de cultivo en condiciones que dan como resultado la
producción de un péptido soluble de \betaAP que se puede
identifica en el medio de cultivo, en el que las células de
mamífero cultivadas proceden de una línea celular que comprende el
ADN que codifica un isótopo o variante de una proteína precursora
amiloide (APP) que proporciona sobreproducción de \betaAP en las
células de mamífero cultivadas; que expone las células cultivadas a
un compuesto de prueba y que determina si el compuesto de prueba
afecta a la cantidad de péptido \betaAP soluble presente en el
medio de cultivo.
El efecto del compuesto de prueba se determina
comparando la acumulación de \betaAP en el medio de cultivo
durante un periodo de tiempo en ausencia del compuesto de prueba
con acumulación de \betaAP en el medio de cultivo en presencia
del compuesto de prueba durante el mismo periodo de tiempo.
La invención también proporciona un procedimiento
de análisis in vitro para analizar la capacidad de un
compuesto de prueba para inhibir la producción de células del
péptido \beta-amiloide (\betaAP), comprendiendo
dicho procedimiento el cultivo de una primera población de células
de mamífero en un medio de cultivo en las condiciones que producen
la generación de un péptido \betaAP soluble que se puede
identificar en el medio de cultivo, en el que las células de
mamífero cultivadas proceden de una línea celular que comprende el
ADN que codifica un isótopo o variante de una proteína de precursor
amiloide (APP) que proporciona sobreproducción de \betaAP en las
células de mamífero cultivadas; cultivando una segunda población de
las mismas células de mamífero en un segundo medio de cultivo en
condiciones idénticas a las de la primera población, excepto que el
compuesto de prueba está presente en el segundo medio de cultivo;
midiendo las cantidades de \betaAP soluble presentes en el medio
de cultivo de la primera población y de la segunda población de
células; y comparando las cantidades medidas de \betaAP para
determinar si el compuesto de prueba ha tenido un efecto sobre la
generación por las células cultivadas de péptido \betaAP
soluble.
En las formas de realización preferidas de la
invención las células cultivadas proceden de una línea celular
humana.
El compuesto de prueba puede estar presente en
una concentración en el intervalo de 1 nM a 1 mM.
La invención proporciona además un procedimiento
in vitro para dentificar inhibidores de producción
\beta-amiloide (\betaAP), comprendiendo dicho
procedimiento la administración de un compuesto de prueba a un
huésped transgénico mamífero que comprende el ADN que codifica un
isótopo o variante de una proteína de precursor amiloide (APP) que
proporciona sobreproducción de \betaAP en las células de mamífero
cultivadas que comprenden dicho ADN; y determinando si el compuesto
de prueba afecta a la cantidad de péptido \betaAP soluble
presente en el fluido corporal.
El efecto del compuesto de prueba determinado
preferentemente midiendo una cantidad de referencia de péptido
\betaAP soluble en un fluido corporal antes de administrar el
compuesto de prueba y volviendo a medir la cantidad de \betaAP
soluble en el fluido corporal después de dicha administración.
En las formas de realización preferidas de la
invención el huésped transgénico mamífero se selecciona de entre el
grupo que consta de monos, perros, conejos, cerdos de Guinea, ratas
y ratones.
El huésped transgénico mamífero es
preferentemente un huésped transgénico con aumento de
susceptibilidad a la deposición de placas de \betaAP comparado
con un mamífero de la misma especie que no comprende dicho ADN.
El fluido corporal se selecciona preferentemente
del grupo que está compuesto por sangre, CSF, orina y fluido
peritoneal.
El compuesto de prueba se administra
preferentemente al huésped transgénico por vía oral, tópica,
intramuscular, intravenosa, subcutánea, intraventricular o
intraperitoneal.
\newpage
En las formas de realización preferidas de todos
los aspectos de la invención el péptido \betaAP soluble es
\betaAP íntegro o un fragmento de aproximadamente 3 kD, más
preferentemente los fragmentos de \betaAP están constituidos por
11 a 40 ó 17 a 40 residuos de aminoácidos de \betaAP.
El ADN puede codificar una APP con una o varias
sustituciones de aminoácido directamente
amino-terminal del punto de escisión del
\betaAP.
El ADN codifica directamente una APP que
comprende leucina como residuo amino N-terminal
inmediato a la zona de escisión del \betaAP.
El ADN codifica más preferentemente una APP que
comprende la mutación sueca (una doble mutación Lys^{595}
\rightarrow Asn^{595} y Met^{596} \rightarrow
Leu^{596}).
El documento WO 91/19810 da a conocer la
utilización de animales transgénicos que expresan APP natural para
la identificación de fármacos y contempla que los puntos finales
deseados de tal análisis deberían de tener la capacidad de un
fármaco para reducir la cantidad de placas formadas dentro del
cerebro de un animal.
La presente invención proporciona por
consiguiente procedimientos útiles para la identificación de
inhibidores de producción del péptido
\beta-amiloide (\betaAP) así como para el
diagnóstico y el control de enfermedades relacionadas con \betaAP
en pacientes, en la que los procedimientos y composiciones cuentan
con la detección específica de \betaAP soluble y/o fragmentos de
\betaAP en muestras de fluido. Para la identificación de
inhibidores de producción de \betaAP, se introduce un compuesto de
prueba en un modelo de generación de \betaAP in vitro o
in vivo, y se observa el efecto del compuesto de prueba
sobre la cantidad de \betaAP soluble o sobre el fragmento de
\betaAP generado por el modelo. El modelo in vitro consiste
en líneas celulares que expresan variantes de APP que sobreproducen
\betaAP. Las sustancias de la prueba que afectan a la producción
de \betaAP y/o fragmentos de \betaAP, reduciendo generalmente
la cantidad producida, se considera que son probablemente
candidatas para probar además la utilización como fármacos
terapéuticos en el tratamiento de enfermedades relacionadas con
\betaAP, particularmente la enfermedad de Alzheimer. Para el
diagnóstico y el control de las enfermedades relacionadas con
\betaAP, la cantidad de \betaAP y/o de fragmentos de \betaAP
en una muestra del paciente, tal como sangre, fluido cerebroespinal
(CFS), orina o fluido peritoneal, se mide y se compara con un valor
predeterminado de referencia, tal como un valor normal (en caso de
diagnóstico) o con un valor anterior del paciente (en caso de
referencia).
En un aspecto particular la presente invención
proporciona análisis de unión específicos que son útiles para la
medición de concentraciones de \betaAP en muestras de fluido y
que se puede emplear en la identificación de fármacos y en
procedimientos de diagnóstico y control del paciente. El análisis
de unión específico de la presente invención es capaz de detectar
\betaAP soluble a concentraciones muy bajas que son
características de los fluidos del paciente y medios de cultivo
acondicionados, siendo capaz típicamente de medir concentraciones
umbral en el intervalo de aproximadamente 1 ng/ml a 10 ng/ml, o
inferiores.
El análisis de unión específico emplea por lo
menos una sustancia específica de unión para un epítopo o punto
determinante de la molécula \betaAP, cuyo punto generalmente no
se encuentra en otros fragmentos o productos de degradación de la
proteína precursora \beta-amiloide (APP). Son
especialmente útiles los anticuerpos que reconocen una zona de unión
con \betaAP, en los que la zona de unión está situada alrededor
del punto de la escisión proteolítica normal de APP entre los
residuos Lys^{16} y Leu^{17} (Esch et al. (1990)
Science 248:492-495 y Anderson et al.
(1991) Neuro. Science Lett. 128:126-128),
abarcando típicamente los residuos de aminoácidos 13 y 28. El
análisis de unión específico modelo comprende el análisis
(sandwich) en dos puntos en el que el anticuerpo de captura
es específico para la zona de unión del \betaAP, como se acaba de
describir, y un segundo anticuerpo marcado es específico para otro
epítopo aparte del epítopo reconocido por el anticuerpo de captura.
Son especialmente útiles los segundos anticuerpos que se unen al
extremo amino-terminal de \betaAP, reconociendo
típicamente un epítopo dentro de los residuos de los aminoácidos 1 a
16.
Las formas de realización preferidas de la
invención se describirán con detalle, haciendo referencia a los
dibujos adjuntos, en los que:
La Fig. 1 es un gráfico que ilustra la detección
de tres péptidos \betaAP sintéticos que utilizan el formato de
análisis ELISA con el anticuerpo monoclonal 266 como anticuerpo de
captura y el anticuerpo monoclonal 10D5 como anticuerpo indicador.
El anticuerpo 266 se preparó frente a un péptido sintético que
comprende los residuos de aminoácidos 13 a 28 de \betaAP. El
anticuerpo 10D5 surgió frente a un péptido sintético que incluye
los residuos de aminoácidos 1 a 28 de \betaAP.
Las Figs. 2A y 2B son gráficos que comparan el
plasma y las concentraciones de \betaAP en el control normal y en
pacientes de AD.
La Fig. 3 es un gráfico que compara la
concentración de CSF de \betaAP en controles normales (C),
pacientes de la enfermedad de Alzheimer (AD), pacientes de
accidente vascular cerebral (CVA) (apoplejía) y pacientes de la
enfermedad de Parkinson (PD).
\newpage
La Fig. 4 es una transferencia de Western del
medio acondicionado purificado por afinidad de una línea celular
que sobreexpresa APP. El material purificado por afinidad
procedente del medio acondicionado de los cultivos celulares de
cerebro mezclado humano que había sido purificado además mediante
cromatografía en fase inversa.
La Fig. 5 es un autorradiograma que demuestra la
presencia de \betaAP soluble en el fluido de cultivo de las
células 293 de riñón humano. El \betaAP se inmunoprecipitó a
partir del fluido de cultivo con un anticuerpo específico de
\betaAP en los residuos 1 a 40 de \betaAP.
La Fig. 6 es un autorradiograma que demuestra que
\betaAP es totalmente soluble en el medio de las células 293 del
riñón humano y que queda en el sobrenadante posterior a 10^{5}
\times g y no se encuentra en el sedimento posterior a 10^{5}
\times g después de la ultracentrifugación.
La Fig. 7 muestra la cuantificación de \betaAP
(panel izquierdo) y la proteína precursora
\beta-amiloide segregada (APPs) (panel derecho) en
el medio acondicionado en las células 293 transfectadas
transitoriamente utilizando dos ELISAs de sandwich
distintos. Cada columna representa la media de cuatro experimentos
de transfección con construcciones de APP normales o variantes con
la excepción de la columna simulada que se basa en tres experimentos
de transfección.
La Fig. 8 es un autorradiograma que demuestra las
concentraciones de \betaAP soluble en el medio de cultivo de las
células 293 de riñón humano transfectadas con construcciones
normales variantes de APP_{695}.
Se han descubierto que una amplia variedad de
células de mamíferos genera cantidades detectables de péptido
\beta-amiloide soluble (\betaAP) y fragmentos
de \betaAP continuamente a bajas concentraciones. En particular,
se ha descubierto que células de mamífero cultivadas generan in
vitro teles péptidos \betaAP y se pueden medir en el medio de
cultivo acondicionado de numerosas líneas celulares de mamíferos.
Se ha descubierto además que los péptidos \betaAP están presentes
en los fluidos corporales de varios huéspedes de mamíferos y que
grandes concentraciones de péptidos están asociadas a enfermedades
relacionadas con \betaAP, tales como la enfermedad de Alzheimer y
el síndrome de Down.
La presente invención proporciona procedimientos
para la detección de fármacos para identificar inhibidores de
generación potencial de \betaAP. Los procedimientos cuentan con
la medición de muy bajas concentraciones de \betaAP en una
muestra de fluido, típicamente en el intervalo de 0,1 ng/ml a 10
ng/ml, proporcionando además la presente invención procedimientos
muy sensibles y específicos para realizar tales mediciones. Los
procedimientos de detección pueden proporcionar mediciones de
\betaAP a las concentraciones umbral de 0,1 ng/ml e inferiores y
son suficientemente específicos para distinguir \betaAP de otros
fragmentos de la proteína precursora
\beta-amiloide (APP) que contiene los aminoácidos
precursores además de los aminoácidos 39 a 43 que comprenden la
zona de \betaAP.
No se entiende actualmente el mecanismo de
generación de \betaAP y del fragmento de \betaAP. Es posible que
se produzca \betaAP íntegra o completa intracelularmente y a
continuación se libere o se segregue en el fluido extracelular, es
decir, fluidos corporales in vivo y medio de cultivo celular
acondicionado in vitro. Como alternativa, es posible que una
proteína o fragmento precursores, que puede ser la APP completa o
una porción de la misma que contiene la zona \betaAP, se segregue
o se libere de las células de mamífero y se procese fuera de la
fuente celular. Independientemente del mecanismo particular, la
presente invención cuenta con la detección y la medición de las
concentraciones o cantidades de \betaAP y fragmentos de \betaAP
en los fluidos extracelulares, incluyendo el medio de cultivo
acondicionado y los fluidos corporales como se trata con más detalle
a continuación.
El término "péptido
\beta-amiloide" (\betaAP), tal como se
utiliza en la presente memoria, se refiere a una proteína de
aproximadamente 4,2 kD que, en los cerebros con AD, síndrome de
Down, HCHWA-D y en algunos pacientes de edad
normales, produce la subunidad de los filamentos amiloides que está
compuesta por placas (amiloides) seniles y por depósitos amiloides
en pequeños vasos sanguíneos del cerebro y de las meninges
(angiopatía amiloide). La \betaAP puede aparecer en forma
polimérica filamentosa (en esta forma, presenta las propiedades de
amiloide de fijación a los colorantes rojo Congo y tioflavina S
descritas en relación con éstos). \betaAP puede aparecer asimismo
en forma no filamentosa (depósitos "preamiloides" o
"amorfos" o "difusos") en el tejido, en el que no aparece
ninguna forma birrefringente detectable teñida por el rojo Congo.
En la patente U.S. nº 4.666.829 se describe una porción de esta
proteína en forma insoluble obtenida de los vasos sanguíneos de las
meninges. Cuando se utiliza \betaAP en relación con la presente
invención, se refiere específicamente a un péptido de
aproximadamente 39 a 43 aminoácidos que es sustancialmente homólogo
a la forma de la proteína producida por el procedimiento descrito
en la patente de Glenner et al., pero que, según la presente
invención, se puede encontrar y purificar a partir del fluido
extracelular (medio) del cultivo de células cultivadas in
vitro o a partir de fluidos corporales humanos o de otros
animales, incluyendo tanto a individuos normales como a individuos
que padecen enfermedades relacionadas con \betaAP. Por tanto,
\betaAP también se refiere a secuencias de \betaAP relacionadas
que resultan de mutaciones en la zona de \betaAP del gen normal.
De cualquier forma, \betaAP es un fragmento de aproximadamente 39
a 43 aminoácidos de una glucoproteína grande que abarca la
membrana, denominada proteína precursora
\beta-amiloide (APP), codificada por un gen en el
brazo largo del cromosoma 21 humano. \betaAP se caracteriza además
por su movilidad relativa en la electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida o en la cromatografía líquida de
alto rendimiento (HPLC). Su secuencia de 43 aminoácidos es:
\newpage
1
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly
Tyr
11
Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe
Phe
21
Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly
Ala
31
Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val
Val
41
Ile Ala
Thr
o una secuencia que es sustancialmente homóloga a
ésta.
El término "péptidos de \betaAP", tal como
se utiliza en la presente memoria, se refiere a \betaAP íntegra o
completa así como a fragmentos y productos de degradación de
\betaAP que generan células de mamíferos a bajas
concentraciones. Determinados fragmentos de \betaAP tienen un peso
molecular de aproximadamente 3 kD y se cree actualmente que
consisten en 11 a 40 residuos de aminoácidos y 17 a 40 de
\betaAP.
El término "zona de unión del \betaAP",
tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una zona
de \betaAP que está centrada en el punto entre los residuos de
los aminoácidos 16 y 17 (Lys^{16} y Leu^{17}) que es un
objetivo para el tratamiento proteolítico normal de APP. Tal
procesamiento normal produce una variedad de fragmentos de APP que
son potencial e inmunológicamente interreactivos con la molécula de
\betaAP íntegra y los fragmentos de \betaAP que se han de
identificar en los procedimientos de la presente invención. La zona
de unión abarca los residuos de aminoácidos 10 a 35, abarcando
preferentemente los residuos de aminoácidos 15 a 30, con
anticuerpos producid contra un péptido sintético que está compuesto
de los residuos de aminoácidos 13 a 28 que se ha observado que
presentan la especificidad del requisito.
El término "proteína precursora
\beta-amiloide" (APP), tal como se utiliza en
la presente memoria, se define como un polipéptido que está
codificado por un gen del mismo nombre localizado en el ser humano
en el brazo largo del cromosoma 21 y que incluye la \betaAP en su
tercer carboxilo. APP es una proteína glucoxilada, que abarca una
sola membrana expresada en una amplia variedad de células en muchos
tejidos de mamíferos. Ejemplos de isótopos específicos de APP que
se sabe actualmente que existen en el ser humano son el polipéptido
de 695 aminoácidos descrito por Kang et al. (1987)
Nature 325:733-736 que se denomina APP
"normal"; el polipéptido de 751 aminoácidos descrito por Ponte
et al. (1988) Nature 331:525-527
(1988) y Tanzi et al. (1988) Nature
331:528-530; y el polipéptido de 770 aminoácidos
descrito por Kitaguchi et al. (1988) Nature
331:530-532. Ejemplos de variantes específicas de
APP incluyen mutaciones puntuales que se pueden diferenciar tanto
en la posición como en el fenotipo (para consulta de las mutaciones
de variante conocida véase Hardy (1992) Nature Genet.
1:233-234).
El término "fragmentos de APP", tal como se
utiliza en la presente memoria, se refiere a otros fragmentos de
APP aparte de los que constan únicamente de \betaAP o de
fragmentos de \betaAP. Esto es, los fragmentos de APP incluirán
secuencias de aminoácido de APP además de las que producen
\betaAP íntegro o un fragmento de \betaAP.
El término "enfermedad relacionada con
\betaAP", tal como se utiliza en la presente memoria, se
define incluyendo la enfermedad de Alzheimer (que incluye la
enfermedad familiar de Alzheimer), el síndrome de Down,
HCHWA-D y el envejecimiento del cerebro.
Los términos "medio de cultivo
acondicionado" y "medio de cultivo", tal como se utilizan
en la presente memoria, se refieren al fluido acuoso extracelular
que rodea el cultivo celular en el cultivo de tejido (in
vitro) y que contiene, entre otros constituyentes, proteínas y
péptidos segregados por las células.
El término "fluido corporal", tal como se
utiliza en la presente memoria, se refiere los fluidos de un
huésped mamífero que es de esperar que contengan cantidades
medibles de \betaAP y de fragmentos de \betaAP, incluyendo
específicamente sangre, fluido cerebroespinal (CSF), orina y fluido
peritoneal. El término "sangre" se refiere a la sangre en
conjunto, así como al plasma sanguíneo y al suero.
Según la presente invención, \betaAP y los
fragmentos de \betaAP se pueden detectar y/o medir en una
variedad de muestras biológicas y fisiológicas, incluyendo muestras
in vitro, tales como medio acondicionado procedente de
células cultivadas, incluyendo las líneas celulares transfectadas y
las líneas celulares endógenas, y muestras del paciente in
vivo, típicamente fluidos corporales. La detección y la
medición de péptidos \betaAP se puede realizar por cualquier
técnica capaz de distinguir \betaAP y fragmentos de \betaAP de
otros fragmentos de APP que se pueden encontrar en la muestra.
Convenientemente, se pueden emplear técnicas de detección
inmunológica utilizando sustancias de unión específicas para
\betaAP, tales como anticuerpos, fragmentos de anticuerpo,
anticuerpos recombinantes y similares, que se unen con especificidad
y sensibilidad a \betaAP. En particular, se ha descubierto que
los anticuerpos que son monoespecíficos para la zona de unión del
\betaAP son capaces de distinguir el \betaAP de otros
fragmentos de APP. La zona de unión de \betaAP se centra en los
residuos de los aminoácidos 16 y 17, que se extiende típicamente a
los residuos de aminoácidos 13 a 28, y tales anticuerpos
específicos de la unión se pueden preparar utilizando péptidos
sintéticos que tienen esta secuencia como inmunógeno. Las técnicas
de detección particularmente adecuadas incluyen ELISA,
transferencia de Western, radioinmunoanálisis y similares.
Una técnica de inmunoanálisis preferida consiste
en un análisis de dos puntos o "sandwich" que emplea un
anticuerpo específico de unión como anticuerpo de captura (unido a
una fase sólida) y un segundo anticuerpo marcado que se une a otro
epítopo aparte del unido por el anticuerpo de captura. El segundo
anticuerpo marcado reconoce preferentemente el terminal amino de
\betaAP y se puede producir convenientemente contra un péptido
sintético que está compuesto esencialmente por los residuos de
aminoácidos 1 a 16 de \betaAP. Los procedimientos particulares
para preparar tales anticuerpos y utilizar tales anticuerpos en un
ELISA modelo están indicados en el apartado experimental más
adelante.
Se pueden emplear asimismo otras técnicas no
inmunológicas para detectar \betaAP y fragmentos de \betaAP que
no necesitan la utilización de anticuerpos específicos de
\betaAP. Por ejemplo, se puede emplear la electroforesis de gel
bidimensional para separar proteínas solubles íntimamente
relacionadas presentes en una muestra de fluido. Los anticuerpos que
son interreactivos con muchos fragmentos de APP, incluyendo
\betaAP, se pueden utilizar a continuación para probar los geles,
estando identificada la presencia de \betaAP basándose en su
posición exacta en el gel. En el caso de las células cultivadas,
las proteína celulares se pueden marcar metabólicamente y separar
por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida,
empleando opcionalmente inmunoprecipitación como etapa de
separación inicial. Un ejemplo específico del último enfoque se
describe en la sección experimental más adelante.
Los anticuerpos específicos para \betaAP se
pueden preparar contra un antígeno o hapteno adecuados que
comprende el epítopo objetivo deseado, tal como la zona de unión
que consta de los residuos 13 a 28 de aminoácidos y el terminal
amino que consiste en los residuos 1 a 16 de aminoácidos. Se pueden
preparar convenientemente, péptidos sintéticos mediante técnicas
convencionales en fase sólida, acoplados a un inmunógeno adecuado y
utilizar para preparar antisueros o anticuerpos monoclonales
mediante técnicas convencionales. Los haptenos del péptido adecuado
comprenden normalmente por lo menos cinco residuos contiguos dentro
del \betaAP y pueden incluir más de seis residuos.
Los haptenos de polipéptido sintético se pueden
producir por la técnica bien conocida de síntesis en fase sólida de
Merrifield, en la que los aminoácidos se añaden secuencialmente a
una cadena en desarrollo (Merrifield (1963) J. Am. Chem.
Soc. 85:2149-2156). Las secuencias de
aminoácidos pueden estar basadas en la secuencia del \betaAP
indicada anteriormente.
Una vez se ha obtenido suficiente cantidad de
hapteno de polipéptido, se puede conjugar con un vehículo
inmunógeno adecuado, tal como albúmina de suero, hemocianina de la
lapa de agujero de cerradura u otros vehículos de proteína
adecuados, como se describe generalmente en Hudson y Hay,
Practical Immunology, Blackwell Scientific Publications,
Oxford, capitulo 1.3, 1980. Un ejemplo de vehículo inmunógeno
utilizado en los ejemplos proporcionados a continuación es el
anticuerpo \alpha-CD3\varepsilon
(Boehringer-Mannheim, clon nº
145-2C11).
Una vez se ha obtenido suficiente cantidad de
inmunógeno, se pueden producir anticuerpos específicos para el
epítopo deseado mediante técnicas in vitro o in vivo.
Las técnicas in vitro implican la exposición de linfocitos
a los inmunógenos, mientras que las técnicas in vivo
necesitan la inyección de inmunógenos en un huésped vertebrado
adecuado. Los huéspedes vertebrados adecuados son no humanos,
incluyendo ratones, ratas, conejos, ovejas, cabras y similares. Los
inmunógenos se inyectan en el animal según un programa
predeterminado y se extrae sangre periódicamente a los animales,
mediante extracciones de sangre sucesivas con valoración y
especificidad mejoradas. Las inyecciones se pueden realizar por vía
intramuscular, intraperitoneal, subcutánea o similares, y se puede
emplear un adyuvante, tal como el adyuvante incompleto de
Freund.
Si se desea, se pueden obtener anticuerpos
monoclonales preparando líneas celulares inmortalizadas capaces de
producir anticuerpos con la especificidad deseada. Tales líneas
celulares inmortalizadas se pueden producir de varías maneras. Un
pequeño vertebrado, tal como un ratón se hiperinmuniza
convenientemente con el inmunógeno deseado por el procedimiento
recién descrito. El vertebrado se sacrifica a continuación,
normalmente varios días después de la inmunización final, se
extraen las células del bazo y se inmortalizan las células del
bazo. La forma de inmortalización no es crítica. Actualmente, la
técnica más frecuente es la fusión con una pareja de fusión de
células de mieloma, como describieron por primera vez Kohler y
Milstein (1975) Nature 256:495-497. Otras
técnicas incluyendo transformación por EBV, transformación con ADN
desnudo, p. ej.: oncogenes, retrovirus, etc., o cualquier otro
procedimiento que proporcione mantenimiento estable de la línea
celular y producción de anticuerpos monoclonales. Las técnicas
específicas para preparar anticuerpos monoclonales se describen en
Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lane, eds., Cold
Spring Harbor Laboratory, 1988.
Además de los anticuerpos monoclonales y de los
anticuerpos policlonales (antisueros), las técnicas de detección de
la presente invención serán también capaces de utilizar fragmentos
de anticuerpo, tales como F(ab), Fv, V_{L}, V_{H} y
otros fragmentos. En la utilización de anticuerpos policlonales, sin
embargo, es necesario adsorber los antisueros contra los epítopos
objetivo para producir una población de anticuerpo monoespecífico.
Será asimismo posible emplear anticuerpos producidos
recombiantemente (inmunoglobulinas) y variaciones de éstos tal como
se describe bien actualmente en la patente y en la bibliografía
científica. Véase, por ejemplo, los documentos EP 0123527 (EP
8430268.0); EP 0171496 (EP 85102665.8); EP 0173494
(EP 85305604.2); WO 86/01533 (PCT/GB 85/00392); EP 0184187 (EP
85115311.4); y la patente japonesa nº 62/00291 (solicitud
85239543). Sería asimismo posible preparar otras proteínas
recombinantes que simularían la especificidad de unión de los
anticuerpos preparados tal como se acaba de describir.
La detección in vivo de \betaAP en
muestras del paciente se puede utilizar para diagnosticar y
controlar la enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades
relacionadas con \betaAP, tales como el síndrome de Down y
HCHWA-D. Las muestras adecuadas de pacientes
comprenden los fluidos corporales, tales como sangre, CSF, orina y
fluido peritoneal. La presencia de la enfermedad relacionada con
\betaAP estará asociada generalmente con concentraciones elevadas
de \betaAP en el fluido comparadas con los valores en individuos
normales, es decir, individuos que no padecen la enfermedad de
Alzheimer o cualquier otra enfermedad relacionada con \betaAP.
Las concentraciones de diagnóstico de \betaAP en la sangre son
del orden de 0,1 ng/ml a 10 ng/ml o mayores, más generalmente de
0,1 ng/ml a 3 ng/ml. La concentraciones de diagnóstico de \betaAP
en CSF son del orden de 0,1 ng/ml a 25 ng/ml o
superiores, más generalmente 0,1 ng/ml a 5 ng/ml.
Además del diagnóstico inicial de la enfermedad
relacionada con \betaAP, las concentraciones medidas de \betaAP
se pueden controlar para seguir la evolución de la enfermedad y
seguir potencialmente la eficacia del tratamiento (cuando tales
tratamientos llegan a estar disponibles). Es de esperar que las
concentraciones de \betaAP disminuyan con un régimen de
tratamiento eficaz.
El control in vitro de las concentraciones
de \betaAP en un medio de cultivo acondicionado procedente de un
cultivo adecuado se puede utilizar para la identificación del
fármaco. Cultivando células en condiciones que producen la
acumulación de \betaAP en el medio de cultivo acondicionado y
exponiendo las células cultivadas a los compuestos de prueba, se
puede observar el efecto de estos compuestos de prueba sobre la
producción de BAP. Es de esperar que los compuestos de prueba que
son capaces de disminuir la cantidad de acumulación de \betaAP
sean candidatos para probar como inhibidores de la generación de
\betaAP. Las líneas celulares adecuadas incluyen líneas celulares
del ser humano y de animales, tales como la línea celular 293 del
riñón humano, las líneas celulares del neuroglioma humano, células
HeLa humanas, células endoteliales primarias humanas (p. ej.:
células HUVEC), fibroblastos primarios humanos o linfoblastos,
células de cerebro primarias humanas mezcladas (incluyendo
neuronas, astrocitos y neuroglia), células del ovario del hamster
chino (CHO) y similares.
En los procedimientos de identificación de
fármacos según la presente invención, se utilizan líneas celulares
capaces de expresar variantes de APP que sobreproducen \betaAP.
"Sobreproducir", significa que la cantidad de \betaAP
producida a partir de la APP variante es mayor que la cantidad
producida a partir de cualquier o de todas las isoformas de APP
normales, p. ej.:, las isoformas de 695, 751 y 770 aminoácidos que
se han descrito anteriormente. Son particularmente preferidas las
variantes de APP con una o varias sustituciones de aminoácidos
directamente aminoterminales del punto de escisión del \betaAP.
Por ejemplo, tal como se muestra el apartado experimental en la
presente memoria, las célula K293 que expresa una mutación doble
que lleva un ADN de APP (Lys^{595} \rightarrow Asn^{595} y
Met^{596} \rightarrow Leu^{596}) descubierta en una familia
con FAD sueca, producen aproximadamente de seis a ocho veces más
\betaAP que las células que expresan la APP normal. La mutación
en el residuo 596 parece ser principalmente responsable del
aumento.
De igual forma, el control in vivo de
\betaAP en modelos animales, tales como el modelo animal de ratón
dado a conocer en el documento WO 91/19810 y los modelos animales
que expresan otros isotipos de APP y/o variantes, se pueden también
utilizar para identificar la eficacia terapéutica de los compuestos
(generalmente para probar compuestos que se han identificado
previamente mediante una identificación in vitro, tal como la
identificación in vitro descrita anteriormente). El/los
compuesto(s) de la prueba se administran al animal y se
observa la concentración de \betaAP o de fragmento de \betaAP en
un fluido corporal. Los compuestos de prueba que reducen la
concentración del \betaAP en determinados fluidos corporales se
consideran candidatos para la evaluación posterior.
Los compuestos de prueba pueden ser cualquier
molécula, compuesto u otra sustancia que se puede añadir al cultivo
celular sin interferir sustancialmente con la viabilidad celular.
Los compuestos adecuados para la prueba pueden ser pequeñas
moléculas, polímeros biológicos, tales como polipéptidos,
polisacáridos, polinucleótidos y similares. Los compuestos de prueba
se administran típicamente al medio de cultivo a una concentración
en el intervalo desde aproximadamente 1 nM a 1 mM, generalmente
desde aproximadamente 10 \muM a 1 mM. Los compuestos de prueba
que son capaces de inhibir la generación, acumulación o segreción
de \betaAP se consideran candidatos para determinaciones
posteriores de la capacidad para disminuir la producción de
\betaAP en células y/o animales.
La presente invención comprende además
procedimientos para inhibir la producción
\beta-amiloide en células, en las que el
procedimiento comprende administrar a las células compuestos
seleccionados por el procedimiento descrito anteriormente. Los
compuestos se pueden añadir al cultivo celular para inhibir la
producción de \betaAP por las células cultivadas. Los compuestos
se pueden también administrar a un paciente para inhibir la
deposición de la placa amiloide relacionada con la enfermedad de
Alzheimer y otras enfermedades relacionadas con \betaAP.
La presente invención comprende además
composiciones farmacéuticas que incorporan un compuesto seleccionado
por el procedimiento descrito anteriormente y que incluyen un
vehículo farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones
farmacéuticas contendrían una cantidad terapéutica o profiláctica de
por lo menos un compuesto identificado por el procedimiento de la
presente invención. El vehículo farmacéuticamente aceptable puede
ser cualquier sustancia compatible, no tóxica, adecuada para
liberar los compuestos en un huésped deseado. Se puede utilizar
como vehículo agua esterilizada, alcohol, grasas, ceras y sólidos
inertes. Se pueden incorporar asimismo en las composiciones
farmacéuticas adyuvantes farmacéuticamente aceptables, agentes
tamponantes, agentes dispersantes y similares. La preparación de
las condiciones farmacéuticas que incorporan principios activos
está bien descrita en la bibliografía médica y científica. Véase,
por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciencies, Mack
Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 16ª ed., 1982.
Las composiciones farmacéuticas recién descritas
son adecuadas para la administración generalizada al huésped,
incluyendo tanto la administración parenteral como la tópica y la
oral. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar por vía
parenteral, es decir por vía subcutánea, intramuscular o
intravenosa. Por consiguiente, la presente invención proporciona
composiciones para la administración a un huésped, en la que las
composiciones comprenden una solución farmacéuticamente aceptable
del compuesto identificado en un vehículo aceptable, como se
describió anteriormente.
Frecuentemente, es deseable o necesario
introducir las composiciones farmacéuticas directa o indirectamente
en el cerebro. Las técnicas directas implican generalmente la
colocación de un catéter de administración del fármaco en el
sistema ventricular del huésped para desviar la barrera
sangre-cerebro. Las técnicas indirectas, que se
prefieren generalmente, implican formular las composiciones para
proporcionar el periodo de latencia del fármaco mediante la
conversión de fármacos hidrófilos en fármacos liposolubles. El
periodo de latencia se consigue generalmente mediante el bloqueo de
los grupos hidroxilo, carboxilo y amino primario presentes en el
fármaco para hacer al fármaco más liposoluble y susceptible al
transporte a través de la barrera sangre-cerebro.
Alternativamente, la administración de fármaco hidrófilos se puede
aumentar por infusión intraarterial o por soluciones hipertónicas
que pueden abrir transitoriamente la barrera
sangre-cerebro.
La concentración del compuesto en el vehículo
farmacéutico puede variar ampliamente, es decir desde menos de
aproximadamente 0,1% en peso de la composición farmacéutica a
aproximadamente el 20% en peso, o superior. La composición
farmacéutica típica para inyección intramuscular se prepararía para
contener, por ejemplo, de uno a cuatro ml de agua tamponada
esterilizada y de un \mug a un mg del compuesto identificado por
el procedimiento de la presente invención. La composición típica
para la infusión intravenosa se podría preparar para contener de
100 a 500 ml de solución esterilizada de Ringer y aproximadamente
de 1 a 100 mg del compuesto.
Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención se pueden administrar mediante tratamiento profiláctico
y/o terapéutico de las enfermedades relacionadas con la deposición
de \betaAP, tales como la enfermedad de Alzheimer, el síndrome de
Down y el envejecimiento del cerebro. En las aplicaciones
terapéuticas, las composiciones farmacéuticas se administran al
huésped que padece ya la enfermedad. Las composiciones farmacéuticas
se deben administrar en una cantidad suficiente para inhibir la
deposición posterior de la placa de \betaAP. Una cantidad
adecuada para llevar a cabo esto se define como una "dosis
terapéuticamente eficaz". Tal dosis eficaz dependerá de la
propagación de la enfermedad, de la envergadura del huésped y
similares, pero generalmente variará desde aproximadamente 0,01
\mug a 10 mg del compuesto por kilogramo de peso corporal del
huésped, siendo las dosis de 0,1 \mug a 1 mg/kg las más
frecuentemente empleadas.
Para aplicaciones profilácticas, las
composiciones farmacéuticas de la presente invención se administran
a un huésped susceptible a la enfermedad relacionada con \betaAP,
pero que no padece ya tal enfermedad. Tales huéspedes se pueden
identificar mediante detección genética y análisis clínico, tal como
se describe en la bibliografía médica (p. ej.: Goate (1991)
Nature 349:704-706). Las composiciones
farmacéuticas serán capaces de inhibir o evitar la deposición de la
placa de \betaAP en una etapa sintomáticamente inicial,
previniendo preferentemente incluso las etapas iniciales de la
enfermedad \beta-amiloide. La cantidad de
compuesto necesario para tal tratamiento profiláctico, referidas a
una dosis profilácticamente eficaz, es generalmente la misma que la
descrita anteriormente para el tratamiento terapéutico.
Los ejemplos siguientes se ofrecen a título de
ilustración, no de forma limitativa.
Se prepararon anticuerpos monoclonales para la
zona de unión al \betaAP utilizando un péptido sintético que
abarca los residuos de aminoácidos 13 a 28
(\betaAP_{13-28}). Se conjugó
\betaAP_{13-28} con un inmunógeno (anticuerpo
\alpha-CD3\varepsilon; clon nº
145-2C11, Boehringer-Mannheim)
utilizando éster de
m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida
(MBS) según las instrucciones del fabricante (Pierce).
Se inmunizaron inicialmente ratones A/J por vía
intraperitoneal (IP) con el conjugado \betaAP mezclado con
adyuvante completo de Freund. Catorce días después, se administró
una dosis IP a los ratones con el conjugado \betaAP mezclado con
solución salina tamponada con fosfato (PBS) en intervalos de 14
días. Después de seis dosis de refuerzo en total, se administró a
los ratones por último dosis de refuerzo por vía intravenosa con
conjugado \betaAP mezclado con PBS y se fusionaron 3 días
después. La fusión de células del bazo con células P3.653 de
mieloma se realizó según se describe en Oi y Herzenberg,
Selective Methods in Cellular Immunology, Mishell y Shigii,
eds., W.H. Freeman and Company, San Francisco, capítulo 17 (1980).
Las valoraciones del suero y las identificaciones iniciales se
realizaron por el procedimiento RIA descrito más adelante. Se
distribuyeron varios clones en una placa de 24 pocillos y se
sometieron a análisis posterior tal como se describe a
continuación. Los clones en cuestión se produjeron en ascitis de
ratón.
El procedimiento RIA utilizado para detectar
extracciones de suero y sobrenadantes de hibridoma de fusión estaba
basado en un procedimiento desarrollado por Wang et al.
(1977) J. Immunol. Methods 18:157-164. En
resumen, el sobrenadante (o el suero) se incubó toda la nocha a
temperatura ambiente en un agitador con
\betaAP_{1-28} marcado con _{125}I y granos
de Sepharose® 4B a los que se había acoplado IgG de oveja con
antiratón vía bromuro de cianógeno. Se recogieron los granos de
cada pocillo sobre discos filtrantes de fibra de vidrio con un
recogedor de células y se lavó varias veces con PBS. Los discos
filtrantes se transfirieron a continuación a tubos gamma y se hizo
el contaje de la radioactividad ligada con un contador gamma.
Se analizó el enlace de todos los hibridomas a
\betaAP_{1-28} utilizando el procedimiento
descrito anteriormente en la detección inicial y a continuación se
repitió el análisis 3 días después. Se caracterizó además la
reactividad de los clones positivos
\betaAP_{1-28} con
\betaAP_{1-16} marcado con ^{125}I utilizando
el procedimiento RIA descrito anteriormente. No se observaron
clones para unirse a \betaAP_{1-16}. En un ELISA
de captura de péptido, se observó que todos los clones reaccionan
con \betaAP_{13-28} mientras que ningún clon
reaccionó con \betaAP_{17-28}. Por consiguiente,
se decidió que todos los clones tuvieran un epítopo dentro de la
zona de unión que abarca los aminoácidos 16 y 17.
Sobre la base de los resultados de los análisis
anteriores, se distribuyeron varios clones en placas de 24
pocillos. Estos clones se caracterizaron además por análisis de
saturación. Se añadieron sobrenadantes en el del punto de
valoración del 50% (determinado por el procedimiento RIA descrito
anteriormente) a los pocillos que contenían granos de Sepharose®-IgG
de oveja con anti-ratón, una cantidad constante de
\betaAP_{1-28} marcado con ^{125}I y
cantidades variables de \betaAP_{13-28} o
\betaAP_{17-28} sin marcar. Se determinó para
cada anticuerpo la concentración de péptido frío para el 50% de
inhibición. No se observó inhibición para el
\betaAP_{17-28} a 100 ng/pocillo para ningún
clon. El punto de inhibición del 50% para
\betaAP_{13-28} varió de 10 a 80 ng/pocillo. Los
clones se caracterizaron asimismo basándose en la reactidad en las
transferencias de Western. Se produjeron varios clones en ascitis
basándose en el punto de valoración, sensibilidad (determinada por
el punto de inhibición al 50%) y en la reactividad en la
transferencia de Western.
Se seleccionaron anticuerpos de los hibridomas
denominados 067, 266, 297 y 361 para utilización como anticuerpo de
captura en el análisis descrito a continuación.
Se prepararon anticuerpos monoclonales para la
zona N-terminal de \betaAP utilizando un péptido
sintético que abarca los residuos de aminoácidos 1 a 28
(\betaAP_{1-28}). Se acopló químicamente
\betaAP_{1-28} utilizando suberato de
disuccinimilo (DSS) en albúmina de suero de conejo (RSA) utilizando
un relación molar 20:1 de péptido a proteína en fosfato de sodio 50
mM, pH 7,0, NaCl 150 mM, toda la noche a 21ºC utilizando DSS 1 mM
(Hyman et al. (1992) J. Neuropath. Exp. Neuro.
51:76).
Se obtuvieron los anticuerpos 10D5 y 6C6 a partir
de una fusión en la que los ratones habían recibido 5 inyecciones
de \betaAP_{1-28} acoplado a RSA vía DSS a 100
\mug/ml. La inyección inicial fue en adyuvante completo de Freund
(CFA) seguida por una segunda y posteriores inyecciones en adyuvante
incompleto de Freund (IFA) cada 10 a 14 días. Tres días antes de la
fusión, el ratón 4 que tenía un valor de 1/70.000 medido mediante
ELISA frente a \betaAP_{1-28}, recibió 100
\mug de \betaAP_{1-28} RSA en PBS por vía
intraperitoneal como refuerzo final. Se hizo la detección por ELISA
y en secciones de cerebro con AD fijadas con parafina. La
concentración del recubrimiento de
\betaAP_{1-28} fue de 1 \mug/pocillo. 10D5 y
6C6 fueron positivas por ELISA y la sección de tejido cerebral con
AD.
En los análisis descritos a continuación se
seleccionaron anticuerpos de los hibridomas denominados 10D5 y 6C6
para utilizar como anticuerpo indicador.
Se produjeron anticuerpos policlonales frente a
péptido sintéticos \betaAP_{1-38}4,
\betaAP_{1-40} y
\betaAP_{1-42} y se denominaron
anti-\betaAP_{1-38} (antisuero
Y), anti-\betaAP_{1-40}
(antisuero 1280) y
anti-\betaAP_{1-42} (antisuero
HM). Se inmunizaron conejos con 0,5 a 3,0 mg de uno de estos
péptidos (no conjugados) en adyuvante completo de Freund por vía
intradérmica. Los conejos recibieron inyecciones de refuerzo de 0,1
a 0,5 mg de péptido 3 semanas después de la inmunización principal
y aproximadamente a intervalos de 2 a 4 semanas después de ésta
hasta que se pudieron detectar valores elevados de reactividad
anti-péptido en las muestras de suero de conejo.
Estos antisueros se utilizaron a continuación en análisis
inmunológico a diluciones que varían de 1:300 a 1:1.500.
Se diluyó anticuerpo monoclonal 266 hasta una
concentración de 5 \mug/ml y el anticuerpo monoclonal 067 a 10
\mug/ml en un tampón conteniendo
NaH_{2}PO_{4}\cdot7H_{2}O, 26,2 g/l; NaN_{3}, 1 g/l; pH
8,3. Cien \mul/pocillo de esta solución se repartió a continuación
en una placa COSTAR de poliestireno transparente de 96 pocillos y
se incubó toda la noche a temperatura ambiente. Después de
recubrir, la solución restante se aspiró y se bloquearon los puntos
de unión no específicos al anticuerpo con albúmina de suero humano
(HSA) al 0,25% disuelta en un tampón que contenía
NaH_{2}PO_{4}\cdotH_{2}O, 1 g/l;
Na_{2}HPO_{4}\cdot7H_{2}O, 10,8 g/l; NaN_{3}, 0,5 g/l y
sacarosa, 25 g/l; pH 7,4. Estas placas recubiertas/bloqueadas se
utilizaron inmediatamente o se secaron en un desecador y se
guardaron en un recipiente seco a 4ºC durante un máximo de 5
días.
Se añadieron a continuación calibradores que
contenían cantidades conocidas de \betaAP y muestras de varios
fluidos corporales o extracorporales a la placa a 100
\mul/pocillo. Se añadieron las muestras sin diluir o diluidas en
un tampón que contenía NaH_{2}PO_{4}\cdotH_{2}O, 0,2 g/l;
Na_{2}HPO_{4}\cdot7H_{2}O, 2,16 g/l; NaN_{3}, 0,5 g/l; BSA
(sin globulina) 6 g/l; Triton
X-405, 0,5 ml/l; NaCl, 8,5 g/l; pH 7,4. Las muestras y los calibradores se incubaron en los pocillos durante 1 hora a temperatura ambiente, posteriormente se aspiraron y se lavaron los pocillos con 300 \mul/pocillo de una solución que contenía NaCl, 80 g/l; KCl, 3,8 g/l; base Tris, 5,85 g/l; Tris HCl, 31,75 g/l y Tween® 20 al 0,05%; pH 7,5 (TBS).
X-405, 0,5 ml/l; NaCl, 8,5 g/l; pH 7,4. Las muestras y los calibradores se incubaron en los pocillos durante 1 hora a temperatura ambiente, posteriormente se aspiraron y se lavaron los pocillos con 300 \mul/pocillo de una solución que contenía NaCl, 80 g/l; KCl, 3,8 g/l; base Tris, 5,85 g/l; Tris HCl, 31,75 g/l y Tween® 20 al 0,05%; pH 7,5 (TBS).
Se disolvió NHS-biotina (15 mg)
en 0,25 ml de dimetilsulfóxido y se añadió 10 \mul de esta
solución a 1 mg de anticuerpo 10D5 ó 6C6 puesto en suspensión en 1
ml de solución de carbonato de sodio, 50 mM, pH 8,5. Se incubó la
mezcla en la oscuridad durante 1½ horas a temperatura ambiente y a
continuación se dializó frente a solución salina tamponada con
fosfato, pH 7,4 durante 48 horas a 4ºC, para producir anticuerpo
indicador biotinilado. Se diluyeron cien \mul/pocillo del
anticuerpo indicador biotinilado (10D5 ó 6C6) diluido a 3
\mug/ml, a continuación se añadieron a cada pocillo y se incubaron
durante otra hora a temperatura ambiente. El diluyente del
anticuerpo estaba compuesto por Trizma base, 1,21 g/l; NaCl, 29,22
g/l; NaN_{3}, 1,5 g/l; Triton X-405, 0,5 ml/l;
PEG (Mw 3350), 40 g/l; MgCl_{2}\cdot6H_{2}O, 0,095 g/l;
ZnCl_{2}, 0,014 g/l; suero bovino fetal 100 ml/l y BSA 2,5 g/l, pH
7,4.
Después de 1 hora de incubación a temperatura
ambiente con el anticuerpo indicador (10D5 ó 6C6) se aspiró el
sobrenadante y se lavaron los pocillos tres veces con 300
\mul/pocillo de TBS. Se añadió fosfatasa alcalina con
estreptavidina (100 \mul/pocillo diluida a 1:2000 en el tampón
diluyente conjugado) y se incubó durante otra hora a temperatura
ambiente. A continuación se aspiró el sobrenadante y se lavó 3
veces con 300 \mul/pocillo de TBS. Se añadió sustrato
fluorescente (fosfato de
4-metil-umbeliferil en tampón de
2-amino-2-metil
propanolol; pH 9,5; (100 \mul/pocillo)) y se tomó el dato de la
fluorescencia y se expresó como unidades de fluorescencia relativa
(FSU) después de 15 minutos utilizando Cytofluor 2300 de Millipore,
con un filtro de excitación 360/40 y un filtro de emisión
460/40.
Se cultivaron células humanas (y células de otros
mamíferos) en condiciones de cultivo celular normal en platos de
plástico o en placas de microvaloración de varios pocillos. En
particular, las células 293 del carcinoma de riñón embriónico (en
lo sucesivo denominadas células K293) se cultivaron en el medio de
Eagle modificado con Dulbecco (DMEM) que contenían suero de ternero
fetal al 10% y antibióticos. Las células K293 que habían sido
transfectadas previamente con una construcción de ADN recombinante
conteniendo la zona de codificación completa de la proteína
precursora \beta-amiloide (APP) se utilizaron
además de las células K293 sin transfectar (Selkoe et al.
(1988) Proc. Acad. Sci. USA 85:7341-7345 y
Oltersdorf et al. (1990) J. Biol. Chem.
265:4492-4497). Las células transfectadas expresan
grandes concentraciones de la proteína APP, comparadas con las
concentraciones de fondo habituales de la APP endógena
característica de las células K293.
Se cultivaron asimismo otros diversos tipos de
células, incluyendo las células endoteliales de la vena umbilical
humana (HUVEC); una línea celular leucémica megacariocitoidea
humana denominada DAMI; células del ovario del hamster chino (CHO),
fibroblastos primarios humanos y cultivos celulares primarios de
cerebro mezclados (incluyendo neuronas, astrocitos y microglia)
probados en cerebro humano o de roedor.
Estas diversas líneas celulares se cultivaron a
37ºC en un incubador de cultivos de tejidos que contenían una
atmósfera de oxígeno al 95% y de dióxido de carbono al 5%. Las
células se subcultivaron de forma rutinaria aportando medio de
cultivo reciente a intervalos regulares. El fluido extracelular que
rodea las células (medio acondicionado) se recogió del cultivo
celular bien en las condiciones de reposo habituales o siguiendo
varios tratamientos bioquímicos de las células. Todas las células
cultivadas y sus muestras de los medios derivados se manipularon en
condiciones asépticas.
Se prepararon cultivos de células de cerebro
humano mezcladas para utilización en estudios cromatográficos de
inmunoafinidad, como sigue. Se obtuvieron muestras de tejido
neural fetal de cadáveres fetales de 12 a 14 semanas de edad. Se
enjuagaron dos veces muestras de córtex cerebral con solución
salina equilibrada de Hank (HBSS). Se colocó tejido cortical (2 a 3
gramos) en 10 mls de HBSS fría a la que se añadió 1 mg de DNasa
(Sigma Chemical Co., Sant Louis, MO D3427). La suspensión
disgregada se filtró a través de tamices Nitex de nilón de 210
\mum, a continuación de 130 \mum, como describió Pulliam et
al. (1984) J. Virol. Met. 9:301.
Se recogieron las células por centrifugación y se
volvieron a poner en suspensión en medio neuronal (MEM reforzado
con suero bovino fetal al 10%, glucosa al 1%, piruvato Na 1 mM,
glutamina 1 mM, KCl 20 mM). Los platos de 100 mm recubiertos con
polietilenimina se sembraron con 1,5 \times 10^{7} células en 8
ml de medio neuronal. Se recogió el medio y se añadió medio reciente
dos veces a la semana. El medio acondicionado procedente de las
células (HFBC-CM) se congeló hasta la
utilización.
Células K293 cultivadas en condiciones de cultivo
normal experimentaron marcado metabólico de proteínas recién
sintetizadas mediante adición de metionina radiomarcada con
^{35}S en el medio de cultivo. Durante esta etapa, el medio
contenía metionina no marcada ("fría") pero fue por otra parte
idéntico al medio normal utilizado para las células de cultivo
K293. Cantidades de meteonina radioactiva que varían de 50 a 300
\muCi/ml de medio se utilizaron en los experimentos de marcado.
Se incubaron células durante aproximadamente 10 a 20 horas. A
continuación, se recogió el medio que contiene proteínas
radiomarcadas liberadas de las células.
Un anticuerpo policlonal producido en un péptido
\betaAP sintético que comprende los aminoácidos
Asp-1 hasta Val-40
(\betaAP_{1-40}) se añadió al medio recogido y
se incubó durante periodos que varían de 2 a 10 horas. Esto
permitió que se formaran complejos
antígeno-anticuerpo entre el anticuerpo
anti-\betaAP y cualquier péptido \betaAP
presente en los medios de cultivo. A continuación, se añadió un
reactivo de la proteína A-Sepharose® capaz de
unirse a inmunoglobulinas (anticuerpos), y esta mezcla se incubó
posteriormente durante varios periodos de 2 a 10 horas. Esta
incubación permitió a los granos de proteína
A-Sepharose® unirse a anticuerpos
anti-\betaAP que a su vez se unieron al péptido
\betaAP. El medio acondicionado se centrifugó a continuación a
12.000 \times g durante 12 minutos para sedimentar los granos de
los complejos
antígeno-anticuerpo-proteína
A-Sepharose®.
Se realizó la electroforesis de los
inmunoprecipitados del medio procedentes de células marcadas
metabólicamente en geles de Tristicina del 10 al 20%, que tiene la
ventaja de resolver bien las proteínas de bajo peso molecular
(tales como \betaAP). Se secaron a continuación los geles y se
expusieron en una película de rayos-X para producir
un autorradiograma o fluorograma. Los tiempos de exposición
variaban pero generalmente estuvieron en el intervalo de 2 a 7
días. Después del revelado de la película de
rayos-X, cualquiera de las proteínas radiomarcadas
que se habían precipitado, procedentes del medio celular, mediante
el anticuerpo anti-\betaAP se visualizaron como
bandas oscuras en el peso molecular apropiado (es decir, 4 kD).
Se dializó el anticuerpo 266 (15 ml a 0,85
mg/ml) frente a acetato Na 10 mM, NaCl 15 mm, pH 5,5 y a
continuación se acoplaron a hidrazida Hz Affi-Gel®
(Bio-Rad, Richmond, CA) según el protocolo del
fabricante, utilizando aproximadamente 5 ml de resina. Se colocó un
ml de resina en una columna de 1 \times 10 cm para la
purificación de \betaAP procedente de 4 litros de medio
acondicionado.
Se sometieron muestras a SDS-PAGE
en geles de Tricine (Novex) del 10 al 20% y se transfirieron a
membranas de PVDF (Pro-blot, Applied Biosystems) a
40 voltios, toda la noche, en el sistema de tampón descrito por
Towbin, et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
76:4350-4354. La visualización de proteínas
inmunorreactivas empleó el sistema de quimioluminiscencia
TROPIX según las directrices del fabricante para el sustrato AMPPD.
El anticuerpo primario utilizado fue 10D5 a una concentración de 5
\mug/ml.
La mutación sueca implica dos conversiones de
pares de bases adyacentes: nucleótido 1785 G a T y nucleótido 1786 A
a C que conduce a dos intercambios de aminoácido: Lys \rightarrow
Asn^{595} y Met \rightarrow Leu^{596} (toda la numeración está
basada en APP_{695}).
Para analizar el efecto bioquímico de esta
mutación sobre el metabolismo de APP in vitro se introdujo
mediante mutagénesis in vitro en un vector de expresión para
la expresión eucariótica de moléculas de APP (descritas en Selkoe
et al., 1988 supra). En este caso, se utilizaron ambas
formas del vector que llevan las formas de aminoácidos 695 y 751 de
APP. La mutagénesis se realizó mediante la utilización de dos
cebadores de oligonucleótido procedentes de la secuencia de APP y
de la reacción en cadena de polimerasa (PCR). El cebador 1 (cadena
transcrita) es un 30-mero y posee la secuencia GAG
GAG ATC TCT GAA GTG AAT CTG GAT GCA. Este cebador contiene un punto
en la endonucleasa de restricción BglII (AGA TCT) correspondiente
al punto BglII en la posición 1770 de APP y contiene los dos
intercambios de nucleótido descritos en las posiciones 24 y 25 del
cebador. El cebador 2 (cadena complementaria) es un
29-mero con la secuencia AAT CTA TTC ATG CAC TAG
TTT GAT ACA GC. El cebador contiene un punto en la endonucleasa de
restricción SpeI (ACT AGT) correspondiente a la posición 2360 de
APP. Utilizando un ADNc de APP normal para una plantilla, los dos
cebadores permiten la creación de un fragmento de ADN de
aproximadamente 600 pares de bases de longitud mediante PCR
estándar (reactivos y protocolos de Perkin Elmer). El fragmento
obtenido así como el vector de expresión que contiene el ADNc de
APP normal se escindió con las endonucleasas de restricción BgIII y
SpeI.
BglII y SpeI se seleccionaron debido a que ambos
son los únicos puntos de corte en este vector y por lo tanto
permiten la eliminación simple del fragmento de restricción no
mutado correspondiente al fragmento creado por PCR. Por
consiguiente el fragmento del vector de aproximadamente 600 pares de
bases se sustituyó por el fragmento generado por PCR de igual
longitud que realiza la mutación por técnicas estándar. El ADN de
los clones bacterianos recombinantes se obtuvo por procedimientos
estándar, que se detectó por la ausencia de un punto en la
endonucleasa de restricción Mbo II. A continuación se confirmó la
secuencia del ADN por secuenciado de la zona completa que ha
experimentado la reacción PCR.
Además de la construcción de la doble mutación,
se examinaron independientemente los efectos de cada una de las dos
mutaciones. Utilizando cebadores apropiados o oligonucleótidos
específicos bien para la sustitución 595
Lys \rightarrow Asn o para la sustitución 596 Met \rightarrow Leu, se prepararon las construcciones de ADN y se utilizaron para transfectar células K293 tal como se describió.
Lys \rightarrow Asn o para la sustitución 596 Met \rightarrow Leu, se prepararon las construcciones de ADN y se utilizaron para transfectar células K293 tal como se describió.
El análisis de los efectos de la mutación se
realizó mediante la expresión transitoria del clon mutado obtenido
en las células 293. Se utilizó el procedimiento de transfección con
reactivo DOTAP según las especificaciones del fabricante
(Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN). Se recogió el medio
acondicionado 48 horas después de la transfección. La eficacia de la
transfección se evaluó mediante un ELISA en sandwich para
APP en el medio acondicionado con anticuerpos B5 policlonales
purificados por afinidad (biotinilados) en una proteína de fusión
bacteriana de APP_{444-592} y en el anticuerpo de
captura B3, en una proteína de fusión bacteriana de
APP_{20-304}. Se midieron las concentraciones de
\betaAP mediante el ELISA descrito anteriormente en el Ejemplo 2.
Como se describe a continuación, la medición de \betaAP en el
medio acondicionado de células K293 transfectadas transitoriamente
que expresan la forma variante sueca de APP presentan un aumento de
6 a 7 veces en la producción de \betaAP.
Se utilizó el análisis ELISA de \betaAP para
detectar cantidades conocidas de péptidos \betaAP sitéticos
\betaAP_{1-38} y
\betaAP_{1-40}. El análisis que emplea el
anticuerpo de captura 266 y el anticuerpo indicador 10D5 fue capaz
de detectar los péptidos en 0,1 ng/ml. Véase la Fig. 1. Además,
el análisis con 266/10D5 se observó que no interreacciona
significativamente con la APP completa, con la APP 695 ó 751
segregadas, con las construcciones 15 ó 6 con fragmentos de APP
recombinantes, con fragmentos de \betaAP 15 a 20, 11 a 18, 13 a
18 ó 13 a 20 o con fibrinógeno (Tabla I).
| Molécula | ng/ml | Reactividad cruzada, % |
| APP completa | 1-100 | 0 |
| APP 695 segregada | 1-100 | 0 |
| APP 751 segregada | 1-100 | 0 |
| Construcción 15* | 1-100 | 0 |
| Contrucción 6** | 1-100 | < 0,1 |
| Fragmento 15 a 20 de \betaAP | 1-1000 | 0 |
| Fragmento 11 a 18 de \betaAP | 1-1000 | 0 |
| Fragmento 13 a 18 de \betaAP | 1-1000 | 0 |
| Fragmento 13 a 20 de \betaAP | 1-1000 | 0,2 |
| Fibrinógeno tipo I | 1-1000 | 0 |
| Fibrinógeno tipo II | 1-1000 | 0 |
| Fibrinógeno tipo III | 1-1000 | 0 |
| * Descrito en Sinha et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:2104-21013 | ||
| ** Residuos 590 a 695, tal como se numeran en la isoforma 695 |
El análisis ELISA se utilizó para detectar
muestras de sangre y de CSF en el ser humano, perros, cerdos de
Guinea y ratas. Se encontraron cantidades detectables de \betaAP,
con concentraciones en los intervalos indicados en la Tabla II.
| Especie | \betaAP de CSF (ng/ml) | \betaAP de plasma (ng/ml) |
| Humana | 0,1 - 20,0 | 0,1 - 30,0 |
| Perro | 2,0 - 10,0 | 2,0 |
| Cerdo de Guinea | 2,5 -8,0 | 4,0 - 5,0 |
| Rata | 1,5 | ND |
| Conejo | 1,5 - 9,0 | 0,5 - 3,0 |
Se realizó un estudio comparativo en grupos de
individuos normales y de pacientes de AD, tanto en el plasma como
en el CSF. Las muestras se identificaron utilizando el análisis
ELISA, con los resultados indicados en la Fig. 2A para el plasma y
los resultados indicados en la Fig. 2B para el CSF. Las
concentraciones de \betaAP en el CSF para individuos normales (C),
pacientes de AD, de accidente cerebrovascular (CVA) y de enfermedad
de Parkinson (PD) se indican en la Fig. 3. Un grupo de CSF de
aproximadamente 1000 individuos tenía un valor medio de 2,5 ng/ml
en CSF, marcado con un círculo en la Fig. 3, fila C. El resto de
los individuos de referencia tenía una variedad de enfermedades
degenerativas neuronales sin AD. Los valores medios de AD están muy
por encima del valor del grupo de referencia.
Se analizó la liberación de \betaAP en un
número de células cultivadas transfectadas y no transfectadas
utilizando el análisis ELISA. Se observó que todas las células
analizadas liberan \betaAP en el medio de cultivo, liberando
mayores concentraciones las células transfectadas con APP que las
células cultivadas no transfectadas, como se indica en la Tabla
III.
| Tipo de células | Transfección | \betaAP (ng/ml) |
| K293 | - - - | 0,1 - 0,4 |
| K293 | 695 | 1,6 - 2,5 |
| K293 | 751 | 1,2 - 2,5 |
| Células de cerebro mezcladas | - - - | 4,0 |
| CHO | 751 | 2,0 - 9,0 |
Utilizando el análisis de
inmunoprecipitación/autorradiografía descrito anteriormente en el
Ejemplo 4, se demostró que el anticuerpo policlonal 1280
inmunoprecipitaba una proteína de 4 kD procedente del medio celular
K293 que migraba exactamente junto con una muestra estándar del
péptido \betaAP_{1-40} sintético radioyodado.
Además, se precipitó simultáneamente una proteína de 3 kD. Ésta
parece ser un fragmento de \betaAP que carece de los primeros 10
ó 16 aminoácidos. Al absorber el anticuerpo 1280 con péptido
sintético \betaAP_{1-40} para bloquear su
actividad, no precipitaron las bandas de 3 kD ni las de 4 kD
procedentes del medio celular K293. Cuando el medio acondicionado
de células K293 que sobreexpresan APP se centrifugó a 100.000
\times g durante 2 horas (para decantar cualquier material
proteico insoluble), la inmunoprecipitación/autorradigrafía con el
anticuerpo 1280 demostró que sustancialmente todas las proteínas de
3 kD y de 4 kD permanecian en el sobrenadante, (véase la Fig. 6).
Este experimento demuestra que la \betaAP encontrada en el medio
de cultivo es una molécula soluble, a diferencia de las
descripciones anteriores acerca de \betaAP en el tejido del
cerebro humano postmortem (véase por ejemplo, Glenner y Wong
(1984), supra).
Se confirmó la precipitación del \betaAP de 4
kD que migra junto con el péptido procedente del medio de las
células K293 transfectadas con ADNc de \betaAPP utilizando
anticuerpos de \betaAP adicionales. El anticuerpo Y del péptido
\betaAP_{1-38} sintético precipitó la proteína
de 4 kD de manera idéntica al anticuerpo 1280. Asimismo, el
anticuerpo HM de \betaAP_{1-42} sintético
precipitó la proteína de 4 kD. Como referencia, cada uno de estos
anticuerpos fue preabsorbido con su antígeno del péptido sintético,
neutralizando de este modo su actividad. Después de esto, los
anticuerpos no inmunoprecipitaron más el péptido \betaAP de 4 kD
procedente del medio acondicionado. Como referencia adicional, los
sueros preinmunes (es decir, una muestra de suero normal extraída
de cada conejo se utilizó para aumentar los anticuerpos
policlonales antes de la inmunización existente) no
inmunoprecipitaron el péptido de 4 kD procedente del medio.
Para determinar la especificidad inmunoquímica
del péptido de 4 kD que migra junto con \betaAP precipitado en el
medio, se utilizaron otros anticuerpos para las zonas de APP que
flanquean la zona de \betaAP en el análisis de
inmunoprecipitación/autorradiografía anterior. Por ejemplo, un
anticuerpo para la zona de los 20 aminoácidos, inmediata al terminal
amino al comienzo de la zona \betaAP de APP, fue incapaz de
precipitar el péptido de 4 kD del medio. Asimismo, un anticuerpo
para los últimos 20 aminoácidos en el terminal carboxilo de APP (60
aminoácidos fuera de la zona \betaAP) fue incapaz asimismo de
precipitar el péptido de 4 kD. En cambio, un anticuerpo para los
primeros 15 residuos de \betaAP precipitó con éxito la banda de 4
kD. Asimismo, los anticuerpos para la porción media de \betaAP
también precipitaron el péptido de 4 kD, pero no el péptido de 3 kD
tratado anteriormente. Estas diversas precipitaciones del
anticuerpo demuestran que el péptido de 4 kD presente en el medio
de las células cultivadas (p. ej.: células K293) muestra las
reactividades inmunoquímicas específicas características de
\betaAP. El péptido de 3 kD en el medio muestra la reactividad
inmunoquímica específica de \betaAP que carece de los primeros 10
ó 16 residuos. La prueba de que los anticuerpos fueron activos en
cada reacción fue proporcionada mediante la coprecipitación del
mismo medio del fragmento normal segregado de APP (denominado
"APP soluble" o "APP_{s}") siempre que las reacciones de
precipitación se realicen con anticuerpos para esta zona de APP. Se
sabe que este fragmento grande de APP soluble está presente
normalmente en los medios de células cultivadas que expresan APP.
Su coprecipitación mediante anticuerpos
anti-\betaAP representa de este modo una reacción
de referencia positiva que demuestra la actividad íntegra de los
anticuerpos utilizados en este análisis.
Como reacción de referencia adicional para
demostrar que la proteína de 4 kD inmunoprecipitada que emigra
junto con el \betaAP sintético representaba realmente el
\betaAP auténtico, se comparó el medio de las células
transfectadas con ADNc de APP (y sobre expresando de este modo APP)
con el medio de las células no transfectadas. La
inmunoprecipitación/autorradiografía mostró un aumento en la
cantidad de proteína de 4 kD precipitable en el medio de las
células transfectadas a las no transfectadas, como es de esperar por
su aumento de producción de la molécula precursora de APP. Véase la
Fig. 5. De modo similar, los medios de las células transfectadas
mostraron más fragmento soluble de APP_{s} de APP que los medios
de las células no transfectadas; esta reacción de referencia
positiva se observó simultáneamente en los inmunoprecipitados que
contienen la proteína de 4 kD.
El mismo resultado se obtuvo cuando se utilizó un
tipo de célula diferente, células de ovario de hamster chino (CHO).
La comparación de las células del CHO bien sin transfectar o
transfectadas con ADNc de APP mostró aumento de la concentración
del péptido precipitable 1280 de 4 kD en el medio de las últimas
células. Estos resultados proporcionaron pruebas adicionales de que
la proteína de 4 kD en el medio celular fue el \betaAP
auténtico.
Se extrajo \betaAP natural, auténtico de córtex
cerebral humano procedente de la autopsia de pacientes que murieron
de AD. Esta muestra de A\beta procedente del tejido del cerebro
con AD migró junto con el péptido precipitable 1280 de 4 kD del
medio cultivo celular cuando se analizó por electroforesis en gel
de SDS-poliacrilamida. Esta migración conjunta
proporcionó soporte adicional para la identidad del péptido de 4 kD
como \betaAP.
Se descongelaron cuatro litros de medio de
cultivo acondicionado de cerebro fetal humano
(HFBC-CM) y se filtraron a través de un embudo de
filtración de 0,45 \mum. Se añadieron al HFBC-CM,
leupeptina (1 \mug/ml) y PMSF (35 \mug/ml) tomados de
existencias de 35 mg/ml en isopropanol, inmediatamente antes de la
cromatografía de afinidad. El material se pasó a través de la
columna 266 de afinidad a un caudal de aproximadamente 2 ml/min a
4ºC. A continuación se lavó la columna con 500 ml de PBS. La elución
del material unido específicamente a la resina se consiguió con
glicina 0,2 M, pH 2,0. Se utilizó un total de 9 ml.
El material eluido se sometió a dos etapas de
cromatografía líquida en fase inversa utilizando una columna Vydac
C4 [0,21 \times 15 cm] en fase inversa y un sistema de disolvente
que contenía TFA al 0,1% en tampón "A" y TFA al
0,1%/acetonitrilo al 80% en tampón "B". El material purificado
por afinidad se cargó en la columna de fase inversa a 200
\mul/min y se lavó a continuación con tampón
"A" al 80% y tampón "B" al 20% a 200 \mul/min durante
60 min y 50 \mul/min durante 42 min para equilibrar la columna y
estabilizar el valor de referencia. Se ejecutó un gradiente
procedente de "B" del 20% al 70% durante 50 min a 50
\mul/min y se controló el eluyente en OD_{220}. Se recogieron
fracciones de 100 \mul y se analizaron tanto por transferencia de
Western como por ELISA. Sobre la base de estos resultados, se
agruparon las fracciones 11 y 12 y se volvieron a cromatografíar en
condiciones casi idénticas excepto que se empleó un gradiente de
150 min desde el 10 al 40% de "B" seguido de un gradiente de
20 min desde el 40 al 100% de "B".
Se observó que la fracción 77 de la segunda etapa
de la cromatografía en fase inversa era reactiva frente al
anticuerpo 10D5 tanto por transferencia de Western (Fig. 4) como
por ELISA.
Se realizó una microsecuencia de una alícuota del
material en la fracción 77 y demostró poseer la secuencia
N-terminal de \betaAP, que comienza por Asp. Se
realizó la microsecuencia en un secuenciador de proteínas de Applied
Biosystems modelo 477 utilizando un cartucho de reacción a
microescala y ciclos del programa MICFST de Applied Biosystems.
Una segunda alícuota se sometió a espectrometría
de masa de ionización por electroatomización, llevada a cabo en
M-SCAN, Inc., revelando un pico de masa a 4329,81
(+/- 1,27 SD) que correspondería a la masa esperada de \betaAP
1-40 (peso molecular teórico de 4330,4). El
secuenciado N-terminal de varios picos de A_{220}
fue positivo para \betaAP. El ELISA reveló que la secuencia
\betaAP estaba presente en la fracciones 65, 70 y 75 además del
pico principal en la fracción 77. Las fracciones 65 y 70 contenían
una secuencia adicional de un fragmento de \betaAP no descrito
que comienza en el residuo 11 (Glu) de \betaAP. En la fracción
65, estaba presente suficiente material para secuenciar todo el
residuo 33 de \betaAP.
Transferencia de Western (Fig. 4) de las
fracciones RPLC de material purificado por
afinidad-266 procedente de HFBC-CM.
Se diluyeron 3 \mul de las fracciones indicadas con 15 \mul de
tampón de la muestra SDS-PAGE y se neutralizó con 1
\mul de NaOH 1 M antes de hervir y tratar como se describió
anteriormente. El material cargado en las respectivas vías fue el
siguiente:
| Vía | Fracción RPLC |
| 1 | 65 |
| 2 | 70 |
| 3 | 71 |
| 4 | 74 |
| 5 | 75 |
| 6 | 77 |
| 7 | 78 |
| 8 | 79 |
| 9 | 83 |
| 10 | 84 |
| 11 | 85 |
La vía 12 fue tampón sólamente; la vía 13
contenía 20 ng de \betaAP 1-38; la vía 14
contiene 100 ng de \betaAP 1-38; la vía 15
contiene patrones Rainbow® (Amersham) de bajo peso molecular.
Obsérvese que la banda aproximada de 4 kD en la vía 6 migra junto
con el patron \betaAP en la vía 14.
Se llevaron a cabo experimentos paralelos a los
descritos para HFBC-CM utilizando 4 litros de CSF
humano para caracterizar estructuralmente la inmunorreactividad de
\betaAP procedente de este origen. Los datos de secuenciado
confirmaron la presencia de secuencias N-terminales
que comienzan por el residuo 1 de \betaAP (Asp) y por el residuo
11 de \betaAP (Glu).
El aumento en las concentraciones de \betaAP en
el medio de los transfectantes suecos se cuantificó utilizando el
ELISA específico para \betaAP con anticuerpos monoclonales 266 y
6C6. El ELISA en sandwich para APPS utilizó anticuerpos
policlonales B5 y B3. Se utilizaron para cada ELISA, cantidades
crecientes de \betaAP_{1-40} sintético
purificado o APP_{S} purificada procedente del medio
acondicionado de células K293 transfectadas con ADNc para la
isoforma 695 de APP para construir una curva patrón. La
cuantificación de \betaAP (panel izquierdo) y de APP_{S} (panel
derecho) en el medio acondicionado en las células K293
transfectadas transitoriamente se muestra en la Fig. 7. Cada
columna representa la media de cuatro transfecciones con la
excepción de la columna simulada, que se basa en tres cultivos. Las
barras de error indican la desviación estándar. Para las columnas
sin barras de error, la desviación estándar fue inferior a 0,01
unidades.
Tal como se muestra en la Fig. 7, las células que
expresan la construcción 695 de la variante APP sueca produjeron de
6 a 7 veces más \betaAP como promedio que las células
transfectadas idénticamente que expresan APP normal (isoforma 695).
Además, se observó un aumento similar de 7 a 8 veces en los
cultivos que expresan la mutación sueca en la isoforma 751 de APP
(Fig. 7). Aumentos similares en las concentraciones de \betaAP se
documentaron utilizando un segundo procedimiento de cuantificación:
análisis con el espectrómetro fosforescente de la banda de
\betaAP de 4 kD en geles de inmunoprecipitados con 1280. Este
procedimiento demuestra además que el fragmento de 3 kD disminuyó
varias veces en los medios de los transfectantes suecos. Las células
CHO y K293 transfectaron establemente con ADNc la mutación sueca en
la isoforma 751 de APP también mostraron aumentos notables en las
concentraciones de \betaAP en su medio de cultivo.
Para estudiar el mecanismo responsable del
aumento de producción de \betaAP, se examinaron
independientemente los efectos de cada mutación individual (Lys
\rightarrow Asn^{595} y Met \rightarrow Leu^{596}) en la
isoforma 695 de APP. La Fig. 8 muestra los medios acondicionados de
las células K293 radiomarcadas, transfectadas transitoriamente sin
ADN (vía 1); con APP normal (vía 2), KM-NL 695 de
APP mutante sueca (vía 3), variante 695 K-N de APP
(vía 4), variante 695 M-L de APP (vía 5),
APP\DeltaC (deleción del dominio citoplásmico de APP, vía 6) y
APP\DeltaC KM-NL (mutaciones suecas y deleciones
del dominio citoplásmico, vía 7) e inmunoprecipitadas con 1280. El
\betaAP y las bandas de 3 kD están indicadas con flechas.
\betaAP (1-40) sintético marcado con ^{125}I se
introdujo como marcador de tamaño en el mismo gel (vía 8). Las
células que expresan la sustitución Met \rightarrow Leu habían
aumentado las concentraciones de \betaAP en su medio, mientras que
las células que expresan la sustitución Lys \rightarrow Asn
tenían concentraciones similares a los transfectantes normales
(Fig. 8, vías 2 a 5). Este descubrimiento sugiere que la mutación
596 produce más escisión proteolítica de APP en el enlace péptido
Leu-Asp que en el enlace Met-Asp
normal. Es posible que el cambio Lys \rightarrow Asn en 595 pueda
aumentar además la escisión cuando se acopla con la sustitución Met
\rightarrow Leu en 596.
Las células que contienen la mutación sueca junto
con la deleción del dominio citoplásmico de la deleción de APP,
eliminando de este modo la secuencia de consenso de
direccionamiento liposómico
Asn-Pro-X-Tyr,
producían todavía fundamentalmente más \betaAP en su medio que los
transfectantes normales pero mostraban aumento de concentraciones
del péptido de 3 kD (Fig. 8, vías 6 y 7). Este resultado indica que
el efecto de las mutaciones suecas no necesita un dominio
citoplásmico íntegro y que la generación de APP es improbable que
requiera tratamiento de APP en los endosomas/lisosomas
recientes.
Estos descubrimientos proporcionan pruebas
experimentales de que las mutaciones puntuales en el gen de APP
descubierto en análogos de FAD pueden producir directamente aumento
de la generación de \betaAP. El análisis de las mutaciones suecas
demuestran la utilidad de medir la producción de \betaAP in
vitro a partir de APP produciendo una mutación particular (p.
ej.: mutaciones en el residuo 717 inmediatamente después de la zona
de \betaAP y aquellas dentro de la zona de \betaAP) no
solamente como una vía para elucidar el mecanismo de la
\beta-amiloidosis acelerada en las formas
familiares de AD, sino también para el suministro de variantes de
APP en los procedimientos de la presente invención.
Los análisis de detección para los compuestos de
prueba capaces de inhibir la producción de \betaAP en las líneas
celulares que poseen la mutación sueca se realizaron como sigue.
Dos líneas celulares (línea celular K293 del riñón humano y línea
celular del ovario del hamster chino (CHO) se transfectaron
establemente con genes para APP751 que contienen la doble mutación
Lys-651-Met-652 a
Asn-651-Leu-652
(numeración APP-751) denominada generalmente
mutación sueca utilizando el procedimiento descrito en Citron et
al. (1992) Nature 360:672-674. Las
líneas celulares transfectadas se denominaron 293 751 SWE y CHO 751
SWE y se colocaron en placas Corning de 96 pocillos con 2,5
\times 10^{4} células por pocillo respectivamente en medio
esencial mínimo de Dulbecco más suero bovino fetal al 10%. Después
de incubación toda la noche a 37ºC en un incubador equilibrado con
dióxido de carbono al 10% (CO_{2}), se eliminó el medio y se
sustituyó por 200 \mul de medio por pocillo conteniendo un
inhibidor de proteasa de la prueba. Después de un periodo de
pretratamiento de dos horas, se retiró de nuevo el medio y se
sustituyó por medio reciente conteniendo el mismo inhibidor de
proteasa y se incubaron las células durante un periodo adicional de
dos horas.
Se prepararon existencias de inhibidor de
proteasa en DMSO semejantes a la de la concentración final
utilizada en el tratamiento, la concentración de DMSO no excedió
del 0,5%. Después del tratamiento, se centrifugaron las
placas en un Beckman GPR a 1200 rpm durante cinco minutos a
temperatura ambiente para sedimentar los desechos celulares
procedentes de los medios acondicionados. De cada pocillo, se
transfirieron 100 \mul de medio acondicionado a una placa ELISA
recubierta previamente con anticuerpo 266 frente a
\betaAP-13-28 tal como se
describió anteriormente y se guardó toda la noche a 4ºC. Al día
siguiente se puso en marcha un análisis ELISA empleando anticuerpo
6C6 marcado (frente a
\betaAP-1-16) para medir la
cantidad de \betaAP producida.
Se midieron los efectos citotóxicos de los
compuestos mediante una modificación del procedimiento de Hansen
et al. (1989) J. Immun. Meth.
119:203-210. A las células restantes en la placa de
cultivo del tejido se añadió 25 \mul de una solución de
existencias de bromuro de
3,(4,5-dimetiltiazol-2-il)2,5-difeniltetrazolio
(MTT) (5 mg/l) hasta una concentración final de 1 mg/ml. Se
incubaron las células a 37ºC durante una hora y se interrumpió la
actividad celular mediante la adición de un volumen igual de tampón
de lisis de MTT (dodecilsulfato de sodio al 20% p/v en DMF al 50%,
pH 4,7). Se consiguió la extracción completa durante toda la noche
agitando a temperatura ambiente. Se midió la diferencia entre la
OD_{562nm} y la OD_{650nm} en un lector de microplacas
Molecular Devices UV_{max} como indicador de la viabilidad
celular.
Los resultados del ELISA de \betaAP se
ajustaron en una curva estándar y se expresaron como ng/ml de
péptido \betaAP. Con el fin de normalizar para citotoxicidad,
estos resultados de \betaAP se dividieron por los resultados de
MTT y se expresaron como un porcentaje de los resultados de una
referencia sin fármaco.
Se analizó la actividad de la inhibición de la
producción de \betaAP de los compuestos de prueba en las células
utilizando este análisis. Los resultados presentados en las Tablas
IV y V, que se exponen a continuación, son la media y la desviación
estándar de por lo menos seis análisis por duplicado.
| Ejemplo | Inhibición de la producción de \betaAP |
| 41 | -6,2 \pm 6,2% |
| 42 | 13,1 \pm 7,5% |
| 43 | 16,2 \pm 8,5% |
| 45 | 3,3 \pm 1,1% |
| 48 | 1,6 \pm 19,8% |
| Compuesto de prueba | Inhibición de la producción de \betaAP * |
| 1 | 37,5 \pm 2,2% |
| 2 | 53,4 \pm 1,4% |
| 3 | 53,5 \pm 1,5% |
| 4 | 57,4 \pm 3,1% |
| 5 | 58,1 \pm 2,8% |
| 6 | 65,4 \pm 3,9% |
| 7 | 69,1 \pm 6,8% |
| 8 | 77,5 \pm 6,0% |
| 9 | 89,3 \pm 7,7% |
| 10 | 89,8 \pm 4,9% |
| 11 | 110,3 \pm 3,3% |
| 12 | 111,7 \pm 9,1% |
| * Los resultados negativos de la prueba no se muestran en esta Tabla. |
Claims (15)
1. Procedimiento in vitro para identificar
inhibidores de producción del péptido
\beta-amiloide (\betaAP), comprendiendo dicho
procedimiento cultivar células de mamífero en un medio de cultivo
en condiciones que dan como resultado la producción de un péptido
\betaAP soluble que se puede detectar en el medio de cultivo, en
el que las células de mamífero cultivadas proceden de una línea
celular que comprende el ADN que codifica un isotipo o variante de
la proteína precursora amiloide (APP) que proporciona
sobreproducción de \betaAP en las células de mamífero cultivadas;
exponer las células cultivadas a un compuesto de prueba y
determinar si el compuesto de prueba afecta a la cantidad de
péptido \betaAP soluble presente en el medio de cultivo.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que el efecto del compuesto de prueba se determina comparando la
acumulación de \betaAP en el medio de cultivo durante un periodo
de tiempo en ausencia del compuesto de prueba con acumulación de
\betaAP en el medio de cultivo en presencia del compuesto de
prueba durante el mismo periodo de tiempo.
3. Procedimiento in vitro para analizar la
capacidad de un compuesto de prueba para inhibir la producción por
las células del péptido \beta-amiloide
(\betaAP), comprendiendo dicho procedimiento cultivar una primera
población de células de mamífero en un medio de cultivo en las
condiciones que producen la generación de un péptido \betaAP
soluble que se puede identificar en el medio de cultivo, en el que
las células de mamífero cultivadas proceden de una línea celular
que comprende el ADN que codifica un isótopo o variante de la
proteína precursora amiloide (APP) que proporciona sobreproducción
de \betaAP en las células de mamífero cultivadas; cultivar una
segunda población de las mismas células de mamífero en un segundo
medio de cultivo en condiciones idénticas a las de la primera
población, excepto que el compuesto de prueba está presente en el
segundo medio de cultivo; medir las cantidades de \betaAP soluble
presentes en el medio de cultivo de la primera población y de la
segunda población de células; y comparar las cantidades medidas de
\betaAP para determinar si el compuesto de prueba ha tenido un
efecto sobre la generación por las células cultivadas de péptido
\betaAP soluble.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que las células cultivadas proceden
de una línea celular humana.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el compuesto de prueba está
presente en una concentración en el intervalo de 1 nM a 1 mM.
6. Procedimiento para identificar inhibidores de
producción \beta-amiloide (\betaAP),
comprendiendo dicho procedimiento administrar un compuesto de
prueba a un huésped transgénico mamífero que comprende el ADN que
codifica un isótopo o variante de la proteína precursora amiloide
(APP) que proporciona sobreproducción de \betaAP en las células
de mamífero cultivadas que comprenden dicho ADN; y realizar una
determinación in vitro si el compuesto de prueba afecta a la
cantidad de péptido \betaAP soluble presente en el fluido
corporal.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el
que el efecto del compuesto de prueba se determina midiendo una
cantidad de referencia de péptido \betaAP soluble en un fluido
corporal antes de administrar el compuesto de prueba y de volver a
medir la cantidad de \betaAP soluble en el fluido corporal
después de dicha administración.
8. Procedimiento según la reivindicación 6 ó la
reivindicación 7, en el que el huésped transgénico mamífero se
selecciona de entre el grupo que consta de monos, perros, conejos,
cerdos de Guinea, ratas y ratones.
9. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 8, en el que el huésped transgénico mamífero
es un huésped transgénico con aumento de susceptibilidad a la
deposición de la placa de \betaAP comparado con un mamífero de la
misma especie que no comprende dicho ADN.
10. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 9, en el que el fluido corporal se selecciona
de entre el grupo que está compuesto por sangre, CSF, orina y
fluido peritoneal.
11. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 10, en el que el compuesto de prueba se
administra por vía oral, tópica, intramuscular, intravenosa,
subcutánea, intraventricular o intraperitoneal.
12. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el péptido \betaAP soluble
es \betaAP íntegro o un fragmento de \betaAP de aproximadamente
3 kD.
13. Procedimiento según la reivindicación 12, en
el que el fragmento \betaAP está compuesto de los residuos 11 a
40 ó 17 a 40 de aminoácidos de \betaAP.
14. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho ADN codifica una APP
que tiene una o varias sustituciones de aminoácido directamente
amino-terminal del punto de escisión de
\betaAP.
\newpage
15. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho ADN codifica una APP
que comprende leucina como residuo inmediatamente amino
N-terminal hasta el punto de escisión de
\betaAP.
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