KR100520495B1 - 베타아밀로이드 특이 단일 클론 항체 및 그의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 베타아밀로이드의 형태를 특이적(specific)으로 인식하는 단일 클론 항체에 관한 것으로서, 상기 항체는 1) 베타아밀로이드 및 상기 베타아밀로이드를 안정한 형태(conformation)로 변형시키는 화합물로 구성된 혼합물을 제조하여 항원으로 사용하고 2) 상기 혼합물을 면역화하는 단계로 제조되는 것이다. 본 발명에 의한 항체는 종래에 베타아밀로이드 단독 또는 단순한 길이의 변화를 조절하여 항원으로 사용하여 제조한 항체에 비하여, 베타아밀로이드-화합물과의 혼합물을 사용하여 가장 안정된 형태의 베타아밀로이드 단위체를 강력하게 인식하는 항체를 제조함으로써, 베타아밀로이드의 집적으로 유발되는 알쯔하이머 병의 치료제로 유용하다.

Description

베타아밀로이드 특이 단일 클론 항체 및 그의 제조방법{A BETA-AMYLOID SPECIFIC ANTIBODIES AND ITS PREPARATION}

본 발명은 베타아밀로이드의 형태를 특이적(specific)으로 인식하는 단일 클론 항체에 관한 것으로서, 상기 항체가 1) 베타아밀로이드 및 상기 베타아밀로이드를 안정한 형태(conformation)로 변형시키는 화합물로 구성된 혼합물을 제조하여 항원으로 사용하고 2) 상기 혼합물을 면역화하는 단계로 제조되는 것이다.

빠른 경제적 성장을 이룬 우리나라의 경우 노인인구의 증가로 인해 고령화 사회로 급격히 이행해 가고 있으나, 알츠하이머병으로 대표되는 노인성치매, 뇌졸중, 또는 파킨슨병에 대한 복지대책은 매우 미흡한 실정이다. 특히, 알쯔하이머병 환자에 대하여 효과적인 진단법과 치료법이 없어서 세계 각국의 의학계가 경쟁적으로 모색 중에 있다.

아직까지 발병원인이 명확히 규명되지는 않았으나 노인성치매 환자는 노인반은 중심부분에 베타아밀로이드(β-amyloid: A-beta)로 구성되어진 아밀로이드 침적물(deposit)이 발견되었으며, 상기 베타아밀로이드가 알쯔하이머 병의 직접 원인인지 또는 원인의 결과로 나오는 것인지에 대한 이론은 불분명하다. 그러나 현재까지 알려진 바로는 베타아밀로이드 집적에 의한 시나일 플래그(senile plaque)가 알쯔하이머 병의 가장 대표적인 증상 또는 예후(hallmark)이다.

베타아밀로이드 단백질은 40, 42, 또는 43 개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 주어진 조건에 따라 여러 가지의 형태(conformation)로 존재한다고 알려져 있다. 즉, 펩타이드가 집적될 때, 베타이밀로이드의 형태는 높은 베타 시트(beta-sheet) 상태를 포함하고 있는 반면에 베타아밀로이드가 집적이 잘 되지 않는 1% 아세트산의 조건에서는 랜덤 코일형(random coil)으로 존재하는 것으로 보고되었다.

이러한 베타아밀로이드의 형태(conformation)는 pH의 변화에 따라 변화하게 되고, 이에 따라 플라그의 생성 속도가 급격히 달라질 수 있다. 보다 구체적으로 pH 5.8 정도에서 베타아밀로이드는 플라그의 형성이 극대점을 나타내며, pH 5.8보다 낮거나 높으면 침착 속도는 늦어진다. 따라서 생리학적 pH에서는 베타아밀로이드의 형태를 정확하게 예측할 수 없지만, 플라그의 생성 속도가 느린 결과를 관찰함으로써, 베타아밀로이드의 형태가 랜덤 코일형(random coil)일 가능성을 예측할 수 있다.

그러나 생리학적 pH에서의 이와 같은 조건이 계속 진행되는지에 관해서는 별로 알려진 바 없다. 또한, 통상적으로 단백질이 가장 안정한 형태로 변화하고 평형이 진행되듯이, 형태학적으로 불안정한 베타아밀로이드 단위체는 베타 시트(beta-sheet)의 생성 및 중합반응(polymerization)에 의해 안정한 형태로 집적할 수 있고, 이것이 베타아밀로이드 집적에 의한 시나일 플래그(senile plaque) 현상으로 진행된다.

최근 연구 결과, 잘못 폴딩된 베타아밀로이드의 올리고머가 베타아밀로이드의 단위체 또는 플래그화 된 베타아밀로이드가 갖는 것보다 강한 독성을 띤다고 밝혀졌다.

항체는 항원의 형태에 따라 상기 항원을 인식하려는 특징을 가지는 데, 그의 일례로서, 베타아밀로이드의 형태가 랜덤 코일형(random coil)일 경우, 이에 대한 항원의 형태(conformation)에 대응하는 항체가 주종을 이룰 것이다. 따라서, 최근 연구 결과에 따르면 베타아밀로이드를 특이적으로 인식하는 항체가 베타아밀로이드의 집적을 저해할 수 있는 치료제로서 제시되었다[Dodel R, Hampel H, Depboylu C, Lin S, Gao F, Schock S, Jackel S, Wei X, Buerger K, Hoft C, Hemmer B, Moller HJ, Farlow M, Oertel WH, Sommer N, Du Y. Human antibodies against amyloid beta peptide: a potential treatment for Alzheimer's disease. Ann. Neurol. (2002) 52, 253-256. Lambert MP, Viola KL, Chromy BA, Chang L, Morgan TE, Yu J, Venton DL, Krafft GA, Finch CE, Klein WL. Vaccination with soluble Abeta oligomers generates toxicity-neutralizing antibodies. J. Neurochem. (2001) 79, 595-605.].

보다 상세하게는, 항체가 뇌혈류막(Brain Blood Barrier)을 통과하여 뇌 속으로의 침투가 가능하다는 사실이 새롭게 알려지면서 베타아밀로이드를 특이적으로 인식할 수 있는 항체는 베타아밀로이드 집적을 직접 방해할 수 있고, 상기 항체에 의해서 인식된 베타아밀로이드는 면역반응에 의하여 제거될 수 있다. 따라서, 베타아밀로이드를 특이적으로 인식할 수 있는 항체가 베타아밀로이드 집적에 유발되는 알쯔하이머 병에 대한 치료제로 사용될 수 있다.

최근까지 베타아밀로이드 항체에 대한 임상실험은 백신 요법 및 면역요법으로 진행되었다. 그러나 베타아밀로이드 특이적 백신 요법은 염증 반응을 수반하는 여러 가지 부작용이 관찰되어 중지된 상태이나, 베타아밀로이드를 인식하는 항체 및 이에 대한 백신 요법은 알쯔하이머 병의 가장 중요한 치료제 개발에 대한 가능성을 제시하고 있다.

면역 요법은 주로 펩타이드 길이를 변화시킨 여러 가지 펩타이드를 이용하여 제작된 베타아밀로이드에 대한 항체를 면역 반응시켜 얻는 것이다.

종래에는 베타아밀로이드를 특이적으로 인식할 수 있는 항체를 개발하기 위하여, 베타아밀로이드의 길이(1-16, 1-28, 12-28, 1-38, 1-42 또는 1-40, 1-43 등)를 조절하거나, 상기 베타아밀로이드의 일부를 절단한 펩타이드를 항원으로 사용하였다. 그의 일례로서, 환 펩타이드를 제조하거나 다이설파이드(disulfide) 결합을 도입하여 불안정한 펩타이드의 형태(conformation)를 안정화하기 위하여 시도되었다.

그러나 펩타이드 길이를 달리한다 하여도 그들 나름대로 가지는 베타아밀로이드 형태에 대한 평형은 계속 진행될 것으로 예상된다. 따라서, 펩타이드 길이를 변화시켜 제작된 베타아밀로이드 항체 중 일부는 랜덤 코일(random coil) 또는 다른 일부는 베타 시트를 인식할 것이다.

그러므로, 종래의 베타아밀로이드 자체 또는 길이를 변화시킨 베타아밀로이드를 항원으로 사용하여, 항체를 제작하는 방법에서 벗어나, 여러 가지 형태(conformation)를 갖는 베타아밀로이드의 특징을 이용하여, 베타아밀로이드의 특이적 형태를 인식하는 항체 제작이 요구된다. 상기의 요구에 만족하는 항체를 제작함으로써, 단백질의 형태 변화에 따라, 그 변화를 인식할 수 있는 항체를 제작할 수 있다.

그러나, 베타아밀로이드의 형태(conformation)를 변화시킨 항원을 적용하여 제조된 항체에 대한 연구는 거의 시도된 바가 없을 뿐만 아니라, 베타아밀로이드의 형태(conformation)변화 및 베타아밀로이드의 길이에 따른 형태의 변화가 어떤 경로로 진행되었는가에 관해 보고된 바 없다.

본 발명자들은 상기의 문제점을 개선하고자 노력하던 중, 항원-항체 반응에 의해서, 안정한 형태의 베타아밀로이드 형태로 변형시킨 항원으로서, 베타아밀로이드-화합물의 혼합물을 이용하여, 안정한 형태의 베타아밀로이드 특이 단일 클론 항체를 제조함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 베타아밀로이드의 형태를 특이적(specific)으로 인식하는 단일 클론 항체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 1) 베타아밀로이드 및 상기 베타아밀로이드를 안정한 형태(conformation)로 변형시키는 화합물로 구성된 혼합물을 제조하여 항원으로 사용하고, 2) 상기 혼합물을 면역화하는 단계로 구성된, 베타아밀로이드의 형태를 특이적(specific)으로 인식하는 단일 클론 항체의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 베타아밀로이드의 형태를 특이적(specific)으로 인식하는 단일 클론 항체 및 그의 제조방법을 제공한다.

보다 구체적으로는 상기 제조방법이 1) 베타아밀로이드 및 상기 베타아밀로이드를 안정한 형태(conformation)로 변형시키는 물질로 구성된 혼합물을 제조하여 항원으로 사용하고, 2) 상기 혼합물을 면역화하는 단계로 구성된다.

항원-항체 반응에 의해서, 항원이 가장 안정한 형태를 가질 수 있도록 유도한 것으로서, 베타아밀로이드 및 상기 베타아밀로이드와 강력한 결합을 하는 화합물과의 혼합물을 이용함으로써, 화합물 존재 하에서는 베타아밀로이드의 형태가 플라그 형성이 감소되는 방향으로 평형을 변화시키고 베타아밀로이드의 형태(conformation)가 한쪽으로 기울어진 결과를 가져올 것이다. 이를 항원으로 이용하여 쥐에 주사하게 되면, 베타아밀로이드 및 화합물과의 강한 결합력 때문에 상당시간 동안 베타아밀로이드-화합물간의 혼합물 형태를 유지할 것이므로, 항체는 상기 혼합물에 대해 특이적으로 제조되는 것이다.

베타아밀로이드는 1 ∼ 43의 아미노산 및 이들의 일부를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 1∼42의 아미노산을 사용한다.

상기에서 "물질"이라 함은 베타아밀로이드를 안정한 형태(conformation)로 변형시킬 수 있는 것이면 화합물질 또는 생체물질을 포함할 수 있음을 의미한다.

본 발명의 혼합물은 베타아밀로이드 및 상기 베타아밀로이드와 강력히 결합할 수 있는 화합물과 혼합하는 것이다. 이때 화합물은 하기 화학식 1의 헥사운데실메틸피페리디움 브로마이드(hexaundecylmethylpiperidinium bromide; 이하 "HMPBr"라고 한다)이며, 자체가 베타아밀로이드 침착 방해 효과를 가진다.

상기 HMPBr은 친수성과 소수성을 동시에 가지고 있는 세제(detergent)의 일종으로, HTS(high throughput screening)를 통하여 베타아밀로이드의 집적을 방해하는 물질이다. 원편광 이색성(circular dichroism, CD)을 이용하여, 베타아밀로이드-HMPBr 혼합물이 용액 상에서 존재하는 조건에서 관찰한 결과, 베타아밀로이드 단독일 경우보다 더욱 안정한 베타 시트형(beta-sheet)이 형성되었다. 그러므로 불안정하거나 일시적인 베타 시트를 가진 형태의 존재가 급격하게 감소되고, 대부분의 경우에 가장 안정한 형태의 베타아밀로이드만이 존재할 것이다.

따라서, 베타아밀로이드-HMPBr 혼합물이 가장 안정한 형태의 항원으로 제공될 때, 항원-항체 반응에 따라 가장 안정한 형태에 대해 강한 접합력을 갖는 베타아밀로이드를 특이적(specific)으로 인식하는 항체가 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 혼합물은 베타아밀로이드 및 생체 물질로 구성될 수 있으며, 상기 생체물질은 순수한 형태 또는 변조된 형태로 사용될 수 있다.

베타아밀로이드와 결합하는 생체물질로는 베타아밀로이드와 결합하여 안정한 형태로 변화시킬 수 있는 것이면 사용 가능하고, 그의 일례로는 다른 종의 펩타이드(peptide-aptamer), 단백질, RNA-엡타머(RNA-aptamer) 및 DNA-엡타머(DNA-aptamer)으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.

또한 본 발명의 베타아밀로이드의 형태를 특이적(specific)으로 인식하는 단일 클론 항체는 베타아밀로이드를 강력하게 인식하여 플라그를 형성할 수 있는 베타아밀로이드 형태를 최소화할 수 있으므로, 베타아밀로이드의 집적으로 유발되는 알쯔하이머 병의 치료제로 활용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다.

단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 베타아밀로이드를 특이적(specific)으로 인식하는 단일 클론 항체는 엘리사(enzyme-linked immunosorbent assay; 이하 "ELISA:라고 한다) 또는 표면 플라스몬 공명(surface plasomon resonance; 이하 "SPR"라고 한다)의 방법을 통해 증명되었다.

<실시예 1> 베타아밀로이드를 특이적(specific)으로 인식하는 항체의 제작

베타아밀로이드는 1-42 펩타이드 서열을 갖는 시그마(Sigma)사의 제품을 이용하였다. 화학식 1의 화합물인 HMPBr은 통상의 공지방법으로 합성하였다[Wood SJ, MacKenzie L, Maleeff B, Hurle MR, Wetzel R Selective inhibition of Abeta fibril formation. J. Biol. Chem. (1996) 271, 4086-4092]. 상기 베타아밀로이드 및 HMPBr을 1:1 몰비율로 혼합하고, 이때 베타아밀로이드 10 ㎍, PBS 250 ㎕, 0.15 M NaCl 및 0.01 M의 pH 7.5 소듐 포스페이트를 항원으로 제조하였다. 상기 항원과 동량의 complete Freund's adjuvant(Sigma; 250 ㎕)와 섞고 상기 에멀젼을 8 주령 된 암놈 BALB/C 생쥐에 주사하였으며, 2 ∼ 4 차 면역은 2 주 간격으로 실시하였다. complete Freund's adjuvant 대신에 incomplete Freund's adjuvant(Sigma; 250 ㎕)를 동일한 방법으로 실시하여 얻어진 에멀젼을 생쥐에 주사하였다. 이후, incomplete Freund's adjuvant로 추가접종(boost)하였다.

<실시예 2> 단일 클론 항체의 제작

항체가 항원 특이적인 것을 확인 한 후에 항원을 추가접종(boost) 한지 5 ∼ 7 일 후 쥐를 희생시킨 후 비장(spleen)을 적출하여 B cell (1 ×108)을 얻어낸 후 골수종 세포(myeloma cell; SP2-0-Ag14 세포주; 1 ×108) 과 PEG(8000, Sigma)를 이용하여 융합시켰다. 이때 10 mL의 HY 미디아를 사용하였으며, 융합된 세포는 HAT (hypoxanthine-aminopterin-thymidine) 미디아에서 2 주 동안 배양하였다. 배양액을 HT 미디아로 바꾸고 2 주 동안 재배양하였다. 배양된 상등액을 이용하여 베타아밀로이드에 특이적인 항체가 있는지를 하기 실험예 1의 방법으로 수행하여, ELISA 결과에 의하여 선택된 웰들의 세포들은 제한 희석법(limiting dilution method; Halow and Lane)에 의하여 클로닝하여 단일 클론을 얻었다. 즉, 웰로부터 얻어낸 세포의 수를 센 다음에 1 개의 세포에 3 개의 웰로 희석시켜 96-웰에 다시 깔아 HY 미디아에서 배양하였다. 단일 클론 항체의 상등액을 하기 실험예 1의 ELISA 방법으로 측정한 결과, 베타아밀로이드-HMPBr의 혼합물을 특이적으로 인식하는 것을 확인하였다.

<실험예 1> 항체(antisera)로부터 항체가(titering) 측정

항체의 항원 의존성을 관찰하기 위하여, 하기와 같이 실험을 수행하였으며, 상기 실시예 1에서 면역반응을 실시한 지 5 일 후에 피를 채취하여 사용하였다.

베타아밀로이드 및 HMPBr을 1:1 로 섞은 용액 100 ㎕ (2 ㎎ 베타 아밀로이드/1 ㎖ PBS)를 각각의 웰(well)에 위치시키고 상온에서 4 시간 동안 배양하였고 4℃에서 하루동안 배양하였다. 배양 후, PBS 200 ㎕으로 4 번씩 세척하였다. 쥐에서 채취한 피는 PBS를 이용하여 1/2 연속적인 희석(serial dilution) 방법에 의하여 희석하고 각각 100 ㎕씩 준비했다. 상기 용액들을 베타아밀로이드 및 HMPBr을 1:1로 섞은 용액을 배양한 웰에 넣고 상온에서 2 시간 동안 배양하였다. 희석시킨 항체(antisera)를 웰에서 제거하고 PBS 200 ㎕으로 4 번씩 세척하였다. 1/10000로 희석시킨 anti-mouse IgG-alkaline phosphatase conjugate (0.02% PBS-T) 100 ㎕를 각각의 웰에 첨가하고 상온에서 2 시간 동안 배양하였다. 용액을 제거한 후 PBS 200 ㎕으로 4 번씩 세척하였다. 세척 후, 100 ㎕의 기질 p-Nitrophenyl phosphate (pNPP; 1.0 mg/mL)를 넣고 37℃에서 20 분간 배양하였다. 대조구로서, 동일량의 베타아밀로이드 용액을 HMPBr 없이 배양한 웰을 준비했으며, 베타아밀로이드 1-40에 대한 항체 (Sigma; IgG 3.2 mg/mL)를 1/1000 및 1/2000로 희석하여 양성군(positive control)으로 사용하였다. 상기에서 준비한 각각 항체에 대하여 ELISA를 이용하여 405 nm의 visible light에서 흡광도를 측정한 결과를 하기 표 1에 기재하였다.

항체 종류	베타아밀로이드 + HMPBr coated plate	베타아밀로이드coated plate
베타아밀로이드 + HMPBr 혼합물 anti-sera (1/10 diluted)	0.178	0.080
베타아밀로이드 + HMPBr 혼합물 anti-sera (1/20 diluted)	0.163	0.062
베타아밀로이드 + HMPBr 혼합물 anti-sera (1/40 diluted)	0.173	0.040
베타아밀로이드 + HMPBr 혼합물 anti-sera (1/80 diluted)	0.139	0.028
베타아밀로이드 anti-sera (1/10 diluted)	0.148	0.110
베타아밀로이드 anti-sera (1/20 diluted)	0.131	0.064
베타아밀로이드 anti-sera (1/40 diluted)	0.119	0.055
베타아밀로이드 anti-sera (1/80 diluted)	0.101	0.021
베타아밀로이드 (1-40) 특이 항체 (Sigma; 1/1000 diluted)	0.172	0.203
베타아밀로이드 (1-40) 특이 항체 (Sigma; 1/2000 diluted)	0.120	0.170
기질 (pNPP) 만 넣은 웰	0.000	0.000

상기 표 1에서 기술된 바와 같이, 베타아밀로이드-HMPBr의 혼합물 형태로 면역반응 시킨 항체(antisera)에서는 베타아밀로이드-HMPBr에 대한 특이적인 항체가 제조되었음을 알 수 있었다. 반면에, HMPBr없이 베타아밀로이드만을 면역화 반응시킨 항체(antisera)에서는 전반적으로 베타아밀로이드-HMPBr 혼합물을 항원으로 사용한 것에 비하여 낮은 항체가(titer)를 보였으며, 베타아밀로이드-HMPBr에 대해 역시 인식하는 것으로 조사되었다. 상기의 결과를 근거하면, 베타아밀로이드 단독으로 처리했을 경우보다 베타아밀로이드-HMPBr의 혼합물로 존재할 때, 이에 대한 항체가 더욱 잘 만들어졌음을 확인하였다.

또한, 본 발명과 베타아밀로이드의 길이에서 약간의 차이가 있기는 하지만 종래 시그마(Sigma)사에서 시판하고 있는 베타아밀로이드(1-40)에 대한 항체는 베타아밀로이드-HMPBr의 혼합물보다 HMPBr없이 베타아밀로이드만이 존재한 경우 인식하는 정도가 높게 관찰되었다. 따라서, 본 발명의 베타아밀로이드-화합물과의 혼합물을 항원으로 이용하여 항체를 제조하면, 종래의 항체에 비하여, 특이성 있는 항체가 얻어짐을 알 수 있었다.

<실험예 2> 항체(anti-sera)의 결합력 비교

본 발명의 항체 (anti-sera)와 보통 (normal) 항체(anti-sera)에 대한 베타아밀로이드 특이성을 확인하기 위하여 surface plasmon resonance를 이용하여 하기와 같이 실험하였다, 본 발명에서 제조한 항체(anti-sera)에 대한 특이성을 측정하기 위하여, 베타아밀로이드를 flowcell 표면에 붙이고, 면역화 한 항체(anti-sera)를 흘림으로서 surface plasmon resonance를 통하여 쉽게 알 수 있었다. 일련의 실험방법은 바이아코어(Biacore)사에서 제공하는 규칙을 준수하여 수행되었다.

CM5 센서칩(Biacore) 표면에 있는 4 개의 flow cell 중 2 번 flow cell에 베타아밀로이드(Sigma)를 고정하였다. PBS buffer(pH 7.4)를 5 ㎕/min의 유속으로 흘려준 후에 0.05 M NHS(N-hydroxysuccinimide)와 0.2 M EDC (N-ethyl-N'-(dimethylaminopropyl)-carbodiimide) 혼합액 35 ㎕를 5 ㎕/min의 유속으로 흘려주어 센서칩 표면을 활성화시켰다. 이후, 50 ㎍/mL의 농도로 소듐 아세테이트 용액 (10 mM, pH 4.0)으로 희석시킨 베타아밀로이드 35 ㎕ 를 5 ㎕/min의 유속으로 흘려주어 베타아밀로이드를 칩 표면에 고정하였다. 베타아밀로이드와 반응하지 않고 활성화 상태로 남아있는 센서칩 표면은 1M 에탄올아민(ethanolamine) 35 ㎕를 흘려주어 고정화하였다. CM5 센서칩의 1번 flow cell에 0.05 M NHS와 0.2 M EDC 혼합액 35 ㎕를 흘려주어 활성화시킨 후, 1M 에탄올아민 35 ㎕를 흘려주어 대조구를 마련하였다.

항체(anti-sera)와 베타아밀로이드 사이의 친화력 측정은 일반 생쥐로부터 얻은 혈청(serum)과 베타아밀로이드를 면역화한 쥐로부터 얻은 혈청(serum), 및 베타아밀로이드-HMPBr 혼합물을 항원으로 사용하여 면역화한 쥐로부터 얻은 혈청의 세 가지 항체를 가지고 수행하였다.

상기 세 가지 항체에 포함된 단백질의 농도는 OD280값이 0.1이 되도록 PBS (pH 7.4)로 희석하였다. 센서칩 1, 2번 flow cell에 running buffer(PBS, pH7.4)를 30 ㎕/min의 유속으로 흘려서 센서칩 표면을 평형으로 만든 후에 준비한 세 가지 항체를 30 ㎕/min의 유속으로 순서대로 흘려주며 항체의 결합력을 측정하여 도 1에 나타내었다.

도 1에서 살펴본 세 가지의 항체의 단백질 양은 0.07 ㎎/㎖를 사용하였으며 이때 주입시 RU(Response Unit; RU)의 값은 베타아밀로이드-HMPBr의 혼합물을 면역화한 항체 140, 베타아밀로이드 항체 110, 및 면역화하지 않은 일반 항체 55로 관찰되었으며, 분리(dissociation)가 시작한지 200 초 후의 RU 값은 각각 116, 95, 및 45로나타내었다. 따라서, 본 발명의 베타아밀로이드-HMPBr의 혼합물을 면역화한 항체가 가장 높은 RU 값을 보임으로써, 베타아밀로이드를 직접 면역화한 항체보다 더욱 베타아밀로이드에 특이적 항체가 만들어 졌음을 확인하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 베타아밀로이드 및 상기 베타아밀로이드를 안정한 형태(conformation)로 변형시키는 화합물로 구성된 혼합물을 제조하여 항원으로 사용하고, 상기 혼합물을 면역화시켜 베타아밀로이드의 형태를 특이적(specific)으로 인식하는 단일 클론 항체를 제조하였다. 본 발명의 베타아밀로이드-화합물의 혼합물을 항원으로 사용함으로써, 베타아밀로이드를 가장 안정한 형태로 유도하고, 가장 안정한 형태에 대해 강한 접합력을 가지는 항체를 제조할 수 있다. 종래에 베타아밀로이드 단독 또는 단순한 길이의 변화를 조절하여 항원으로 사용하여 제조한 항체에 비하여, 본 발명에 의한 항체는 베타아밀로이드-화합물과의 혼합물을 사용하여 가장 안정된 형태의 베타아밀로이드 단위체를 강력하게 인식하는 기능적으로 향상된 항체를 제조함으로써, 베타아밀로이드의 집적으로 유발되는 알쯔하이머 병의 치료제로 활용될 수 있다.

도 1은 베타아밀로이드에 대한 항체의 결합력을 비교한 그래프이다.

(a) 베타아밀로이드-HMPBr 혼합물을 면역화한 항체

(b) 베타아밀로이드 항체

(c) 면역화하지 않은 일반 항체

Claims (7)

1) 베타아밀로이드 및 상기 베타아밀로이드를 단일체 상태로 유지시켜 주는 화학식 1의 HMPBr과 혼합하는 단계; 2) 상기 혼합물로 면역화 하는 단계; 로 구성되는 것을 특징으로 하는 베타아밀로이드 단일체의 단일 클론 항체 제조방법.

화학식 1

삭제

제 1 항에 있어서, 상기 베타아밀로이드는 1∼42의 아미노산 및 이들의 일부를 포함하는 것을 특징으로 하는 베타아밀로이드 단일체의 단일 클론 항체 제조방법.

삭제

삭제

삭제

제 1항에 있어서, 상기 베타아밀로이드가 베타-시트 상태인 것을 특징으로 하는 베타아밀로이드 단일체의 단일 클론 항체 제조방법.