ES2230551T3 - Procedimientos para ayudar al diagnostico de la enfermedad de alzheimer mediante la medicion del peptido (x- 41)amiloide beta y de la proteina tau. - Google Patents
Procedimientos para ayudar al diagnostico de la enfermedad de alzheimer mediante la medicion del peptido (x- 41)amiloide beta y de la proteina tau.Info
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Abstract
LA INVENCION SUMINISTRA METODOS UTILES EN LA AYUDA EN LA DIAGNOSIS EN LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER. LOS METODOS COMPRENDEN LA MEDICION DE LA CANTIDAD DE PEPTIDO AMILOIDE-{BE} (X- (MAYOR O IGUAL) 41) EN EL FLUIDO CEREBROESPINAL DE UN PACIENTE. LOS ALTOS NIVELES DEL PEPTIDO SON GENERALMENTE INCONSISTENTE CON UNA DIAGNOSIS DE LA ENFERMEDAD DE LA ALZHEIMER. LOS BAJOS NIVELES DEL PEPTIDOS SON CONSISTENTES CON LA ENFERMEDAD, Y OTRAS PRUEBAS, PUEDEN SUMINISTRAR UNA DIAGNOSIS POSITIVA. OTROS METODOS COMPRENDEN LA MEDICION DE LA CANTIDADES TANTO DEL A{BE}(X- (MAYOR O IGUAL) 41) Y EL TAU. LOS BAJOS NIVELES DE A{BE}(X- (MAYOR O IGUAL) 41) Y LOS ALTOS NIVELES DE TAU SON UN INDICADOR POSITIVO DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER, MIENTRAS QUE LOS ALTOS NIVELES DE A{BE} (X- (MAYOR O IGUAL) 41) Y LOS BAJOS NIVELES DE TAU SON UNA INDICACION NEGATIVA DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER.
Description
Procedimientos para ayudar al diagnóstico de la
enfermedad de Alzheimer mediante la medición del péptido
(X-\geq41) amiloide \beta y de la proteína
tau.
La presente invención se refiere en general a
procedimientos para el diagnóstico o el control de la enfermedad de
Alzheimer. Más particularmente, la presente invención se refiere a
la medición de la cantidad de proteína tau y/o de la cantidad del
péptido (x-\geq41) \beta amiloide en muestras de
líquido del paciente y utilizando estas cantidades como indicador
para el diagnóstico.
La enfermedad de Alzheimer (AD) es un trastorno
degenerativo del cerebro caracterizado clínicamente por la pérdida
progresiva de memoria, conocimiento, razonamiento, juicio y
estabilidad emocional que conduce gradualmente a un deterioro
mental profundo y finalmente a la muerte. AD es una causa muy
frecuente de insuficiencia mental progresiva (demencia) en personas
mayores y se cree que representa la cuarta causa de muerte médica
más frecuente en los Estados Unidos. La AD se ha observado en razas
y grupos étnicos de todo el mundo y presenta un problema principal
de salud pública actual y futuro. Se estima que la enfermedad
afecta actualmente alrededor de dos a tres millones de personas
solamente en los Estados Unidos. La AD es incurable en la
actualidad. No se conoce actualmente ningún tratamiento que evite
eficazmente la AD o anule sus síntomas y evolución.
Los cerebros de pacientes de AD presentan
lesiones características denominadas placas seniles y nudos
neurofibrilares. Un gran número de estas lesiones se encuentra
generalmente en varias áreas del cerebro humano importantes para la
función de la memoria y del conocimiento en pacientes de AD. Un
número menor de estas lesiones en una distribución anatómica más
restringida se encuentra a veces en los cerebros de las personas de
edad que no padecen AD clínica. Las placas amiloides y la
angiopatía amiloide caracterizan asimismo los cerebros de pacientes
por encima de una determinada edad con trisomía 21 (síndrome de
Down) y la hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis de tipo
holandés (HCHWA-D). En la actualidad, un
diagnóstico definitivo de AD requiere observar las lesiones antes
mencionadas en el tejido cerebral de pacientes que han muerto de la
enfermedad o, en raras ocasiones, en pequeñas muestras de biopsia de
tejido cerebral tomadas durante un procedimiento neuroquirúrgico
traumático. El principal constituyente químico de las placas
amiloides y de los depósitos amiloides vasculares (angiopatía
amiloide) característico de AD y de otros trastornos mencionados
anteriormente es una proteína de aproximadamente 4,2 kilodalton
(kD) de aproximadamente 39 a 43 aminoácidos denominada péptido
\beta-amiloide (A\beta) o a veces \betaAP,
A\betaP o \beta/A4. Glenner y Wong (1984) Biochem. Biophys.
Res. Commun. 120:885-890 purificadon por
primera vez A\beta y describieron una secuencia parcial de
aminoácidos. El procedimiento de aislamiento y los datos de la
secuencia para los primeros 28 aminoácidos se describen en la
patente U.S. nº 4.666.829. Las formas de A\beta con aminoácidos
por encima del número 40 fueron descritas por primera vez por Kang
et al. (1987) Nature 325:733-736.
Roher et al. (1993) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 90:10836-840 demostró que
A\beta(1-42) es el principal constituyente
de las placas neuríticas (90%) con cantidades significativas de
restos de aspartilo isomerizados y racemizados. Los autores también
demostraron que A\beta(17-42) predomina
también en las placas difusas (70%), mientras que
A\beta(1-40) es el principal constituyente
en las placas meningovasculares, comprendiendo el 60% del A\beta
total, y en los depósitos A\beta(1-42) del
vaso parenquimal representa el 75% del A\beta total. Iwatsubo
et al. (1994) Neuron 13:45-53 demostró
que las placas seniles positivas a A\beta42(43) son las
especies principales en el cerebro AD esporádico.
Los análisis biológicos moleculares y químicos de
la proteína realizados durante los últimos seis años han demostrado
que A\beta es un fragmento pequeño de una proteína precursora
mucho mayor, denominada proteína precursora
\beta-amiloide (APP), que es producida
generalmente por células en muchos tejidos de diversos animales,
incluyendo los seres humano. El conocimiento de la estructura del
gen que codifica APP ha demostrado que A\beta aparece como un
fragmento de péptido que es escindido del extremo
carboxi-terminal de APP por enzimas (proteasas)
hasta ahora desconocidas. Se desconoce actualmente el mecanismo
bioquímico exacto mediante el cual el fragmento A\beta se escinde
de APP y se deposita posteriormente en forma de placas amiloides en
el tejido cerebral y en las paredes los vasos sanguíneos del
cerebro y de las meninges.
Varías líneas de pruebas indican que la
deposición cerebral progresiva de A\beta representa una función
fundamental en la patogénesis de AD y puede preceder durante años o
décadas a los síntomas cognitivos (para consulta, véase Selkoe
(1994) J. Neuropath. and Exp. Neurol.
53:438-447 y Selkoe (1991) Neuron 6:487). La
única línea de prueba más importante es el descubrimiento en 1991
que estas mutaciones sin sentido del ADN en el aminoácido 717 de la
isoforma de 770 aminoácidos de APP se pueden encontrar en miembros
afectados pero no en miembros no afectados de varias familias con
una forma genéticamente determinada (familiar) de AD (Goate et
al. (1991) Nature 349:704-706; Chartier
Harlan et al. (1991) Nature
353:844-846; y Murrell et al. (1991)
Science 254:97-99). Suzuki et al.
(1994) Science 264:1336-1340 demostró que en
las personas con la mutación 717, existe un porcentaje mayor de
A\beta(1-42) que de
A\beta(1-40).
Además, una mutación doble que cambia
lisina^{595}-metionina^{596} por
asparagina^{595}-leucina^{596} (con relación a
la isoforma 695) hallada en una familia sueca se describió en 1992
(Mullan et al. (1992) Nature Genet
1:345-347) y se denomina variante sueca. Los
análisis de la fijación genética han demostrado que estas
mutaciones, así como otras determinadas mutaciones en el gen de
APP, son la causa molecular específica de AD en los miembros
afectados de dichas familias. Además, una mutación en el aminoácido
693 de la isoforma de 770 aminoácidos de APP ha sido identificada
como la causa de la enfermedad de deposición de A\beta,
HCHWA-D, y un cambio de alanina por glicina en el
aminoácido 692 parece producir un fenotipo que se parece al de AD
en algunos pacientes pero a HCHWA-D en otros. El
descubrimiento de éstas y otras mutaciones en APP en casos de AD
basados genéticamente demuestra que la alteración de APP y la
posterior deposición de su fragmento A\beta puede producir
AD.
Los nudos neurofibrilares se componen
principalmente de la proteína microtubular, tau. Z.S. Khachaturian
(1985) Arch. Neurol. 42:1097-1105. Estudios
recientes han demostrado que tau es elevada en el CSF de los
pacientes de la enfermedad de Alzheimer. M. Vandermeeren et
al. (1993) J. Neurochem.
61:1828-1834.
A pesar del progreso que se ha llevado a cabo en
la comprensión de los mecanismos de AD subyacentes, subsiste una
necesidad de desarrollar procedimientos para su utilización en el
diagnóstico de la enfermedad. Aunque la concentración de tau es de
alguna ayuda en el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer (M.
Vandermeeren et al., supra) serían útiles más
marcadores y más marcadores específicos. Además, sería deseable
proporcionar procedimientos para su utilización en el diagnóstico
de las enfermedades relacionadas con A\beta, en las que el
diagnóstico se base al menos en parte en la identificación de
A\beta y de los fragmentos relacionados en muestras de fluido del
paciente. Ensayos específicos de identificación de A\beta deberían
ser capaces de identificar A\beta y fragmentos relacionados en
muestras de fluido a muy bajas concentraciones así como en
distinguir entre A\beta y otros fragmentos de APP que puedan
estar presentes en la muestra.
Glenner y Wong (1984) Biochem. Biophys. Res.
Commun. 120:885-890 y la patente U.S. nº
4.666.829, se expusieron anteriormente. La patente '829 sugiere la
utilización de un anticuerpo en el fragmento A\beta de 28
aminoácidos para identificar "polipéptido amiloide de
Alzheimer" en una muestra del paciente y diagnosticar AD. No se
presentaron datos que demuestren la identificación o el
diagnóstico.
Numerosos estudios bioquímicos al microscopio
electrónico e inmunoquímicos han dado cuenta que A\beta es muy
insoluble en soluciones fisiológicas a pH normal. Véase, por
ejemplo, Glenner y Wong (1984) Biochem. Biophys. Res.
Commun. 122:1131-1135; Masters et al.
(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
82:4245-4249; Selkoe et al. (1986) J.
Neurochem. 46:1820-1834; Joachim et al.
(1988) Brain Research 474:100-111; Hilbich
et al. (1991) J. Mol. Biol.
218:149-163; Barrow y Zagorski (1991) Science
253:179-182; y Burdick et al. (1992) J.
Biol. Chem. 267:546-554. Además, esta
insolubilidad se previó y es acorde con la secuencia de aminoácidos
de A\beta que incluye un segmento de aminoácidos hidrófobos que
constituyen parte de la zona que ancla la proteína precursora (APP)
en las membranas de lípido de las células. Se prevé que las
proteínas hidrófobas, tales como A\beta, que se anclan a lípidos
permanecen asociadas a membranas celulares o fragmentos de
membranas y por tanto no están presentes en los fluidos fisiológicos
extracelulares. Los estudios mencionados anteriormente y muchos
otros han descrito la insolubilidad en solución fisiológica de
A\beta natural purificada a partir de depósitos amiloides
cerebrales de AD o de péptidos sintéticos que contienen la
secuencia de A\beta. La extracción de A\beta a partir de
depósitos amiloides cerebrales y su solubilización posterior ha
requerido la utilización de disolventes y desnaturalizantes
fuertes, no fisiológicos. Soluciones salinas fisiológicas,
tamponadas que simulan fluidos extracelulares de tejidos humanos
han fracasado igualmente para solubilizar A\beta.
Se han acometido asimismo intentos independientes
para detectar APP o fragmentos de ésta en el plasma o en CSF. Se ha
descubierto en el líquido cerebroespinal humano un fragmento grande
segregado de APP que no contiene la zona de A\beta íntegra
(Palmert et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86:6338-6342; Weidemann et al. (1989)
Cell 57:115-126; Henriksson et al.
(1991) J. Neurochem. 56:1037-1042; Palmert
et al. (1990) Neurology
40:1028-1034); y Seubert et al. (1993)
Nature 361:260-263) y en el plasma (Podlisny
et al. (1990) Biochem. Biophys. Res. Commun.
167:1094-1101). Se ha descrito asimismo la
identificación de fragmentos de la porción
carboxi-terminal de APP en el plasma (Rumble et
al. (1989) N. Engl. J. Med.
320:1446-1452) que presenta insuficiencia para
detectar tales fragmentos (Schlossmacher et al.(1992)
Neurobiol. Aging 13:421-434).
A pesar de la aparente insolubilidad del A\beta
natural y sintético, se ha especulado que el A\beta podría
aparecer en fluidos corporales, tales como el fluido cerebroespinal
(CSF) o en el plasma (Wong et al. (1984) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 92:8729-8732; Selkoe (1986)
Neurobiol. Aging 7:425-432; Pardridge et
al. (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun.
145:241-248; Joachim et al. (1989)
Nature 341:226-230; Selkoe et al.
(1989) Neurobiol. Aging 10:387-395).
Se han descrito varios intentos para medir
A\beta en el CSF y en el plasma mediante procedimientos de
radioinmunoanálisis (documento WO 90/12870 publicado el 1 de
noviembre de 1990) y ELISA en sandwich (Wisniewski en Alzheimer's
Disease, eds. Becker y Giacobini, Taylor y Francas, N.Y. pág.
206, 1990; Kim y Wisniewski en Techniques in Diagnostic
Pathology, eds. Bullock et al., Academic Press, Boston
pág 106; y el documento WO 90/12871 publicado el 1 de noviembre de
1990). Aunque estos informes detectaron niveles muy bajos de
inmunorreactividad de A\beta en los fluidos corporales, no se
prosiguieron los intentos para purificar y caracterizar
directamente está inmunorreactividad adicional y determinar si
representaba a A\beta y se abandonaron los esfuerzos. No se
consideró ni se demostró la posibilidad de producción de A\beta
por células cultivadas.
En el pasado, la incapacidad para detectar
fácilmente A\beta en fluidos corporales se debió probablemente a
la presencia de fragmentos de precursor amiloide con zonas o
fragmentos solapantes de A\beta que oscurecían las mediciones y a
falta de anticuerpos completamente específicos para el A\beta
íntegro. Esto es supuestamente debido a que los anticuerpos
utilizados por ambos grupos interrelacionarían con otros fragmentos
de APP que contienen parte del A\beta que se sabe que está
presente en el CSF interfiriendo de este modo con la medición, si
existe, del A\beta íntegro. Estas dificultades han sido superadas
mediante la utilización de anticuerpos monoclonales específicos para
un epítopo en la zona de fijación central del A\beta íntegro
(Seubert et al. (1992) Nature
359:325-327).
Seubert et al. (1992) Nature
359:325-327 y Shoji et al. Science (1992)
258 :126-129 proporcionaron la primera prueba
bioquímica de la presencia de A\beta discreto en fluidos
corporales. Vigo-Pelfrey et al. (1993) J.
Neurochem. 61:1965-1968 describieron la
identificación de muchas especies de A\beta en el fluido
cerebroespinal.
La presente invención proporciona procedimientos
útiles para ayudar al diagnóstico y al control de las enfermedades
relacionadas con A\beta en los pacientes, cuyos procedimientos se
basan en la identificación específica en muestras de fluidos de
pacientes de uno o más A\beta solubles o fragmentos de A\beta
solubles con restos de aminoácidos por encima del número 40 en su
extremo carboxi-terminal. Estos péptidos se
denominan "A\beta(x-\geq41)"
(A\beta desde el aminoácido número "x" hasta un aminoácido
mayor o igual al aminoácido número 41). En una forma de
realización, los péptidos medidos pertenecen a la clase de
A\beta(x-\geq41) que contienen por lo
menos los aminoácidos 13 a 41.
Para el diagnóstico y el control de las
enfermedades relacionadas con A\beta, la cantidad de los péptidos
mencionados anteriormente en una muestra de fluido del paciente,
especialmente de fluido cerebroespinal (CSF), se mide y se compara
con un valor predeterminado, tal como un valor indicador (en caso de
diagnóstico) o un valor anterior del paciente (en caso de control).
En caso de diagnóstico, las cantidades de
A\beta(x-\geq41) medidas que son
superiores al valor indicador se consideran que son una indicación
poderosa de que el paciente no está padeciendo de la enfermedad AD
o de otra enfermedad relacionada con A\beta. Sin embargo, esta
información se puede considerar también junto con otros factores al
hacer un diagnóstico determinante. Las cantidades medidas de
A\beta(x-\geq41) que son iguales o
menores que el valor indicador se consideran que son una indicación
positiva de que el paciente puede estar padeciendo de AD o de otra
enfermedad relacionada con A\beta. El estado de
A\beta(x-\geq41) bajo del individuo
analizado normalmente no se considerará por sí mismo un diagnóstico
determinante de una enfermedad relacionada con A\beta, sino que
en su lugar se considerará junto con otros síntomas clínicos
aceptados de las enfermedades relacionadas con A\beta al hacer el
diagnóstico. En el fluido cerebroespinal, es útil un valor
indicador de aproximadamente 0,5 ng/ml.
En un determinado aspecto, la presente invención
proporciona ensayos de fijación específicos que son útiles para la
identificación de A\beta(x-\geq41)
soluble en muestras de fluido y que se puede emplear para el
diagnóstico del paciente y en los procedimientos de control recién
descritos. Los ensayos de fijación específica según la presente
invención emplean dos sustancias específicas de fijación para
diferentes epítopos o puntos determinantes en la molécula de
A\beta(x-\geq41). Un epítopo o punto no
se encuentra generalmente en otros fragmentos o productos de
degradación de la proteína precursora
\beta-amiloide (APP), para evitar la reacción
cruzada con estos fragmentos. Son particularmente útiles los
anticuerpos que reconocen una zona de fijación con A\beta, cuando
la zona de fijación está situada más o menos en el punto de la
escisión proteolítica normal de APP entre los restos de Lys^{16} y
Leu^{17} (Esch et al. (1990) Science
248:492-495 y Anderson et al. (1991)
Neuro. Science Lett. 128:126-128), abarcando
normalmente los restos de aminoácidos 13 a 26. El otro epítopo o
punto contiene al menos un aminoácido por encima del aminoácido
número 40 de A\beta que es esencial para el reconocimiento, pero
que no interreacciona con A\beta o fragmentos de A\beta cuyos
aminoácido carboxi-terminal sea el número 40 o
menor. Ejemplos de ensayos de fijación específica incluyen los
ensayos en dos puntos (sandwich) en los que el anticuerpo de
captura es específico para la zona de fijación de A\beta, como se
acaba de describir, y un segundo anticuerpo detectable es específico
para un epítopo o un punto que contiene al menos un aminoácido de
A\beta superior al número 40. En particular, el segundo
anticuerpo se puede producir por inmunización con un hapteno que
contiene los aminoácidos 33 a 42 de A\beta.
La presente invención proporciona también
procedimientos para ayudar al diagnóstico o el control de la
enfermedad de Alzheimer en un paciente que implican medidas tanto
de A\beta(x-\geq41) como de la proteína
microtubular tau. Los procedimientos implican la medición de la
cantidad de una o más A\beta(x-\geq41)
solubles en una muestra del paciente; comparando la cantidad medida
con una cantidad predeterminada de
A\beta(x-\geq41) soluble; midiendo la
cantidad de tau en una muestra del paciente; comparando la cantidad
medida con una cantidad predeterminada de dicha tau; y evaluando el
estado del paciente basándose en una diferencia entre las
cantidades de A\beta(x-\geq41) y tau
medidas y predeterminadas. De nuevo, la cantidad predeterminada
puede ser un valor indicador o un valor anterior del paciente. Una
cantidad medida igual o menor al valor indicador de
A\beta(x-\geq41) e igual o mayor del
valor indicador de tau proporciona una indicación positiva en el
diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer y en la que una cantidad
medida mayor del valor del indicador de
A\beta(x-\geq41) y menor que el valor del
indicador de tau proporciona una indicación negativa en el
diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer. Son útiles valores
indicadores en el CSF de aproximadamente 0,5 ng/ml para
A\beta(x-\geq41) y aproximadamente 0,3
ng/ml para tau.
La presente invención proporciona también kits
para ayudar al diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer. Los kits
incluyen una sustancia de fijación que se une a
A\beta(x-\geq41) pero que no se une a
A\beta(x-\leq40) y una sustancia de
fijación que se une a tau. En una forma de realización, el kit
contiene cuatro anticuerpos: a) un anticuerpo no marcado que se une
a la zona de fijación de A\beta; b) un anticuerpo marcado de
manera detectable que se une a un epítopo que contiene aminoácidos
por encima del número 40 en A\beta; c) un anticuerpo no marcado
que se une a tau; y d) un anticuerpo marcado de manera detectable
que se une a tau.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un sistema para identificar uno o más
A\beta(x-\geq41) solubles en una muestra
de fluido. El sistema incluye una primera sustancia de fijación,
normalmente un anticuerpo, específica para un epítopo en una zona
de fijación de A\beta, tal como se describió anteriormente, y una
segunda sustancia de fijación, normalmente un anticuerpo,
específico para un epítopo de A\beta que contiene un aminoácido
por encima del aminoácido número 40 de A\beta en el terminal
carboxi esencial para reconocimiento. La primera sustancia de
fijación es un anticuerpo anti-A\beta unido a una
fase sólida, mientras que la otra es un anticuerpo indicador contra
el terminal carboxi de A\beta. El anticuerpo indicador puede, por
sí mismo, estar marcado, o puede ser detectable por otro anticuerpo
(p. ej. un anticuerpo de conejo reconocible por anticuerpos
anti-conejo marcados o conjugados con enzimas). El
sistema puede incluir además un sustrato para un marcador de
enzimas. El sistema es útil para realizar el ensayo inmunosorbente
con enzima ligada (ELISA) con gran especificidad y sensibilidad
para la detección de A\beta(x-\geq41) en
muestras de fluido.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona procedimientos para identificar un compuesto para
determinar su capacidad para alterar la cantidad de
A\beta(x-\geq41) en el CSF. Los
procedimientos implican la medición de una primera cantidad de
A\beta(x-\geq41) soluble en el CSF de un
animal no humano utilizado como modelo de la enfermedad de
Alzheimer; administrando el compuesto al animal no humano; midiendo
una segunda cantidad de A\beta(x-\geq41)
soluble en el CSF de un animal no humano; y comparando la primera
cantidad con la segunda cantidad. La diferencia indica si el
compuesto aumenta A\beta(x-\geq41) en el
CSF, en cuyo caso puede ser útil en el tratamiento del Alzheimer; o
disminuye la cantidad, en cuyo caso el compuesto puede agravar o
acelerar el Alzheimer. El animal no humano preferentemente es un
mamífero, más preferentemente un roedor y aún más preferentemente un
ratón.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona procedimientos para identificar un compuesto para
determinar su capacidad de alterar tanto la cantidad de
A\beta(x-\geq41) como de tau en el CSF
que implican la medición de una primera cantidad de
A\beta(x-\geq41) soluble en el CSF de un
animal no humano utilizado como modelo de la enfermedad de
Alzheimer; administrando el compuesto al animal no humano; midiendo
una primera cantidad de tau en el CSF del animal no humano;
administrando el compuesto al animal no humano; midiendo una
segunda cantidad de dichos uno o más
A\beta(x-\geq41) solubles en el CSF del
animal no humano; midiendo una segunda cantidad de tau en el CSF del
animal no humano; y comparando las primeras cantidades con la
segundas cantidades, indicando la diferencia si el compuesto
aumenta, disminuye o deja inalterada la cantidad de
A\beta(x-\geq41) soluble o si aumenta,
disminuye o deja inalterada la cantidad de tau en el CSF. La
información es útil, como anteriormente, para identificar
compuestos que pueden ser útiles en el tratamiento del Alzheimer o
que pueden agravar o acelerar el Alzheimer. El animal no humano
preferentemente es un mamífero, más preferentemente un roedor y aún
más preferentemente un ratón.
La Fig. 1 presenta los resultados de los análisis
de ELISA utilizando el anticuerpo 266 (dirigido a la zona de
fijación de A\beta) y el anticuerpo 277/2 (dirigido a los
aminoácidos 33 a 42 de A\beta) para identificar
A\beta(42), pero no A\beta(28),
A\beta(38) o A\beta(40).
La Fig. 2 presenta las cantidades de
A\beta(x-\geq41) en CSF de pacientes de
referencia (C) y pacientes de AD (AD) en el Grupo A identificadas
por ELISA.
La Fig. 3 presenta las cantidades de
A\beta(x-\geq41) en CSF de pacientes de
AD (AD), referencias neurológicas de pacientes sin Alzheimer (NC) y
referencias (C) en el Grupo B identificadas por ELISA.
La Fig. 4 presenta las cantidades de
A\beta(x-\geq41) en CSF de pacientes de
AD (AD), referencias neurológicas de pacientes sin Alzheimer (ND) y
referencias no dementes (NC) identificadas por ELISA.
La Fig. 5 presenta las cantidades de tau en CSF
de pacientes de enfermedad de Alzheimer (AD), referencias
neurológicas de pacientes sin Alzheimer (ND) y pacientes de
referencia no dementes (NC).
La Fig. 6 presenta las cantidades de
A\beta(x-\geq41) y tau en CSF de
pacientes de enfermedad de Alzheimer (AD), referencias neurológicas
de pacientes sin Alzheimer (ND) y pacientes de referencia no
dementes (NC). Los datos de las Figuras 4 y 5 están combinados para
ilustrar el efecto de la consideración simultánea de las dos
mediciones al discriminar el grupo AD. Las líneas indican cortes
optimizados. El cuadrante tau
superior/A\beta(x-\geq41) inferior
contiene los pacientes de AD con solo una excepción única (pacientes
21/22) mientras que el cuadrante tau
inferior/A\beta(x-\geq41) superior
contiene únicamente los individuos de referencia.
La presente invención resulta al menos en parte
del descubrimiento de que el fluido cerebroespinal ("CSF") de
los individuos que padecen de la enfermedad de Alzheimer contienen
en general A\beta(x-\geq41) en cantidades
que están en el extremo muy bajo del intervalo normal presente en
el CSF de los individuos sin Alzheimer y, en particular, por debajo
de aproximadamente 0,5 ng/ml. Este descubrimiento es sorprendente
porque la mayor parte de los depósitos A\beta en el tejido
cerebral de las personas que padecen la enfermedad de Alzheimer es
A\beta(1-42) y es significativamente
elevada en comparación con la cantidad de
A\beta(1-42) en los individuos sin
Alzheimer.
Basándose en este descubrimiento, la presente
invención proporciona procedimientos para el diagnóstico y el
control de la enfermedad de Alzheimer. Según un procedimiento, se
obtiene en primer lugar una muestra del paciente. Normalmente la
muestra del paciente es una muestra de fluido y, preferentemente,
de fluido cerebroespinal. A continuación se mide la cantidad de
A\beta(x-\geq41) soluble en la muestra
del paciente. Un procedimiento preferido para la medición de la
cantidad es utilizar el análisis sandwich descrito en la presente
memoria. La cantidad medida se compara a continuación con un valor
predeterminado, tal como un valor indicador en caso de diagnóstico
o un valor anterior del paciente en caso de control. Se evalúa el
estado del paciente basándose en la diferencia entre las dos
cantidades.
Como se describió con más detalle anteriormente,
los procedimientos de la presente invención serán útiles tanto como
indicadores positivos como negativos de AD y de otras enfermedades
relacionadas con A\beta en los individuos analizados. Los datos
en la sección experimental demuestran que los individuos que no
padecen la enfermedad de Alzheimer tienen concentraciones de CSF de
A\beta(x-\geq41) soluble que oscila
aproximadamente entre 0,2 ng/ml y aproximadamente 1,0 ng/ml. Sin
embargo, los pacientes de enfermedad de Alzheimer presentan
concentraciones de CSF de
A\beta(x-\geq41) soluble generalmente
inferiores a 0,5 ng/ml. Por consiguiente, una cantidad medida por
encima del valor del indicador de aproximadamente 0,5 ng/ml es una
indicación negativa muy acusada de la enfermedad de Alzheimer. Esto
es, los individuos que presentan dichos niveles se consideran que
es menos probable que padezcan de la enfermedad relacionada con
A\beta y, en particular, de la enfermedad de Alzheimer. Un valor
indicador de 0,7 ng/ml reducirá el número de falsos negativos
detectados y además es útil como cantidad predeterminada. En
cambio, una cantidad medida inferior al valor indicador de 0,5
ng/ml es un indicador positivo de la enfermedad de Alzheimer y los
individuos con estos niveles se consideran que es más probable que
padezcan de la enfermedad de Alzheimer. Un valor indicador de 0,45
ng/ml reduce el número de falsos positivos y también es útil como
valor predeterminado. Sin embargo, ya que los valores inferiores a
0,5 ng/ml y 0,45 ng/ml están en el extremo inferior del intervalo
normal hallado en individuos sin Alzheimer, una cantidad medida
inferior al nivel indicador no es suficiente, por sí misma, para
proporcionar un diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer. Por
consiguiente, los procedimientos de la presente invención serán
útiles como parte de un procedimiento de diagnóstico que
considerará además otros síntomas de AD conocidos, tales como los
descritos en los criterios NINCDS-ADRDA (p. ej.
demencias clínicas y pérdida de memoria).
La invención asimismo resulta en parte del
descubrimiento de una observación de
A\beta(x-\geq41) en el extremo inferior
del intervalo normal junto con una observación de cantidades
mayores de las normales de tau en el CSF de un individuo es un
indicador positivo más potente de la enfermedad de Alzheimer que
una de las dos observaciones solas y que una observación de
concentraciones altas de
A\beta(x-\geq41) y de concentraciones
bajas de tau en el CSF de un individuo es un indicador negativo muy
potente de la enfermedad de Alzheimer. Por lo tanto, la utilización
combinada de estos dos marcadores parece ofrecer información
significativa de diagnóstico complementario.
Los datos presentados en la Figura 6 demuestran
que los pacientes que presentan tau elevado (por encima de
aproximadamente 0,3 ng/ml) y
A\beta(x-\geq41) bajo (inferior
aproximadamente a 0,5 ng/ml) tenían un 96% de probabilidad de
padecer la enfermedad de Alzheimer (22/23). El cincuenta y nueve por
ciento de los pacientes de enfermedad de Alzheimer en este estudio
(22/37) están comprendidos en esta categoría. En cambio, los
pacientes que presentan tau bajo (inferior aproximadamente a 300
ng/ml) y A\beta(x-\geq41) elevado tienen
una probabilidad del 100% de no padecer la enfermedad de Alzheimer
(28/28, Figura 6). Algo más de la mitad de los individuos sin
enfermedad de Alzheimer (28/52, 54%) están comprendidos en esta
categoría. Considerados en conjunto, los análisis combinados de tau
y A\beta(x-\geq41) de CSF fue muy
pronosticador de la presencia o de la ausencia de la enfermedad de
Alzheimer en algo más de la mitad de todos los individuos alistados
en este estudio. Las mediciones combinadas de tau y
A\beta(x-\geq41) en CSF no proporcionaron
información en aquellos pacientes que están comprendidos en el
grupo A\beta(x-\geq41) bajo/tau bajo. No
obstante, la capacidad de cualquier prueba para ayudar en la
inclusión o exclusión de la enfermedad de Alzheimer con
especificidad alta y sensibilidad incluso moderada es muy
importante.
Según un segundo procedimiento de la presente
invención, se mide la cantidad tanto de
A\beta(x-\geq41) soluble como de tau en
una muestra del paciente. Un procedimiento útil de determinación de
la cantidad de tau es por ELISA, tal como se describe con más
detalle a continuación. Las cantidades de
A\beta(x-\geq41) y tau medidas se
comparan a continuación con los valores predeterminados para cada
uno. Se evalúa el estado del paciente basándose en las diferencias
entre los valores predeterminados y los valores medidos.
Tal como se expone a continuación, los valores
indicadores se pueden calibrar basándose en la sustancia de
fijación particular utilizada y en las particulares proteínas
A\beta(x-\geq41) y tau que se deben
identificar. La calibración implica el ensayo de la sustancia de
fijación frente a patrones de individuos con la enfermedad
relacionada con A\beta y patrones de referencia de los que no
tienen dicha enfermedad. Se seleccionan valores indicadores de estos
resultados basándose en el número de falsos positivos o de falsos
negativos que el médico de familia está dispuesto a tolerar. Es de
esperar que los valores indicadores que utilizan diferentes
sustancias de fijación y se dirigen contra las dianas descreas en
esta memoria serán aproximadamente los mismos que los valores
indicadores descritos en la presente memoria. Valores indicadores
inferiores a 0,45 ng/ml para
A\beta(x-\geq41) y superiores a 0,4 ng/ml
para tau disminuyen el número de resultados positivos falsos;
mientras que los valores indicadores por encima de 0,7 ng/ml para
A\beta(x-\geq41) y por debajo de 0,25
ng/ml para tau disminuyen el potencial de una indicación falsa o de
estar libre de la enfermedad de Alzheimer.
Si la razón para
A\beta(x-\geq41) de CSF reducida en AD es
de hecho secundaria para la deposición de la placa en curso, ello
podría explicar por qué un número sustancial de pacientes de
enfermedad neurológica y unos pocos pacientes de referencia
presentaban bajas concentraciones de
A\beta(x-\geq41) en CSF. Se ha supuesto
que la deposición de la placa precede a la insuficiencia cognitiva
y sería de esperar que una parte significativa de estos pacientes
sin AD ancianos desarrollen AD en los próximos años (DMA Mann et
al. (1992) Neurodegeneration 1:201-215 y
DL Price et al. (1991) Neurobiol Aging
12:295-312). Estudios longitudinales serán
necesarios obviamente para estudiar la posibilidad de que bajas
concentraciones de A\beta(x-\geq41) sean
pronósticos de AD.
Se ha descubierto también que los niveles de tau
en CSF de AD no están correlacionados con la edad, MMSE, A\beta
total, A\beta_{42} o ApoE \varepsilon4. Aunque la razón exacta
de la elevación de tau en AD continúa sin estar clara, se debe
probablemente al aumento de las concentraciones de tau en el tejido
cerebral de AD (S. Khatoon et al. (1992) J Neurochem
59:750-753) combinado con la degeneración en curso
de las neuronas en la enfermedad.
El ensayo sandwich descrito en el apartado
experimental utilizó anticuerpos en aumento contra la zona de la
fijación de A\beta y contra los restos 33 a 42 de A\beta. En
este ensayo, los pacientes de Alzheimer generalmente presentaban
niveles de A\beta(x-\geq41) inferiores a
0,5 ng/ml detectados mediante los anticuerpos. El valor indicador
de 0,5 ng/ml es, en parte, una función de los péptidos particulares
reconocidos por los anticuerpos utilizados así como por el lote de
péptidos utilizado al realizar la calibración. Por consiguiente, el
médico de familia puede basar la cantidad predeterminada en una
recalibración utilizando reactivos y protocolos que se deben
utilizar al medir A\beta(x-\geq41) en el
ensayo.
Además del diagnóstico inicial de la enfermedad
relacionada con A\beta, las concentraciones medidas de A\beta
pueden controlarse para seguir la evolución de la enfermedad, y
seguir potencialmente la eficacia del tratamiento (cuando dichos
tratamientos estén disponibles). Sería de esperar que los niveles de
A\beta(x-\geq41) disminuyesen a medida
que evolucione la enfermedad.
La expresión "péptido
\beta-amiloide" o "A\beta", tal como se
utiliza en la presente memoria, se refiere a una proteína de
aproximadamente 4,2 kD que, en los cerebros con AD, síndrome de
Down, HCHWA-D y en algunos pacientes de edad
normales, produce la subunidad de los filamentos amiloides que
comprenden las placas seniles (amiloides) y los depósitos amiloides
en pequeños vasos sanguíneos del cerebro y de las meninges
(angiopatía amiloide). La A\beta puede aparecer en forma
polimérica filamentosa (en esta forma, presenta las características
de amiloide de fijación a los colorantes rojo Congo y tioflavina S
descritas en relación con éste). A\beta puede aparecer asimismo en
forma no filamentosa (depósitos "preamiloides", "amorfos"
o "difusos") en el tejido, en cuya forma no aparece ningún
birrefringente detectable que se tiña por el rojo Congo. En la
patente U.S. nº 4.666.829 se describe una porción de esta proteína
en forma insoluble obtenida de los vasos sanguíneos de las meninges.
A\beta es un fragmento de aproximadamente 39 a 43 aminoácidos de
una glucoproteína grande que abarca la membrana, denominada
proteína precursora \beta-amiloide (APP),
codificada por un gen en el brazo largo del cromosoma 21 humano. En
la presente memoria se contemplan además formas de A\beta mayores
de 43 aminoácidos. A\beta se caracteriza además por su movilidad
relativa en la electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida o en cromatografía líquida de
alto rendimiento (HPLC). Una secuencia para la versión de 43
aminoácidos es:
1
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr
11
Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe
21
Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala
31
Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val
41
Ile Ala Thr [SEC ID nº: 1].
Tal como se utiliza en la presente memoria,
A\beta se refiere también a formas polimórficas relacionadas de
A\beta, incluyendo las que proceden de mutaciones en la zona
A\beta del gen normal de A\beta.
La expresión "fragmento de A\beta", tal
como se utiliza en la presente memoria, se refiere a fragmentos y
productos de degradación de A\beta que generan las células de
mamíferos a bajas concentraciones. Determinados fragmentos de
A\beta tienen un peso molecular de aproximadamente 3 kD y se cree
actualmente que incluyen péptidos, por ejemplo, con los restos de
aminoácidos 3 a 34, 6 a 27, 6 a 34, 6 a 35, 6 a 42, 11 a 34, 11 a
40, 17 a 40, 11 a 43 y 12 a 43 de \betaAP.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "A\beta(x-\geq41)" se
refiere a A\beta cuyo terminal amino comienza en el aminoácido
número 1 de A\beta o que está truncado, y cuyo terminal carboxi
se prolonga por encima del aminoácido número 40. Estos péptidos y
fragmentos comprenden un grupo heterogéneo. Por ejemplo,
A\beta(6-42),
A\beta(11-43) y
A\beta(12-43) se han encontrado todos en
el CSF. Sin embargo, esta lista no significa que sea exclusiva.
Otros péptidos de entre el grupo se supone que existen en el CSF y
son detectables con los procedimientos descritos en la presente
memoria.
Determinados péptidos medidos de entre el grupo
de todos los A\beta(x-\geq41) dependen
del procedimiento de medición particular utilizado. En caso de
utilizar sustancias de fijación, tal como anticuerpos, la sustancia
de fijación se puede dirigir a uno o más de entre el grupo de
péptidos. Por ejemplo, un anticuerpo producido contra los
aminoácidos 33 a 42 de A\beta que no interreacciona con
A\beta(1-40) se unirá a
A\beta(x-42). Puede unirse también a
A\beta(x-41) y
A\beta(x-43). Según una forma de
realización de la invención, el procedimiento implica determinar la
cantidad de A\beta(x-\geq41) que tiene
al menos los aminoácidos 13-41 de A\beta. Esta
especie se puede medir utilizando un análisis sandwich que emplea
anticuerpos que reconocen la zona de fijación (aminoácidos 13 a 26)
y los anticuerpos producidos por inmunización con un hapteno con
los aminoácidos 33 a 42 de A\beta, tal como se describe en el
Ejemplo.
La expresión "zona de fijación de A\beta",
tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una zona
de A\beta que está centrada en el punto entre los restos de los
aminoácidos 16 y 17 (Lys^{16} y Leu^{17}) que es una diana para
el tratamiento proteolítico normal de APP. Dicho tratamiento produce
una variedad de fragmentos de APP que pueden, por ejemplo, terminar
en el aminoácido 16 de A\beta y que, por consiguiente, son
potencial e inmunológicamente interreactivos con los anticuerpos
contra la molécula de A\beta íntegra que deben ser identificados
en los procedimientos de la presente invención. Los anticuerpos
producidos contra un péptido sintético incluyendo los restos de
aminoácidos 13 a 29 que se ha observado que presentan la
especificidad del requisito.
La expresión "proteína precursora
\beta-amiloide" (APP), tal como se utiliza en
la presente memoria, se define como un polipéptido que está
codificado por un gen del mismo nombre localizado en el ser humano
en el brazo largo del cromosoma 21 y que incluye A\beta en su
tercer carboxilo. APP es una proteína glucoxilada, que abarca una
sola membrana expresada en una amplia variedad de células en muchos
tejidos de mamíferos. Ejemplos de isótopos específicos de APP que
se conoce actualmente que existen en el ser humano son el
polipéptido de 695 aminoácidos descrito por Kang et al.
(1987) Nature 325:733-736 que se denomina
APP "normal"; el polipéptido de 751 aminoácidos descrito por
Ponte et al. (1988) Nature
331:525-527 (1988) y Tanzi et al. (1988)
Nature 331:528-530; y el polipéptido de 770
aminoácidos descrito por Kitaguchi et al. (1988)
Nature 331:530-532. Ejemplos de variantes
específicas de APP incluyen mutaciones puntuales que se pueden
diferenciar tanto en la posición como en el fenotipo (para consulta
de las mutaciones de variante conocida véase Hardy (1992) Nature
Genet. 1:233-234).
La expresión "enfermedad relacionada con
A\beta", tal como se utiliza en la presente memoria, se define
incluyendo la enfermedad de Alzheimer (que incluye la enfermedad
familiar de Alzheimer), el síndrome de Down, HCHWA-D
y el envejecimiento del cerebro.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
"tau" se refiere a la familia de proteínas relacionadas con
microtúbulos. El filamento helicoidal emparejado de nudos
neurofibrilares en los cerebros de pacientes de enfermedad de
Alzheimer está compuesto de proteína tau. (Véase, p. ej., M.
Goedert et al. (1989) Neuron
3:519-526 y M. Goedert (1993) TINS 16
:460-465). Goedert et al. (1989) también
presenta una secuencia de ADN y de aminoácidos para tau.
La expresión "fluido corporal", tal como se
utiliza en la presente memoria, se refiere a los fluidos de un
huésped mamífero que es de esperar que contengan cantidades de
A\beta, de fragmentos de A\beta o de proteína tau que se pueden
medir, incluyendo específicamente fluido cerebroespinal (CSF),
sangre, orina y fluido peritoneal. El término "sangre" se
refiere a la sangre en conjunto, así como al plasma sanguíneo y al
suero.
Los procedimientos y sistemas de la presente
invención implican la capacidad de detectar especies de A\beta
que se extienden por encima del número de aminoácido 40 en el
extremo terminal carboxi y, por consiguiente, para distinguirlos de
las especies más cortas, tal como A\beta(40). Mientras que
la identificación de A\beta(x-\geq41) se
puede realizar por algunos procedimientos conocidos en la técnica
para identificar péptidos, se prefiere la utilización de técnicas
de detección inmunológica que emplean sustancias de fijación tales
como anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, anticuerpos
recombinados y similares. En particular las técnicas de detección
adecuadas incluyen ELISA, transferencia Western,
radioinmunoanálisis y similares. Los procedimientos inmunológicos
adecuados que emplean un solo anticuerpo se contemplan también, por
ejemplo, el radioinmunoanálisis que utiliza un anticuerpo
específico para formas \geq41 de A\beta o los procedimientos de
ELISA con un solo anticuerpo.
Por lo tanto, la presente invención proporciona
además anticuerpos específicos para
A\beta(x-\geq41) que no interreaccionan
con A\beta(\leq40). Esos anticuerpos se pueden preparar
inmunizando animales con péptidos sintéticos que incluyen los
aminoácidos por encima del número 40 de A\beta. Por ejemplo, el
péptido sintético puede incluir los aminoácidos 33 a 42. Un ejemplo
específico de la producción de dicho anticuerpo se proporciona en
el apartado experimental.
Según una forma de realización de la invención,
la identificación y la medida de los péptidos
A\beta(x-\geq41) implica la utilización
de dos anticuerpos, uno específico para un anticuerpo que contiene
los aminoácidos con un número superior a 40 en A\beta, y otro
anticuerpo capaz de distinguir A\beta y fragmentos de A\beta de
otros fragmentos de APP que se pueden encontrar en la muestra. En
particular, se ha descubierto que los anticuerpos que son
monoespecíficos para la zona de fijación del A\beta son capaces de
distinguir el A\beta de otros fragmentos de APP. La zona de
fijación de A\beta se centra en los residuos de los aminoácidos
16 y 17, que se extiende típicamente a los restos de aminoácidos 13
a 26, y tales anticuerpos específicos para la fijación se pueden
preparar utilizando péptidos sintéticos que tienen esta secuencia
como inmunógeno.
Una técnica de inmunoanálisis preferida consiste
en un análisis de dos puntos o en "sandwich" que emplea un
anticuerpo específico para la fijación como anticuerpo de captura
(unido a una fase sólida) y un segundo anticuerpo que se une a un
epítopo que contiene aminoácidos por encima de número 40 en
A\beta. Los procedimientos particulares para preparar dichos
anticuerpos y utilizar dichos anticuerpos en un ejemplo de ELISA
están indicados en el apartado experimental más adelante y en la
solicitud de patente US nº 07/965.972 relacionada,
supra.
Se pueden preparar anticuerpos específicos para
A\beta contra un antígeno o hapteno adecuado comprendiendo el
epítopo diana deseado, tal como la zona de fijación que consta de
los restos de aminoácidos 13 a 29 y el terminal carboxi que
consiste en los restos de aminoácidos 33 a 42. Se pueden preparar de
forma adecuada, péptidos sintéticos por técnicas convencionales en
fase sólida, acoplar a un inmunógeno adecuado y utilizar para
preparar antisueros o anticuerpos monoclonales mediante las
técnicas convencionales. Los haptenos del péptido adecuado
comprenderán normalmente por lo menos cinco restos contiguos dentro
del A\beta y pueden incluir más de seis restos.
Se pueden producir haptenos de polipéptido
sintético por la técnica bien conocida de síntesis en fase sólida
de Merrifield, en la que los aminoácidos se añaden sucesivamente a
una cadena en desarrollo (Merrifield (1963) J. Am. Chem.
Soc. 85:2149-2156). Las secuencias de
aminoácidos se pueden basar en la secuencia del \betaAP indicada
anteriormente.
Una vez se ha obtenido suficiente cantidad de
hapteno de polipéptido, se puede conjugar con un vehículo
inmunógeno adecuado, tal como albúmina de suero, hemocianina de la
lapa de agujero de cerradura u otros portadores de proteína
adecuados, como se describe generalmente en Hudson y Hay,
Practical Immunology, Blackwell Scientific Publications,
Oxford, capitulo 1.3, 1980. Un ejemplo de vehículo inmunógeno
utilizado en los ejemplos proporcionados a continuación es el
anticuerpo \alpha-CD3\varepsilon
(Boehringer-Mannheim, clon nº
145-2C11).
Una vez se ha obtenido suficiente cantidad de
inmunógeno, se pueden producir anticuerpos específicos para el
epítopo deseado mediante técnicas in vitro o in vivo.
Las técnicas in vitro implican la exposición de linfocitos a
los inmunógenos, mientras que las técnicas in vivo requieren
la inyección de inmunógenos en un huésped vertebrado adecuado. Los
huéspedes vertebrados adecuados son no humanos, incluyendo ratones,
ratas, conejos, ovejas, cabras y similares. Se inyectan inmunógenos
en el animal según un programa predeterminado y se extrae sangre
periódicamente a los animales, mediante extracciones de sangre
sucesivas con título y especificidad mejoradas. Las inyecciones se
pueden realizar por vía intramuscular, intraperitoneal, subcutánea
o similares, y se puede emplear un adyuvante, tal como el adyuvante
incompleto de Freund.
Si se desea, se pueden obtener anticuerpos
monoclonales preparando líneas celulares inmortalizadas capaces de
producir anticuerpos con la especificidad deseada. Tales líneas
celulares inmortalizadas se pueden producir de varías maneras. Se
hiperinmuniza de forma adecuada un pequeño vertebrado, tal como un
ratón con el inmunógeno deseado por el procedimiento recién
descrito. Se sacrifica a continuación el vertebrado, normalmente
varios días después de la inmunización final, se extraen las
células del bazo y se inmortalizan las células del bazo. La forma
de inmortalización no es crítica. Actualmente, la técnica más
frecuente es la fusión con un compañero de fusión celular de
mieloma, como describieron por primera vez Kohler y Milstein (1975)
Nature 256:495-497. Otras técnicas
incluyendo la transformación por EBV, la transformación con ADN
desnudo, p. ej.: oncogenes, retrovirus, etc., o cualquier otro
procedimiento que proporcione mantenimiento estable de la línea
celular y producción de anticuerpos monoclonales. Las técnicas
específicas para preparar anticuerpos monoclonales se describen en
Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lane, eds., Cold
Spring Harbor Laboratory, 1988.
Además de los anticuerpos monoclonales y de los
anticuerpos policlonales (antisueros), las técnicas de detección de
la presente invención serán también capaces de utilizar fragmentos
de anticuerpo, tales como F(ab), Fv, V_{L}, V_{H} y
otros fragmentos. En la utilización de anticuerpos policlonales, sin
embargo, puede ser necesario adsorber los antisueros contra los
epítopos diana para producir una población de anticuerpo
monoespecífico. Será asimismo posible emplear anticuerpos
producidos de forma recombinada (inmunoglobulinas) y variaciones de
los mismos tal como está bien descrito actualmente en la patente y
en la bibliografía científica. Véase, por ejemplo, los documentos
EPO 8430268.0; EPO 85102665.8; EPO 85305604.2; PCT/GB 85/00392; EPO
85115311.4; PCT/US86/002269 y la solicitud japonesa 85239543. Sería
asimismo posible preparar otras proteínas recombinantes que
simularían la especificidad de fijación de los anticuerpos
preparados tal como se acaba de describir.
La identificación de tau también se puede
realizar por cualquiera de los procedimientos conocidos en la
técnica para identificar péptidos. Sin embargo, se prefiere la
utilización de técnicas de detección inmunológicas que emplean
sustancias de fijación. Las técnicas de detección útiles incluyen
todas las mencionadas anteriormente. Son particularmente útiles los
análisis ELISA que implican un anticuerpo de captura y un
anticuerpo de identificación marcado, ambos contra tau.
Se pueden preparar anticuerpos contra tau
inoculando animales con tau purificada procedente de cerebros de AD
o procedente de fuentes recombinadas. Se puede producir tau
recombinada por expresión en células de insecto de un vector
baculovirus que contiene la isoforma repetida
pVL941-tau-4 descrita por J. Knops
et al. (1991) J Cell Biol
1991:114:725-733. Tau purificada también está
disponible en Immogenetics (Zwijndrecht, Bélgica). Los anticuerpos
contra tau están disponibles en Sigma (St. Louis, MO). Se pueden
identificar otras fuentes en el directorio Lindscott.
Se puede preparar tau a partir del cerebro de AD
por el procedimiento de Merken et al. (1992) J
Neurochem 58:548. Normalmente, se corta 50 g de cerebro fresco
en pequeñas piezas con tijeras y se homogeiniza 1:1 (p/vol) en
tampón A (ácido
2[N-morfolino]etansulfónico 20 mM,
NaCl 80 mM, EDTA 2 mM, EGTA 0,1 mM, MgCl_{2} 1 mM y
\beta-mercaptoetanol 1 mM, pH 6,75) con un
homogeneizador Potter equipado con un émbolo de Teflon. El
homogeneizado se centrifuga durante 1 hora a 150.000 g a 4ºC y se
calienta el sobrenadante durante 5 minutos en agua hirviendo y se
enfría otra vez durante 10 minutos en hielo. Se centrifuga la
suspensión durante 2 horas a 150.000 g a 4ºC, y a continuación se
recoge el sobrenadante. El extracto citosólico estable al calor se
prepara con ácido perclórico al 2,5% y se centrifuga durante 1 hora
a 150.000 g a 4ºC, tras lo cual se neutraliza el sobrenadante con
Tris 3 M. Se dializa a continuación el sobrenadante y se concentra
en agua en un concentrador Centiprep (Amicon, Lusanne, Suiza). El
producto final se puede evaluar por electroforesis en gel de
dodecilsulfato de sodio-poliacrilamina
(SDS-PAGE) (método Laemmli). Esta preparación es
útil para inmunizar animales que producen anticuerpos
anti-tau.
Se puede también inmunopurificar tau a partir de
esta preparación. Se acoplan diez miligramos de anticuerpo
monoclonal anti-tau a 1 g de Sepharose activada con
bromuro de cianógeno (Pharmacia) por el procedimiento propuesto por
el fabricante. Cincuenta mililitros del extracto citosólico estable
al calor descrito anteriormente se diluyen 1:2 en tampón fosfato
0,1 M (pH 8,5) y se aplican a la columna. Se lava la columna con
fosfato 0,1 M, se eluye tau con ácido cítrico 0,1 M (pH 2,5) y se
neutraliza inmediatamente con NaOH 1 M. Se pueden evaluar las
fracciones por SDS-PAGE en geles al 10% y en
inmunotransferencia con anticuerpos anti-tau.
La presente invención proporciona también kits
para realizar análisis que ayudan al diagnóstico de la enfermedad
de Alzheimer. Los kits incluyen medios para detectar
A\beta(x-\geq41) y medios para detectar
tau. Los medios pueden incluir cualquier medio conocido o descrito
anteriormente, p. ej., sustancias de fijación. Las sustancias de
fijación útiles incluyen moléculas que contienen la parte de
fijación de un anticuerpo, tal como un anticuerpo completo o un
fragmento de anticuerpo. Las sustancias de fijación pueden ser
anticuerpos monoclonales. En una forma de realización el kit
incluye una sustancia de fijación que se une a
A\beta(x-\geq41) pero que no se une a
A\beta(\leq40) y una sustancia de fijación que se une a
tau.
En una forma de realización el kit incluye
anticuerpos o similares para realizar ELISA en sandwich para
identificar cada compuesto, por ejemplo, como se describió
anteriormente. En una forma de realización, los medios para detectar
A\beta(x-\geq41) pueden incluir una
sustancia de fijación que se une a un epítopo que contiene
aminoácidos por encima del número 40 en A\beta y una sustancia de
fijación que se une a A\beta o a un fragmento de A\beta pero
que no se une a otros fragmentos de APP. Los medios para identificar
a tau también pueden implicar un ELISA en sandwich. Por ejemplo el
kit puede incluir a) una sustancia de fijación no marcada que se
una a la zona de fijación de A\beta; b) una sustancia de fijación
marcada de forma detectable que se una a un epítopo que contiene
aminoácidos superiores al número 40 en A\beta; c) una sustancia
de fijación no marcada que se une a tau; y d) una sustancia de
fijación marcada de forma detectable que se une a tau.
Los marcadores detectables pueden ser cualquiera
conocido y utilizado en la técnica incluyendo, p. ej., marcador de
biotinilación, marcador radioactivo, enzimas, marcadores
fluorescentes y similares.
Actualmente se están utilizando modelos animales
para estudiar la enfermedad de Alzheimer. (Véase, p. ej., la
solicitud de patente internacional WO 93/14200, la solicitud de
patente U.S. nº 08/143.697, presentada el 27 de octubre de 1993 y
la patente nº U.S. 5.387.742). Estos modelos son útiles para
identificar compuestos por su capacidad para efectuar el curso de
la enfermedad de Alzheimer, tanto para mejorar como para agravar la
enfermedad. Como AD se caracteriza por una disminución en las
cantidades de A\beta(x-\geq41) en el
CSF, es de esperar que los tratamientos eficaces para la enfermedad
de Alzheimer produzcan un aumento en la cantidad de
A\beta(x-\geq41) en el CSF, mientras que
los agentes que aceleran la evolución de la enfermedad produzcan una
disminución en la cantidad de A\beta(-\geq41) en el CSF.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona procedimientos para identificar compuestos que elevan o
disminuyen la cantidad de
A\beta(x-\geq41) en una muestra de
fluido, en particular de CSF, y que, por consiguiente, son
candidatos para su utilización en el tratamiento de la enfermedad,
o que aceleran la enfermedad y se han de evitar en el hombre. Los
procedimientos implican la medición de una primera cantidad de dicho
uno o más A\beta(x-\geq41) solubles en
una muestra de un animal no humano utilizado como modelo de
enfermedad de Alzheimer; administrando el compuesto al animal;
midiendo una segunda cantidad de uno o más
A\beta(x-\geq41) soluble en una muestra
del animal; y comparando la primera cantidad con la segunda
cantidad, indicando la diferencia si el compuesto aumenta,
disminuye o permanece inalterado la cantidad de
A\beta(x-\geq41) soluble en la muestra.
El nivel de dosificación administrado al animal y la cantidad de
tiempo que transcurre antes de medir la segunda cantidad dependerá,
desde luego, del sistema de modelo.
La presente invención proporciona procedimientos
para identificar compuestos que elevan la cantidad de
A\beta(x-\geq41) y disminuyen la cantidad
de tau en una muestra de fluido, en particular de CSF, y que, por
consiguiente, son candidatos para su utilización en el tratamiento
de la enfermedad; o que disminuyen la concentración de
A\beta(x-\geq41) y que aumentan la
concentración de tau y por consiguiente, que aceleran la enfermedad
y se han de evitar en el hombre. Los procedimientos implican la
medición de una primera cantidad de dicho uno o más
A\beta(x-\geq41) solubles y tau en una
muestra de fluido de un animal no humano utilizado como modelo de
enfermedad de Alzheimer; la administración del compuesto al animal;
la medición de una segunda cantidad de uno o más
A\beta(x-\geq41) solubles y tau en una
muestra de fluido del animal; y la comparación de las primeras
cantidades con las segundas cantidades, indicando la diferencia si
el compuesto aumenta, disminuye o permanece inalterada la cantidad
de A\beta(x-\geq41) soluble y tau en la
muestra de fluido. El nivel de dosificación administrado al animal y
la cantidad de tiempo que transcurre antes de medir la segunda
cantidad dependerá, desde luego, del sistema de modelo.
Un modelo animal no humano útil alberga una copia
de una secuencia transgénica expresable que codifica la mutación
sueca de APP (asparagina^{595}-leucina^{596}).
La secuencia se expresa generalmente en células que expresan
normalmente el gen APP endógeno natural (si está presente). Los
modelos de mamíferos, más particularmente, los modelos de roedores y
en particular los modelos murino y de hámster, son adecuados para
esta utilización. Dichos transgenes comprenden normalmente una
casete de expresión de APP con mutación sueca, en la que un
activador de enlace y, preferentemente, un potenciador conduce la
expresión de las secuencias estructurales que codifican un
polipéptido de APP heterólogo que comprende la mutación sueca.
Los animales transgénicos que albergan el
transgen que codifica un polipéptido de APP con la mutación sueca
se producen normalmente introduciendo el transgen o dirigiendo la
construcción en un óvulo fertilizado o una célula madre embrionaria
(ES), normalmente por microinyección, electroporación, lipofección o
biolística. Los animales transgénicos expresan el gen APP del
transgén de la mutación sueca (o la construcción de
direccionamiento recombinada de manera homóloga), normalmente en el
tejido cerebral. Preferentemente, uno o ambos alelos de APP
endógenos están inactivados y son incapaces de expresar el APP
natural.
Los ejemplos siguientes se ofrecen a título de
ilustración, no a título de limitación.
Se prepararon anticuerpos monoclonales para la
zona de fijación de A\beta utilizando un péptido sintético que
abarca los restos de aminoácidos 13 a 31, excepto que AI, los
aminoácidos 30 y 31, se sustituyeron por GC. Este péptido se
denominó A\beta_{13-28}. Se conjugó
A\beta_{13-28} con un inmunógeno (anticuerpo
\alpha-CD3\varepsilon; clon nº
145-2C11, Boehringer-Mannheim)
utilizando éster de
m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida
(MBS) según las instrucciones del fabricante (Pierce).
Se inmunizaron inicialmente ratones A/J por vía
intraperitoneal (IP) con el conjugado A\beta mezclado con
adyuvante completo de Freund. Catorce días después, se administró
una dosis IP a los ratones con el conjugado A\beta mezclado con
solución salina tamponada con fosfato (PBS) en intervalos de 14
días. Después de seis dosis de refuerzo en total, se administró a
los ratones por último una dosis de refuerzo por vía intravenosa
con conjugado A\beta mezclado con adyuvante incompleto de Freund
y se fusionaron 3 días después. La fusión de células del bazo con
células P3.653 de mieloma se realizó según se describe en Oi y
Herzenberg, Selective Methods in Cellular Immunology,
Mishell y Shigii, eds., W.H. Freeman and Company, San Francisco,
capítulo 17 (1980). Se realizaron valoraciones del suero e
identificaciones iniciales por el procedimiento RIA descrito más
adelante. Se distribuyeron varios clones en una placa de 24
pocillos y se sometieron a análisis posterior tal como se describe a
continuación. Los clones en cuestión se produjeron en ascitis de
ratón.
El procedimiento RIA utilizado para detectar
extracciones de suero y sobrenadantes de hibridoma de fusión estaba
basado en un procedimiento desarrollado por Wang et al.
(1977) J. Immunol. Methods 18:157-164. De
forma resumida, el sobrenadante (o el suero) se incubó toda la nocha
a temperatura ambiente en un agitador con
A\beta_{1-28} marcado con ^{125}I y bolas de
Sepharose® 4B a los que se había acoplado IgG de oveja con
antirratón vía bromuro de cianógeno. Se recogieron los granos de
cada pocillo sobre discos filtrantes de fibra de vidrio con un
recogedor de células y se lavaron varias veces con PBS. Se
transfirieron a continuación los discos filtrantes a tubos gamma y
se hizo el contaje de la radioactividad ligada con un contador
gamma.
Se analizó el enlace a
A\beta_{1-28} de todos los hibridomas utilizando
el procedimiento descrito anteriormente en la identificación
inicial y a continuación se repitió el análisis 3 días después. Se
caracterizó además la reactividad de los clones positivos
A\beta_{1-28} con A\beta_{1-16}
marcado con ^{125}I utilizando el procedimiento RIA descrito
anteriormente. No se observaron clones para unirse a
A\beta_{1-16}. En un ELISA de captura de péptido,
se observó que todos los clones reaccionan con
A\beta_{13-28} mientras que ningún clon reaccionó
con A\beta_{17-28}. Por consiguiente, se decidió
que todos los clones tuvieran un epítopo dentro de la zona de
fijación que abarca los aminoácidos 16 y 17.
Basándose en los resultados de los análisis
anteriores, se distribuyeron varios clones en placas de 24
pocillos. Estos clones se caracterizaron además por análisis de
saturación. Se añadieron sobrenadantes en el del punto de valoración
del 50% (determinado por el procedimiento RIA descrito
anteriormente) a los pocillos que contenían bolas de IgG de
antirratón de oveja con Sepharose®, una cantidad constante de
A\beta_{1-28} marcado con ^{125}I y cantidades
variables de A\beta_{13-28} o
A\beta_{17-28} sin marcar. Se determinó para cada
anticuerpo la concentración de péptido frío para el 50% de
inhibición. No se observó inhibición para
A\beta_{17-28} a 100 ng/pocillo para ningún clon.
El punto de inhibición del 50% para A\beta_{13-28}
oscilaba entre 10 y 80 ng/pocillo. Los clones se caracterizaron
asimismo basándose en la reactividad en las transferencias Western.
Se produjeron varios clones en ascitis basándose en el punto de
valoración, sensibilidad (determinada por el punto de inhibición del
50%) y en la reactividad en la transferencia de Western. Se
seleccionaron anticuerpos del hibridoma denominado 266 para su
utilización como anticuerpo de captura en el análisis descrito a
continuación.
Se generaron anticuerpos policlonales contra
A\beta(33-42) de la forma siguiente. Se
conjugó el péptido 277-2
(C-aminoheptanoico-GLMVGGVVIA [SEC.
ID nº: 2]) con BSA catiónico ("Supercarrier" activado de
Pierce) en una proporción de 5 mg de péptido 277-2
a 10 mg de BSA catiónico de la forma siguiente. Se puso en
suspensión un vial de Supercarrier de Pierce (10 mg) en 1 ml de agua
desionizada. Se disolvió 5 mg del péptido 277-2 en
5 ml de PO_{4} 10 mM pH 8,0. Se añadió el péptido
277-2 en el Supercarrier y se incubó toda la noche a
temperatura ambiente. Se concentró esto a continuación y se eliminó
el EDTA.
Se inyectó por vía subcutánea el inmunógeno (500
mg de péptido equivalente) en adyuvante completo de Freund. Los
conejos recibieron un refuerzo de 0,2 a 0,5 mg después de tres
semanas y a continuación 0,2 a 0,5 en intervalos de dos a cuatro
semanas. Los refuerzos se administraron por vía subcutánea en
adyuvante incompleto de Freund. Se extrajo veinticinco ml de suero
una semana después de cada refuerzo. Las extracciones de sangre se
identificaron de la forma siguiente. La semana 7 de la extracción
de sangre de conejo se valoraron por dilución en serie. Se
recubrieron placas de ELISA con A\beta 1-42 toda
la noche, y a continuación se bloquearon con gelatina al 3%. Las
diluciones en serie de las extracciones de sangre de conejo de
1/100 a 1/200.000 se incubaron en las placas durante 2 horas a
temperatura ambiente. Se lavaron a continuación las placas y se
añadió HRP anti-conejo a cada pocillo. Se incubó
esto durante una hora. Se lavó la placa y se utilizó el sustrato de
TMB. El título de ELISA de los conejos fue de 1/20.000 a
1/200.000.
Se valoraron a continuación las extracciones de
sangre de conejo positivas a ELISA en una RIA de captura para
comparar su capacidad para capturar ^{125}I
A\beta(1-42) frente a ^{125}I
A\beta(1-40). Se incubaron diluciones de
antisuero de conejo de 1/25 a 1/675 con el mismo número
aproximadamente de cpm de ambos trazadores. Se utilizó la proteína
sepharose A para precipitar los complejos inmunes y se hizo el
recuento a continuación en un contador de centelleo Microbeta. La D
del conejo 277-2 presentó el título mayor para el
trazador A\beta(1-42) y ninguna reacción
cruzada con el trazador A\beta(1-40). Las
extracciones de sangre con títulos más altos se sometieron a
continuación a purificación por afinidad de anticuerpos.
Para purificar por afinidad los anticuerpos
anti-277-2, se preparó una matriz de
afinidad 277-2 de la manera siguiente: se lavó tres
ml de gel sulfo-link (Pierce) con seis volúmenes de
Tris 50 mM, EDTA 5 mM, pH 8,5. Tres mg de péptido
277-2 disueltos en 0,3 ml de DMSO se llevaron hasta
3 ml con Tris 50 mM, EDTA 5 mM, pH 8,5 y se añadió al gel. Después
de mezclar suavemente durante 15 minutos, se lavó la columna de
resina con seis volúmenes de Tris 50 mM, EDTA 5 mM, NaCl 0,5 M, pH
8. Se lavó a continuación la resina de la columna con 16 volúmenes
de PBS/NaN_{3} al 0,05%.
Para purificar por afinidad los anticuerpos, se
diluyó 20 ml de suero con título alto a 40 ml con PBS y un volumen
igual de (NH_{4})_{2}SO_{4} se añadió despacio
mientras se agitaba a 4ºC. Se dejó agitar la mezcla otros 30
minutos, se centrifugó a continuación durante 15 minutos a 10.000
rpm en una centrífuga Beckman JA17. Se volvieron a poner en
suspensión los sedimentos en PBS, se llevó a un volumen de 40 ml
con PBS y se repitió la precipitación con
(NH_{4})_{2}SO_{4} como anteriormente. Se volvieron a
poner en suspensión los sedimentos en un total de 20 ml de PBS y se
dializaron toda la noche frente a PBS a 4ºC.
Se lavó la columna 277-2 con 10
ml de PBS. A continuación se rebosó el dializado en la columna. Se
lavó a continuación la columna con 50 ml de PBS. Se añadió 1 ml de
glicina 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 2,5 de una vez y se recogieron las
fracciones. Se agruparon las primeras cuatro fracciones que
contenían la mayoría de la proteína eluida y se neutralizaron con
0,4 ml de Tris 1 M, pH 8,0. Se concentró el conjunto por filtración
de membrana hasta ligeramente menos de 2 ml. Se sometió la columna
inicial en flujo descendente a una segunda etapa cromatográfica
(después de neutralizar en primer lugar la columna y de
reequilibrarla en PBS). El segundo material purificado por afinidad
se neutralizó igualmente y se concentró, se combinó con el primer
material y a continuación se dializó frente a PBS toda la noche, a
4ºC. Se determinó el contenido en proteínas (procedimiento BCA de
Pierce) y se utilizaron estos anticuerpos en los experimentos
ELISA.
Se diluyó anticuerpo monoclonal 266 hasta una
concentración de 10 \mug/ml en un tampón conteniendo 0,23 g/l de
NaH_{2}PO_{4}\cdotH_{2}O, 26,2 g/l de Na_{2}HPO_{4};
7H_{2}O, 1 g/l de NaN_{3}; pH 8,5. Cien \mul/pocillo de esta
solución se repartió a continuación en una placa de 96 pocillos con
fondo plano, blanca, Microlite 2 de Dynatech. Se sellaron las
placas y se incubó toda la noche a temperatura ambiente. Después de
recubrir, se aspiró la solución restante y se bloquearon los puntos
de fijación no específicos con 200 \mul por pocillo de 0,2 g/l de
(NaH_{2}PO_{4}\cdotH_{2}O), 0,8 g/l de
Na_{2}HPO_{4}\cdot7H_{2}O, 2,5 g/l de albúmina de suero humano
(HSA) cristalizada y liofilizada, pH 7,4. Estas placas se
bloquearon por incubación durante 1 hora a temperatura ambiente en
la solución de bloqueo.
Se prepararon los calibradores a partir de una
solución madre de A\beta_{1-42}, 1 \mug/ml, en
DMSO. En diluyente de muestra (0,2 g/l de
(NaH_{2}PO_{4}\cdotH_{2}O), 2,16 g/l de
Na_{2}HPO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,5 g/l de NaN_{3}, 6 g/l de
albúmina de suero bovino (PSA) (exento de globulina), 0,5 ml/L de
Triton X-405, 8,5 g/l de NaCl, pH 7,4), se preparó
1000 pg/ml del calibrador mayor (10 \mul de solución madre de
A\beta_{1-42} (1 \mug/ml de DMSO) en 10 ml de
diluyente de muestra de caseína). Se hicieron diluciones sucesivas
en diluyente de muestra para obtener concentraciones de 500, 250,
125, 62,5 y 31,25 pg/ml de A\beta_{1-42}.
Se prepararon muestras de CSF de la forma
siguiente. Se hirvieron muestras de CSF (100 a 500 \mul) durante
3 minutos. Se colocaron las muestras hervidas a 4ºC durante 10 a 14
horas antes del análisis. Las muestras de CSF se analizan sin
diluir. Las diluciones se hacen solamente si el valor inicial
calculado está por encima del calibrador mayor (1000 pg/ml).
Se aplicaron calibradores o muestras de cien
\mul por pocillo a las placas de microvaloración. Se sellaron las
placas y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Se
lavaron a continuación las placas tres veces con tampón de lavado
(80 g/l de NaCl, 3,85 g/l de KCl, 31,75 g/l de
Tris-HCl, 0,5 ml/L de Tween-20, pH
7,5).
Se diluyó
anti-A\beta(33-42)
(anticuerpo 277-2) en diluyente de muestra hasta 1
\mug/ml y se añadió 100 \mul por pocillo. Se cubrió la placa y
se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lavó la placa
tres veces con tampón de lavado. La IgG (H+L) (Jackson)
anti-conejo de burro con fragmento F(ab')2
purificado por afinidad con fosfatasa alcalina se diluyó 1:1000 en
diluyente de muestra. Se añadió cien \mul/pocillo. Se cubrió la
placa y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lavó la
placa tres veces con tampón de lavado, a continuación se añadió 100
\mul/pocillo de sustrato quimioluminiscente. Se preparó el
sustrato quimioluminiscente diluyendo el reactivo
quimioluminiscente, AMPPD (Tropix) y un potenciador, verde
esmeralda (Tropix), 1:1000 y 1:100 respectivamente en tampón de
dietanolamina 1 M, pH 10, conteniendo MgCl_{2} 1mM y NaN_{3} al
0,2%. Se sellaron las placas y se incubaron 10 a 15 minutos a
temperatura ambiente. No se aspiró la solución. Esta vez puede que
se tenga que optimizar para los diferentes lotes de anticuerpo.
Se leyó la quimioluminiscencia y se expresó en
unidades de quimioluminiscencia relativa (CLU) después de 15
minutos utilizando un Dynatech ML 1000.
El ELISA de
A\beta(x-\geq41) no interreacciona con
A\beta(1-28), (1-38) o
(1-40) (Fig. 1).
El límite inferior de sensibilidad para este
análisis es de 31 pg/ml ó 3,1 pg/pocillo (0,7 fmoles/pocillo) (Fig.
1).
Se ha comprobado
A\beta(x-\geq41) en CSF utilizando el
ELISA de A\beta(x-\geq41). En el momento
propicio, se obtuvieron dos grupos diferentes de muestras de CSF,
denominados Grupo A y Grupo B, de varias procedencias. A veces, se
hirvieron doscientos \mul de muestras de CSF durante 3 minutos
antes del análisis (se observó que la ebullición aumentaba en
algunos casos la inmunorreactividad de
A\beta(x-\geq41)). Los resultados de este
análisis se pueden observar en la Fig. 2 y en la Fig. 3. La Tabla 1
resume estos resultados.
Se identificó también la inmunorreactividad de
A\beta(x-\geq41) en CSF de cobayas y de
perros (Tabla II).
Este ELISA en sandwich demuestra la
presencia de A\beta(x-\geq41) en CSF.
A\beta(x-\geq41) es solo un componente
minoritario del A\beta total en CSF. Las concentraciones de
A\beta(x-\geq41) en CSF son
significativamente inferiores en AD que las referencias normal y
neurológica. Tomando un límite de sensibilidad del 50%, la
especificidad es 93,8 para el Grupo A y 97,4% para el Grupo B.
Estos dos grupos independientes presentan una similitud notable que
demuestra que las mediciones de
A\beta(x-\geq41) en CSF tienen utilidad
como diagnóstico.
Todos los pacientes inscritos en este estudio
experimentaron una evolución clínica y neurológica detallada en
centros médicos universitarios por neurólogos expertos en el
diagnóstico de la demencia. Se obtuvo permiso escrito de los
pacientes, o de sus tutores, de la manera apropiada. La evaluación
incluyó antecedentes médicos, exámenes físicos y neurológicos,
análisis de sangre en laboratorio para excluir causas metabólicas
de la demencia, un estudio por neurografía (CT o MR de cabeza en
los últimos 3 años para los pacientes de demencia y controles
neurológicos) y análisis psicométrico detallado (éste varió entre
las instituciones). Además, todos los pacientes recibieron los
instrumentos de evaluación siguientes: examen del estado
mini-mental (MMSE) (American Psychiatric
Association, Committee on Nomenclature and Statistics: Diagnostic
and Statistical Manual of Mental Disorders:tercera edición revisada,
Washington D.C. Am. Psych Associ. (1987)), inventario de depresión
de Hamilton (V.C. Hachiniski et al. (1975) Ann.
Neurol. 32:632-637) y el índice isquémico de
Hachinski (G. McKann et al. (1984) Neurology
34:939-944). Los pacientes de no más de un
diagnóstico por demencia, apoplejía reciente, traumatismo craneal o
trastornos del sistema nervioso periférico significativos se
excluyeron. Se utilizaron los siguientes criterios de
diagnóstico:
diagnóstico:
i. AD (n=37): pacientes que reunen las
directrices NINCDS-ADRDA por probable AD; los que
reunen criterios de posible AD se excluyeron (The Lund and
Manchester Groups (1994) J Neurol Neurosurg Psychiatr
57:416-418). Todos los pacientes se internaron en
comunidad y presentaban demencia leve a moderada.
ii. Controles de la enfermedad neurológica (ND;
n=32): pacientes de demencia sin AD o trastornos degenerativos que
afectan al sistema nervioso central. Para los controles
neurológicos, se estudió también un resumen de registros clínicos
por un segundo neurólogo (DG) para confirmar los diagnósticos y
para asegurar que había probablemente coexistencia de AD. Los
pacientes de demencia del lóbulo frontal se diagnosticaron según el
criterio indicado por los grupos de Lund y Manchester (Kawasaki
E.S., en: PCR Protocols: A guide to methods and
applications. Academic Press, Inc., Nueva York 1990 págs.
146-152).
iii. Controles de no dementes (NC; n=20): los
pacientes eran de 50 años de edad o mayores y no presentaban
síntomas cognitivos significativos, no presentaban alteración
funcional, presentaban resultados normales en el examen neurológico
y puntuaron de 28 a 30 en el MMSE. El subgrupo de estos controles
presentó síntomas de depresión que no producían una alteración
cognitiva o funcional significativa, y se consideró que no tenían
AD o ninguna enfermedad neurológica orgánica.
Se realizaron punciones lumbares en las mañanas,
tras un ayuno toda la noche. Se extrajeron todas las muestras de
CSF en tubos de ensayo provistos en todos los puntos. Se analizó
proteína, glucosa y células en los primeros 2 a 3 ml de CSF en el
laboratorio del centro médico local, y se extrajeron 4,5 ml de los
tubos de extracción original y se añadieron a tubos Sarstedt de 8
ml conteniendo 500 \mul de tampón (que contenían aditivos de modo
que la composición de la solución de CSF final incluía: fosfato de
sodio 20 mM, trietanolamina 20 mM, Triton X-100 al
0,05%, NaCl 100 mM, NaN_{3} al 0,05%,
dietilen-triamina penta ácido acético 1 mM, EGTA 1
mM, pH 7,4) y se congelaron a -20ºC hasta el análisis. Los
analistas ignoraban los diagnósticos de los pacientes.
Se realizó el genotipado de ApoE en las muestras
de sangre disponibles, que habían sido extraídas en tubos al vacío
con EDTA. Se prepararon las muestras por el método de Kawasaki
(Kawasaki ES, en: PCR Protocols: A guide to methods and
applications, Academic Press, Inc., Nueva York 1990 págs.
146-152) y se realizó el análisis PCR tal como
describe Wenham (P.C. Wenham et al. (1991) Lancet
337:1158-1159).
Se midió el A\beta total por un ELISA en
sandwich del anticuerpo monoclonal doble secuencial tal como se
describe en Seubert et al. (1992) Nature
359:325-327. En resumen, A\beta en CSF fue
capturado por el anticuerpo monoclonal 266 (específico de los
residuos 13 a 28 del péptido A\beta) que se habían recubierto
previamente en pocillos de placa de microvaloración. La
identificación utilizó un segundo anticuerpo 6C6 específico de
A\beta, biotinilado monoclonal (que reconoce los restos 1 a 16 de
A\beta), seguido de reacción con un conjugado alcalino de
fosfatasa-avidina. Después de la incubación con el
sustrato fluorógeno fosfato de
4-metil-umbeliferil (MUP), se midió
el producto fluorescente utilizando un fluorómetro Cytofluor 2350 de
Millipore.
Se midió
A\beta(x-\geq41) en un análisis de
formateado igualmente utilizando 266 como anticuerpo de captura. Se
produjo el anticuerpo 277-2 indicador policlonal
contra el péptido sintético que incluía los restos 33 a 42 de
A\beta (GLMVGGVVIA) [SEC. ID nº: 2], con cisteína-ácido
aminoheptanoico en su terminal amino. Se conjugó con cisteína a BSA
catiónico (Pierce). El anticuerpo 277-2 se purificó
por afinidad utilizando el péptido sintético conjugado con resina
Sulfo-link (Pierce) y se hizo reaccionar a fondo con
^{125}I-A\beta_{1-42} según se
identificó por precipitación del trazador. No presentó ninguna
reactividad cruzada detectable con A\beta_{1-40}
en los formatos de inmunoprecipitación o de ELISA, lo que indica al
menos una sensibilidad menor de 1.000 veces hacia el péptido
A\beta_{1-40}. Se utilizó
A\beta_{1-42} sintético como patrón. Se consiguió
la identificación del anticuerpo indicador 277-2
utilizando un conjugado de IgG-fosfatasa alcalina
anti-conejo de burro y el sustrato
quimioluminiscente AMPPD con potenciador Esmeralda (Tropix) (C.
Vigo-Pelfrey et al. (1994) J Neurochem
61:1965-1968).
Para eliminar la variabilidad entre ensayos como
factor en el análisis de
A\beta(x-\geq41), se realizaron todas las
muestras por duplicado el mismo día con el mismo lote de patrones.
La variabilidad intra-ensayo fue menor del 10%.
Antes de la medición, se calentaron alícuotas de muestras de CSF a
100ºC durante tres minutos y a continuación se almacenaron a 4ºC
toda la noche antes del análisis. Se observó que, en general, la
etapa de calentamiento aumenta la inmunorreactividad en las
muestras de CSF, independiente del diagnóstico, y por lo tanto se
incluyó. Debe observarse que diferentes lotes de
A\beta(x-\geq41) sintético generan
valores patrón ligeramente diferentes, a pesar de estar
normalizados por análisis de aminoácidos. Los valores relacionados
están basados en un patrón único utilizado para el estudio
completo. Los estudios que implican adición de
A\beta(x-\geq41) sintéticos a CSF
demostraron que la recuperación medida era 80
\pm 5%.
\pm 5%.
Se utilizaron tau purificadas de tejido de
cerebro AD humano y de fuentes recombinadas para la caracterización
del análisis y de anticuerpos. Se produjo tau humana recombinada
utilizando el vector baculovirus descrito anteriormente que
contiene la isoforma repetida
pVL941-tau-4 (J. Knops et al.
(1991) J Cell Biol 1991:114:725-733). Se
expresaron concentraciones elevadas de tau y se purificaron en
células SF9 y de insecto cinco alto. Se recogieron cultivos
celulares que se expresan al máximo, se lavaron una vez en PBS y se
enfriaron en hielo. Se destruyeron a continuación las células por
ultrasonidos en MES 0,1 M, pH 6,5, EGTA 1 mM, EDTA 18 \muM,
MgCl_{2} 0,5 mM, 5 \mug/ml de leupeptina y PMSF 1 mM. Se
eliminó el residuo celular por centrifugación a baja velocidad y se
ajustó el sobrenadante a NaCl 0,75 M,
\beta-mercaptoetanol al 2%. Se hirvieron las
muestras 10 minutos en tubos tapados, se enfriaron en hielo y se
clarificaron por centrifugación a 100.000 \times g durante 30
minutos. Se ajustaron a continuación los sobrenadantes a ácido
perclórico al 2,5% y se centrifugaron durante 15 minutos a 13.000
\times g. Se sometieron los sedimentos a un segundo ciclo de
ebullición/precipitación con ácido y se dializaron los
sobrenadantes agrupados frente a KH_{2}PO_{4} 100 mM, pH 6,9,
EDTA 2 mM, EGTA 2 mM, \beta-mercaptoetanol 2 mM y
PMSF 0,3 mM.
Se consideró que tau recombinada era por lo menos
del 85% de pureza por SDS-PAGE teñido con azul de
Coomassie y se utilizó sin purificación adicional. Se estimaron las
concentraciones de todos los patrones tau mediante análisis con
aminoácidos. Para desfosforilar tau, se dializó una alícuota en
Tris-HCl 20 mM pH 8,6, MgCl_{2} 2 mM, DTT 1 mM y
tampón de ZnCl_{2} 10 \muM. A la mitad de la muestra, se
añadieron 0,1 unidades de fosfatasa alcalina (Boehringer Mannheim)
por \mug de tau; la otra mitad se diluyó igualmente con tampón
solo y se incubaron las dos muestras durante 5 horas a 37ºC.
Se prepararon anticuerpos monoclonales según una
modificación del método de Kohler y Milstein (G. Kohler y C.
Milstein (1975) Nature 256:495-497). Se
utilizó tau en todas las inyecciones y se purificaron los análisis
de identificación en células SF9 inyectadas con la construcción de
baculovirus que contiene tau. Se inyectaron ratones A/J de seis
semanas de vida con 100 \mug de tau purificada a intervalos de
dos semanas. Se emulsionó tau en adyuvante completo de Freund para
la primera inmunización y en adyuvante incompleto de Freund para
todas las inmunizaciones posteriores. Se tomaron muestras de suero
tres días después de la tercera inyección para evaluar el título de
estos animales. El ratón con el título mayor se inyectó por vía
intravenosa con 100 \mug de tau en 500 \mul de PBS dos semanas
después de recibir su tercera inyección. La fusión del mieloma tuvo
lugar tres días después utilizando SP2/0 como compañero de fusión.
Se obtuvieron los anticuerpos 16G7 y 8C11 a partir de esta fusión
mientras que los anticuerpos 16B5 y 16C5 se aislaron de una fusión
posterior.
Se identificó la capacidad para precipitar tau
marcada con ^{125}I en los sobrenadantes de los pocillos que
contienen células de hibridoma. Se radioyodó tau utilizando glucosa
oxidasa inmovilizada y lactoperoxidasa según las instrucciones del
fabricante (Bio-Rad). En resumen, se radiomarcó tau
recombinada purificada con 1 mCi de Na^{125}I hasta una actividad
específica de 20 \muCi/\mug de proteína. Se identificaron 16G7,
8C11, 16B5 y 16C5 como los cuatro anticuerpos monoclonales con
mayor afinidad específicos para tau y se clonaron por dilución
limitativa. Se determinó que los isótopos de los cuatro anticuerpos
monoclonales específicos para tau eran gamma 1 kappa.
Se puso en suspensión el anticuerpo 16G7
monoclonal anti-tau en 5 \mug/ml en TBS y se
recubrieron 100 \mul/pocillo en placas de microvaloración (Dynatec
Microlite 2). Se realizó el recubrimiento toda la noche a
temperatura ambiente. Se aspiró a continuación la solución y se
bloquearon las placas con caseína al 0,25% (p/v) en solución salina
tamponada con fosfato (PBS). Se biotiniló el anticuerpo 16B5
anti-tau con el éster de
N-hidroxisuccinimida de biotina según las
instrucciones del fabricante (Pierce). Se combinaron las muestras de
50 \mul de CSF o de calibradores (50 \mul de 3 a 1000 pg/ml de
tau humana), con 50 \mul del anticuerpo anti-tau
biotinilado (0,75 \mug/ml en PBS-caseína, Tween
20 al 0,05%) en los pocillos recubiertos con 16G7 y se incubaron
toda la noche a temperatura ambiente con agitación constante. Se
aspiró a continuación la solución y se lavaron las placas tres
veces en TTBS. Se diluyó la fosfatasa alcalina con estreptavidina
(Boehringer-Mannheim) 1:1000 en
PBS-caseína, Tween 20 al 0,05% y se añadió 100
\mul a cada pocillo. Después de la incubación durante 1 hora a
temperatura ambiente, se aspiró el fluido y se lavaron los pocillos
tres veces. El reactivo quimioluminiscente,
3-(4-metoxiespiro{1,2-dioxetano-3,2^{1}-triciclo
[3.3.1.1^{3,7}]tdecano}-4-il) fenil fosfato
disódico (AMPPD, Tropix) y un potenciador verde Esmeralda (Tropix)
se diluyeron 1:1000 y 1:100 respectivamente en tampón de
dietanolamina 1 M, conteniendo MgCl_{2}1 mM, NaN_{3} al 0,02%,
pH 10. Se añadieron 100 \mul por pocillo y se leyeron las placas
después de 30 min. en un quimioluminómetro Dynatech ML 1000. Los
datos publicados en esta memoria utilizaron tau humana aislada del
cerebro como calibrador.
Se realizó el análisis estadístico de los datos
por un método de análisis de varianza (ANOVA) utilizando InStat,
versión 1.21.
La comparación de los tres grupos de paciente
(Tabla III) demostró que estaban muy igualadoss por edad y género.
El grupo AD tenía una MMSE promedio de 17,5 \pm 7,1 indicando una
alteración cognitiva de leve a moderada. El grupo de referencia de
la enfermedad neurológica consistía en una variedad de trastornos
incluyendo la demencia vascular (4), demencia del lóbulo frontal
(7), depresión (6), enfermedad de Parkinson (3), degeneración
gangliónica cortico-basal (2), ataxia del cerebelo
(2), parálisis supranuclear progresiva (1), hidrocefalia normotensa
(1), convulsión tonicoclónica generalizada (1), parálisis de Bell
(1), disminución de la memoria relacionada con la edad (1), demencia
con signos extrapiramidales (1), síndrome amnésico (1),
degeneración del cerebelo (1). El grupo de referencia constaba de
individuos que no padecían la enfermedad neurológica y eran
cognitivamente normales (Tabla III).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
| \begin{minipage}[t]{140mm} ^{1}Se determinaron los genotipos de ApoE en 30/37 de AD, 19/32 de referencia neurológica y 17/20 referencias normales. \end{minipage} | |
| **p<0,0001 comparando el grupo AD con uno de los dos grupos de referencia. | |
| *p<0,001 comparando el grupo AD con uno de los grupos de referencia. |
El análisis de las concentraciones de A\beta
totales en CSF no pusieron de manifiesto diferencias significativas
entre los diferentes grupos de pacientes (Tabla III). Los valores
medios oscilaron entre 19,0 ng/ml en el grupo AD y 17,9 ng/ml en el
grupo NC. Existió solapamiento significativo con diferencias no
estadísticamente significativas entre los grupos (p>0,05). El
análisis de la forma A\beta(x-\geq41)
del péptido, sin embargo, demostró una reducción en el valor medio
en el grupo AD, en comparación con ambos pacientes ND y NC (383
frente a 543 y 632 pg/ml respectivamente) que fue significativo a la
concentración de p<0,0001 (Figura 4). La desviación estándar
relativamente pequeña (76 pg/ml) del grupo AD fue particularmente
llamativa. En cambio, algunos de los pacientes de ND presentaron
A\beta(x-\geq41) reducida en su CSF.
Cuando se situó un corte a 505 pg/ml, 15 de los 37 pacientes de ND y
sólo cuatro de los 23 de NC estaban situados por debajo de esta
concentración. Por otra parte, de los 35 individuos que tienen
concentraciones de A\beta(x-\geq41)
mayores de 505 pg/ml, ninguno fue diagnosticado de AD, lo que
sugiere que el ensayo es muy específico en ausencia de la
enfermedad. Se midió A\beta(x-\geq41)
tal como se describe en el texto. Todas las mediciones son medias
de determinaciones por duplicado, la variación fue =10%. Se
asignaron a las placas muestras al azar y el analista ignoraba los
diagnósticos de los pacientes. Los patrones de referencia, presentes
en cada placa de microvaloración, no fueron significativamente
diferentes entre las placas.
Se examinaron también las concentraciones de tau
en muestras de CSF de los mismos pacientes. Se realizaron
mediciones de tau por duplicado. Para asegurar la constancia,
varias muestras de los análisis anteriores se incluyeron en las
placas posteriores y todas las muestras se evaluaron por lo menos
con medición por duplicado. Las mediciones por duplicado estaban
comprendidas dentro del 15% de los valores originales. Existe una
diferencia significativa entre el grupo AD y uno de los grupos de
referencia (p<0,001). Se utilizó tau procedente de cerebro
humano como patrón de referencia. Los pacientes de AD tenían un
valor medio de 407 pg/ml frente a 168 y 212 pg/ml en las
referencias neurológica y normal, respectivamente (Figura 5). Esta
diferencia entre el grupo AD y los demás grupos es significativa a
p<0,001. Empleando un corte de 312 pg/ml, los individuos con
valores por encima de este nivel tenían una probabilidad muy alta
de enfermedad de Alzheimer (22/24 = 92%). Solamente un paciente de
NC y uno de ND registraron este corte anteriormente. Análisis
independientes de la media de A\beta de CSF,
A\beta(x-\geq41) o concentraciones de tau
obtenidas de cada centro no pusieron de manifiesto diferencias
entre los centros que eran estadísticamente significativos para
alguna de las categorías de enfermedad tal como se puso de
manifiesto por análisis de varianza de una vía. De particular
interés fue el análisis simultáneo de las mediciones de
A\beta(x-\geq41) y tau en las mismas
muestras de CSF (Figura 6). La Figura 6 se divide en cuatro
cuadrantes utilizando los cortes para
A\beta(x-\geq41) y tau descritos
anteriormente. La presencia tanto de tau elevada como de
A\beta(x-\geq41) reducida (cuadrante
inferior derecho) era una predicción elevada de AD (22/23 = 96%).
En cambio A\beta(x-\geq41) elevada y tau
baja (cuadrante superior izquierdo) estaba representada
completamente por los pacientes de referencia (Figura 6). Más de la
mitad (58,7%) de todos los individuos en este estudio estaban
comprendidos en uno de estos dos cuadrantes. Los pacientes restantes
presentaron concentraciones de
A\beta(x-\geq41) bajas y de tau bajas
(cuadrante inferior izquierdo).
Aunque la invención anterior se ha descrito con
detalle en aras de la claridad de comprensión, resulta evidente que
se pueden poner en práctica determinadas modificaciones dentro del
alcance de las reivindicaciones adjuntas.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Seubert, Peter A.
\hskip4cmVigo-Pelfrey, Carmen
\hskip4cmSchenk, Dale B.
\hskip4cmBarbour, Robin
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Procedimientos para ayudar al diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer mediante la medición del péptido (x-\leq41) amiloide beta y tau
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Remitente: Townsend and Townsend Khourie and Crew
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: One Market Plaza, Steuart Tower, Suite 2000
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: San Francisco
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- DISTRITO POSTAL: 94105
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- LISTADO DESCIFRABLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA INFORMÁTICO: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 7 de abril de 1995
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- APODERADO / AGENTE DE INFORMACIÓN
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Heslin, James M.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 29.541
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA / NÚMERO DE ETIQUETA: 15270-002110
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 415-326-2400
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 415-326-2422
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 43 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu
Val His His Gln Lys Leu Val Phe}
\sac{Phe Ala Gly Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala
Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly}
\sac{Val Val Ile Ala Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile
Ala}
Claims (19)
1. Procedimiento útil como parte de un
procedimiento de diagnóstico para la enfermedad de Alzheimer en un
paciente, comprendiendo dicho procedimiento:
medir la cantidad de uno o más
A\beta(x-\geq41) soluble en una muestra
de fluido del cuerpo del paciente;
comparar la cantidad medida con un valor
indicador predeterminado de dichas una o más
A\beta(x-\geq41) solubles, en la que
opcionalmente el valor indicador predeterminado se mide en el mismo
paciente y en un tiempo inicial y el procedimiento proporciona
control;
evaluar el estado del paciente basándose en una
diferencia entre la cantidad medida y el valor indicador
predeterminado; y
en el que una cantidad medida por encima del
valor indicador proporciona una indicación negativa en el
diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer y una cantidad medida
igual o inferior al valor indicador proporciona una indicación
positiva en el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que la muestra del paciente es fluido cerebroespinal y el valor
indicador está comprendido aproximadamente entre 0,45 ng/ml y
aproximadamente 0,7 ng/ml, preferentemente alrededor de 0,5 ng/ml,
opcionalmente en el que el
A\beta(x-\geq41) medido contiene por lo
menos los aminoácidos 33 a 41 de A\beta.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que la muestra del paciente es plasma.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la cantidad de
A\beta(x-\geq41) soluble se mide
exponiendo la muestra del paciente a un primer anticuerpo o
fragmento del mismo específico para una zona de fijación en
A\beta o en el fragmento de A\beta que abarca los restos 13 a
26 de aminoácidos e identificando la fijación entre el primer
anticuerpo o fragmento del mismo y el
A\beta(x-\geq41) soluble exponiendo la
muestra del paciente a un segundo anticuerpo o fragmento del mismo
específico para A\beta(x-\geq41),
preferentemente en el que
(a) el segundo anticuerpo o fragmento del mismo
reconoce un epítopo en A\beta que tiene los restos 33 a 42 de
aminoácidos, y/o
(b) el primer anticuerpo o fragmento del mismo
reconoce un epítopo en A\beta que tiene los restos 13 a 26 de
aminoácidos.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el
que la fijación del primer anticuerpo o un fragmento del mismo y el
A\beta(x-\geq41) soluble se identifica
separando los complejos unidos del primer anticuerpo o del fragmento
del mismo y los A\beta o los fragmentos de A\beta, exponiendo
los complejos unidos separados a un segundo anticuerpo marcado o a
un fragmento del mismo específico de
A\beta(x-\geq41) e identificando la
presencia del marcador en los complejos unidos.
6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que la cantidad de péptido (x-\geq41)
(A\beta(x-\geq41))
\beta-amiloide en la muestra del paciente,
opcionalmente fluido cerebroespinal, se mide:
capturando el
A\beta(x-\geq41) soluble de la muestra
utilizando un primer anticuerpo o fragmento específico del mismo
para una zona de fijación en A\beta que comprende los restos 13 a
26 de aminoácidos; y
detectando la captura de
A\beta(x-\geq41) soluble utilizando un
segundo anticuerpo marcado o fragmento del mismo específico de
A\beta(x-\geq41).
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el
que el A\beta(x-\geq41) soluble se
captura en una fase sólida, y la captura se detecta exponiendo la
fase sólida al segundo anticuerpo marcado o a un fragmento del mismo
y a continuación detectando la presencia del marcador en la fase
sólida.
8. Procedimiento para la identificación de un
compuesto para determinar su capacidad para alterar la cantidad de
A\beta(x-\geq41) en el CSF que
comprende:
medir una primera cantidad de uno o más
A\beta(x-\geq41) solubles en el CSF de
un animal no humano utilizado como modelo de enfermedad de
Alzheimer;
administrar el compuesto al animal no humano;
medir una segunda cantidad de dichos uno o más
A\beta(x-\geq41) solubles en el CSF del
animal no humano; y
comparar la primera cantidad con la segunda
cantidad,
indicando la diferencia si el compuesto aumenta,
disminuye o deja inalterada la cantidad de
A\beta(x-\geq41) soluble en el CSF, en el
que un compuesto que aumenta la cantidad de
A\beta(x-\geq41) en el CSF puede ser útil
en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, y un compuesto que
disminuye la cantidad de
A\beta(x-\geq41) puede agravar o acelerar
la enfermedad de Alzheimer.
9. Procedimiento útil como parte de un
procedimiento de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer en un
paciente, comprendiendo dicho procedimiento:
medir la cantidad de uno o más
A\beta(x-\geq41) solubles en una muestra
de fluido del cuerpo del paciente;
comparar la cantidad medida del
A\beta(x-\geq41) soluble con una cantidad
de indicador predeterminada del
A\beta(x-\geq41) soluble,
medir la cantidad de tau en la muestra del
paciente;
comparar la cantidad medida de tau con un valor
indicador predeterminado de tau; y
evaluar el estado del paciente basándose en una
diferencia entre las cantidades medida y los valores indicadores
predeterminados de A\beta(x-\geq41) y de
tau, en el que una cantidad medida igual o inferior al valor
indicador de A\beta(x-\geq41) e igual o
superior al valor indicador de tau proporciona una indicación
positiva en el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer, y en el
que una cantidad medida por encima del valor indicador de
A\beta(x-\geq41) e inferior al valor
indicador de tau proporciona una indicación negativa en el
diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, en
el que la muestra del paciente es fluido cerebroespinal, el valor
indicador para A\beta(x-\geq41) está
comprendido aproximadamente entre 0,45 ng/ml y aproximadamente 0,7
ng/ml, preferentemente alrededor de 0,5 ng/ml y el valor indicador
para tau está comprendido aproximadamente entre 0,25 ng/ml y
aproximadamente 0,4 ng/ml, preferentemente alrededor de 0,3 ng/ml,
opcionalmente en el que el
A\beta(x-\geq41) medido contiene por lo
menos los aminoácidos 33 a 41 de A\beta.
11. Procedimiento según la reivindicación 9, en
el que la muestra del paciente es plasma.
12. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 11, en el que la cantidad de
A\beta(x-\geq41) soluble se mide
exponiendo la muestra del paciente a un primer anticuerpo o
fragmento del mismo específico para una zona de fijación en
A\beta o en el fragmento de A\beta que abarca los restos 13 a
26 de aminoácidos e identificando la fijación entre el primer
anticuerpo o un fragmento del mismo y el
A\beta(x-\geq41) soluble, exponiendo la
muestra del paciente a una segunda sustancia de fijación específica
para A\beta(x-\geq41).
13. Procedimiento según la reivindicación 12, en
el que
(a) el segundo anticuerpo o un fragmento del
mismo es un anticuerpo que reconoce un epítopo en A\beta que
tiene los restos 33 a 42 de aminoácidos, y/o
(b) el primer anticuerpo o un fragmento del mismo
es un anticuerpo que reconoce un epítopo en A\beta que tiene los
restos 13 a 26 de aminoácidos.
14. Procedimiento según la reivindicación 12 ó
13, en el que la fijación del primer anticuerpo o un fragmento del
mismo y el A\beta(x-\geq41) soluble se
identifica separando los complejos unidos del anticuerpo o del
fragmento del mismo y los A\beta o los fragmentos de A\beta,
exponiendo los complejos unidos separados a un segundo anticuerpo
marcado o a un fragmento del mismo específico de
A\beta(x-\geq41) e identificando la
presencia del marcador en los complejos unidos.
15. Procedimiento para la identificación de un
compuesto para determinar su capacidad para alterar la cantidad
tanto de A\beta(x-\geq41) como de tau en
el CSF, que comprende:
medir una primera cantidad de uno o más
A\beta(x-\geq41) solubles en el CSF de
un animal no humano utilizado como modelo de enfermedad de
Alzheimer;
medir una primera cantidad de tau en el CSF de un
animal no humano;
administrar el compuesto al animal no humano;
medir una segunda cantidad de dichos uno o más
A\beta(x-\geq41) solubles en el CSF del
animal no humano;
medir una segunda cantidad de tau en el CSF del
animal no humano; y
comparar las primeras cantidades con las segundas
cantidades,
indicando la diferencia si el compuesto aumenta,
disminuye o deja inalterada la cantidad de
A\beta(x-\geq41) soluble y aumenta,
disminuye o deja inalterada la cantidad de tau en el CSF, en el que
un compuesto que aumenta la cantidad de A\beta(x->41) y
disminuye la cantidad de tau en el CSF puede ser útil en el
tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, y un compuesto que
disminuye la cantidad de A\beta(x->41) y aumenta la
cantidad de tau puede agravar o acelerar la enfermedad de
Alzheimer.
16. Procedimiento según la reivindicación 8 ó 15,
en el que el animal no humano es un roedor, preferentemente un
ratón.
17. Kit que comprende un anticuerpo o un
fragmento del mismo que se une a
A\beta(x-\geq41) pero que no se une a
A\beta(\leq40) y un anticuerpo o fragmento del mismo que
se une a tau, que comprende opcionalmente además un anticuerpo o
fragmento del mismo que se une a A\beta o a un fragmento de
A\beta pero que no se une a otros fragmentos de APP.
18. Kit según la reivindicación 17, en el que el
anticuerpo o fragmento del mismo que se une a
A\beta(x-\geq41) pero que no se une a
A\beta(\leq40) se une a un epítopo que contiene los
aminoácidos por encima del número 40 en A\beta y el anticuerpo o
fragmento del mismo que se une a A\beta o a un fragmento de
A\beta pero que no se une a otros fragmentos de APP que se unen a
una zona de fijación en A\beta que abarca los restos de
aminoácidos 13 a 26.
19. Kit según la reivindicación 18, que
comprende:
(a) un anticuerpo no marcado o un fragmento del
mismo que se une a una zona de fijación de A\beta que abarca los
restos de aminoácidos 13 a 26;
(b) un anticuerpo marcado de forma detectable o
un fragmento del mismo que se une a un epítopo que contiene los
aminoácidos por encima del número 40 en A\beta;
(c) un anticuerpo no marcado o un fragmento del
mismo que se une a tau; y
(d) un anticuerpo marcado de forma detectable o
un fragmento del mismo que se une a tau;
preferentemente los anticuerpos son anticuerpos
monoclonales o fragmentos de los mismos.
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