ES2206455T3 - Metodos y composiciones para controlar el tratamiento celular de la proteina precursora beta-amiloide. - Google Patents

Metodos y composiciones para controlar el tratamiento celular de la proteina precursora beta-amiloide.

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ES2206455T3 ES93907104T ES93907104T ES2206455T3 ES 2206455 T3 ES2206455 T3 ES 2206455T3 ES 93907104 T ES93907104 T ES 93907104T ES 93907104 T ES93907104 T ES 93907104T ES 2206455 T3 ES2206455 T3 ES 2206455T3
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Abstract

PROCESAMIENTO DE PROTEINA PRECURSORA DE ((BETA))-AMILOIDE ((BETA)APP) ES SUPERVISADO DETECTANDO LA SECRECCION DE UN FRAGMENTO SOLUBLE BAPP QUE RESULTA DEL DESDOBLAMIENTO DE (BETA)APP EN LOS TERMINOS AMINO DE PEPTIDA (BETA)-AMILOIDE. SUPERVISION EN VIVO DE LA SECRECION DEL FRAGMENTO DE (BETA)APP PUEDE SER SUPERVISADO POR DIAGNOSIS DEL MAL DE ALZHEIMER Y OTRAS ENFERMEDADES RELACIONADAS CON (BETA)-AMILOIDE, MIENTRAS QUE SUPERVISION IN VITRO DE TAL SECRECION DE CELULAS CULTIVADAS PUEDE SER SUPERVISADA PARA IDENTIFICAR INHIBIDORES DE PRODUCCION DE (BETA)-AMILOIDE. EL FRAGMENTO (BETA)APP PUEDE SER DETECTADO USANDO ANTICUERPOS Y OTRAS SUSTANCIAS ESPECIFICAS DE ENLACE QUE RECONOCEN UN RESIDUO CARBOXI TERMINAL SOBRE EL FRAGMENTO.

Description

Métodos y composiciones para controlar el tratamiento celular de la proteína precursora beta-amiloide.
Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención
La presente invención se refiere en general a métodos y composiciones para el control del tratamiento de proteína precursora del \beta-amiloide. Más particularmente, la presente invención se refiere a la utilización de tales métodos y composiciones para el diagnóstico, prognosis, y control de la respuesta a la terapia de la enfermedad de Alzheimer, y para la detección sistemática y evaluación de potenciales fármacos para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
La enfermedad de Alzheimer se caracteriza por la presencia de numerosas placas amiloides y marañas neurofibrilares (agregados proteicos altamente insolubles) presentes en los cerebros de los pacientes de la enfermedad de Alzheimer, en particular en aquellas regiones involucradas en la memoria y cognición. Aunque se ha dado un debate considerable sobre si las placas y marañas eran una causa o meramente el resultado de la enfermedad de Alzheimer, descubrimientos recientes indican que la placa amiloide es un precursor o factor causativo. En particular, se ha descubierto que la producción de péptido \beta-amiloide, un constituyente principal de la placa amiloide, puede resultar de mutaciones en el gen que codifica para la proteína precursora del amiloide, una proteína que no producirá péptido \beta-amiloide cuando es procesada con normalidad. La identificación de mutaciones en el gen de la proteína precursora amiloide que causan enfermedad de Alzheimer familiar y temprana es la evidencia más fuerte de que el metabolismo amiloide es un hecho clave en el proceso patogénico que subyace a la enfermedad. Se han dado a conocer cuatro mutaciones causantes de enfermedad, que incluyen, con respecto a la isoforma 770, cambio de valina^{717} a isoleucina (Goate et al. (1991) Nature 349:704-706), cambio de valina^{717} a glicina (Chartier Harlan et al. (1991) Nature 353:844-846), cambio de valina^{717} a fenilalanina (Murrell et al. (1991) Science 254:97-99), y con respecto a la isoforma 695, una mutación doble que cambia la lisina^{595}-metionina^{596} a asparagina^{595}-leucina^{596} (Mullan et al. (1992) Nature Genet. 1:345-347). Además, el péptido \beta-amiloide es tóxico para las neuronas cerebrales, y se ha asociado la muerte neuronal con la enfermedad.
De esta manera, la capacidad de hacer un control del tratamiento celular de la proteína precursora del amiloide sería de valor considerable en el diagnóstico, prognosis, y supervisión terapéutica de la enfermedad de Alzheimer. En particular, sería deseable identificar procedimientos mínimamente invasivos para la exploración sistemática y evaluación de marcadores diagnósticos detectables en muestras fácilmente obtenibles del paciente, tal como suero, líquido cerebroespinal (CSF), y similares.
Se ha propuesto una serie de marcadores diagnósticos potenciales para la enfermedad de Alzheimer. Son de particular interés en la presente invención ciertos fragmentos de la proteína precursora del amiloide que incluyen fragmentos carboxi-terminales (tal como el péptido \beta-amiloide en sí y fragmentos del mismo), y fragmentos amino-terminales (tal como ciertos fragmentos de 25 kD, 105 kD, y 125 kD). Hasta el momento, ninguno de los marcadores propuestos ha demostrado ser definitivo en el diagnóstico o control ante-mortem de la enfermedad de Alzheimer.
De esta manera, sería deseable identificar marcadores diagnósticos adicionales y alternativos para la enfermedad de Alzheimer. Tales marcadores serían útiles por sí solos y/o en combinación con otros marcadores y procedimientos diagnósticos. Preferiblemente, los marcadores diagnósticos deberían ser detectables en líquidos corporales, tal como CSF, sangre, plasma, suero, orina, tejido, y similares, de manera que puedan utilizarse procedimientos diagnósticos mínimamente invasivos.
De interés adicional para la presente invención son sistemas y métodos in vitro para la detección sistemática de fármacos candidatos por su capacidad de inhibir o prevenir la producción de placas de \beta-amiloide. Sería deseable proporcionar métodos y sistemas para la detección sistemática de compuestos de prueba con capacidad de inhibir o prevenir la conversión de proteína precursora del amiloide a péptido \beta-amiloide. En particular, sería deseable basar tales métodos y sistemas en rutas metabólicas en las que se haya descubierto su implicación en tal conversión, en las que el compuesto de prueba sería capaz de interrumpir o interferir con la ruta metabólica que conduce a la conversión. Tales métodos y sistemas deberían ser rápidos, económicos, y adecuados para la exploración sistemática de gran número de compuestos de prueba.
2. Descripción de los antecedentes de la técnica
El péptido \beta-amiloide (también denominado A4, \betaAP, A\beta, o A\betaP; ver patente U.S. nº 4.666.829, y Glenner y Wong (1984) Biochem. Biophys. Res. Commun. 120:1131-1135) se deriva de la proteína precursora del \beta-amiloide (\betaAPP), la cual se expresa en las formas de diverso corte de 695, 751, y 770 aminoácidos. Ver Kang et al. (1987) Nature 325:773-776; Ponte et al. (1988) Nature 331:525-527; y Kitaguchi et al. (1988) Nature 331:530-532. El tratamiento normal de la proteína precursora amiloide involucra el corte proteolítico en un sitio entre los residuos Lys^{16} y Leu^{17} (numeración para la región vAP en la que Asp^{597} es el residuo 1, en Kang et al. (1987)), supra, cerca del dominio transmembrana, resultando en la secreción constitutiva de un dominio extracelular que retiene la parte restante de la secuencia peptídica \beta-amiloide (Esch et al. (1990) Science 248:1122-1124). Esta ruta aparentemente ha sido ampliamente conservada entre especies y está presente en muchos tipos celulares. Ver Weidemann et al. (1989) Cell 57:115-126, y Oltersdorf et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:4492-4497. Esta ruta normal corta dentro de la región de la proteína precursora que corresponde con el péptido \beta-amiloide, al parecer preveniendo, de esta manera, su formación. Se ha descubierto otra forma de secreción constitutiva de \betaAPP (Robakis et al. Soc. Neurosci. octubre 26, 1993, resumen nº 15,4, Anaheim, CA.) que contiene más de la secuencia \betaAP en dirección carboxi-terminal que la forma descrita por Esch et al. obra citada.
Golde et al. (1992), Science 255:728-730, prepararon una serie de mutantes por deleción de proteína precursora amiloide y observaron un solo sitio de corte dentro de la región del péptido \beta-amiloide. Basándose en esta observación, se postuló que la formación de péptido \beta-amiloide no involucra una ruta secretoria. Estus et al., (1992) Science 255:726-728, dan a conocer que los dos fragmentos proteolíticos carboxi-terminales más grandes de proteína precursora amiloide descubiertos en células cerebrales contienen la región peptídica \beta-amiloide entera.
La solicitud PCT WO 92/00521 describe métodos para la evaluación de la enfermedad de Alzheimer basados en la medición de cantidades de ciertos derivados solubles de 25 kD, 105 kD, y 125 kD de proteína precursora amiloide en el líquido cerebroespinal de un paciente. La figura 3 de la patente WO 92/00521 sugiere que el corte de la proteína precursora amiloide podría ocurrir en una posición adyacente al extremo amino-terminal del péptido \beta-amiloide, produciendo un fragmento soluble amino-terminal, pero no se presenta evidencia o discusión de tal corte en la solicitud. Kennedy et al. (1992) Neurodegeneration 1:59-64, presentan datos sobre una forma de \betaAPP secretada, la cual se caracterizó por su reactividad de anticuerpos frente a los residuos 527-540 de \betaAPP, y por la ausencia de reactividad de anticuerpos frente a los primeros quince residuos de \betaAP. No se proporciona evidencia directa que sugiera el sitio de corte o la identidad del extremo carboxi-terminal de la forma \betaAPP. La solicitud PCT WO 91/16628 describe métodos para el diagnóstico de la enfermedad basándose en la detección de proteínas precursoras amiloides y de fragmentos de las mismas, utilizando anticuerpos frente a la proteasa nexina-2 o frente a la proteína precursora amiloide.
Recientemente se ha dado a conocer que el péptido soluble \beta-amiloide es producido por células sanas en medios de cultivo (Haass et al. (1992) Nature 359:322-325) y en CSF humano y animal (Seubert et al. (1992) Nature 359:325-327).
La presente invención proporciona un método para el control del tratamiento de la proteína precursora \beta-amiloide (\betaAPP) en células, el cual comprende la detección específica de un fragmento soluble amino-terminal de proteína precursora \beta-amiloide (ATF-\betaAPP) secretada por las células, en el que la secuencia aminoacídica de ATF-\betaAPP se extiende desde el extremo amino-terminal de \betaAPP hasta el extremo amino-terminal del péptido \beta-amiloide, por el cual se distingue ATF-\betaAPP de otras formas cortadas de \betaAPP que puedan estar presentes.
El ATF-\betaAPP puede detectarse mediante una técnica seleccionada del grupo que consiste en (1) exposición a una sustancia que se une específicamente a un epítopo de ATF-\betaAPP acabado en un residuo C-terminal, el cual ha quedado expuesto por el corte del péptido \beta-amiloide a partir de \betaAPP, y (2) electroforesis bidimensional en gel de los fragmentos de \betaAPP secretados por las células, seguido de exposición de estos fragmentos de electroforesis a una sustancia reactiva frente a los fragmentos de \betaAPP.
La invención también proporciona un método para la detección de un fragmento amino-terminal secretado de proteína precursora \beta-amiloide (ATF-\betaAPP) resultante del corte de \betaAPP en el extremo amino-terminal del péptido
\beta-amiloide (\betaAP) en una muestra biológica, comprendiendo dicho método:
la exposición de la muestra a una sustancia que se une específicamente a una región C-terminal en la ATF-\betaAPP secretada; y
la detección de la unión entre la sustancia y el fragmento secretado.
La sustancia es preferiblemente un anticuerpo específico para la región C-terminal, incluyendo un residuo
C-terminal que ha quedado expuesto por el corte del péptido \beta-amiloide procedente de \betaAPP, opcionalmente en el que \betaAPP es la isoforma 695, 751 ó 770.
En las realizaciones preferidas, el residuo C-terminal de ATF-\betaAPP es metionina^{596} o leucina^{596}. El anticuerpo puede ser específico contra un péptido que comprenda los residuos 591-596 de \betaAPP quedando expuesto el residuo^{596}.
La invención también proporciona un método para determinar la presencia de un fragmento secretado amino-terminal de proteína precursora \beta-amiloide (ATF-\betaAPP) en una muestra biológica, el método comprende:
la exposición de la muestra a un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo en el extremo carboxi-terminal de un fragmento de \betaAPP, opcionalmente en el que \betaAPP es la isoforma 695, 751 ó 770, con metionina en su extremo carboxi-terminal, el anticuerpo del cual está sustancialmente libre de reactividad cruzada con otros fragmentos de \betaAPP que tuviesen aminoácidos más allá de la metionina; y
la detección de unión entre la sustancia y el fragmento secretado, preferiblemente con un anticuerpo específico contra un péptido que comprende los residuos 591-596 de \betaAPP, en el que queda expuesto el residuo^{596}.
\newpage
En las realizaciones preferidas, el ATF-\betaAPP se detecta en una muestra de un paciente, o la muestra biológica es una muestra de un paciente. En particular, la muestra de un paciente puede ser líquido cerebroespinal.
El ATF-\betaAPP puede detectarse en un medio de cultivo celular condicionado, o la muestra biológica puede ser medio condicionado de una línea celular.
La invención proporciona, además, un método in vitro de exploración sistemática de compuestos para identificar inhibidores de la producción del \beta-amiloide, comprendiendo dicho método:
(a) el cultivo de células bajo condiciones que resultan en la secreción de un fragmento soluble amino-terminal de proteína precursora \beta-amiloide (ATF-\betaAPP) en el que la secuencia aminoacídica de ATF-\betaAPP soluble se extiende desde el extremo amino-terminal de \betaAPP hasta el extremo amino-terminal del péptido \beta-amiloide;
(b) la exposición de las células cultivadas a un compuesto de prueba; y
(c) la detección de una cantidad de ATF-\betaAPP soluble; por la cual una reducción en la cantidad de ATF-\betaAPP soluble en comparación con la cantidad de ATF-\betaAPP soluble de células no expuestas al compuesto indica que el compuesto es un inhibidor de la producción del \beta-amiloide.
Las células son, preferiblemente, de un cultivo de células cerebrales de feto humano.
El compuesto de prueba puede exponerse a una concentración entre 1 nM y 1 mM. El compuesto de prueba es, preferiblemente, una molécula pequeña o un polímero biológico.
En ciertas realizaciones, el ATF-\betaAPP tiene un extremo carboxi-terminal en metionina^{596}, opcionalmente en metionina^{652} o en metionina^{671}. En otras realizaciones, el ATF-\betaAPP tiene un extremo carboxi-terminal en leucina^{596}, opcionalmente en leucina^{652} o leucina^{671}.
La invención proporciona asimismo una composición de anticuerpos que comprende moléculas de anticuerpos que reconocen específicamente un fragmento amino-terminal de la proteína precursora \beta-amiloide (ATF-\betaAPP), la cual es cortada en el extremo amino-terminal del péptido \beta-amiloide, pero cuyas moléculas de anticuerpos no reconocen específicamente un fragmento secretado de \betaAPP cuya secuencia se extiende hacia el interior de la secuencia del péptido \beta-amiloide.
El anticuerpo preferiblemente reconoce de manera específica la región C-terminal, incluyendo un residuo C-terminal expuesto por el corte del péptido \beta-amiloide procedente de \betaAPP, opcionalmente en el que \betaAPP es la isoforma 695, 751 ó 770.
Las moléculas de anticuerpos pueden comprender inmunoglobulinas intactas o fragmentos de inmunoglobulinas, preferiblemente el fragmento de inmunoglobulina es un fragmento F(ab), un fragmento Fv, un fragmento VL o un fragmento VH.
Las moléculas de anticuerpos se han generado, preferiblemente, contra un péptido que comprende, al menos, los residuos 591-596 de \betaAPP, siendo el residuo^{596} el aminoácido carboxi-terminal del péptido, más preferiblemente la composición de anticuerpos puede comprender moléculas de anticuerpos de ratón, de conejo, de oveja, o de cabra, ATF-\betaAPP tiene un residuo carboxi-terminal que corresponde a metionina^{596} o leucina^{596}.
La composición de anticuerpos puede comprender antisueros específicos contra el péptido.
La composición de anticuerpos puede comprender anticuerpos monoclonales.
En otras realizaciones, la composición de anticuerpos puede comprender moléculas de anticuerpos producidos de manera recombinante.
La invención proporciona, adicionalmente, un hibridoma que produce moléculas de anticuerpos que reconocen específicamente un fragmento amino-terminal de proteína precursora \beta-amiloide (ATF-\betaAPP), el cual ha sido cortado del extremo amino-terminal del péptido \beta-amiloide, pero cuyas moléculas de anticuerpos no reconocen específicamente un fragmento secretado de \betaAPP cuya secuencia se extiende hacia el interior de la secuencia del péptido
\beta-amiloide.
ATF-\betaAPP puede tener un residuo carboxi-terminal que corresponde a metionina^{596} o leucina^{596}; opcionalmente metionina^{652} o leucina^{652}; o metionina^{671} o leucina^{671}.
La invención proporciona asimismo un fragmento soluble de proteína precursora \beta-amiloide (\betaAPP) en forma purificada y aislada, teniendo dicho fragmento una metionina o leucina C-terminal que resulta del corte del péptido \beta-amiloide procedente de \betaAPP intacto, preferiblemente el fragmento soluble se aisla a partir de una fuente natural o recombinante, tal como líquido cerebroespinal, medio condicionado de células cultivadas, o similares. La secuencia aminoacídica del fragmento puede consistir en los residuos 18-596 de la isoforma 695 de \betaAPP, en los residuos 18-612 de la isoforma 751 de \betaAPP, o en los residuos 18-671 de la isoforma 770 de \betaAPP. Las composiciones del fragmento soluble serán útiles en diversos ensayos convencionales para la detección de ATF-\betaAPP.
La invención prevé la utilización de una composición de anticuerpos tal como se ha definido anteriormente, para el control del tratamiento de \beta-amiloide.
La invención prevé asimismo la utilización de un fragmento soluble tal como se ha definido anteriormente, para el control del tratamiento de \beta-amiloide.
Sumario de la invención
Por tanto, se proporcionan métodos y composiciones para la detección y control de un fragmento amino-terminal secretado de proteína precursora \beta-amiloide (\betaAPP) en muestras biológicas, en el que el fragmento resulta del corte en el extremo amino-terminal, o cerca de éste, de la región del péptido \beta-amiloide (\betaAP). En particular para la secuencia aminoacídica en \betaAPP descrita por Kang et al., supra, (es decir, la secuencia "normal"), este fragmento truncado de \betaAPP que se ha secretado puede ser reconocido por anticuerpos específicos contra péptidos que comprenden ciertos residuos carboxi-terminales del fragmento secretado con una metionina expuesta en su extremo carboxi-terminal. Alternativamente, secuencias naturales o secuencias variantes sintéticas de \betaAPP, tal como la mutación doble que cambia lisina^{595}-metionina^{596} por asparagina^{595}-leucina^{596}, dada a conocer por Mullan et al. (1992) Nature Genet. 1:345-347, puede introducir una secuencia nueva en esta región. Una sustancia de unión específica para los residuos C-terminales de esta secuencia \betaAPP sería un método preferible para la detección de tales secuencias.
Los fragmentos secretados pueden comprender una secuencia amino-terminal sustancialmente intacta de \betaAPP que termina a cinco aminoácidos del residuo carboxi-terminal (metionina en el caso de la secuencia normal), el cual es adyacente a la región \betaAP en \betaAPP intacto. En particular, los fragmentos secretados pueden consistir esencialmente en secuencias que terminan en metionina^{596} y lisina^{595} de la isoforma de 695 aminoácidos de \betaAPP, con la numeración correspondiente para las otras isoformas y aminoácidos correspondientes para las formas mutantes de \betaAPP, tal como, por ejemplo, el cambio de LYS^{595}-MET^{596} por ASN^{595}-LEU^{596} (la forma "sueca"). Los métodos y composiciones de la presente invención son útiles in vivo e in vitro para el control del tratamiento intracelular de \betaAPP, en particular para el control del corte de \betaAPP para liberar \betaAP intacto, el cual se ha asociado con ciertas enfermedades, en particular con la enfermedad de Alzheimer, incluyendo la forma familiar, y con el síndrome de Down.
Pueden generarse anticuerpos que tengan la especificidad requerida, cultivándolos contra haptenos peptídicos sintéticos que incluyan los residuos C-terminales de ATF-\betaAPP. Tales moléculas de anticuerpos pueden prepararse por cualquier método convencional, habitualmente utilizando un inmunógeno que comprenda los residuos C-terminales de ATF-\betaAPP, por ejemplo estando expuesta la metionina C-terminal en la secuencia normal. Las enfermedades relacionadas con \betaAP, tal como la enfermedad de Alzheimer y el síndrome de Down, pueden diagnosticarse y hacerse un control en pacientes basándose en la detección de ATF-\betaAPP en muestras del paciente, tal como de CSF, suero, sangre, plasma, orina, tejido, y similares. Pueden asociarse los niveles elevados de ATF-\betaAPP con el inicio y la progresión de la enfermedad, y estos niveles podrían reducirse con el progreso en el tratamiento de la enfermedad.
Breve descripción de los dibujos
Las figuras 1A y 1B ilustran las diversas isoformas de \betaAPP normal, y las isoformas correspondientes de ATF-\betaAPP, respectivamente.
Las figuras 2A, 2B y 2C son patrones en gel quimioluminiscente de material derivado de medio condicionado de un cultivo de células cerebrales de feto humano. Las pistas 1, 2, y 3 de cada gel representan, respectivamente, medio condicionado sin tratamiento, el medio condicionado agotado por reacción con anticuerpo que reconoce un epítopo entre los residuos peptídicos 1-16 de \beta-amiloide, y el material eliminado por este anticuerpo. Los paneles A, B, y C representan, respectivamente, las siguientes sondas: anticuerpo anti-5 (el cual reconoce sitios entre el extremo amino-terminal de \betaAPP y la región peptídica \beta-amiloide), anticuerpo 92 (el cual se generó contra un péptido sintético acabado en la metionina C-terminal expuesta por el corte de \betaAP procedente de \betaAPP), y anticuerpo 10D5 (un anticuerpo monoclonal que reconoce un epítopo de \betaAP entre los residuos 1 y 16).
La figura 3 es un patrón en gel quimioluminiscente obtenido del examen de CSF lumbar humano. Se sondeó el CSF con anticuerpo 92 solo (pista 1), o pre-incubado con diversos péptidos que representaban variaciones del extremo C-terminal de ATF-\betaAPP. Se observó competición significativa (reducción en la unión) con los péptidos que terminaban en la metionina C-terminal (pistas 3, 4, 6, y 7). Los péptidos eran los siguientes: Pista 1, no se añadió péptido competidor; Pista 2, GSGLTNIKTEEISEVK; Pista 3, YSGLTNIKTEEISEVKM; Pista 4, ISEVKM; Pista 5, EISEVKMD; Pista 6, CISEVKM; Pista 7, YISEVKM. PM = marcadores de peso molecular (indicado en kilodaltons).
La figura 4 es una autorradiografía que representa los patrones en gel de electroforesis obtenidos por inmunoprecipitación de medio condicionado de varias líneas celulares. El material secretado por cultivos de células cerebrales de feto humano e inmunoprecipitadas con anticuerpo 92 (pista 11 donde indica la flecha) es, aparentemente, menor que el material precipitado por anticuerpo 6C6 (pista 10 donde indica la flecha). El anticuerpo 6C6 reconoce un epítopo entre los residuos 1 y 16 de \betaAP.
La figura 5 es un autorradiografía que representa patrones en gel de electroforesis obtenidos por inmunoprecipitación de medio condicionado de líneas de células 293 humanas transfectadas con cADN que codifica para \betaAPP normal y sueco. La cantidad de material AFT-\betaAPP secretada por las células suecas transfectadas (pistas 11 y 12) fue cualitativamente mayor que la producida por transfectantes \betaAPP normales (pistas 9 y 10).
Descripción de las realizaciones específicas
La presente invención resulta de la identificación de un nuevo fragmento secretado de proteína precursora
\beta-amiloide (\betaAPP) que resulta del corte de una región peptídica \beta-amiloide (\betaAP) intacta de la proteína precursora. Los nuevos fragmentos secretados comprenden la parte amino-terminal de \betaAPP que resta después de tal corte, la cual se denominará en lo sucesivo en esta memoria, fragmento amino-terminal de \betaAPP (ATF-\betaAPP). Se cree que ATF-\betaAPP es el producto de una ruta alternativa de tratamiento secretorio para \betaAPP, ruta que está presente incluso en células normales (no enfermas). Sin embargo, también se cree que la ruta alternativa de secreción puede ser responsable de un hecho clave en la producción de \betaAP en células enfermas de pacientes, y que la producción anormal de ATF-\betaAPP puede estar involucrada en enfermedades relacionadas con las placas de \betaAP, en particular con la enfermedad de Alzheimer y con el síndrome de Down. De esta manera, la presente invención proporciona métodos y composiciones para el control del tratamiento celular de \betaAPP basados en la detección y medida de ATF-\betaAPP en muestras biológicas.
ATF-\betaAPP es identificado y reconocido por la unión específica a anticuerpos generados contra péptidos que comprenden ciertos residuos de \betaAPP inmediatamente adyacentes a la región \betaAP y que incluyen, en \betaAPP normal, la metionina carboxi-terminal (numerada como metionina^{596} en la isoforma 695, como se describe posteriormente). Los péptidos incluirán, habitualmente, al menos cinco residuos contiguos hasta, e incluyendo, el residuo^{596}, y se describen a continuación métodos específicos para producir tales anticuerpos.
Con referencia a las figuras 1A y 1B, se encuentra \betaAPP en tres isoformas, que comprenden, respectivamente, 695, 751, y 770 aminoácidos. La isoforma 695 es la más común en células neuronales, y las isoformas 751 y 770 resultan de inserciones en el residuo 289 de la isoforma 695 (la numeración de la isoforma 695 se hará de acuerdo con Kang et al. (1987) Nature 325:733-736). ATF-\betaAPP resulta, aparentemente, del corte proteolítico de las diversas isoformas de \betaAPP a cinco residuos o menos, en el lado amino-terminal, del extremo amino-terminal de la región del péptido \beta-amiloide (\betaAP), localizándose entre los residuos 596 y 597 de la isoforma 695. Tal corte resulta en la exposición de un residuo C-terminal, el cual habitualmente será metionina^{596}, lisina^{595} o leucina^{596}, siendo más habitualmente metionina^{596}, los cuales se muestran como MET^{596} y LIS^{595} en la figura 1B. Evidentemente se apreciará, que los residuos C-terminales tendrían una numeración diferente cuando ATF-\betaAPP se deriva de una isoforma \betaAPP diferente. En particular, la metionina C-terminal sería MET^{652} y MET^{671} y la lisina C-terminal sería LIS^{651} y LIS^{670} en las isoformas 751 y 770 de \betaAPP, respectivamente. En su utilización en este documento y en las reivindicaciones, metionina^{596}, lisina^{595}, y leucina^{596} se referirán, generalmente, a los residuos correspondientes de todas las otras isoformas o variantes de \betaAPP. En la actualidad, se cree que el residuo N-terminal de ATF-\betaAPP es LEU^{18} en todas las isoformas (basado en el tratamiento del extremo amino-terminal de \betaAPP en formas secretadas que son cortadas dentro de la región \betaAP).
De acuerdo con la presente invención, ATF-\betaAPP puede ser detectado y/o medido en una diversidad de muestras biológicas, incluyendo muestras in vitro, tal como medio condicionado de cultivos celulares, y en muestras in vivo de pacientes, típicamente de CSF, sangre, suero, plasma, orina, tejido, y similares. Puede conseguirse la detección y medida por cualquier técnica capaz de distinguir ATF-\betaAPP de otros fragmentos de \beta-APP que puedan encontrarse en la muestra. Convenientemente, pueden utilizarse técnicas de detección inmunológica que utilicen anticuerpos, fragmentos de éstos, u otras sustancias equivalentes de unión específica, las cuales se unan a un residuo C-terminal de ATF-\betaAPP expuesto al cortar la región \betaAP, por ejemplo, a metionina^{596}, leucina^{596} o lisina^{595}. Se ha descubierto que tales anticuerpos específicos de extremos C-terminales son capaces de discriminar entre ATF-\betaAPP y fragmentos de \betaAPP relacionados. Alternativamente, las técnicas de detección inmunológica pueden basarse en ATF-\betaAPP aislado y purificado utilizando técnicas convencionales. Posteriormente se describe la preparación de anticuerpos específicos de residuos C-terminales y de ATF-\betaAPP purificado y aislado. Entre las técnicas de detección particularmente adecuadas se incluyen ELISA, transferencia de Western, radioinmunoensayo, y similares.
También pueden utilizarse otras técnicas para la detección de ATF-\betaAPP que no requieran la utilización de anticuerpos específicos de ATF-\betaAPP y/o de antígeno competidor. Por ejemplo, puede utilizarse la electroforesis bidimensional en gel para separar fragmentos solubles de \betaAP muy relacionados. Pueden utilizarse entonces anticuerpos de reactividad cruzada con muchos o todos los fragmentos con el fin de marcar los geles, identificando la presencia de ATF-\betaAPP a partir de su posición exacta en el gel. Otras técnicas para la detección de ATF-\betaAPP también están dentro de las técnicas conocidas. Por ejemplo, las especies de \betaAPP secretadas que contienen la región amino-terminal de \betaAP pueden eliminarse inmunológicamente de una muestra para aislar ATF-\betaAPP (ver la figura 2A, pista 2 y la figura 5, pistas 11 y 12), el cual puede ser detectado entonces por cualquiera de varios métodos, como se ha comentado anteriormente.
Pueden prepararse anticuerpos específicos para ATT-\betaAPP contra un antígeno o hapteno adecuado que comprenda la secuencia C-terminal de ATF-\betaAPP incluyendo el residuo de metionina. Convenientemente, pueden prepararse péptidos sintéticos mediante técnicas convencionales de fase sólida, acoplados a un inmunógeno adecuado, y utilizarse para preparar antisueros o anticuerpos monoclonales mediante técnicas convencionales. Un péptido sintético adecuado consiste en seis residuos de ATF-\betaAPP (ISEVKM) situados inmediatamente adyacentes en el lado amino-terminal de \betaAP, y que pueden acoplarse a un inmunógeno y utilizarse para preparar anticuerpos específicos, como se describe en detalle en la sección experimental. Otros haptenos peptídicos adecuados comprenderán, habitualmente, al menos cinco residuos contiguos dentro de \betaAPP inmediatamente adyacentes en el lado amino-terminal de \betaAP, y pueden incluir más de seis residuos (aunque se descubrió que un péptido que incluía dieciséis residuos amino-terminales producía antisuero que era menos específico). Los 25 residuos carboxi-terminales del ATF-\betaAPP normal son los siguientes (utilizando las denominaciones de una letra de los aminoácidos).
DRGLT TRPGSGLTNI KTEEISEVKM
576 586 596
Pueden producirse haptenos polipeptídicos sintéticos mediante la bien conocida técnica de síntesis en fase sólida Merrifield, en la que los aminoácidos se añaden secuencialmente a una cadena en crecimiento (Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156). Las secuencias aminoacídicas pueden basarse en la secuencia de ATF-\betaAPP presentada anteriormente, o pueden utilizar secuencias de origen natural o secuencias mutantes de la ingeniería. Por ejemplo, el mutante sueco tendría una sustitución de asparagina^{595}-leucina^{596} por lisina^{595}-metionina^{596}, y otra sustitución podría ser solamente la leucina^{596} por metionina^{596}.
Una vez se ha obtenido suficiente cantidad de hapteno polipeptídico, puede conjugarse con un portador inmunogénico adecuado, tal como albúmina de suero, hemocianina de lapa californiana, u otros portadores proteicos adecuados, como se describe, en general, en Hudson y Hay, Practical Immunology, Blackwell Scientific Publications, Oxford, Capítulo 1.3, 1980.
Una vez se ha obtenido una cantidad suficiente del inmunógeno, pueden producirse anticuerpos específicos del residuo C-terminal, expuesto tras el corte de \betaAP desde ATF-\betaAPP, mediante técnicas in vitro o in vivo. Las técnicas in vitro involucran la exposición de linfócitos a los inmunógenos, mientras que las técnicas in vivo requieren la inyección de los inmunógenos en un huésped adecuado de vertebrado. Los huéspedes adecuados de vertebrado son no humanos, entre ellos, ratones, ratas, conejos, ovejas, cabras, y similares. Los inmunógenos se inyectan en el animal de acuerdo con un programa predeterminado, y periódicamente se extrae sangre a los animales, presentando las extracciones sucesivas, títulos y especificidades mejorados. Las inyecciones pueden ser intramusculares, intraperitoneales, subcutáneas, o similares, y se utilizará un adyuvante, tal como adyuvante incompleto de Freund.
Si se desea, pueden obtenerse anticuerpos monoclonales mediante la preparación de líneas celulares inmortalizadas capaces de producir anticuerpos con la deseada especificidad. Tales líneas celulares inmortalizadas pueden ser producidas de una variedad de maneras. Convenientemente, se hiperinmuniza con el inmunógeno deseado un vertebrado pequeño, tal como un ratón, mediante el método que se acaba de describir. Entonces se mata el vertebrado, habitualmente varios días después de la inmunización final, se extraen las células de bazo, y éstas se inmortalizan. El modo de inmortalización no es crítico. En la actualidad, la técnica más común es la fusión con una pareja de célula de mieloma, como primero describieron Kohler y Milstein (1975) Nature 256:495-497. Otras técnicas, incluyendo la transformación con EBV, transformación con ADN desnudo, por ejemplo, con oncogenes, retrovirus, etc., o cualquier otro método que proporcione un mantenimiento estable de la línea celular y producción de anticuerpos monoclonales. Se describen técnicas específicas para la preparación de anticuerpos monoclonales en Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lane, editores, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.
Además de anticuerpos monoclonales y policlonales (antisueros), las técnicas de detección de la presente invención también podrán utilizar fragmentos de anticuerpos, tal como F(ab), Fv, V_{L}, V_{H}, y otros fragmentos. También será posible utilizar anticuerpos producidos de manera recombinante (inmunoglobulinas) y variaciones de los mismos, como está bien descrito en la actualidad en la literatura de patentes y científica. Ver, por ejemplo, las patentes EP 0123527, EP 0171496, EP 0173494, WO 8601583, EP 0184187, WO 8702671 y JP 62100291. También sería posible preparar otras proteínas recombinantes que imitarían la especificidad de unión de anticuerpos preparados como se acaba de describir.
La presente invención comprende, adicionalmente, ATF-\betaAPP aislado y purificado, habitualmente obtenido en forma sustancialmente pura. "Sustancialmente pura" significa, al menos, aproximadamente 50% p/p (peso/peso), o de mayor pureza sustancialmente libre de proteínas y contaminantes que interfieran. Preferiblemente, se aislará o sintetizará el ATF-\betaAPP a una pureza mayor que el 50% p/p, preferentemente al 80% p/p o mayor. El ATF-\betaAPP puede ser purificado a partir de una fuente natural mediante técnicas convencionales de purificación de proteínas, purificando composiciones homogéneas a una pureza de, al menos, aproximadamente 50% p/p, mediante técnicas convencionales de separación por inmunoafinidad. Entre los materiales de inicio de origen natural que son adecuados se incluyen: medio condicionado de líneas celulares productoras de ATF-\betaAPP, tal como cultivos de células cerebrales de feto, y similares. Alternativamente, puede aislarse ATF-\betaAPP a partir de muestras biológicas obtenidas de un huésped humano, tal como a partir de CSF, suero, y similares. Se describen técnicas adecuadas de purificación de proteínas en Methods in Enzymology, Volumen 182, Deutcher, editor, Academic Press, Inc., San Diego, 1990, la descripción de las cuales se incorpora en la presente memoria de patente como referencia.
Pueden utilizarse anticuerpos y ATF-\betaAPP purificados, preparados como se ha descrito anteriormente, en diversas técnicas inmunológicas convencionales para la detección de ATF-\betaAPP en muestras biológicas, en particular muestras in vivo de pacientes para el control de enfermedades relacionadas con \beta-amiloides, y en medios condicionados de cultivos celulares para el control del tratamiento intracelular de \betaAPP. Entre las técnicas inmunológicas adecuadas se incluyen los inmunoensayos, tal como ELISA, análisis de Western Blot, y similares. Se describen numerosas técnicas de detección inmunológica específica en Harlow y Lane, obra citada.
Puede utilizarse la detección in vivo de ATF-\betaAPP, en muestras de pacientes para el diagnóstico y control de la enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades relacionadas con la deposición de placas \beta-amiloides, tal como el síndrome de Down. Entre las muestras adecuadas de pacientes se incluyen: CSF, sangre, suero, plasma, orina, tejido, y similares. La presencia de la enfermedad se asociará, generalmente, con niveles elevados de ATF-\betaAPP, o proporciones elevadas de cantidades de ATF-\betaAPP respecto a cantidades de otros fragmentos de \betaAPP secretado (es decir, de aquellos fragmentos de \betaAPP cortados dentro de la región \betaAP, o cortados en posición carboxi-terminal respecto a dicha región) en comparación con los mismos valores en individuos normales, es decir, individuos que no sufren la enfermedad de Alzheimer u otras enfermedades relacionadas con \beta-amiloides. La cantidad de ATF-\betaAPP puede compararse con la cantidad de otras especies de APP, sea de una isoforma (por ejemplo, 695, 751 ó 770), y/o de una forma definida adicionalmente por su extremo carboxi-terminal (por ejemplo, formas cortadas en el sitio descrito por Esch et al, o carboxi-terminales respecto a éste). Además de los procedimientos iniciales de diagnóstico, puede efectuarse un control de los niveles de ATF-\betaAPP con el fin de seguir el progreso de la enfermedad, y potencialmente hacer un control de la eficacia del tratamiento. Sería de esperar que los niveles de ATF-\betaAPP decrecerían con un régimen eficaz de tratamiento.
Puede efectuarse el control in vitro de los niveles de ATF-\betaAPP en medio suplementado procedente de un cultivo celular adecuado para la exploración sistemática de fármacos. Mediante el cultivo de células en condiciones que resultan en la secreción de ATF-\betaAPP al medio de cultivo, y la exposición de las células a compuestos de prueba, puede observarse el efecto de dichos compuestos de prueba sobre la secreción de ATF-\betaAPP. Sería de esperar que los compuestos de prueba que son capaces de reducir la cantidad de ATF-\betaAPP serían candidatos para las pruebas como inhibidores de formación de \betaAP. Entre las líneas celulares adecuadas se incluyen líneas celulares humanas y animales, tal como la línea celular 293 de riñón humano, las líneas celulares de neuroglioma humano, células HeLa humanas, células endoteliales primarias (por ejemplo, células HUVEC), fibroblastos primarios humanos o linfoblastos (incluyendo células endógenas derivadas de pacientes con mutaciones en \betaAPP), células primarias cerebrales mixtas humanas (incluyendo neuronas, astrocitos y neurogliales), células ováricas de hámster chino (CHO), y similares. Las líneas celulares que incrementan preferentemente los niveles o proporciones de ATF-\betaAPP serían especialmente útiles en los métodos de la invención.
De manera similar, el control in vitro de ATF-\betaAPP en modelos animales de la enfermedad de Alzheimer, tal como el modelo de ratón dado a conocer en la patente WO 91/19810, también puede ser utilizado para explorar la eficacia terapéutica de compuestos de prueba (habitualmente para la exploración sistemática de compuestos ya previamente identificados mediante una exploración sistemática in vitro). Se administran el compuesto, o los compuestos, de prueba al animal, y se realizan observaciones del nivel de ATF-\betaAPP, o de la proporción de ATF-\betaAPP frente a otros fragmentos de \betaAPP. Aquellos compuestos que reducen el nivel de ATF-\betaAPP, o reducen la proporción de ATF-\betaAPP frente a otros fragmentos de \betaAPP, se considerarán candidatos para evaluaciones posteriores.
Los compuestos de prueba pueden ser cualquier molécula, compuesto, u otra sustancia que pueda añadirse a un cultivo celular sin interferir sustancialmente en la viabilidad celular. Pueden ser compuestos de prueba adecuados, moléculas pequeñas, polímeros biológicos, tal como polipéptidos, polisacáridos, polinucleótidos, y similares. Los compuestos de prueba se administrarán al medio de cultivo, típicamente a una concentración en el rango entre, aproximadamente, 1 nM y 1 mM, habitualmente entre 10 \muM y 1 mM.
Los compuestos de prueba que son capaces de inhibir la secreción de ATF-\betaAPP se consideran candidatos para determinaciones posteriores de la capacidad de bloqueo de la producción de \beta-amiloides en células patogénicas. La inhibición de la secreción indica que el corte de \betaAPP en el extremo amino-terminal de \betaAP probablemente ha sido, al menos en parte, bloqueado, reduciendo la cantidad disponible para la conversión a péptido \beta-amiloide de un intermediario en el tratamiento.
La presente invención considera, adicionalmente, métodos para la inhibición de la producción de \beta-amiloide en células, en el que el método incluye la administración a las células de compuestos seleccionados mediante el método anteriormente descrito. Los compuestos pueden añadirse al cultivo celular con el fin de inhibir la producción de \betaAP por parte de las células cultivadas. Los compuestos también pueden administrar a un paciente con el fin de inhibir la deposición de placa amiloide asociada con la enfermedad de Alzheimer y con otras enfermedades relacionadas con \betaAP.
La presente invención considera, adicionalmente, composiciones farmacéuticas que incorporan un compuesto seleccionado por el método anteriormente descrito y su inclusión en un portador farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones farmacéuticas deberían contener una cantidad terapéutica o profiláctica de, al menos, un compuesto identificado por el método de la presente invención. El portador farmacéuticamente aceptable puede ser cualquier sustancia compatible no tóxica adecuada para la entrega de compuestos a un huésped de interés. Pueden utilizarse como portador, agua estéril, alcohol, grasas, ceras, y sólidos inertes. También pueden incorporarse en las composiciones farmacéuticas, adyuvantes farmacéuticamente aceptables, agentes tamponadores, agentes dispersantes, y similares. La preparación de condiciones farmacéuticas que incorporan agentes activos se encuentra bien descrita en la literatura médica y científica. Ver, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 16ª edición, 1982.
Las composiciones farmacéuticas que se acaban de describir son adecuadas para la administración sistémica al huésped, incluyendo la administración parenteral, tópica, y oral. Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse parenteralmente, es decir, subcutáneamente, intramuscularmente, o intravenosamente. De esta manera, la presente invención considera composiciones para la administración a un huésped, en la que las composiciones comprenden una solución farmacéuticamente aceptable del compuesto identificado en un portador aceptable, como se ha descrito anteriormente.
Con frecuencia, será deseable o necesario introducir las composiciones farmacéuticas directa o indirectamente en el cerebro. Las técnicas directas habitualmente involucran la introducción de un catéter para la administración de fármacos en el sistema ventricular del huésped con el fin de rodear la barrera hematoencefálica. Las técnicas indirectas, las cuales son generalmente preferidas, involucran la formulación de las composiciones con el fin de proporcionar capacidad de bioactivación al fármaco mediante la conversión de los fármacos hidrofílicos en fármacos liposolubles. La bioactivación se consigue, generalmente, mediante el bloqueo de los grupos hidroxilo, carboxilo, y amina primaria presentes en el fármaco, haciendo que el fármaco sea más liposoluble y fácil de transportar a través de la barrera hematoencefálica. Alternativamente, puede potenciarse la entrega de fármacos hidrofílicos mediante la infusión intra-arterial de soluciones hipertónicas, las cuales pueden abrir transitoriamente la barrera hematoencefálica.
La concentración del compuesto en el portador farmacéutico puede variar ampliamente, en concreto entre menos de, aproximadamente, 0,1% en peso de composición farmacéutica, hasta 20% en peso aproximadamente, o más. Las composiciones farmacéuticas típicas para inyección intramuscular se fabricarían para contener, por ejemplo, uno a cuatro mililitros de agua estéril tamponada, y un \mugramo a un miligramo del compuesto identificado mediante el método de la presente invención. La composición típica para la infusión intravenosa podría fabricarse para contener 100 a 500 ml de solución estéril de Ringer, y aproximadamente, 1 a 100 mg del compuesto.
Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de enfermedades relacionadas con la deposición de \betaAP, tal como la enfermedad de Alzheimer y el síndrome de Down. En las aplicaciones terapéuticas, se administran las composiciones farmacéuticas a un huésped que ya sufre la enfermedad. Las composiciones farmacéuticas se administrarán en una cantidad suficiente para inhibir la deposición adicional de placa \betaAP. Una cantidad adecuada para conseguir esto se define como una "dosis terapéuticamente efectiva". Tal dosis efectiva dependerá de la extensión de la enfermedad, del tamaño del huésped, y similares, pero generalmente oscilará entre, aproximadamente, 0,01 \mug y 10 mg del compuesto por kilogramo de peso corporal del huésped, utilizándose más habitualmente dosis entre 0,1 \mug y 1 mg/kg.
Para aplicaciones profilácticas, se administran las composiciones farmacéuticas a un huésped susceptible de la enfermedad asociada a \betaAP, pero que no sufre todavía de tal enfermedad. Tales huéspedes pueden identificarse mediante exploración genética y análisis clínico, como se describe en la literatura médica. Las composiciones farmacéuticas serán capaces de inhibir o prevenir la deposición de la placa \betaAP en una etapa muy temprana, preferiblemente serán capaces de prevención, incluso en las etapas iniciales de la enfermedad \beta-amiloide. La cantidad del compuesto requerida para tal tratamiento profiláctico, denominada dosis profilácticamente efectiva, es generalmente la misma que la descrita anteriormente para el tratamiento terapéutico.
Los siguientes ejemplos se ofrecen como ilustración, y no son limitativos.
Sección experimental Materiales y métodos 1. Preparación de anticuerpos y de la matriz de afinidad
Se cultivó y cribó anticuerpo monoclonal 6C6 de la misma manera que el anticuerpo 10D5 (Hyman et al. (1992) J. Neuropath. Exp. Neurol. 51:76) utilizando un péptido sintético que contenía los residuos 1-28 de \betaAP conjugados con albúmina de suero de conejo como inmunógeno. Ambos, 10D5 y 6C6, reconocen un epítopo en los primeros 16 aminoácidos de la secuencia de \betaAP. 6C6 fue más eficiente que 10D5 en la inmunoprecipitación y se utilizó como anticuerpo de captura. Para preparar resina 6C6, se lavaron 4 mililitros de Affigel®10 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) con agua fría y se combinaron con 3 mililitros de 6C6 (12,5 mg/ml en PBS (KCl 2,7 mM, KH_{2}PO_{4} 1,5 mM, Na_{2}HPO_{4} 8,1 mM, NaCl 137 mM, pH 7,5) NaCl 0,5 M. El acoplamiento se realizó durante la noche a 4ºC, bajo agitación suave. Se añadieron, entonces, 400 \mul de Tris 1 M, pH 8,0, y se continuó la agitación durante 40 minutos. A continuación, se lavó la resina exhaustivamente con TTBS (NaCl 137 mM, KCl 5 mM, Tris 25 mM, Tween® 20 al 0,5%, pH 7,5) previamente a su utilización. También se describe el anticuerpo 7H5 en Hyman et al. (1992), supra.
Se cultivaron anticuerpos (denominados anticuerpo 92) contra un péptido sintético que incluía los residuos 591-596 de \betaAPP (según numeración de Kang et al. (1987), supra). Se conjugó el péptido (N-acetil-CISEVKM) con albúmina de suero de conejo, la cual había sido activada con éster de sulfo-maleimido benzoil-N-hidroxisuccinimida para formar un inmunógeno. Se cultivaron antisueros contra el inmunógeno en conejos utilizando metodologías estándar. Durante cada inoculación, los conejos recibieron 5 \mug de inmunógeno en inyecciones subcutáneas de 0,1 ml en aproximadamente 10 sitios (50 \mug/inoculación). Se acopló el mismo péptido con gel Sulfo-link™ (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) para la purificación por afinidad de anticuerpos de la fracción IgG.
A continuación, se proporciona una descripción más detallada de la preparación de anticuerpo 92. Se incubó albúmina de suero de conejo (12,3 mg) con 13 mg de éster de sulfo-maleimido benzoil-N-hidroxisuccinimida en 1,25 ml de KH_{2}PO_{4} 0,05 M, pH 7,0, durante 20 minutos a 0ºC. A continuación e inmediatamente, se sometió la mezcla a filtración en gel en una columna 1 x 75 cm de Sephadex™ G-10 equilibrada con el tampón fosfato. Se agrupó el eluído de proteína en el volumen excluído e inmediatamente se combinó con 30 mg de péptido N-acetil-CISEVKM, el cual se había sintetizado mediante metodologías estándar automáticas en fase sólida. La reacción de acoplamiento (volumen 20 ml) se dejó que se produjese durante la noche, y después se envió a un laboratorio privado para la generación de anticuerpos. El protocolo de inyección fue emulsionar el antígeno en un volumen igual de adyuvante completo de Freund, e inyectar subcutáneamente un total de 50 \mug de antígeno en alícuotas de 0,1 ml en, aproximadamente, 10 sitios. A partir de entonces, cada 3 semanas se proporcionaba una inyección de refuerzo utilizando un protocolo idéntico excepto que se utilizaba adyuvante incompleto de Freund como emulsificante. Se extrajo sangre de los conejos una semana después de cada inyección y se midió el título sérico mediante reacción contra el péptido en una ELISA. Se purificó el IgG del suero de reacción positiva por precipitación con (NH_{4})_{2}SO_{4} al 50%, (2 veces) y se dializó frente a PBS. Se conjugó el péptido N-acetil-CISEVKM con gel Sulfo-link™ (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) siguiendo las recomendaciones del fabricante, para generar una resina de afinidad para purificar los anticuerpos específicos para el péptido. Se introdujo la fracción de IgG en la columna y, tras lavar el material no unido específicamente utilizando PBS, se eluyeron los anticuerpos con glicina 0,1 M, pH 2,5 NaCl 0,5 M, y a continuación, se dializaron frente a PBS antes de congelarlos.
2. Cultivo de células cerebrales de feto humano
Se obtuvieron especímenes de tejido neural de cadáveres fetales de 12-14 semanas de edad. Se enjuagaron dos veces muestras de córtex cerebral con solución salina equilibrada de Hank (HBSS). Se introdujo tejido cortical (2-3 gramos) en 10 ml de HBSS frío al que se le había añadido 1 mg de ADNasa (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO D3427). Se filtró la suspensión triturada a través de filtros Nitex de nilón de 210 \mum primero, y de 130 \mum después, como describen Pulliam et al. (1984) J. Virol. Met. 9:301.
Se recolectaron las células por centrifugación y se resuspendieron en medio neuronal (MEM suplementado con suero de feto bovino al 10%, glucosa al 1%, piruvato sódico 1 mM, glutamina 1 mM, KCl 20 mM). Se sembraron placas de 100 mm recubiertas con polietilenimina con 1,5 x 10^{7} células en 8 ml de medio neuronal. Se cambió el medio dos veces por semana. Todos los cultivos en este estudio se cultivaron in vitro durante, al menos, 30 días. Para condiciones de crecimiento libre de suero, los cultivos se cambiaron a un medio definido (DMEM suplementado con 5 \mug/ml de insulina bovina; 0,1 mg/ml de transferrina humana; 0,1 mg/ml de BSA fracción V; 0,062 \mug/ml de progesterona, 1,6 \mug/ml de putrescina; 0,039 \mug/ml de selenita sódica, 0,042 \mug/ml de tiroxina; y 0,033 \mug/ml de triyodo-L-tironina), y tras 3 días se recogió el sobrenadante.
Se recogió el medio condicionado de las células (10 ml). Se añadió EDTA (5 mM), leupeptina (10 \mug/ml), y Tris-HCl (20 mM, pH 8,0) a cada una de las muestras de 10 ml a la concentración final indicada, y se centrifugó la muestra a 30.000 x g durante 20 minutos a 4ºC. Se dividió el sobrenadante resultante en dos alícuotas iguales, se añadió resina 6C6 a una de las alícuotas (200 \mul de resina con unión de aproximadamente 5 mg/ml de 6C6). Se mezclaron suavemente ambas alícuotas durante 6 horas a 4ºC, se peletizó la resina, y se añadió una segunda alícuota de 200 \mul de resina. Se mezclaron adicionalmente las muestras durante la noche a 4ºC. Se lavaron las resinas agrupadas con TTBS dos veces, y a continuación se extrajeron brevemente con alícuotas de 1 ml de glicina 0,1 M, NaCl 0,1 M, pH 2,8.
El material extraído de la resina, el medio agotado por ésta, y el medio de inicio se hicieron precipitar individualmente con TCA (ácido tricloroacético) al 10% a 0ºC durante una hora, se lavaron los pellets con acetona y, a continuación, se resuspendieron en 150 \mul de tampón de muestras SDS-PAGE bajo condiciones reductoras, y se hirvieron. Cada muestra (25 \mul) se sometió a SDS-PAGE utilizando geles de tricina al 10-20% (Novex). Se transfirieron las proteínas a membranas ProBlot™ de PVDF durante la noche a 40V. La visualización de las proteínas inmunoreactivas se realizó utilizando el sistema de quimioluminiscencia TROPIX™, siguiendo las indicaciones del fabricante para el sustrato AMPPD. Las concentraciones de anticuerpos primarios utilizados fueron: anti-5, 0,1 \mug/ml; 92, 2 \mug/ml; 10D5, 2 \mug/ml.
3. Cultivo de células 293 humanas
Se modificaron células 293 humanas (ATCC nº CRL-1573) para sobreexpresar APP (Selkoe et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7341). Se cultivaron las células en placas de 10 cm hasta subconfluencia previamente a su utilización. El marcaje metabólico e inmunoprecipitación se llevaron a cabo, esencialmente, como se había descrito previamente en Oltersdorf et al. (1989) Nature 341:144 y (1990) J. Biol. Chem. 265:4492. Brevemente, el marcaje se llevó a cabo en placas de 10 cm. Se lavaron las células en medio libre de metionina, se incubaron durante 20 minutos en 2 ml de medio libre de metionina suplementado con 0,5 mCi de metionina-^{35}S, se lavaron en medio completo, y se captaron durante 2 horas en 3 ml de medio completo. Se recogió el medio condicionado y se clarificó a 3.000 x g durante 10 minutos seguido de preabsorción con proteína A Sepharose® (Pharmacia, Piscataway, NJ). La inmunoprecipitación se llevó a cabo con 1,5 mg de proteína A Sepharose® por muestra. Se utilizaron 2 \mug de anticuerpo anti-5 por muestra; y 10 \mug de 6C6, 7H5 y 92 por muestra. Se utilizaron 5 mg de IgG anti-ratón de conejo con 6C6 y 7H5, y también en las muestras de control. Se lavaron cuatro veces los precipitados con TBS (NaCl 137 mM, KCl 5 mM, Tris 25 mM, pH 7,5), NP40 al 0,1%, EDTA 5 mM, PMSF 1 mM, 10 \mug/ml de leupeptina. Se llevó a cabo SDS-PAGE en geles Laemmli al 5%.
4. Cultivo de células 293 humanas transfectadas con mutación sueca
Se transfectaron transitoriamente células 293 de riñón humano en pocillos duplicados en una bandeja de 6 pocillos, con vectores plásmido que expresaban \betaAPP humana normal o la variante mutación sueca de \betaAPP mediante transfección mediada por DOTAP siguiendo indicaciones del fabricante (Boehringer Manheim). 40 horas después, las células se introdujeron en medio DME libre de metionina que contenía suero de feto de vaca al 10%, y 20 minutos después se marcaron durante 35 minutos con 200 \muCi/ml de metionina-^{35}S. Entonces, las células se re-introdujeron en medio DME normal que contenía suero de feto de vaca al 10%, y se incubaron durante 2,5 horas más. Se recogió el medio de las células, y se centrifugó a 1.000 x g durante 15 minutos para eliminar todas las células. Se dividió el sobrenadante en dos, y una mitad se inmunoprecipitó con anticuerpo anti-5 utilizando métodos estándar. La otra mitad se incubó durante la noche con anticuerpo 6C6 acoplado con agarosa, y el material unido a la agarosa 6C6 se separó por centrifugación. El material restante se inmunoprecipitó entonces con anticuerpo anti-5. El total de inmunoprecipitados anti-5 (\alpha5+), precipitados unidos a 6C6 (6C6+), e inmunoprecipitados no reactivos frente a 6C6 y reactivos frente a anti-5 (6C6-, \alpha5+) se corrieron en un gel Laemmli al 5%, y las proteínas inmunoreactivas se visualizaron por autorradiografía.
Descripción de las figuras experimentales Figura 2 Demostración de \betaAPP truncada en medio condicionado de cultivos celulares mixtos de cerebros humanos
La muestra 1 es el medio condicionado procedente de un cultivo; muestra 2 es el medio agotado de \betaAPP reactivo frente a 6C6; y muestra 3 es el material extraído de la resina 6C6. Se sondeó el panel A con anticuerpos anti-5, específicos contra la secuencia 444-592 de \betaAPP (Oltersdorf et al. (1989) supra, y (1990) supra). El panel B se sondeó con anticuerpo 92, descrito en la sección de Materiales y métodos. El panel C se sondeó con 10D5, un anticuerpo monoclonal que reconoce un epítopo en los residuos 1-16 de \betaAP, como se describe en la sección de Materiales y métodos. Las bandas de menor peso molecular observadas en C2 y C3, no se observaron en C1, y se derivan de la resina 6C6 y son reconocidas por conjugado de IgG anti-ratón de cabra-fosfatasa alcalina que es independiente de un anticuerpo primario (datos no mostrados).
Figura 3 Especificidad de los anticuerpos 92
Un mililitro de un espécimen de CSF lumbar humano obtenido de un varón de 75 años se hizo precipitar con ACT al 10% con el fin de concentrarlo por un factor de diez, y se procesó como se describe en la figura 2, excepto en que el pocillo del gel era una ranura de 4 cm. Se diluyó el anticuerpo 92 a 6,7 \mug/ml en 0,5 ml de TTBS en presencia de diversos péptidos potencialmente competidores, cada uno a una concentración aproximada de 60 \muM, durante 10 horas a 4ºC bajo mezcla suave. Se diluyó entonces el anticuerpo por un factor de 8 en gelatina al 1%/TTBS previamente a la incubación con tiras del blot de material derivado del CSF, y se procesó como se describe en la figura 2. Los péptidos competidores eran los siguientes: Pista 1, sin adición de péptido competidor; Pista 2, GSGLTNIKTEEISEVK; Pista 3, YSGLTNIKTEEISEVKM; Pista 4, ISEVKM; Pista 5, EISEVKMD; Pista 6, CISEVKM; Pista 7, YISEVKM. PM = marcadores de peso molecular (indicado en kilodaltons).
Figura 4 Heterogeneidad de peso molecular de formas secretadas de APP en la inmunoprecipitación detectadas mediante anticuerpos contra diferentes extremos C-terminales en líneas celulares y en cultivos primarios de células cerebrales de feto humano
Anticuerpos: anti-5: Pistas 3, 6, 9; 6C6 (dirigidos contra residuos peptídicos 1-16 de \betaAP): pistas 4, 7, 10; anticuerpo 92 (contra aminoácidos 591 a 596 de APP): pistas 5, 8, 11; 7H5 (contra APP-KPI): pista 12. Células: panel izquierdo (pistas 1 y 3-5): células 293 transfectadas establemente con APP 695; panel intermedio (pistas 2 y 6-8): células 293 transfectadas establemente con APP 751; panel derecho (pistas 9-13); cultivos de células cerebrales de feto humano. Controles: pistas 1, 2, y 13: anticuerpo IgG anti-ratón de conejo. Flechas: un ejemplo de diferencia de peso molecular entre formas secretadas de APP reconocidas por los anticuerpos 6C6 y 92. Se llevó a cabo SDS-PAGE en un gel Laemmli al 5%. PM = marcadores de peso molecular (indicado en kilodaltons).
Figura 5 Demostración de \betaAPP truncado en medio condicionado procedente de células 293 humanas transfectadas con mutación Sueca
La figura 5 muestra resultados de transfecciones duplicadas de formas normales y Suecas. Las pistas 1-4 son \alpha5+; las pistas 5-8 son 6C6+; y las pistas 9-12 son muestras 6C6-, \alpha5+. Las pistas 1, 2, 5, 6, 9 y 10 son de \betaAPP normal; las pistas 3, 4, 7, 8, 11 y 12 son de \betaAPP sueco. La mutación sueca resulta en la producción incrementada de 
\hbox{ATF- \alpha PP}
ya que las pistas 11 y 12 contienen más material de ATF-\betaAPP que las pistas 9 y 10. Resultados
Se utilizó anticuerpo monoclonal 6C6, el cual reconoce un epítopo de \betaAP entre los residuos 1 y 16, para agotar inmunológicamente ciertos fragmentos de \betaAPP de diversas muestras. El anticuerpo monoclonal 6C6 se acopló a resina (como se ha descrito anteriormente), y se incubó con el medio condicionado de cultivos celulares de cerebro fetal humano, como se ha descrito anteriormente. Como se puede observar (figura 2, pista C2), esta resina elimina eficazmente el \betaAPP que contiene \betaAP 1-6 del medio condicionado del cultivo celular. La resina, sin embargo, no captura inmunoreactividad sustancial de \betaAPP, como detecta el anticuerpo anti-5 dirigido contra un epítopo en dirección N-terminal a la región \betaAP (figura 2, pista A2).
Con el fin de caracterizar esta aparentemente nueva forma de \betaAPP, los presentes inventores generaron anticuerpos contra un péptido sintético que incluía los residuos 591-596 de \betaAPP (como se ha descrito anteriormente). Este anticuerpo (denominado 92) se descubrió que reconocía las especies de \betaAPP no capturadas por la resina, (figura 2, pista B2) pero, sorprendentemente, no reaccionó con la forma secretada de \betaAPP que contenía la secuencia 1-16 de \betaAP (pista B3).
La explicación de esta falta de reactividad cruzada parece ser que el anticuerpo 92 reconoce un epítopo en \betaAPP que incluye la metionina carboxi-terminal, correspondiente al residuo 596. De acuerdo con esto, los presentes inventores examinaron la capacidad de diversos péptidos sintéticos de bloquear la inmunoreactividad generada con 92. Como puede observarse en la figura 3, los péptidos de secuencia basada en \betaAPP que terminan con el equivalente de la metionina 596, bloquean sustancialmente la reacción de 92, mientras que los péptidos que son un aminoácido más largos o más cortos en sus extremos carboxi-terminales son comparativamente ineficaces en situación de competencia. Se observó el mismo patrón de competencia de péptidos en sobrenadantes de cultivos celulares (datos no mostrados) y en CSF. Una serie de experimentos de pulso-caza reveló cantidades detectables de material inmunoprecipitable por anticuerpo 92 producido por células 293 que sobreexpresaban las isoformas 695 ó 751 de \betaAPP (figura 4, pistas 5 y 8). Experimentos similares en cultivos celulares de cerebro fetal humano mostraron que el material inmunoprecipitable 92 puede resolverse del \betaAPP que es reactivo frente a 6C6 mediante SDS-PAGE de bajo porcentaje (5%) (figura 4, pistas 9-11). En los cultivos celulares de cerebro fetal, el tratamiento alternativo de formas de \betaAPP que contienen dominio inhibidor de proteasa Kunitz (KPI) es menos evidente, aunque se observan bandas comigrantes débiles en inmunoprecipitaciones con anticuerpo 92 y con anticuerpo 7H5 anti-KPI (pistas 11, 12).
La capacidad de resolver los materiales precipitables por anticuerpos 92 y 6C6 en cultivos mixtos de células cerebrales se debe, al menos en parte, a la producción de las formas respectivas en cantidades casi iguales, en comparación con la situación con células 293. Estus et al. (1992), obra citada, observaron que, en comparación con otros tejidos, el cerebro humano contenía una cantidad relativamente más elevada del fragmento carboxi-terminal potencialmente amiloidogénico, el cual, basados en el tamaño, parece iniciarse en el extremo amino-terminal de \betaAP o cerca de éste.
La coincidencia temporal en la aparición de materiales de \betaAPP precipitables con anticuerpos 92 y 6C6 es evidencia en contra de la posibilidad de un segundo suceso proteolítico después de la secreción, en particular porque tiempos de captura más largos no resultan en una alteración perceptible en la proporción de especies reactivas a 92 y 6C6 (datos no mostrados). La resolución en SDS-PAGE de las formas secretadas, junto con la completa falta de reactividad inmunológica de estas especies, corrobora adicionalmente la existencia de una ruta alternativa de secreción. El sitio de corte alternativo se denominó sitio \beta-secretasa, para enfatizar que el corte ocurre en dirección amino-terminal a \betaAP, el cual es diferente del corte descrito por Esch et al. (1990) obra citada, el cual ocurre dentro de \betaAP.
Aunque la invención anterior ha sido descrita en detalle con el fin de ser clara al entendimiento, resultará obvio que pueden practicarse ciertas modificaciones dentro del ámbito de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (41)

1. Método para controlar el tratamiento de proteína precursora \beta-amiloide (\betaAPP) en células, el cual comprende la detección específica de un fragmento amino-terminal soluble de proteína precursora \beta-amiloide (ATF-\betaAPP) secretada por las células, en el que la secuencia aminoacídica del ATF-\betaAPP se extiende desde el extremo amino-terminal de \betaAPP hasta el extremo amino-terminal del péptido \beta-amiloide, en el que ATF-\betaAPP se distingue de otras formas cortadas de \betaAPP que puedan estar presentes.
2. Método según la reivindicación 1, en el que ATF-\betaAPP se detecta mediante una técnica seleccionada de entre el grupo que consiste en, (1) exposición a una sustancia que se une específicamente a un epítopo de ATF-\betaAPP que termina en un residuo C-terminal que ha sido expuesto por el corte del péptido \beta-amiloide procedente de \betaAPP, y (2) electroforesis bidimensional en gel de los fragmentos \betaAPP secretados por las células, seguido de exposición de los fragmentos de electroforesis a una sustancia que es reactiva frente a los fragmentos de \betaAPP.
3. Método para la detección de un fragmento amino-terminal secretado de proteína precursora \beta-amiloide (ATF-\betaAPP) que resulta del corte de \betaAPP del extremo amino-terminal del péptido \beta-amiloide (\betaAP) en una muestra biológica, comprendiendo dicho método:
exponer la muestra a una sustancia que se une específicamente a una región C-terminal en la ATF-\betaAPP secretada; y
detectar la unión entre la sustancia y el fragmento secretado.
4. Método según la reivindicación 3, en el que la sustancia es un anticuerpo específico de la región C-terminal que incluye un residuo C-terminal expuesto por el corte del péptido \beta-amiloide procedente de \betaAPP.
5. Método según la reivindicación 4, en el que \betaAPP es la isoforma 695, 751 ó 770.
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que el residuo C-terminal es metionina^{596}.
7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que el residuo C-terminal es leucina^{596}.
8. Método según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, en el que el anticuerpo es específico contra un péptido que comprende los residuos 591-596 de \betaAPP, en el que está expuesto el residuo 596.
9. Método para la determinación de la presencia de un fragmento amino-terminal secretado de proteína precursora \beta-amiloide (ATF-\betaAPP), en el que la secuencia aminoacídica de ATF-\betaAPP se extiende desde el extremo amino-terminal de \betaAPP hasta el extremo amino-terminal del péptido \beta-amiloide, en una muestra biológica, comprendiendo dicho método:
exposición de la muestra a un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo en el extremo carboxi-terminal de un fragmento de \betaAPP que tiene metionina en su extremo carboxi-terminal, estando dicho anticuerpo sustancialmente libre de reactividad frente a otros fragmentos de \betaAPP que tuviesen aminoácidos más allá de la metionina; y
detección de la unión entre la sustancia y el fragmento secretado.
10. Método según la reivindicación 9, en el que \betaAPP es la isoforma 695, 751 ó 770.
11. Método según la reivindicación 9 ó 10, en el que el anticuerpo es específico contra un péptido que comprende los residuos 591-596 de \betaAPP, estando expuesto el residuo 596.
12. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que se detecta ATF-\betaAPP en una muestra de un paciente.
13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 11, en el que la muestra biológica es una muestra de un paciente.
14. Método según la reivindicación 12 ó 13, en el que la muestra de un paciente es líquido cerebroespinal.
15. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que se detecta ATF-\betaAPP en medio condicionado procedente de un cultivo celular.
16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 11, en el que la muestra biológica es un medio condicionado procedente de una línea celular.
17. Método in vitro de exploración sistemática de compuestos para identificar inhibidores de producción de
\beta-amiloide, comprendiendo dicho método:
(a) cultivo de células bajo condiciones que resultan en secreción de un fragmento amino-terminal soluble de proteína precursora \beta-amiloide (ATF-\betaAPP) en el que la secuencia aminoacídica del ATF-\betaAPP soluble se extiende desde el extremo amino-terminal del \betaAPP hasta el extremo amino-terminal del péptido \beta-amiloide;
(b) exposición de las células cultivadas a un compuesto de prueba; y
(c) detección de una cantidad del ATF-\betaAPP soluble; de tal modo que una reducción en la cantidad del ATF-\betaAPP soluble en comparación con la cantidad de ATF-\betaAPP soluble de células no expuestas al compuesto indica que éste es un inhibidor de producción de \beta-amiloide.
18. Método según la reivindicación 17, en el que las células son células cultivadas de cerebro fetal humano.
19. Método según la reivindicación 17 ó 18, en el que el compuesto de prueba se expone a una concentración entre 1 nM y 1 mM.
20. Método según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en el que el compuesto de prueba es una molécula pequeña.
21. Método según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en el que el compuesto de prueba es un polímero biológico.
22. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que ATF-\betaAPP tiene un extremo carboxi-terminal de metionina^{596}, metionina^{652} o metionina^{671}.
23. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que ATF-\betaAPP tienen un extremo carboxi-terminal de leucina^{596}, leucina^{652} o leucina^{671}.
24. Composición de anticuerpos que comprende moléculas de anticuerpos que reconocen específicamente un fragmento amino-terminal de la proteína precursora \beta-amiloide (ATF-\betaAPP), la cual se corta en el extremo amino-terminal del péptido \beta-amiloide, pero cuyas moléculas de anticuerpos no reconocen específicamente un fragmento de \betaAPP secretado cuya secuencia se extienda hacia el interior de la secuencia del péptido \beta-amiloide.
25. Composición de anticuerpos según la reivindicación 24, en la que el anticuerpo reconoce específicamente la región C-terminal que incluye un residuo C-terminal expuesto por el corte del péptido \beta-amiloide procedente de \betaAPP.
26. Composición de anticuerpos según la reivindicación 25, en el que \betaAPP es la isoforma 695, 751 ó 770.
27. Composición de anticuerpos según la reivindicación 24 ó 25, en el que las moléculas de anticuerpo comprenden inmunoglobulinas intactas o fragmentos de inmunoglobulina.
28. Composición de anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27, en el que las moléculas de anticuerpos específicos contra un péptido que comprende al menos los residuos 591-596 de \betaAPP, siendo el residuo 596 el aminoácido carboxi-terminal del péptido.
29. Composición de anticuerpos según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 28, que comprende antisueros específicos contra el péptido.
30. Composición de anticuerpos según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 29, en el que ATF-\betaAPP tiene un residuo carboxi-terminal que corresponde a metionina^{596} o leucina^{596}.
31. Composición de anticuerpos según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 28 ó 30, que comprende anticuerpos monoclonales.
32. Composición de anticuerpos según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 31, en la que las moléculas de anticuerpo son moléculas de anticuerpo de ratón, de conejo, de oveja o de cabra.
33. Composición de anticuerpos según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 32, en la que las moléculas de anticuerpo se producen de manera recombinante.
34. Composición de anticuerpos según la reivindicación 27, en la que el fragmento de inmunoglobulina es un fragmento F(ab), un fragmento Fv, un fragmento VL o un fragmento VH.
35. Hibridoma que produce moléculas de anticuerpos que reconocen específicamente un fragmento amino-terminal de proteína precursora \beta-amiloide (ATF-\betaAPP) que se ha cortado del extremo amino-terminal del péptido \beta-amiloide, pero cuyas moléculas de anticuerpos no reconocen específicamente un fragmento secretado de \betaAPP cuya secuencia se extienda hacia el interior de la secuencia del péptido \beta-amiloide.
\newpage
36. Hibridoma según la reivindicación 35, en el que ATF-\betaAPP tiene un residuo carboxi-terminal que corresponde a:
(a) metionina^{596} o leucina^{596};
(b) metionina^{652} o leucina^{652}; o
(c) metionina^{671} o leucina^{671}.
37. Fragmento soluble de proteína precursora \beta-amiloide (\betaAPP) en forma aislada y purificada, presentando dicho fragmento una metionina o leucina C-terminal que resulta del corte del péptido \beta-amiloide a partir de \betaAPP intacto.
38. Fragmento soluble según la reivindicación 37, aislado a partir de una fuente natural seleccionada de entre el grupo que consiste en líquido cerebroespinal y medio condicionado procedente de células cultivadas.
39. Fragmento soluble según la reivindicación 37 ó 38, cuya secuencia aminoacídica consiste en los residuos 18-596 de la isoforma 695 de \betaAPP, en los residuos 18-612 de la isoforma 751 de \betaAPP, o en los residuos 18-671 de la isoforma 770 de \betaAPP.
40. Uso de una composición de anticuerpos según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 34 para el control del tratamiento de la proteína precursora \beta-amiloide.
41. Uso de un fragmento soluble según cualquiera de las reivindicaciones 37 a 39 para el control del tratamiento de proteína precursora \beta-amiloide.
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