JP3974168B2 - β−アミロイド前駆体タンパク質の細胞プロセッシングをモニターするための方法及び組成物 - Google Patents

Description

発明の背景
１．発明の分野
本発明は、一般的にβ−アミロイド前駆体タンパク質のプロセッシングをモニターするための方法及び組成物に関する。より特定には、本発明は、アルツハイマー病の診断、予測及び治療への応答のモニターのためへの、及びアルツハイマー病の処理のための可能な薬物のスクリーニング及び評価のためへのそのような方法及び組成物の使用に関する。
アルツハイマー病は、アルツハイマー病患者の脳、特に記憶及び知識に関与する領域に存在する多くのアミロイドプラーク及び神経細繊維網（高い不溶性のタンパク質凝集体）の存在によって特徴づけられる。過去において、プラーク及び網が原因であるか又は単にアルツハイマー病の結果であるかについて有意な科学的論争が存在するが、最近の発見は、アミロイドプラークが原因前駆体又は因子であることを示唆する。特に、β−アミロイドペプチド、すなわちアミロイドプラークの主要構成成分の生成がアミロイド前駆体タンパク質をコードする遺伝子における変異に起因することが発見されており、ここで前記タンパク質は通常プロセッシングされる場合、β−アミロイドペプチドを生成しないであろう。アルツハイマー病の家族性初期開始を引き起こす、アミロイド前駆体タンパク質における変異の同定は、アミロイド代謝がその病気の根底にある病原性工程における中枢的出来事である最強の証拠である。４つの報告される、疾病を引き起こす変異は、770の同形（isoform）に関して、バリン⁷¹⁷〜イソロイシン（Goateなど.（1991）Nature 349：704〜706）、バリン⁷¹⁷〜グリシン（Chartier Harlonなど.（1991）Nature 353：844〜846）、バリン⁷¹⁷〜フェニルアラニン（Murrellなど.（1991）Science 254：97〜99）及び695の同形に関しては、二重変異変更リシン⁵⁹⁵−メチオニン⁵⁹⁶〜アスパラジン⁵⁹⁵−ロイシン⁵⁹⁶（Mullanなど.（1992）Nature Genet 1：345〜347）を包含する。さらに、β−アミロイドペプチドは脳のニューロンに対して毒性であり、そしてニューロン細胞の死がこの疾病に関連している。
従って、アミロイド前駆体タンパク質の細胞プロセッシングをモニターする能力は、アルツハイマー病の診断、予測及び治療管理において有意に価値あるものである。特に、容易に得られる患者のサンプル、たとえば血清、脳脊髄液（CSF）及び同様のものにおける検出できる診断マーカーをスクリーニングし、そして評価するために最小限に侵略的な方法を同定することが所望される。
アルツハイマー病のための多くの可能性ある診断マーカーがこれまで示唆されて来た。本発明において特に興味あるものは、カルボキシ末端フラグメント（たとえばβ−アミロイドペプチド自体及びそのフラグメント）及びアミノ末端フラグメント（たとえば一定の25KD，105KD及び125KDのフラグメント）を含む、アミロイド前駆体タンパク質の一定のフラグメントである。今までのところでは、提案されたマーカーは、アルツハイマー病の死亡前診断又はモニターリングについては明確ではない。
従って、アルツハイマー病のための追加及び他の診断マーカーを同定することが所望される。そのようなマーカーは、単独で及び／又は他の診断マーカー及び方法と組合して有用であるべきである。好ましくは、診断マーカーは体液、たとえばCSF、血液、血漿、血清、尿、組織及び同様のものにおいて検出され、その結果、侵略的診断方法が利用され得る。
本発明のさらに興味あるものは、β−アミロイドプラークの生成を阻害し又は妨げる能力のための候補薬物をスクリーニングするインビトロシステム及び方法である。β−アミロイドペプチドへのアミロイド前駆体タンパク質の転換を阻害し又は妨げる能力のための試験化合物をスクリーニングするための方法及びシステムを提供することが所望される。特に、試験化合物が転換を導びく代謝路を中断し又は妨害することができるような転換に包含されると思われて来た代謝路に基づく方法及びシステムを確立することが所望される。そのような方法及びシステムは多数の試験化合物をスクリーニングするために急速で、経済的で且つ適切であるべきである。
２．背景技術の記載
β−アミロイドペプチド（また、Ａ４，βAP，Ａβ又はAβPとしても言及される：アメリカ特許第4,666,829号及びWong（1984）Biochem.Biophys.Res.Commun.120．1131〜1135を参照のこと）は、β−アミロイド前駆体タンパク質（βAPP）に由来し、これは695,751及び770個のアミノ酸の異なってスプライスされた形で発現される。Kangなど.（1987）Nature 325：773〜776；Ponteなど.（1988）Nature 331：525〜527；及びKitaguchiなど.（1988）Nature 331：530〜532を参照のこと。アミロイド前駆体タンパク質の通常のプロセッシングは、トランスメンブランドメイン近くの残基Lys¹⁶とLeu¹⁷（Kangなど.（1987）前記においてAsp⁵⁹⁷が残基１であるνAP領域について番号を付与されている）との間の部位でタンパク質分解性切断を包含し、β−アミロイドペプチド配列の残る部分を保持する細胞外ドメインの構成的分泌をもたらす（Eschなど.（1990）Science 248：1122〜1124）。この経路は、種間に広く保存され、そして多くの細胞型に存在しているように思える。Weidemannなど.（1989）Cell 57：115〜126及びOltersdorfなど.（1990）J.Biol.Chem.265：4492〜4497を参照のこと。この正常な経路は、β−アミロイドペプチドに対応する前駆体タンパク質の領域内で分解し、従って、その形成を明らかに妨げる。βAPPのもう１つの構成的に分泌される形が注目され（Robakisなど．Soc.Neurosci．October 26，1993，Abstract No.15.4，Anaheim，CA.）、これはEschなど．前記により記載される形のものからβAP配列のカルボキシ末端のものを含む。
Goldeなど.（1992）Science 255：728〜730は、アミロイド前駆体タンパク質の一連の欠失変異体を調製し、そしてβ−アミロイドペプチド領域内の１つの切断部位を観察した。この観察に基づけば、β−アミロイドペプチド形成は分泌路を包含しないことが推定された。Estusなど.（1992）Science 255：726〜728は、脳細胞に見出されるアミロイド前駆体タンパク質の２つの最大カルボキシ末端タンパク質分解フラグメントが完全なβ−アミロイドペプチド領域を含むことを教授する。
PCT出願WO92／00521は、患者の脳脊髄液におけるアミロイド前駆体タンパク質の一定の25KD，105KD及び125KDの可溶性誘導体の量の測定に基づいてアルツハイマー病を評価するための方法を記載する。そのWO92／00521の第３図は、アミロイド前駆体タンパク質の切断がβ−アミロイドペプチドのアミノ末端近くで生じ、可溶性アミノ末端フラグメントを生成することを示唆しているが、しかしそのような切断の証拠又は論議はその出願には示されていない。
Kennedyなど.（1992）Neurodegeneration 1：59〜64は、分泌されたβAPPの形についてのデータを表わし、これはβAPPの残基527−540に対する抗体とのその反応性及びβAPの最初の15個の残基に対する抗体との反応性の欠乏により特徴づけられる。βAPP形のカルボキシ末端の切断部位又は同定を示す直接的な証拠は提供されていない。PCT出願WO91／16628号は、プロテアーゼnexin−２又はアミロイド前駆体タンパク質に対する抗体を利用して、アミロイド前駆体タンパク質及びそのフラグメントの検出に基づいての疾病の診断方法を記載する。
最近の報告は、可溶性β−アミロイドペプチドが培養培地（Haassなど.（1992）Nature 359：322〜325）に、及びヒト及び動物CSF（Seubertなど.（1992）Nature 359：325〜327）に健康細胞により生成されることを示す。
発明の要約
生物学的サンプルにおけるβ−アミロイド前駆体タンパク質（βAPP）の分泌されたアミノ末端フラグメントを検出、そしてモニターするための方法及び組成物が提供され、ここで前記フラグメントは前記β−アミロイドペプチド（βAP）領域のアミノ末端で又はその近くでの切断に起因する。特に、Kangなど．、前記により記載されるβAPPに基づくアミノ酸配列（すなわち“正常”な配列）に関しては、βAPPのこの切断され、分泌されたフラグメントは、それらのカルボキシ末端で暴露されるメチオニンを有する分泌されたフラグメントの一定のカルボキシ末端残基を含んで成るペプチドに対して発生せしめられた抗体により認識され得る。他方、天然に存在し又は構築された、βAPPの変異配列、たとえばMullanなど．（1992）Nature Genet 1：345〜347により報告される、リシン⁵⁹⁵−メチオニン⁵⁹⁶をアスパラジン⁵⁹⁵−ロイシン⁵⁹⁶に変える二重変異誘発がこの領域における新規配列を導入することができる。このβAPP配列のＣ末端残基に対して特異的な結合物質がそのような配列のための検出の好ましい手段であろう。
分泌されたフラグメントは、損なわれていないβAPPにおけるβAP領域に隣接して存在するカルボキシ末端残基（正常な配列の場合はメチオニン）の５個のアミノ酸内で終結するβAPPの実質的に損なわれていないアミノ末端配列を含んで成るであろう。特に、分泌されたフラグメントは、βAPPの695個のアミノ酸イソフォーム（isoform）のメチオニン⁵⁹⁶及びリシン⁵⁹⁵において終結する配列、及び他のイソフォームのための対応する番号並びに変異体βAPP形、たとえばLYS⁵⁹⁵−MET⁵⁹⁶〜ASN⁵⁹⁵−LEU⁵⁹⁶（“Swedish”形）のための対応するアミノ酸から成る。本発明の方法及び組成物は、βAPPの細胞内プロセッシングをモニターするために、特にある疾病、特にアルツハイマー病及び家族性形並びにダウン症候群に関与される損なわれていないβAPを放すβAPPの切断をモニターするためにインビボ及びインビトロの両者において有用である。
本発明の第１の特定の観点においては、βAPPの分泌されたアミノ末端フラグメント（ATF−βAPP）が、βAPP 695イソフォームの残基596で終結するβAPP配列のＣ末端残基に対して発生せしめられた及び／又はその残基に対して特異的な結合物質との反応により、典型的には、生物学的サンプルに存在するβAPPの他の切断された形とATF−βAPPとを区別することができる抗体との反応により検出される。その必要な特異性を有する抗体は、ATF−βAPPのＣ末端残基を包含する合成ペプチドハプテンに対して生ぜしめられる。
本発明の第２の特定の観点においては、βAP関連の疾病、たとえばアルツハイマー病及びダウン症候群は、患者のサンプル、たとえばCSF、血清、血液、血漿、尿、組織及び同様のものにおけるATF−βAPPの検出に基づいて、患者において診断され、そしてモニターされ得る。高められたATF−βAPPレベル又は割合は、前記疾病の開始及び進行に関与し、そして前記疾病の処理での経過を伴って減じられ得る。
第３の特定の観点においては、本発明は、βAP生成インヒビターを同定するための方法を提供し、ここでATF−βAPPの分泌をもたらす条件下で動物がその分泌を高められ、又は細胞が培養される。動物又は培養された細胞は試験化合物に暴露され、そしてATF−βAPPの分泌された量又は割合の変化を引き起こす試験化合物が同定され得る。
第４の特定の観点においては、本発明は、ATF−βAPPのＣ末端に特異的に結合できる、抗体分子、たとえば損なわれていない免疫グロブリン分子及び免疫グロブリンフラグメントを含む抗体組成物を含んで成る。そのような抗体分子は、ATF−βAPPのＣ末端残基を含んで成る免疫原を通常用いて、いづれかの従来の手段で調製され得、そしてここでＣ末端メチオニンが正常な配列においては暴露される。
第５の特定の観点においては、本発明は精製され、そして単離された形でATF−βAPPを含んで成る。そのようを組成物はATF−βAPPの検出のために種々の従来のアッセイにおいて有用であろう。そのような組成物は、天然又は組換え源、たとえばCSF、適切な細胞培養物からのならし培地又は同様のものからのATF−βAPPの単離及び精製により得られる。
【図面の簡単な説明】
第１Ａ及び１Ｂ図は、正常なβAPPの種々のイソフォーム及びATF−βAPPのその対応するインフォームをそれぞれ示す。
第２Ａ，２Ｂ及び２Ｃ図は、ヒト胎児の脳細胞培養物のならし培地に由来する材料の化学発光ゲルパターンである。個々のゲルのレーン１，２、及び３は、未処理のならし培地、β−アミロイドペプチド残基１〜16内でエピトープを認識する抗体との反応により消耗されたならし培地、及びこの抗体により除去される材料をそれぞれ表わす。パネルＡ，Ｂ及びＣは、次のプローブを示す：抗−５抗体（β−アミロイドペプチド領域の方に対してβAPPアミノ末端上の位置を認識する）、抗体92（βAPPからのβAPの切断により暴露されるＣ末端メチオニンで終結する合成ペプチドに対して生ぜしめられている）、及び抗体10D4（残基１〜16以内のβAPのエピトープを認識するモノクローナル抗体）。
第３図は、ヒト腰動脈CSFを試験することによって得られた化学発光ゲルパターンである。CSFは、単独で（レーン１）又はATF−βAPPのＣ末端の変動を表わす種々のペプチドにより予備インキュベートされた92抗体によりプローブされた。有意な競争（結合の低下）は、Ｃ末端メチオニンで終結するペプチドにより観察された（レーン３，４，６、及び７）。ペプチドは次の通りであった：レーン１、競争ペプチドは添加されなかった；レーン２、GSGLTNIKTEEISEVK；レーン３、YSGLTNIKTEEISEVKM；レーン４、ISEVKM；レーン５、EISEVKMD；レーン６、CISEVKM；レーン７、YISEVKM。MW＝分子質量マーカー（キロドルトンで示される）。
第４図は、種々の細胞系からのならし培地の免疫沈殿により得られた電気泳動ゲルパターンを表わすオートラジオグラムである。ヒト胎児脳培養物により分泌され、そして抗体92（矢印でのレーン11）により免疫沈殿された材料は明らかに、抗体6C6（矢印でのレーン10）により沈殿された材料よりも小さい。抗体6C6は、βAPの残基１−16内のエピトープを認識する。
第５図は正常な及びSwedish βAPPの両者をコードするcDNAによりトランスフェクトされたヒト293細胞系からのならし培地の免疫沈殿により得られた電気泳動ゲルパターンを表わすオートラジオグラムである。Swedishトランスフェクト細胞（レーン11及び12）により分泌されたAFT−βAPP材料の量は正常なβAPPトランスフェクタント（レーン９及び10）により生成された量よりも定性的に高い。
特定態様の記載
本発明は、前駆体タンパク質からの損なわれていないβ−アミロイドペプチド（βAP）領域の切断に起因するβ−アミロイド前駆体タンパク質（βAPP）の新規分泌されたフラグメントの同定に起因する。その新規の分泌されたフラグメントは、そのような切断の後に残存するβAPPのアミノ末端部分を含んで成り、そしてβAPPのアミノ末端フラグメント（ATF−βAPP）としてこの後、言及されるであろう。ATF−βAPPは、βAPPのための他の分泌プロセッシング路の生成物であると思われており、ここで前記路は正常な（疾病を有さない）細胞に存在する。しかしながら、他の分泌路は患者における疾病細胞におけるβAPの生成において必須の出来事を担当し、そしてATF−βAPPの異常生成はβAPプラークに関連する疾病、特にアルツハイマー病及びダウン症候群に包含され得ると思われる。従って、本発明は、生物学的サンプルにおけるATF−βAPPの検出及び測定に基づいてβAPPの細胞プロセッシングをモニターするための方法及び組成物を提供する。
ATF−βAPPは、βAP領域にすぐ隣接して存在し、そして正常なβAPPのためには、カルボキシ末端メチオニン（下記に示されるように695イソフォームにおいてメチオニン596として番号を付与されている）を含む、βAPPの一定残基を含んで成るペプチドに対して発生せしめられた抗体に対する特異的結合により同定され、そして認識される。そのペプチドは通常、少なくとも５個までの連続残基を含み、そして残基⁵⁹⁶を含み、そしてそのような抗体を生成するための特定方法が下記に示される。
第１Ａ及び１Ｂ図を参照すれば、βAPPは、それぞれ695，751及び770個のアミノ酸を含んで成る３種のイソフォームで見出される。
695のイソフォームは神経細胞において最とも通常であり、そして751及び770のイソフォームは695イソフォーム上での残基289での挿入に起因する（695イソフォームのすべての番号付けは、Kangなど.（1987）Nature 325：733〜736に従っている）。ATF−βAPPは、明らかに、695イソフォームの残基596と597との間に位置する、β−アミロイドペプチド（βAP）領域のアミノ末端のアミノ末端側上の５つの残基で又はその５つの残基以内での種々のβAPPイソフォームのタンパク質分解性切断に起因する。そのような切断は、通常メチオニン⁵⁹⁶、リシン⁵⁹⁵又はロイシン⁵⁹⁶であり、より通常にはメチオニン⁵⁹⁶である、第１Ｂ図にMET⁵⁹⁶及びLYS⁵⁹⁵として示される、Ｃ末端残基の暴露をもたらす。もちろん、Ｃ末端残基は、ATF−βAPPが異なったβAPPイソフォームから誘導される場合、異なった番号付けを有することが認識されるであろう。特に、Ｃ末端メチオニンはそれぞれ751及び770 βAPPイソフォームにおいて、MET⁶⁵²及びMET⁶⁷¹であり、そしてＣ末端リシンはLYS⁶⁵¹及びLYS⁶⁷⁰である。この後に使用される場合、メチオニン⁵⁹⁶、リシン⁵⁹⁵及びロイシン⁵⁹⁶は一般的に、βAPPのすべての他のイソフォーム又は変異体における対応する残基を言及するであろう。現在、ATF−βAPPのＮ末端残基はすべてのイソフォームにおけるLEU¹⁸であると思われる（βAP領域内で切断される分泌された形でのβAPPのアミノ末端のプロセッシングに基づく）。
本発明によれば、ATF−βAPPは、種々の生物学的サンプル、たとえばインビトロサンプル、たとえば培養された細胞からのならし培地及びインビボ患者サンプル、典型的にはCSF、血液、血清、血漿、尿、組織及び同様のものにおいて検出され、そして／又は測定され得る。検出及び測定は、サンプルに見出される他のβ−APPフラグメントとATF−βAPPとを区別できるいづれかの技法により達成され得る。便利には、免疫学的検出技法が、使用され得、ここでその技法は、βAP領域の切断に基づいて暴露されるATF−βAPPのＣ末端残基、たとえばメチオニン⁵⁹⁶、ロイシン⁵⁹⁶又はリシン⁵⁹⁵に結合する、抗体、抗体フラグメント又は他の同等の特異的結合物質を使用する。そのようなＣ末端特異的抗体はATF−βAPPと関連するβAPPフラグメントとの間で区別できることが見出された。他方、免疫学的検出技法は、従来の技法を用いて、単離され、そして精製されたATF−βAPPに基づかれている。Ｃ末端残基特異的抗体及び精製され、そして単離されたATF−βAPPの両者の調製はこの後に記載される。特に適切な検出技法は、ELISA、ウェスターンブロット、ラジオイムノアッセイ及び同様のものを包含する。
ATF−βAPP特異的抗体及び／又は競争抗原の使用を必要としない、ATF−βAPPを検出するための他の技法がまた、使用され得る。たとえば、二次元ゲル電気泳動が、βAPPの密接に関連する可溶性フラグメントを分離するために使用され得る。次に、多くの又はすべてのフラグメントと交叉反応する抗体が、ゲルをプローブするために使用され得、そしてATF−βAPPの存在はゲル上でのその正確な位置に基づいて同定される。ATF−βAPPの検出のための他の技法はまた、当業者の技術の範囲内である。たとえば、βAPのアミノ末端領域を含む分泌されたβAPP種は、サンプルから免疫学的に除去され、ATF−βAPPが単離され（第２Ａ図、レーン２及び第５図、レーン11及び12を参照のこと）、次にこれは上記に論ぜられたいくつかの方法のいづれかにより検出され得る。
ATF−βAPPに対して特異的な抗体は、メチオニン残基を含むＣ末端ATF−βAPP配列を含んで成る適切な抗原又はハプテンに対して調製され得る。便利には、合成ペプチドが、従来の固相技法により調製され、適切な免疫原に結合され、そして従来の技法により抗血清又はモノクローナル抗体を調製するために使用され得る。１つの適切な合成ペプチドは、βAPのすぐアミノ末端部位上に位置し、そして免疫原に結合され、そして実験セクションに詳細に記載されるように特定の抗体を調製するために使用されるATF−βAPP（ISEVKM）の６個の残基から成る。他の適切なペプチドハプテンは通常、βAPのすぐアミノ末端側上のβAPP内の少なくとも５個の連続した残基を含んで成り、そして６個以上の残基を含むこともできる（但し、16個のアミノ末端残基を含むペプチドはほとんど特異的でない抗血清を生成することが見出されている）。正常なATF−βAPPのカルボキシ末端の25個の残基は次の通りである（単一文字のアミノ酸名称を用いる）。

合成ポリペプチドハプテンは、アミノ酸が成長鎖に連続的に付加される、良く知られたMerrifield固相合成技法により生成され得る（Merrifield（1963）J.Am.Chem.Soc．85：2149〜2156）。アミノ酸配列は上記ATF−βAPPの配列に基づかれており、又は天然に存在する又は構築された変異配列を用いることができる。たとえば、Swedish変異体は、リシン⁵⁹⁵−メチオニン⁵⁹⁶のために置換されたアスパラジン⁵⁹⁵−ロイシン⁵⁹⁶を有し、そして他の置換はメチオニン⁵⁹⁶とロイシン⁵⁹⁶との置換のみを包含する。
十分な量のポリペプチドハプテンが得られたなら、それは、一般的にHudson and Hay，Practical Immunology，Blackwell Scientific Publications，Oxford，Chapter 1.3，1980（これは引用により本明細書に組込まれる）に記載されるようにして、適切な免疫原性キャリヤー、たとえば血清アルブミン、キーホールリンペット（keyholelimpet）ヘモシアニン、他の適切なタンパク質キャリヤーに接合され得る。
十分な量の免疫原が得られたなら、ATF−βAPPからβAPの切断に基づいて暴露されるＣ末端残基に対して特異的な抗体がインビトロ又はインビボ技法により生成され得る。インビトロ技法は、免疫原へのリンパ球の暴露を包含し、そしてインビボ技法は適切な脊椎動物宿主中への免疫原の注射を必要とする。適切な脊椎動物宿主は、ヒトではなく、たとえばマウス、ラット、ウサギ、羊、ヤギ及び同様のものを包含する。免疫原は予定されたスケジュールに従って動物中に注射され、そしてその動物は改良された力価及び特異性を有する連続的な採血を伴って定期的に採血される。注射は、筋肉内、腹腔内、皮下又は同様のものに行なわれ、そしてアジュバント、たとえば不完全フロイントアジュバントが使用されるであろう。
所望には、モノクローナル抗体は、所望する特異性を有する抗体を生成できる不滅化された細胞系を調製することによって得られる。そのような不滅化された細胞系は種々の手段で生成され得る。便利には、小脊椎動物、たとえばマウスが上記方法により所望する免疫原により高度免疫化される。次に、脊椎動物は通常、最終免疫化の数日後に殺害され、脾臓細胞が除かれ、そして脾臓細胞が不滅化される。この不滅化の態様は臨界ではない。現在、ほとんどの共通する技法は、Kohler and Milstein（1975）Nature 256：495〜497により最初に記載されているように、骨髄腫細胞融合パートナーとの融合である。他の技法は、EBV形質転換、裸のDNA、たとえば癌遺伝子、レトロウィルス、等による形質転換、又は細胞系の適切な維持及びモノクローナル抗体の生成を提供するいづれか他の方法を包含する。モノクローナル抗体を調製するための特定の技法は、Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow and Lane，eds.，Cold Spring Harbor Laboratory，1988に記載されており、これは引例により本明細書に組込まれる。
モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体（抗血清）の他に、本発明の検出技法は、抗体フラグメント、たとえばＦ（ab），Ｆ_V，Ｖ_L，Ｖ_H及び他のフラグメントを用いることができるであろう。現在十分に特許及び科学文献に記載されているように、組換え的に生成された抗体（免疫グロブリン）及びその変異体を用いることもまた可能である。たとえば、EPO第8430268.0号；EPO第85102665.8号；EPO第85305604.2号；PCT／GB85／00392号；EPO第85115311.4号；PCT／US86／002269号；及び日本特許出願第85239543号（これらは引用により本明細書に組込まれる）を参照のこと。上記のようにして調製された抗体の結合特異性をまねる他の組換えタンパク質を調製することもまた可能である。
本発明はさらに、通常、実質的に純粋な形で得られる、単離され、そして精製されたATF−βAPPを含んで成る。“実質的に純粋な”とは少なくとも約50％ｗ／ｗ（重量／重量）又はそれ以上の純度を意味し、そして妨害タンパク質及び汚染物を実質的に有さない。好ましくは、ATF−βAPPは、50％ｗ／ｗ、好ましくは80％ｗ／ｗ又はそれ以上の純度で単離又は合成されるであろう。ATF−βAPPは従来のタンパク質精製技法により天然源から精製され、そして少なくとも約50％ｗ／ｗの純度の均質組成物が従来の免疫親和性分離技法を用いて上記のようにして調製された抗体の使用により精製される。適切な天然の出発材料は、ATF−βAPP生成細胞系、たとえば胎児脳細胞培養物及び同様のものからのならし培地を包含する。他方、ATF−βAPPはヒト宿主から得られた生物学的サンプル、たとえばCSF、血清及び同様のものから単離され得る。適切なタンパク質精製技法は、Methods in Enzymology，Vol.182，Deutcher，ed.，Academic Press，Inc.，San Diego，1990（引用により本明細書に組込まれる）に記載される。
上記のようにして調製された、抗体及び精製ATF−βAPPは、β−アミロイド関連疾病のモニターのために生物学的サンプル、特にインビボ患者サンプルにおいて、及びβAPPの細胞内プロセッシングをモニターするために細胞培養物からのならし培地においてATF−βAPPを検出するために種々の従来の免疫学的技法に使用され得る。適切な免疫学的技法は、イムノアッセイ、たとえばELISA、ウェスターンブロット分析、及び同様のものを包含する。多くの特定の免疫学的検出技法がHarlow and Lane、前記に記載されている。
患者サンプルにおけるATF−βAPPのインビボ検出は、アルツハイマー病及びβ−アミロイドプラーク沈着に関連する他の疾病、たとえばダウン症候群の診断及びモニターのために使用され得る。適切な患者のサンプルは、CSF、血液、血清、血漿、尿、組織及び同様のものを包含する。その疾病の存在は一般的に、アルツハイマー病又は他のβ−アミロイド関連疾病を有さない正常な個人に比較して、高レベルのATF−βAPP、又は他の分泌されたβAPPフラグメント（すなわち、βAP領域内で又はその領域の方のカルボキシ末端で切断されたβAPPフラグメント）の量に対するATF−βAPPの量の高い割合に関連しているであろう。ATF−βAPPの量は、イソフォーム（たとえば695，751又は770）及び／又はそのカルボキシ末端によりさらに定義された形（たとえば、Eschなどにより記載された部位で及び／又はその部位の方のカルボキシ末端で切断された形）のいづれかで、APPの他の種の量に比較され得る。初期診断方法の他に、ATF−βAPPのレベルは、疾病の進行を追跡するために、及び処理の有効性を実質的に追跡するためにモニターされ得る。ATF−βAPPのレベルは効果的な処理法により低下することが予測される。
適切な細胞培養物からの培養培地におけるATF−βAPPレベルのインビトロモニターは薬物のスクリーニングのために使用され得る。培養培地中へのATF−βAPPの分泌をもたらす条件下で細胞を増殖し、そしてその細胞を試験化合物に暴露することによって、ATF−βAPP分泌に対するそれらの試験化合物の効果が観察され得る。ATF−βAPPの量を減じることができる試験化合物は、βAP形成のインヒビターとして試験のための候補体であることが予測される。適切な細胞系は、ヒト及び動物細胞系、たとえば293ヒト腎細胞系、ヒト神経膠細胞系、ヒトHeLa細胞、一次内皮細胞（たとえばHUVEC細胞）、一次ヒト線維芽細胞又はリンパ芽球（βAPP変異を有する患者に由来する内因性細胞を包含する）、一次ヒト混合脳細胞（ニューロン、星状細胞及び神経膠を包含する）、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、及び同様のものを包含する。ATF−βAPPのレベル又は割合を選択的に高める細胞系は本発明の方法において特に有用である。
同様に、アルツハイマー病の動物モデル、たとえばWO91／19810号に開示されるマウスモデル（この開示は、引用により本明細書に組込む）におけるATF−βAPPのインビトロモニターリングはまた、治療効果のために（通常、インビトロスクリーンにより前もって同定されている化合物の試験のために）試験化合物をスクリーンするためにも使用され得る。試験化合物は動物に投与され、そしてATF−βAPPのレベル又は他のβAPPフラグメントに対するATF−βAPPの割合が観察される。ATF−βAPPのレベルを減じ、又は他のβAPPフラグメントに対するATF−βAPPの割合を減じる化合物が追加の評価のための候補体であると思われる。
試験化合物は、細胞の生存性を実質的に妨害しないで細胞培養物に添加され得るいづれかの分子、化合物又は他の物質であり得る。適切な試験化合物は、小さな分子、生物学的ポリマー、たとえばポリペプチド、ポリサッカリド、ポリヌクレオチド及び同様のものであり得る。試験化合物は典型的には、約１nM〜１mM、通常約10μＭ〜１mMの範囲の濃度で培養培地に添加されるであろう。
ATF−βAPPの分泌を阻害できる試験化合物は、病原性細胞におけるβ−アミロイド生成をブロックする能力のさらなる決定のための候補体として見なされる。分泌の阻害は、βAPのアミノ末端でのβAPPの切断が少なくとも部分的にブロックされ、β−アミロイドペプチドへの転換のために利用できるプロセッシング中間体の量を減じることを示す。
本発明は、細胞におけるβ−アミロイド生成を阻害するための方法をさらに含んで成り、ここでその方法は、上記方法により選択された化合物を細胞に投与することを包含する。その化合物は、培養された細胞によりβAP生成を阻害するために細胞培養物に添加され得る。その化合物はまた、アルツハイマー病及び他のβAP−関連疾病に関連するアミロイドプラークの沈着を阻害するために患者に投与され得る。
本発明は、上記方法により選択された化合物を組込み、そして医薬的に許容できるキャリヤーを含む医薬組成物をさらに含んで成る。そのような医薬組成物は、本発明の方法により同定された少なくとも１種の化合物の治療又は予防量を含むべきである。医薬的に許容できるキャリヤーは、意図される宿主に化合物を供給するのに適切ないづれかの相溶性非毒性物質であり得る。滅菌水、アルコール、脂肪、ロウ、及び不活性固体がキャリヤーとして使用され得る。医薬的に許容できるアジュバント、緩衝剤、分散剤、及び同様のものがまた、医薬組成物中に導入され得る。活性剤を組込む医薬条件の調整は、医学及び科学文献に十分に記載されている。たとえば、Remington's Pharmaceutical Science，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania，16th Ed.，1982（この開示は引用により本明細書に組込まれる）を参照のこと。
上記医薬組成物は、非経口、局部及び経口投与を包含する、宿主への全身投与のために適切である。その医薬組成物は非経口的に、すなわち皮下、筋肉内又は静脈内投与され得る。従って、本発明は宿主への投与のための組成物を供給し、ここに前記組成物は上記のように、許容できるキャリヤーにおける同定された化合物の医薬的に許容できる溶液を含んで成る。
時々、脳に直接的又は間接的に前記医薬組成物を導入することが所望され又は必要であろう。直接的な技法は通常、血液−脳バリヤーをバイパスするために宿主の心室システム中に薬物供給カーテーテルの配置を包含する。一般的に好ましい間接的な技法は、脂質可溶性薬物への親水性薬物の転換により薬物潜在性を提供するために組成物を配合することを包含する。潜在性は一般的に、薬物をより脂質可溶性にするために薬物上に存在し、そして血液−脳バリヤーを通しての輸送を受けやすい、ヒドロキシル、カルボキシル及び第一アミン基のブロックを通して達成される。他方、親水性薬物の供給は、血液−脳バリヤーを一時的に開放できる高張液の動脈内注入により高められ得る。
医薬キャリヤーにおける化合物の濃度は広く変化し、すなわち医薬組成物の約0.1重量％〜約20重量％又はそれ以上である。筋肉内注射のための局部医薬組成物は、たとえば１〜４mlの滅菌した緩衝水及び本発明の方法により同定された化合物１μｇ〜１mgを含むように製造される。静脈内注入のための局部組成物は、滅菌リンガー溶液100〜500ml及び前記化合物約１〜100mgを含むように製造され得る。
本発明の医薬組成物は、βAPの沈着に関連する疾病、たとえばアルツハイマー病及びダウン症候群の予防的及び／又は治療的処置のために投与され得る。治療的適用において、医薬組成物は、疾病をすでに有する宿主に投与される。医薬組成物は、βAPプラークのさらなる沈着を阻止するのに十分な量で投与されるであろう。これを達成するために適切な量は、“治療的有効量”として定義される。そのような有効量は疾病の程度、宿主の大きさ及び同様のものに依存し、そして一般的には、約0.01μｇ〜10mgの化合物／宿主の体重１kgの範囲であり、そして0.1μｇ〜１mg／kgの用量がより通常には使用される。
予防的適用のためには、本発明の医薬組成物はβAP疾病に対して敏感ではあるが、しかしそのような疾病をすでに有さない宿主に投与される。そのような宿主は、医学文献に記載されているように、遺伝的スクリーニング及び臨床的分析により同定され得る。その医薬組成物はひじょうに初期段階でβAPプラークの沈着を阻害又は妨げることができ、好ましくはβ−アミロイド疾病の初期段階さえも防止するであろう。予防的有効量として言及される、そのような予防的処置のために必要とされる化合物の量は一般的に、治療的処置のために記載された量と同じである。
次の例は例示的目的により示されており、本発明を制限するものではない。
実 験
材料及び方法
１．抗体及び親和性マトリックスの調製
モノクローナル抗体6C6を、免疫原としてウサギ血清アルブミンに接合されたβAP残基１−28を含む合成ペプチドを用いて、抗体10D5（Hymanなど.（1992）J.Neuropath.Exp.Neurol．51：76）と同じ態様で発生せしめ、そしてスクリーンした。10D5及び6C6の両者は、βAP配列の初めの16個のアミノ酸内のエピトープを認識する。6C6は免疫沈殿における10D5よりもより効果的であり、そして捕獲抗体として使用された。6C6樹脂を調製するために、４mlのAffigel^▲Ｒ▼10（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA）を冷水により洗浄し、そして３mlの6C6（PBS（2.7mMのKCl，1.5mMのKH₂PO₄，8.1mMのNa₂HPO₄，137mMのNaCl，pH7.5）及び0.5ＭのNaClにおいて12.5mg／mlを組合した。カップリングは軽い振盪を伴って４℃で一晩、進行した。次に、400μｌの１Ｍのトリス（pH8.0）を添加し、そして振盪を40分間続けた。次に、樹脂を、使用する前、TTBS（137mMのNaCl，５mMのKCl，25mMのトリス、0.5％のTween^▲Ｒ▼20，pH7.5）により徹底的に洗浄した。抗体7H5はまた、Hymanなど.（1992）前記に記載される。
抗体（抗体92と称する）を、βAPPの残基591−596を含む合成ペプチドに対して発生せしめた（Kangなど.（1987）前記において番号を付けられている）。ペプチド（Ｎ−アセチル−CISEVKM）を、免疫原を形成するためにスルホ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルにより活性されたウサギ血清アルブミンに接合した。抗血清を、標準方法論によりウサギにおいて免疫原に対して生成せしめた。個々の接種の間、ウサギは、約10の部位で0.1mlの皮下注射において免疫原５μｇを受けた（50μｇ／追加免疫）。上記と同じペプチドを、IgG画分からの抗体の親和性精製のためにSulfo-ling（TM）ゲル（Pierce Chemical Co.，Rockford，IL）に結合した。
抗体92の調製の詳細な説明は次の通りである。ウサギ血清アルブミン（12.3mg）を、1.25mlの0.05ＭのKH₂PO₄（pH7.0）中、13mgのスルホ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと共に０℃で20分間インキュベートした。次に、その混合物をすぐに、リン酸緩衝液により平衡化されたSephadex G−10の１×75cmカラム上でゲル濾過にゆだねた、排除された体積のタンパク質溶離物をプールし、そしてすぐに、標準の自動化された固相方法論により合成されたＮ−アセチル−CISEVKMペプチド30mgと共に組合した。カップリング反応（20mlの体積）を一晩進行せしめ、そして他に、抗体発生のために商業的施設に送った。注射方法は、等体積の完全フロイントアジュバントに抗原を乳化すること及び約10の部位に0.1mlのアリコートにおいて合計50μｇの抗原を皮下注射することである。その後、３週間ごとに、追加免疫注射を同一の手段により与え、但し、不完全フロイントアジュバントを乳化剤として使用した。ウサギを個々の注射の後、１週間後、採血し、そして血清をELISAにおけるペプチドへの反応により力価について試験した。
IgGを、50％の（NH₄）₂SO₄（２×）による沈殿化により陽性反応血清から精製し、そしてPBSに対して透析した。Ｎ−アセチル−CISEVKMペプチドを、そのペプチドに対して特異的な抗体を精製するために、親和性樹脂を生成するための製造業者の推薦を用いてSulfo-link（TM）ゲル（Pierce Chemical Co.，Rockford，IL）に接合した。IgG画分を前記カラムに適用し、そしてPBSにより非特異的に結合された材料を通して洗浄した後、抗体を0.1ＭのグリシンpH2.5及び0.5ＭのNaClにより溶離し、そして凍結の前、PBSを通して透析した。
２．ヒト胎児脳細胞培養物
胎児ニューロン組織検体を、生後12〜14週目の胎児死骸から得た。脳皮質のサンプルをハンクス液（HBSS）により２度、すすいだ。皮質組織（２〜３ｇ）を、１mgのDNase（Sigma Chemical Co.，St，Louis，MO D3427）が添加されている冷HBSS 10mlに置いた。粉砕された懸濁液を、210μｍ及び130μｍのNitexナイロンスクリーンを通して、Pulliamなど.（1984）J.Virol.Met．９：301により記載されているようにして濾過した。
細胞を遠心分離により収穫し、そしてニューロン媒体（10％ウシ胎児血清、１％グルコース、１mMのNapyruate，１mMのグルタミン、20mMのKClにより強化されたMEM）に再懸濁した。ポリエチレンイミンにより被覆された100mmの皿に、ニューロン培地８mlにおける1.5×10⁷個の細胞を接種した。培地は１週当たり２度交換された。この研究におけるすべての培養物は少なくとも30日、インビトロで増殖された。血清を含まない増殖条件のためには、培養物を定義された培地（５μｇ／mlのウシインシュリン；0.1mg／mlのヒトトランスフェリン；0.1mg／mlのBSA画分Ｖ；0.062μｇ／mlのプロゲステロン；1.6μｇ／mlのプトレッシン；0.039μｇ／mlの亜セレン酸ナトリウム；0.042μｇ／mlのチロキシン及び0.033μｇ／mlのトリヨード−Ｌ−チロニン）中に移し、そして３日後、その上清液を収穫した。
前記細胞からのならし培地（10ml）を収穫した。EDTA（５mM）、ロイペプチド（10μｇ／ml）及びトリス−HCl（20mM，pH8.0）を、示された最終濃度で個々の10mlのサンプルに添加し、そしてそのサンプルを30,000×ｇで４℃で20分間、回転せしめた。得られた上清液を２つの等しいアリコートに分け、6C6樹脂を前記アリコートの１つに添加した（200μｌの樹脂及び約５mg／mlの結合された6C6）。両アリコートを４℃で６時間、軽く混合し、樹脂をペレット化し、そして第２の200μｌのアリコートの樹脂を添加した。サンプルを４℃で一晩、さらに混合した。その組合された樹脂をTTBSにより２度洗浄し、次にすぐに、0.1Ｍのグリシン、0.1ＭのNaClのアリコート（pH2.8）１mlにより２度抽出した。
樹脂から抽出された材料、樹脂により消耗された培地及び出発材料を、10％TCA（トリクロロ−酢酸）により０℃で１時間、それぞれ沈殿せしめ、ペレットをアセトンにより洗浄し、そして次に、減圧下でSDS−PAGEサンプル緩衝液150μｌに再懸濁し、そして煮沸した。個々のサンプル（25μｌ）を、10〜20％のトリシンゲル（Novex）を用いてSDS−PAGEにゆだねた。タンパク質を40Ｖで一晩、ProBlotPVDF膜に移した。免疫反応性タンパク質の可視化は、AMPPD基質について製造業者の指図に従ってTROPIX化学発光システムを用いた。使用される一次抗体濃度は、抗−５，0.1μｇ／ml；92，２μｇ／ml；10D5，２μｇ／ml。
３．ヒト293細胞の培養
ヒト293細胞（ATCC No.CRL−1573）を変性し、APPを過剰発現せしめた（Selkoeなど.（1988）Proc.Natl.Acad.Sci．USA 85：7341）。細胞を、使用する前、10cmの皿において半集密性（subconfluency）に増殖せしめた。代謝ラベリング及び免疫沈殿を、Oltersdorfなど.（1989）Nature 341：144及び（1990）J.Biol.Chem．265：4492に記載されているようにして実質的に行なった。手短に言及すれば、ラベリングは10cmの皿において行なわれた。細胞をメチオニンを有さない培地で洗浄し、0.5mCiの35^S−メチオニンにより補充されたメチオニンを有さない培地２mlにおいて20分間、インキュベートし、完全な培地により洗浄し、完全な培地３mlにおいて２時間、追跡した。ならし培地を集め、そして3000×ｇで10分間透明にし、続いてプロテインA Sepharose（R）（Pharmacia，Piscataway，NJ）により予備吸収せしめた。免疫沈殿は、サンプル当たり1.5mgのプロテインA Sepharose（R）により行なわれた。抗体抗−５はサンプル当たり２μｇで使用され；6C6，7H5及び92はサンプル当たり10μｇで使用された。５mgのウサギ抗マウスIgGは、6C6及び7H5と共に並びに対照サンプルにおいて使用された。沈殿物を、TBS（137mMのNaCl，５mMのKCl，25mMのトリス、pH7.5）、0.1％のNP40，５mMのEDTA，１mMのPMSF，10μｇ／mlのロイペプチンにより４度洗浄した。SDS−PAGEは５％ Laemmliゲル上で行なわれた。
４．Swedish変異によりトランスフェクトされたヒト293細胞の培養
ヒト腎臓293細胞の６つのウェルトレーにおける二重ウェルを、製造業者（Boehringer Mannheim）により記載されるようにして、DOTAP介在トランスフェクションを用いて正常なヒトβAPP又はSwedish変異体βAPPのいづれかを発現するプラスミドベクターにより一般的にトランスフェクトした。40時間後、細胞を、10％ウシ胎児血清を含む、メチオニンを含まないDME中に置き、そして20分後、それらを200μCi／mlの³⁵Ｓ−メチオニンにより35分間ラベル化した。次に、細胞を、10％ウシ胎児血清を含む正常なDME培地中に戻し、そしてさらに2.5時間インキュベートした。培地を細胞から集め、そして1000×ｇで15分間、回転せしめ、すべての細胞を除いた。上清液を半分に分け、そして半分を標準方法により抗−５抗体により免疫沈殿した。他の半分をアガロース結合された6C6抗体と共に一晩インキュベートし、そして6C6アガロースに結合された材料を遠心分離により分離した。残る材料を抗−５抗体により免疫沈殿せしめた。全体の抗−５免疫沈殿物（α５＋）、6C6結合された沈殿物（6C6＋）及び6C6非反応性、抗−５反応性免疫沈殿物（6C6−，α５＋）を、５％ Laemmliゲルにかけ、そして免疫反応性タンパク質をオートラジオグラフィーにより可視化した。
実験的な図面の記載
第２図：ヒト混合された脳細胞培養物からのならし培地における切断されたβAPPの表示
サンプル１は、培養物からのならし培地であり；サンプル２は6C6−反応性βAPPを消耗された培地であり；そしてサンプル３は6C6樹脂から抽出された材料である。パネルＡを、βAPP配列444−592（Oltersdorfなど.（1989）前記及び（1990）前記）に対して生ぜしめられた抗−５抗体によりプローブした。パネルＢを、材料及び方法セクションに記載されるように抗92によりプローブした。パネルＣを、材料及び方法セクションに記載されるようにβAP残基１−16内のエピトープを認識するモノクローナル抗体10D5によりプローブした。Ｃ２及びＣ３において観察された低分子量バンドは、Ｃ１には見出されず、そして6C6樹脂から誘導され、そして一次抗体には無関係なヤギ−抗−マウスIgGアルカリホスファターゼ接合体により認識される（データは示されていない）。
第３図：92抗体の特異性
75才の男性から得られたヒト腰動脈CSF検体１mlを、10％ TCAにより沈殿せしめ、10倍の濃度をもたらし、そして第２図に記載されるようにして処理した（但し、ゲルウェルは４cmのスロットであった）。92抗体を、軽く混合しながら、４℃で10時間、それぞれ約60μＭの濃度で、種々の可能性ある競争ペプチドの存在下でTTBS 0.5ml中、6.7μｇ／mlに希釈した。次に、抗体を１％ゼラチン／TTBSにおいて８倍に希釈し、その後、CSF由来の材料のブロットのストリップと共にインキュベートし、そして第２図に記載されているようにして処理した。競争ペプチドは次の通りであった：レーン１、競争ペプチドは添加されなかった；レーン２、GSGLTNIKTEEISEVK；レーン３、YSGLTNIKTEEISEVKM；レーン４、ISEVKM；レーン５、EISEVKMD；レーン６、CISEVKM；レーン７、YISEVKM。MW＝分子質量マーカー（キロドルトンで示される）。
第４図：細胞系及び一次ヒト胎児脳培養物における異なったＣ−末端に対する抗体により検出される免疫沈殿におけるAPPの分泌された形の分子質量異種性
抗体：抗−５：レーン３，６，９；6C6（βAPペプチド残基１−16に対して検出された）；レーン４，７，10；抗体92（APPアミノ酸591−596に対する）；レーン５，８，11；7H5（APP−KPIに対する）：レーン12。細胞：左側のパネル（レーン１及び３−５）：APP695により安定してトランスフェクトされた293細胞；中間のパネル（レーン２及び６−８）：APP751により安定してトランスフェクトされた293細胞；左側のパネル（レーン９−13）：ヒト胎児脳培養物。対照：レーン１，２及び13：ウサギ抗マウスIgG抗体。矢印：抗体6C6及び92により認識される分泌される形のAPP間での分子質量差異の例。SDS−PAGEは５％ Laemmliゲル上で行なわれた。MW＝分子質量マーカー（キロドルトンにより示される）。
第５図：Swedish変異によりトランスフェクトされたヒト293細胞からのならし培地における切断されたβAPPの表示
第５図は正常な形及びSwedish形の両者のために二重トランスフェクションからの結果を示す。レーン１−４はα５＋であり；レーン５−８は6C6＋であり；そしてレーン９−12は6C6−，α５＋サンプルである。レーン１，２，５，６，９及び10は正常なβAPPからであり、レーン３，４，７，８，11及び12はSwedish βAPPからである。そのSwedish変異は、高められたAFT−αAPPの生成をもたらし、そしてレーン11及び12はレーン９及び10よりも一層のATF−βAPP材料を含む。
結 果
残基１−16内のβAPのエピトープを認識するモノクローナル抗体6C6を、種々のサンプルからの一定のβAPPフラグメントを免疫消耗するために使用した。モノクローナル抗体6C6を樹脂（上記のような）に結合し、そして上記のようにして、ヒト胎児脳細胞培養物からのならし培地と共にインキュベートした。第２図、レーンＣ２に見られるように、この樹脂は細胞培養物のならし培地からのβAB１−６を含むβAPPを効果的に除く。しかしながら、実質的なβAPP免疫反応性は、βAP領域側のエピトープＮ末端に対して向けられた抗−５抗体により検出されるように樹脂により捕獲されない。
βAPPのこの明らかに新規の形を特徴づけるために、本発明者は、βAPP残基591−596を含む合成ペプチドに対する抗体を生成した。この抗体（92と称する）は、樹脂により捕獲されないβAPPの種を認識することが見出されたが（第２図、レーンＢ２）、しかし驚くべき事には、βAB１−６配列を含むβAPPの分泌形と反応しなかった（レーンＢ３）。
交叉反応性のこの欠乏についての説明は、92抗体が残基596に対応する、カルボキシ−末端メチオニンを含むβAPPにおけるエピトープを認識することを示す。従って、本発明者は、92により生成される免疫反応性をブロックする種々の合成ペプチドの能力を試験する。第３図に見出されるように、メチオニン596の同等物で終る、βAPP配列基材のペプチドは92の反応を実質的にブロックし、そしてそれらのカルボキシ末端で１つのアミノ酸よりも長いか又は短いペプチドは競争において比較的効果的ではない。ペプチド競争の同じパターンが細胞培養物上清液（データは示されていない）及びCSFにおいて観察された。一連のパルス−追跡実験は、検出される量の抗体92免疫沈殿可能材料がβAPPの695又は751イソフォームのいづれかを過剰発現する293細胞により生成されることを示した（第４図、レーン５及び８）。ヒト胎児脳細胞培養物に対する類似する実験は、92免疫沈殿可能性材料が低％（５％）のSDS−PAGEにより6C6反応性βAPPから溶解され得ることを示す（第４図、レーン９−11）。胎児脳細胞培養物においては、Kunitzプロテアーゼ阻害ドメイン（KPI）−含有βAPP形の他のプロセッシングはほとんど明白ではなく、但し、薄い同時移動性バンドが抗体92及び抗−KPI抗体7H5免疫沈殿により観察された（レーン11，12）。
混合された脳培養物に抗体92及び6C6沈殿性材料の溶解する能力は、293細胞におけるその位置に比較して生成されるそれぞれの形のほぼ等しい量に少なくとも部分的に依存する。Estusなど.（1992）前記は、他の組織に比較して、ヒト脳は、サイズに基づいて、βAPのアミノ末端で又はその近くで開始すると思われる、比較的多量の実質的にアミロイド原性カルボキシ末端フラグメントを含むことを観察した。
抗体92及び6C6沈殿可能βAPP材料の出現の一時的な一致は、特に長い追跡時間が92及び6C6反応性種の割合の著しい変化をもたらさないので（データは示されていない）、分泌後に生じる第２のタンパク質分解性出来事の見込みに反対の議論を示す。それらの種の免疫学的交叉反応性の完全な欠乏と組合される、SDS−PAGEによる分泌形の分析は、他の分泌経路の存在をさらに示す。他の切断部位は、β−セレクターゼ部位と称され、それは切断がβAP内に生じる、Eschなど.（1990）前記により記載される切断とは異なった、βAPのアミノ末端で生じることを強調する。
前述の発明はより理解するために詳細に記載されて来たが、ある一定の変更が本発明の範囲内で実施され得ることは明らかであろう。

Claims (4)

1. 細胞におけるβ−アミロイド前駆体タンパク質（βAPP）のプロセッシングをモニターするための方法であって、前記細胞から分泌される可溶性アミノ末端βAPPフラグメント（ATF-βAPP）を特異的に検出することを含んで成り、ここで前記βAPPフラグメントのアミノ酸配列は、そのＣ−末端のアミノ酸配列がISEVKMであり、そしてβAPPイソフォーム695の残基18−596、βAPPイソフォーム751の残基18−652及びβAPPイソフォーム770の残基18−671から成る群から選択され、ここで、前記ATF-βAPPは存在するかもしれないβAPPの他の開裂フラグメントから区別され、上記の検出を、βAPPからのβ−アミロイドペプチド（β-AP）の開裂により露出された、前記フラグメントのＣ−末端に特異的に結合する抗体にサンプルを暴露し、そして前記抗体と前記フラグメントとの間の結合を検出する、ことを特徴とする方法。
2. 前記Ｃ−末端の残基が、βAPPイソフォーム695のメチオニン596である、請求項１に記載の方法。
3. 前記サンプルを、βAPPからのβアミロイドペプチドの開裂により露出される前記Ｃ−末端の残基に対して特異的な抗体に暴露する、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記抗体が、βAPPイソフォーム695の残基591-596を含んで成るペプチドであって残基596が露出しているものに対して生じさせたものである、請求項３に記載の方法。

Images