JPH07506967A - β−アミロイド前駆体タンパク質の細胞プロセッシングをモニターするための方法及び組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 β−アミロイド前駆体タンパク質の細胞プロセッシングをモニターするための方 法及び組成物 発明の背景 １、発明の分野 本発明は、一般的にβ−アミロイド前駆体タンパク質のプロセッシングをモニタ ーするための方法及び組成物に関する。より特定には、本発明は、アルツハイマ ー病の診断、予測及び治療への応答のモニターのためへの、及びアルツハイマー 病の処理のための可能な薬物のスクリーニング及び評価のためへのそのような方 法及び組成物の使用に関する。

アルツハイマー病は、アルツハイマー病患者の脳、特に記憶及び知識に関与する 領域に存在する多くのアミロイドプラーク及び神経細繊維網（高い不溶性のタン パク質凝集体）の存在によって特徴づけられる。過去において、プラーク及び網 が原因であるか又は単にアルツハイマー病の結果であるかについて有意な科学的 論争が存在するが、最近の発見は、アミロイドプラークが原因前駆体又は因子で あることを示唆する。特に、β−アミロイドペプチド、すなわちアミロイドプラ ークの主要構成成分の生成がアミロイド前駆体タンパク質をコードする遺伝子に おける変異に起因することが発見されており、ここで前記タンパク質は通常プロ セッシングされる場合、β−アミロイドペプチドを生成しないであろう。アルツ ハイマー病の家族性初期開始を引き起こす、アミロイド前駆体タンパク質におけ る変異の同定は、アミロイド代謝がその病気の根底にある病原性工程における中 枢的出来事である最強の証拠である。４つの報告される、疾病を引き起こす変異 は、７７０の同形（ｉｓｏｆｏｒｎ＋）に関して、バリン７１′〜イソロイシン （Ｇｏａｔｅなど、（１９！Ｊｌ）　Ｎａｔｕｒｅ　３４９：　７０４〜７０６ ）、バリン′１〜グリシン（Ｃｈａｒｔｉｅｒ　１ｌａｒｌｏｎなど、（１９９ １）　Ｎａｔｕｒｅ３５３　：　８４４〜８４６）、バリン７Ｉ′〜フエールア ラニン（ｌＪｕｒｔｅｌｌなど。

（１９９１）　５ｃｉｅｎｃｅ　２５４　：　９７〜９９）及び６９５の同形に 関しては、二重変異変更リジン１ｏｓ−メチオニンｓｅｓ〜アスパラジン５９５ −ロイシン５９６（Ｍｕｌｌａｎなど、（１９９２）　Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅ ｔ　１　：　３４５〜３４７）を包含する。さらに、β−アミロイドペプチドは 脳のニューロンに対して毒性であり、そしてニューロン細胞の死がこの疾病に関 連している。

従って、アミロイド前駆体タンパク質の細胞プロセッシングをモニターする能力 は、アルツハイマー病の診断、予測及び治療管理において有意に価値あるもので ある。特に、容易に得られる患者のサンプル、たとえば血清、脳を髄液（Ｃ３Ｆ ）及び同様のものにおける検出できる診断マーカーをスクリーニングし、そして 評価するために最小限に侵略的な方法を同定することが所望される。

アルツハイマー病のための多くの可能性ある診断マーカーがこれまで示唆されて 来た。本発明において特に興味あるものは、カルボキン末端フラグメント（たと えばβ−アミロイドペプチド自体及びそのフラグメント）及びアミノ末端フラグ メント（たとえば一定の２５ＫＤ、　１０５ＫＤ及び１２５ＫＤのフラグメント ）を含む、アミロイド前駆体タンパク質の一定のフラグメントである。今までの ところでは、提案されたマーカーは、アルツハイマー病の死亡前診断又はモニタ ーリングについては明確ではない。

従って、アルツハイマー病のための追加及び他の診断マーカーを同定することが 所望される。そのようなマーカーは、単独で及び／又は池の診断マーカー及び方 法と組合して有用であるべきである。

好ましくは、診断マーカーは体液、たとえばＣ５Ｆ、血液、血漿、血清、尿、組 織及び同様のものにおいて検出され、その結果、侵略的診断方法が利用され得る 。

本発明のさらに興味あるものは、β−アミロイドプラークの生成を阻害し又は妨 げる能力のための候補薬物をスクリーニングするインビトロシステム及び方法で ある。β−アミロイドペプチドへのアミロイド前駆体タンパク質の転換を阻害し 又は妨げる能力のための試験化合物をスクリーニングするための方法及びシステ ムを提供することが所望される。特に、試験化合物が転換を導びく代謝路を中断 し又は妨害することができるような転換に包含されると思われて来た代謝路に基 づく方法及びシステムを確立することが所望される。

そのような方法及びシステムは多数の試験化合物をスクリーニングするために急 速で、経済的で且つ適切であるべきである。

２、背景技術の記載 β−アミロイドペプチド（また、Ａ４．　βＡＰ、　Ａβ又はＡ、１９Ｐとして も言及される：アメリカ特許第４．６６６、８２９号及びＷｏｎｇ　（１９８４ ）Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、１２０．１１３１ 〜１１３５を参照のこと）は、β−アミロイド前駆体タンパク質（βＡＰＰ）に 由来し、これは６９５゜７５１及び７７０個のアミノ酸の異なってスプライスさ れた形で発現される。Ｋａｎｇなど、（１９８７）　Ｎａｔｕｒｅ　３２５　： 　７７３〜７７６；　Ｐｏｎｔｅなど、　（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ　３３１　 ：　５２５〜５２７　；及びＫｉｔａｇｕｃｈｉなど、（１９８８）　Ｎａｔｕ ｒｅ　３３１：５３０〜５３２を参照のこと。アミロイド前駆体タンパク質の通 常のプロセッシングは、トランスメンブランドメイン近くの残基ＬｙＳ１８とＬ ｅｕ　”　（Ｋａｎｇなど、　（１９８７）前記においてＡＳｐＩＩ７が残基ｌ であるｖＡＰ領域について番号を付与されている）との間の部位でタンパク質分 解性切断を包含し、β−アミロイドペプチド配列の残る部分を保持する細胞外ド メインの構成的分泌をもたらすＣＥｓｃｈなど、　（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ 　２４８　：　１１２２〜１１２４）　ｏこの経路は、種間に広く保存され、そ して多くの細胞型に存在しているように思える。Ｗｅ　ｉ　ｄｅｉｌａｎｎなど 。

（２９８９）　Ｃｅ１ｌ　５７：　１１５〜１２６及び０１　ｔｅｒｓｄａｒｆ など、（１９９０）　Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｎ、　２６５　：　４４９２〜４４９７を参照のこと。この正常な経路は 、β−アミロイドペプチドに対応する前駆体タンパク質の領域内で分解し、従っ て、その形成を明らかに妨げる。βＡＰＰのもう１つの構成的に分泌される形が 注目され（Ｒｏｂａｋｉｓなど、　Ｓｏｃ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　０ｃｔｏｂｅ ｒ　２６゜１９９３、　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｎｏ、１５．４．　Ａｎａｈｅｔ＋ ＋＋、　Ｃ＾、）、これは［！ｓｃｈなど、前記により記載される形のものから βＡＰ配列のカルボキシ末端のものを含む。

Ｇｏｌｄｅなど、（１９９２）　５ｃｉｅｎｃｅ　２５５：　７２８〜７３０は 、アミロイド前駆体タンパク質の一連の欠失変異体を調製し、モしてβ−アミロ イドペプチド領域内の１つの切断部位を観察した。この観察に基づけば、β−ア ミロイドペプチド形成は分泌路を包含しないことが推定された。［！５ｔｕｓな ど、　（１９９２）　５ｃｉｅｎｃｅ　２５５　：　７２６〜７２８は、脳細胞 に見出されるアミロイド前駆体タンパク質の２つの最大カルボキシ末端タンパク 質分解フラグメントが完全なβ−アミロイドペプチド領域を含むことを教授する 。

ＰＣＴ出願Ｗ０９２１００５２１は、患者の脳を髄液におけるアミロイド前駆体 タンパク質の一定の２５ＫＤ、　ｌ０５ＫＤ及び１２５ＫＤの可溶性誘導体の量 の測定に基づいてアルツハイマー病を評価するための方法を記載する。そのＷ０ ９２１００５２１の第３図は、アミロイド前駆体タンパク質の切断がβ−アミロ イドペプチドのアミノ末端近くで生じ、可溶性アミノ末端フラグメントを生成す ることを示唆しているが、しかしそのような切断の証拠又は論議はその出願には 示されていない。

Ｋｅｎｎｅｄｙなど、（１９９２）　Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　１ 　：　５９〜６４は、分泌されたβＡＰＰの形についてのデータを表わし、これ はβＡＰＰの残基５２７−５４０に対する抗体とのその反応性及びβＡＰの最初 の１５個の残基に対する抗体との反応性の欠乏により特徴づけられる。βＡＰＰ 形のカルボキシ末端の切断部位又は同定を示す直接的な証拠は提供されていない 。ＰＣＴ出願Ｗ０９１／１６６２８号は、プロテアーゼｎｅｘｉｎ−２又はアミ ロイド前駆体タンパク質に対する抗体を利用して、アミロイド前駆体タンパク質 及びそのフラグメントの検出に基づいての疾病の診断方法を記載する。

最近の報告は、可溶性β−アミロイドペプチドが培養培地（Ｈａａｓｓなど、（ １９９２）　Ｎａｔｕｒｅ　３５９：　３２２〜３２５）に、及びヒト及び動物 Ｃ３Ｆ（Ｓｅｕｂｅｒｔなど、（１９９２）　Ｎａｔｕｒｅ　３５９　：　３２ ５〜３２７）に健康細胞により生成されることを示す。

発明の要約 生物学的サンプルにおけるβ−アミロイド前駆体タンパク質（βＡＰＰ）の分泌 されたアミノ末端フラグメントを検出、そしてモニターするための方法及び組成 物が提供され、ここで前記フラグメントは前記β−アミロイドペプチド（βＡＰ ）領域のアミノ末端で又はその近くでの切断に起因する。特に、Ｋａｎｇなど９ 、前記により記載されるβＡＰＰに基づ＜キ婁アミノ酸配列（すなわち“正常” な配列）に関しては、βＡＰＰのこの切断され、分泌されたフラグメントは、そ れらのカルボキン末端で暴露されるメチオニンを有する分泌されたフラグメント の一定のカルボキン末端残基を含んで成るペプチドに対して発生せしめられた抗 体により認識され得る。他方、天然に存在し又は構築された、βＡＰＰの変異配 列、たとえばＭｕｌｌａｎなど。

（’１９９２）　Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ　ｌ　：　３４５〜３４７により報 告される、リジンｆｉｌｓ−メチオニン１１をアスパラジンＩ＠′−ロイシン５ １に変える二重変異誘発がこの領域における新規配列を導入することができる。

このβＡＰＰ配列のＣ末端残基に対して特異的な結合物質がそのような配列のた めの検出の好ましい手段であろう。

分泌されたフラグメントは、損なわれていないβＡＰＰにおけるβＡＰ領域に隣 接して存在するカルボキシ末端残基（正常な配列の場合はメチオニン）の５個の アミノ酸内で終結するβＡＰＰの実質的に損なわれていないアミン末端配列を含 んで成るであろう。特に、分泌されたフラグメントは、βＡＰＰの６９５個のア ミノ酸イソフオーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）のメチオニンＳ９６及びリジンＳ９％に おいて終結する配列、及び他のインフオームのための対応する番号並びに変異体 βＡＰＰ形、たとえばＬＹＳ”’−ＭＥＴ”’　〜ＡＳＮ”’−ＬＥＵ”’　（ ”Ｓｗｅｄｉｓｈ”　形）　（１）タメの対応するアミノ酸から成る。本発明の 方法及び組成物は、βＡＰＰの細胞内プロセッシングをモニターするために、特 にある疾病、特にアルツハイマー病及び家族性形並びにダウン症候群に関与され る損なわれていないβＡＰを放すβＡＰＰの切断をモニターするためにインビボ 及びインビトロの両者において有用である。

本発明の第１の特定の観点においては、βＡＰＰの分泌されたアミノ末端フラグ メント（ＡＴＦ−βＡＰＰ）が、βＡＰＰ　６９５イソフオームの残基５９６で 終結するβＡＰＰ配列のＣ末端残基に対して発生せしめられた及び／又はその残 基に対して特異的な結合物質との反応により、典型的には、生物学的サンプルに 存在するβＡＰＰの他の切断された形とＡＴＦ−βＡＰＰとを区別することがで きる抗体との反応により検出される。その必要な特異性を有する抗体は、ＡＴＦ 〜βＡＰＰのＣ末端残基を包含する合成ペプチドハブテンに対して生ぜしめられ る。

本発明の第２の特定の観点においては、βＡＰ関連の疾病、たとえばアルツハイ マー病及びダウン症候群は、患者のサンプル、たとえばＣ３Ｆ、血清、血液、血 漿、尿、組織及び同様のものにおけるＡＴＦ−βＡＰＰの検出に基づいて、患者 において診断され、そしてモニターされ得る。高められたＡＴＦ−βＡＰＰレベ ル又は割合は、前記疾病の開始及び進行に関与し、そして前記疾病の処理での経 過を伴って減じられ得る。

第３の特定の観点においては、本発明は、βＡＰ生成インヒビターを同定するた めの方法を提供し、ここでＡＴＦ−βＡＰＰの分泌をもたらす条件下で動物がそ の分泌を高められ、又は細胞が培養される。

動物又は培養された細胞は試験化合物に暴露され、そしてＡＴＦ−βＡＰＰの分 泌された量又は割合の変化を引き起こす試験化合物が同定され得る。

第４の特定の観点においては、本発明は、ＡＴＦ−βＡＰＰのＣ末端に特異的に 結合できる、抗体分子、たとえば損なわれていない免疫グロブリン分子及び免疫 グロブリンフラグメントを含む抗体組成物を含んで成る。そのような抗体分子は 、ＡＴＦ−βＡＰＰのＣ末端残基を含んて成る免疫原を通常用いて、いづれかの 従来の手段で調製され得、そしてここでＣ末端メチオニンが正常な配列において は暴露される。

第５の特定の観点においては、本発明は精製され、そして単離された形でＡＴＦ −βＡＰＰを含んで成る。そのようを組成物はＡＴＦ　−βＡＰＰの検出のため に種々の従来のアッセイにおいて有用であろう。

そのような組成物は、天然又は組換え源、たとえばＣＳＦ、適切な細胞培養物か らのならし培地又は同様のものからのＡＴＦ−βＡＰＰの単離及び精製により得 られる。

図面の簡単な説明 第１Ａ及び１８図は、正常なβＡＰＰの種々のイソフオーム及びＡＴＦ−βＡＰ Ｐのその対応するイソフオームをそれぞれ示す。

第２Ａ、２Ｂ及び２０図は、ヒト胎児の脳細胞培養物のならし培地に由来する材 料の化学発光ゲルパターンである。個々のゲルのし−ンＩ、２、及び３は、未処 理のならし培地、β−アミロイドペプチド残基ｌ〜１６内でエピトープを認識す る抗体との反応により消耗されたならし培地、及びこの抗体により除去される材 料をそれぞれ表わす。パネルＡ、　Ｂ及びＣは、次のプローブを示す：抗−５抗 体（β−アミロイドペプチド領域の方に対してβＡＰＰアミノ末端上の位置を認 識する）、抗体９２（ＢＡＰＰからのβＡＰの切断により暴露されるＣ末端メチ オニンで終結する合成ペプチドに対して生ぜしめられている）、及び抗体１０［ １４（残基１〜１Ｇ以内のβＡＰのエピトープを認識するモノクローナル抗体） 。

第３図は、ヒト腰動脈Ｃ５Ｆを試験することによって得られた化学発光ゲルパタ ーンである。Ｃ３Ｆは、単独で（レーンｌ）又はＡＴＦ　−ＢＡＰＰのＣ末端の 変動を表わす種々のペプチドにより予備インキュベートされた９２抗体によりプ ローブされた。有意な競争（結合の低下）は、Ｃ末端メチオニンで終結するペプ チドにより観察された（レーン３．４．６、及び７）。ペプチドは次の通りであ った：レーン１、競争ペプチドは添加されなかった。レーン２、ＧＳＧＬＴＮＩ ＫＴＥＥＩＳＥＶＫ　；　レ−ン３、　ＹＳＧＬＴＮＩＫＴＥＥＩＳ［！ＶＫＭ 　；　レ−＞　４、ＩＳＥＶＫＭ；　ｌ／　−ン５、旧ＳＥＶＫＭＤ　：　Ｌｉ 　−ン６、ＣＣｌ５ＥＶＫ　、レーン７、ＹＩＳＥＶＫＭｌ、１ＪＷ＝分子質量 マーカー（キロドルトンで示される）。

第４図は、種々の細胞系からのならし培地の免疫沈殿により得られた電気泳動ゲ ルパターンを表わすオー用−ラジオダラムである。ヒト胎児脳培養物により分泌 され、そして抗体９２（矢印でのレーン１１）により免疫沈殿された材料は明ら かに、抗体６０６（矢印でのレーン１０）により沈殿された材料よりも小さい。

抗体６ＣＧは、βＡＰの残基１−１６内のエビ）・−プを認識する。

第５図は正常な及びＳｗｅｄｉｓｈ　ＢＡＰＰの両者をコードするｃＤＮＡによ りトランスフエフ！−されたヒｈ　２９３細胞系からのならし培地の免疫沈殿に より得られた電気泳動ゲルパターンを表わすオートラジオグラトである。Ｓｗｅ ｄｉｓｈ　トランスフェクト細胞（レーン１１及び１２）により分泌されたＡＦ Ｔ−βへＰＰ材料の量は正常なＢＡＰＰ　）ランスフエクタント（レーン９及び １０）により生成された量よりも定性的に高い。

特定態様の記載 本発明は、前駆体タンパク質からの損なわれていないβ−アミロイドペプチド（ βＡＰ）領域の切断に起因するβ−アミロイド前駆体タンパク質（ＢＡＰＰ）の 新規分泌されたフラグメントの同定に起因する。その新規の分泌されたフラグメ ントは、そのような切断の後に残存するＢＡＰＰのアミノ末端部分を含んで成り 、そしてＢＡＰＰのアミノ末端フラグメント（ＡＴＦ−ＢＡＰＰ）としてこの後 、言及されるであろう。ＡＴＦ−ＢＡＰＰは、ＢＡＰＰのための他の分泌プロセ ッシング路の生成物であると思われており、ここで前記路は正常な（疾病を有さ ない）細胞に存在する。しかしながら、他の分泌路は患者における疾病細胞にお けるβＡＰの生成において必須の出来事を担当し、そして八ＴＦ−βＡＰＰの異 常生成はβＡＰプラークに関連する疾病、特にアルツハイマー病及びダウン症候 群に包含され得ると思われる。従って、本発明は、生物学的サンプルにお（プる ＡＴＦ−ＢＡＰＰの検出及び測定に基づいてＢＡＰＰの細胞プロセッシングをモ ニターするための方法及び組成物を提供する。

ＡＴＦ−ＢＡＰＰは、βＡＰ領域にすぐ隣接して存在し、そして正常なＢＡＰＰ のためには、カルボキシ末端メチオニン（下記に示されるように６９５イソフオ ームにおいてメチオニンｓｒ＠とじて番号を付与されている）を含む、ＢＡＰＰ の一定残基を含んで成るペプチドに対して発生せしめられた抗体に対する特異的 結合により同定され、そして認識される。そのペプチドは通常、少なくとも５個 までの連続残基を含み、モして残基８０Ｇを含み、そしてそのような抗体を生成 するための特定方法が下記に示される。

第１Ａ及びＪＢ図を参照すれば、ＢＡＰＰは、それぞれ６９５．７５１及び７７ ０個のアミノ酸を含んで成る３種のイソフオームで見出される。

６９５のイソフオームは神経細胞において最とも通常であり、そして７５１及び ７７０のイソフオームは６９５イソフオーム上での残基２８９での挿入に起因す る（６９５４ソフオームのすべての番号付けは、にａｎｇなど、（１９８７）　 Ｎａｔｕｒｅ　３２５：　７３３〜７３６に従っている）。ＡＴＦ−ＢＡＰＰは 、明らかに、　６９５イソフオームの残基５９６と５９７との間に位置する、β −アミロイドペプチド（βＡＰ）領域のアミ、ノ末端のアミノ末端側上の５つの 残基て又はその５つの残基以内での種々のβＡＰＰイソフオームのタンパク質分 解性切断に起因する。そのような切断は、通常メチオニン″９１、リシン５０５ 又はロイシン′９″であり、より通常にはメチオニン５０である、第１Ｂ図にＭ ＥＴ”　’及びＬＹＳ”！′として示される、Ｃ末端残基の暴露をもたらす。も ちろん、Ｃ末端残基は、ＡＴＦ−ＢＡＰＰが異なったβＡＰＰイソフオームから 誘導される場合、異なった番号付けを有することが認識されるであろう。特に、 Ｃ末端メチオニンはそれぞれ７５１及び７７０βＡＰＰイソフオームにおいて、 ＭＥＴ６５’及びＭＥＴ”　’であり、そしてＣ末端リシンはＬＹＳ”’及びＬ ＹＳ　”　’である。この後に使用される場合、メチオニン５０、リジン′１及 びロイシン５ｇ′は一般的に、ＢＡＰＰのすべての他のイソフオーム又は変異体 における対応する残基を言及するであろう。現在、ＡＴＦ　−ＢＡＰＰのＮ末端 残基はすべてのイソフオームにおけるＬＥＵ”であると思われる（βＡＰ領域内 で切断される分泌された形てのＢＡＰＰのアミノ末端のプロセッシングに基づく ）。

本発明によれば、ＡＴＦ−ＢＡＰＰは、種々の生物学的サンプル、たとえばイン ビトロサンプル、たとえば培養された細胞からのならし培地及びインビボ患者サ ンプル、典型的にはＣＳＦ、血液、血清、血漿、尿、組織及び同様のものにおい て検出され、モして／又は測定され得る。検出及び測定は、サンプルに見出され る他のβ−ＡＰＰフラグメントとＡＴＦ−ＢＡＰＰとを区別できるいづれかの技 法により達成され得る。便利には、免疫学的検出技法が、使用され得、ここでそ の技法は、βＡＰ領域の切断に基づいて暴露されるＡＴＦ−ＢＡＰＰのＣ末端残 基、たとえばメチオニン５９６、ロイシン５９６又はリシン１５に結合する、抗 体、抗体フラグメント又は他の同等の特異的結合物質を使用する。そのようなＣ 末端特異的抗体はＡＴＦ−ＢＡＰＰと関連するβＡＰＰフラグメントとの間で区 別できることが見出された。他方、免疫学的検出技法は、従来の技法を用いて、 単離され、そして精製されたＡＴＦ−ＢＡＰＰに基づかれている。Ｃ末端残基特 異的抗体及び精製され、そして単離されたＡＴＦ−ＢＡＰＰの両者の調製はこの 後に記載される。特に適切な検出技法は、ＥＬＩＳＡ、ウェスターンプロット、 ラジオイムノアッセイ及び同様のものを包含する。

ＡＴＦ−βＡＰＰ特異的抗体及び／又は競争抗原の使用を必要としない、ＡＴＦ −ＢＡＰＰを検出するための他の技法がまた、使用され得る。

たとえば、二次元ゲル電気泳動が、ＢＡＰＰの密接に関連する可溶性フラグメン トを分離するために使用され得る。次に、多くの又はすべてのフラグメントと交 叉反応する抗体が、ゲルをプローブするために使用され得、そしてＡＴＦ−ＢＡ ＰＰの存在はゲル上でのその正確な位置に基づいて同定される。ＡＴＦ−ＢＡＰ Ｐの検出のための他の技法はまた、当業者の技術の範囲内である。たとえば、β ＡＰのアミノ末端領域を含む分泌されたＢＡＰＰ種は、サンプルから免疫学的に 除去され、ＡＴＦ−ＢＡＰＰが単離され（第２Ａ図、レーン２及び第５図、レー ン１１及び１２を参照のこと）、次にこれは上記に論ぜられたいくつかの方法の いづれかにより検出され得る。

八ＴＦ−βＡＰＰに対して特異的な抗体は、メチオニン残基を含むＣ末端ＡＴＦ −βＡＰＰ配列を含んで成る適切な抗原又はハブテンに対して調製され得る。便 利には、合成ペプチドが、従来の固相技法により調製され、適切な免疫原に結合 され、そして従来の技法により抗血清又はモノクローナル抗体を調製するために 使用され得る。１つの適切な合成ペプチドは、βＡＰのすぐアミノ末端部位上に 位置し、そして免疫原に結合され、そして実験セクションに詳細に記載されるよ うに特定の抗体を調製するために使用されるＡＴＦ−βＡＰＰ（ＩｓＥＶＫＭ） の６個の残基から成る。池の適切なペプチドハブテンは通常、βＡＰのすぐアミ ン末端側上のβＡＰＰ内の少なくとも５個の連続した残基を含んで成り、そして ６個以上の残基を含むこともできる（但し、１６個のアミノ末端残基を含むペプ チドはほとんど特異的でない抗血清を生成することが見出されている）。正常な ＡＴＦ−βＡＰＰのカルボキシ末端の２５個の残基は次の通りである（単一文字 のアミノ酸名称を用いる）。

１）ＲＧＬＴ　ＴＲＰＧＳＧＬＴＮＩ　ＫＴＥＥＩＳＥＶＫＭ合成ポリペプチド ハプテンは、アミノ酸が成長路に連続的に付加される、良く知られたＭｅｒｒｉ ｆｉｅｌｄ固相合成技法により生成され得る（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　（＋９６ ３）　Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、　８５　：　２１４９〜２１５６）　。ア ミノ酸配列は上記ＡＴＦ−βＡＰＰの配列に基づかれており、又は天然に存在す る又は構築された変異配列を用いることができる。たとえば、Ｓｗｅｄｉｓｈ変 異体は、リジン１９ｓ−メチオニン６９６のために置換されたアスパラジン″９ ５−ロイシン１９６を有し、そして他の置換はメチオニン５９６　とロイシン５ ９′との置換のみを包含する。

十分な量のポリペプチドハプテンが得られたなら、それは、一般的（こ１（ｕｄ ｓｏｎ　ａｎｄ　Ｈａｙ、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｂｌａ ｃｋｗｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、　０ｘｆｏｒ ｄ、　Ｃｈａｐｔｅｒ　１．３．１９８０（これは引用により本明細書に組込ま れる）に記載されるようにして、適切な免疫原性キャリヤー、たとえば血清アル ブミン、キーホールリンペット（ｋｅｙｈｏｌｅｌｉｍｐｅｔ）ヘモンアニン、 他の適切なタンパク質キャリヤーに接合され得る。

十分な量の免疫原が得られたなら、ＡＴＦ−βＡＰＰがらβＡＰの切断に基づい て暴露されるＣ末端残基に対して特異的な抗体がインビトロ又はインビボ技法に より生成され得る。インビトロ技法は、免疫原へのリンパ球の暴露を包含し、そ してインビボ技法は適切なを椎動物宿主中への免疫原の注射を必要とする。適切 なを推動物宿主は、ヒトではなく、たとえばマウス、ラット、ウサギ、羊、ヤギ 及び同様のものを包含する。免疫原は予定されたスケジュールに従って動物中に 注射され、そ（−でその動物は改良された力価及び特異性を有する連続的な採血 を伴って定期的に採血される。注射は、筋肉内、腹腔内、皮下又は同様のものに 行なわれ、そしてアジュバント、たとえば不完全フロインドアジュバントが使用 されるであろう。

所望には、モノクローナル抗体は、所望する特異性を有する抗体を生成できる不 滅化された細胞系を調製することによって得られる。

そのような不滅化された細胞系は種々の手段で生成され得る。便利には、小を推 動物、たとえばマウスが上記方法により所望する免疫原により高度免疫化される 。次に、を推動物は通常、最終免疫化の数日後に殺害され、肺臓細胞が除かれ、 モして肺臓細胞が不滅化される。この不滅化の態様は臨界ではない。現在、はと んどの共通する技法は、Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　（１９７５ ）　Ｎａｔｕｒｅ　２５６　：　４９５〜４９７により最初に記載されているよ うに、骨髄腫細胞融合パートナ−との融合である。他の技法は、ＥＢＶ形質転換 、裸のＤＮＡ、たとえば癌遺伝子、レトロウィルス、等による形質転換、又は細 胞系の適切な維持及びモノクローナル抗体の生成を提供するいづれか他の方法を 包含する。モノクローナル抗体を調製するための特定の技法は、Ａｎｔｉｂｏｄ ｉｅｓ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｈａｒｌｏｗ　ａｎ ｄ　Ｌａｎｅ、　ｅｄｓ、、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　ｔｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ、　１９８８に記載されており、これは引例により本明細書に組 込まれる。

モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体（抗血清）の他に、本発明の検出技 法は、抗体フラグメント、たとえばＦ（ａｂ）、Ｆｖ　。

Ｖ　Ｌ　、Ｖ　ｕ及び他のフラグメントを用いることができるであろう。

現在十分に特許及び科学文献に記載されているように、組換え的に生成された抗 体（免疫グロブリン）及びその変異体を用いることもまた可能である。たとえば 、ＥＰＯ第８４３０２６８．０号、ＥＰＯ第８５１０２６６５．８号；　ＥＰＯ 第８５３０５６０４．２号；　ＰＣＴ／ＧＢ８５１００３９２号、ｉ：ｐｏ第８ ５１１５３１１．４号、ＰＣＴ／ＵＳ８６１００２２６９号、及び日本特許出願 第８５２３９５４３号（これらは引用により本明細書に組込まれる）を参照のこ と。上記のようにして調製された抗体の結合特異性をまねる他の組換えタンパク 質を調製することもまた可能である。

本発明はさらに、通常、実質的に純粋な形で得られる、単離され、そして精製さ れたＡＴＦ−βＡＰＰを含んで成る。“実質的に純粋な”とは少なくとも約５０ ％ｗ／ｗ（重量／重量）又はそれ以上の純度を意味し、そして妨害タンパク質及 び汚染物を実質的に有さない。好ましくは、ＡＴＦ−βＡＰＰは、５０％ｗ／ｗ 、好ましくは８０％ｗ／ｗ又はそれ以上の純度で単離又は合成されるであろう。

ＡＴＦ−βＡＰＰは従来のタンパク質精製技法により天然源から精製され、そし て少なくとも約５０％ｗ　／　ｗの純度の均質組成物が従来の免疫親和性分離技 法を用いて上記のようにして調製された抗体の使用により精製される。適切な天 然の出発材料は、ＡＴＦ−βＡＰＰ生成細胞系、たとえば胎児脳細胞培養物及び 同様のものからのならし培地を包含する。他方、ＡＴＦ−βＡＰＰはヒト宿主か ら得られた生物学的サンプル、たとえばＣ３Ｆ、血清及び同様のものから単離さ れ得る。適切なタンパク質精製技法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ ｏｇｙ、　Ｖｏｌ、１８２．　Ｄｅｕｔｃｈｅｒ、　ｅｄ、。

Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　１９９ ０（引用により本明細書に組込まれる）に記載される。

上記のようにして調製された、抗体及び精製ＡＴＦ−βＡＰＰは、β−アミロイ ド関連疾病のモニターのために生物学的サンプル、特にインビボ患者サンプルに おいて、及びβＡＰＰの細胞内プロセッシングをモニターするために細胞培養物 からのならし培地においてＡＴＦ−βＡＰＰを検出するために種々の従来の免疫 学的技法に使用され得る。適切な免疫学的技法は、イムノアッセイ、たとえばＥ ＬＩＳＡ、ウェスターンプロット分析、及び同様のものを包含する。多くの特定 の免疫学的検出技法が）Ｉａｒｌｏｗ　ａｎｄ　Ｌａｎｅ、前記に記載されてい る。

患者サンプルにおけるＡＴＦ−βＡＰＰのインビボ検出は、アルツハイマー病及 びβ−アミロイドプラーク沈着に関連する他の疾病、たとえばダウン症候群の診 断及びモニターのために使用され得る。適切な患者のサンプルは、Ｃ３Ｆ、血液 、血清、血漿、尿、組織及び同様のものを包含する。その疾病の存在は一般的に 、アルツハイマー病又は他のβ−アミロイド関連疾病を有さない正常な個人に比 較して、高レベルのＡＴＦ−β＾ＰＰ　、又は他の分泌されたβＡＰＰフラグメ ント（すなわち、βＡＰ領域内で又はその領域の方のカルボキシ末端で切断され たβＡＰＰフラグメント）の量に対するＡＴＦ−βＡＰＰの量の高い割合に関連 しているであろう。ＡＴＦ−βＡＰＰの量は、イソフオーム（たとえば６９５． ７５１又は７７０）及び／又はそのカルボキシ末端によりさらに定義された形（ たとえば、Ｅｓｃｈなどにより記載された部位で及び／又はその部位の方のカル ボキシ末端で切断された形）のいづれかて、ＡＰＰの他の種の量に比較され得る 。初期診断方法の他に、ＡＴＦ−βＡＰＰのレベルは、疾病の進行を追跡するた めに、及び処理の有効性を実質的に追跡するためにモニターされ得る。ＡＴＦ− βＡＰＰのレベルは効果的な処理法により低下することが予測される。

適切な細胞培養物からの培養培地におけるＡＴＦ−βＡＰＰレベルのインビトロ モニターは薬物のスクリーニングのために使用され得る。

培養培地中へのＡＴＦ−βＡＰＰの分泌をもたらす条件下で細胞を増殖し、そし てその細胞を試験化合物に暴露することによって、ＡＴＦ　−βＡＰＰ分泌に対 するそれらの試験化合物の効果が観察され得る。ＡＴＦ−βＡＰＰの量を減じる ことができる試験化合物は、βＡＰ形成のインヒビターとして試験のための候補 体であることが予測される。適切な細胞系は、ヒト及び動物細胞系、たとえば２ ９３ヒト・腎細胞系、ヒト神経膠細胞系、ヒｈＨｅＬａ細胞、−機内皮細胞（た とえば）ＩＬＩＶＢＣ細胞）、−次ヒト線維芽細胞又はリンパ芽球（βＡＰＰ変 異を有する患者に由来する内因性細胞を包含する）、−次ヒ［・混合脳細胞にュ ーロン、星状細胞及び神経膠を包含する）、チャイニーズハムスター卵巣（Ｃｉ （０）細胞、及び同様のものを包含する。ＡＴＦ−βＡＰＰのレベル又は割合を 選択的に高める細胞系は本発明の方法において特に有用である。

同様に、アルツハイマー病の動物モデル、たとえばＷＯ９１／１９８１０号に開 示されるマウスモデル（この開示は、引用により本明細書に組込む）におけるＡ ＴＦ−βへＰＰのインビトロモニターリングはまた、治療効果のために（通常、 インビトロスクリーンにより前もって同定されている化合物の試験のために）試 験化合物をスクリーンするためにも使用され得る。試験化合物は動物に投与され 、そしてＡＴＦ−βＡＰＰのレベル又は池のβＡＰＰフラグメントに対するＡＴ Ｆ−βＡＰＰの割合が観察される。ＡＴＦ−βＡＰＰのレベルを減じ、又は他の βＡＰＰフラグメントに対するＡＴＦ−βＡＰＰの割合を減じる化合物が追加の 評価のための候補体であると思われる。

試験化合物は、細胞の生存性を実質的に妨害しないで細胞培養物に添加され得る いづれかの分子、化合物又は他の物質であり得る。

適切な試験化合物は、小さな分子、生物学的ポリマー、たとえばポリペプチド、 ポリサツカリド、ポリヌクレオチド及び同様のものであり得る。試験化合物は典 型的には、約１ｎＭ−１１１ＩＭ、通常的１０μＭ〜１ｍＭの範囲の濃度で培養 培地に添加されるであろう。

ＡＴＦ−βＡＰＰの分泌を阻害できる試験化合物は、病原性細胞におけるβ−ア ミロイド生成をブロックする能力のさらなる決定のための候補体と（、て見なさ れる。分泌の阻害は、βＡＰのアミノ末端でのβＡＰＰの切断が少なくとも部分 的にブロックされ、β−アミロイドペプチドへの転換のために利用できるプロセ ッシング中間体の量を減じることを示す。

本発明は、細胞におけるβ−アミロイド生成を阻害するための方法をさらに含ん で成り、ここでその方法は、上記方法により選択された化合物を細胞に投与する ことを包含する。その化合物は、培養された細胞によりβＡＰ生成を阻害するた めに細胞培養物に添加され得る。その化合物はまた、アルツハイマー病及び他の βＡＰ−関連疾病に関連するアミロイドプラークの沈着を阻害するために患者に 投与され得る。

本発明は、上記方法により選択された化合物を組込み、そして医薬的に許容でき るキャリヤーを含む医薬組成物をさらに含んで成る。

そのような医薬組成物は、本発明の方法により同定された少なくとも１種の化合 物の治療又は予防量を含むべきである。医薬的に許容できるキャリヤーは、意図 される宿主に化合物を供給するのに適切ないづれかの相溶性非毒性物質であり得 る。滅菌水、アルコール、脂肪、ロウ、及び不活性固体がキャリヤーとして使用 され得る。医薬的に許容できるアジュバント、緩衝剤、分散剤、及び同様のもの がまた、医薬組成物中に導入され得る。活性剤を組込む医薬条件の調整は、医学 及び科学文献に十分に記載されている。たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐ ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ ｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ。

Ｅａｓｔｏｎ、　Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉａ、　１６ｔｈ　Ｅｄ、、　１９８２ 　（この開示は引用により本明細書に組込まれる）を参照のこと。

上記医薬組成物は、非経口、局部及び経口投与を包含する、宿主／”Ｎの全身投 与のために適切である。その医薬組成物は非経口的に、すなわち皮下、筋肉内又 は静脈内投与され得る。従って、本発明は宿主への投与のための組成物を供給し 、ここに前記組成物は上記のように、許容できるキャリヤーにおける同定された 化合物の医薬的に許容できる溶液を含んで成る。

時々、脳に直接的又は間接的に前記医薬組成物を導入することが所望され又は必 要であろう。直接的な技法は通常、血液−脳バリヤーをバイパスするために宿主 の心室システム中に薬物供給カーチーチルの配置を包含する。一般的に好ましい 間接的な技法は、脂質可溶性薬物への親水性薬物の転換により薬物潜在性を提供 するために組成物を配合することを包含する。潜在性は一般的に、薬物をより脂 質可溶性にするために薬物上に存在し、そして血液−脳／（リヤーを通しての輸 送を受けやすい、ヒドロキシル、カルボキシル及び第一アミン基のブロックを通 して達成される。他方、親水性薬物の供給は、血液−脳バリヤーを一時的に開放 てきる高張液の動脈内注入により高められ得る。

医薬キャリヤーにおける化合物の濃度は広く変化し、すなわち医薬組成物の約０ ．１重量％〜約２０重量％又はそれ以上である。筋肉内注射のための局部医薬組 成物は、たとえば１〜４ｏ＋ｌの滅菌した緩衝水及び本発明の方法により同定さ れた化合物ｌμｇ−１１Ｉｇを含むように製造される。静脈内注入のための局部 組成物は、滅菌リンガ−溶液１００〜５００ｍ１及び前記化合物的１−１００ｍ ｇを含むように製造され得る。

本発明の医薬組成物は、βＡＰの沈着に関連する疾病、たとえばアルツハイマー 病及びダウン症候群の予防的及び／又は治療的処置のために投与され得る。治療 的適用において、医薬組成物は、疾病をすてに有する宿主に投与される。医薬組 成物は、βＡＰプラークのさらなる沈着を阻止するのに十分な量で投与されるで あろう。これを達成するために適切な量は、“治療的有効量”として定義される 。

そのような有効量は疾病の程度、宿主の大きさ及び同様のものに依存し、そして 一般的には、約０．Ｏ１μｇ−１０ｍｇの化合物／宿主の体重１ｋｇの範囲であ り、そして０．１μｇ−１ｍｇ／　ｋｇの用量がより通常には使用される。

予防的適用のためには、本発明の医薬組成物はβＡＰ疾病に対して敏感ではある が、しかしそのような疾病をすでに有さない宿主に投与される。そのような宿主 は、医学文献に記載されているように、遺伝的スクリーニング及び臨床的分析に より同定され得る。その医薬組成物はひしように初期段階てβＡＰプラークの沈 着を阻害又は妨げることができ、好ましくはβ−アミロイド疾病の初期段階さえ も防止するであろう。予防的有効量として言及される、そのような予防的処置の ために必要とされる化合物の量は一般的に、治療的処置のために記載された量と 同じである。

次の例は例示的目的により示されており、本発明を制限するものではない。

実験 材料及び方法 １、抗体及び親和性マトリックスの調製モノクローナル抗体６Ｃ６を、免疫原と してウサギ血清アルブミンに接合されたβＡＰ残基１−２８を含む合成ペプチド を用いて、抗体１０Ｄ５（Ｈｙｍａｎなど、（１９９２）　Ｊ、Ｎｅｕｒｏｐａ ｔｈ、Ｅｘｐ、Ｎｅｕｒｏｌ、　５１　：　７６）と同じ態様で発生せしめ、そ してスクリーンした。１０Ｄ５及び６Ｃ６の両者は、β＾Ｐ配列の初めの１６個 のアミノ酸内のエピトープを認識する。６Ｃ６は免疫沈殿における１ＯＤ５より もより効果的であり、そして捕獲抗体として使用された。６Ｃ６樹脂を調製する ために、４ｍｌのＡｆｆｉｇｅｌ■１０（旧ｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ ｅｓ、　ｌ−１ｅｒｃｕｌｅｓ、　ＣＡ）を冷水により洗浄し、ツブリングは軽 い振盪を伴って４℃で一晩、進行した。次に、４００μｍのＩＭのトリス（ｐＨ ８，０）を添加し、そして振盪を４０分間続けた。次に、樹脂を、使用する前、 ＴＴＢＳ（１３７ｍＭのＮａ、ＣＩ、５　ｍＭのＫＣＩ、　２５ｍＭのトリス、 ０．５％のＴｗｅｅｎ０２０．　ｐｔ＋　７．５）により徹底的に洗浄した。抗 体７）１５はまた、　Ｈｙｍａｎなど、　（１９９２）前記に記載される。

抗体（抗体９２と称する）を、βＡＰＰの残基５９１−５９６を含む合成ペプチ ドに対して発生せしめた（Ｋａｎｇなど、　（１９８７）前記において番号を付 けられている）。ペプチド（Ｎ−アセチル−ＣＩＳＥＶＫＭ）を、免疫原を形成 するためにスルホ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエス テルにより活性されたウサギ血清アルブミンに接合した。抗血清を、標準方法論 によりウサギにおいて免疫原に対して生成せしめた。個々の接種の間、ウサギは 、約ｌＯの部位で０．１ｍｌの皮下注射において免疫原５μｇを受けた（５０Ｍ ｇ／追加免疫）。上記と同しペプチドを、　ＩｇＧ画分からの抗体の親和性精製 のためにＳｕｌｆｏ−１ｉｎｇ（ＴＭ）ゲル（Ｐｉｅｒｃｅ　ＣｈｅＩＩｉｃａ ｌ　Ｃｏ、、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　ＩＬ）に結合した。

抗体９２の調製の詳細な説明は次の通りである。ウサギ血清アルブミン（］、２ ２．３ｍｇを、１．２５ｍ１の０．０５ＭのＫＨｌＰＯｌ　ｃｐＨ７，０）中、 １３Ｈのスルホ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステ ルと共に０℃で２０分間インキュベートした。次に、その混合物をすぐに、リン 酸緩衝液により平衡化された５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−４０の１×７５ｃｍカラム 上でゲル濾過にゆだねた、排除された体積のタンパク質溶離物をプールし、そし てすぐに、標準の自動化された固相方法論により合成されたＮ−アセチル−ＣＩ ＳＥＶＫＭペプチド３０ｍｇと共に組合した。カップリング反応（２ｆ）ｕ＋１ の体積）を−晩進行せしめ、そして他に、抗体発生のために商業的施設に送った 。注射方法は、等体積の完全フロインドアジュバントに抗原を乳化すること及び 約１０の部位に０．１ｍｌのアリコートにおいて合計５０μｇの抗原を皮下注射 することである。その後、３週間ごとに、追加免疫注射を同一の手段により与え 、但し、不完全フロインドアジュバントを乳化剤として使用した。ウサギを個々 の注射の後、１週間後、採血し、そして血清をＥＬＩＳＡにおけるペプチドへの 反応により力価について試験した。

ＩｇＧを、５０％の（ＮＨυｌ５ＯＩ（２Ｘ）による沈殿化により陽性反応血清 から精製し、そしてＰＢＳに対して透析した。Ｎ−アセチル−ＣＩＳＲＶＫＭペ プチドを、そのペプチドに対して特異的な抗体を精製するために、親和性樹脂を 生成するための製造業者の推薦を用いてＳｕｌｆｏ−１ｉｎｋ（ＴＭ）ゲル（Ｐ ｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）に接合し た。　ＩｇＧ画分を前記カラムに適用し、そしてＰＢＳにより非特異的に結合さ れた材料を通して洗浄した後、抗体をＯ，１ＭのグリシンｐＨ２，５及び０．５ 〜１のＮａＣｌにより溶離し、そして凍結の前、ＰＢＳを通して透析した。

２、ヒト胎児脳細胞培養物 胎児ニューロン組織検体を、生後１２〜＋４ａ目の胎児死骸から得た。

脳皮質のサンプルをハンクス液（ＩＩＢｓｓ）により２度、すすいだ。皮質組織 （２〜３ｇ）を、１ｍｇのＤＮａｓｅ　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ 、、　Ｓｔ。

Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯＤ３４２７）が添加されている冷ＨＢＳＳ　ｌ０ｍ１に置い た。粉砕された懸濁液を、２１０μｍ及び１３０μｍのＮ１ｔｅＸナイロンスク リーンを通して、Ｐｕｌｌｉａｍなど、（１９８４）　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、Ｍｅｔ 、　９　：　３０１により記載されているようにして濾過した。

細胞を遠心分離により収穫し、そしてニューロン媒体（１０％ウシ胎児血清、１ ％グルコース、１ｍＭのＮａｐｙｒｕａｔｅ、］　ｍＭのグルタミン、２０＋ｎ ＭのＫＣＩにより強化されたＭＥＭ）に再懸濁した。ポリエチレンイミンにより 被覆された１００ｍｍの皿に、ニューロン培地８ｍｌにおける１、５ＸＩＯ“個 の細胞を接種した。培地は１適当たり２度交換された。この研究におけるすべて の培養物は少なくとも３０日、インビトロで増殖された。血清を含まない増殖条 件のためには、培養物を定義された培地（５μｇ／ｍｌのウシインシュリン：　 ０．Ｉｒｎｇ／ｍＩのヒトトランスフェリン；　Ｏ，ｉｏ＋ｇ／ｍｌのＢＳＡ画 分Ｖ　；　０．０６２μｇ／ｍｌのプロゲステロン；　１．６μｇ／ｍｌのプト レッシン；　０．０３９μｇ　／ｍｌの亜セレン酸ナトリウム、０．０４２μｇ ／ｍｌのチロキシン及び０．０３３μｇ／ｍｌのトリヨード−Ｌ−チロニン）中 に移し、そして３日後、その上清液を収穫した。

前記細胞からのならし培地（１０ｍｌ）を収穫した。ＥＤＴＡ　（５ｍＭ）、ロ イペプチド（ｉｏμｇ／ｍｌ）及びトリス−ＨＣＩ（２０ｍＭ、　ｐｌ＋　８． ０）を、示された最終濃度で個々の１０ｍ１のサンプルに添加し、そしてそのサ ンプルを３０．０００　Ｘ　ｇで４℃で２０分間、回転せしめた。得られた上清 液を２つの等しいアリコートに分け、６Ｃ６樹脂を前記アリコートの１つに添加 した（２００μｌの樹脂及び約５＋ｎｇ／ｍ！の結合された６０６）。

両アリコートを４℃で６時間、軽く混合し、樹脂をペレット化し、そして第２の ２００μＩのアリコートの樹脂を添加した。サンプルを４８Ｃで一晩、さらに混 合した。その組合された樹脂をＴＴＢＳにより２度洗浄し、次にすぐに、０．１ Ｍのグリシン、０．１ＭのＮａＣＩのアリコート　（ｐｌ＋　２．８）　１　ｍ ｌにより２度抽出した。

樹脂から抽出された材料、樹脂により消耗された培地及び出発材料を、ｌＯ％Ｔ ＣＡ（１−リクロロー酢酸）により０℃で１時間、それぞれ沈殿せしめ、ペレッ トをアセトンにより洗浄し、そして次に、減圧下でＳＤＳ　−ＰＡＧＥサンプル 緩衝液１５０μｍに再懸濁し、そして煮沸した。個々のサンプル（２５μｌ）を 、１０〜２０％のトリシンゲル（Ｎｏｖｅｘ）を用いて５ＤＳ−ＰＡＧＥにゆだ ねた。タンパク質を４０Ｖで一晩、ＰｒｏＢｌｏｔＰＶＤＦ膜に移した。免疫反 応性タンパク質の可視化は、へＭＰＰＤ基質について製造業者の指図に従ってＴ Ｒ０Ｐ！Ｘ化学発光システムを用いた。

使用される一次抗体濃度は、抗−５，Ｏ，ｌμｇ／ｎｌ；９２，２μｇ／ｍｌ　 ；　１００５．　２　ｕ　ｇ／ｍｌ。

３、ヒト２９３細胞の培養 ヒｌ−２９３細胞（ＡＴＣＣＮｏ、　ＣＲＬ−１５７３）を変性し、八ＰＰを過 剰発現せしめた（Ｓｅｌｋｏｅなど、（１９８８）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５　：　７３４１）。

細胞を、使用する前、１０ｃｍの皿において半集密性（ｓｕｂｃｏｎｆ　１ｕｅ ｎｃｙ）に増殖せしめた。代謝ラベリング及び免疫沈殿を、０１　ｔｅｒｓｄｏ ｒｆなど。

（１９８９）ＮａＬｕｒｅ　３４１　：　１４４及び（＋９９０）　Ｊ、Ｂｉｏ ｌ、Ｃｈｅ＋ｎ、　２６５　：　４４９２に記載されているようにして実質的に 行なった。手短に言及すれば、ラベリングは１０ｃｍの皿において行なわれた。

細胞をメチオニンを有さない培地で洗浄し、０．５ｍＣ１の３５Ｓ−メチオニン により補充されたメチオニンを有さない培地２ｍｌにおいて２０分間、インキュ ベートし、完全な培地により洗浄し、完全な培地３＋ｎｌにおいて２時間、追跡 した。ならし培地を集め、そして３０００Ｘ　ｇで１０分間透明にし、続いてプ ロティンＡ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ　（Ｒ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｐｉｓｃａ ｔａｗａｙ、　ＮＪ）により予備吸収せしめた。免疫沈殿は、サンプル当たり１ ．５ｍｇのプロティンＡ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ　（Ｒ）により行なわれた。抗体 抗−５はサンプル当たり２μｇで使用され；　６Ｃ６，７Ｈ５及び９２はサンプ ル当たり１０μｇで使用された。５μｇのウサギ抗マウスＩｇＧは、６Ｃ６及び ７１１５と共に並びに対照サンプルにおいて使用された。沈殿物を、Ｔ［］Ｓ　 （１３７ｄのＮａＣＩ　。

５ｍＭのＫＣｌ、２５ｎ＋Ｍのトリス、ｐＨ７，５）、　０．１％のＮＰ４０． 　５　ＩＩＩＭのＥＤＴＡ。

１ｍＭのＰＭＳＦ、　ＩＯｕ　ｇ／ｍｌの口・イペブチンにより４度洗浄した。

ＳＯ３−ＰＡＧＥは５％Ｌａｅｍｍｌ　ｉゲル上で行なわれた。

４、　Ｓｗｅｄｉｓｈ変異によりトランスフェクトされたヒト２９３細胞の培養 ヒト腎臓２９３細胞の６つのウェルトレーにおける二重ウェルを、製造業者（Ｂ ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　ＭａｎｎｈｅｉＩｌｌ）により記載されるようにして、Ｄ ＯＴＡＰ介在トランスフェクンヨンを用いて正常なヒトβＡＰＰ又はＳｗｅｄ　 ｉ　ｓｈ変異体βＡＰＰのいづれかを発現するプラスミドベクターにより一般的 にトランスフェクトした。４０時間後、細胞を、１０％ウシ胎児血清を含む、メ チオニンを含まないＤＭ［！中に置き、そして２０分後、それらを２００μＣｉ ／ｍｌの１ｉｓ−メチオニンにより３５分間ラベル化した。次に、細胞を、１０ ％ウシ胎児血清を含む正常なりＭＥ培地中に戻し、そしてさらに２．５時間イン キュベートした。培地を細胞から集め、そして１１０００Ｘて１５分間、回転せ しめ、すべての細胞を除いた。上清液を半分に分け、そして半分を標準方法によ り抗−５抗体により免疫沈殿した。他の半分をアガロース結合された６Ｃ６抗体 と共に一晩インキュベートし、そして６Ｃ６アガロースに結合された材料を遠心 分離により分離した。残る材料を抗−５抗体により免疫沈殿せしめた。全体の抗 −５免疫沈殿物（α５＋）、６Ｃ６結合された沈殿物（６Ｃ６＋）及び６Ｃ６非 反応性、抗−５反応性免疫沈殿物（６Ｃ６−。

α５＋）を、５％Ｌａｅｍｍｌｉゲルにかけ、そして免疫反応性タンパク質をオ ートラジオグラフィーにより可視化した。

実験的な図面の記載 第２図：ヒト混合された脳細胞培養物からのならし培地における切断されたβＡ ＰＰの表示 すンプルｌは、培養物からのならし培地であり；サンプル２は６Ｃ６−反応性β ＡＰＰを消耗された培地であり；そしてサンプル３は６Ｃ６樹脂から抽出された 材料である。パネルＡを、βＡＰＰ配列４４４−５９２（０１ｔｅｒｓｄｏｒｆ など、（１９８９）前記及び（１９９０）前記）に対して生ぜしめられた抗−５ 抗体によりプローブした。パネルＢを、材料及び方法セクションに記載されるよ うに抗９２によりプローブした。パネルＣを、材料及び方法セクシミンに記載さ れるようにβＡＰ残基１−１６内のエピトープを認識するモノクローナル抗体１ ０Ｄ５によりプローブした。Ｃ２及びＣ３において観察された低分子量バンドは 、ＣＩには見出されず、そして６Ｃ６樹脂から誘導され、そして−次抗体には無 関係なりギー抗−マウスＩｇＧアルカリホスファターゼ接合体により認識される （データは示されていない）。

第３図：９２抗体の特異性 ７５才の男性から得られたヒト腰動脈Ｃ３Ｆ検体１ｍｌを、１０％ＴＣＡにより 沈殿せしめ、１０倍の濃度をもたらし、そして第２図に記載されるようにして処 理した（但し、ゲルウェルは４ｃｍのスロットであった）。９２抗体を、軽く混 合しながら、４℃で１０時間、それぞれ約６０μＭの濃度で、種々の可能性ある 競争ペプチドの存在下でＴＴＢＳｏ、５ｍｌ中、６．７μｇ／ｒｎｌに希釈した 。次に、抗体を１％ゼラチン／ＴＴＢＳにおいて８倍に希釈し、その後、Ｃ３Ｆ 由来の材料のプロットのストリップと共にインキュベートし、そして第２図に記 載されているようにして処理した。競争ペプチドは次の通りであった：レーンｌ 、競争ペプチドは添加されなかった；Ｌ／−ン２、ＧＳＧＬＴＮＩＫＴＥＥＩＳ ＥＶＫ　。

レーン３、　ＹＳＧＬＴＮＩＫＴＥＥＩＳＥＶＫＭ　、レーン４、ＩｓＥＶＫＭ 　、レーン５、ＥＩＳＥＶＫＭＤ　；　レ−ン６、ＣＣｌ５ＥＶＫ　；　レ−ン ７、Ｙ［ＳＥＶＫＭ、　１ｆｆ＝分子質量マーカー（キロドルトンで示される） 。

抗体、抗−５：レーン３．　６．　９．６Ｃ６（β＾Ｐペプチド残基１−１６に 対して検出された）：レーン４，７，１０：抗体９２（ＡＰＰアミノ酸５９１− ５９６に対する）；レーン５．　８．１１；７Ｈ５（ＡＰＰ−ＫＰＩに対する） ；レーン１２゜細胞：左側のパネル（レーンｌ及び３−５　）　：　ＡＰＰ６９ ５により安定してトランスフェクトされた２９３細胞；中間のパネル（レーン２ 及び６−８　）　：　ＡＰＰ７５１により安定してトランスフェクトされた２９ ３細胞１左側のパネル（レーン９−１３）：ヒト胎児脳培養物。

対照、レーンｌ、２及び１３：ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体。矢印；抗体６Ｃ６及 び９２により認識される分泌される形のＡＰＰ間での分子質量差異の例。５ＤＳ −ＰＡＧＥは５％Ｌａｅｍｍｌｉゲル上で行なわれた。ＭＷ＝分子質量マーカー （キロドルトンにより示される）。

第５図：　Ｓｗｅｄｉｓｈ変異によりトランスフェクトされたヒト２９３細胞か らのならし培地における切断されたβＡＰＰの表示第５図は正常な形及びＳｗｅ ｄｉｓｈ形の両者のために二重Ｉ・ランスフエクションからの結果を示す。レー ン１−４はα５＋であり；レーン５−８は６Ｃ６＋であり：そしてレーン９−１ ２は６Ｃ６−、α５＋サンプルである。レーン１．　２．　５．　６．　９及び １０は正常なβＡＰＰからであり、レーン３，４，７，８．１１及び１２はＳｗ ｅｄｉｓｈβＡＰＰからである。そのＳｗｅｄｉｓｈ変異は、高められたＡＦＴ −αＡＰＰの生成をもたらし、そしてレーン１１及び１２はレーン９及びＩＯよ りも一層のＡＴＦ　−βＡＰＰ材料を含む。

結果 残基１−１６内のβＡＰのエピトープを認識するモノクローナル抗体６Ｃ６を、 種々のサンプルからの一定のβＡＰＰフラグメントを免疫消耗するために使用し た。モノクローナル抗体６Ｃ６を樹脂（上記のような）に結合し、そして上記の ようにして、ヒト胎児脳細胞培養物からのならし培地と共にインキュベートした 。第２図、レーンＣ２に見られるように、この樹脂は細胞培養物のならし培地か らのβへ８１−６を含むβＡＰＰを効果的に除く。しかしながら、実質的なβＡ ＰＰ免疫反応性は、βＡＰ領域側のエピトープＮ末端に対して向けられた抗−５ 抗体により検出されるように樹脂により捕獲されない。

βＡＰＰのこの明らかに新規の形を特徴づけるために、本発明者は、βＡＰＰ残 基５９１−５９６を含む合成ペプチドに対する抗体を生成した。

この抗体（９２と称する）は、樹脂により捕獲されないβＡＰＰの種を認識する ことが見出されたが（第２図、レーンＢ２）、しかし驚くべき事には、βＡＢＩ −６配列を含むβＡＰＰの分泌形と反応しなかった（レーンＢ３）。

交叉反応性のこの欠乏についての説明は、９２抗体が残基５９６に対応する、カ ルボキン−末端メチオニンを含むβＡＰＰにおけるエピトープを認識することを 示す。従って、本発明者は、９２により生成される免疫反応性をブロックする種 々の合成ペプチドの能力を試験する。第３図に見出されるように、メチオニン５ ９６の同等物で終る、βＡＰＰ配列基材のペプチドは９２の反応を実質的にブロ ックし、そしてそれらのカルボキシ末端で１つのアミノ酸よりも長いか又は短い ペプチドは競争において比較的効果的ではない。ペプチド競争の同しパターンが 細胞培養物上清液（データは示されていない）及びＣ３Ｆにおいて観察された。

一連のパルス−追跡実験は、検出される量の抗体９２免疫沈殿可能材料がβＡＰ Ｐの６９５又は７５１イソフオームのいづれかを過剰発現する２９３細胞により 生成されることを示した（第４図、レーン５及び８）。ヒト胎児脳細胞培養物に 対する類似する実験は、９２免疫沈殿可能性材料が低％（５％）の５ＤＳ−ＰＡ ＧＥにより６ＤＳ反応性βＡＰＰから溶解され得ることを示す（第４図、レーン ９−１１）。胎児脳細胞培養物においては、ｘｕｎｔｔｚプロテアーゼ阻害ドメ イン（にＰＩ）−含有βＡＰＰ形の他のプロセッシングはほとんど明白ではなく 、但し、薄い同時移動性バンドが抗体９２及び抗−ＫＰＩ抗体７Ｈ５免疫沈殿に より観察された（レーン１１．１２）。

混合された脳培養物に抗体９２及び６Ｃ６沈殿性材料の溶解する能力は、２９３ 細胞におけるその位置に比較して生成されるそれぞれの形のほぼ等しい量に少な くとも部分的に依存する。Ｒｓｔｕｓなど、　（１９９２）前記は、他の組織に 比較して、ヒト脳は、サイズに基づいて、βＡＰのアミン末端で又はその近くて 開始すると思われる、比較的多量の実質的にアミロイド原性カルボキシ末端フラ グメントを含むことを観察した。

抗体９２及び６Ｃ６沈殿可能βＡＰＰ材料の出現の一時的な一致は、特に長い追 跡時間が９２及び６Ｏ６反応性種の割合の著しい変化をもたらさないので（デー タは示されていない）、分泌後に生じる第２のタンパク質分解性出来事の見込み に反対の議論を示す。それらの種の免疫学的交叉反応性の完全な欠乏と組合され る、５Ｏ３−ＰＡＧＥによる分泌形の分析は、他の分泌経路の存在をさらに示す 。他の切断部位は、β−セレクターゼ部位と称され、それは切断がβＡＰ内に生 じる、Ｅｓｃｈなど、　（１９９０）前記により記載される切断とは異なった、 βＡＰのアミン末端で生じることを強調する。

前述の発明はより理解するために詳細に記載されて来たが、ある一定の変更が本 発明の範囲内で実施され得ることは明らかであろう。

ＦＩＧ２Ａ、　ＰＩ６．　２Ｂ、　帛２ＣＷ ＦＩＧ、　３゜ ２０〇− ＦＩＧ　イ ＦＩＧ、５゜ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号／／　Ｃ１２Ｎ　１５１ ０２ （Ｃ１２Ｐ　２１１０８ Ｃ１２Ｒ１：９１） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＰＴ、　Ｓ Ｅ）、　ＡＵ、　ＣＡ、　Ｆｌ、ＪＰ、　ＮＯ，ＮＺ （７２）発明者　セウバート、ピータ−ニー６アメリ力合衆国、カリフォルニア 　９４０８０゜サウス　サンフランシスコ、ノースウッドドライブ　２２２ Ｉ （７２）発明者　シェンク、ディル　ビー。

アメリカ合衆国、カリフォルニア　９４０４４゜パシイフィカ、シャープ　パー ク　ロード（７２）発明者　フリッツ、ローレンス　シー。

アメリカ合衆国、カリフォルニア　９４１２７゜サンフランシスコ、アップラン ド　ドライブ１７０

Claims (43)

【特許請求の範囲】
1. １．細胞におけるβ−アミロイド前駆体タンパク質（βＡＰＰ）のプロセッシン グをモニターするための方法であって、前記細胞から分泌される可溶性βＡＰＰ フラグメントを検出することを含んで成り、ここで前記βＡＰＰフラグメントが β−アミロイドペプチド（βＡＰ）のアミノ末端でのβＡＰＰの切断に起因する 方法。
2. ２．前記切断がβＡＰ側の方に向かって連続した５個の残基領域のアミノ末端内 で生じる請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．前記切断がメチオニン５９６又はリシン５９６で生じる請求の範囲第２項記 載の方法。
4. ４．前記切断がメチオニン５９６で生じる請求の範囲第３項記載の方法。
5. ５．前記切断がロイシン５９６で生じる請求の範囲第２項記載の方法。
6. ６．前記βＡＰＰフラグメントが、βＡＰＰからのβ−アミロイドペプチドの切 断により暴露された、前記フラグメント上のＣ−末端残基に特異的に結合する物 質への暴露により検出される請求の範囲第１項記載の方法。
7. ７．前記βＡＰＰフラグメントが患者サンプルにおいて検出される請求の範囲第 １項記載の方法。
8. ８．前記患者サンプルが脳脊髄液である請求の範囲第７項記載の方法。
9. ９．前記βＡＰＰフラグメントが細胞培養物からのならし培地において検出され る請求の範囲第１項記載の方法。
10. １０．生物学的サンプルにおけるβ−アミロイド前駆体タンパク質（βＡＰＰ） の分泌されたフラグメントの存在を検出するための方法であって、βＡＰＰから のβ−アミロイドペプチド（βＡＰ）の切断により暴露されている、分泌された フラグメント上のＣ末端領域に特異的に結合する物質に前記サンプルを暴露し； そして前記物質と前記分泌されたフラグメントとの間の結合を検出することを含 んで成る方法。
11. １１．前記Ｃ末端残基がβＡＰ側の方に向かって連続した５個の残基領域のアミ ノ末端内に存在する請求の範囲第１０項記載の方法。
12. １２．前記Ｃ末端残基がメチオニン５９６又はリシン５９６である請求の範囲第 １１項記載の方法。
13. １３．前記Ｃ末端残基がメチオニン５９６である請求の範囲第１１項記載の方法 。
14. １４．前記Ｃ末端残基がロイシン５９６である請求の範囲第１１項記載の方法。
15. １５．前記サンプルが、βＡＰＰからのβ−アミロイドペプチドの切断により暴 露されたＣ−末端残基に対して特異的な抗体に暴露される請求の範囲第１０項記 載の方法。
16. １６．前記Ｃ末端残基がメチオニンである請求の範囲第１５項記載の方法。
17. １７．前記Ｃ末端残基がロイシンである請求の範囲第１５項記載の方法。
18. １８．前記抗体が、暴露されている残基５９６を伴って、βＡＰＰの残基５９１ 〜５９６を含んで成るペプチドに対して生ぜしめられている請求の範囲第１５項 記載の方法。
19. １９．前記生物学的サンプルが患者サンプルである請求の範囲第１０項記載の方 法。
20. ２０．前記患者サンプルが脳脊髄液である請求の範囲第１９項記載の方法。
21. ２１．前記生物学的サンプルが細胞系からのならし培地である請求の範囲第１０ 項記載の方法。
22. ２２．患者におけるβ−アミロイド関連疾病を診断又はモニターするための方法 であって、 β−アミロイド前駆体タンパク質（βＡＰＰ）の分泌されたフラグメントの量又 は割合を患者サンプルにおいて測定し、ここで前記βＡＰＰフラグメントがβ− アミロイドペプチドのアミノ末端でのβ−ＡＰＰの切断に起因する方法。
23. ２３．前記切断がβＡＰ側の方に向かって連続した５個の残基領域のアミノ末端 内で生じる請求の範囲第２２項記載の方法。
24. ２４．前記切断がメチオニン５９６、ロイシン５９６又はリシン５９６で生じる 請求の範囲第２３項記載の方法。
25. ２５．前記切断がメチオニン５９６で生じる請求の範囲第２４項記載の方法。
26. ２６．前記患者サンプルが脳脊髄液である請求の範囲第２２項記載の方法。
27. ２７．分泌されたフラグメントの測定された量又は割合と正常な患者に特徴的な 量とを比較することをさらに含んで成り、ここで高められたβＡＰＰの量又は割 合がアルツハイマー病の診断である請求の範囲第２６項記載の方法。
28. ２８．前記βＡＰＰフラグメントが、β−アミロイドペプチドのアミノ末端での ＡＰＰの切断により暴露された、前記フラグメント上のＣ−末端残基に特異的に 結合する物質への暴露により測定される請求の範囲第２２項記載の方法。
29. ２９．β−アミロイド生成インヒビターを同定するための方法であって； β−アミロイド前駆体タンパク質（βＡＰＰ）のフラグメントの分泌をもたらす 条件下で細胞を培養し、ここで前記βＡＰＰフラグメントがβ−アミロイドペプ チドのアミノ末端でのβＡＰＰの切断に起因し；前記培養された細胞を多くの試 験化合物に暴露し；そして分泌されたβＡＰＰフラグメントの量の変化を引き起 こす試験化合物を同定することを含んで成る方法。
30. ３０．前記細胞が培養されたヒト胎児脳細胞である請求の範囲第２９項記載の方 法。
31. ３１．前記試験化合物が１ｎＭ〜１ｍＭの濃度で暴露される請求の範囲第２９項 記載の方法。
32. ３２．前記試験化合物が小分子を含んで成る請求の範囲第２９項記載の方法。
33. ３３．前記試験化合物が生物学的ポリマーを含んで成る請求の範囲第２９項記載 の方法。
34. ３４．β−アミロイドペプチドのアミノ末端で切断される、β−アミロイド前駆 体タンパク質（βＡＰＰ）の分泌されたフラグメントに特異的に結合する抗体分 子を含んで成る抗体組成物。
35. ３５．前記分泌されたフラグメントがβＡＰＰからのβＡＰのインビボ切断に起 因し、Ｃ末端メチオニン又はロイシンの暴露をもたらす請求の範囲第３４項記載 の抗体組成物。
36. ３６．前記抗体分子が損なわれていない免疫グロブリンを含んで成る請求の範囲 第３４項記載の抗体組成物。
37. ３７．前記抗体分子が免疫グロブリンフラグメントを含んで成る請求の範囲第３ ４項記載の抗体組成物。
38. ３８．前記抗体分子がβＡＰＰの少なくとも残基５９１−５９６を含んで成るペ プチドに対して生ぜしめられる請求の範囲第３４項記載の抗体組成物。
39. ３９．前記ペプチドに対して生ぜしめられた抗血清を含んで成る請求の範囲第３ ８項記載の抗体組成物。
40. ４０．精製され、そして単離された形でのβ−アミロイド前駆体タンパク質（β ＡＰＰ）の可溶性フラグメントであって、前記フラグメントが損なわれていない βＡＰＰからのβ−アミロイドペプチドの切断に起因するＣ末端メチオニン又は ロイシンを有することを特徴とする可溶性フラグメント。
41. ４１．脳脊髄液及び培養された細胞からのならし培地から成る群がら選択される 天然源から単離される請求の範囲第４０項記載の可溶性フラグメント。
42. ４２．βＡＰＰイソフォーム６９５の残基１８−５９６、βＡＰＰイソフォーム ７５１の残基１８−６１２、又はβＡＰＰイソフォーム７７０の残基１８−６７ １から実質的に成る請求の範囲第４１項記載の可溶性フラグメント。
43. ４３．βＡＰＰイソフォーム６９５の残基１８−５９５、βＡＰＰイソフォーム ７５１の残基１８−６１１又はβＡＰＰイソフォーム７７０の残基１８−６７０ から実質的に成る請求の範囲第４２項記載の可溶性フラグメント。