ES2206455T3 - Metodos y composiciones para controlar el tratamiento celular de la proteina precursora beta-amiloide. - Google Patents
Metodos y composiciones para controlar el tratamiento celular de la proteina precursora beta-amiloide.Info
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Abstract
PROCESAMIENTO DE PROTEINA PRECURSORA DE ((BETA))-AMILOIDE ((BETA)APP) ES SUPERVISADO DETECTANDO LA SECRECCION DE UN FRAGMENTO SOLUBLE BAPP QUE RESULTA DEL DESDOBLAMIENTO DE (BETA)APP EN LOS TERMINOS AMINO DE PEPTIDA (BETA)-AMILOIDE. SUPERVISION EN VIVO DE LA SECRECION DEL FRAGMENTO DE (BETA)APP PUEDE SER SUPERVISADO POR DIAGNOSIS DEL MAL DE ALZHEIMER Y OTRAS ENFERMEDADES RELACIONADAS CON (BETA)-AMILOIDE, MIENTRAS QUE SUPERVISION IN VITRO DE TAL SECRECION DE CELULAS CULTIVADAS PUEDE SER SUPERVISADA PARA IDENTIFICAR INHIBIDORES DE PRODUCCION DE (BETA)-AMILOIDE. EL FRAGMENTO (BETA)APP PUEDE SER DETECTADO USANDO ANTICUERPOS Y OTRAS SUSTANCIAS ESPECIFICAS DE ENLACE QUE RECONOCEN UN RESIDUO CARBOXI TERMINAL SOBRE EL FRAGMENTO.
Description
Métodos y composiciones para controlar el
tratamiento celular de la proteína precursora
beta-amiloide.
La presente invención se refiere en general a
métodos y composiciones para el control del tratamiento de proteína
precursora del \beta-amiloide. Más
particularmente, la presente invención se refiere a la utilización
de tales métodos y composiciones para el diagnóstico, prognosis, y
control de la respuesta a la terapia de la enfermedad de Alzheimer,
y para la detección sistemática y evaluación de potenciales fármacos
para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
La enfermedad de Alzheimer se caracteriza por la
presencia de numerosas placas amiloides y marañas neurofibrilares
(agregados proteicos altamente insolubles) presentes en los
cerebros de los pacientes de la enfermedad de Alzheimer, en
particular en aquellas regiones involucradas en la memoria y
cognición. Aunque se ha dado un debate considerable sobre si las
placas y marañas eran una causa o meramente el resultado de la
enfermedad de Alzheimer, descubrimientos recientes indican que la
placa amiloide es un precursor o factor causativo. En
particular, se ha descubierto que la producción de péptido
\beta-amiloide, un constituyente principal de la
placa amiloide, puede resultar de mutaciones en el gen que codifica
para la proteína precursora del amiloide, una proteína que no
producirá péptido \beta-amiloide cuando es
procesada con normalidad. La identificación de mutaciones en el gen
de la proteína precursora amiloide que causan enfermedad de
Alzheimer familiar y temprana es la evidencia más fuerte de que el
metabolismo amiloide es un hecho clave en el proceso patogénico que
subyace a la enfermedad. Se han dado a conocer cuatro mutaciones
causantes de enfermedad, que incluyen, con respecto a la isoforma
770, cambio de valina^{717} a isoleucina (Goate et al.
(1991) Nature 349:704-706), cambio de
valina^{717} a glicina (Chartier Harlan et al. (1991)
Nature 353:844-846), cambio de
valina^{717} a fenilalanina (Murrell et al. (1991)
Science 254:97-99), y con respecto a la
isoforma 695, una mutación doble que cambia la
lisina^{595}-metionina^{596} a
asparagina^{595}-leucina^{596} (Mullan et
al. (1992) Nature Genet. 1:345-347).
Además, el péptido \beta-amiloide es tóxico para
las neuronas cerebrales, y se ha asociado la muerte neuronal con la
enfermedad.
De esta manera, la capacidad de hacer un control
del tratamiento celular de la proteína precursora del amiloide
sería de valor considerable en el diagnóstico, prognosis, y
supervisión terapéutica de la enfermedad de Alzheimer. En
particular, sería deseable identificar procedimientos mínimamente
invasivos para la exploración sistemática y evaluación de
marcadores diagnósticos detectables en muestras fácilmente
obtenibles del paciente, tal como suero, líquido cerebroespinal
(CSF), y similares.
Se ha propuesto una serie de marcadores
diagnósticos potenciales para la enfermedad de Alzheimer. Son de
particular interés en la presente invención ciertos fragmentos de
la proteína precursora del amiloide que incluyen fragmentos
carboxi-terminales (tal como el péptido
\beta-amiloide en sí y fragmentos del mismo), y
fragmentos amino-terminales (tal como ciertos
fragmentos de 25 kD, 105 kD, y 125 kD). Hasta el momento, ninguno
de los marcadores propuestos ha demostrado ser definitivo en el
diagnóstico o control ante-mortem de la
enfermedad de Alzheimer.
De esta manera, sería deseable identificar
marcadores diagnósticos adicionales y alternativos para la
enfermedad de Alzheimer. Tales marcadores serían útiles por sí
solos y/o en combinación con otros marcadores y procedimientos
diagnósticos. Preferiblemente, los marcadores diagnósticos deberían
ser detectables en líquidos corporales, tal como CSF, sangre,
plasma, suero, orina, tejido, y similares, de manera que puedan
utilizarse procedimientos diagnósticos mínimamente invasivos.
De interés adicional para la presente invención
son sistemas y métodos in vitro para la detección
sistemática de fármacos candidatos por su capacidad de inhibir o
prevenir la producción de placas de
\beta-amiloide. Sería deseable proporcionar
métodos y sistemas para la detección sistemática de compuestos de
prueba con capacidad de inhibir o prevenir la conversión de
proteína precursora del amiloide a péptido
\beta-amiloide. En particular, sería deseable
basar tales métodos y sistemas en rutas metabólicas en las que se
haya descubierto su implicación en tal conversión, en las que el
compuesto de prueba sería capaz de interrumpir o interferir con la
ruta metabólica que conduce a la conversión. Tales métodos y
sistemas deberían ser rápidos, económicos, y adecuados para la
exploración sistemática de gran número de compuestos de prueba.
El péptido \beta-amiloide
(también denominado A4, \betaAP, A\beta, o A\betaP; ver
patente U.S. nº 4.666.829, y Glenner y Wong (1984) Biochem.
Biophys. Res. Commun. 120:1131-1135) se deriva
de la proteína precursora del \beta-amiloide
(\betaAPP), la cual se expresa en las formas de diverso corte de
695, 751, y 770 aminoácidos. Ver Kang et al. (1987)
Nature 325:773-776; Ponte et al.
(1988) Nature 331:525-527; y Kitaguchi et
al. (1988) Nature 331:530-532. El
tratamiento normal de la proteína precursora amiloide involucra el
corte proteolítico en un sitio entre los residuos Lys^{16} y
Leu^{17} (numeración para la región vAP en la que Asp^{597} es
el residuo 1, en Kang et al. (1987)), supra, cerca del
dominio transmembrana, resultando en la secreción constitutiva de
un dominio extracelular que retiene la parte restante de la
secuencia peptídica \beta-amiloide (Esch et
al. (1990) Science 248:1122-1124). Esta
ruta aparentemente ha sido ampliamente conservada entre especies y
está presente en muchos tipos celulares. Ver Weidemann et
al. (1989) Cell 57:115-126, y Oltersdorf
et al. (1990) J. Biol. Chem.
265:4492-4497. Esta ruta normal corta dentro de la
región de la proteína precursora que corresponde con el péptido
\beta-amiloide, al parecer preveniendo, de esta
manera, su formación. Se ha descubierto otra forma de secreción
constitutiva de \betaAPP (Robakis et al. Soc.
Neurosci. octubre 26, 1993, resumen nº 15,4, Anaheim, CA.) que
contiene más de la secuencia \betaAP en dirección
carboxi-terminal que la forma descrita por Esch
et al. obra citada.
Golde et al. (1992), Science
255:728-730, prepararon una serie de mutantes por
deleción de proteína precursora amiloide y observaron un solo sitio
de corte dentro de la región del péptido
\beta-amiloide. Basándose en esta observación, se
postuló que la formación de péptido
\beta-amiloide no involucra una ruta secretoria.
Estus et al., (1992) Science
255:726-728, dan a conocer que los dos fragmentos
proteolíticos carboxi-terminales más grandes de
proteína precursora amiloide descubiertos en células cerebrales
contienen la región peptídica \beta-amiloide
entera.
La solicitud PCT WO 92/00521 describe métodos
para la evaluación de la enfermedad de Alzheimer basados en la
medición de cantidades de ciertos derivados solubles de 25 kD, 105
kD, y 125 kD de proteína precursora amiloide en el líquido
cerebroespinal de un paciente. La figura 3 de la patente WO 92/00521
sugiere que el corte de la proteína precursora amiloide podría
ocurrir en una posición adyacente al extremo
amino-terminal del péptido
\beta-amiloide, produciendo un fragmento soluble
amino-terminal, pero no se presenta evidencia o
discusión de tal corte en la solicitud. Kennedy et al.
(1992) Neurodegeneration 1:59-64, presentan
datos sobre una forma de \betaAPP secretada, la cual se
caracterizó por su reactividad de anticuerpos frente a los residuos
527-540 de \betaAPP, y por la ausencia de
reactividad de anticuerpos frente a los primeros quince residuos de
\betaAP. No se proporciona evidencia directa que sugiera el sitio
de corte o la identidad del extremo
carboxi-terminal de la forma \betaAPP. La
solicitud PCT WO 91/16628 describe métodos para el diagnóstico de
la enfermedad basándose en la detección de proteínas precursoras
amiloides y de fragmentos de las mismas, utilizando anticuerpos
frente a la proteasa nexina-2 o frente a la
proteína precursora amiloide.
Recientemente se ha dado a conocer que el péptido
soluble \beta-amiloide es producido por células
sanas en medios de cultivo (Haass et al. (1992) Nature
359:322-325) y en CSF humano y animal (Seubert
et al. (1992) Nature 359:325-327).
La presente invención proporciona un método para
el control del tratamiento de la proteína precursora
\beta-amiloide (\betaAPP) en células, el cual
comprende la detección específica de un fragmento soluble
amino-terminal de proteína precursora
\beta-amiloide (ATF-\betaAPP)
secretada por las células, en el que la secuencia aminoacídica de
ATF-\betaAPP se extiende desde el extremo
amino-terminal de \betaAPP hasta el extremo
amino-terminal del péptido
\beta-amiloide, por el cual se distingue
ATF-\betaAPP de otras formas cortadas de
\betaAPP que puedan estar presentes.
El ATF-\betaAPP puede
detectarse mediante una técnica seleccionada del grupo que consiste
en (1) exposición a una sustancia que se une específicamente a un
epítopo de ATF-\betaAPP acabado en un residuo
C-terminal, el cual ha quedado expuesto por el
corte del péptido \beta-amiloide a partir de
\betaAPP, y (2) electroforesis bidimensional en gel de los
fragmentos de \betaAPP secretados por las células, seguido de
exposición de estos fragmentos de electroforesis a una sustancia
reactiva frente a los fragmentos de \betaAPP.
La invención también proporciona un método para
la detección de un fragmento amino-terminal
secretado de proteína precursora \beta-amiloide
(ATF-\betaAPP) resultante del corte de \betaAPP
en el extremo amino-terminal del péptido
\beta-amiloide (\betaAP) en una muestra biológica, comprendiendo dicho método:
\beta-amiloide (\betaAP) en una muestra biológica, comprendiendo dicho método:
la exposición de la muestra a una sustancia que
se une específicamente a una región C-terminal en
la ATF-\betaAPP secretada; y
la detección de la unión entre la sustancia y el
fragmento secretado.
La sustancia es preferiblemente un anticuerpo
específico para la región C-terminal, incluyendo un
residuo
C-terminal que ha quedado expuesto por el corte del péptido \beta-amiloide procedente de \betaAPP, opcionalmente en el que \betaAPP es la isoforma 695, 751 ó 770.
C-terminal que ha quedado expuesto por el corte del péptido \beta-amiloide procedente de \betaAPP, opcionalmente en el que \betaAPP es la isoforma 695, 751 ó 770.
En las realizaciones preferidas, el residuo
C-terminal de ATF-\betaAPP es
metionina^{596} o leucina^{596}. El anticuerpo puede ser
específico contra un péptido que comprenda los residuos
591-596 de \betaAPP quedando expuesto el
residuo^{596}.
La invención también proporciona un método para
determinar la presencia de un fragmento secretado
amino-terminal de proteína precursora
\beta-amiloide (ATF-\betaAPP)
en una muestra biológica, el método comprende:
la exposición de la muestra a un anticuerpo que
se une específicamente a un epítopo en el extremo
carboxi-terminal de un fragmento de \betaAPP,
opcionalmente en el que \betaAPP es la isoforma 695, 751 ó 770,
con metionina en su extremo carboxi-terminal, el
anticuerpo del cual está sustancialmente libre de reactividad
cruzada con otros fragmentos de \betaAPP que tuviesen aminoácidos
más allá de la metionina; y
la detección de unión entre la sustancia y el
fragmento secretado, preferiblemente con un anticuerpo específico
contra un péptido que comprende los residuos
591-596 de \betaAPP, en el que queda expuesto el
residuo^{596}.
\newpage
En las realizaciones preferidas, el
ATF-\betaAPP se detecta en una muestra de un
paciente, o la muestra biológica es una muestra de un paciente. En
particular, la muestra de un paciente puede ser líquido
cerebroespinal.
El ATF-\betaAPP puede
detectarse en un medio de cultivo celular condicionado, o la
muestra biológica puede ser medio condicionado de una línea
celular.
La invención proporciona, además, un método in
vitro de exploración sistemática de compuestos para identificar
inhibidores de la producción del \beta-amiloide,
comprendiendo dicho método:
(a) el cultivo de células bajo condiciones que
resultan en la secreción de un fragmento soluble
amino-terminal de proteína precursora
\beta-amiloide (ATF-\betaAPP)
en el que la secuencia aminoacídica de
ATF-\betaAPP soluble se extiende desde el extremo
amino-terminal de \betaAPP hasta el extremo
amino-terminal del péptido
\beta-amiloide;
(b) la exposición de las células cultivadas a un
compuesto de prueba; y
(c) la detección de una cantidad de
ATF-\betaAPP soluble; por la cual una reducción
en la cantidad de ATF-\betaAPP soluble en
comparación con la cantidad de ATF-\betaAPP
soluble de células no expuestas al compuesto indica que el compuesto
es un inhibidor de la producción del
\beta-amiloide.
Las células son, preferiblemente, de un cultivo
de células cerebrales de feto humano.
El compuesto de prueba puede exponerse a una
concentración entre 1 nM y 1 mM. El compuesto de prueba es,
preferiblemente, una molécula pequeña o un polímero biológico.
En ciertas realizaciones, el
ATF-\betaAPP tiene un extremo
carboxi-terminal en metionina^{596}, opcionalmente
en metionina^{652} o en metionina^{671}. En otras
realizaciones, el ATF-\betaAPP tiene un extremo
carboxi-terminal en leucina^{596}, opcionalmente
en leucina^{652} o leucina^{671}.
La invención proporciona asimismo una composición
de anticuerpos que comprende moléculas de anticuerpos que reconocen
específicamente un fragmento amino-terminal de la
proteína precursora \beta-amiloide
(ATF-\betaAPP), la cual es cortada en el extremo
amino-terminal del péptido
\beta-amiloide, pero cuyas moléculas de
anticuerpos no reconocen específicamente un fragmento secretado de
\betaAPP cuya secuencia se extiende hacia el interior de la
secuencia del péptido \beta-amiloide.
El anticuerpo preferiblemente reconoce de manera
específica la región C-terminal, incluyendo un
residuo C-terminal expuesto por el corte del péptido
\beta-amiloide procedente de \betaAPP,
opcionalmente en el que \betaAPP es la isoforma 695, 751 ó
770.
Las moléculas de anticuerpos pueden comprender
inmunoglobulinas intactas o fragmentos de inmunoglobulinas,
preferiblemente el fragmento de inmunoglobulina es un fragmento
F(ab), un fragmento Fv, un fragmento VL o un fragmento
VH.
Las moléculas de anticuerpos se han generado,
preferiblemente, contra un péptido que comprende, al menos, los
residuos 591-596 de \betaAPP, siendo el
residuo^{596} el aminoácido carboxi-terminal del
péptido, más preferiblemente la composición de anticuerpos puede
comprender moléculas de anticuerpos de ratón, de conejo, de oveja, o
de cabra, ATF-\betaAPP tiene un residuo
carboxi-terminal que corresponde a metionina^{596}
o leucina^{596}.
La composición de anticuerpos puede comprender
antisueros específicos contra el péptido.
La composición de anticuerpos puede comprender
anticuerpos monoclonales.
En otras realizaciones, la composición de
anticuerpos puede comprender moléculas de anticuerpos producidos de
manera recombinante.
La invención proporciona, adicionalmente, un
hibridoma que produce moléculas de anticuerpos que reconocen
específicamente un fragmento amino-terminal de
proteína precursora \beta-amiloide
(ATF-\betaAPP), el cual ha sido cortado del
extremo amino-terminal del péptido
\beta-amiloide, pero cuyas moléculas de
anticuerpos no reconocen específicamente un fragmento secretado de
\betaAPP cuya secuencia se extiende hacia el interior de la
secuencia del péptido
\beta-amiloide.
\beta-amiloide.
ATF-\betaAPP puede tener un
residuo carboxi-terminal que corresponde a
metionina^{596} o leucina^{596}; opcionalmente metionina^{652}
o leucina^{652}; o metionina^{671} o leucina^{671}.
La invención proporciona asimismo un
fragmento soluble de proteína precursora
\beta-amiloide (\betaAPP) en forma purificada y
aislada, teniendo dicho fragmento una metionina o leucina
C-terminal que resulta del corte del péptido
\beta-amiloide procedente de \betaAPP intacto,
preferiblemente el fragmento soluble se aisla a partir de una fuente
natural o recombinante, tal como líquido cerebroespinal, medio
condicionado de células cultivadas, o similares. La secuencia
aminoacídica del fragmento puede consistir en los residuos
18-596 de la isoforma 695 de \betaAPP, en los
residuos 18-612 de la isoforma 751 de \betaAPP, o
en los residuos 18-671 de la isoforma 770 de
\betaAPP. Las composiciones del fragmento soluble serán útiles en
diversos ensayos convencionales para la detección de
ATF-\betaAPP.
La invención prevé la utilización de una
composición de anticuerpos tal como se ha definido anteriormente,
para el control del tratamiento de
\beta-amiloide.
La invención prevé asimismo la utilización de un
fragmento soluble tal como se ha definido anteriormente, para el
control del tratamiento de \beta-amiloide.
Por tanto, se proporcionan métodos y
composiciones para la detección y control de un fragmento
amino-terminal secretado de proteína precursora
\beta-amiloide (\betaAPP) en muestras
biológicas, en el que el fragmento resulta del corte en el extremo
amino-terminal, o cerca de éste, de la región del
péptido \beta-amiloide (\betaAP). En particular
para la secuencia aminoacídica en \betaAPP descrita por Kang et
al., supra, (es decir, la secuencia "normal"),
este fragmento truncado de \betaAPP que se ha secretado puede ser
reconocido por anticuerpos específicos contra péptidos que
comprenden ciertos residuos carboxi-terminales del
fragmento secretado con una metionina expuesta en su extremo
carboxi-terminal. Alternativamente, secuencias
naturales o secuencias variantes sintéticas de \betaAPP, tal como
la mutación doble que cambia
lisina^{595}-metionina^{596} por
asparagina^{595}-leucina^{596}, dada a conocer
por Mullan et al. (1992) Nature Genet.
1:345-347, puede introducir una secuencia nueva en
esta región. Una sustancia de unión específica para los residuos
C-terminales de esta secuencia \betaAPP sería un
método preferible para la detección de tales secuencias.
Los fragmentos secretados pueden comprender una
secuencia amino-terminal sustancialmente intacta de
\betaAPP que termina a cinco aminoácidos del residuo
carboxi-terminal (metionina en el caso de la
secuencia normal), el cual es adyacente a la región \betaAP en
\betaAPP intacto. En particular, los fragmentos secretados pueden
consistir esencialmente en secuencias que terminan en
metionina^{596} y lisina^{595} de la isoforma de 695
aminoácidos de \betaAPP, con la numeración correspondiente para
las otras isoformas y aminoácidos correspondientes para las formas
mutantes de \betaAPP, tal como, por ejemplo, el cambio de
LYS^{595}-MET^{596} por
ASN^{595}-LEU^{596} (la forma "sueca"). Los
métodos y composiciones de la presente invención son útiles in
vivo e in vitro para el control del tratamiento
intracelular de \betaAPP, en particular para el control del corte
de \betaAPP para liberar \betaAP intacto, el cual se ha
asociado con ciertas enfermedades, en particular con la enfermedad
de Alzheimer, incluyendo la forma familiar, y con el síndrome de
Down.
Pueden generarse anticuerpos que tengan la
especificidad requerida, cultivándolos contra haptenos peptídicos
sintéticos que incluyan los residuos C-terminales de
ATF-\betaAPP. Tales moléculas de anticuerpos
pueden prepararse por cualquier método convencional, habitualmente
utilizando un inmunógeno que comprenda los residuos
C-terminales de ATF-\betaAPP, por
ejemplo estando expuesta la metionina C-terminal en
la secuencia normal. Las enfermedades relacionadas con \betaAP,
tal como la enfermedad de Alzheimer y el síndrome de Down, pueden
diagnosticarse y hacerse un control en pacientes basándose en la
detección de ATF-\betaAPP en muestras del
paciente, tal como de CSF, suero, sangre, plasma, orina, tejido, y
similares. Pueden asociarse los niveles elevados de
ATF-\betaAPP con el inicio y la progresión de la
enfermedad, y estos niveles podrían reducirse con el progreso en el
tratamiento de la enfermedad.
Las figuras 1A y 1B ilustran las diversas
isoformas de \betaAPP normal, y las isoformas correspondientes de
ATF-\betaAPP, respectivamente.
Las figuras 2A, 2B y 2C son patrones en gel
quimioluminiscente de material derivado de medio condicionado de un
cultivo de células cerebrales de feto humano. Las pistas 1, 2, y 3
de cada gel representan, respectivamente, medio condicionado sin
tratamiento, el medio condicionado agotado por reacción con
anticuerpo que reconoce un epítopo entre los residuos peptídicos
1-16 de \beta-amiloide, y el
material eliminado por este anticuerpo. Los paneles A, B, y C
representan, respectivamente, las siguientes sondas: anticuerpo
anti-5 (el cual reconoce sitios entre el
extremo amino-terminal de \betaAPP y la
región peptídica \beta-amiloide), anticuerpo 92
(el cual se generó contra un péptido sintético acabado en la
metionina C-terminal expuesta por el corte de
\betaAP procedente de \betaAPP), y anticuerpo 10D5 (un
anticuerpo monoclonal que reconoce un epítopo de \betaAP entre los
residuos 1 y 16).
La figura 3 es un patrón en gel
quimioluminiscente obtenido del examen de CSF lumbar humano. Se
sondeó el CSF con anticuerpo 92 solo (pista 1), o
pre-incubado con diversos péptidos que
representaban variaciones del extremo C-terminal de
ATF-\betaAPP. Se observó competición significativa
(reducción en la unión) con los péptidos que terminaban en la
metionina C-terminal (pistas 3, 4, 6, y 7). Los
péptidos eran los siguientes: Pista 1, no se añadió péptido
competidor; Pista 2, GSGLTNIKTEEISEVK; Pista 3, YSGLTNIKTEEISEVKM;
Pista 4, ISEVKM; Pista 5, EISEVKMD; Pista 6, CISEVKM; Pista 7,
YISEVKM. PM = marcadores de peso molecular (indicado en
kilodaltons).
La figura 4 es una autorradiografía que
representa los patrones en gel de electroforesis obtenidos por
inmunoprecipitación de medio condicionado de varias líneas
celulares. El material secretado por cultivos de células cerebrales
de feto humano e inmunoprecipitadas con anticuerpo 92 (pista 11
donde indica la flecha) es, aparentemente, menor que el material
precipitado por anticuerpo 6C6 (pista 10 donde indica la flecha).
El anticuerpo 6C6 reconoce un epítopo entre los residuos 1 y 16 de
\betaAP.
La figura 5 es un autorradiografía que representa
patrones en gel de electroforesis obtenidos por inmunoprecipitación
de medio condicionado de líneas de células 293 humanas
transfectadas con cADN que codifica para \betaAPP normal y sueco.
La cantidad de material AFT-\betaAPP secretada
por las células suecas transfectadas (pistas 11 y 12) fue
cualitativamente mayor que la producida por transfectantes
\betaAPP normales (pistas 9 y 10).
La presente invención resulta de la
identificación de un nuevo fragmento secretado de proteína
precursora
\beta-amiloide (\betaAPP) que resulta del corte de una región peptídica \beta-amiloide (\betaAP) intacta de la proteína precursora. Los nuevos fragmentos secretados comprenden la parte amino-terminal de \betaAPP que resta después de tal corte, la cual se denominará en lo sucesivo en esta memoria, fragmento amino-terminal de \betaAPP (ATF-\betaAPP). Se cree que ATF-\betaAPP es el producto de una ruta alternativa de tratamiento secretorio para \betaAPP, ruta que está presente incluso en células normales (no enfermas). Sin embargo, también se cree que la ruta alternativa de secreción puede ser responsable de un hecho clave en la producción de \betaAP en células enfermas de pacientes, y que la producción anormal de ATF-\betaAPP puede estar involucrada en enfermedades relacionadas con las placas de \betaAP, en particular con la enfermedad de Alzheimer y con el síndrome de Down. De esta manera, la presente invención proporciona métodos y composiciones para el control del tratamiento celular de \betaAPP basados en la detección y medida de ATF-\betaAPP en muestras biológicas.
\beta-amiloide (\betaAPP) que resulta del corte de una región peptídica \beta-amiloide (\betaAP) intacta de la proteína precursora. Los nuevos fragmentos secretados comprenden la parte amino-terminal de \betaAPP que resta después de tal corte, la cual se denominará en lo sucesivo en esta memoria, fragmento amino-terminal de \betaAPP (ATF-\betaAPP). Se cree que ATF-\betaAPP es el producto de una ruta alternativa de tratamiento secretorio para \betaAPP, ruta que está presente incluso en células normales (no enfermas). Sin embargo, también se cree que la ruta alternativa de secreción puede ser responsable de un hecho clave en la producción de \betaAP en células enfermas de pacientes, y que la producción anormal de ATF-\betaAPP puede estar involucrada en enfermedades relacionadas con las placas de \betaAP, en particular con la enfermedad de Alzheimer y con el síndrome de Down. De esta manera, la presente invención proporciona métodos y composiciones para el control del tratamiento celular de \betaAPP basados en la detección y medida de ATF-\betaAPP en muestras biológicas.
ATF-\betaAPP es identificado y
reconocido por la unión específica a anticuerpos generados contra
péptidos que comprenden ciertos residuos de \betaAPP
inmediatamente adyacentes a la región \betaAP y que incluyen, en
\betaAPP normal, la metionina carboxi-terminal
(numerada como metionina^{596} en la isoforma 695, como se
describe posteriormente). Los péptidos incluirán, habitualmente, al
menos cinco residuos contiguos hasta, e incluyendo, el
residuo^{596}, y se describen a continuación métodos específicos
para producir tales anticuerpos.
Con referencia a las figuras 1A y 1B, se
encuentra \betaAPP en tres isoformas, que comprenden,
respectivamente, 695, 751, y 770 aminoácidos. La isoforma 695 es la
más común en células neuronales, y las isoformas 751 y 770 resultan
de inserciones en el residuo 289 de la isoforma 695 (la numeración
de la isoforma 695 se hará de acuerdo con Kang et al. (1987)
Nature 325:733-736).
ATF-\betaAPP resulta, aparentemente, del corte
proteolítico de las diversas isoformas de \betaAPP a cinco
residuos o menos, en el lado amino-terminal, del
extremo amino-terminal de la región del péptido
\beta-amiloide (\betaAP), localizándose entre
los residuos 596 y 597 de la isoforma 695. Tal corte resulta en la
exposición de un residuo C-terminal, el cual
habitualmente será metionina^{596}, lisina^{595} o
leucina^{596}, siendo más habitualmente metionina^{596}, los
cuales se muestran como MET^{596} y LIS^{595} en la figura 1B.
Evidentemente se apreciará, que los residuos
C-terminales tendrían una numeración diferente
cuando ATF-\betaAPP se deriva de una isoforma
\betaAPP diferente. En particular, la metionina
C-terminal sería MET^{652} y MET^{671} y la
lisina C-terminal sería LIS^{651} y LIS^{670} en
las isoformas 751 y 770 de \betaAPP, respectivamente. En su
utilización en este documento y en las reivindicaciones,
metionina^{596}, lisina^{595}, y leucina^{596} se referirán,
generalmente, a los residuos correspondientes de todas las otras
isoformas o variantes de \betaAPP. En la actualidad, se cree que
el residuo N-terminal de
ATF-\betaAPP es LEU^{18} en todas las isoformas
(basado en el tratamiento del extremo amino-terminal
de \betaAPP en formas secretadas que son cortadas dentro de la
región \betaAP).
De acuerdo con la presente invención,
ATF-\betaAPP puede ser detectado y/o medido en
una diversidad de muestras biológicas, incluyendo muestras in
vitro, tal como medio condicionado de cultivos celulares, y en
muestras in vivo de pacientes, típicamente de CSF, sangre,
suero, plasma, orina, tejido, y similares. Puede conseguirse la
detección y medida por cualquier técnica capaz de distinguir
ATF-\betaAPP de otros fragmentos de
\beta-APP que puedan encontrarse en la muestra.
Convenientemente, pueden utilizarse técnicas de detección
inmunológica que utilicen anticuerpos, fragmentos de éstos, u otras
sustancias equivalentes de unión específica, las cuales se unan a
un residuo C-terminal de
ATF-\betaAPP expuesto al cortar la región
\betaAP, por ejemplo, a metionina^{596}, leucina^{596} o
lisina^{595}. Se ha descubierto que tales anticuerpos específicos
de extremos C-terminales son capaces de discriminar
entre ATF-\betaAPP y fragmentos de \betaAPP
relacionados. Alternativamente, las técnicas de detección
inmunológica pueden basarse en ATF-\betaAPP
aislado y purificado utilizando técnicas convencionales.
Posteriormente se describe la preparación de anticuerpos
específicos de residuos C-terminales y de
ATF-\betaAPP purificado y aislado. Entre las
técnicas de detección particularmente adecuadas se incluyen ELISA,
transferencia de Western, radioinmunoensayo, y similares.
También pueden utilizarse otras técnicas para la
detección de ATF-\betaAPP que no requieran la
utilización de anticuerpos específicos de
ATF-\betaAPP y/o de antígeno competidor. Por
ejemplo, puede utilizarse la electroforesis bidimensional en gel
para separar fragmentos solubles de \betaAP muy relacionados.
Pueden utilizarse entonces anticuerpos de reactividad cruzada con
muchos o todos los fragmentos con el fin de marcar los geles,
identificando la presencia de ATF-\betaAPP a
partir de su posición exacta en el gel. Otras técnicas para la
detección de ATF-\betaAPP también están dentro de
las técnicas conocidas. Por ejemplo, las especies de \betaAPP
secretadas que contienen la región amino-terminal
de \betaAP pueden eliminarse inmunológicamente de una muestra
para aislar ATF-\betaAPP (ver la figura 2A, pista
2 y la figura 5, pistas 11 y 12), el cual puede ser detectado
entonces por cualquiera de varios métodos, como se ha comentado
anteriormente.
Pueden prepararse anticuerpos específicos para
ATT-\betaAPP contra un antígeno o hapteno
adecuado que comprenda la secuencia C-terminal de
ATF-\betaAPP incluyendo el residuo de metionina.
Convenientemente, pueden prepararse péptidos sintéticos mediante
técnicas convencionales de fase sólida, acoplados a un inmunógeno
adecuado, y utilizarse para preparar antisueros o anticuerpos
monoclonales mediante técnicas convencionales. Un péptido sintético
adecuado consiste en seis residuos de ATF-\betaAPP
(ISEVKM) situados inmediatamente adyacentes en el lado
amino-terminal de \betaAP, y que pueden acoplarse
a un inmunógeno y utilizarse para preparar anticuerpos específicos,
como se describe en detalle en la sección experimental. Otros
haptenos peptídicos adecuados comprenderán, habitualmente, al menos
cinco residuos contiguos dentro de \betaAPP inmediatamente
adyacentes en el lado amino-terminal de \betaAP,
y pueden incluir más de seis residuos (aunque se descubrió que un
péptido que incluía dieciséis residuos
amino-terminales producía antisuero que era menos
específico). Los 25 residuos carboxi-terminales
del ATF-\betaAPP normal son los siguientes
(utilizando las denominaciones de una letra de los
aminoácidos).
DRGLT | TRPGSGLTNI | KTEEISEVKM | |
576 | 586 | 596 |
Pueden producirse haptenos polipeptídicos
sintéticos mediante la bien conocida técnica de síntesis en fase
sólida Merrifield, en la que los aminoácidos se añaden
secuencialmente a una cadena en crecimiento (Merrifield (1963)
J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156). Las
secuencias aminoacídicas pueden basarse en la secuencia de
ATF-\betaAPP presentada anteriormente, o pueden
utilizar secuencias de origen natural o secuencias mutantes de la
ingeniería. Por ejemplo, el mutante sueco tendría una sustitución
de asparagina^{595}-leucina^{596} por
lisina^{595}-metionina^{596}, y otra
sustitución podría ser solamente la leucina^{596} por
metionina^{596}.
Una vez se ha obtenido suficiente cantidad de
hapteno polipeptídico, puede conjugarse con un portador
inmunogénico adecuado, tal como albúmina de suero, hemocianina de
lapa californiana, u otros portadores proteicos adecuados, como se
describe, en general, en Hudson y Hay, Practical Immunology,
Blackwell Scientific Publications, Oxford, Capítulo 1.3, 1980.
Una vez se ha obtenido una cantidad suficiente
del inmunógeno, pueden producirse anticuerpos específicos del
residuo C-terminal, expuesto tras el corte de
\betaAP desde ATF-\betaAPP, mediante técnicas
in vitro o in vivo. Las técnicas in vitro
involucran la exposición de linfócitos a los inmunógenos, mientras
que las técnicas in vivo requieren la inyección de los
inmunógenos en un huésped adecuado de vertebrado. Los huéspedes
adecuados de vertebrado son no humanos, entre ellos, ratones, ratas,
conejos, ovejas, cabras, y similares. Los inmunógenos se inyectan
en el animal de acuerdo con un programa predeterminado, y
periódicamente se extrae sangre a los animales, presentando las
extracciones sucesivas, títulos y especificidades mejorados. Las
inyecciones pueden ser intramusculares, intraperitoneales,
subcutáneas, o similares, y se utilizará un adyuvante, tal como
adyuvante incompleto de Freund.
Si se desea, pueden obtenerse anticuerpos
monoclonales mediante la preparación de líneas celulares
inmortalizadas capaces de producir anticuerpos con la deseada
especificidad. Tales líneas celulares inmortalizadas pueden ser
producidas de una variedad de maneras. Convenientemente, se
hiperinmuniza con el inmunógeno deseado un vertebrado pequeño, tal
como un ratón, mediante el método que se acaba de describir.
Entonces se mata el vertebrado, habitualmente varios días después
de la inmunización final, se extraen las células de bazo, y éstas
se inmortalizan. El modo de inmortalización no es crítico. En la
actualidad, la técnica más común es la fusión con una pareja de
célula de mieloma, como primero describieron Kohler y Milstein
(1975) Nature 256:495-497. Otras técnicas,
incluyendo la transformación con EBV, transformación con ADN
desnudo, por ejemplo, con oncogenes, retrovirus, etc., o cualquier
otro método que proporcione un mantenimiento estable de la línea
celular y producción de anticuerpos monoclonales. Se describen
técnicas específicas para la preparación de anticuerpos monoclonales
en Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lane, editores,
Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.
Además de anticuerpos monoclonales y policlonales
(antisueros), las técnicas de detección de la presente invención
también podrán utilizar fragmentos de anticuerpos, tal como
F(ab), Fv, V_{L}, V_{H}, y otros fragmentos. También
será posible utilizar anticuerpos producidos de manera recombinante
(inmunoglobulinas) y variaciones de los mismos, como está bien
descrito en la actualidad en la literatura de patentes y científica.
Ver, por ejemplo, las patentes EP 0123527, EP 0171496, EP 0173494,
WO 8601583, EP 0184187, WO 8702671 y JP 62100291. También sería
posible preparar otras proteínas recombinantes que imitarían la
especificidad de unión de anticuerpos preparados como se acaba de
describir.
La presente invención comprende, adicionalmente,
ATF-\betaAPP aislado y purificado, habitualmente
obtenido en forma sustancialmente pura. "Sustancialmente pura"
significa, al menos, aproximadamente 50% p/p (peso/peso), o de
mayor pureza sustancialmente libre de proteínas y contaminantes que
interfieran. Preferiblemente, se aislará o sintetizará el
ATF-\betaAPP a una pureza mayor que el 50% p/p,
preferentemente al 80% p/p o mayor. El
ATF-\betaAPP puede ser purificado a partir de una
fuente natural mediante técnicas convencionales de purificación de
proteínas, purificando composiciones homogéneas a una pureza de, al
menos, aproximadamente 50% p/p, mediante técnicas convencionales de
separación por inmunoafinidad. Entre los materiales de inicio de
origen natural que son adecuados se incluyen: medio condicionado de
líneas celulares productoras de ATF-\betaAPP, tal
como cultivos de células cerebrales de feto, y similares.
Alternativamente, puede aislarse ATF-\betaAPP a
partir de muestras biológicas obtenidas de un huésped humano, tal
como a partir de CSF, suero, y similares. Se describen técnicas
adecuadas de purificación de proteínas en Methods in
Enzymology, Volumen 182, Deutcher, editor, Academic Press, Inc.,
San Diego, 1990, la descripción de las cuales se incorpora en la
presente memoria de patente como referencia.
Pueden utilizarse anticuerpos y
ATF-\betaAPP purificados, preparados como se ha
descrito anteriormente, en diversas técnicas inmunológicas
convencionales para la detección de ATF-\betaAPP
en muestras biológicas, en particular muestras in vivo de
pacientes para el control de enfermedades relacionadas con
\beta-amiloides, y en medios condicionados de
cultivos celulares para el control del tratamiento intracelular de
\betaAPP. Entre las técnicas inmunológicas adecuadas se incluyen
los inmunoensayos, tal como ELISA, análisis de Western Blot, y
similares. Se describen numerosas técnicas de detección
inmunológica específica en Harlow y Lane, obra citada.
Puede utilizarse la detección in vivo de
ATF-\betaAPP, en muestras de pacientes para el
diagnóstico y control de la enfermedad de Alzheimer y otras
enfermedades relacionadas con la deposición de placas
\beta-amiloides, tal como el síndrome de Down.
Entre las muestras adecuadas de pacientes se incluyen: CSF, sangre,
suero, plasma, orina, tejido, y similares. La presencia de la
enfermedad se asociará, generalmente, con niveles elevados de
ATF-\betaAPP, o proporciones elevadas de
cantidades de ATF-\betaAPP respecto a cantidades
de otros fragmentos de \betaAPP secretado (es decir, de aquellos
fragmentos de \betaAPP cortados dentro de la región \betaAP, o
cortados en posición carboxi-terminal respecto a
dicha región) en comparación con los mismos valores en individuos
normales, es decir, individuos que no sufren la enfermedad de
Alzheimer u otras enfermedades relacionadas con
\beta-amiloides. La cantidad de
ATF-\betaAPP puede compararse con la cantidad de
otras especies de APP, sea de una isoforma (por ejemplo, 695, 751 ó
770), y/o de una forma definida adicionalmente por su extremo
carboxi-terminal (por ejemplo, formas cortadas en
el sitio descrito por Esch et al, o
carboxi-terminales respecto a éste). Además de los
procedimientos iniciales de diagnóstico, puede efectuarse un
control de los niveles de ATF-\betaAPP con el fin
de seguir el progreso de la enfermedad, y potencialmente hacer un
control de la eficacia del tratamiento. Sería de esperar que los
niveles de ATF-\betaAPP decrecerían con un
régimen eficaz de tratamiento.
Puede efectuarse el control in vitro de
los niveles de ATF-\betaAPP en medio suplementado
procedente de un cultivo celular adecuado para la exploración
sistemática de fármacos. Mediante el cultivo de células en
condiciones que resultan en la secreción de
ATF-\betaAPP al medio de cultivo, y la exposición
de las células a compuestos de prueba, puede observarse el efecto de
dichos compuestos de prueba sobre la secreción de
ATF-\betaAPP. Sería de esperar que los compuestos
de prueba que son capaces de reducir la cantidad de
ATF-\betaAPP serían candidatos para las pruebas
como inhibidores de formación de \betaAP. Entre las líneas
celulares adecuadas se incluyen líneas celulares humanas y
animales, tal como la línea celular 293 de riñón humano, las líneas
celulares de neuroglioma humano, células HeLa humanas, células
endoteliales primarias (por ejemplo, células HUVEC), fibroblastos
primarios humanos o linfoblastos (incluyendo células endógenas
derivadas de pacientes con mutaciones en \betaAPP), células
primarias cerebrales mixtas humanas (incluyendo neuronas,
astrocitos y neurogliales), células ováricas de hámster chino
(CHO), y similares. Las líneas celulares que incrementan
preferentemente los niveles o proporciones de
ATF-\betaAPP serían especialmente útiles en los
métodos de la invención.
De manera similar, el control in vitro de
ATF-\betaAPP en modelos animales de la enfermedad
de Alzheimer, tal como el modelo de ratón dado a conocer en la
patente WO 91/19810, también puede ser utilizado para explorar la
eficacia terapéutica de compuestos de prueba (habitualmente para la
exploración sistemática de compuestos ya previamente identificados
mediante una exploración sistemática in vitro). Se
administran el compuesto, o los compuestos, de prueba al animal, y
se realizan observaciones del nivel de
ATF-\betaAPP, o de la proporción de
ATF-\betaAPP frente a otros fragmentos de
\betaAPP. Aquellos compuestos que reducen el nivel de
ATF-\betaAPP, o reducen la proporción de
ATF-\betaAPP frente a otros fragmentos de
\betaAPP, se considerarán candidatos para evaluaciones
posteriores.
Los compuestos de prueba pueden ser cualquier
molécula, compuesto, u otra sustancia que pueda añadirse a un
cultivo celular sin interferir sustancialmente en la viabilidad
celular. Pueden ser compuestos de prueba adecuados, moléculas
pequeñas, polímeros biológicos, tal como polipéptidos,
polisacáridos, polinucleótidos, y similares. Los compuestos de
prueba se administrarán al medio de cultivo, típicamente a una
concentración en el rango entre, aproximadamente, 1 nM y 1 mM,
habitualmente entre 10 \muM y 1 mM.
Los compuestos de prueba que son capaces de
inhibir la secreción de ATF-\betaAPP se
consideran candidatos para determinaciones posteriores de la
capacidad de bloqueo de la producción de
\beta-amiloides en células patogénicas. La
inhibición de la secreción indica que el corte de \betaAPP en el
extremo amino-terminal de \betaAP probablemente ha
sido, al menos en parte, bloqueado, reduciendo la cantidad
disponible para la conversión a péptido
\beta-amiloide de un intermediario en el
tratamiento.
La presente invención considera, adicionalmente,
métodos para la inhibición de la producción de
\beta-amiloide en células, en el que el método
incluye la administración a las células de compuestos seleccionados
mediante el método anteriormente descrito. Los compuestos pueden
añadirse al cultivo celular con el fin de inhibir la producción de
\betaAP por parte de las células cultivadas. Los compuestos
también pueden administrar a un paciente con el fin de inhibir la
deposición de placa amiloide asociada con la enfermedad de
Alzheimer y con otras enfermedades relacionadas con \betaAP.
La presente invención considera, adicionalmente,
composiciones farmacéuticas que incorporan un compuesto
seleccionado por el método anteriormente descrito y su inclusión en
un portador farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones
farmacéuticas deberían contener una cantidad terapéutica o
profiláctica de, al menos, un compuesto identificado por el método
de la presente invención. El portador farmacéuticamente aceptable
puede ser cualquier sustancia compatible no tóxica adecuada para la
entrega de compuestos a un huésped de interés. Pueden utilizarse
como portador, agua estéril, alcohol, grasas, ceras, y sólidos
inertes. También pueden incorporarse en las composiciones
farmacéuticas, adyuvantes farmacéuticamente aceptables, agentes
tamponadores, agentes dispersantes, y similares. La preparación de
condiciones farmacéuticas que incorporan agentes activos se
encuentra bien descrita en la literatura médica y científica. Ver,
por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack
Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 16ª edición, 1982.
Las composiciones farmacéuticas que se acaban de
describir son adecuadas para la administración sistémica al
huésped, incluyendo la administración parenteral, tópica, y oral.
Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse
parenteralmente, es decir, subcutáneamente, intramuscularmente, o
intravenosamente. De esta manera, la presente invención considera
composiciones para la administración a un huésped, en la que las
composiciones comprenden una solución farmacéuticamente aceptable
del compuesto identificado en un portador aceptable, como se ha
descrito anteriormente.
Con frecuencia, será deseable o necesario
introducir las composiciones farmacéuticas directa o indirectamente
en el cerebro. Las técnicas directas habitualmente involucran la
introducción de un catéter para la administración de fármacos en el
sistema ventricular del huésped con el fin de rodear la barrera
hematoencefálica. Las técnicas indirectas, las cuales son
generalmente preferidas, involucran la formulación de las
composiciones con el fin de proporcionar capacidad de bioactivación
al fármaco mediante la conversión de los fármacos hidrofílicos en
fármacos liposolubles. La bioactivación se consigue, generalmente,
mediante el bloqueo de los grupos hidroxilo, carboxilo, y amina
primaria presentes en el fármaco, haciendo que el fármaco sea más
liposoluble y fácil de transportar a través de la barrera
hematoencefálica. Alternativamente, puede potenciarse la entrega de
fármacos hidrofílicos mediante la infusión
intra-arterial de soluciones hipertónicas, las
cuales pueden abrir transitoriamente la barrera
hematoencefálica.
La concentración del compuesto en el portador
farmacéutico puede variar ampliamente, en concreto entre menos de,
aproximadamente, 0,1% en peso de composición farmacéutica, hasta
20% en peso aproximadamente, o más. Las composiciones farmacéuticas
típicas para inyección intramuscular se fabricarían para contener,
por ejemplo, uno a cuatro mililitros de agua estéril tamponada, y
un \mugramo a un miligramo del compuesto identificado mediante el
método de la presente invención. La composición típica para la
infusión intravenosa podría fabricarse para contener 100 a 500 ml de
solución estéril de Ringer, y aproximadamente, 1 a 100 mg del
compuesto.
Las composiciones farmacéuticas pueden
administrarse para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de
enfermedades relacionadas con la deposición de \betaAP, tal como
la enfermedad de Alzheimer y el síndrome de Down. En las
aplicaciones terapéuticas, se administran las composiciones
farmacéuticas a un huésped que ya sufre la enfermedad. Las
composiciones farmacéuticas se administrarán en una cantidad
suficiente para inhibir la deposición adicional de placa \betaAP.
Una cantidad adecuada para conseguir esto se define como una
"dosis terapéuticamente efectiva". Tal dosis efectiva
dependerá de la extensión de la enfermedad, del tamaño del huésped,
y similares, pero generalmente oscilará entre, aproximadamente,
0,01 \mug y 10 mg del compuesto por kilogramo de peso corporal
del huésped, utilizándose más habitualmente dosis entre 0,1 \mug y
1 mg/kg.
Para aplicaciones profilácticas, se administran
las composiciones farmacéuticas a un huésped susceptible de la
enfermedad asociada a \betaAP, pero que no sufre todavía de tal
enfermedad. Tales huéspedes pueden identificarse mediante
exploración genética y análisis clínico, como se describe en la
literatura médica. Las composiciones farmacéuticas serán capaces de
inhibir o prevenir la deposición de la placa \betaAP en una etapa
muy temprana, preferiblemente serán capaces de prevención, incluso
en las etapas iniciales de la enfermedad
\beta-amiloide. La cantidad del compuesto
requerida para tal tratamiento profiláctico, denominada dosis
profilácticamente efectiva, es generalmente la misma que la
descrita anteriormente para el tratamiento terapéutico.
Los siguientes ejemplos se ofrecen como
ilustración, y no son limitativos.
Se cultivó y cribó anticuerpo monoclonal 6C6 de
la misma manera que el anticuerpo 10D5 (Hyman et al. (1992)
J. Neuropath. Exp. Neurol. 51:76) utilizando un péptido
sintético que contenía los residuos 1-28 de
\betaAP conjugados con albúmina de suero de conejo como
inmunógeno. Ambos, 10D5 y 6C6, reconocen un epítopo en los primeros
16 aminoácidos de la secuencia de \betaAP. 6C6 fue más eficiente
que 10D5 en la inmunoprecipitación y se utilizó como anticuerpo de
captura. Para preparar resina 6C6, se lavaron 4 mililitros de
Affigel®10 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) con
agua fría y se combinaron con 3 mililitros de 6C6 (12,5 mg/ml en
PBS (KCl 2,7 mM, KH_{2}PO_{4} 1,5 mM, Na_{2}HPO_{4} 8,1 mM,
NaCl 137 mM, pH 7,5) NaCl 0,5 M. El acoplamiento se realizó durante
la noche a 4ºC, bajo agitación suave. Se añadieron, entonces, 400
\mul de Tris 1 M, pH 8,0, y se continuó la agitación durante 40
minutos. A continuación, se lavó la resina exhaustivamente con TTBS
(NaCl 137 mM, KCl 5 mM, Tris 25 mM, Tween® 20 al 0,5%, pH 7,5)
previamente a su utilización. También se describe el anticuerpo 7H5
en Hyman et al. (1992), supra.
Se cultivaron anticuerpos (denominados anticuerpo
92) contra un péptido sintético que incluía los residuos
591-596 de \betaAPP (según numeración de Kang
et al. (1987), supra). Se conjugó el péptido
(N-acetil-CISEVKM) con albúmina de
suero de conejo, la cual había sido activada con éster de
sulfo-maleimido
benzoil-N-hidroxisuccinimida para
formar un inmunógeno. Se cultivaron antisueros contra el inmunógeno
en conejos utilizando metodologías estándar. Durante cada
inoculación, los conejos recibieron 5 \mug de inmunógeno en
inyecciones subcutáneas de 0,1 ml en aproximadamente 10 sitios
(50 \mug/inoculación). Se acopló el mismo péptido con gel
Sulfo-link™ (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) para
la purificación por afinidad de anticuerpos de la fracción IgG.
A continuación, se proporciona una descripción
más detallada de la preparación de anticuerpo 92. Se incubó
albúmina de suero de conejo (12,3 mg) con 13 mg de éster de
sulfo-maleimido
benzoil-N-hidroxisuccinimida en 1,25
ml de KH_{2}PO_{4} 0,05 M, pH 7,0, durante 20 minutos a 0ºC. A
continuación e inmediatamente, se sometió la mezcla a filtración en
gel en una columna 1 x 75 cm de Sephadex™ G-10
equilibrada con el tampón fosfato. Se agrupó el eluído de
proteína en el volumen excluído e inmediatamente se combinó con 30
mg de péptido N-acetil-CISEVKM, el
cual se había sintetizado mediante metodologías estándar automáticas
en fase sólida. La reacción de acoplamiento (volumen 20 ml) se dejó
que se produjese durante la noche, y después se envió a un
laboratorio privado para la generación de anticuerpos. El protocolo
de inyección fue emulsionar el antígeno en un volumen igual de
adyuvante completo de Freund, e inyectar subcutáneamente un total
de 50 \mug de antígeno en alícuotas de 0,1 ml en,
aproximadamente, 10 sitios. A partir de entonces, cada 3 semanas se
proporcionaba una inyección de refuerzo utilizando un protocolo
idéntico excepto que se utilizaba adyuvante incompleto de Freund
como emulsificante. Se extrajo sangre de los conejos una semana
después de cada inyección y se midió el título sérico mediante
reacción contra el péptido en una ELISA. Se purificó el IgG del
suero de reacción positiva por precipitación con
(NH_{4})_{2}SO_{4} al 50%, (2 veces) y se dializó
frente a PBS. Se conjugó el péptido
N-acetil-CISEVKM con gel
Sulfo-link™ (Pierce Chemical Co., Rockford, IL)
siguiendo las recomendaciones del fabricante, para generar una
resina de afinidad para purificar los anticuerpos específicos para
el péptido. Se introdujo la fracción de IgG en la columna y, tras
lavar el material no unido específicamente utilizando PBS, se
eluyeron los anticuerpos con glicina 0,1 M, pH 2,5 NaCl 0,5 M, y a
continuación, se dializaron frente a PBS antes de congelarlos.
Se obtuvieron especímenes de tejido neural de
cadáveres fetales de 12-14 semanas de edad. Se
enjuagaron dos veces muestras de córtex cerebral con solución
salina equilibrada de Hank (HBSS). Se introdujo tejido cortical
(2-3 gramos) en 10 ml de HBSS frío al que se le
había añadido 1 mg de ADNasa (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO
D3427). Se filtró la suspensión triturada a través de filtros Nitex
de nilón de 210 \mum primero, y de 130 \mum después, como
describen Pulliam et al. (1984) J. Virol. Met.
9:301.
Se recolectaron las células por centrifugación y
se resuspendieron en medio neuronal (MEM suplementado con suero de
feto bovino al 10%, glucosa al 1%, piruvato sódico 1 mM, glutamina
1 mM, KCl 20 mM). Se sembraron placas de 100 mm recubiertas con
polietilenimina con 1,5 x 10^{7} células en 8 ml de medio
neuronal. Se cambió el medio dos veces por semana. Todos los
cultivos en este estudio se cultivaron in vitro durante, al
menos, 30 días. Para condiciones de crecimiento libre de suero, los
cultivos se cambiaron a un medio definido (DMEM suplementado con 5
\mug/ml de insulina bovina; 0,1 mg/ml de transferrina humana; 0,1
mg/ml de BSA fracción V; 0,062 \mug/ml de progesterona, 1,6
\mug/ml de putrescina; 0,039 \mug/ml de selenita sódica, 0,042
\mug/ml de tiroxina; y 0,033 \mug/ml de
triyodo-L-tironina), y tras 3 días
se recogió el sobrenadante.
Se recogió el medio condicionado de las células
(10 ml). Se añadió EDTA (5 mM), leupeptina (10 \mug/ml), y
Tris-HCl (20 mM, pH 8,0) a cada una de las muestras
de 10 ml a la concentración final indicada, y se centrifugó la
muestra a 30.000 x g durante 20 minutos a 4ºC. Se dividió el
sobrenadante resultante en dos alícuotas iguales, se añadió resina
6C6 a una de las alícuotas (200 \mul de resina con unión de
aproximadamente 5 mg/ml de 6C6). Se mezclaron suavemente ambas
alícuotas durante 6 horas a 4ºC, se peletizó la resina, y se añadió
una segunda alícuota de 200 \mul de resina. Se mezclaron
adicionalmente las muestras durante la noche a 4ºC. Se lavaron las
resinas agrupadas con TTBS dos veces, y a continuación se
extrajeron brevemente con alícuotas de 1 ml de glicina 0,1 M, NaCl
0,1 M, pH 2,8.
El material extraído de la resina, el medio
agotado por ésta, y el medio de inicio se hicieron precipitar
individualmente con TCA (ácido tricloroacético) al 10% a 0ºC
durante una hora, se lavaron los pellets con acetona y, a
continuación, se resuspendieron en 150 \mul de tampón de muestras
SDS-PAGE bajo condiciones reductoras, y se
hirvieron. Cada muestra (25 \mul) se sometió a
SDS-PAGE utilizando geles de tricina al
10-20% (Novex). Se transfirieron las proteínas a
membranas ProBlot™ de PVDF durante la noche a 40V. La visualización
de las proteínas inmunoreactivas se realizó utilizando el sistema
de quimioluminiscencia TROPIX™, siguiendo las indicaciones del
fabricante para el sustrato AMPPD. Las concentraciones de
anticuerpos primarios utilizados fueron: anti-5,
0,1 \mug/ml; 92, 2 \mug/ml; 10D5, 2 \mug/ml.
Se modificaron células 293 humanas (ATCC nº
CRL-1573) para sobreexpresar APP (Selkoe et
al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7341). Se
cultivaron las células en placas de 10 cm hasta subconfluencia
previamente a su utilización. El marcaje metabólico e
inmunoprecipitación se llevaron a cabo, esencialmente, como se
había descrito previamente en Oltersdorf et al. (1989)
Nature 341:144 y (1990) J. Biol. Chem. 265:4492.
Brevemente, el marcaje se llevó a cabo en placas de 10 cm. Se
lavaron las células en medio libre de metionina, se incubaron
durante 20 minutos en 2 ml de medio libre de metionina suplementado
con 0,5 mCi de metionina-^{35}S, se lavaron en
medio completo, y se captaron durante 2 horas en 3 ml de medio
completo. Se recogió el medio condicionado y se clarificó a 3.000 x
g durante 10 minutos seguido de preabsorción con proteína A
Sepharose® (Pharmacia, Piscataway, NJ). La inmunoprecipitación se
llevó a cabo con 1,5 mg de proteína A Sepharose® por muestra. Se
utilizaron 2 \mug de anticuerpo anti-5 por
muestra; y 10 \mug de 6C6, 7H5 y 92 por muestra. Se utilizaron 5
mg de IgG anti-ratón de conejo con 6C6 y 7H5, y
también en las muestras de control. Se lavaron cuatro veces los
precipitados con TBS (NaCl 137 mM, KCl 5 mM, Tris 25 mM, pH 7,5),
NP40 al 0,1%, EDTA 5 mM, PMSF 1 mM, 10 \mug/ml de leupeptina. Se
llevó a cabo SDS-PAGE en geles Laemmli al 5%.
Se transfectaron transitoriamente células 293 de
riñón humano en pocillos duplicados en una bandeja de 6 pocillos,
con vectores plásmido que expresaban \betaAPP humana normal o la
variante mutación sueca de \betaAPP mediante transfección mediada
por DOTAP siguiendo indicaciones del fabricante (Boehringer
Manheim). 40 horas después, las células se introdujeron en medio DME
libre de metionina que contenía suero de feto de vaca al 10%, y 20
minutos después se marcaron durante 35 minutos con 200 \muCi/ml
de metionina-^{35}S. Entonces, las células se
re-introdujeron en medio DME normal que contenía
suero de feto de vaca al 10%, y se incubaron durante 2,5 horas más.
Se recogió el medio de las células, y se centrifugó a 1.000 x g
durante 15 minutos para eliminar todas las células. Se dividió el
sobrenadante en dos, y una mitad se inmunoprecipitó con anticuerpo
anti-5 utilizando métodos estándar. La otra mitad
se incubó durante la noche con anticuerpo 6C6 acoplado con agarosa,
y el material unido a la agarosa 6C6 se separó por centrifugación.
El material restante se inmunoprecipitó entonces con anticuerpo
anti-5. El total de inmunoprecipitados
anti-5 (\alpha5+), precipitados unidos a 6C6
(6C6+), e inmunoprecipitados no reactivos frente a 6C6 y reactivos
frente a anti-5 (6C6-, \alpha5+) se corrieron en
un gel Laemmli al 5%, y las proteínas inmunoreactivas se
visualizaron por autorradiografía.
La muestra 1 es el medio condicionado procedente
de un cultivo; muestra 2 es el medio agotado de \betaAPP reactivo
frente a 6C6; y muestra 3 es el material extraído de la resina 6C6.
Se sondeó el panel A con anticuerpos anti-5,
específicos contra la secuencia 444-592 de
\betaAPP (Oltersdorf et al. (1989) supra, y (1990)
supra). El panel B se sondeó con anticuerpo 92, descrito en
la sección de Materiales y métodos. El panel C se sondeó con 10D5,
un anticuerpo monoclonal que reconoce un epítopo en los residuos
1-16 de \betaAP, como se describe en la sección de
Materiales y métodos. Las bandas de menor peso molecular observadas
en C2 y C3, no se observaron en C1, y se derivan de la resina 6C6 y
son reconocidas por conjugado de IgG anti-ratón de
cabra-fosfatasa alcalina que es independiente de un
anticuerpo primario (datos no mostrados).
Un mililitro de un espécimen de CSF lumbar humano
obtenido de un varón de 75 años se hizo precipitar con ACT al 10%
con el fin de concentrarlo por un factor de diez, y se procesó como
se describe en la figura 2, excepto en que el pocillo del gel era
una ranura de 4 cm. Se diluyó el anticuerpo 92 a 6,7 \mug/ml en
0,5 ml de TTBS en presencia de diversos péptidos potencialmente
competidores, cada uno a una concentración aproximada de 60 \muM,
durante 10 horas a 4ºC bajo mezcla suave. Se diluyó entonces el
anticuerpo por un factor de 8 en gelatina al 1%/TTBS previamente a
la incubación con tiras del blot de material derivado del CSF, y se
procesó como se describe en la figura 2. Los péptidos competidores
eran los siguientes: Pista 1, sin adición de péptido competidor;
Pista 2, GSGLTNIKTEEISEVK; Pista 3, YSGLTNIKTEEISEVKM; Pista 4,
ISEVKM; Pista 5, EISEVKMD; Pista 6, CISEVKM; Pista 7, YISEVKM. PM =
marcadores de peso molecular (indicado en kilodaltons).
Anticuerpos: anti-5: Pistas 3, 6,
9; 6C6 (dirigidos contra residuos peptídicos 1-16
de \betaAP): pistas 4, 7, 10; anticuerpo 92 (contra aminoácidos
591 a 596 de APP): pistas 5, 8, 11; 7H5 (contra
APP-KPI): pista 12. Células: panel izquierdo (pistas
1 y 3-5): células 293 transfectadas establemente
con APP 695; panel intermedio (pistas 2 y 6-8):
células 293 transfectadas establemente con APP 751; panel derecho
(pistas 9-13); cultivos de células cerebrales de
feto humano. Controles: pistas 1, 2, y 13: anticuerpo IgG
anti-ratón de conejo. Flechas: un ejemplo de
diferencia de peso molecular entre formas secretadas de APP
reconocidas por los anticuerpos 6C6 y 92. Se llevó a cabo
SDS-PAGE en un gel Laemmli al 5%. PM = marcadores de
peso molecular (indicado en kilodaltons).
La figura 5 muestra resultados de transfecciones
duplicadas de formas normales y Suecas. Las pistas
1-4 son \alpha5+; las pistas 5-8
son 6C6+; y las pistas 9-12 son muestras 6C6-,
\alpha5+. Las pistas 1, 2, 5, 6, 9 y 10 son de \betaAPP normal;
las pistas 3, 4, 7, 8, 11 y 12 son de \betaAPP sueco. La mutación
sueca resulta en la producción incrementada de
\hbox{ATF- \alpha PP}ya que las pistas 11 y 12 contienen más material de ATF-\betaAPP que las pistas 9 y 10.
Se utilizó anticuerpo monoclonal 6C6, el cual
reconoce un epítopo de \betaAP entre los residuos 1 y 16, para
agotar inmunológicamente ciertos fragmentos de \betaAPP de
diversas muestras. El anticuerpo monoclonal 6C6 se acopló a resina
(como se ha descrito anteriormente), y se incubó con el medio
condicionado de cultivos celulares de cerebro fetal humano, como se
ha descrito anteriormente. Como se puede observar (figura 2, pista
C2), esta resina elimina eficazmente el \betaAPP que contiene
\betaAP 1-6 del medio condicionado del cultivo
celular. La resina, sin embargo, no captura inmunoreactividad
sustancial de \betaAPP, como detecta el anticuerpo
anti-5 dirigido contra un epítopo en dirección
N-terminal a la región \betaAP (figura 2, pista
A2).
Con el fin de caracterizar esta aparentemente
nueva forma de \betaAPP, los presentes inventores generaron
anticuerpos contra un péptido sintético que incluía los residuos
591-596 de \betaAPP (como se ha descrito
anteriormente). Este anticuerpo (denominado 92) se descubrió que
reconocía las especies de \betaAPP no capturadas por la resina,
(figura 2, pista B2) pero, sorprendentemente, no reaccionó con la
forma secretada de \betaAPP que contenía la secuencia
1-16 de \betaAP (pista B3).
La explicación de esta falta de reactividad
cruzada parece ser que el anticuerpo 92 reconoce un epítopo en
\betaAPP que incluye la metionina
carboxi-terminal, correspondiente al residuo 596. De
acuerdo con esto, los presentes inventores examinaron la capacidad
de diversos péptidos sintéticos de bloquear la inmunoreactividad
generada con 92. Como puede observarse en la figura 3, los péptidos
de secuencia basada en \betaAPP que terminan con el equivalente
de la metionina 596, bloquean sustancialmente la reacción de 92,
mientras que los péptidos que son un aminoácido más largos o más
cortos en sus extremos carboxi-terminales son
comparativamente ineficaces en situación de competencia. Se observó
el mismo patrón de competencia de péptidos en sobrenadantes de
cultivos celulares (datos no mostrados) y en CSF. Una serie de
experimentos de pulso-caza reveló cantidades
detectables de material inmunoprecipitable por anticuerpo 92
producido por células 293 que sobreexpresaban las isoformas 695 ó
751 de \betaAPP (figura 4, pistas 5 y 8). Experimentos similares
en cultivos celulares de cerebro fetal humano mostraron que el
material inmunoprecipitable 92 puede resolverse del \betaAPP que
es reactivo frente a 6C6 mediante SDS-PAGE de bajo
porcentaje (5%) (figura 4, pistas 9-11). En los
cultivos celulares de cerebro fetal, el tratamiento alternativo de
formas de \betaAPP que contienen dominio inhibidor de proteasa
Kunitz (KPI) es menos evidente, aunque se observan bandas
comigrantes débiles en inmunoprecipitaciones con anticuerpo 92 y con
anticuerpo 7H5 anti-KPI (pistas 11, 12).
La capacidad de resolver los materiales
precipitables por anticuerpos 92 y 6C6 en cultivos mixtos de
células cerebrales se debe, al menos en parte, a la producción de
las formas respectivas en cantidades casi iguales, en comparación
con la situación con células 293. Estus et al. (1992), obra
citada, observaron que, en comparación con otros tejidos, el
cerebro humano contenía una cantidad relativamente más elevada del
fragmento carboxi-terminal potencialmente
amiloidogénico, el cual, basados en el tamaño, parece iniciarse en
el extremo amino-terminal de \betaAP o cerca de
éste.
La coincidencia temporal en la aparición de
materiales de \betaAPP precipitables con anticuerpos 92 y 6C6 es
evidencia en contra de la posibilidad de un segundo suceso
proteolítico después de la secreción, en particular porque tiempos
de captura más largos no resultan en una alteración perceptible en
la proporción de especies reactivas a 92 y 6C6 (datos no
mostrados). La resolución en SDS-PAGE de las formas
secretadas, junto con la completa falta de reactividad inmunológica
de estas especies, corrobora adicionalmente la existencia de una
ruta alternativa de secreción. El sitio de corte alternativo se
denominó sitio \beta-secretasa, para enfatizar que
el corte ocurre en dirección amino-terminal a
\betaAP, el cual es diferente del corte descrito por Esch et
al. (1990) obra citada, el cual ocurre dentro de \betaAP.
Aunque la invención anterior ha sido descrita en
detalle con el fin de ser clara al entendimiento, resultará obvio
que pueden practicarse ciertas modificaciones dentro del ámbito de
las reivindicaciones adjuntas.
Claims (41)
1. Método para controlar el tratamiento de
proteína precursora \beta-amiloide (\betaAPP)
en células, el cual comprende la detección específica de un
fragmento amino-terminal soluble de proteína
precursora \beta-amiloide
(ATF-\betaAPP) secretada por las células, en el
que la secuencia aminoacídica del ATF-\betaAPP se
extiende desde el extremo amino-terminal de
\betaAPP hasta el extremo amino-terminal del
péptido \beta-amiloide, en el que
ATF-\betaAPP se distingue de otras formas cortadas
de \betaAPP que puedan estar presentes.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
ATF-\betaAPP se detecta mediante una técnica
seleccionada de entre el grupo que consiste en, (1) exposición a
una sustancia que se une específicamente a un epítopo de
ATF-\betaAPP que termina en un residuo
C-terminal que ha sido expuesto por el corte del
péptido \beta-amiloide procedente de \betaAPP,
y (2) electroforesis bidimensional en gel de los fragmentos
\betaAPP secretados por las células, seguido de exposición de los
fragmentos de electroforesis a una sustancia que es reactiva frente
a los fragmentos de \betaAPP.
3. Método para la detección de un fragmento
amino-terminal secretado de proteína precursora
\beta-amiloide (ATF-\betaAPP)
que resulta del corte de \betaAPP del extremo
amino-terminal del péptido
\beta-amiloide (\betaAP) en una muestra
biológica, comprendiendo dicho método:
- exponer la muestra a una sustancia que se une específicamente a una región C-terminal en la ATF-\betaAPP secretada; y
- detectar la unión entre la sustancia y el fragmento secretado.
4. Método según la reivindicación 3, en el que la
sustancia es un anticuerpo específico de la región
C-terminal que incluye un residuo
C-terminal expuesto por el corte del péptido
\beta-amiloide procedente de \betaAPP.
5. Método según la reivindicación 4, en el que
\betaAPP es la isoforma 695, 751 ó 770.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 5, en el que el residuo
C-terminal es metionina^{596}.
7. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 5, en el que el residuo
C-terminal es leucina^{596}.
8. Método según se reivindica en cualquiera de
las reivindicaciones 3 a 7, en el que el anticuerpo es específico
contra un péptido que comprende los residuos
591-596 de \betaAPP, en el que está expuesto el
residuo 596.
9. Método para la determinación de la presencia
de un fragmento amino-terminal secretado de proteína
precursora \beta-amiloide
(ATF-\betaAPP), en el que la secuencia
aminoacídica de ATF-\betaAPP se extiende desde el
extremo amino-terminal de \betaAPP hasta el
extremo amino-terminal del péptido
\beta-amiloide, en una muestra biológica,
comprendiendo dicho método:
exposición de la muestra a un anticuerpo que se
une específicamente a un epítopo en el extremo
carboxi-terminal de un fragmento de \betaAPP que
tiene metionina en su extremo carboxi-terminal,
estando dicho anticuerpo sustancialmente libre de reactividad
frente a otros fragmentos de \betaAPP que tuviesen aminoácidos más
allá de la metionina; y
detección de la unión entre la sustancia y el
fragmento secretado.
10. Método según la reivindicación 9, en el que
\betaAPP es la isoforma 695, 751 ó 770.
11. Método según la reivindicación 9 ó 10, en el
que el anticuerpo es específico contra un péptido que comprende los
residuos 591-596 de \betaAPP, estando expuesto el
residuo 596.
12. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el
que se detecta ATF-\betaAPP en una muestra de un
paciente.
13. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 11, en el que la muestra biológica es una
muestra de un paciente.
14. Método según la reivindicación 12 ó 13, en el
que la muestra de un paciente es líquido cerebroespinal.
15. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el
que se detecta ATF-\betaAPP en medio condicionado
procedente de un cultivo celular.
16. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 11, en el que la muestra biológica es un medio
condicionado procedente de una línea celular.
17. Método in vitro de exploración
sistemática de compuestos para identificar inhibidores de
producción de
\beta-amiloide, comprendiendo dicho método:
\beta-amiloide, comprendiendo dicho método:
(a) cultivo de células bajo condiciones que
resultan en secreción de un fragmento
amino-terminal soluble de proteína precursora
\beta-amiloide (ATF-\betaAPP)
en el que la secuencia aminoacídica del
ATF-\betaAPP soluble se extiende desde el extremo
amino-terminal del \betaAPP hasta el extremo
amino-terminal del péptido
\beta-amiloide;
(b) exposición de las células cultivadas a un
compuesto de prueba; y
(c) detección de una cantidad del
ATF-\betaAPP soluble; de tal modo que una
reducción en la cantidad del ATF-\betaAPP soluble
en comparación con la cantidad de ATF-\betaAPP
soluble de células no expuestas al compuesto indica que éste es un
inhibidor de producción de \beta-amiloide.
18. Método según la reivindicación 17, en el que
las células son células cultivadas de cerebro fetal humano.
19. Método según la reivindicación 17 ó 18, en el
que el compuesto de prueba se expone a una concentración entre 1 nM
y 1 mM.
20. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 19, en el que el compuesto de prueba es una
molécula pequeña.
21. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 19, en el que el compuesto de prueba es un
polímero biológico.
22. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que
ATF-\betaAPP tiene un extremo
carboxi-terminal de metionina^{596},
metionina^{652} o metionina^{671}.
23. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 22, en el que ATF-\betaAPP
tienen un extremo carboxi-terminal de
leucina^{596}, leucina^{652} o leucina^{671}.
24. Composición de anticuerpos que comprende
moléculas de anticuerpos que reconocen específicamente un fragmento
amino-terminal de la proteína precursora
\beta-amiloide (ATF-\betaAPP),
la cual se corta en el extremo amino-terminal del
péptido \beta-amiloide, pero cuyas moléculas de
anticuerpos no reconocen específicamente un fragmento de \betaAPP
secretado cuya secuencia se extienda hacia el interior de la
secuencia del péptido \beta-amiloide.
25. Composición de anticuerpos según la
reivindicación 24, en la que el anticuerpo reconoce específicamente
la región C-terminal que incluye un residuo
C-terminal expuesto por el corte del péptido
\beta-amiloide procedente de \betaAPP.
26. Composición de anticuerpos según la
reivindicación 25, en el que \betaAPP es la isoforma 695, 751 ó
770.
27. Composición de anticuerpos según la
reivindicación 24 ó 25, en el que las moléculas de anticuerpo
comprenden inmunoglobulinas intactas o fragmentos de
inmunoglobulina.
28. Composición de anticuerpo según cualquiera de
las reivindicaciones 24 a 27, en el que las moléculas de
anticuerpos específicos contra un péptido que comprende al menos
los residuos 591-596 de \betaAPP, siendo el
residuo 596 el aminoácido carboxi-terminal del
péptido.
29. Composición de anticuerpos según cualquiera
de las reivindicaciones 24 a 28, que comprende antisueros
específicos contra el péptido.
30. Composición de anticuerpos según cualquiera
de las reivindicaciones 24 a 29, en el que
ATF-\betaAPP tiene un residuo
carboxi-terminal que corresponde a
metionina^{596} o leucina^{596}.
31. Composición de anticuerpos según cualquiera
de las reivindicaciones 24 a 28 ó 30, que comprende anticuerpos
monoclonales.
32. Composición de anticuerpos según cualquiera
de las reivindicaciones 24 a 31, en la que las moléculas de
anticuerpo son moléculas de anticuerpo de ratón, de conejo, de
oveja o de cabra.
33. Composición de anticuerpos según cualquiera
de las reivindicaciones 24 a 32, en la que las moléculas de
anticuerpo se producen de manera recombinante.
34. Composición de anticuerpos según la
reivindicación 27, en la que el fragmento de inmunoglobulina es un
fragmento F(ab), un fragmento Fv, un fragmento VL o un
fragmento VH.
35. Hibridoma que produce moléculas de
anticuerpos que reconocen específicamente un fragmento
amino-terminal de proteína precursora
\beta-amiloide (ATF-\betaAPP)
que se ha cortado del extremo amino-terminal del
péptido \beta-amiloide, pero cuyas moléculas de
anticuerpos no reconocen específicamente un fragmento secretado de
\betaAPP cuya secuencia se extienda hacia el interior de la
secuencia del péptido \beta-amiloide.
\newpage
36. Hibridoma según la reivindicación 35, en el
que ATF-\betaAPP tiene un residuo
carboxi-terminal que corresponde a:
(a) metionina^{596} o leucina^{596};
(b) metionina^{652} o leucina^{652}; o
(c) metionina^{671} o leucina^{671}.
37. Fragmento soluble de proteína precursora
\beta-amiloide (\betaAPP) en forma aislada y
purificada, presentando dicho fragmento una metionina o leucina
C-terminal que resulta del corte del péptido
\beta-amiloide a partir de \betaAPP intacto.
38. Fragmento soluble según la reivindicación 37,
aislado a partir de una fuente natural seleccionada de entre el
grupo que consiste en líquido cerebroespinal y medio condicionado
procedente de células cultivadas.
39. Fragmento soluble según la reivindicación 37
ó 38, cuya secuencia aminoacídica consiste en los residuos
18-596 de la isoforma 695 de \betaAPP, en los
residuos 18-612 de la isoforma 751 de \betaAPP, o
en los residuos 18-671 de la isoforma 770 de
\betaAPP.
40. Uso de una composición de anticuerpos según
cualquiera de las reivindicaciones 24 a 34 para el control del
tratamiento de la proteína precursora
\beta-amiloide.
41. Uso de un fragmento soluble según cualquiera
de las reivindicaciones 37 a 39 para el control del tratamiento de
proteína precursora \beta-amiloide.
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---|---|---|---|
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Publication Number | Publication Date |
---|---|
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES93907104T Expired - Lifetime ES2206455T3 (es) | 1992-04-15 | 1993-03-03 | Metodos y composiciones para controlar el tratamiento celular de la proteina precursora beta-amiloide. |
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---|---|
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Families Citing this family (172)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5525339A (en) * | 1986-08-27 | 1996-06-11 | Dms Pharmaceutical Inc. | Isolated components of dense microspheres derived from mammalian brain tissue and antibodies thereto |
US5441870A (en) * | 1992-04-15 | 1995-08-15 | Athena Neurosciences, Inc. | Methods for monitoring cellular processing of β-amyloid precursor protein |
US5837672A (en) * | 1992-07-10 | 1998-11-17 | Athena Neurosciences, Inc. | Methods and compositions for the detection of soluble β-amyloid peptide |
US6610493B1 (en) * | 1993-06-17 | 2003-08-26 | Brigham And Women's Hospital | Screening compounds for the ability to alter the production of amyloid-β peptide |
US5605811A (en) * | 1992-10-26 | 1997-02-25 | Athena Neurosciences, Inc. | Methods and compositions for monitoring cellular processing of beta-amyloid precursor protein |
DE69333144T2 (de) * | 1992-10-26 | 2004-05-19 | Elan Pharmaceuticals, Inc., San Francisco | Verfahren zur Identifizierung von Hemmstoffe der Produktion des beta-Amyloidpeptids |
CA2174429C (en) | 1993-10-27 | 2011-08-30 | Lisa C. Mcconlogue | Transgenic animals harboring app allele having swedish mutation |
US5589154A (en) * | 1994-11-22 | 1996-12-31 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Methods for the prevention or treatment of vascular hemorrhaging and Alzheimer's disease |
US5804560A (en) * | 1995-01-06 | 1998-09-08 | Sibia Neurosciences, Inc. | Peptide and peptide analog protease inhibitors |
US5872101A (en) * | 1995-01-06 | 1999-02-16 | Sibia Neurosciences, Inc. | Methods of treating neurodegenerative disorders using protease inhibitors |
JPH11506923A (ja) * | 1995-06-06 | 1999-06-22 | アセナ ニューロサイエンシーズ,インコーポレイテッド | 新しいカテプシンならびにその阻害のための方法および組成物 |
US5783434A (en) * | 1995-06-06 | 1998-07-21 | Tung; Jay S. | Cathepsin and methods and compositions for inhibition thereof |
US5849711A (en) * | 1995-06-06 | 1998-12-15 | Athena Neurosciences, Inc. | Cathepsin and methods and compositions for inhibition thereof |
US6717031B2 (en) | 1995-06-07 | 2004-04-06 | Kate Dora Games | Method for selecting a transgenic mouse model of alzheimer's disease |
US6136530A (en) * | 1995-11-29 | 2000-10-24 | Texas Tech University Health Sciences Center | Compositions and methods for assessing risk factors in Alzheimer's disease |
EP0866805A1 (en) | 1995-12-12 | 1998-09-30 | Karolinska Innovations AB | PEPTIDE BINDING THE KLVFF-SEQUENCE OF AMYLOID $g(b) |
JPH09178743A (ja) * | 1995-12-27 | 1997-07-11 | Oriental Yeast Co Ltd | 可溶性appの定量法 |
GB9701684D0 (en) | 1997-01-28 | 1997-03-19 | Smithkline Beecham Plc | Novel compounds |
US8173127B2 (en) * | 1997-04-09 | 2012-05-08 | Intellect Neurosciences, Inc. | Specific antibodies to amyloid beta peptide, pharmaceutical compositions and methods of use thereof |
EP1032435B1 (en) * | 1997-10-31 | 2003-09-03 | Children's Medical Center Corporation | Bladder reconstruction |
US7588766B1 (en) | 2000-05-26 | 2009-09-15 | Elan Pharma International Limited | Treatment of amyloidogenic disease |
US7179892B2 (en) * | 2000-12-06 | 2007-02-20 | Neuralab Limited | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
US6750324B1 (en) | 1997-12-02 | 2004-06-15 | Neuralab Limited | Humanized and chimeric N-terminal amyloid beta-antibodies |
US6905686B1 (en) | 1997-12-02 | 2005-06-14 | Neuralab Limited | Active immunization for treatment of alzheimer's disease |
US6923964B1 (en) | 1997-12-02 | 2005-08-02 | Neuralab Limited | Active immunization of AScr for prion disorders |
US6913745B1 (en) | 1997-12-02 | 2005-07-05 | Neuralab Limited | Passive immunization of Alzheimer's disease |
TWI239847B (en) * | 1997-12-02 | 2005-09-21 | Elan Pharm Inc | N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease |
US20080050367A1 (en) | 1998-04-07 | 2008-02-28 | Guriq Basi | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
US6787523B1 (en) | 1997-12-02 | 2004-09-07 | Neuralab Limited | Prevention and treatment of amyloidogenic disease |
US7964192B1 (en) | 1997-12-02 | 2011-06-21 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Prevention and treatment of amyloidgenic disease |
US6710226B1 (en) | 1997-12-02 | 2004-03-23 | Neuralab Limited | Transgenic mouse assay to determine the effect of Aβ antibodies and Aβ Fragments on alzheimer's disease characteristics |
US7790856B2 (en) | 1998-04-07 | 2010-09-07 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
US6761888B1 (en) * | 2000-05-26 | 2004-07-13 | Neuralab Limited | Passive immunization treatment of Alzheimer's disease |
US20050059802A1 (en) * | 1998-04-07 | 2005-03-17 | Neuralab Ltd | Prevention and treatment of amyloidogenic disease |
US20030147882A1 (en) * | 1998-05-21 | 2003-08-07 | Alan Solomon | Methods for amyloid removal using anti-amyloid antibodies |
US7060670B1 (en) | 1999-05-05 | 2006-06-13 | Neurochem (International) Limited | Stereoselective antifibrillogenic peptides and peptidomimetics thereof |
US20040167634A1 (en) * | 1999-05-26 | 2004-08-26 | Anthony Atala | Prosthetic kidney and its use for treating kidney disease |
US6787637B1 (en) | 1999-05-28 | 2004-09-07 | Neuralab Limited | N-Terminal amyloid-β antibodies |
UA81216C2 (en) * | 1999-06-01 | 2007-12-25 | Prevention and treatment of amyloid disease | |
US20070135337A2 (en) * | 1999-11-29 | 2007-06-14 | Neurochem (International) Limited | Vaccine for the Prevention and Treatment of Alzheimer's and Amyloid Related Diseases |
US20020094335A1 (en) * | 1999-11-29 | 2002-07-18 | Robert Chalifour | Vaccine for the prevention and treatment of alzheimer's and amyloid related diseases |
US6479064B1 (en) * | 1999-12-29 | 2002-11-12 | Children's Medical Center Corporation | Culturing different cell populations on a decellularized natural biostructure for organ reconstruction |
US6992081B2 (en) | 2000-03-23 | 2006-01-31 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Compounds to treat Alzheimer's disease |
WO2001070672A2 (en) * | 2000-03-23 | 2001-09-27 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Compounds and methods to treat alzheimer's disease |
AU2001257022B2 (en) * | 2000-04-13 | 2005-02-03 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Abeta 42 lowering agents |
ATE314343T1 (de) * | 2000-06-30 | 2006-01-15 | Elan Pharm Inc | Verbindungen zur behandlung der alzheimerischen krankheit |
PE20020276A1 (es) | 2000-06-30 | 2002-04-06 | Elan Pharm Inc | COMPUESTOS DE AMINA SUSTITUIDA COMO INHIBIDORES DE ß-SECRETASA PARA EL TRATAMIENTO DE ALZHEIMER |
EP1666452A2 (en) | 2000-06-30 | 2006-06-07 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Compounds to treat Alzheimer's disease |
US20030096864A1 (en) * | 2000-06-30 | 2003-05-22 | Fang Lawrence Y. | Compounds to treat alzheimer's disease |
US6846813B2 (en) * | 2000-06-30 | 2005-01-25 | Pharmacia & Upjohn Company | Compounds to treat alzheimer's disease |
FR2816411B1 (fr) * | 2000-11-03 | 2003-07-04 | Inst Nat Sante Rech Med | Moyens de detection de la transformation pathologique de la proteine app et leurs applications |
US7700751B2 (en) | 2000-12-06 | 2010-04-20 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Humanized antibodies that recognize β-amyloid peptide |
TWI255272B (en) | 2000-12-06 | 2006-05-21 | Guriq Basi | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
US20030215896A1 (en) * | 2001-04-25 | 2003-11-20 | Yueming Li | Gamma secretase substrates and in vitro assays |
DE60229051D1 (de) * | 2001-04-30 | 2008-11-06 | Lilly Co Eli | Humanisierte antikörper |
US7196163B2 (en) * | 2001-05-22 | 2007-03-27 | Merk & Co., Inc. | Assays using amyloid precursor proteins with modified β-secretase cleavage sites to monitor β-secretase activity |
CA2448834A1 (en) * | 2001-06-01 | 2002-12-12 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Hydroxy alkyl amine derivatives as beta-secretase inhibitors and their use for the treatment of alzheimer's disease and similar diseases |
WO2002100818A2 (en) | 2001-06-13 | 2002-12-19 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Aminediols as agents for the treatment of alzheimer's disease |
MXPA04000140A (es) * | 2001-06-27 | 2004-06-03 | Elan Pharm Inc | Derivados de beta-hidroxiamina utiles en el tratamiento de enfermedad de alzheimer. |
US20070213407A1 (en) * | 2001-06-29 | 2007-09-13 | Elan Pharmaceuticals And Pharmacia & Upjohn Company Llc | Compounds to treat Alzheimer's disease |
MXPA04000338A (es) * | 2001-07-10 | 2004-07-23 | Upjohn Co | Diamindioles para tratamiento de enfermedad de alzheimer. |
CA2453451A1 (en) * | 2001-07-10 | 2003-01-23 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Aminediols for the treatment of alzheimer's disease |
US7297553B2 (en) * | 2002-05-28 | 2007-11-20 | Nanosphere, Inc. | Method for attachment of silylated molecules to glass surfaces |
BR0212078A (pt) * | 2001-08-31 | 2004-09-28 | Neurochem Int Ltd | Método de tratar ou prevenir uma doença relacionada com amilóide em um paciente, composição farmacêutica, composto quìmico, e, uso de um composto |
AU2002343483A1 (en) * | 2001-10-04 | 2003-04-14 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Hydroxypropylamines |
AR039555A1 (es) * | 2001-11-08 | 2005-02-23 | Upjohn Co | Derivados n,n'-sustituidos de 1,3-diamino-2-hidroxipropano |
ATE526047T1 (de) * | 2001-11-16 | 2011-10-15 | Childrens Medical Center | Verbesserung der funktion von organen |
US20050080141A1 (en) * | 2001-11-19 | 2005-04-14 | Schostarez Heinrich J. | Amino diols useful in the treatment of alzheimer's disease |
AU2003208857A1 (en) * | 2002-02-14 | 2003-09-04 | Evotec Neurosciences Gmbh | Diagnostic and therapeutic use of caps |
US20050214763A1 (en) * | 2002-02-14 | 2005-09-29 | Rainer Hipfel | Diagnostic and therapeutic use of an activator protein for vesicle secretion for neurodegenerative diseases |
CA2477002A1 (en) * | 2002-02-27 | 2003-09-04 | Merck & Co., Inc. | Assays to monitor amyloid precursor protein processing |
EP2292247A3 (en) * | 2002-03-05 | 2011-10-05 | Ramot at Tel Aviv University Ltd. | Immunizing composition and method for inducing an immune response against the beta-secretase cleavage site of amyloid precursor protein |
MY139983A (en) * | 2002-03-12 | 2009-11-30 | Janssen Alzheimer Immunotherap | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
AU2003223330A1 (en) * | 2002-04-17 | 2003-11-03 | Pharmacia And Upjohn Company Llc | Compositions and method of treating alzheimer's disease |
AU2003303141A1 (en) * | 2002-04-30 | 2004-07-22 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Hydroxypropyl amides for the treatment of alzheimer's disease |
EP1633786A4 (en) * | 2002-10-09 | 2007-07-25 | Rinat Neuroscience Corp | METHOD FOR TREATING ALZHEIMER DISEASE WITH ANTIBODIES TO AMYLOID BETA PEPTIDE AND COMPOSITIONS THEREOF |
KR100520495B1 (ko) * | 2002-10-23 | 2005-10-11 | 한국과학기술연구원 | 베타아밀로이드 특이 단일 클론 항체 및 그의 제조방법 |
CA2507484A1 (en) * | 2002-11-27 | 2004-06-17 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Substituted ureas and carbamates |
DE10303974A1 (de) | 2003-01-31 | 2004-08-05 | Abbott Gmbh & Co. Kg | Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung |
JP2006516639A (ja) * | 2003-02-01 | 2006-07-06 | ニユーララブ・リミテツド | 可溶性A−βに対する抗体を生成させるための能動免疫 |
CL2004000849A1 (es) * | 2003-04-21 | 2005-01-28 | Elan Pharmaceuticals Inc Pharm | Compuestos derivados de benzamidas-2-hidroxi-3-diaminoalcanos, utiles para el tratamiento o la prevencion de alzheimer, sindrome de down, hemorragia cerebral hereditaria, demencias degenerativas y otras. |
BRPI0409627A (pt) * | 2003-04-21 | 2006-04-25 | Elan Pharm Inc | 2-hidróxi-3-diaminoalcanos de fenacila |
US20040223912A1 (en) * | 2003-05-07 | 2004-11-11 | Montalto Michael Christopher | Compositions and methods for non-invasive imaging of soluble beta-amyloid |
WO2004100998A2 (en) | 2003-05-07 | 2004-11-25 | General Electric Company | Compositions and methods for non-invasive imaging of soluble beta-amyloid |
PE20050627A1 (es) | 2003-05-30 | 2005-08-10 | Wyeth Corp | Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido beta amiloideo |
US20060014790A1 (en) * | 2004-01-21 | 2006-01-19 | Varghese John | Methods of treatment of amyloidosis using spirocyclohexane aspartyl-protease inhibitors |
US7262223B2 (en) * | 2004-01-23 | 2007-08-28 | Neurochem (International) Limited | Amidine derivatives for treating amyloidosis |
EP1734942A1 (en) * | 2004-03-09 | 2006-12-27 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Substituted urea and carbamate, phenacyl-2-hydroxy-3-diaminoalkane, and benzamide-2-hydroxy-3-diaminoalkane aspartyl-protease inhibitors |
JP2007528403A (ja) * | 2004-03-09 | 2007-10-11 | エラン ファーマシューティカルズ,インコーポレイテッド | 二環式アスパラギン酸プロテアーゼ阻害薬を用いるアミロイドーシスの処置方法 |
JP2007528402A (ja) * | 2004-03-09 | 2007-10-11 | エラン ファーマシューティカルズ,インコーポレイテッド | 置換ヒドロキシエチルアミン系のアスパラギン酸プロテアーゼ阻害薬 |
US20060014737A1 (en) * | 2004-03-09 | 2006-01-19 | Varghese John | Methods of treatment of amyloidosis using bi-aryl aspartyl protease inhibitors |
WO2005087751A2 (en) * | 2004-03-09 | 2005-09-22 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Substituted hydroxyethylamine aspartyl protease inhibitors |
CA2573138A1 (en) * | 2004-07-09 | 2006-01-26 | Elan Pharmaceuticals Inc. | Oxime derivative substituted hydroxyethylamine aspartyl protease inhibitors |
WO2006010094A1 (en) | 2004-07-09 | 2006-01-26 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Oxime derivative hydroxyethylamine aspartyl-protease inhibitors |
US7807165B2 (en) * | 2004-07-30 | 2010-10-05 | Rinat Neuroscience Corp. | Antibodies directed against amyloid-beta peptide and methods using same |
WO2006026533A2 (en) * | 2004-08-27 | 2006-03-09 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treatment of amyloidosis using ethanol cyclicamine derivatives aspartyl protease inhibitors |
EP1814917A2 (en) * | 2004-10-13 | 2007-08-08 | Ablynx N.V. | Single domain camelide anti-amyloid beta antibodies and polypeptides comprising the same for the treatment and diagnosis of degenerative neural diseases such as alzheimer's disease |
JP2008523815A (ja) | 2004-12-15 | 2008-07-10 | エラン ファーマ インターナショナル リミテッド | 認知の改善における使用のためのヒト化アミロイドβ抗体 |
CA2589017A1 (en) * | 2004-12-15 | 2006-06-22 | Neuralab Limited | Amyloid beta antibodies for use in improving cognition |
PE20061152A1 (es) | 2004-12-15 | 2006-10-13 | Neuralab Ltd | Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido beta amiloideo |
WO2006074419A2 (en) * | 2005-01-07 | 2006-07-13 | Roskamp Research Llc | Compounds for inhibiting beta-amyloid production and methods of identifying the compounds |
UY29504A1 (es) | 2005-04-29 | 2006-10-31 | Rinat Neuroscience Corp | Anticuerpos dirigidos contra el péptido amiloide beta y métodos que utilizan los mismos. |
CA2617294A1 (en) * | 2005-08-03 | 2007-02-08 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Substituted ethane-1,2-diamines for the treatment of alzheimer's disease ii |
CA2624904A1 (en) * | 2005-10-12 | 2007-04-26 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating amyloidosis using aryl-cyclopropyl derivative aspartyl protease inhibitors |
WO2007047305A1 (en) * | 2005-10-12 | 2007-04-26 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating amyloidosis using cyclopropyl derivative aspartyl protease inhibitors |
US7872009B2 (en) * | 2005-11-21 | 2011-01-18 | Amgen Inc. | Beta-Secretase modulators and methods of use |
US7838676B2 (en) * | 2005-11-21 | 2010-11-23 | Amgen Inc. | Beta-secretase modulators and methods of use |
US7745484B2 (en) * | 2005-11-21 | 2010-06-29 | Amgen Inc. | Beta-secretase modulators and methods of use |
CN101432302A (zh) | 2005-11-30 | 2009-05-13 | 艾博特公司 | 抗-Aβ球聚体抗体,其抗原结合部分,相应的杂交瘤、核酸、载体、宿主细胞,生产所述抗体的方法,包含所述抗体的组合物,所述抗体的应用以及使用所述抗体的方法 |
CA2631195C (en) | 2005-11-30 | 2016-04-05 | Abbott Laboratories | Monoclonal antibodies against amyloid beta protein and uses thereof |
PT2361638E (pt) * | 2005-12-12 | 2014-04-17 | Ac Immune Sa | Anticorpos monoclonais específicos beta 1-42 com propriedades terapêuticas |
US8784810B2 (en) | 2006-04-18 | 2014-07-22 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Treatment of amyloidogenic diseases |
US20070292895A1 (en) * | 2006-05-19 | 2007-12-20 | Xiao-Ping Shi | Assays and methods to detect beta-secretase and its activity in body fluids and tissue extracts |
WO2008042024A2 (en) | 2006-06-01 | 2008-04-10 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Neuroactive fragments of app |
EP2046833B9 (en) | 2006-07-14 | 2014-02-19 | AC Immune S.A. | Humanized antibody against amyloid beta |
US8455626B2 (en) | 2006-11-30 | 2013-06-04 | Abbott Laboratories | Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies |
AR064501A1 (es) * | 2006-12-22 | 2009-04-08 | Genentech Inc | Antagonistas del dr6 (receptor de muerte 6) y usos de los mismos en el tratamiento de trastornos neurologicos |
EP2124952A2 (en) | 2007-02-27 | 2009-12-02 | Abbott GmbH & Co. KG | Method for the treatment of amyloidoses |
JP2011526240A (ja) * | 2007-04-18 | 2011-10-06 | ヤンセン アルツハイマー イミュノセラピー | 脳アミロイド血管症の予防および治療 |
US8003097B2 (en) | 2007-04-18 | 2011-08-23 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Treatment of cerebral amyloid angiopathy |
WO2008137168A2 (en) * | 2007-05-07 | 2008-11-13 | True Charles W | Collapsible, stackable, semi-rigid universal tank for hazardous and non-hazardous goods |
MX2009012608A (es) | 2007-05-25 | 2009-12-07 | Amgen Inc | Compuestos de hidroxietil amina substituidos como moduladores de beta-secretasa y metodos de uso. |
TW200901991A (en) | 2007-05-25 | 2009-01-16 | Amgen Inc | Substituted hydroxyethyl amine compounds as beta-secretase modulators and methods of use |
JP2010528658A (ja) | 2007-06-08 | 2010-08-26 | ウェイク・フォレスト・ユニヴァーシティ・ヘルス・サイエンシズ | 腎不全の治療のための選択的細胞治療 |
US10590391B2 (en) * | 2007-06-08 | 2020-03-17 | Wake Forest University Health Sciences | Selective cell therapy for the treatment of renal failure |
PE20090766A1 (es) * | 2007-06-12 | 2009-07-09 | Ac Immune Sa | Anticuerpo igg1 humanizado |
US8048420B2 (en) | 2007-06-12 | 2011-11-01 | Ac Immune S.A. | Monoclonal antibody |
US8613923B2 (en) | 2007-06-12 | 2013-12-24 | Ac Immune S.A. | Monoclonal antibody |
JP2010533478A (ja) | 2007-07-13 | 2010-10-28 | エラン ファーマシューティカルズ,インコーポレイテッド | ガンマセクレターゼの阻害剤の基質特異性を同定するための組成物および方法 |
EP2182983B1 (en) | 2007-07-27 | 2014-05-21 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Treatment of amyloidogenic diseases with humanised anti-abeta antibodies |
SG178809A1 (en) * | 2007-10-05 | 2012-03-29 | Genentech Inc | Use of anti-amyloid beta antibody in ocular diseases |
CA2701793C (en) | 2007-10-05 | 2017-04-25 | Genentech, Inc. | Use of anti-amyloid beta antibody in ocular diseases |
JO3076B1 (ar) | 2007-10-17 | 2017-03-15 | Janssen Alzheimer Immunotherap | نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe |
US20090163594A1 (en) * | 2007-10-31 | 2009-06-25 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Triple Assay System for Identifying Substrate Selectivity of Gamma Secretase Inhibitors |
US7803809B2 (en) * | 2008-11-12 | 2010-09-28 | Amgen Inc. | Substituted pyrano [2,3-b] pyridinamine compounds as beta-secretase modulators and methods of use |
WO2009090650A2 (en) * | 2008-01-16 | 2009-07-23 | Ben-Gurion University Of The Negev Research And Development Authority | Vaccine for alzheimer's disease |
KR20110028504A (ko) * | 2008-06-12 | 2011-03-18 | 제넨테크, 인크. | 신경변성을 억제하는 화합물의 스크리닝 방법 |
ES2459195T3 (es) * | 2008-09-11 | 2014-05-08 | Amgen Inc. | Compuestos de anillo espiro-tetracíclico como moduladores de beta-secretasa y métodos de uso |
US20110256559A1 (en) * | 2008-10-20 | 2011-10-20 | Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) | Method for Detecting Soluble Amyloid Precursor Protein (APP) Alpha and/or Soluble APP Beta |
US9067981B1 (en) | 2008-10-30 | 2015-06-30 | Janssen Sciences Ireland Uc | Hybrid amyloid-beta antibodies |
WO2010057015A1 (en) * | 2008-11-14 | 2010-05-20 | Wake Forest University Health Sciences | Kidney structures and methods of forming the same |
EA201190025A1 (ru) | 2008-11-25 | 2012-12-28 | Байоджен Айдек Ма Инк. | ПРИМЕНЕНИЕ АНТАГОНИСТОВ DR6 И p75 ДЛЯ ПРОМОТИРОВАНИЯ ВЫЖИВАНИЯ КЛЕТОК НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ |
AR078986A1 (es) * | 2009-11-12 | 2011-12-14 | Genentech Inc | Un metodo para promover la densidad de espinas dendriticas |
EP2504315A1 (en) | 2009-11-23 | 2012-10-03 | Amgen Inc. | Amino heteroaryl compounds as beta-secretase modulators and methods of use |
US8822485B2 (en) | 2009-11-23 | 2014-09-02 | Amgen Inc. | Amino heteroaryl compounds as beta-secretase modulators and methods of use |
US8735384B2 (en) | 2010-01-19 | 2014-05-27 | Amgen Inc. | Amino heteroaryl compounds as beta-secretase modulators and methods of use |
JP5584352B2 (ja) | 2010-03-15 | 2014-09-03 | アムジエン・インコーポレーテツド | β−セクレターゼ調節剤としてのアミノ−ジヒドロオキサジン系およびアミノ−ジヒドロチアジン系スピロ化合物ならびにそれらの医学的用途 |
EP2547685A1 (en) | 2010-03-15 | 2013-01-23 | Amgen Inc. | Spiro-tetracyclic ring compounds as beta - secretase modulators |
US8987419B2 (en) | 2010-04-15 | 2015-03-24 | AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG | Amyloid-beta binding proteins |
SG187173A1 (en) | 2010-07-30 | 2013-02-28 | Ac Immune Sa | Safe and functional humanized anti beta-amyloid antibody |
EP2601197B1 (en) | 2010-08-05 | 2014-06-25 | Amgen Inc. | Amino-iso-indole, amino-aza-iso-indole, amino-dihydroisoquinoline and amino-benzoxazine compounds as beta-secretase modulators and methods of use |
MX358739B (es) | 2010-08-14 | 2018-09-03 | Abbvie Inc Star | Proteinas de union a amiloide beta. |
WO2012071279A1 (en) | 2010-11-23 | 2012-05-31 | Amgen Inc. | Spiro-amino-imidazolone and spiro-amino-dihydro-pyrimidinone compounds as beta-secretase modulators and methods of use |
WO2012109165A1 (en) | 2011-02-07 | 2012-08-16 | Amgen Inc. | 5-amino-oxazepine and 5-amino-thiazepane compounds as beta-secretase antagonists and methods of use |
WO2012112462A1 (en) | 2011-02-15 | 2012-08-23 | Amgen Inc. | Spiro-amino-imidazo-fused heterocyclic compounds as beta-secretase modulators and methods of use |
US20140302532A1 (en) | 2011-04-12 | 2014-10-09 | Quanterix Corporation | Methods of determining a treatment protocol for and/or a prognosis of a patient's recovery from a brain injury |
US9296759B2 (en) | 2011-09-21 | 2016-03-29 | Amgen Inc. | Amino-oxazine and amino-dihydrothiazine compounds as beta-secretase modulators and methods of use |
JP5605879B2 (ja) * | 2012-02-03 | 2014-10-15 | 塩野義製薬株式会社 | sAPPβに対する抗体 |
US9556135B2 (en) | 2012-10-12 | 2017-01-31 | Amgen, Inc. | Amino-dihydrothiazine and amino-dioxido dihydrothiazine compounds as beta-secretase antagonists and methods of use |
WO2014078314A1 (en) | 2012-11-15 | 2014-05-22 | Amgen Inc. | Amino-oxazine and amino-dihydrothiazine compounds as beta-secretase modulators and methods of use |
WO2014120658A1 (en) | 2013-01-29 | 2014-08-07 | Amgen Inc. | Fused multicyclic 3-amino-5,6-dihydro-2h-1,4-thiazine derivatives and their use as beta-secretase inhibitors |
TW201446758A (zh) | 2013-03-01 | 2014-12-16 | Amgen Inc | 作爲β-分泌酶抑制劑的全氟化5,6-二氫-4H-1,3-□-2-胺化合物及其用途 |
KR20150124985A (ko) | 2013-03-08 | 2015-11-06 | 암젠 인크 | 베타-세크레타제 억제제로서 퍼플루오르화된 사이클로프로필 융합된 1,3-옥사진-2-아민 화합물 및 그의 사용 방법 |
US9096615B2 (en) * | 2013-07-30 | 2015-08-04 | Amgen Inc. | Bridged bicyclic amino thiazine dioxide compounds as inhibitors of beta-secretase and methods of use thereof |
CN106795147B (zh) | 2014-08-08 | 2020-09-22 | 美国安进公司 | 作为β-分泌酶抑制剂的环丙基稠合噻嗪-2-胺化合物和使用方法 |
EP3070096A1 (en) * | 2015-03-19 | 2016-09-21 | Ludwig-Maximilians-Universität München | A peptide or collection of peptides derived from amyloid precursor protein |
US10246429B2 (en) | 2015-08-06 | 2019-04-02 | Amgen Inc. | Vinyl fluoride cyclopropyl fused thiazin-2-amine compounds as beta-secretase inhibitors and methods of use |
MA54100A (fr) | 2016-12-15 | 2021-10-20 | Amgen Inc | Dérivés de thiazine en tant qu'inhibiteurs de bêta-sécrétase et procédés d'utilisation |
MX2019007104A (es) | 2016-12-15 | 2019-11-05 | Amgen Inc | Derivados de dioxido de 1,4-tiazina y dioxido de 1,2,4-tiadiazina como inhibidores de beta-secretasa y metodos de uso. |
EP3555085B1 (en) | 2016-12-15 | 2020-12-02 | Amgen Inc. | Cyclopropyl fused thiazine derivatives as beta-secretase inhibitors and methods of use |
CA3047286A1 (en) | 2016-12-15 | 2018-06-21 | Amgen Inc. | Oxazine derivatives as beta-secretase inhibitors and methods of use |
CA3047285A1 (en) | 2016-12-15 | 2018-06-21 | Amgen Inc. | Bicyclic thiazine and oxazine derivatives as beta-secretase inhibitors and methods of use |
Family Cites Families (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4492760A (en) * | 1983-04-19 | 1985-01-08 | The Wistar Institute Of Anatomy And Biology | HLA D Typing assay |
JPS6147500A (ja) * | 1984-08-15 | 1986-03-07 | Res Dev Corp Of Japan | キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法 |
EP0173494A3 (en) * | 1984-08-27 | 1987-11-25 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Chimeric receptors by dna splicing and expression |
GB8422238D0 (en) * | 1984-09-03 | 1984-10-10 | Neuberger M S | Chimeric proteins |
JPS61134325A (ja) * | 1984-12-04 | 1986-06-21 | Teijin Ltd | ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法 |
US4666829A (en) * | 1985-05-15 | 1987-05-19 | University Of California | Polypeptide marker for Alzheimer's disease and its use for diagnosis |
JPS62100291A (ja) * | 1985-10-28 | 1987-05-09 | Teijin Ltd | 遺伝子断片およびプラスミド |
WO1987002671A1 (en) * | 1985-11-01 | 1987-05-07 | International Genetic Engineering, Inc. | Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use |
US5223482A (en) * | 1986-11-17 | 1993-06-29 | Scios Nova Inc. | Recombinant Alzheimer's protease inhibitory amyloid protein and method of use |
EP0331514A3 (en) * | 1988-03-04 | 1991-07-10 | Ajinomoto Co., Inc. | Assaying the duchenne muscular dystrophy protein deletion or defect |
US5134062A (en) * | 1988-03-22 | 1992-07-28 | Cornell Research Foundation, Inc. | Diagnosis of neuronal disorders and screening potential therapeutic agents therefor |
US5262332A (en) * | 1989-04-05 | 1993-11-16 | Brigham And Women's Hospital | Diagnostic method for Alzheimer's disease: examination of non-neural tissue |
US5234814A (en) * | 1989-06-01 | 1993-08-10 | Du Pont Merck Pharmaceutical Company | Diagnostic assay for alzheimer's disease |
US5213962A (en) * | 1990-04-24 | 1993-05-25 | The Regents Of The University Of California | Purification, detection and methods of use of protease Nexin-2 |
CA2079880A1 (en) * | 1990-04-24 | 1991-10-25 | William E. Van Nostrand | Purification, detection and methods of use of protease nexin-2 |
US5385915A (en) * | 1990-05-16 | 1995-01-31 | The Rockefeller University | Treatment of amyloidosis associated with Alzheimer disease using modulators of protein phosphorylation |
US5387742A (en) * | 1990-06-15 | 1995-02-07 | Scios Nova Inc. | Transgenic mice displaying the amyloid-forming pathology of alzheimer's disease |
AU8215391A (en) * | 1990-06-29 | 1992-01-23 | Case Western Reserve University | Diagnostic and prognostic methods based on soluble derivatives of the beta amyloid protein precursor |
US5200339A (en) * | 1990-08-17 | 1993-04-06 | Abraham Carmela R | Proteases causing abnormal degradation of amyloid β-protein precursor |
BE1003316A5 (fr) * | 1990-11-27 | 1992-02-25 | Will L F & Cie Sa | Anticorps monoclonal utile pour le diagnostic de la maladie d'alzheimer, hybridome secreteur d'un tel anticorps monoclonal et procede pour sa preparation. |
US5441870A (en) * | 1992-04-15 | 1995-08-15 | Athena Neurosciences, Inc. | Methods for monitoring cellular processing of β-amyloid precursor protein |
-
1992
- 1992-10-26 US US07/965,971 patent/US5441870A/en not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-03-03 DK DK93907104T patent/DK0638172T3/da active
- 1993-03-03 WO PCT/US1993/001817 patent/WO1993021526A1/en active IP Right Grant
- 1993-03-03 DE DE69333225T patent/DE69333225T2/de not_active Expired - Lifetime
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- 1993-03-03 JP JP51830393A patent/JP3974168B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
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-
1995
- 1995-05-12 US US08/440,423 patent/US5721130A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-05-01 US US08/846,444 patent/US6018024A/en not_active Expired - Lifetime
-
2005
- 2005-08-08 JP JP2005230075A patent/JP2006051029A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0638172A4 (en) | 1997-03-19 |
PT638172E (pt) | 2004-02-27 |
US6018024A (en) | 2000-01-25 |
NO943912L (no) | 1994-11-10 |
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AU688726B2 (en) | 1998-03-19 |
NO943912D0 (no) | 1994-10-14 |
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JP3974168B2 (ja) | 2007-09-12 |
CA2118243A1 (en) | 1993-10-28 |
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DK0638172T3 (da) | 2004-02-02 |
US5441870A (en) | 1995-08-15 |
NO320067B1 (no) | 2005-10-17 |
US5721130A (en) | 1998-02-24 |
AU3782793A (en) | 1993-11-18 |
DE69333225D1 (de) | 2003-11-06 |
DE69333225T2 (de) | 2004-05-06 |
EP0638172B1 (en) | 2003-10-01 |
WO1993021526A1 (en) | 1993-10-28 |
NZ251053A (en) | 1996-11-26 |
JPH07506967A (ja) | 1995-08-03 |
ATE251304T1 (de) | 2003-10-15 |
CA2118243C (en) | 2009-11-03 |
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