FI111546B - In vitro -menetelmiä, joilla voidaan monitoroida beta-amyloidiesiasteproteiinin prosessointia solussa, diagnosoida tai monitoroida beta-amyloidiin liittyvää tautia tai tunnistaa beta-amyloidin tuotannon inhibiittoreita, sekä beta-amyloidiesiasteproteiinin liukoinen fragmentti - Google Patents

In vitro -menetelmiä, joilla voidaan monitoroida beta-amyloidiesiasteproteiinin prosessointia solussa, diagnosoida tai monitoroida beta-amyloidiin liittyvää tautia tai tunnistaa beta-amyloidin tuotannon inhibiittoreita, sekä beta-amyloidiesiasteproteiinin liukoinen fragmentti Download PDF

Info

Publication number
FI111546B
FI111546B FI944847A FI944847A FI111546B FI 111546 B FI111546 B FI 111546B FI 944847 A FI944847 A FI 944847A FI 944847 A FI944847 A FI 944847A FI 111546 B FI111546 B FI 111546B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
βαρρ
fragment
amyloid
beta
residues
Prior art date
Application number
FI944847A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI944847A0 (fi
FI944847A (fi
Inventor
Peter A Seubert
Dale B Schenk
Lawrence C Fritz
Original Assignee
Lilly Co Eli
Athena Neurosciences Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27128086&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=FI111546(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Lilly Co Eli, Athena Neurosciences Inc filed Critical Lilly Co Eli
Publication of FI944847A0 publication Critical patent/FI944847A0/fi
Publication of FI944847A publication Critical patent/FI944847A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI111546B publication Critical patent/FI111546B/fi

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5091—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5058—Neurological cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
    • A01K2267/0312—Animal model for Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
    • A01K2267/0318—Animal model for neurodegenerative disease, e.g. non- Alzheimer's
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4709—Amyloid plaque core protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)

Description

111546
In vitro -menetelmiä, joilla voidaan monitoroida β-amyloidiesiasteproteiinin prosessointia solussa, diagnosoida tai monitoroida β-amyloidiin liittyvää tautia tai tunnistaa β-amyloidin tuotannon inhibiittoreita, sekä β-5 amyloidiesiasteproteiinin liukoinen fragmentti
Keksinnön tausta 1. Keksinnön ala Tämä keksintö koskee yleisesti in vitro -menetel-10 miä, joilla voidaan monitoroida β-amyloidiesiasteproteiinin prosessointia. Erityisemmin tämä keksintö koskee tällaisten menetelmien käyttöä Alzheimerin taudin diagnoosia, prognoosia ja hoitovasteen tarkkailua varten ja Alzheimerin taudin hoitoon sopivien mahdollisten lääkkeiden seulontaa 15 ja arviointia varten.
Alzheimerin taudin piirteenä ovat lukuisat amy-loidiplakit ja neurofibrillikimput (hyvin huonoliukoiset proteiiniaggregaatit), joita esiintyy Alzheimerin taudista kärsivien potilaiden aivoissa, erityisesti niillä alueilla 20 jotka ovat osallisena muistissa ja kognitiossa. Vaikka aikaisemmin oli merkittävää tieteellistä väittelyä siitä, ovatko plakit ja kimput Alzheimerin taudin syy tai pelkästään sen seuraus, viimeaikaiset löydökset viittaavat siihen, että amyloidiplakki on aiheuttava esiaste tai tekijä.
25 Erityisesti on havaittu, että β-amyloidipeptidin, amyloidi-plakin pääainesosan, tuotanto voi johtua mutaatioista geenissä, joka koodittaa amyloidiesiasteproteiinia, proteiinia, joka normaalisti prosessoituna ei tuota β-amyloidi-peptidiä. Sellaisten mutaatioiden tunnistus amyloidiesias-30 teproteiinin geenissä, jotka saavat aikaan perinnöllistä, varhain alkavaa Alzheimerin tautia, on vahvin todistusaineisto siitä, että amyloidimetabolismi on keskeinen tapahtuma taudin taustalla olevassa patogeenisessä prosessissa. Neljään raportoituun tautia aiheuttavaan mutaatioon kuuluu 35 770-isomuotoa koskien väliini717 isoleusiiniksi (Goate ym. (1991) Nature 349:704-706), väliini717 glysiiniksi (Chartier 111546 2
Harlan ym. (1991) Nature 353:844 - 846, väliini717 fenyy- lialaniiniksi (Murrell ym. (1991) Science 254:97-99) ja 695-isomuotoa koskien kaksoismutaatio, joka muuttaa lysii-ni595-metioniini596 :n asparagiini595-leusiini596 :ksi (Mullan 5 ym. (1992) Nature Genet 1:345-347) . Lisäksi β-amyloidipep-tidi on toksinen aivojen neuroneille ja hermosolujen kuolema liittyy tautiin.
Niinpä kyky monitoroida amyloidiesiasteproteiinin prosessointia solussa olisi arvoltaan merkittävä Alzheime-10 rin taudin diagnoosia, prognoosia ja terapeuttista valvontaa silmällä pitäen. Olisi erityisesti suotavaa tunnistaa minimaalisen invasiivisia menetelmiä, joilla voitaisiin seuloa ja arvioida havaittavissa olevia diagnostisia mark-kereita helposti saatavilla olevissa potilasnäytteissä, ku-15 ten seerumi, aivo-selkäydinneste (CSF) ja vastaavat.
On ehdotettu monia mahdollisia diagnostisia markke-reita Alzheimerin taudille. Erityisen mielenkiintoisia tämän keksinnön kannalta ovat tietyt amyloidin esiasteprote-iinin fragmentit, mukaan lukien karboksiterminaaliset frag-20 mentit (kuten itse β-amyloidipeptidi ja sen fragmentit), ja aminoterminaaliset fragmentit (kuten tietyt 25 kDa:n, 105 kDa:n ja 125 kDa:n fragmentit). Tähän mennessä mikään ehdotetuista markkereista ei ole osoittautunut ratkaisevaksi kuolemaa edeltävää Alzheimerin taudin diagnoosia tai moni-25 torointia silmällä pitäen.
Niinpä olisi suotavaa tunnistaa muita ja vaihtoehtoisia diagnostisia markkereita Alzheimerin taudille. Sellaisten markkereiden pitäisi olla hyödyllisiä sinänsä ja/ tai yhdistelmänä muiden diagnostisten markkereiden ja mene-30 telmien kanssa. Diagnostiset markkerit olisivat edullisesti havaittavissa ruumiinnesteissä, kuten CSF, veri, plasma, seerumi, virtsa, kudos, ja vastaavat, niin että voidaan käyttää hyödyksi minimaalisen invasiivisia menetelmiä.
Tätä keksintöä varten edelleen mielenkiintoisia 35 ovat in vitro -järjestelmät ja menetelmät, joilla voitaisiin seuloa mahdollisia lääkkeitä, silmällä pitäen kykyä 3 111546 inhiboida tai estää β-amyloidiplakin tuotantoa. Olisi suotavaa tarjota menetelmiä ja järjestelmiä testattavien yhdisteiden seulontaa varten, silmällä pitäen kykyä inhiboida tai estää amyloidiesiasteproteiinin muuttumista β-amyloidi-5 peptidiksi. Erityisesti olisi suotavaa perustaa sellaiset menetelmät ja järjestelmät sellaisten metabolisten reittien varaan, joiden on havaittu olevan mukana sellaisessa muuttamisessa, jossa testattava yhdiste kykenisi estämään tai häiritsemään metabolista reittiä, joka johtaa muuttumiseen.
10 Sellaisten menetelmien ja järjestelmien pitäisi olla nopeita, taloudellisia ja soveliaita seulottaessa suuria määriä testattavia yhdisteitä.
2. Tekniikan tason kuvaus β-amyloidipeptidi (johon viitataan myös nimellä A4, 15 βΑΡ, Αβ, tai ΑβΡ, katso US-patenttijulkaisu nro 4 666 829 ja Glenner ja Wong (1984) Biochem. Biophys. Res. Commun. 120:1131 - 1135) on peräisin β-amyloidiesiasteproteiinista (βΑΡΡ), joka ekspressoidaan eri tavoin silmukoituina muotoina, joiden koko on 695, 751 ja 770 aminohappoa. Katso 20 Kang ym. (1987) Nature 325:773 - 776; Ponte ym. (1988) Nature 331:525 - 527; ja Kitaguchi ym. (1988) Nature 331:530 - 532. Amyloidiesiasteproteiinin normaali proses sointi käsittää proteolyyttisen katkaisun tähteiden Lys16 ja Leu17 välisessä kohdassa (numerointi AP-aluetta silmäl-25 lä pitäen, jossa Asp597 on tähde 1 Kangin ym. artikkelissa (1987) edellä), lähellä solukalvon läpäisevää osaa, mikä johtaa solunulkoisen osan, jossa on jäljellä β-amyloidipeptidisekvenssin jäljellä oleva osa, jatkuvaan erittymiseen (Esch ym. (1990) Science 248:1122 - 1124). Tä-30 mä reitti vaikuttaa olevan laajalti säilynyt lajien kesken : ja läsnä monissa solutyypeissä. Katso Weidemann ym. (1989)
Cell 57:115 - 126 ja Oltersdorf ym. (1990) J. Biol. Chem. 265:4492 - 4497. Tämä normaali reitti katkaisee esiastepro-teiinin alueelta, joka vastaa β-amyloidipeptidiä, ja näin 35 ilmeisesti estää sen muodostumisen. Toinen jatkuvasti erittyvä βΑΡΡ:n muoto on havaittu (Robakis ym. Soc. Neurosci.
111546 4 26. lokakuuta 1993, Abstract nro 15.4, Anaheim, CA.), joka sisältää enemmän βΑΡ-sekvenssiä karboksiterminaalisessa suunnassa siitä muodosta, joka on kuvattu Eschin ym. artikkelissa edellä.
5 Golde ym., (1992) Science 255:728 - 730, valmisti vat sarjan amyloidiesiasteproteiinin deleetiomutantteja ja panivat merkille yksittäisen katkaisukohdan β-amyloidipep-tidin alueella. Tämän havainnon pohjalta esitettiin olettamus, että β-amyloidipeptidin muodostuminen ei sisällä eri-10 tysreittiä. Estus ym:n artikkeli (1992) Science 255:726 -728, opettaa, että aivosoluissa havaittavat amyloidiesiasteproteiinin suurimmat karboksiterminaaliset proteolyytti-set fragmentit sisältävät koko β-amyloidipeptidialueen.
PCT-hakemus W0 92/00 521 kuvaa menetelmiä, joilla 15 voidaan arvioida Alzheimerin tautia, joka perustuu siihen että mitataan tiettyjen 25 kDa:n, 105 kDa:n ja 125 kDa:n liukoisten amyloidiesiasteproteiinin johdannaisten määriä potilaan aivo-selkäydinnesteessä. Kuvio 3 WO 92/00 521:ssä viittaa siihen, että amyloidiesiasteproteiinin katkaisu voi 20 tapahtua β-amyloidipeptidin aminopään vieressä, jolloin tuotetaan liukoinen aminoterminaalinen fragmentti, mutta sellaisesta katkaisusta ei tässä hakemuksessa esitetä todisteita tai pohdintaa. Kennedy ym. (1992) Neurodegeneratχοή 1:59 - 64, esittävät tuloksia eritetystä βΑΡΡ-muodosta, 25 jonka piirteenä on sen reaktiivisuus vasta-aineiden kanssa, jotka suuntautuvat βΑΡΡ:η tähteitä 527 - 540 vastaan, ja reaktiivisuuden puute vasta-aineiden kanssa, jotka olivat kohdistuneet βΑΡ:n 15 ensimmäistä aminohappoa vastaan. Ei tarjota suoraa todistetta, joka viittaisi βΑΡΡ-muodon 30 katkaisukohtaan tai karboksipään identiteettiin. PCT-: hakemus W0 91/16 628 kuvaa menetelmiä, joilla voidaan diag nosoida tautia, mikä perustuu amyloidiesiasteproteiinien ja sen fragmenttien havaitsemiseen, ja joissa käytetään vasta-aineita neksiini-2-proteaasia tai amyloidiesiasteproteiinia 35 vastaan.
5 111546
Viimeaikaiset raportit osoitt :at, että terveet solut tuottavat liukoista β-amyloidipeptidiä soluviljelyra-vintonesteeseen (Haass ym. (1992) Nature 359:322 - 325) ja ihmisen ja eläimen CSF:ssä (Seubert ym. (1992) Nature 5 359:325 - 327).
Keksinnön yhteenveto
Tarjotaan in vitro -menetelmiä, joilla voidaan havaita ja monitoroida β-amyloidiesiasteproteiinin (βΑΡΡ) eritetty liukoinen aminoterminaalinen fragmentti biologi-10 sissa näytteissä, joissa fragmentti on tuloksena katkaisusta β-amyloidipeptidin (βΑΡ) alueen aminopäässä tai sen lähellä. Erityisesti βΑΡΡ:n aminohapposekvenssille, jonka ovat kuvanneet Kang ym. edellä (se on: "normaali" sekvenssi) , tämä βΑΡΡ:n lyhentynyt eritetty fragmentti voidaan 15 tunnistaa vasta-aineilla, jotka on saatu aikaan peptidejä vastaan, jotka sisältävät tiettyjä sellaisen eritetyn fragmentin karboksiterminaalisia tähteitä, jolla on paljastettu metioniini karboksipäässään. Vaihtoehtoisesti luonnossa ilmenevät tai muokatut βΑΡΡ:n varianttisekvenssit, kuten kak-20 soismutaatio joka vaihtaa lysiini595-metioniini596 :n aspara-giini595-leusiini596 :ksi, kuten ovat raportoineet Mullan ym.
(1992) Nature Genet 1:345 - 347, voivat tuoda uuden sekvenssin tähän alueeseen. Sitova aine, joka on spesifinen tämän βΑΡΡ-sekvenssin C-terminaalisille tähteille, olisi * 25 edullinen keino havaita sellaisia sekvenssejä.
Eritetyt fragmentit käsittävät oleellisesti ehjän, aminoterminaalisen βΑΡΡ-sekvenssin, joka päättyy viiden aminohapon sisällä laskien karboksiterminaalisesta tähteestä (metioniini normaalin sekvenssin tapauksessa), joka on 30 βΑΡ-alueen vieressä ehjässä βAPP:ssä. Eritetyt fragmentit :* voivat erityisesti koostua oleellisesti sekvensseistä, jot ka päättyvät metioniini596 :een ja lysiini595:een βΑΡΡ:η 695 aminohapon isomuodossa, ja vastaava numerointi on muissa isomuodoissa ja vastaavissa aminohapoissa mutantteja βΑΡΡ-35 muotoja silmällä pitäen, kuten esimerkiksi LYS595 -MET596 ASN595 - LEU596 :ksi ("ruotsalainen" muoto) . Tämän keksinnön 111546 6 mukaiset menetelmät ovat hyödyllisiä in vitro βΑΡΡ:n solun-sisäisen prosessoinnin monitorointia silmällä pitäen, erityisesti monitoroitaessa βΑΡΡ:η katkaisua, jossa vapautuu ehjä βΑΡ, joka on assosioitu tiettyihin tauteihin, erityi-5 sesti Alzheimerin tautiin, mukaan lukien periytyvä muoto, ja Downin syndrooma.
Esillä olevan keksinnön kohteena on se, mitä patenttivaatimuksissa on esitetty.
Tämän keksinnön ensimmäisessä erityisessä piirtees-10 sä βΑΡΡ:η eritetty liukoinen aminoterminaalinen fragmentti (ATF-βΑΡΡ) havaitaan reaktiolla, jossa on sitova aine, joka on saatu aikaan sellaisen βΑΡΡ-sekvenssin C-terminaalista tähdettä vastaan, joka päättyy βΑΡΡ:n 695-isomuodon tähteessä 596, ja/tai joka on sille spesifinen, tyypillisesti 15 reaktiolla, jossa on vasta-aine, joka kykenee erottamaan ΑΤΡ-βΑΡΡ:η muista βΑΡΡ:η katkaistuista muodoista, jotka voivat olla läsnä biologisessa näytteessä. Vasta-aineita, joilla on vaadittava spesifisyys, on saatu aikaan synteettisiä peptidihapteeneja vastaan, mukaan lukien ATF-βΑΡΡιη 20 C-terminaaliset tähteet.
Tämän keksinnön toisessa erityisessä piirteessä βΑΡ:1ιβη liittyvät taudit, kuten Alzheimerin tauti ja Downin syndrooma, voidaan diagnosoida ja monitoroida potilaista, mikä perustuu ΑΤΡ-βΑΡΡ:η havaitsemiseen potilasnäytteissä, 25 kuten CSF, seerumi, veri, plasma, virtsa, kudos ja vastaavat. Kohonneet ATF-βΑΡΡ-tasot tai -suhteet voivat liittyä taudin alkamiseen ja etenemiseen, ja voivat mahdollisesti laskea kun taudin hoito etenee.
Kolmannessa erityisessä piirteessä tämä keksintö 30 tarjoaa in vitro -menetelmiä, joilla voidaan tunnistaa βΑΡ-tuotannon inhibiittoreita, ja joissa soluja viljellään olosuhteissa, jotka johtavat ΑΤΡ-βΑΡΡ:η erittymiseen. Viljellyt solut altistetaan testiyhdisteelle/testiyhdisteille, ja testiyhdiste(et), jotka saavat aikaan muutoksen ATF-βΑΡΡ.'η 35 eritetyssä määrässä tai suhteissa, on mahdollista tunnistaa.
7 111546
Neljännessä erityisessä aspektissa tämä keksintö käsittää ΑΤΡ-βΑΡΡ:η puhtaassa ja eristetyssä muodossa. Sitä sisältävät koostumukset ovat hyödyllisiä monissa erilaisissa tavanomaisissa määrityksissä ATF-βΑΡΡιη havaitsemista 5 varten. Sitä sisältävät koostumukset on mahdollista hankkia eristämällä ja puhdistamalla ATF-βΑΡΡ luonnollisesta tai rekombinanttisesta lähteestä, kuten CSF, soveliaasta soluviljelmästä peräisin oleva muokattu elatusaine, tai vastaavat .
10 Kuvioiden lyhyt kuvaus
Kuviot IA ja IB havainnollistavat normaalin βΑΡΡ:η eri isomuotoja ja vastaavasti vastaavia ATFjAPP:n isomuo-toja.
Kuviot 2A, 2B ja 2C ovat kerniluminoivia geelikuvi-15 oita materiaalista, joka on peräisin ihmisen fetaa-liaivosoluviljelmän muokatusta elatusaineesta. Kaistat 1, 2 ja 3 kustakin geelistä edustavat käsittelemätöntä muokattua elatusainetta, muokattua elatusainetta, joka on depletoitu reaktiolla vasta-aineen kanssa, joka tunnistaa epitoopin β-20 amyloidipeptiditähteiden 1-16 sisällä, ja vastaavasti tämän vasta-aineen depletoima materiaali. Alakuvat A, B ja C edustavat seuraavia koettimia: anti-5-vasta-aine (joka tunnistaa paikkoja βAPP:ssä aminoterminaalisesti β-amyloidi-peptidialueen suhteen), ja vasta-aine 92 (joka saatiin ai-25 kaan synteettistä peptidiä vastaan, joka päättyy C-termi-naaliseen metioniiniin, joka paljastuu kun βΑΡ katkaistaan irti βAPP:stä) ja vastaavasti vasta-aine 10D5 (monoklonaa-linen vasta-aine, joka tunnistaa βΑΡ:η epitoopin tähteiden 1-16 sisällä).
30 Kuvio 3 on kemiluminoiva geelikuvio, joka hankit- • j tiin tutkimalla ihmisen lantion CSF:ää. CSF:tä tutkittiin 92-vasta-aineella joko yksinään (kaista 1) tai esi-inkuboituna eri peptidien kanssa, jotka edustavat ATF-βΑΡΡ:η C-pään variaatioita. Oleellinen kompetitio (sitoutu-35 misen väheneminen) havaittiin peptideillä, jotka päättyivät C-terminaaliseen metioniiniin (kaistat 3, 4, 6 ja 7) . Pep- 111546 8 tidit olivat seuraavanlaisia: kaista 1, ei lisät ty kilpailevaa peptidiä; kaista 2, GSGLTNIKTEEISEVK; kaista 3, YSGLTNIKTEEISEVKM, kaista 4, ISEVKM, kaista 5, EISEVKMD, kaista 6, CISEVKM, kaista 7, YISEVKM. MW = molekyylipaino-5 markkerit (osoitettu kilodaltoneina).
Kuvio 4 on autoradiogrammi, joka edustaa elektrofo-reettisia geelikuvioita, jotka hankittiin immunopresipitoi-malla muokattua elatusainetta, joka oli peräisin useista eri solulinjöistä. Ihmisen sikiön aivoviljelmien erittämä 10 ja vasta-aineen 92 immunopresipitoima materiaali (kaista 11 nuolen kohdalla) on ilmeisesti pienempi kuin vasta-aineen 6C6 presipitoima materiaali (kaista 10 nuolen kohdalla). Vasta-aine 6C6 tunnistaa epitoopin βΔΡ:η tähteiden 1-16 sisällä.
15 Kuvio 5 on autoradiogrammi, joka edustaa elektrofo- reettisia geelikuvioita, jotka hankittiin immunopresipitoi-malla muokattua elatusainetta, joka oli peräisin ihmisen 293-solulinjoista, jotka oli transfektoitu cDNA:lla, joka kooditti sekä normaalia että ruotsalaista PAPP:tä. Ruotsa-20 laisella transfektoitujen solujen erittämän ΑΡΤ-βΑΡΡ-materiaalin määrä (kaistat 11 ja 12) on kvalitatiivisesti suurempi kuin normaalien βΑΡΡ-transfektanttien tuottama määrä (kaistat 9 ja 10).
Erityisten suoritusmuotojen kuvaus 25 Tämä keksintö on tuloksena siitä, että on tunnis tettu β-amyloidiesiasteproteiinin (βΑΡΡ) uusi eritetty fragmentti, joka on tuloksena ehjän β-amyloidipeptidin (βΑΡ) alueen katkaisusta irti esiasteproteiinista. Uudet eritetyt fragmentit käsittävät βΑΡΡ:n aminoterminaalisen 30 osan, joka jää jäljelle sellaisen katkaisun jälkeen ja jo-hon viitataan tämän jälkeen βΑΡΡ:η aminoterminaalisena fragmenttimuotona (ATF-βΑΡΡ). ΑΤΡ-βΑΡΡ:η uskotaan olevan βΑΡΡ:n vaihtoehtoisen erittyrnisprosessointireitin tulos, joka reitti on läsnä jopa normaaleissa (ei-sairaissa) so-35 luissa. Uskotaan kuitenkin lisäksi, että vaihtoehtoinen erittymisreitti voi olla vastuussa oleellisesta tapahtumas- » 111546 9 ta βΑΡ:η tuotannossa potilaiden sairaissa soluissa, ja että ATF-βΑΡΡ:n epänormaali tuotanto voi olla mukana taudeissa, jotka liittyvät βΑΡ-plakkiin, erityisesti Alzheimerin taudissa ja Downin syndroomassa. Niinpä tämä keksintö tarjoaa 5 in vitro -menetelmiä, joilla voidaan monitoroida βΑΡΡ:η solutason prosessointia ja jotka perustuvat ATF-βΑΡΡ:n havaitsemiseen ja mittaamiseen biologisissa näytteissä.
ATF-βΑΡ tunnistetaan ja havaitaan sen perusteella, että se sitoutuu spesifisesti vasta-aineisiin, jotka on 10 saatu aikaan sellaisia peptidejä vastaan, jotka käsittävät tiettyjä βΑΡΡ:η tähteitä, jotka sijaitsevat heti βΑΡ-alueen vieressä, ja normaalin βΑΡΡ:η tapauksessa sisältävät karboksiterminaalisen metioniinin (numeroitu metionii-ni596 :ksi 695-isomuodossa, kuten jäljempänä esitetään) . Pep-15 tideihin sisältyy ainakin viisi vierekkäistä tähdettä, jopa tähde596 mukaan lukien, ja spesifiset menetelmät, joilla voidaan tuottaa sellaisia vasta-aineita esitetään jäljempänä .
Kun nyt viitataan kuvioihin IA ja IB, βΑΡΡ havai-20 taan kolmena isomuotona, jotka vastaavat 695:tä, 751:tä ja vastaavasti 770:tä aminohappoa. 695-isomuoto on yleisin hermosoluissa, kun taas 751- ja 770-isomuodot ovat tuloksena insertioista tähteessä 289 695-isomuodossa (kaikki 695-isomuodon numerointi noudattaa Kangin ym. artikkelia, 25 (1987) Nature 325:733-736). ATF-βΑΡΡ on ilmeisesti tulokse na eri βΑΡΡ-isomuotojen proteolyyttisestä pilkkoutumisesta β-amyloidipeptidi (βΑΡ) -alueen aminopään, joka sijaitsee tähteiden 596 ja 597 välissä 695-isomuodossa, aminotermi-naalisella puolella sijaitsevien viiden tähteen kohdalla 30 tai niiden sisällä. Sellainen pilkkoutuminen saa aikaan C-terminaalisen tähteen paljastumisen, joka on yleensä metio-niini596, lysiini595 tai leusiini51 tavallisemmin metionii-ni596, jotka esitetään kuviossa IB nimillä MET596 ja LYS595. Ymmärretään tietenkin, että C-terminaalisilla tähteillä 35 olisi eri numerointi kun ATF-βΑΡΡ olisi peräisin eri βΑΡΡ-isomuodosta. Erityisesti C-terminaalinen metioniini olisi 111546 10 MET652 ja MET671 ja C-terminaalinen lysiini olisi LYS651 ja LYS670 7 51- ja vastaavasti 770-pAPP-isomuodoissa. Tämän jälkeen ja patenttivaatimuksissa käytettynä met ioniini596, lysiini595 ja leusiini596 viittaavat yleensä vastaaviin tähtei-5 siin kaikissa muissa βΑΡΡ:η isomuodoissa tai varianteissa. Tällä hetkellä uskotaan, että ATF-βΑΡΡ:n N-terminaalinen tähde on LEU18 kaikissa isomuodoissa (perustuen βΑΡΡ:η ami-noterminaalisen pään prosessointiin eritetyissä muodoissa, jotka pilkotaan βΑΡ-alueen sisältä).
10 Tämän keksinnön mukaisesti ATF-βΑΡΡ voidaan havaita ja/tai mitata monissa eri biologisissa näytteissä, mukaan lukien in vitro -näytteet, kuten viljellyistä soluista peräisin oleva muokattu elatusaine, ja potilasnäytteet, tyypillisesti CSF, veri, seerumi, plasma, virtsa, kudos ja 15 vastaavat. Detektio ja mittaus voidaan saada aikaan millä tahansa menetelmällä, joka kykenee erottamaan ΑΤΡ-βΑΡΡ:η muista β-ΑΡΡ-fragmenteista, jotka ovat mahdollisesti näytteessä. Mukavasti voidaan käyttää immunologisia detektiome-netelmiä, jotka käyttävät hyödyksi vasta-aineita, vasta-20 ainefragmentteja, tai muita ekvivalentteja spesifisiä sitovia aineita, jotka sitoutuvat ΑΤΡ-βΑΡΡ:η C-terminaaliseen tähteeseen, joka paljastuu kun βΑΡ-alue katkaistaan, esim. met ioniini596, leusiini596 tai lysiini595 . On havaittu, että sellaiset C-terminaalispesifiset vastaaineet kykenevät 25 erottamaan toisistaan ATF-βΑΡΡ:n ja sille sukua olevat βΑΡΡ-fragmentit. Immunologiset määritysmenetelmät voivat vaihtoehtoisesti pohjautua eristettyyn ja puhdistettuun ATF-βΑΡΡ:hen, jossa käytetään tavanomaisia menetelmiä. Sekä C-terminaaliselle tähteelle spesifisten vasta-aineiden että 30 puhtaan ja eristetyn ATF-βΑΡΡ:n valmistus kuvataan jäljem-pänä. Erityisen soveliaisiin detektiomenetelmiin kuuluvat ELISA, Western-blottaus, radioimmunomääritys ja vastaavat.
Voidaan myös käyttää muita ATF-βΑΡΡ:n havaitsemis-menetelmiä, jotka eivät vaadi ATF^APP-spesifisten vasta-35 aineiden ja/tai kilpailevan antigeenin käyttöä. Voidaan käyttää esimerkiksi kaksiulotteista geelielektroforeesia 11 111546 erottamaan βΑΡΡ:η läheistä sukua olevat liukoiset fragmentit. Vasta-aineita, jotka ovat ristireagoivia monien tai kaikkien fragmenttien kanssa, voidaan käyttää sitten geelien tutkimiseen, niin että ΑΤΡ-βΑΡΡ:η läsnäolo tunnistetaan 5 sen tarkan sijainnin perusteella geelissä. Muut ΑΤΡ-βΑΡΡ:η detektiomenetelmät ovat myös sinänsä tunnettuja. Eritetyt βΑΡΡ-lajit, jotka sisältävät βΑΡ:η aminoterminaalisen alueen, voidaan depletoida immunologisesti näytteestä ATF-βΑΡΡ:η eristämiseksi (katso kuvio 2A, kaista 2 ja kuvio 5, 10 kaistat 11 ja 12), jotka voidaan sitten detektoida millä tahansa useista menetelmistä, kuten edellä pohditaan.
ΑΤΡ-βΑΡΡ:11θ spesifiset vasta-aineet voidaan valmistaa sopivaa antigeeniä tai hapteenia vastaan, joka käsittää C-terminaalisen ATF-βΑΡΡ-sekvenssin, mukaan lukien 15 metioniinitähde. Synteettiset peptidit voidaan valmistaa mukavasti tavanomaisilla kiinteän faasin menetelmillä, liittää soveliaaseen immunogeeniin ja käyttää antiseerumien tai monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi tavanomaisilla menetelmillä. Yksi sovelias synteettinen peptidi 20 koostuu ΑΤΡ-βΑΡΡ:η kuudesta tähteestä (ISEVKM), jotka sijaitsevat βΑΡ:η välittömällä aminoterminaalisella puolella ja jotka voidaan liittää immunogeeniin ja käyttää spesifisten vasta-aineiden valmistamiseksi, kuten yksityiskohtaisesti kuvataan kokeellisessa osassa. Muut soveliaat pepti-25 dihapteenit käsittävät yleensä ainakin viisi vierekkäistä tähdettä βΑΡΡ:η sisällä βΑΡ:η välittömällä aminoterminaalisella puolella, ja ne voivat käsittää enemmän kuin kuusi tähdettä (vaikkakin peptidin, joka sisälsi kuusitoista aminohappotähdettä, havaittiin tuottavan antiseerumit, jotka 30 olivat vähemmän spesifisiä). Normaalin ATF-βΑΡΡιη karboksi-terminaaliset 25 tähdettä ovat seuraavia (kun käytetään yksikirjaimisia aminohapponimiä).
DRGLT TRPGSGLTNI KTEEISEVKM
35 576 586 596 111546 12
Synteettisiä polypeptidihapteeneja voidaan tuottaa hyvin tunnetulla Merrifieldin kiinteän faasin synteesi-menetelmällä, jossa aminohapot lisätään peräjälkeen kasvavaan ketjuun (Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149 -5 2156). Aminohapposekvenssit voivat perustua edellä esitet tyyn ATF-3APP-sekvenssiin, tai ne voivat käyttää hyödyksi luonnossa ilmeneviä tai muutettuja mutanttisekvenssejä. Esimerkiksi ruotsalaisella mutantilla olisi lysiini595-metioniini596 korvattu asparagiini595-leusiini596 : 11a ja toi-10 nen substituutio sisältäisi mahdollisesti vain metionii-ni596:n substituoimisen leusiini596: 11a.
Kun riittävä määrä polypeptidihapteenia on hankittu, se voidaan konjugoida soveliaaseen immunogeeniseen kantajaan, kuten seerumialbumiini, "keyhole limpet" -hemosya-15 niini, tai muut soveliaat proteiinikantajat, kuten yleisesti kuvataan Hudsonin ja Hayn teoksessa Practical Immunology, Blackwell Scientific Publications, Oxford, kappale 1.3, 1980, jonka esitys liitetään tähän viitteenä.
Kun riittävä määrä immunogeeniä on hankittu, vasta-20 aineita, jotka ovat spesifisiä C-terminaaliselle tähteelle, joka paljastuu, kun βΑΡ katkaistaan ATF-βΑΡΡ:stä, voidaan tuottaa in vitro tai in vivo -menetelmin, in vitro menetelmät sisältävät lymfosyyttien altistamisen immunogee-neille, kun taas in vivo -menetelmät vaativat immunogeenien 25 injektion soveliaaseen selkärankaisisäntään. Soveliaita selkärankaisisäntiä ovat muut kuin ihmiset, mukaan lukien hiiret, rotat, kanit, lampaat, vuohet ja vastaavat. Immuno-geenit injektoidaan eläimeen ennalta määrätyn aikataulun mukaisesti ja eläimistä otetaan ajoittain verinäyte, jol-30 loin peräkkäisillä verinäytteillä on parantunut tiitteri ja spesifisyys. Injektiot voidaan tehdä lihaksensisäisesti, vatsaontelon sisäisesti, ihonalaisesti, tai vastaavalla tavalla, ja käytetään adjuvanttia kuten epätäydellinen Freun-din adjuvantti.
35 Haluttaessa monoklonaalisia vasta-aineita voidaan hankkia valmistamalla immortalisoituja solulinjoja, jotka 111546 13 kykenevät tuottamaan vasta-aineita, joilla on haluttu spesifisyys. Sellaisia immortalisoituja solulinjoja voidaan tuottaa monilla eri tavoilla. Pieni selkärankainen, kuten hiiri, hyperimmunisoidaan mukavasti halutulla immunogeenil-5 lä juuri kuvatulla menetelmällä. Sitten selkärankainen tapetaan, yleensä useita päiviä lopullisen immunisoinnin jälkeen, pernasolut poistetaan ja pernasolut immortalisoidaan. Immortalisoinnin tapa ei ole kriittisen tärkeä. Tällä hetkellä tavanomaisin tapa on fuusio myeloomasolufuusiopartne-10 rin kanssa, minkä ensin kuvasivat Kohler ja Milstein (1975) Nature 256:495 - 497. Muut menetelmät sisältävät EBV- transformaation, transformaation pelkällä DNA:11a, esim. onkogeeneillä, retroviruksilla jne., tai millä tahansa menetelmällä, joka mahdollistaa solulinjan stabiilin ylläpi-15 don ja monoklonaalisten vasta-aineiden tuotannon. Spesifisiä menetelmiä monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi kuvataan teoksessa Antibodies, A Laboratory Manual, toim. Harlow ja Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, jonka täysi esitys liitetään tähän viitteenä.
20 Monoklonaalisten vasta-aineiden ja polyklonaalisten vasta-aineiden (antiseerumien) lisäksi tämän keksinnön mukaiset detektiomenetelmät kykenevät myös käyttämään vasta-ainefragmentteja, kuten F(ab), Fv, VL, VH ja muita fragmentteja. On myös mahdollista käyttää rekombinanttisesti tuo-25 tettuja vasta-aineita (immunoglobuliineja) ja näiden variaatioita, kuten nykyisin on hyvin kuvattu patentti- ja tieteellisessä kirjallisuudessa. Katso esimerkiksi EPO-8 430 268.0; EPO-85 102 665.8; EPO-85 305 604.2; PCT/GB-85/00 392; EPO-85 115 311.4; PCT/US86/002 269; ja 30 JP-hakemus 85 239 543. Olisi myös mahdollista valmistaa muita rekombinanttiproteiineja, jotka jäljittelisivät juuri edellä mainitulla tavalla valmistettujen vasta-aineiden si-toutumisspesifisyyttä.
Tämä keksintö käsittää lisäksi eristetyn ja puhtaan 35 ΑΤΡ-βΑΡΡ:η, joka hankitaan yleensä oleellisen puhtaassa muodossa. "Oleellisen puhdas" tarkoittaa ainakin 50 % w/w 111546 14 (paino/paino) tai puhtaampaa, josta häiritsevät proteiinit ja kontaminantit oleellisesti puuttuvat. ATF-βΑΡΡ eristetään tai syntetisoidaan edullisesti puhtauteen, joka on korkeampi kuin 50 % w/w, edullisesti se on 80 % w/w tai 5 korkeampi. ATF-βΑΡΡ voidaan puhdistaa luonnollisesta lähteestä tavanomaisilla proteiininpuhdistusmenetelmillä, joissa homogeeniset koostumukset, joiden puhtaus on ainakin 50 % w/w, puhdistetaan käyttämällä vasta-aineita jotka on valmistettu edellä kuvatulla tavalla käyttämällä tavanomai-10 siä immunoaffiniteettierotusmenetelmiä. Soveliaisiin luonnollisiin lähtömateriaaleihin kuuluvat muokattu elatusaine, joka on peräisin ATF-βΑΡΡ:tä tuottavista solulinjöistä, kuten fetaaliaivosoluviljelmistä, ja vastaavista. ATF-βΑΡΡ voidaan vaihtoehtoisesti eristää biologisista näytteistä, 15 jotka on hankittu ihmisisännästä, kuten CSF, seerumi ja vastaavat. Soveliaita proteiininpuhdistusmenetelmiä kuvataan teoksessa Methods in Enzymology, voi 182, toim. Deut-cher. Academic Press, Inc., San Diego, 1990, jonka esitys liitetään tähän viitteenä.
20 Vasta-aineita ja puhdistettua ATF-βΑΡΡ:tä, jotka on valmistettu edellä kuvatulla tavalla, voidaan käyttää monissa erilaisissa tavanomaisissa immunologisissa menetelmissä ΑΤΡ-βΑΡΡ:η havaitsemiseksi biologisissa näytteissä, erityisesti in vivo potilasnäytteissä β-amyloidiin liitty-25 vien tautien monitorointia varten, ja muokatuissa elatusai-neissa, jotka ovat peräisin soluviljelmästä, βΑΡΡ:η solun-sisäisen prosessoinnin monitoroimiseksi. Soveliaisiin immunologisiin menetelmiin kuuluvat immunologiset määritykset, kuten ELISA, Western blot -analyysit ja vastaavat. Harlow 30 ja Lane, edellä, kuvaavat monia spesifisiä immunologisia : detektiomenetelmiä.
ATF-βΑΡΡ:n havaitsemista in vivo potilasnäytteistä voidaan käyttää diagnosoimaan ja monitoroimaan Alzheimerin tautia ja muita tauteja, jotka liittyvät β-amyloidiplakin 35 kasaantumiseen, kuten Downin syndroomaa. Soveliaisiin poti-lasnäytteisiin kuuluvat CSF, veri, seerumi, plasma, virtsa, 111546 15 kudos ja vastaavat. Taudin läsnäolo on yleensä liittynyt ΑΤΡ-βΑΡΡ:η kohonneisiin tasoihin tai ATF-βΑΡΡιη määrän ja muiden eritettyjen βΑΡΡ-fragmenttien (ne βΑΡΡ-fragmentit, jotka katkaistaan βΑΡ-alueen sisällä tai karboksiterminaa-5 lisesti siitä) määrien kohonneisiin suhteisiin verrattuna näihin arvoihin normaaleissa yksilöissä, se on: yksilöissä, jotka eivät kärsi Alzheimerin taudista tai muusta β-amyloi-diin liittyvästä taudista. ΑΤΕ-βΑΡΡ:η määrää voidaan verrata muun APP-lajin määrään, joko isomuodon (esimerkiksi 695, 10 751 tai 770) määrään ja/tai sellaisen muodon määrään, jota määrittää edelleen sen karboksipää (esimerkiksi muodot, jotka katkaistaan Eschin ym. kuvaamassa kohdassa tai sitä karboksiterminaalisesti). Alkuperäisten diagnostisten menetelmien lisäksi ΑΤΕ-βΑΡΡ:η tasoja voidaan monitoroida tau-15 din etenemisen seuraamiseksi, ja se seuraa mahdollisesti hoidon tehoa. Olisi odotettavaa, että ΑΤΡ-βΑΡΡ:η tasot laskisivat sopivalla hoito-ohjelmalla.
ATP-βΑΡΡ-tasojen in vitro monitorointia soveliaasta soluviljelmästä peräisin olevassa viljellyssä elatusainees-20 sa voidaan käyttää lääkkeen seulontaan. Näiden testiyhdis-teiden vaikutusta ATP-βΑΡΡ:n erittymiseen voidaan havainnoida kasvattamalla soluja olosuhteissa, jotka johtavat ATP-βΑΡΡ:n erittymiseen viljelmäelatusaineeseen ja altistamalla solut testiyhdisteille. Olisi odotettavaa, että tes-25 tiyhdisteet, jotka kykenevät pienentämään ΑΤΡ-βΑΡΡ:η määrää, olisivat ehdokkaita testattaviksi βΑΡ:η muodostumisen inhibiittoreina. Soveliaisiin solulinjoihin kuuluvat ihmis-ja eläinsolulinjat, kuten ihmisen munuaissolulinja 293, ihmisen neuroglioomasolulinjat, ihmisen HeLa-solut, primääri-30 set endoteelisolut (esim. HUVEC-solut), primääriset ihmisen * v fibroblastit tai lymfoblastit (mukaan lukien endogeeniset solut, jotka olivat peräisin potilaista, joilla oli βΑΡΡ-mutaatioita) , primääriset ihmisen sekalaiset aivosolut (mukaan lukien neuronit, astrosyytit ja hermotukikudos), kii-35 nanhamsterin munasarjasolut (CHO-solut), ja vastaavat. So-lulinjat, jotka etusijassa lisäävät ΑΤΡ-βΑΡΡ:η tasoja tai 111546 16 suhteita, olisivat erityisen hyödyllisiä keksinnön mukaisissa menetelmissä.
Vastaavasti ΑΤΡ-βΑΡΡ:η monitorointia in vitro Alzheimerin taudin eläinmalleissa, kuten hiirimallissa joka 5 esitettiin W0 91/19 810:ssä, voidaan myös käyttää seulottaessa testiyhdisteitä terapeuttista tehoa silmällä pitäen (tavallisesti sellaisten yhdisteiden testaamiseen, jotka on aikaisemmin tunnistettu in vitro -seulonnalla). Testiyhdis-te(et) annetaan eläimelle ja ATF-pAPP:n taso tai ATF-pAPP:n 10 suhde muihin βΑΡΡ-fragmentteihin havaitaan. Niiden yhdisteiden, jotka vähentävät ATF-βΑΡΡιη tasoa tai vähentävät ΑΤΡ-βΑΡΡ:η suhdetta muihin βΑΡΡ-fragmentteihin, ajatellaan olevan ehdokkaita jatkoarviointia varten.
Testiyhdisteet voivat olla mikä tahansa molekyyli, 15 yhdiste tai muu aine, joka voidaan lisätä soluviljelmään häiritsemättä oleellisesti solun viabiliteettia. Soveliaat testiyhdisteet voivat olla pieniä molekyylejä, biologisia polymeerejä, kuten polypeptidejä, polysakkarideja, polynuk-leotideja tai vastaavia. Testiyhdisteet annetaan tyypilli-20 sesti viljelmäelatusaineeseen konsentraationa välillä noin 1 nM - 1 mM, tavallisesti noin 10 μΜ - 1 mM.
Testiyhdisteiden, jotka kykenevät inhiboimaan ATF-βΑΡΡ:η erittymistä, ajatellaan olevan kandidaatteja määritettäessä kykyä estää β-amyloidin tuotantoa patogeenisis-25 sa soluissa. Erittymisen inhibitio viittaa siihen, että βΑΡΡ:n katkeaminen βΑΡ:η aminopäässä on todennäköisesti ainakin osittain estynyt, mikä vähentää prosessointivälituot-teen määrää, joka on saatavilla β-amyloidipeptidiksi muuttamista varten.
30 Tämä keksintö käsittää lisäksi in vitro -menetel- miä, joilla voidaan estää β-amyloidin tuotanto soluissa, jolloin menetelmä käsittää sen, että soluille annetaan yhdisteitä, jotka on valittu edellä kuvatulla menetelmällä. Yhdisteet voidaan lisätä soluviljelmään, jotta viljeltyjen 35 solujen βΑΡ:η tuotanto saadaan inhiboitua.
111546 17
Seuraavat esimerkit annetaan havainnollistamismie-lessä eikä niiden ole tarkoitus olla rajoittavia.
Kokeellinen
Materiaalit ja menetelmät 5 1. Vasta-aineen ja affiniteettimatriisin valmistus
Monoklonaalinen vasta-aine 6C6 saatiin aikaan ja seulottiin samalla tavalla kuin vasta-aine 10D5 (Hyman ym.
(1992) J. Neuropath. Exp. Neurol. 51:76) käyttämällä immu-nogeenina synteettistä peptidiä, joka sisälsi βΑΡ-tähteet 10 1 - 28 kanin seerumialbumiiniin konjugoituina. Sekä 10D5 että 6C6 tunnistavat epitoopin βΑΡ-sekvenssin 16 :n ensimmäisen aminohapon sisällä. 6C6 oli tehokkaampi immunopresi-pitaatiossa kuin 10D5, ja sitä käytettiin sieppausvasta-aineena. 6C6-hartsin valmistamiseksi 4 ml AffigelR10:tä 15 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) pestiin kylmällä vedellä ja yhdistettiin 3 ml:aan 6C6:ta (12,5 mg/ml PBS:ssä (2,7 mM KC1, 1,5 mM KH2P04, 8,1 mM Na2HP04, 137 mM NaCl, pH 7,5), joka oli 0,5-molaarinen NaCl:n suhteen. Liittäminen jatkui yli yön 4 °C:een lämpötilassa hellävaroen ravistel-20 Ien. 400 μΐ 1-molaarista Tris:iä, pH 8,0, lisättiin sitten ja ravistelua jatkettiin 40 minuutin ajan. Hartsi pestiin sitten TTBS: llä (137 mM NaCl, 5 mM KC1, 25 mM Tris, 0,5 % TweenR20, pH 7,5) perusteellisesti ennen käyttöä. Vasta-aine 7H5 kuvataan myös Hymanin ym. artikkelissa (1992) 25 edellä.
Vasta-aineet (joille annettiin nimeksi vasta-aine 92) saatiin aikaan synteettistä peptidiä vastaan, joka käsitti βΑΡΡ:η tähteet 591 - 596 (numerointi Kangin ym. artikkelin (1987), edellä, mukainen). Peptidi (N-asetyyli-30 CISEVKM) konjugoitiin kanin seerumin albumiiniin, joka oli φ aktivoitu sulfomaleimidibentsoyyli-N-hydroksisukkinimidi-esterillä, immunogeenin muodostamiseksi. Antiseerumit saatiin aikaan immunogeeniä vastaan kaneissa standardimenetelmin. Kunkin inokuloinnin aikana kanit saivat 5 pg immuno-35 geeniä 0,1 ml:n injektioina ihonalaisesti noin 10 kohtaan (50 pg/tehoste). Sama peptidi liitettiin Sulfo-link™- 111546 18 geeliin (Pierce Chemical Col., Rockford, IL) vasta-aineiden affiniteettipuhdistusta varten IgG-fraktiosta.
Vasta-aine 92:n valmistuksen yksityiskohtaisempi kuvaus on seuraava. Kanin seerumialbumiinia (12,3 mg) inku-5 boitiin sulfomaleimidobentsoyyli-N-hydroksisukkinimidieste-rin kanssa (13 mg) 1,25 ml:ssa 0,05 M KH2P04:ää, pH 7,0, 20 minuutin ajan 0 °C:een lämpötilassa. Seos alistettiin sitten heti geelisuodatukseen 1 x 75 cm Sephadex G-10-pylväässä, joka oli tasapainotettu fosfaattipuskurilla.
10 Proteiinieluentti välisijatilavuudessa kerättiin yhteen ja yhdistettiin heti 30 mg:aan N-asetyyli-CISEVKM-peptidiä, joka syntetisoitiin standardinomaisilla automatisoiduilla kiinteän faasin menetelmillä. Liittämisreaktion (20 ml: n tilavuus) annettiin edetä yli yön ja sitten se lähetettiin 15 kaupalliseen laitokseen vasta-aineen valmistamista varten. Injektioprotokolla oli emulgoida antigeeni yhtä suuressa tilavuudessa Freundin täydellistä adjuvanttia ja injektoida ihonalaisesti kaikkiaan 50 pg antigeeniä 0,1 ml:n erinä noin 10 kohtaan. Joka kolmas viikko tämän jälkeen annettiin 20 tehosteinjektio identtisellä protokollalla, paitsi että emulgointlaineena käytettiin Freundin epätäydellistä adjuvanttia. Kaneista otettiin verinäyte yksi viikko kunkin injektion jälkeen ja seerumista tutkittiin tiitteri peptidi-reaktiolla ELISAssa. IgG puhdistettiin positiivisesti rea-25 goivista seerumeista saostamalla 50-prosenttisella (NH4) 2S04:llä (2 kertaa) ja dialysoitiin PBS:ää vastaan. N-asetyyli-CISEVKM-peptidi konjugoitiin Sulf o-link™-geeliin (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) käyttämällä valmistajien suosituksia, jolloin saatiin aikaan affiniteettihartsi, 30 jolla voitiin puhdistaa peptidispesifisiä vasta-aineita, ί. IgG-fraktio pantiin pylvääseen ja sen jälkeen kun ei- spesifisesti sitoutunut materiaali oli pesty läpi PBS:llä, vasta-aineet eluoitiin 0,1-molaarisella glysiinillä, pH 2,5, joka oli 0,5-molaarinen NaCl:n suhteen, ja dialysoi-35 tiin sitten PBS:ää vastaan ennen pakastusta.
111546 19 2. Ihmisen fetaaliaivosoluviljelmä
Fetaalihermokudosnäytteet hankittiin 12 - 14 viikon ikäisten sikiöiden ruumiista. Aivokuorinäytteet huuhdeltiin kahdesti Hanksin tasapainotetulla suolaliuoksella (HBSS).
5 Aivokuorikudos (2-3 grammaa) sijoitettiin 10 ml:aan kylmää HBSS:ää, johon lisättiin 1 mg DNAaasia (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO D3427).. Trituroitu suspensio suodatettiin Nitex-nailonseulojen läpi, 210 pm, sitten 130 pm, kuten ovat kuvanneet Pulliam ym. (1984) J. Virol. Met. 9:301.
10 Solut kerättiin sentrifugcrmalla ja resuspendoi- tiin hermosoluelatusaineeseen (MEM, joka oli vahvistettu 10-prosenttisella fetaalinaudan seerumilla, ja joka oli 1-prosenttinen glukoosin, 1-millimolaarinen Na-pyruvaatin, 1-millimolaarinen glutamiinin ja 20-millimolaarinen KCl:n 15 suhteen) . Polyetyleeni-iminillä päällystetyille 100 mm: n maljoille jaettiin 1,5 x 107 solua 8 ml:ssa hermosoluela-tusainetta. Elatusaine vaihdettiin kahdesti viikossa. Kaikkia tässä tutkimuksessa käytettyjä viljelmiä kasvatettiin in vitro ainakin 30 päivää. Seerumittomia kasvatusolosuh-20 teitä varten viljelmät vaihdettiin määrättyyn elatusainee-seen (DMEM, jossa oli lisäksi naudan insuliinia 5 pg/ml, ihmisen transferriinia 0,1 mg/ml, BSA-fraktio V:tä 0,1 mg/ml, progesteronia 0,062 pg/ml, putreskiinia 1,6 pg/ml, natriumseleniittiä 0,039 pg/ml, tyroksiinia 0,042 pg/ml, ja 25 trijodi-L-tyroniinia 0,033 pg/ml), ja 3 päivän jälkeen su-pernatantti kerättiin.
Soluista peräisin oleva muokattu elatusaine (10 ml) kerättiin. Kuhunkin 10 ml:n näytteeseen lisättiin osoitettuna loppukonsentraationa EDTA:ta (5 mM) , leupeptiiniä 30 (10 pg/ml) ja Tris-HCl:ää (20 mM, pH 8,0), ja näytettä pyöritettiin 30 000 g:n kiihtyvyydessä 20 minuuttia 4 °C:een lämpötilassa. Tuloksena oleva supernatant-ti jaettiin kahdeksi yhtä suureksi eräksi, 6C6-hartsi lisättiin yhteen erään (200 pl hartsia johon 6C6:ta oli si-35 toutunut noin 5 mg/ml). Molempia eriä sekoitettiin helläva-roen 6 tuntia 4 °C:een lämpötilassa, hartsi ajettiin sakak- 111546 20 si ja lisättiin toinen 200 μ1:η erä hartsia. Näytteitä sekoitettiin vielä yli yön 4 °C:een lämpötilassa. Yhdistetyt hartsit pestiin kahdesti TTBS:llä, sitten uutettiin lyhyesti kahdesti yhden ml:n erillä 0,1-molaarista glysiiniä, jo-5 ka oli 0,1-molaarinen NaCl:n suhteen, pH 2,8.
Hartsista uutettu materiaali, hatrsin depletoima elatusaine ja lähtöelatusaine saostettiin yksilöllisesti 10-prosenttisella TCA:lla (trikloorietikkahappo) 0 °C:een lämpötilassa yhden tunnin ajan, sakat pestiin asetonilla ja 10 sitten resuspendoitiin 150 pl:aan SDS-PAGE-näytepuskuria pelkistävissä olosuhteissa ja keitettiin. Kukin näyte (25 μΐ) alistettiin SDS-PAGEeen käyttämällä 10 - 20-prosent- tisia trisiinigeelejä (Novex). Proteiinit siirrettiin ProB-lot PVDF-membraanille yli yön 40 Villa. Immunoreaktiivisten 15 proteiinien visualisoinnissa käytettiin TROPIX-kernilumine-senssijärjestelmää valmistajan ohjeiden mukaisesti AMPPD-substraatilla. Käytetyt primäärisen vasta-aineen konsent-raatiot olivat: anti-5, 0,1 μg/ml; 92, 2 pg/ml, 10D5, 2 pg/ml.
20 3. Ihmisen 293-solujen viljelmä
Ihmisen 293-solut (ATCC nro CRL-1573) modifioitiin niin että ne yliekspressoivat APPitä (Selkoe ym. (1988)
Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:7341). Solut kasvatettiin 10 cm:n maljoilla alikonfluenteiksi ennen käyttöä. Metabo-25 linen leimaus ja immunopresipitaatio suoritettiin oleellisesti kuten ovat aikaisemmin kuvanneet Oltersdorf ym. (1989) Nature 341:144 ja (1990) J. Biol. Chem. 265:4492. Lyhyesti ilmaisten leimaus suoritettiin 10 cm:n maljoilla. Solut pestiin metioniinittomassa elatusaineessa, inkuboi-30 tiin 20 minuuttia 2 ml:ssa metioniinitonta elatusainetta, ** jossa oli lisäksi 0,5 mCi 35s-metioniinia, pestiin täydel lisellä elatusaineella ja seurattiin kaksi tuntia 3 ml:ssa täydellistä elatusainetta. Muokattu elatusaine kerättiin ja se kirkastettiin 3 000 g:n kiihtyvyydessä 10 minuutin ajan, 35 jota seurasi esiabsorptio proteiini A SepharoseR:een (Pharmacia, Piscataway, NJ) . Immunopresipitaatio suoritettiin 111546 21 1,5 mgrlla proteiini A SepharoseR: ea per näyte. Vasta-ainetta anti-5 käytettiin 2 gg/näyte, 6C6:ta, 7H5:tä ja 92:ta käytettiin 10 gg/näyte. 5 mg hiiren IgG:tä vastaan suunnattua kanin vasta-ainetta käytettiin 6C6:n ja 7H5:n 5 samoin kuin kontrollinäytteiden kanssa. Sakat pestiin neljä kertaa TBSrllä (137 mM NaCl, 5 mM KC1, 25 mM Tris, pH 7,5), joka oli 0,1 % NP40:n, 5 mM EDTA:n, 1 mM PMSF:n ja 10 gg/ml leupeptiinin suhteen. SDS-PAGE suoritettiin 5-prosentti-silla Laemmli-geeleillä.
10 4. Ruotsalaisella mutaatiolla transfektoitu ihmisen 293-soluviljelmä 6-kuoppalevyllä rinnakkaiskaivoissa olevat ihmisen munuaisen 293-solut transfektoitiin lyhytaikaisesti plasmi-divektoreilla, jotka ekspressoivat joko normaalia ihmisen 15 pAPPrtä tai ruotsalaista mutaatiovariantti-βΑΡΡ:tä, käyttämällä DOTAP-välitteistä transfektiota valmistajan (Boehrin-ger Mannheim) kuvauksen mukaisesti. 40 tuntia myöhemmin solut sijoitettiin metioniinittomaan DME:hen, joka sisälsi 10 % fetaalivasikan seerumia, ja 20 minuuttia myöhemmin ne 20 leimattiin 35 minuutin ajan 35S-metioniinilla (200 gCi/ml). Solut sijoitettiin sitten takaisin normaaliin DME-elatusaineeseen, joka sisälsi 10 % fetaalivasikan seerumia ja inkuboitiin vielä 2,5 tuntia. Elatusaine kerättiin soluista ja pyöritettiin 1 000 g:n kiihtyvyydessä 15 minuutin 25 ajan kaikkien solujen poistamiseksi. Supernatantit jaettiin kahtia ja puolet immunopresipitoitiin anti-5-vasta-aineella standardimenetelmin. Toista puolikasta inkuboitiin yli yön agaroosiin liitetyllä 6C6-vasta-aineella ja 6C6-agaroosiin sitoutunut materiaali erotettiin sentrifugoimalla. Jäljelle 30 jäänyt materiaali immunopresipitoitiin sitten anti-5-vasta-aineella. Anti-5-totaali-immunopresipitaatit (a5+), 6C6:een sitoutuneet presipitaatit (6C6+) ja 6C6:n suhteen ei-reaktiiviset, anti-5:n suhteen reaktiiviset immunopresipi-taatit (6C6+, cx5+) ajettiin 5-prosenttisessa Laemmli- 35 geelissä ja immunoreaktiiviset proteiinit visualisoitiin autoradiografiällä.
111546 22
Kokeiden kuvioiden kuvaus
Kuvio 2: Lyhentyneen βΆΡΡ:η osoittaminen ihmisen sekalaisten aivosolujen viljelmästä peräisin olevassa muokatussa elatusaineessa 5 Näyte 1 on muokattu elatusaine viljelmästä, näyte 2 on elatusaine, josta on depletoitu 6C6-reaktiivinen βΑΡΡ, ja näyte 3 on materiaali, joka on uutettu 6C6-hartsista. Osakuva A tutkittiin anti-5-vasta-aineilla, jotka saatiin aikaan βΑΡΡ-sekvenssiä 444-592 vastaan (Oltersdorf ym.
10 (1989) edellä, ja (1990) edellä. Osakuva B tutkittiin vas ta-aineella 92, joka on kuvattu Materiaalit ja menetelmät -osassa. Osakuva C tutkittiin 10D5:llä, monoklonaalisella vasta-aineella joka tunnistaa epitoopin βΑΡ-tähteiden 1 -16 sisällä, kuten Materiaalit ja menetelmät -osassa kuva-15 taan. C2:ssa ja C3:ssa havaittuja molekyylipainoltaan alhaisempia juovia ei nähty Cl:ssä ja ne ovat peräisin 6C6-hartsista ja ne tunnistaa emäksiseen fosfataasiin konjugoi-tu vuohen vasta-aine, joka on suunnattu hiiren IgG:tä vastaan, primäärisestä vasta-aineesta riippumatta (tuloksia ei 20 näytetä).
Kuvio 3. 92-vasta-aineiden spesifisyys
Yksi millilitra ihmisen lantiosta saatua CSF-näytettä, joka hankittiin 75-vuotiaalta mieheltä, saostet-tiin 10-prosenttisella TCA:lla, jotta saatiin aikaan kym-25 menkertainen konsentraatio, ja käsiteltiin kuviossa 2 kuvatulla tavalla paitsi että geelikuoppa oli 4 cm:n kolo. 92-vasta-aine laimennettiin pitoisuuteen 6,7 pg/ml 0,5 ml:ssa TTBS:ää monien mahdollisesti kilpailevien peptidien läsnä ollessa, kukin 60 μΜ:η arvioidussa konsentraatiossa, 3 0 10 tuntia 4 °C.-een lämpötilassa hellävaraisesti sekoittaen.
:* Vasta-aine laimennettiin sitten kahdeksanteen osaansa TTBS:llä, joka oli 1-prosenttinen gelatiinin suhteen, ennen kuin inkuboitiin blottisuikaleilla, joissa oli CSF-peräistä materiaalia, ja tehtiin kuvion 2 mukainen käsittely. Kil-35 pailevat peptidit olivat seuraavia: kaista 1, ei lisätty kilpailevaa peptidiä; kaista 2, GSGLTNIKTEEISEVK; kaista 3, 111546 23 YSGLTNIKTEEISEVKM, kaista 4, ISEVKM, kaista 5, EISEVKMD, kaista 6, CISEVKM, kaista 7, YISEVKM. MW = molekyylipaino-markkerit (osoitettu kilodaltoneina).
Kuvio 4: APP:n eritettyjen muotojen molekyylipainon 5 heterogeenisyys immunopresipitaatiossa, mikä ha vaittiin vasta-aineilla, jotka on suunnattu eri C-päitä vastaan, solulinjoissa ja primäärisissä ihmisen sikiön aivoviljelmissä
Vasta-aineet: anti-5: kaistat 3, 6, 9; 6C6 (suun- 10 nattu βΑΡ-peptidin tähteitä 1-16 vastaan): kaistat 4,7, 10; vasta-aine 92 (APP-aminohappo ja 591 - 596 vastaan) : kaistat 5, 8, 11; 7H5 (APP-KPI:tä vastaan): kaista 12. Solut: vasen osakuva (kaistat 1 ja 3 - 5): 293-solut, jotka on transfektoitu stabiilisti APP 695:llä; keksimmäinen osa-15 kuva (kaistat 2 ja 6 - 8): 293-solut, jotka on transfektoitu APP 751:llä; oikea osakuva (kaistat 9 - 13): ihmisen fe-taaliaivoviljelmät. Kontrollit: kaistat 1, 2 ja 13: kanin vasta-aine, joka on suunnattu hiiren IgG:tä vastaan. Nuolet: esimerkki molekyylipainoerosta APP:n eritettyjen muo-20 tojen välillä, jonka vasta-aineet 6C6 ja 92 havaitsevat. SDS-PAGE suoritettiin 5-prosenttisessa Laemmli-geelissä. MW = molekyylipainomarkkerit (osoitettu kilodaltoneina).
Kuvio 5: Lyhennetyn βΑΡΡ:η osoittaminen ihmisen 293-soluista peräisin olevassa muokatussa elatusai-25 neessa, joka oli transfektoitu ruotsalaisella mu taatiolla
Kuvio 5 osoittaa tulokset rinnakkaisista transfek-tioista sekä normaaleille että ruotsalaisille muodoille. Kaistat 1-4 ovat a5+; kaistat 5-8 ovat 6C6+; ja kaistat 30 9-12 ovat 6C6-, a5+-näytteitä. Kaistat 1, 2, 5, 6, 9 ja 10 ovat peräisin normaalista pAPP:stä, kaistat 3, 4, 7, 8, 11 ja 12 ovat peräisin ruotsalaisesta PAPP:stä. Ruotsalainen mutaatio johtaa lisääntyneeseen ATF-αΑΡΡ-tuotantoon, koska kaistat 11 ja 12 sisältävät enemmän ATF-βΑΡΡ- 35 materiaalia kuin kaistat 9 ja 10.
111546 24
Tulokset
Monoklonaalinen vasta-aine 6C6, joka tunnistaa βΑΡ-epitoopin tähteiden 1-16 sisällä, käytettiin immunologi-sesti depletoimaan tiettyjä βΑΡΡ-fragmentteja eri näytteis-5 tä. Monoklonaalinen vasta-aine 6C6 liitettiin hartsiin (kuten edellä on kuvattu) ja inkuboitiin muokatun elatusaineen kanssa, joka oli peräisin ihmisen fetaaliaivosoluviljelmis-tä, kuten edellä on kuvattu. Kuten voidaan havaita (kuvio 2, kaista C2), tämä hartsi poistaa tehokkaasti βΑΡΡ:η, joka 10 sisältää βΑΡ 1 - 6:n soluviljelmän muokatusta elatusainees-ta. Hartsi ei kuitenkaan sieppaa oleellista osaa βΑΡΡ:η immunologisesta reaktiivisuudesta, mikä havaitaan anti-5-vasta-aineella, joka on suunnattu epitooppia vastaan, joka sijaitsee N-terminaalisesti βΑΡ-alueen suhteen (kuvio 2, 15 kaista A2).
Jotta saataisiin karakterisoitua tämä ilmeisen uusi βΑΡΡ-muoto, teimme vasta-aineita synteettistä peptidiä vastaan, joka sisälsi βΑΡΡ-tähteet 591 - 596 (kuten edellä on kuvattu). Tämän vasta-aineen (jolle annettiin nimeksi 20 92), havaittiin tunnistavan βΑΡΡ-lajin, jota hartsi ei sie pannut (kuvio 2, kaista B2) , mutta yllättävää kyllä se ei reagoinut βΑΡΡ:n eritetyn muodon kanssa joka sisälsi βΑΡ:n 1-16 -sekvenssin (kaista B3).
Selitys tälle ristireagoivuuden puuttumiselle näyt-25 tää olevan se, että 92-vasta-aine tunnistaa βAPP:ssä epi-toopin, joka sisältää karboksiterminaalisen metioniinin, joka vastaa tähdettä 596. Me tutkimme vastaavasti eri synteettisten peptidien kykyä estää 92:11a aikaan saatu immu-noreaktiivisuus. Kuten kuviosta 3 voidaan nähdä, βΑΡΡ-30 sekvenssiin pohjautuvat peptidit, jotka loppuvat metioniini * 596:n ekvivalenttiin, estävät oleellisesti 92 :n reaktion, kun taas peptidit jotka ovat karboksipäästään yhtä aminohappoa pidempiä tai lyhyempiä, ovat kilpailussa suhteellisen tehottomia. Sama peptidikompetition kuvio havaittiin 35 soluviljelmäsupernatanteissa (tuloksia ei esitetä) ja CSFrssä. Sarja pulssi-seuranta-kokeita paljasti, että ha- 111546 25 väittävissä olevia määriä vasta-aineella 92 immunopresipi-toitavissa olevaa materiaalia tuotetaan 293-soluissa, jotka yliekspressoivat joko βΑΡΡ:η isomuotoa 695 tai 751 (kuvio 4, kaistat 5 ja 8) . Samanlaiset kokeet ihmisen fetaali-5 vasikkasoluviljelmissä osoittavat, että 92:11a immunopresi-pitoitavissa oleva materiaali voidaan erottaa 6C6:n kanssa reaktiivisesta pAPP:stä prosenttisuudeltaan alhaisessa (5-prosenttisessa) SDS-PAGE:ssa (kuvio 5, kaistat 9 - 11) . Fe-taaliaivosoluviljelmissä Kuniz-proteaasia inhiboivan osan 10 (KPI) sisältävien βΑΡΡ-muotojen vaihtoehtoinen prosessointi on vähemmän ilmeinen, vaikkakin vasta-aineella 92 ja KPI-vasta-aine 7H5:llä tehdyissä immunopresipitaatioissa on havaittavissa heikkoja samalla nopeudella liikkuvia juovia (kaistat 11, 12).
15 Kyky erottaa vasta-aineella 92 ja 6C6 saostettavis- sa olevat materiaalit sekalaisissa aivoviljelmissä johtuu ainakin osittain siitä, että vastaavia tuotettuja muotoja on lähes yhtä suuria määriä verrattuna tilanteeseen 293-soluissa. Estus ym. (1992) edellä havaitsivat, että 20 muihin kudoksiin verrattuna ihmisen aivot sisälsivät suhteessa korkeamman määrän mahdollisesti amyloidogeenistä karboksiterminaalista fragmenttia, joka koon perusteella vaikuttaa alkavan βΑΡ:η aminopäästä tai sen läheltä.
Vasta-aineilla 92 ja 6C6 saostettavissa olevien 25 βΑΡΡ-materiaalien samanaikaisuus väittää sitä vastaan, että olisi todennäköisesti olemassa toinen proteolyyttinen tapahtuma joka tapahtuisi erittymisen jälkeen, erityisesti koska pitemmät seuranta-ajat eivät johda havaittavissa olevaan muutokseen 92:n ja 6C6:n kanssa reaktiivisten laji-30 en suhteessa (tuloksia ei näytetä). Eritettyjen muotojen : erottaminen SDS-PAGE:11a, liitettynä näiden lajien täydel liseen immunologisen ristireagoivuuden puuttumiseen, osoittaa edelleen että läsnä on vaihtoehtoinen erittymisreitti. Vaihtoehtoiselle katkeamiskohdalle annettiin nimeksi β-35 sekretaasikohta, sen painottamiseksi että katkeaminen tapahtuu βΑΡ:3ΐ3 aminoterminaalisesti, erona Eschin ym. ku- 111546 26 vaarnaan katkaisuun (1990) edellä, joka tapahtuu βΑΡ:η sisällä .
Vaikka edellä oleva keksintö on kuvattu yksityiskohtaisesti ymmärryksen selkeyden vuoksi, on ilmeistä että 5 tiettyjä modifikaatioita voidaan suorittaa liitteenä olevien patenttivaatimusten suojapiirissä.
« <

Claims (10)

  1. 27 111546
  2. 1. In vitro -menetelmä, jolla voidaan monitoroida /3-amyloidiesiasteproteiinin (/3APP) prosessointia soluis- 5 sa, tunnettu siitä, että menetelmässä spesifisesti todetaan mainituista soluista eritetty liukoinen aminoter-minaalinen /3APP-fragmentti (/3ATF-APP) ja aine, joka sitoutuu spesifisesti mainittuun liukoiseen /SAPP-fragmenttiin, jolloin mainitun /3APP-fragment in aminohapposekvenssi oleel-10 lisesti ulottuu /SAPP:n aminopäästä /3-amyloidipeptidin (/SAP) aminopäähän, ja jolloin ATF-βΑΡΡ voidaan erottaa muista jSAPP:n katkaistuista muodoista, joita voi olla läsnä biologisessa näytteessä.
  3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että ATF-/SAPP-fragmentin toteamisessa näyte altistetaan aineelle, joka sitoutuu spesifisesti eritetyn fragmentin C-terminaaliseen alueeseen, joka oli paljastettu katkaisemalla /S-amyloidipeptidi (/SAP) irti 2 0 /SAPP : stä, ja todetaan sitoutuminen aineen ja eritetyn fragmentin välillä.
  4. 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että C-terminaalinen tähde on vii- 25 den vierekkäisen tähteen alueen sisällä aminoterminaalises-ti /SAP:n nähden.
  5. 4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että C-terminaalinen tähde on me- tioniini596, lysiini595 tai leusiini596 .
  6. 5. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, « ' * tunnettu siitä, että näyte altistetaan vasta-aineelle, joka on spesifinen C-terminaaliselle tähteelle, joka paljastuu, kun /S-amyloidipeptidi katkaistaan irti /SAPP: stä. 35 111546 28
  7. 6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta-aine oli saatu aikaan peptidiä vastaan, joka käsittää βΑΡΡ:η tähteet 591 - 596, jossa tähde596 on paljastettu.
  8. 7. In vitro -menetelmä, jolla voidaan diagnosoida tai monitoroida /S-amyloidiin liittyvää tautia potilaassa, tunnettu siitä, että potilasnäytteestä mitataan jS-amyloidiesiastepro-teiinin (/3APP) eritetyn fragmentin suhteen määrä altista-10 maila fragmenttlaineelle, joka sitoutuu spesifisesti mainittuun /3APP-fragmenttiin, jolloin mainitun βΑΡΡ-fragmentin aminohapposekvenssi oleellisesti ulottuu /3APP:n aminopäästä /3-amyloidipeptidin (/?AP) aminopäähän; ja verrataan mainitun /3APP-fragment in määrää määrään, 15 joka on luonteenomainen normaaleille potilasnäytteille, jolloin kohonnut määrä osoittaa Alzheimerin taudin.
  9. 8. In vitro -menetelmä, jolla voidaan tunnistaa β-amyloidin tuotannon inhibiittoreita, tunnettu siitä, että: 20 soluja viljellään olosuhteissa, jotka johtavat β- amyloidiesiasteproteiinin liukoisen aminoterminaalisen fragmentin (ATF-/3APP) erittymiseen, jolloin mainitun liukoisen ATF-βΑΡΡ-fragmentin aminohapposekvenssi oleellisesti ulottuu /?APP:n aminopäästä β-amyloidipeptidin (jSAP) amino-25 päähän; viljellyt solut altistetaan monille testiyhdisteil- le j a todetaan liukoisen ATF-/3APP:n määrä, jolloin liukoisen ATF-/3APP:n määrän lasku soluista, joita ei altisteta 30 testiyhdisteelle, osoittaa, että yhdiste on /3-amyloidin '·.. tuotannon inhibiittori. 9. jö-amyloidiesiasteproteiinin (βΑΡΡ) liukoinen fragmentti puhdistetussa ja eristetyssä muodossa, tunnettu siitä, että mainitun /3APP-fragmentin aminohap-35 posekvenssi ulottuu oleellisesti /3APP:n aminopäästä /3-amy-. . loidipeptidin (βΑΡ) aminopäähän, jolloin mainitussa /3APP- 111546 29 fragmentissa on C-terminaalinen metioniini tai leusiini, joka on tuloksena jS-amyloidipeptidin katkaisusta irti ehjästä jSAPP: stä.
  10. 10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen liukoinen frag-5 mentti, tunnettu siitä, että se koostuu oleellisesti jSAPP-isomuodon 695 tähteistä 18 - 596, jSAPP-isomuodon 751 tähteistä 18 - 612, jSAPP-isomuodon 770 tähteistä 18 - 671, jSAPP-isomuodon 695 tähteistä 18 - 595, jSAPP- isomuodon 751 tähteistä 18 - 611 tai jSAPP-isomuodon 770 10 tähteistä 18 - 670. « 1 111546 30
FI944847A 1992-04-15 1994-10-14 In vitro -menetelmiä, joilla voidaan monitoroida beta-amyloidiesiasteproteiinin prosessointia solussa, diagnosoida tai monitoroida beta-amyloidiin liittyvää tautia tai tunnistaa beta-amyloidin tuotannon inhibiittoreita, sekä beta-amyloidiesiasteproteiinin liukoinen fragmentti FI111546B (fi)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US86894992A 1992-04-15 1992-04-15
US86894992 1992-04-15
US07/965,971 US5441870A (en) 1992-04-15 1992-10-26 Methods for monitoring cellular processing of β-amyloid precursor protein
US96597192 1992-10-26
US9301817 1993-03-03
PCT/US1993/001817 WO1993021526A1 (en) 1992-04-15 1993-03-03 METHODS AND COMPOSITIONS FOR MONITORING CELLULAR PROCESSING OF β-AMYLOID PRECURSOR PROTEIN

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI944847A0 FI944847A0 (fi) 1994-10-14
FI944847A FI944847A (fi) 1994-10-14
FI111546B true FI111546B (fi) 2003-08-15

Family

ID=27128086

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI944847A FI111546B (fi) 1992-04-15 1994-10-14 In vitro -menetelmiä, joilla voidaan monitoroida beta-amyloidiesiasteproteiinin prosessointia solussa, diagnosoida tai monitoroida beta-amyloidiin liittyvää tautia tai tunnistaa beta-amyloidin tuotannon inhibiittoreita, sekä beta-amyloidiesiasteproteiinin liukoinen fragmentti

Country Status (14)

Country Link
US (3) US5441870A (fi)
EP (1) EP0638172B1 (fi)
JP (2) JP3974168B2 (fi)
AT (1) ATE251304T1 (fi)
AU (1) AU688726B2 (fi)
CA (1) CA2118243C (fi)
DE (1) DE69333225T2 (fi)
DK (1) DK0638172T3 (fi)
ES (1) ES2206455T3 (fi)
FI (1) FI111546B (fi)
NO (1) NO320067B1 (fi)
NZ (1) NZ251053A (fi)
PT (1) PT638172E (fi)
WO (1) WO1993021526A1 (fi)

Families Citing this family (172)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5525339A (en) * 1986-08-27 1996-06-11 Dms Pharmaceutical Inc. Isolated components of dense microspheres derived from mammalian brain tissue and antibodies thereto
US5441870A (en) * 1992-04-15 1995-08-15 Athena Neurosciences, Inc. Methods for monitoring cellular processing of β-amyloid precursor protein
US5837672A (en) * 1992-07-10 1998-11-17 Athena Neurosciences, Inc. Methods and compositions for the detection of soluble β-amyloid peptide
US6610493B1 (en) * 1993-06-17 2003-08-26 Brigham And Women's Hospital Screening compounds for the ability to alter the production of amyloid-β peptide
US5605811A (en) * 1992-10-26 1997-02-25 Athena Neurosciences, Inc. Methods and compositions for monitoring cellular processing of beta-amyloid precursor protein
ES2203620T3 (es) * 1992-10-26 2004-04-16 Elan Pharmaceuticals, Inc. Procedimientos para la identificacion de los inhibidores de la produccion del peptido beta-amiloide.
ATE198622T1 (de) * 1993-10-27 2001-01-15 Elan Pharm Inc Transgene tiere, die app allele mit der schwedischen mutation beherbergen
US5589154A (en) * 1994-11-22 1996-12-31 Rutgers, The State University Of New Jersey Methods for the prevention or treatment of vascular hemorrhaging and Alzheimer's disease
US5804560A (en) * 1995-01-06 1998-09-08 Sibia Neurosciences, Inc. Peptide and peptide analog protease inhibitors
US6017887A (en) * 1995-01-06 2000-01-25 Sibia Neurosciences, Inc. Peptide, peptide analog and amino acid analog protease inhibitors
US5783434A (en) * 1995-06-06 1998-07-21 Tung; Jay S. Cathepsin and methods and compositions for inhibition thereof
EP0831920A4 (en) * 1995-06-06 2003-03-19 Athena Neurosciences Inc NOVEL CATHEPSIN AND METHODS AND COMPOSITIONS FOR INHIBITING CATHEPSIN
US5849711A (en) * 1995-06-06 1998-12-15 Athena Neurosciences, Inc. Cathepsin and methods and compositions for inhibition thereof
US6717031B2 (en) 1995-06-07 2004-04-06 Kate Dora Games Method for selecting a transgenic mouse model of alzheimer's disease
US6136530A (en) * 1995-11-29 2000-10-24 Texas Tech University Health Sciences Center Compositions and methods for assessing risk factors in Alzheimer's disease
AU1072897A (en) 1995-12-12 1997-07-03 Karolinska Innovations Ab Peptide binding the klvff-sequence of amyloid beta
JPH09178743A (ja) * 1995-12-27 1997-07-11 Oriental Yeast Co Ltd 可溶性ａｐｐの定量法
GB9701684D0 (en) 1997-01-28 1997-03-19 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
US8173127B2 (en) * 1997-04-09 2012-05-08 Intellect Neurosciences, Inc. Specific antibodies to amyloid beta peptide, pharmaceutical compositions and methods of use thereof
US6576019B1 (en) * 1997-10-31 2003-06-10 Children's Medical Center Corporation Bladder reconstruction
US6761888B1 (en) * 2000-05-26 2004-07-13 Neuralab Limited Passive immunization treatment of Alzheimer's disease
TWI239847B (en) * 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US7964192B1 (en) 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
US6710226B1 (en) 1997-12-02 2004-03-23 Neuralab Limited Transgenic mouse assay to determine the effect of Aβ antibodies and Aβ Fragments on alzheimer's disease characteristics
US6750324B1 (en) 1997-12-02 2004-06-15 Neuralab Limited Humanized and chimeric N-terminal amyloid beta-antibodies
US6913745B1 (en) 1997-12-02 2005-07-05 Neuralab Limited Passive immunization of Alzheimer's disease
US6787523B1 (en) 1997-12-02 2004-09-07 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US7179892B2 (en) * 2000-12-06 2007-02-20 Neuralab Limited Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US6923964B1 (en) 1997-12-02 2005-08-02 Neuralab Limited Active immunization of AScr for prion disorders
US7588766B1 (en) 2000-05-26 2009-09-15 Elan Pharma International Limited Treatment of amyloidogenic disease
US7790856B2 (en) 1998-04-07 2010-09-07 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US6743427B1 (en) 1997-12-02 2004-06-01 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US20080050367A1 (en) * 1998-04-07 2008-02-28 Guriq Basi Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US20050059802A1 (en) * 1998-04-07 2005-03-17 Neuralab Ltd Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US20030147882A1 (en) * 1998-05-21 2003-08-07 Alan Solomon Methods for amyloid removal using anti-amyloid antibodies
US7060670B1 (en) * 1999-05-05 2006-06-13 Neurochem (International) Limited Stereoselective antifibrillogenic peptides and peptidomimetics thereof
US20040167634A1 (en) * 1999-05-26 2004-08-26 Anthony Atala Prosthetic kidney and its use for treating kidney disease
US6787637B1 (en) 1999-05-28 2004-09-07 Neuralab Limited N-Terminal amyloid-β antibodies
UA81216C2 (en) * 1999-06-01 2007-12-25 Prevention and treatment of amyloid disease
US20070135337A2 (en) * 1999-11-29 2007-06-14 Neurochem (International) Limited Vaccine for the Prevention and Treatment of Alzheimer's and Amyloid Related Diseases
US20020094335A1 (en) * 1999-11-29 2002-07-18 Robert Chalifour Vaccine for the prevention and treatment of alzheimer's and amyloid related diseases
US6479064B1 (en) * 1999-12-29 2002-11-12 Children's Medical Center Corporation Culturing different cell populations on a decellularized natural biostructure for organ reconstruction
US6992081B2 (en) 2000-03-23 2006-01-31 Elan Pharmaceuticals, Inc. Compounds to treat Alzheimer's disease
DE60124080T2 (de) * 2000-03-23 2007-03-01 Elan Pharmaceuticals, Inc., San Francisco Verbindungen und verfahren zur behandlung der alzheimerschen krankheit
AU5702201A (en) * 2000-04-13 2001-10-30 Mayo Foundation Abeta<sub>42</sub> lowering agents
PE20020276A1 (es) 2000-06-30 2002-04-06 Elan Pharm Inc COMPUESTOS DE AMINA SUSTITUIDA COMO INHIBIDORES DE ß-SECRETASA PARA EL TRATAMIENTO DE ALZHEIMER
US6846813B2 (en) 2000-06-30 2005-01-25 Pharmacia & Upjohn Company Compounds to treat alzheimer's disease
EP1666452A2 (en) 2000-06-30 2006-06-07 Elan Pharmaceuticals, Inc. Compounds to treat Alzheimer's disease
US20030096864A1 (en) * 2000-06-30 2003-05-22 Fang Lawrence Y. Compounds to treat alzheimer's disease
ES2248356T3 (es) 2000-06-30 2006-03-16 Elan Pharmaceuticals, Inc. Compuestos para tratar la enfermedad de alzheimer.
FR2816411B1 (fr) * 2000-11-03 2003-07-04 Inst Nat Sante Rech Med Moyens de detection de la transformation pathologique de la proteine app et leurs applications
PE20020574A1 (es) 2000-12-06 2002-07-02 Wyeth Corp Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido amiloideo beta
US7700751B2 (en) 2000-12-06 2010-04-20 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize β-amyloid peptide
US20030215896A1 (en) * 2001-04-25 2003-11-20 Yueming Li Gamma secretase substrates and in vitro assays
ES2312569T3 (es) * 2001-04-30 2009-03-01 Eli Lilly And Company Anticuerpos humanizados.
US7196163B2 (en) * 2001-05-22 2007-03-27 Merk & Co., Inc. Assays using amyloid precursor proteins with modified β-secretase cleavage sites to monitor β-secretase activity
EP1395551B1 (en) * 2001-06-01 2008-05-21 Elan Pharmaceuticals, Inc. Hydroxy alkyl amine derivatives as beta-secretase inhibitors and their use for the treatment of alzheimer's disease and similar diseases
JP2004532894A (ja) 2001-06-13 2004-10-28 イーラン　ファーマスーティカルズ、インコーポレイテッド アルツハイマー病を治療するためのアミンジオール
BR0210721A (pt) * 2001-06-27 2004-07-20 Elan Pharm Inc Composto, sal ou éster farmaceuticamente aceitável, método para fabricar um composto, e, método para tratar um paciente que tem, ou para evitar que o paciente adquira uma doença ou condição
US20070213407A1 (en) * 2001-06-29 2007-09-13 Elan Pharmaceuticals And Pharmacia & Upjohn Company Llc Compounds to treat Alzheimer's disease
US7053109B2 (en) * 2001-07-10 2006-05-30 Pharmacia & Upjohn Company Aminediols for the treatment of Alzheimer's disease
BR0211118A (pt) * 2001-07-10 2004-10-26 Elan Pharm Inc Composto, métodos para o tratamento ou prevenção de doenças e para fabricar um composto, intermediário, e, uso de um composto ou sal
US7297553B2 (en) * 2002-05-28 2007-11-20 Nanosphere, Inc. Method for attachment of silylated molecules to glass surfaces
IL160208A0 (en) * 2001-08-31 2004-07-25 Neurochem Int Ltd Amidine derivatives for treating amyloidosis
CA2462851A1 (en) * 2001-10-04 2003-04-10 Elan Pharmaceuticals, Inc. Hydroxypropylamines
NZ533107A (en) 2001-11-08 2007-04-27 Upjohn Co N, N'-substituted-1,3-diamino-2-hydroxypropane derivatives
BR0214217A (pt) * 2001-11-16 2004-09-21 Childrens Medical Center Aumento de função de órgão
MXPA04004713A (es) * 2001-11-19 2005-08-16 Pharmacia & Up John Company Ll Aminoides utiles en el tratamiento de la enfermedad de alzheimer.
ATE316657T1 (de) * 2002-02-14 2006-02-15 Evotec Neurosciences Gmbh Diagnostische und therapeutische verwendung des caps
US20050214763A1 (en) * 2002-02-14 2005-09-29 Rainer Hipfel Diagnostic and therapeutic use of an activator protein for vesicle secretion for neurodegenerative diseases
WO2003072041A2 (en) * 2002-02-27 2003-09-04 Merck & Co., Inc. Assays to monitor amyloid precursor protein processing
CA2477675C (en) * 2002-03-05 2013-05-21 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Immunizing composition and method for inducing an immune response against the .beta.-secretase cleavage site of amyloid precursor protein
MY139983A (en) * 2002-03-12 2009-11-30 Janssen Alzheimer Immunotherap Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
CA2482589A1 (en) * 2002-04-17 2003-10-30 Pharmacia & Upjohn Company Llc Compositions and method of treating alzheimer's disease
AU2003303141A1 (en) * 2002-04-30 2004-07-22 Elan Pharmaceuticals, Inc. Hydroxypropyl amides for the treatment of alzheimer's disease
CA2501945A1 (en) * 2002-10-09 2004-04-22 Rinat Neuroscience Corp. Methods of treating alzheimer's disease using antibodies directed against amyloid beta peptide and compositions thereof
KR100520495B1 (ko) * 2002-10-23 2005-10-11 한국과학기술연구원 베타아밀로이드 특이 단일 클론 항체 및 그의 제조방법
BR0316629A (pt) 2002-11-27 2005-10-11 Elan Pharm Inc Uréias e carbamatos substituìdos
DE10303974A1 (de) 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
JP2006516639A (ja) * 2003-02-01 2006-07-06 ニユーララブ・リミテツド 可溶性Ａ−βに対する抗体を生成させるための能動免疫
BRPI0409627A (pt) * 2003-04-21 2006-04-25 Elan Pharm Inc 2-hidróxi-3-diaminoalcanos de fenacila
AR044044A1 (es) * 2003-04-21 2005-08-24 Elan Pharm Inc 2-hidroxi-3-diaminoalcanos de benzamida
US20040223912A1 (en) * 2003-05-07 2004-11-11 Montalto Michael Christopher Compositions and methods for non-invasive imaging of soluble beta-amyloid
EP1631561B1 (en) 2003-05-07 2010-08-18 General Electric Company Compositions and methods for non-invasive imaging of soluble beta-amyloid
PE20050627A1 (es) 2003-05-30 2005-08-10 Wyeth Corp Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido beta amiloideo
JP2007522129A (ja) * 2004-01-21 2007-08-09 エラン ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド アスパラギン酸プロテアーゼ阻害薬を用いるアミロイドーシスの処置方法
US7262223B2 (en) * 2004-01-23 2007-08-28 Neurochem (International) Limited Amidine derivatives for treating amyloidosis
EP1734942A1 (en) * 2004-03-09 2006-12-27 Elan Pharmaceuticals, Inc. Substituted urea and carbamate, phenacyl-2-hydroxy-3-diaminoalkane, and benzamide-2-hydroxy-3-diaminoalkane aspartyl-protease inhibitors
CA2558034A1 (en) * 2004-03-09 2005-09-22 Elan Pharmaceuticals, Inc. Substituted hydroxyethylamine aspartyl protease inhibitors
US20060014737A1 (en) * 2004-03-09 2006-01-19 Varghese John Methods of treatment of amyloidosis using bi-aryl aspartyl protease inhibitors
EP1734961A2 (en) * 2004-03-09 2006-12-27 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods of treatment of amyloidosis using bi-cyclic aspartyl protease inhibitors
WO2005087752A2 (en) * 2004-03-09 2005-09-22 Elan Pharmaceuticals, Inc. Substituted hydroxyethylamine aspartyl protease inhibitors
CA2572775A1 (en) * 2004-07-09 2006-01-26 Elan Pharmaceuticals, Inc. Oxime derivative hydroxyethylamine aspartyl-protease inhibitors
CA2573138A1 (en) * 2004-07-09 2006-01-26 Elan Pharmaceuticals Inc. Oxime derivative substituted hydroxyethylamine aspartyl protease inhibitors
KR20070040824A (ko) * 2004-07-30 2007-04-17 리나트 뉴로사이언스 코퍼레이션 아밀로이드-베타 펩티드에 대해 지시된 항체 및 이의 사용방법
EP1802574A2 (en) * 2004-08-27 2007-07-04 Elan Pharmaceuticals Inc. Methods of treatment of amyloidosis using ethanol cyclicamine derivatives aspartyl protease inhibitors
BRPI0518151A2 (pt) * 2004-10-13 2009-06-16 Ablynx Nv polipetìdeos contra amiloide-beta, ácido nucléico que codifica tal polipetìdeo, composição compreendendo tal polipetìdeo, método para produzir um polipetìdeo e uso do mesmo
PE20061329A1 (es) 2004-12-15 2006-12-08 Neuralab Ltd Anticuerpos ab humanizados para mejorar la cognicion
WO2006066049A2 (en) 2004-12-15 2006-06-22 Neuralab Limited Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
JP2008524247A (ja) * 2004-12-15 2008-07-10 エラン ファーマ インターナショナル リミテッド 認知の改善における使用のためのアミロイドβ抗体
CA2603676A1 (en) * 2005-01-07 2006-07-13 Roskamp Research Llc Compounds for inhibiting beta-amyloid production and methods of identifying the compounds
UY29504A1 (es) * 2005-04-29 2006-10-31 Rinat Neuroscience Corp Anticuerpos dirigidos contra el péptido amiloide beta y métodos que utilizan los mismos.
US20080293680A1 (en) * 2005-08-03 2008-11-27 Stefan Peters Substituted Ethane-1,2-Diamines for the Treatment of Alzheimer's Disease II
WO2007047305A1 (en) * 2005-10-12 2007-04-26 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating amyloidosis using cyclopropyl derivative aspartyl protease inhibitors
JP2009511589A (ja) * 2005-10-12 2009-03-19 エラン ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド アリール−シクロプロピル誘導体のアスパルチルプロテアーゼ阻害剤を使用してアミロイドーシスを治療する方法
US7872009B2 (en) * 2005-11-21 2011-01-18 Amgen Inc. Beta-Secretase modulators and methods of use
US7838676B2 (en) * 2005-11-21 2010-11-23 Amgen Inc. Beta-secretase modulators and methods of use
US7745484B2 (en) * 2005-11-21 2010-06-29 Amgen Inc. Beta-secretase modulators and methods of use
PL1976877T5 (pl) 2005-11-30 2017-09-29 Abbvie Inc Przeciwciała monoklonalne przeciwko białku amyloidu beta oraz ich zastosowania
CN117903302A (zh) 2005-11-30 2024-04-19 Abbvie 公司 抗-Aβ球聚体抗体，其相关产品，生产所述抗体的方法，所述抗体的应用以及使用方法
RU2551782C2 (ru) 2005-12-12 2015-05-27 Ац Иммуне Са Специфические в отношении амилоида бета (а бета) 1-42 моноклональные антитела, обладающие терапевтическими свойствами
US8784810B2 (en) 2006-04-18 2014-07-22 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of amyloidogenic diseases
US20070292895A1 (en) * 2006-05-19 2007-12-20 Xiao-Ping Shi Assays and methods to detect beta-secretase and its activity in body fluids and tissue extracts
JP2009538924A (ja) * 2006-06-01 2009-11-12 エラン ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド Ａｐｐの神経活性断片
WO2008011348A2 (en) * 2006-07-14 2008-01-24 Ac Immune S.A. Humanized antibody against amyloid beta
US8455626B2 (en) * 2006-11-30 2013-06-04 Abbott Laboratories Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies
US20100203044A1 (en) * 2006-12-22 2010-08-12 Anatoly Nikolaev Dr6 antagonists and uses thereof in treating neurological disorders
EP2486928A1 (en) 2007-02-27 2012-08-15 Abbott GmbH & Co. KG Method for the treatment of amyloidoses
CA2684323A1 (en) * 2007-04-18 2008-10-30 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of cerebral amyloid angiopathy
US8003097B2 (en) 2007-04-18 2011-08-23 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of cerebral amyloid angiopathy
WO2008137954A2 (en) * 2007-05-07 2008-11-13 Environmental Packaging Technologies Limited Universal shipping container
TW200901991A (en) 2007-05-25 2009-01-16 Amgen Inc Substituted hydroxyethyl amine compounds as beta-secretase modulators and methods of use
WO2008147544A1 (en) 2007-05-25 2008-12-04 Amgen Inc. Substituted hydroxyethyl amine compounds as beta-secretase modulators and methods of use
US9580688B2 (en) * 2007-06-08 2017-02-28 Wake Forest University Health Sciences Kidney structures and methods of forming the same
US10590391B2 (en) * 2007-06-08 2020-03-17 Wake Forest University Health Sciences Selective cell therapy for the treatment of renal failure
ES2725502T3 (es) * 2007-06-08 2019-09-24 Univ Wake Forest Health Sciences Terapia celular selectiva para el tratamiento de la insuficiencia renal
US8048420B2 (en) 2007-06-12 2011-11-01 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
TW201518320A (zh) * 2007-06-12 2015-05-16 Ac Immune Sa 特異性結合β-類澱粉蛋白之抗體及相關核酸分子、表現載體、細胞、組合物、套組、方法及用途
US8613923B2 (en) * 2007-06-12 2013-12-24 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
WO2009012237A1 (en) 2007-07-13 2009-01-22 Elan Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for identifying substrate specificity of inhibitors of gamma secretase
PL2182983T3 (pl) 2007-07-27 2014-10-31 Janssen Alzheimer Immunotherap Leczenie chorób amyloidowych z wykorzystaniem humanizowanych przeciwciał specyficznych względem Abeta
EP2205632B1 (en) * 2007-10-05 2016-11-16 Genentech, Inc. Use of anti-amyloid beta antibody in ocular diseases
EP2586795B1 (en) 2007-10-05 2018-05-16 Genentech, Inc. Use of anti-amyloid beta antibody in ocular diseases
JO3076B1 (ar) 2007-10-17 2017-03-15 Janssen Alzheimer Immunotherap نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe
US20090163594A1 (en) * 2007-10-31 2009-06-25 Elan Pharmaceuticals, Inc. Triple Assay System for Identifying Substrate Selectivity of Gamma Secretase Inhibitors
US7803809B2 (en) * 2008-11-12 2010-09-28 Amgen Inc. Substituted pyrano [2,3-b] pyridinamine compounds as beta-secretase modulators and methods of use
US9345753B2 (en) * 2008-01-16 2016-05-24 Yeda Research And Development Co. Ltd. At The Weizmann Institute Of Science Vaccine for alzheimer's disease
EP2294413A4 (en) * 2008-06-12 2012-04-25 Genentech Inc SCREENING METHOD FOR IDENTIFYING COMPOUNDS THAT INHIBIT NEURODEGENERESCENCE
BRPI0918449A2 (pt) * 2008-09-11 2019-09-24 Amgen Inc compostos de anel espiro-tricíclico como moduladores de beta-secretas e métodos de uso
US20110256559A1 (en) * 2008-10-20 2011-10-20 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Method for Detecting Soluble Amyloid Precursor Protein (APP) Alpha and/or Soluble APP Beta
US9067981B1 (en) 2008-10-30 2015-06-30 Janssen Sciences Ireland Uc Hybrid amyloid-beta antibodies
WO2010062904A2 (en) 2008-11-25 2010-06-03 Biogen Idec Ma Inc. Use of dr6 and p75 antagonists to promote survival of cells of the nervous system
EP2498817A2 (en) * 2009-11-12 2012-09-19 F. Hoffmann-La Roche AG A method of promoting dendritic spine density
WO2011063272A1 (en) 2009-11-23 2011-05-26 Amgen Inc. Amino heteroaryl compounds as beta-secretase modulators and methods of use
WO2011063233A1 (en) 2009-11-23 2011-05-26 Amgen Inc. Amino heteroaryl compounds as beta-secretase modulators and methods of use
US8735384B2 (en) 2010-01-19 2014-05-27 Amgen Inc. Amino heteroaryl compounds as beta-secretase modulators and methods of use
JP5584352B2 (ja) 2010-03-15 2014-09-03 アムジエン・インコーポレーテツド β−セクレターゼ調節剤としてのアミノ−ジヒドロオキサジン系およびアミノ−ジヒドロチアジン系スピロ化合物ならびにそれらの医学的用途
AU2011227511B2 (en) 2010-03-15 2014-02-20 Amgen Inc. Spiro-tetracyclic ring compounds as Beta - secretase modulators
CA2796339C (en) 2010-04-15 2020-03-31 Abbott Laboratories Amyloid-beta binding proteins
CN103179981B (zh) 2010-07-30 2017-02-08 Ac免疫有限公司 安全和功能性的人源化抗β‑淀粉样蛋白抗体
EP2601197B1 (en) 2010-08-05 2014-06-25 Amgen Inc. Amino-iso-indole, amino-aza-iso-indole, amino-dihydroisoquinoline and amino-benzoxazine compounds as beta-secretase modulators and methods of use
CA2808187A1 (en) 2010-08-14 2012-02-23 Abbvie Inc. Amyloid-beta binding proteins
EP2643325A1 (en) 2010-11-23 2013-10-02 Amgen Inc. Spiro-amino-imidazolone and spiro-amino-dihydro-pyrimidinone compounds as beta-secretase modulators and methods of use
US9346827B2 (en) 2011-02-07 2016-05-24 Amgen Inc. 5-amino-oxazepine and 5-amino-thiazepane compounds as beta secretase antagonists and methods of use
WO2012112462A1 (en) 2011-02-15 2012-08-23 Amgen Inc. Spiro-amino-imidazo-fused heterocyclic compounds as beta-secretase modulators and methods of use
WO2012142301A2 (en) 2011-04-12 2012-10-18 Quanterix Corporation Methods of determining a treatment protocol for and/or a prognosis of a patients recovery from a brain injury
WO2013044092A1 (en) 2011-09-21 2013-03-28 Amgen Inc. Amino-oxazines and amino-dihydrothiazine compounds as beta-secretase modulators and methods of use
EP2811018B1 (en) * 2012-02-03 2017-03-22 Shionogi & Co., Ltd. ANTI-sAPPß ANTIBODY
WO2014059185A1 (en) 2012-10-12 2014-04-17 Amgen Inc. Amino - dihydrothiazine and amino - dioxido dihydrothiazine compounds as beta-secretase antagonists and methods of use
US9725469B2 (en) 2012-11-15 2017-08-08 Amgen, Inc. Amino-oxazine and amino-dihydrothiazine compounds as beta-secretase modulators and methods of use
WO2014120658A1 (en) 2013-01-29 2014-08-07 Amgen Inc. Fused multicyclic 3-amino-5,6-dihydro-2h-1,4-thiazine derivatives and their use as beta-secretase inhibitors
US9296734B2 (en) 2013-03-01 2016-03-29 Amgen Inc. Perfluorinated 5,6-dihydro-4H-1,3-oxazin-2-amine compounds as beta-secretase inhibitors and methods of use
SG11201507196WA (en) 2013-03-08 2015-10-29 Amgen Inc Perfluorinated cyclopropyl fused 1,3-oxazin-2-amine compounds as beta-secretase inhibitors and methods of use
US9096615B2 (en) * 2013-07-30 2015-08-04 Amgen Inc. Bridged bicyclic amino thiazine dioxide compounds as inhibitors of beta-secretase and methods of use thereof
WO2016022724A1 (en) 2014-08-08 2016-02-11 Amgen Inc. Cyclopropyl fused thiazin-2-amine compounds as beta-secretase inhibitors and methods of use
EP3070096A1 (en) * 2015-03-19 2016-09-21 Ludwig-Maximilians-Universität München A peptide or collection of peptides derived from amyloid precursor protein
WO2017024180A1 (en) 2015-08-06 2017-02-09 Amgen Inc. Vinyl fluoride cyclopropyl fused thiazin-2-amine compounds as beta-secretase inhibitors and methods of use
JP7149272B2 (ja) 2016-12-15 2022-10-06 アムジエン・インコーポレーテツド β－セクレターゼ阻害剤としてのチアジン誘導体および使用方法
MX2019007101A (es) 2016-12-15 2019-12-16 Amgen Inc Derivados de oxazina como inhibidores de beta secretasa y metodos de uso.
JP7149271B2 (ja) 2016-12-15 2022-10-06 アムジエン・インコーポレーテツド β－セクレターゼ阻害剤としての１，４－チアジンジオキシドおよび１，２，４－チアジアジンジオキシド誘導体ならびに使用方法
AU2017378316B2 (en) 2016-12-15 2021-04-01 Amgen Inc. Cyclopropyl fused thiazine derivatives as beta-secretase inhibitors and methods of use
MA54101A (fr) 2016-12-15 2021-10-27 Amgen Inc Dérivés de thiazine et d'oxazine bicycliques en tant qu'inhibiteurs de bêta-sécrétase et procédés d'utilisation

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4492760A (en) * 1983-04-19 1985-01-08 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology HLA D Typing assay
JPS6147500A (ja) * 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) * 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) * 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
JPS61134325A (ja) * 1984-12-04 1986-06-21 Teijin Ltd ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法
US4666829A (en) * 1985-05-15 1987-05-19 University Of California Polypeptide marker for Alzheimer's disease and its use for diagnosis
JPS62100291A (ja) * 1985-10-28 1987-05-09 Teijin Ltd 遺伝子断片およびプラスミド
JPS63501765A (ja) * 1985-11-01 1988-07-21 インタ−ナショナル、ジェネティック、エンジニアリング　インコ−ポレ−テッド 抗体遺伝子のモジュ−ル組立体、それにより産生された抗体及び用途
US5223482A (en) * 1986-11-17 1993-06-29 Scios Nova Inc. Recombinant Alzheimer's protease inhibitory amyloid protein and method of use
EP0331514A3 (en) * 1988-03-04 1991-07-10 Ajinomoto Co., Inc. Assaying the duchenne muscular dystrophy protein deletion or defect
US5134062A (en) * 1988-03-22 1992-07-28 Cornell Research Foundation, Inc. Diagnosis of neuronal disorders and screening potential therapeutic agents therefor
US5262332A (en) * 1989-04-05 1993-11-16 Brigham And Women's Hospital Diagnostic method for Alzheimer's disease: examination of non-neural tissue
US5234814A (en) * 1989-06-01 1993-08-10 Du Pont Merck Pharmaceutical Company Diagnostic assay for alzheimer's disease
US5213962A (en) * 1990-04-24 1993-05-25 The Regents Of The University Of California Purification, detection and methods of use of protease Nexin-2
EP0527823A1 (en) * 1990-04-24 1993-02-24 The Regents Of The University Of California Purification, detection and methods of use of protease nexin-2
US5385915A (en) * 1990-05-16 1995-01-31 The Rockefeller University Treatment of amyloidosis associated with Alzheimer disease using modulators of protein phosphorylation
ES2217250T3 (es) * 1990-06-15 2004-11-01 Scios Inc. Mamifero transgenico, no humano que muestra la patologia de formacion amiloides de la enfermedad de alzheimer.
WO1992000521A1 (en) * 1990-06-29 1992-01-09 Case Western Reserve University Diagnostic and prognostic methods based on soluble derivatives of the beta amyloid protein precursor
US5200339A (en) * 1990-08-17 1993-04-06 Abraham Carmela R Proteases causing abnormal degradation of amyloid β-protein precursor
BE1003316A5 (fr) * 1990-11-27 1992-02-25 Will L F & Cie Sa Anticorps monoclonal utile pour le diagnostic de la maladie d'alzheimer, hybridome secreteur d'un tel anticorps monoclonal et procede pour sa preparation.
US5441870A (en) * 1992-04-15 1995-08-15 Athena Neurosciences, Inc. Methods for monitoring cellular processing of β-amyloid precursor protein

Also Published As

Publication number Publication date
AU688726B2 (en) 1998-03-19
JP3974168B2 (ja) 2007-09-12
JP2006051029A (ja) 2006-02-23
US5441870A (en) 1995-08-15
WO1993021526A1 (en) 1993-10-28
JPH07506967A (ja) 1995-08-03
FI944847A0 (fi) 1994-10-14
CA2118243C (en) 2009-11-03
NZ251053A (en) 1996-11-26
DE69333225D1 (de) 2003-11-06
AU3782793A (en) 1993-11-18
US5721130A (en) 1998-02-24
NO943912L (no) 1994-11-10
ATE251304T1 (de) 2003-10-15
ES2206455T3 (es) 2004-05-16
DE69333225T2 (de) 2004-05-06
NO320067B1 (no) 2005-10-17
EP0638172A4 (en) 1997-03-19
EP0638172B1 (en) 2003-10-01
NO943912D0 (no) 1994-10-14
US6018024A (en) 2000-01-25
CA2118243A1 (en) 1993-10-28
PT638172E (pt) 2004-02-27
FI944847A (fi) 1994-10-14
EP0638172A1 (en) 1995-02-15
DK0638172T3 (da) 2004-02-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI111546B (fi) In vitro -menetelmiä, joilla voidaan monitoroida beta-amyloidiesiasteproteiinin prosessointia solussa, diagnosoida tai monitoroida beta-amyloidiin liittyvää tautia tai tunnistaa beta-amyloidin tuotannon inhibiittoreita, sekä beta-amyloidiesiasteproteiinin liukoinen fragmentti
US5605811A (en) Methods and compositions for monitoring cellular processing of beta-amyloid precursor protein
EP0667959B1 (en) Methods for identifying inhibitors of the production of beta-amyloid peptide
EP0736106B1 (en) Methods of screening for beta-amyloid peptide production inhibitors
US5837672A (en) Methods and compositions for the detection of soluble β-amyloid peptide
US5766846A (en) Methods of screening for compounds which inhibit soluble β-amyloid peptide production
AU2008200489B2 (en) Methods and compositions for the detection of soluble beta-amyloid peptide
AU687747C (en) Methods and compositions for the detection of soluble beta-amyloid peptide
AU722044B2 (en) Methods and compositions for the detection of soluble beta-amyloid peptide
AU2004203875A1 (en) Methods and compositions for the detection of soluble beta-amyloid peptide

Legal Events

Date Code Title Description
PC Transfer of assignment of patent

Owner name: ELI LILLY AND COMPANY

Free format text: ELI LILLY AND COMPANY

Owner name: ELAN PHARMACEUTICALS, INC.

Free format text: ELAN PHARMACEUTICALS, INC.

MA Patent expired