ES2297852T3 - Aplicaciones terapeuticas de laminina y de fragmentos proteicos obtenidos a partir de laminina. - Google Patents

Abstract

ESTA INVENCION SE REFIERE AL DESCUBRIMIENTO, A LA IDENTIFICACION Y A LA UTILIZACION DE LA LAMININA, DE FRAGMENTOS DE PROTEINA DERIVADA DE LA LAMININA Y DE POLIPEPTIDOS DERIVADOS DE LA LAMININA, ASI COMO A PEPTIDOS Y ANTICUERPOS, PARA LA INTERVENCION TERAPEUTICA Y EL DIAGNOSTICO DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER Y OTRAS AMILOSIS. ADEMAS, EL DESCUBRIMIENTO Y LA IDENTIFICACION DE UNA PROTEINA BETA - AMILOIDE ESPECIFICA DE ALZHEIMER QUE SE VINCULA A UNAS REPETICIONES DEL CAMPO GLOBULAR DE LA CADENA A DE LA LAMININA HA LLEVADO A UN NUEVO DIAGNOSTICO Y NUEVAS APLICACIONES TERAPEUTICAS PARA LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER Y OTRAS AMILOSIS QUE SE TRATAN EN ESTA INVENCION.

Description

Aplicaciones terapéuticas de laminina y de fragmentos proteicos obtenidos a partir de laminina.

Campo técnico

La presente invención se refiere al uso de laminina, de fragmentos proteicos obtenidos a partir de laminina y de polipéptidos obtenidos a partir de laminina, para la intervención terapéutica de la enfermedad de Alzheimer y de otras amiloidosis. Además, el descubrimiento y la identificación de una región que se une de forma específica a la proteína beta-amiloide (A\beta) de la enfermedad de Alzheimer, dentro de las repeticiones del dominio globular de la cadena A de la laminina, han conducido a nuevas aplicaciones terapéuticas para la enfermedad de Alzheimer y para otras amiloidosis que están descritas.

Antecedentes de la invención

La enfermedad de Alzheimer se caracteriza por la acumulación de un péptido de 39-43 aminoácidos, denominado la proteína beta-amiloide o A\beta, en forma fibrilar, que existe en forma de placas amiloides extracelulares y como una sustancia amiloide dentro de las paredes de los vasos sanguíneos cerebrales. Se cree que la formación de depósitos de sustancia amiloide A\beta fibrilar en la enfermedad de Alzheimer, es perjudicial para el paciente y que finalmente produce toxicidad y muerte de las células neuronales, rasgos característicos de la enfermedad de Alzheimer. La acumulación de indicios implica a la sustancia amiloide como un factor principal causante de la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer. El descubrimiento y la identificación de nuevos compuestos, agentes, proteínas, polipéptidos o derivados proteicos como agentes terapéuticos potenciales para detener la formación, el depósito, la acumulación y/o la persistencia de sustancia amiloide A\beta en la enfermedad de Alzheimer, se está investigando urgentemente.

Se conoce que la A\beta está presente generalmente en la sangre humana y en el fluido cerebroespinal. Sin embargo, se desconoce porqué esta proteína fibrilar potencial sigue siendo soluble en los fluidos biológicos circulantes. ¿Se podrá aplicar el(los) agente(s) responsable(s) de esta extraordinaria solubilidad de la A\beta fibrilar a regímenes diagnósticos o terapéuticos contra la sustancia amiloide A\beta fibrilar presente en el cerebro de pacientes con Alzheimer?.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona respuestas a estas cuestiones y se refiere al nuevo descubrimiento sorprendente de que la laminina y fragmentos proteicos específicos obtenidos a partir de laminina, son de hecho potentes inhibidores de la amiloidosis de la enfermedad de Alzheimer y tienen por ello un uso potencial en la intervención terapéutica de las amiloidosis. Además, hemos identificado una región específica dentro de la laminina que interacciona con la proteína beta-amiloide de la enfermedad de Alzheimer y que contribuye a los efectos inhibidores y terapéuticos observados. Además, se ha observado que los fragmentos proteicos específicos obtenidos a partir de laminina que también interaccionan con la A\beta de la enfermedad de Alzheimer, están presentes en el suero humano y en el fluido cerebroespinal.

En un primer aspecto, la invención proporciona el uso de laminina o de un fragmento de una proteína de laminina, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad amiloide en un paciente.

En un segundo aspecto, la invención proporciona un método in vitro para inhibir o reducir la formación fibrilar, el depósito o la acumulación de proteína beta-amiloide, comprendiendo el método la administración de laminina o de un fragmento de una proteína de laminina a un sitio que contiene proteína beta-amiloide.

Realizaciones particulares del primer y del segundo aspecto de la invención, se exponen en las reivindicaciones dependientes.

La laminina es un componente específico de la membrana basal que está implicada en diversos procesos biológicos fundamentales y que puede tener un papel importante en la patogénesis de una variedad de enfermedades humanas diferentes. Empleando un inmunoensayo de ligación en fase sólida, la presente invención ha determinado que la laminina se une a la A\beta de la enfermedad de Alzheimer con una sola constante de ligación de K_{d} = 2,7 x 10^{-9} M. Adicionalmente, empleando un ensayo de fluorometría con tioflavina T (que determina cuantitativamente la cantidad de sustancia amiloide fibrilar formada), la presente invención ha determinado que la laminina es sorprendentemente un inhibidor extremadamente potente de la formación de A\beta fibrilar. En este último estudio, se incubaron 25 \muM de A\beta (residuos 1-40) a 37ºC durante una semana en presencia o en ausencia de laminina 100 nM. Se observó que la laminina inhibía significativamente (p<0,001) la formación de A\beta (1-40) amiloide fibrilar, 2,9 veces en 1 hora, 4,6 veces en 1 día, 30,6 veces en 3 días y 27,1 veces en 1 semana. Otros componentes de la membrana basal que incluyen perlecan, fibronectina y colágeno de tipo IV, no eran inhibidores eficaces de la fibrilogénesis de A\beta (1-40), en comparación con la laminina, mostrando la especificidad del efecto inhibidor mostrado por la laminina. El efecto inhibidor de la laminina sobre la fibrilogénesis de A\beta, también se encontró que tenía lugar en forma dependiente de la dosis. Además, se observó que la laminina provocaba la disolución de fibrillas de sustancia amiloide de la enfermedad de Alzheimer formadas previamente en forma dependiente de la dosis, después de 4 días de incubación. La laminina se digirió con V8, tripsina o elastasa para determinar fragmentos pequeños de laminina, resistentes a la proteasa que seguían interaccionando con A\beta. Un fragmento de laminina de \sim55 kilodalton (kDa), obtenido a partir de la laminina digerida con elastasa o con V8, se observó que interaccionaba con A\beta (1-40) biotinilada. Con la secuenciación de los aminoácidos del fragmento de \sim55 kDa se identificaba un dominio de unión a A\beta dentro de la laminina, situado en las repeticiones globulares de la cadena A de la laminina.

Se observó que la laminina intacta estaba presente en el suero humano pero no en el fluido cerebroespinal humano, mientras que fragmentos proteicos de laminina en el intervalo de \sim120 kDa a \sim200 kDa, estaban presentes en el suero humano y en el fluido cerebroespinal. Entre todos los fragmentos proteicos de laminina presentes en los fluidos biológicos humanos descritos anteriormente, se observó una banda de \sim130 kilodalton destacada en el suero humano y en el fluido cerebroespinal que interaccionaba principalmente con A\beta tal y como se determinaba con la metodología de transferencia de ligando. Este fragmento de laminina de \sim130 kilodalton se conoce como el fragmento E8 (es decir, generado después de la digestión de la laminina con elastasa) (Yurchenco y Cheng, J. Biol. Chem. 268:17286-17299, 1993) y también se cree que consta de los dominios globulares de la cadena A de laminina. La interacción de los fragmentos específicos de laminina, tal como la nueva proteína descubierta de \sim130 kDa, se cree que produce la unión con A\beta en los fluidos biológicos y mantiene el estado soluble. La presente invención describe el uso de laminina, de fragmentos proteicos obtenidos a partir de laminina y de polipéptidos obtenidos a partir de laminina, para la intervención terapéutica de la enfermedad de Alzheimer y de otras amiloidosis. Además, el descubrimiento y la identificación de una región específica que se une a A\beta de Alzheimer, dentro de las repeticiones del dominio globular de la cadena A de laminina, y el descubrimiento de la presencia de fragmentos de laminina que contienen esta región en el suero humano y en el fluido cerebroespinal, han conducido a nuevas aplicaciones terapéuticas para la enfermedad de Alzheimer y otras amiloidosis.

Características de la invención

Un objeto de la presente invención es establecer nuevos métodos terapéuticos para las enfermedades amiloides. Las enfermedades amiloides incluyen, sin estar limitadas a las mismas, la sustancia amiloide asociada con la enfermedad de Alzheimer y con el síndrome de Down (en donde la sustancia amiloide específica se denomina proteína beta-amiloide o A\beta), la sustancia amiloide asociada con inflamación crónica, diversas formas de malignidad y la fiebre mediterránea familiar (en donde la sustancia amiloide específica se denomina amiloide AA o amiloidosis asociada con inflamación), la sustancia amiloide asociada con mieloma múltiple y otras discrasias de linfocitos B (en donde la sustancia amiloide específica se denomina amiloide AL), la sustancia amiloide asociada con la diabetes de tipo II (en donde la sustancia amiloide específica se denomina amilina o amiloide de los islotes) la sustancia amiloide asociada con enfermedades producidas por priones que incluyen la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, el síndrome de Gerstmann-Straussler, Kuru y Scrapie animal (en donde la sustancia amiloide específica se denomina amiloide PrP), la sustancia amiloide asociada con hemodiálisis de larga duración y el síndrome del túnel carpiano (en donde la sustancia amiloide específica se denomina amiloide beta_{2}-microglobulina), la sustancia amiloide asociada con la sustancia amiloide cardiaco senil y la polineuropatía amiloidótica familiar (en donde la sustancia amiloide específica se denomina transtiretina o prealbúmina) y la sustancia amiloide asociada con tumores endocrinos, tales como el carcinoma medular de la tiroides (en donde la sustancia amiloide específica se denomina variantes de la
procalcitonina).

Otro objeto de la presente invención es el uso de laminina, fragmentos proteicos obtenidos a partir de laminina y/o polipéptidos obtenidos a partir de laminina como inhibidores potentes de la formación, el depósito, la acumulación y/o la persistencia de sustancia amiloide en la enfermedad de Alzheimer y en otras amiloidosis. "Los fragmentos de laminina, los fragmentos obtenidos a partir de laminina, los fragmentos proteicos obtenidos a partir de laminina y/o los polipéptidos obtenidos a partir de laminina" pueden incluir, sin estar limitados a los mismos, la cadena A (o A1) de la laminina, la cadena B1 de la laminina, la cadena B2 de la laminina, la cadena A2 de la laminina (merosina), la cadena G1 de la laminina, las repeticiones del dominio globular dentro de la cadena A1 de la laminina, la SEQ ID NO:1 (secuencia de 11 aminoácidos dentro de la cadena A de la laminina de ratón), la SEQ ID NO:2 (cuarta repetición globular en la cadena A de la laminina de ratón), la SEQ ID NO:3 (cuarta repetición globular en la cadena A de la laminina humana), la SEQ ID NO:4 (cadena A de la laminina de ratón), la SEQ ID NO:5 (la cadena A de la laminina humana), la SEQ ID NO:6 (la cadena B1 de la laminina humana), la SEQ ID NO:7 (la cadena B1 de la laminina de ratón), la SEQ ID NO:8 (la cadena B2 de la laminina de rata), la SEQ ID NO:9 (la cadena B2 de la laminina humana), la SEQ ID NO:10 (la cadena G1 de la laminina de ratón), la SEQ ID NO:11 (la cadena G1 de la laminina humana) y todos los fragmentos o combinaciones de las mismas.

Las proteínas, los polipéptidos o los fragmentos de los mismos que dependen de su conformación, se pueden emplear para el tratamiento de la enfermedad Alzheimer o de otras amiloidosis. Tales proteínas dependientes de la conformación incluyen, pero no están limitadas a, la laminina, fragmentos obtenidos a partir de la laminina que incluyen la cadena A1 de la laminina (SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:5), los dominios de las repeticiones globulares en la cadena A1 de la laminina (SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3), una secuencia peptídica de 11 aminoácidos dentro del dominio globular de la cadena A de la laminina (SEQ ID NO:1), la cadena B1 de la laminina (SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7), la cadena B2 de la laminina (SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9), la cadena G1 de la laminina (SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11) y/o partes de las mismas.

Los compuestos peptidomiméticos modelados a partir de laminina, fragmentos proteicos obtenidos a partir de laminina y/o polipéptidos obtenidos a partir de laminina, que incluyen pero no están limitados a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11, y fragmentos de los mismos, se pueden emplear como inhibidores potentes de la formación, el depósito, la acumulación y/o la persistencia de sustancia amiloide en la enfermedad de Alzheimer y en otras amiloidosis.

El(los) sitio(s) tridimensionales de unión a A\beta en la laminina, los fragmentos proteicos obtenidos partir de laminina y/o los polipéptidos obtenidos a partir de laminina, se pueden mimetizar y estas imitaciones se puede utilizar como potentes inhibidores de la formación, el depósito, la acumulación y/o la persistencia de sustancia amiloide en la enfermedad de Alzheimer y en otras amiloidosis.

Los anticuerpos anti-idiotípicos para la laminina, los fragmentos proteicos obtenidos a partir de laminina y/o los polipéptidos obtenidos a partir de laminina se pueden utilizar como potentes inhibidores de la formación, el depósito, la acumulación y/o la persistencia de sustancia amiloide en la enfermedad de Alzheimer y en otras amiloidosis.

Se pueden utilizar anticuerpos peptídicos policlonales y/o monoclonales nuevos y novedosos en una variedad de ensayos in vitro para detectar específicamente los fragmentos proteicos obtenidos a partir de laminina que se unen a A\beta y/o los polipéptidos obtenidos a partir de laminina que se unen a A\beta, en tejidos humanos y/o en fluidos biológicos. Los anticuerpos policlonales o monoclonales que se preparan dirigidos específicamente contra una porción de péptido o un fragmento de laminina que interacciona con A\beta, se pueden utilizar para detectar y cuantificar fragmentos de laminina específicos de la enfermedad amiloide, en tejidos humanos y/o en fluidos biológicos. Estos anticuerpos se pueden preparar administrando los péptidos en forma antigénica a un hospedador adecuado. Los anticuerpos policlonales o monoclonales se pueden preparar mediante técnicas convencionales, conocidas por los expertos en la materia.

La laminina, los fragmentos de laminina que se unen a A\beta y/o los polipéptidos obtenidos a partir de laminina expuestos anteriormente, también se pueden utilizar para detectar y localizar específicamente péptidos importantes de la laminina, en las enfermedades amiloides en tejidos, células y/o cultivos celulares humanos, empleando técnicas inmunohistoquímicas convencionales.

Los anticuerpos que reconocen la laminina, cualquiera de los fragmentos de laminina que se unen a A\beta y/o los polipéptidos obtenidos a partir de laminina, que incluyen sin estar limitados a los mismos, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11 y fragmentos de los mismos, se pueden emplear para la marcación in vivo; por ejemplo, con un radionucleótido, para la formación de radioimágenes para utilizar en el diagnóstico in vivo y/o para el diagnóstico in vitro.

La laminina, los fragmentos proteicos de laminina que se unen a A\beta y/o los polipéptidos obtenidos a partir de laminina que se unen a A\beta que incluyen, pero no están limitados a los mismos, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11 y sus fragmentos, se pueden emplear para inhibir el depósito, la formación y la acumulación de sustancia amiloide fibrilar en la enfermedad de Alzheimer y en otras amiloidosis (descritas anteriormente) y para mejorar el aclaramiento y/o la eliminación de depósitos de sustancia amiloide preformados en el cerebro (para la amiloidosis de la enfermedad de Alzheimer y del síndrome de Down) y en órganos sistémicos (para amiloidosis sistémicas).

Los polipéptidos obtenidos a partir de laminina que se unen a A\beta o fragmentos de los mismos, se pueden utilizar junto con anticuerpos policlonales y/o monoclonales generados contra estos fragmentos peptídicos, empleando ensayos in vitro, para detectar autoanticuerpos específicos de la enfermedad amiloide en fluidos biológicos humanos. Los sistemas específicos del ensayo se pueden utilizar no sólo para detectar la presencia de autoanticuerpos contra fragmentos proteicos obtenidos a partir de laminina que se unen a A\beta, o polipéptidos de los mismos en fluidos biológicos, sino también para vigilar el avance de la enfermedad mediante una elevación o disminución posterior de los fragmentos proteicos de laminina y/o de los niveles de autoanticuerpo contra el polipéptido obtenido a partir de laminina.

La laminina, los fragmentos proteicos obtenidos a partir de laminina y/o los anticuerpos de polipéptidos obtenidos a partir de laminina y/o sondas producidas mediante biología molecular, se pueden utilizar para detectar estos derivados de laminina en tejidos humanos en enfermedades amiloides.

Los fragmentos proteicos obtenidos a partir de laminina de la presente invención, se pueden utilizar en cada una de las aplicaciones descritas anteriormente. Los fragmentos proteicos obtenidos a partir de laminina incluyen, pero sin estar limitados a los mismos, la cadena A1 de la laminina, las repeticiones globulares en la cadena A1 de la laminina, la cadena B1 de la laminina, la cadena B2 de la laminina, la cadena G1 de la laminina, la cadena A2 de la laminina (también conocida como merosina) y todos los constituyentes o variaciones de los mismos, incluyendo pero sin estar limitados a los mismos, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11 y fragmentos de los mismos, que incluyen péptidos que tienen al menos 70% de homología con las secuencias descritas en esta memoria. Los fragmentos o los péptidos proteicos específicos obtenidos a partir de laminina tal y como se han descrito anteriormente, se pueden obtener a partir de cualquier especie que incluye, sin estar limitados a los mismos, las especies humanas, de múrido, bovinas, porcinas y/o equinas.

Los anticuerpos de péptidos policlonales y/o monoclonales se pueden utilizar en una variedad de ensayos in vitro para detectar específicamente fragmentos proteicos de laminina en tejidos humanos y/o en fluidos biológicos. Los anticuerpos policlonales y monoclonales preparados específicamente contra una porción peptídica o un fragmento de cualquiera de los fragmentos de laminina descritos en esta memoria, se pueden utilizar para detectar y cuantificar fragmentos proteicos obtenidos a partir de laminina en tejidos humanos y/o en fluidos biológicos. Un anticuerpo policlonal preferido es un anticuerpo policlonal preparado contra el fragmento de laminina que se une a A\beta de \sim130 kilodalton, presente en el suero humano y en el fluido cerebroespinal. Estos anticuerpos se pueden preparar aislando y administrando los fragmentos obtenidos a partir de laminina y/o los polipéptidos, en forma antigénica, a un hospedador adecuado. Los anticuerpos policlonales o monoclonales se pueden preparar mediante técnicas convencionales conocidas por un experto en la materia.

Los anticuerpos de fragmentos obtenidos a partir de laminina, tal y como se han descrito en esta memoria, también se pueden utilizar como indicadores específicos de la presencia y del grado de descomposición en el cerebro o en órganos sistémicos, vigilando los fluidos biológicos que incluyen, sin estar limitados a los mismos, el fluido cerebroespinal, la sangre, el suero, la orina, la saliva, el esputo y las heces.

Los anticuerpos de fragmentos obtenidos a partir de laminina, tal y como se han descrito en esta memoria, también se pueden utilizar como indicadores específicos de la presencia, el grado y/o el avance de la enfermedad de Alzheimer y/o de otras amiloidosis cerebrales, vigilando los fluidos biológicos que incluyen, sin estar limitados a los mismos, el fluido cerebroespinal, la sangre, el suero, la orina, la saliva, el esputo y las heces.

Los anticuerpos de fragmentos obtenidos a partir de laminina, tal y como se han descrito en esta memoria, también se pueden utilizar como indicadores específicos de la presencia y del grado de la amiloidosis en la diabetes de tipo II y en otras amiloidosis sistémicas, vigilando los fluidos biológicos que incluyen, sin estar limitados a los mismos, el fluido cerebroespinal, la sangre, el suero, la orina, la saliva, el esputo y las heces.

Los péptidos o los fragmentos de laminina tal y como se han descrito en esta memoria, que incluyen pero sin estar limitados a los mismos, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11 y fragmentos de los mismos, se pueden utilizar como agentes terapéuticos que bloquean potencialmente la interacción de la laminina y de los fragmentos obtenidos a partir de la laminina, en una variedad de procesos biológicos y enfermedades (tales como la enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades amiloides descritas en esta memoria).

Los anticuerpos de fragmentos específicos obtenidos a partir de laminina, tal y como se describen en esta memoria, se pueden emplear para detectar estos fragmentos de laminina en tejidos humanos en las enfermedades amiloides.

La laminina, los fragmentos proteicos obtenidos a partir de laminina y los polipéptidos obtenidos a partir de laminina, tal y como se describen en esta memoria, se pueden emplear para el tratamiento de la formación, depósito, acumulación y/o persistencia de sustancia amiloide en la enfermedad de Alzheimer y en otras amiloidosis.

Las píldoras, los comprimidos, las tabletas revestidas, los comprimidos oblongos, las cápsulas de gelatina dura y blanda, las grageas, los sellos, las cápsulas vegetales, las gotas líquidas, los elixires, las suspensiones, las emulsiones, las soluciones, los jarabes, las bolsas de té, los aerosoles (como un sólido o en un medio líquido), los supositorios, las soluciones inyectables estériles y/o los polvos envasados estériles que contienen laminina, fragmentos proteicos obtenidos a partir de laminina y polipéptidos obtenidos a partir de laminina, que incluyen, sin estar limitados a los mismos, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11 y fragmentos de los mismos, se pueden utilizar para tratar pacientes con la enfermedad de Alzheimer y otras amiloidosis.

La laminina, los fragmentos proteicos obtenidos a partir de laminina y los polipéptidos obtenidos a partir de laminina que incluyen, sin estar limitados a los mismos, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11 y fragmentos de los mismos, se pueden utilizar como agentes potentes que inhiben la formación de sustancia amiloide, el depósito de sustancia amiloide, la acumulación de sustancia amiloide, la persistencia de sustancia amiloide y/o que causan una disolución de las fibrillas amiloides preformadas o predepositadas en la enfermedad de Alzheimer y en otras amiloidosis.

Las composiciones que comprenden una dosis terapéutica de laminina, de fragmentos proteicos obtenidos a partir de laminina y de polipéptidos obtenidos a partir de laminina, que inhiben el depósito sustancia amiloide, que incluyen sin estar limitadas a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11 y fragmentos de los mismos, se pueden administrar a un sujeto. Por tanto, las composiciones son útiles para inhibir la amiloidosis en trastornos en los que tiene lugar un depósito sustancia amiloide. Las proteínas o los polipéptidos de la invención se pueden emplear terapéuticamente para tratar amiloidosis o se pueden utilizar profilácticamente en un sujeto susceptible de padecer amiloidosis. Los métodos de la invención se basan, al menos en parte, en inhibir directamente la formación de fibrilla amiloide y/o en provocar la disolución de las fibrillas amiloides formadas previamente.

También se pueden proporcionar composiciones farmacéuticas para tratar la amiloidosis. Las composiciones farmacéuticas incluyen un compuesto terapéutico de la invención en una cantidad eficaz para inhibir el depósito de sustancia amiloide y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Estas y otras características y ventajas de la presente invención serán más explícitas con la lectura de la siguiente descripción detallada de la invención junto con las figuras acompañantes.

Breve descripción de los dibujos

Los siguientes dibujos son ilustrativos de las realizaciones de la invención y no pretenden limitar el alcance de la invención.

La Figura 1 es una curva de ligación que muestra la interacción de la unión de la laminina EHS con la A\beta (1-40) unida al sustrato. Se determina un único sitio de unión con una K_{d} = 2,7 x 10^{-9} M.

La Figura 2 muestra la potente inhibición de la formación fibrilar de sustancia amiloide A\beta, mediante laminina, tal y como se determina con un ensayo de fluorometría con tioflavina T, durante un periodo experimental de 1 semana.

La Figura 3 compara la potente inhibición de la formación de fibrillas de sustancia amiloide A\beta mediante laminina con la de otros componentes de la membrana basal que incluyen la fibronectina, el colágeno de tipo IV y los perlecanes. Sólo se observó en la laminina el potente efecto inhibidor sobre la fibrilogénesis de A\beta, una hora después de la incubación.

La Figura 4 es un gráfico de un ensayo con fluorometría de tioflavina T, durante 1 semana, empleado para determinar los efectos potenciales dependientes de la dosis de la laminina sobre la inhibición de la formación de fibrillas de sustancia amiloide A\beta. Una inhibición significativa dependiente de la dosis, de la formación fibrilar amiloide A\beta (1-40), se observa al cabo de 1 día, 3 días y 1 semana de tratamiento, con concentraciones crecientes de laminina.

La Figura 5 es un gráfico de un ensayo de fluorometría con tioflavina T, utilizado para determinar los efectos potenciales dependientes de la dosis de la laminina, sobre la disolución de fibrillas amiloides A\beta (1-40) preformadas durante un periodo de incubación de 4 días. La laminina provoca la disolución de las fibrillas amiloided A\beta preformadas en una manera dependiente de la dosis.

La Figura 6 es un gráfico de un ensayo de fluorometría con tioflavina T durante 1 semana, empleado para determinar los efectos de la laminina sobre la fibrilogénesis del polipéptido amiloide de los islotes (amilina) y determinar si la laminina causa una inhibición dependiente de la dosis de la formación de fibrilla de amilina. La laminina no inhibe significativamente la fibrilogénesis de amilina, sugiriendo su especificidad para la amiloidosis de la enfermedad de Alzheimer.

La Figura 7 es una fotografía en blanco y negro de la laminina digerida con proteasa V8, separada con SDS-PAGE y posterior interacción con A\beta (1-40) biotinilada. El fragmento menor de laminina resistente a V8 que interacciona con A\beta, es un fragmento de \sim55 kilodalton.

La Figura 8 es una fotografía en blanco y negro de la laminina digerida con tripsina, separada con SDS-PAGE y posterior interacción con A\beta (1-40) biotinilada. El fragmento más pequeño de laminina resistente a la tripsina que interacciona con A\beta, es un fragmento de \sim30 kilodalton.

La Figura 9 es una fotografía en blanco y negro de la laminina digerida con elastasa, separada con SDS-PAGE y posterior interacción con A\beta (1-40) biotinilada. Un fragmento de laminina de \sim55 kilodalton (flecha) que se une a la A\beta biotinilada se identificó y se secuenció. Obsérvese también la presencia de un fragmento de \sim130 kDa (punta de la flecha) que se une a A\beta después de 1,5 horas de digestión con elastasa (pista 2). El panel A es una transferencia del ligando que emplea A\beta biotinilada como sonda, mientras que el panel B es una tinción con azul de Coomassie de la misma transferencia del panel A, para localizar la(s) banda(s) específica(s) para la secuenciación.

La Figura 10 muestra la secuencia de aminoácidos completa de la cadena A de la laminina de ratón. La secuenciación de la banda que se une a A\beta de \sim55 kilodalton mostrada en la Figura 9, conduce a la identificación de un segmento de 11 aminoácidos (subrayado y con punta de flecha) dentro de la cadena A de la laminina. Esta región que se une a A\beta está situada dentro de las repeticiones del dominio globular de la cadena A de la laminina.

La Figura 11 muestra diagramas esquemáticos de la laminina y la "región que se une a A" descubierta recientemente de la laminina (mostrada en el panel izquierdo; entre las dos puntas de flecha) que está situada dentro de los tres últimos dominios globulares de la cadena A de la laminina.

La Figura 12 es una fotografía en blanco y negro de una transferencia de tipo Western que muestra la presencia de laminina (puntas de flecha) y/o de fragmentos proteicos obtenidos a partir de la laminina (bandas entre las flechas) en suero humano (pistas 1-7; lado izquierdo) y fluido cerebroespinal humano (pistas 1-7, lado derecho) obtenido a partir de pacientes con Alzheimer, con diabetes de tipo II y de ancianos normales. Un intervalo de \sim110-130 kilodalton de fragmentos proteicos positivos para laminina (entre las dos flechas), está presente en el suero humano y en el fluido cerebroespinal, mientras que la laminina intacta (puntas de flecha) sólo está presente en suero pero no en fluido cerebroespinal.

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La Figura 13 es una fotografía en blanco y negro que muestra que la laminina intacta (flecha) y una banda de \sim130 kilodalton destacada (punta de flecha) presente en pacientes humanos con Alzheimer, con diabetes de tipo II y en ancianos normales, se une a A\beta. La laminina que se une a A\beta y los fragmentos de laminina que se unen a A\beta en el suero humano se identificaron después de la separación mediante SDS-PAGE y la interacción con concentraciones nanomolares de A\beta (1-40) biotinilada.

La Figura 14 es una fotografía en blanco y negro que muestra la presencia de una banda destacada de \sim130 kilodalton (flecha) en el fluido cerebroespinal de pacientes humanos con la enfermedad Alzheimer y en ancianos normales, que se identificó después de la separación mediante SDS-PAGE y después de la interacción con concentraciones nanomolares de A\beta (1-40) biotinilada. Esta misma proteína de \sim130 kilodalton que se une a A\beta, también está presente en el suero humano (Figura 13).

Las siguientes secciones se proporcionan a modo de antecedentes adicionales para apreciar mejor la invención.

Enfermedad de Alzheimer

La enfermedad de Alzheimer es la causa más común de demencia en personas de mediana edad y de edad avanzada y se manifiesta por un deterioro progresivo de la memoria, el lenguaje, las percepciones visuales y espaciales y el comportamiento (A Guide to the Understanding of Alzheimer's Disease and Related Disorders, editado por Jorm, New York University Press, Nueva York, 1987). Un diagnóstico de una probable enfermedad de Alzheimer se puede realizar basándose en criterios clínicos (generalmente la exclusión de otras enfermedades, pruebas de memoria, etc.), pero un diagnóstico definitivo requiere el examen histológico de anormalidades específicas en el tejido cerebral, obtenido normalmente en la autopsia.

En la enfermedad de Alzheimer, degeneran las partes del cerebro que son esenciales para procesos cognitivos tales como la memoria, la atención, el lenguaje y la lógica, quitando a las víctimas gran parte de lo que nos hace humanos, incluyendo la independencia. En algunas formas hereditarias de la enfermedad de Alzheimer, el inicio se produce a mediana edad, pero los síntomas aparecen más comúnmente a partir de los 60 años. La enfermedad de Alzheimer se caracteriza por el depósito y la acumulación de un péptido de 39-43 aminoácidos denominado proteína beta-amiloide, A\beta o \beta/A4 (Glenner y Wong, Biochem. Biophys. Res. Comm. 120:885-890, 1984; Masters y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4245-4249, 1985; Husby y col., Bull. WHO 71:105-108, 1993). La A\beta se obtiene a partir de proteínas precursoras más largas denominadas proteínas precursoras de beta-amiloide (o \betaPPs) de las cuales existen diversas variantes por corte y empalme alternativo. Las formas más abundantes de las \betaPPs incluyen proteínas que consisten en 695, 751 y 770 aminoácidos (Tanzi y col., Nature 331:528-530, 1988; Kitaguchi y col., Nature 331:530-532, 1988; Ponte y col., Nature 331:525-528, 1988). El péptido A\beta pequeño es un componente principal que constituye los depósitos amiloides de las "placas" neuríticas y en las paredes de los vasos sanguíneos (conocidos como depósitos amiloides cerebrovasculares) en los cerebros de pacientes con la enfermedad de Alzheimer. Además, la enfermedad de Alzheimer se caracteriza por la presencia de numerosas "marañas" neurofibrilares, compuestas por filamentos helicoidales emparejados que se acumulan anormalmente en el citoplasma neuronal (Grundke-Iqbal y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4913-4917, 1986; Kosik y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4044-4048, 1986; Lee y col., Science 251:675-678, 1991). Por lo tanto, la característica patológica de la enfermedad de Alzheimer es la presencia de "placas" y de "marañas", depositándose la sustancia amiloide en el núcleo central de las placas y en las paredes de los vasos sanguíneos. Es importante observar que el denominado "cerebro normal de anciano" tiene presentes ciertas placas amiloides y marañas neurofibrilares. Sin embargo, en comparación, un cerebro con la enfermedad de Alzheimer muestra una sobreabundancia de placas y marañas. Por ello, la diferenciación de un cerebro con la enfermedad de Alzheimer de un cerebro normal desde un punto de vista de diagnóstico, se basa principalmente en la determinación cuantitativa de las "placas" y las "marañas".

En un cerebro con la enfermedad de Alzheimer se encuentran generalmente miles de placas neuríticas. Las placas neuríticas están formadas por depósitos extracelulares que consisten en un núcleo amiloide, rodeado normalmente por axones alargados y terminaciones sinápticas, conocidas como neuritas y procesos dendríticos anormales, así como un número variable de microglía infiltrante y astrocitos circundantes. Las marañas neurofibrilares presentes en el cerebro con la enfermedad de Alzheimer consisten principalmente en la proteína tau, que es una proteína asociada a microtúbulos (Grundke-Iqbal y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4913-4917, 1986; Kosik y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4044-4048, 1986; Lee y col., Science 251:675-678, 1991). A nivel ultraestructural, la maraña consiste en filamentos helicoidales emparejados, enrollados como un cordón, con un entrecruzamiento específico con una periodicidad de 80 nanómetros. En muchos casos, dentro de una maraña neurofibrilar hay filamentos helicoidales emparejados y filamentos rectos. Además, las células nerviosas mueren muchas veces dejando los filamentos como residuo. Estas marañas se conocen como "marañas fantasmas" puesto que son los restos filamentosos de la neurona muerta.

El otro tipo principal de lesión encontrada en el cerebro de un paciente con la enfermedad de Alzheimer, es la acumulación de sustancia amiloide en las paredes de los vasos sanguíneos, tanto dentro del parénquima cerebral como en las paredes de los vasos meníngeos mayores que están en el exterior del cerebro. Los depósitos amiloides localizados en las paredes de los vasos sanguíneos se denominan sustancia amiloide cerebrovascular o angiopatía congófila (Mandybur, J. Neuropath. Exp. Neurol. 45:79-90, 1986; Pardridge y col., J. Neurochem. 49:1394-1401, 1987).

Adicionalmente, los pacientes con Alzheimer muestran pérdida neuronal y pérdida sináptica. También, estos pacientes muestran pérdida de neurotransmisores tales como la acetilcolina. La tacrina, el primer fármaco aprobado por la FDA para la enfermedad de Alzheimer, es un inhibidor de la colinesterasa (Cutler y Sramek, New Engl. J. Med. 328:808-810, 1993). Sin embargo, este fármaco ha mostrado un éxito limitado en la mejora cognitiva de pacientes con la enfermedad Alzheimer e inicialmente tenía efectos secundarios importantes, tales como toxicidad hepática.

Durante muchos años ha existido un debate científico que aún continúa, en cuanto a la importancia de la "sustancia amiloide" en la enfermedad de Alzheimer y sobre si las "placas" y las "marañas" características de esta enfermedad eran una causa o simplemente las consecuencias de la enfermedad. Estudios recientes de los últimos años indican ahora que, efectivamente, la sustancia amiloide es un factor que causa la enfermedad de Alzheimer y no debe considerarse un simple espectador inocente. Se ha demostrado que la proteína A\beta de la enfermedad de Alzheimer en cultivos celulares, causa la degeneración de las células nerviosas en cortos periodos de tiempo (Pike y col., Br. Res. 563:311-314, 1991; J. Neurochem. 64:253-265, 1994). Los estudios sugieren que es la estructura fibrilar, una característica de todos las sustancias amiloides, la que es responsable de los efectos neurotóxicos. La A\beta también se ha mostrado que es neurotóxica en cultivos de cortes del hipocampo (la región principal de la memoria, afectada en pacientes con Alzheimer) (Harrigan y col., Neurobiol. Aging 16:779-789, 1995) e induce la muerte de las células nerviosas en ratones transgénicos (Games y col., Nature 373:523-527, 1995; Hsiao y col., Neuron 15:1203-1218, 1995). Además, la inyección de la proteína A\beta del Alzheimer en cerebro de ratas, también produce un deterioro de la memoria y una disfunción neuronal (Flood y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3363-3366, 1991; Br. Res 663:271-276, 1994), dos marcas adicionales de la enfermedad de Alzheimer. Probablemente, la evidencia más convincente de que la sustancia amiloide (es decir, la proteína \beta-amiloide) está implicada directamente en la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer, procede de estudios genéticos. Se ha descubierto que la producción de A\beta puede dar como resultado mutaciones en el gen codificante, su precursor, conocido como la proteína precursora de beta-amiloide (Van Broeckhoven y col., Science 248:1120-1122, 1990; Europ. Neurol. 35:8-19, 1995; Murrell y col., Science 254:97-99, 1991; Haass y col., Nature Med. 1:1291-1296, 1995). Esta proteína precursora cuando se procesa normalmente, normalmente produce sólo muy poca cantidad de A\beta tóxica. La identificación de mutaciones en el gen de la protéina precursora de la sustancia amiloide que causa el inicio precoz de la enfermedad de Alzheimer familiar, es el argumento con más peso de que la sustancia amiloide es el centro del proceso patogénico que subyace en esta enfermedad. Se han descubierto ahora cuatro mutaciones publicadas que causan la enfermedad, lo que muestra la importancia que tiene la proteína beta-amiloide como causa de la enfermedad de Alzheimer familiar (revisado por Hardy, Nature Genet. 1:233-234, 1992). Todos estos estudios sugieren que proporcionar un fármaco para reducir, eliminar o evitar la formación, el depósito, la acumulación y/o la persistencia de A\beta fibrilar en los cerebros de pacientes humanos debería considerarse una terapia eficaz.

Otras enfermedades amiloides

Las "enfermedades amiloides" consisten en un grupo de enfermedades humanas clínica y generalmente no relacionadas, mostrando todas una acumulación marcada en los tejidos de una sustancia extracelular conocida como "amiloide" y que se encuentra generalmente en una cantidad suficiente para impedir la función de un órgano normal. Rokitansky en 1842 (Rokitansky, "Handbuch der pathologischen Anatomie", vol. 3, Braumuller y Seidel, Viena) fue el primero en observar depósitos de tejido con aspecto amorfo y céreo en una variedad de tejidos procedentes de pacientes diferentes. Sin embargo, hasta 1854, Virchow no denominó a estos depósitos "amiloides", (Virchow, Arch. Path. Anat. 8:416, 1854), que significa "semejante a almidón", puesto que daban una tinción positiva en la reacción de ácido sulfúrico-yodo, que se empleaba en los años 1850 para mostrar la celulosa. Aunque la celulosa no es un constituyente de la sustancia amiloide, sin embargo la tinción que observó Virchow se debía probablemente a la presencia de proteoglicanos (PGs) que parecían estar asociados con todos los tipos de depósitos amiloides. El nombre amiloide ha permanecido a pesar del hecho que Friederich y Kekule en 1859 descubrieran la naturaleza proteica de la sustancia amiloide (Friederich y Kekule, Arch. Path. Anat. Physiol. 16:50, 1859). Durante muchos años, basándose en el hecho de que todos los amiloides tenían la misma tinción y propiedades estructurales, se llegó a postular que un único mecanismo patogénico estaba implicado en el depósito de sustancia amiloide y que estos depósitos de sustancia amiloide estaban compuestos por un solo grupo de constituyentes. La investigación actual ha mostrado claramente que la sustancia amiloide no es un depósito uniforme y que la sustancia amiloide puede consistir en diferentes proteínas que no están relacionadas en absoluto (Glenner, N. England J. Med. 302:1283-1292, 1980).

Aunque la naturaleza de la sustancia amiloide misma se ha encontrado que consiste en proteínas completamente diferentes y no relacionadas, toda la sustancia amiloide parece similar cuando se observa bajo el microscopio debido a que la proteína subyacente a la sustancia amiloide es capaz de adaptarse en una estructura fibrilar. Toda la sustancia amiloide, independientemente de la naturaleza de la proteína subyacente 1) se tiñe característicamente con el colorante rojo Congo y muestra una birrefringencia clásica rojo/verde, cuando se observa bajo luz polarizada (Puchtler y col., J. Histochem. Cytochem. 10:355-364, 1962), 2) ultraestructuralmente consiste en fibrillas con un diámetro de 7-10 nanómetros y no están ramificadas, 3) adopta una estructura secundaria predominantemente de lámina-\beta. Por tanto, las fibrillas amiloides observadas bajo un microscopio electrónico (de 30.000 aumentos) procedentes del cerebro de un paciente muerto con la enfermedad de Alzheimer, serán casi idénticas a la apariencia de la sustancia amiloide presente en un riñón sometido a biopsia, procedente de un paciente con artritis reumatoide. Estas dos sustancias amiloides mostrarían un diámetro de la fibrilla similar de 7-10 nanómetros.

En la mitad y final de los años setenta, la sustancia amiloide se clasificó clínicamente en 4 grupos, amiloide primario, amiloide secundario, amiloide familiar y amiloide aislado. El amiloide primario es sustancia amiloide que aparece de nuevo, sin ningún trastorno anterior. En 25-40% de los casos, el amiloide primario era el antecedente de la disfunción de células plasmática, tales como el desarrollo de mieloma múltiple u otros tipos de malignidades de tipo linfocito B. En estos casos, el amiloide aparece más bien antes que después de la enfermedad declarada. El amiloide secundario, aparecía como una complicación de una enfermedad que ya existía previamente. De 10-15% de los pacientes con mieloma múltiple desarrollan eventualmente amiloide (Hanada y col., J. Histochem. Cytochem. 19:1-15, 1971). Los pacientes con artritis reumatoide, osteoartritis, espondilitis anquilosante pueden desarrollar una amiloidosis secundaria más que los pacientes con tuberculosis, abscesos pulmonares y osteomielitis (Benson y Cohen, Arth. Rheum. 22:36-42, 1979; Kamei y col., Acta Path. Jpn. 32:123-133, 1982; McAdam y col., Lancet 2:572-575, 1975). Las personas que emplean fármacos intravenosos que se los autoadministran y que posteriormente desarrollan abscesos crónicos en la piel, también pueden desarrollar amiloides secundarios (Novick, Mt. Sin. J. Med. 46:163-167, 1979). El amiloide secundario también se ha observado en pacientes con malignidades específicas tales como la enfermedad de Hodgkin y el carcinoma celular renal (Husby y col., Cancer Res. 42:1600-1603, 1982). Aunque todos estos están clasificados inicialmente como amiloides secundarios, una vez que se aislaron y secuenciaron las proteínas amiloides, se constató que muchas de estas contenían diferentes proteínas amiloides.

Las formas familiares de sustancia amiloide tampoco mostraban uniformidad en términos del péptido responsable del depósito de la fibrilla amiloide. Se han identificado ahora diversas poblaciones geográficas con formas de sustancia amiloide heredadas genéticamente. Un grupo se encontró en Israel y esta enfermedad se denominó fiebre mediterránea familiar y se caracteriza por un depósito amiloide junto con una inflamación recurrente y fiebre elevada (Mataxas, Kidney 20:676-685, 1981). Otra forma de sustancia amiloide heredado es la polineuropatía amiloidótica familiar y se ha encontrado en las nacionalidades sueca (Skinner y Cohen, Biochem. Biophys. Res. Comm. 99:1326-1332, 1981), portuguesa (Saraiva y col., J. Lab. Clin. Med. 102:590-603, 1983; J. Clin. Invest. 74:104-119, 1984) y japonesa (Tawara y col., J. Lab. Clin. Med. 98:811-822, 1981). El depósito de sustancia amiloide en esta enfermedad tiene lugar predominantemente en los nervios periféricos y autonómicos. La angiopatía amiloide hereditaria de origen islandés es una forma autosómica dominante del depósito amiloide, que afecta principalmente a los vasos en el cerebro y que se ha identificado en un grupo de familias encontrado al oeste de Islandia (Jennson y col., Clin. Genet. 36:368-377, 1989). Estos pacientes tienen clínicamente hemorragias cerebrales muy graves en la juventud que causan generalmente la muerte antes de la edad de 40.

Las formas primaria, secundaria y familiar de sustancia amiloide, descritas anteriormente, tienden a implicar muchos órganos del cuerpo, incluyendo el corazón, el riñón, el hígado, el bazo, el tracto gastrointestinal, la piel, el páncreas y las glándulas adrenales. Estas enfermedades amiloides también se denominan "amiloides sistémicos" puesto que muchos órganos en el cuerpo muestran la acumulación de sustancia amiloide. Para la mayoría de estas amiloidosis, no existe una cura evidente o un tratamiento eficaz y las consecuencias del depósito amiloide pueden ser perjudiciales para el paciente. Por ejemplo, el depósito amiloide en el riñón puede conducir a un fallo renal, mientras que el depósito amiloide en el corazón puede conducir a un fallo cardiaco. Para estos pacientes, la acumulación de sustancia amiloide en los órganos sistémicos conduce al final a la muerte, generalmente en 3 a 5 años.

Las formas aisladas de sustancia amiloide, por otro lado, tienden a implicar a un único sistema orgánico. Los depósitos aislados de sustancia amiloide se han encontrado en el pulmón y en el corazón (Wright y col., Lab. Invest. 30:767-773, 1974; Pitkanen y col., Am. J. Path. 117:391-399, 1984). Hasta el 90% de los pacientes con diabetes de tipo II (forma no dependiente de insulina) tienen depósitos aislados de sustancia amiloide en el páncreas, restringido a las células beta de los islotes de Langerhans (Johnson y col., New Engl. J. Med. 321:513-518, 1989; Lab. Invest. 66:522-535, 1992). Las formas aisladas de sustancia amiloide también se han encontrado también en tumores endocrinos que secretan hormonas polipeptídicas, tales como el carcinoma medular de la tiroides (Butler y Khan, Arch. Path. Lab. Med. 110:647-649, 1986; Berger y col., Virch. Arch. A Path. Anat. Hist. 412:543-551, 1988). Una complicación seria de la hemodiálisis de larga duración es la sustancia amiloide depositada en el nervio medio y asociada clínicamente con el síndrome del túnel carpiano (Gejyo y col., Biochem. Biophys. Res. Comm. 129:701-706, 1985; Kidney Int. 30:385-390, 1986). Además, el tipo más común de sustancia amiloide y el tipo con mayor importancia clínica, específico del órgano y de la sustancia amiloide en general, es el que se encuentra en los cerebros de pacientes con la enfermedad de Alzheimer (véase el documento de patente de EE.UU. nº 4.666.829 y Glenner y Wong, Biochem. Biophys. Res. Comm. 120:885-890, 1984; Masters y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4245-4249, 1985). En esta enfermedad, la sustancia amiloide se limita predominantemente al sistema nervioso central. Un depósito similar de sustancia amiloide en el cerebro, tiene lugar en pacientes con el síndrome de Down, una vez que alcanzan la edad de 35 años (Rumble y col., New England J. Med. 320:1446-1452, 1989; Mann y col., Neurobiol. Aging 10:397-399, 1989). Otros tipos de depósito amiloide en el sistema nervioso central, incluyen enfermedades raras pero altamente infecciosas, conocidas como las enfermedades producidas por priones que incluyen la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, el síndrome de Gerstmann-Straussler y el Kuru (Gajdusek y col., Science 197:943-960, 1977; Prusiner y col., Cell 38:127-134, 1984; Prusiner, Scientific American 251:50-59, 1984; Prusiner y col., Micr. Sc. 2:33-39, 1985; Tateishi y col., Ann. Neurol. 24:35-40, 1988).

Ha sido erróneo agrupar las distintas enfermedades amiloidóticas basándose estrictamente en sus características clínicas, ya que cuando se aislaron y se secuenciaron las proteínas principales implicadas, se constató que eran diferentes. Por ejemplo, la proteína amiloide observada en la artritis reumatoide y la osteoartritis, ahora conocida como amiloide AA, era la misma proteína amiloide identificada en pacientes con la forma familiar de sustancia amiloide conocida como fiebre mediterránea familiar. Para no complicar la situación, se decidió que la mejor clasificación de la sustancia amiloide debe estar de acuerdo con la proteína principal encontrada, una vez que se había aislado, secuenciado e identificado.

Por tanto, la sustancia amiloide se clasifica en la actualidad según la proteína amiloide específica depositada. Las enfermedades amiloides incluyen, sin estar limitadas a las mismas, la sustancia amiloide asociada con la enfermedad de Alzheimer, el síndrome de Down y la hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis del tipo Dutch (en donde la sustancia amiloide específica se sabe ahora que es la proteína beta-amiloide o A\beta), la sustancia amiloide asociada con la inflamación crónica, diversas formas de malignidad y la fiebre mediterránea familiar (amiloide AA o amiloidosis asociada con la inflamación), la sustancia amiloide asociada con mieloma múltiple y otras anormalidades de los linfocitos B (amiloide AL), la sustancia amiloide asociada con la diabetes de tipo II (amilina o amiloide de los islotes), la sustancia amiloide asociada con las enfermedades producidas por priones que incluyen la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, el síndrome de Gerstmann-Straussler, el Kuru y el Scrapie animal (amiloide PrP), la sustancia amiloide asociada con hemodiálisis de larga duración y el síndrome del túnel carpiano (amiloide beta_{2}-microglobulina), la sustancia amiloide asociada con el amiloide cardiaco senil y la polineuropatía amiloidótica familiar (amiloide transtiretina o prealbúmina) y la sustancia amiloide asociada con tumores endocrinos, tales como el carcinoma medular de la tiroides (variantes de la procalcitonina).

Laminina y sus dominios estructurales

La laminina es una glicoproteína grande y compleja de 850 kDa que normalmente se encuentra en la membrana basal y que es producida por una variedad de células que incluyen las células embrionarias, las epiteliales y las tumorales (Foidart y col., Lab. Invest. 42:336-342, 1980; Timpl y col., Methods Enzymol. 82:831-838, 1982). La laminina-1 (se obtiene a partir del tumor de Engelbreth-Holm-Swarm) está compuesta por tres cadenas polipeptídicas diferentes, A, B1 y B2 (también denominadas alfa 1, \beta1 y gamma-1, respectivamente), reunidas en una estructura multidominio que posee tres brazos cortos y un brazo largo (Burgeson y col., Matrix Biol. 14:209-211, 1994). Cada uno de estos brazos se subdivide en dominios globulares y similares a bastones. Los estudios que implican un autoensamblaje in vitro y el análisis de las células que forman la membrana basal, han mostrado que la laminina existe en forma de polímero, formando parte de una red en la membrana basal (Yurchenco y col., J. Biol. Chem. 260:7636-7644, 1985; Yurchenco y col., J. Cell Biol. 117:1119-1133, 1992; Yurchenco y Cheng, J. Biol. Chem. 268:17286-17299, 1993). La laminina se cree que tiene un papel importante en una variedad de procesos biológicos fundamentales que incluyen el apoyo de la migración de la cresta neural (Newgreen y Thiery, Cell Tissue Res. 211:269-291, 1980; Rovasio y col., J. Cell Biol. 96: 462-473, 1983), apoyo del crecimiento de las neuritas (Lander y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:2183-2187, 1985; Bronner-Fraser y Lallier, Cell Biol. 106:1321-1329, 1988), la formación de membranas basales (Kleinman y col., Biochem. 22:4969-4974, 1983), La adhesión de células (Engvall y col., J. Cell Biol. 103:2457-2465, 1986) y es inducible en astrocitos de cerebro de adultos mediante lesión (Liesi y col., EMBO J. 3:683-686, 1984). La laminina interacciona con otros componentes que incluyen el colágeno de tipo IV (Terranova y col., Cell 22:719-726, 1980; Rao y col., Biochem. Biophys. Res. Comm. 128:45-52, 1985; Charonis y col., J. Cell Biol. 100:1848-1853, 1985; Laurie y col., J. Mol. Biol. 189:205-216, 1986), los proteoglicanos de heparán-sulfato (Riopelle y Dow, Brain Res. 525:92-100, 1990; Battaglia y col., Eur. J. Biochem. 208:359-366, 1992) y heparina (Sakashita y col., FEBS Lett. 116:243-246, 1980; Del Rosso y col., Biochem. J. 199:699-704, 1981; Skubitz y col., J. Biol. Chem. 263:4861-4868, 1988).

Se ha observado que diversas funciones de la laminina están asociadas con los brazos cortos. En primer lugar, se ha observado que los brazos cortos participan en la polimerización de la laminina (Yurchenco y col., J. Cell Biol. 117:1119-1133, 1992; Yurchenco y Cheng, J. Biol. Chem. 268:17286-17299, 1993). Una hipótesis propuesta recientemente sobre la polimerización de la laminina mediante interacción de los tres brazos (Yurchenco y Cheng, J. Biol. Chem. 268:17286-17299, 1993) sostiene adicionalmente que el autoensamblaje está mediado por las tres regiones finales de cada uno de los tres brazos cortos. Una hipótesis de este modelo es que cada uno de los brazos cortos puede inhibir independiente y competitivamente la polimerización de la laminina. Sin embargo, no ha sido posible someter a ensayo formalmente esta hipótesis, empleando técnicas bioquímicas convencionales, debido a la imposibilidad de separar las cadenas alfa y gamma. En segundo lugar, se pensaba que diversos sitios de unión a la heparina se encontraban en los brazos cortos (Yurchenco y col., J. Biol. Chem. 265:3981-3991, 1990; Skubitz y col., J. Cell Biol. 115:1137-1148, 1991), aunque la localización de estos sitios ha permanecido confusa. En tercer lugar, se ha observado que la integrina alfa1\beta1 interacciona selectivamente con fragmentos largos del brazo corto que contienen todos los dominios del brazo corto o casi todos (Hall y col., J. Cell Biol. 110:2175-2184, 1990; Goodman ycol., J. Cell Biol. 113:931-941, 1991).

La mayoría de las actividades funcionales de la laminina parece que son dependientes del estado de conformación de la glicoproteína. Específicamente, el autoensamblaje y su dependencia de calcio, la unión del nidogen (entactina) a la laminina, el reconocimiento del brazo largo mediante la integrina alfa6\beta1, la unión de la heparina al dominio G proximal (críptico) y el reconocimiento de la cadena corta A de laminina (críptica) dependiente de RGD, se ha observado que todos dependen de la conformación (Yurchenco y col., J. Biol. Chem. 260:7636-7644, 1985; Fox y col., EMBO J. 10:3137-3146, 1991; Sung y col., J. Cell Biol. 123:1255-1268, 1993). Dos consecuencias de una laminina plegada de forma inconveniente, la pérdida de la actividad funcional normal y la activación de actividades previamente crípticas, sugieren que es importante cartografiar y caracterizar las actividades biológicas, empleando una laminina plegada correctamente u homólogos conformacionales de cualquier laminina en particular o cualquier fragmento de laminina.

La laminina también puede estar implicada en la patogénesis de una variedad de enfermedades relevantes. Por ejemplo, en la diabetes una disminución significativa de los niveles de laminina en las membranas basales glomerulares, indica que tiene lugar un desequilibrio molecular (Shimomura y Spiro, Diabetes 36:374-381, 1987). En la amiloidosis experimental AA (es decir, la amiloidosis asociada con inflamación), se han observado niveles incrementados de laminina en los lugares en los que se deposita el amiloide AA (Lyon y col., Lab. Invest. 64:785-790, 1991). Sin embargo, el papel de la laminina en la amiloidosis sistémica no es conocido. En la enfermedad de Alzheimer y en el síndrome de Down, se cree que la laminina está presente en la proximidad de las placas amiloides que contienen A\beta (Perlmutter y Chui, Brain Res. Bull. 24:677-686, 1990; Murtomaki y col., J. Neurosc. Res. 32:261-273, 1992; Perlmutter y col., Micro. Res. Tech. 28:204-215, 1994).

Estudios previos han indicado que diversas isoformas de las proteínas precursoras de beta-amiloide de la enfermedad de Alzheimer, se unen a las proteínas de la membrana basal, perlecan (Narindrasorasak y col., J. Biol. Chem. 266:12878-12883, 1991) y a la laminina (Narindrasorasak y col., Lab Invest. 67:643-652, 1992). En relación con la laminina, no se conocía previamente si la laminina interacciona con A\beta, si un dominio particular de la laminina (si es que hubiera alguno) participa en las interacciones con A\beta y si la laminina tenía algún papel importante en la fibrilogénesis de la sustancia amiloide A\beta.

La presente invención ha descubierto que la laminina se une a A\beta con una afinidad relativamente alta y que sorprendentemente, la laminina es un potente inhibidor de la formación de la sustancia amiloide A\beta y que provoca la disolución de las fibrillas amiloides preformadas en la enfermedad de Alzheimer. Además, un fragmento de laminina resistente a la elastasa, de 55 kilodalton que también se une a A\beta, ha sido localizado en las repeticiones del dominio globular en la cadena A de la laminina. Esta región se cree que es responsable de muchos de los efectos inhibidores que tiene la laminina sobre la amiloidosis de la enfermedad de Alzheimer. Estos descubrimientos indican que la laminina, los fragmentos proteicos obtenidos a partir de laminina y/o los polipéptidos obtenidos a partir de laminina, particularmente los que contienen el sitio descrito de unión a A\beta en las repeticiones del dominio globular, en la cadena A de la laminina, pueden servir como nuevos inhibidores de la amiloidosis A\beta en la enfermedad de Alzheimer y en otras amiloidosis. Además, el descubrimiento y la identificación de una región que se une a A\beta en el Alzheimer, dentro de las repeticiones del dominio globular de la cadena A de la laminina, y el descubrimiento de su presencia en el suero humano y en el fluido cerebroespinal, como un fragmento obtenido a partir de laminina de 130 kDa, conduce a nuevas aplicaciones terapéuticas para la enfermedad de Alzheimer y para otras amiloidosis.

Descripción adicional de la invención Fragmentos proteicos y polipéptidos obtenidos a partir de laminina

Una aplicación terapéutica de la presente invención es emplear laminina, fragmentos proteicos obtenidos a partir de laminina que se unen a A\beta o a otras proteínas amiloides y/o polipéptidos de laminina obtenidos a partir de la secuenciación de aminoácidos de los fragmentos de laminina que se unen a A\beta (tales como la proteína de \sim130 kilodalton descrita en esta memoria) u otras proteínas amiloides, como potentes inhibidores de la formación, el depósito, la acumulación y/o la persistencia de sustancia amiloide en la enfermedad de Alzheimer y en otras amiloidosis.

Los polipéptidos referidos anteriormente, pueden ser un polipéptido natural, un polipéptido sintético o un polipéptido recombinante. Los fragmentos, los derivados o los análogos de los polipéptidos de cualquier fragmento de laminina a la que se haga referencia en esta memoria, pueden ser a) uno en el que uno o varios de los residuos de aminoácidos estén sustituidos por un residuo de aminoácido conservado o no conservado y tales residuos de aminoácidos sustituidos pueden estar o no codificados por el código genético, o b) uno en el que uno o varios de los residuos de aminoácidos incluyen un grupo sustituyente, o c) uno en el que el polipéptido maduro se fusiona con otro compuesto, tal como un compuesto empleado para incrementar la semi-vida del polipéptido (por ejemplo, polilisina), o d) uno en el que los aminoácidos adicionales se fusionan con el polipéptido maduro, en forma de una secuencia líder o secretora o una secuencia que se emplea para la purificación del polipéptido maduro o una secuencia de proproteína. Tales fragmentos, derivados y análogos se consideran dentro del alcance de la invención.

La estructura terciaria de las proteínas se refiere a la arquitectura tridimensional global de una cadena polipeptídica. La complejidad de la estructura tridimensional surge de la capacidad intrínseca de poder girar enlaces covalentes aislados. El giro de varios de dichos enlaces en una molécula lineal, producirá disposiciones tridimensionales no superponibles y diferentes de los átomos, que generalmente se describe como conformación.

La conformación de las proteínas es un componente esencial de las interacciones proteína-proteína, proteína-sustrato, proteína-agonista, proteína-antagonista. Los cambios en los aminoácidos componentes de las secuencias proteicas pueden dar como resultado cambios que tengan poco efecto o ningún efecto sobre la conformación de la proteína resultante. Al contrario, los cambios en las secuencias peptídicas pueden tener efectos sobre la conformación de la proteína, dando como resultado unas interacciones reducidas o aumentadas del tipo proteína-proteína, etc. Tales cambios y sus efectos se describen en general en Proteins: Structures and Molecular Properties de Thomas Creightonm W.H. Freeman and Company, Nueva York 1984.

La "conformación" y la "similitud en la conformación", cuando se emplean en esta memoria descriptiva, se refieren a una capacidad del polipéptido (o cualquier otra molécula orgánica o inorgánica) para asumir una forma dada, mediante el plegamiento y modos similares, de manera que la forma o la conformación, de la molécula se vuelve una parte esencial de su funcionalidad, a veces hasta la exclusión de su estructura química. Se conoce en general que en los procesos biológicos se pueden intercambiar dos moléculas con conformaciones similares, incluso las que son químicamente diferentes. La "similitud conformacional" se refiere a esta última capacidad de intercambio o de sustitución. Por ejemplo, los fragmentos proteicos de laminina y los obtenidos a partir de laminina, son objeto de la invención porque han mostrado que se unen a la proteína A\beta y la vuelven inactiva en formación fibrilar; se contempla que otras moléculas que sean similares en su conformación a la laminina, o a cualquier fragmento o polipéptido reivindicado de laminina, se pueda sustituir en los métodos reivindicados, para que la A\beta se vuelva inactiva de forma similar, en la fibrilogénesis y en otros procesos amiloides. En general, se contempla que niveles de similitud conformacional que sean del 70% o superiores, son suficientes para asumir una funcionalidad homóloga en los métodos reivindicados, aunque niveles reducidos de similitud conformacional pueden servir del mismo modo. Niveles conformacionales similares de 90% o superiores, deberán proporcionar algún nivel de funcionalidad homóloga adicional.

Por tanto, un experto en la técnica podría prever que se pueden realizar cambios en la secuencia de laminina o en sus fragmentos o polipéptidos, que incrementarían, disminuirían o no tendrían efecto sobre la unión de la laminina o de sus fragmentos, al amiloide A\beta. Además, un experto en la técnica podría prever que diversas modificaciones postraduccionales, tales como la fosforilación, la glicosilación y similares, podrían alterar la unión de la laminina, de fragmentos de laminina o de polipéptidos de laminina al amiloide A\beta.

Los polipéptidos de la presente invención incluyen los polipéptidos o los fragmentos de laminina descritos en esta memoria que incluyen, sin estar limitados a los mismos, la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11, y fragmentos de los mismos, así como polipéptidos que tienen al menos 70% de similitud (preferentemente 70% de identidad) y más preferentemente un 90% de similitud (más preferentemente un 90% de identidad) con los polipéptidos descritos anteriormente.

Los fragmentos o las porciones de los polipéptidos o los fragmentos de laminina de la presente invención se pueden emplear para producir los polipéptidos de longitud completa correspondientes, mediante la síntesis de péptidos; por tanto, los fragmentos se pueden emplear como intermediarios para producir los polipéptidos de longitud completa.

Los polipéptidos de la presente invención pueden ser un producto purificado de forma natural o un producto de procedimientos sintéticos químicos o producido por técnicas recombinantes a partir de un hospedador procarionte o eucarionte (por ejemplo, mediante células bacterianas, de levadura, de vegetales superiores, de insectos y de mamíferos en cultivo). Dependiendo del hospedador empleado en un procedimiento recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden estar glicosilados o no glicosilados. Los polipéptidos de la invención también pueden incluir un residuo inicial del aminoácido metionina.

La síntesis química de polipéptidos es un área de rápido desarrollo en la técnica y los métodos de síntesis de polipéptidos en fase sólida, se describen detalladamente en las siguientes referencias, (Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2154, 1963; Merrifield, Science 232:341-347, 1986; Fields, Int. J. Polypeptide Prot. Res. 35, 161, 1990).

La producción recombinante de polipéptidos de laminina se puede realizar de acuerdo con etapas de métodos conocidos. Los trabajos a modo de referencia estándar, que avanzan los principios generales de la tecnología de ADN recombinante, incluyen Watson, Molecular Biology of the Gene, volúmenes I y II, The Benjamín/Cummings Publishing Inc., editorial, Menlo Park, Calif. 1987; Ausubel y col., compiladores, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, editorial, Nueva York, N.Y., 1987, 1992; y Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory, editorial, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.

Los polipéptidos de la presente invención también se pueden utilizar como reactivos y materiales para investigación, para concebir tratamientos y diagnósticos para enfermedades humanas.

Anticuerpos

Los anticuerpos generados contra los polipéptidos que se corresponden con secuencias específicas que reconocen los fragmentos de laminina de la presente invención, que se unen a A\beta o a otras proteínas amiloides, se pueden obtener directamente mediante inyección de los polipéptidos en un animal o administrando los polipéptidos a un animal, preferentemente uno no humano. El anticuerpo así obtenido se unirá posteriormente a los polipéptidos por si mismo. De este modo, incluso una secuencia que codifica sólo un fragmento de los polipéptidos, se puede emplear para generar anticuerpos que se unen a los polipéptidos completos naturales. Tales anticuerpos se pueden usar a continuación para aislar los polipéptidos a partir de tejido que expresa ese polipéptido. Los polipéptidos preferidos incluyen, sin estar limitados a los mismos, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11, y fragmentos de los mismos, así como polipéptidos que tienen al menos 70% de similitud (preferentemente 70% de identidad) y más preferentemente un 90% de similitud (más preferentemente un 90% de identidad) con los polipéptidos descritos
anteriormente.

El término "anticuerpo" incluirá anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos quimeras, anticuerpos anti-idiotípicos para anticuerpos específicos de fragmentos proteicos obtenidos a partir de laminina o polipéptidos de la presente invención.

Los anticuerpos policlonales son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpos obtenidos a partir del suero de animales inmunizados con un antígeno.

Un anticuerpo monoclonal contiene una población sustancialmente homogénea de anticuerpos específicos de antígenos, cuya población contiene sitios de unión a epítopos, sustancialmente similares. Para la preparación de anticuerpos monoclonales se puede utilizar cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos mediante cultivos continuos de líneas celulares. Ejemplos incluyen la técnica del hibridoma (Kohler y Milstein, Nature 256:495-497, 1975), la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de linfocitos B humanos (Kozbor y col., Immunology Today 4:72, 1983) y la técnica de hibridoma EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole y col., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. págs. 77-96, 1985). Tales anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina, incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, GILD y cualquier subclase de las mismas.

Los anticuerpos quimeras son porciones de moléculas diferentes que se obtienen a partir de diferentes especies animales, tales como los que tienen una región variable obtenida a partir de un anticuerpo monoclonal de múrido, y una región constante de inmunoglobulina humana, los cuales se emplean principalmente para reducir la inmunogenicidad en la aplicación y para incrementar los rendimientos en la producción. Los anticuerpos quimeras y los métodos para su producción se conocen en la técnica (p. ej., Cabilly y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3273-3277, 1984; Harlow y Lane: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).

Un anticuerpo anti-idiotípico es un anticuerpo que reconoce únicamente determinantes asociados generalmente con el sitio de unión al antígeno de un anticuerpo. Un anticuerpo anti-idiotípico se puede preparar inmunizando un animal de la misma especie y tipo genético (p. ej., la estirpe de ratón) que la fuente del anticuerpo monoclonal, con el anticuerpo monoclonal para el cual se está preparando un anticuerpo anti-idiotípico. El animal inmunizado reconocerá y responderá a los determinantes idiotípicos del anticuerpo inmunizante, mediante la producción de un anticuerpo para esos determinantes idiotípicos (el anticuerpo anti-idiotípico). Véase, por ejemplo, el documento de patente de EE.UU. nº 4.699.880.

El término "anticuerpo" también incluirá ambas moléculas intactas, así como fragmentos de las mismas, tales como por ejemplo, Fab y F(ab')_{2} que son capaces de unirse al antígeno. Los fragmentos Fab y F(ab')_{2} carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto, se aclaran más rápidamente de la circulación y pueden unirse al tejido de forma menos inespecífica que un anticuerpo intacto (Wahl y col., J. Nucl. Med. 24:316-325, 1983).

Los anticuerpos o los fragmentos de anticuerpos se pueden utilizar para detectar cuantitativa o cualitativamente la laminina o los fragmentos obtenidos a partir de laminina en una muestra o para detectar la presencia de células que expresan un polipéptido de laminina de la presente invención. Esto se puede realizar mediante técnicas inmunofluorescentes, empleando un anticuerpo marcado con fluorescencia junto con microscopía óptica, detección con citometría de flujo o de forma fluorométrica.

Una de las vías con las que se puede marcar de forma detectable un anticuerpo de un fragmento de laminina, es ligar el mismo con una enzima y emplearlo en un inmunoensayo enzimático (EIA). Esta enzima, a su vez, cuando se expone posteriormente a un sustrato adecuado, reaccionará con el sustrato de modo que produzca un resto químico, el cual se puede detectar, por ejemplo, mediante espectrofotometría, fluorometría o medios visuales. Las enzimas que se pueden usar para marcar de forma detectable el anticuerpo, incluyen, sin estar limitadas a las mismas, la deshidrogenasa de malato, la nucleasa de estafilococos, la delta-5-esteroide-isomerasa, la alcohol-deshidrogenasa de levadura, la deshidrogenasa de alfa-glicerofosfato, la isomerasa de triosa-fosfato, la peroxidasa de rábano picante, la fosfatasa alcalina, la asparaginasa, la oxidasa de glucosa, la beta-galactosidasa, la ribonucleasa, la ureasa, la catalasa, la deshidrogenasa de la glucosa-6-fosfato, la glucoamilasa y la acetil-colinesterasa. La detección se puede realizar mediante métodos colorimétricos que emplean un sustrato cromógeno para la enzima. La detección también se puede realizar mediante comparación visual del grado de reacción enzimática de un sustrato con patrones preparados de forma similar (véase, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1988; Ausubel y col., compiladores, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, N.Y. 1987, 1992).

La detección se puede realizar empleando cualquiera entre una variedad de otros inmunoensayos. Por ejemplo, mediante la radiomarcación de los anticuerpos o de los fragmentos de anticuerpo, es posible detectar la R-PTPasa, a través del uso de un radioinmunoensayo (RIA). Una buena descripción del RIA se puede encontrar en Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, de Work y col., North Holland Publishing Company, NY (1978), haciendo referencia en particular al capítulo titulado "An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques" de Chard. El isótopo radiactivo se puede detectar por modos tales como el uso de un contador gamma, un contador de centelleo o por autorradiografía.

También es posible marcar un polipéptido de un fragmento de laminina con un compuesto fluorescente. Cuando el anticuerpo marcado con fluorescencia se expone a la luz con una longitud de onda adecuada, se puede detectar su presencia debido a la fluorescencia. Entre los compuestos que se marcan con fluorescencia más comunes, se encuentran el isotiocianato de fluoresceína, la rodamina, la ficoeritrina, la ficocianina, la aloficocianina, el o-ftaldehído y la fluorescamina, a disposición comercial, p. ej., en Molecular Probes, Inc. (Eugene, Oregon, EE.UU.).

El anticuerpo también se puede marcar de forma detectable empleando metales que emiten fluorescencia, tales como ^{152}EU u otro de la serie de los lantánidos. Estos metales se pueden acoplar al anticuerpo empleando grupos de metales tales como ácido dietilentriamina pentaacético (EDTA).

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El anticuerpo también se puede marcar de forma detectable acoplándolo a un compuesto quimioluminiscente. La presencia del anticuerpo marcado con quimioluminiscencia se determina a continuación, detectando la presencia de luminiscencia que surge durante el curso de una reacción química. Ejemplos de compuestos particularmente útiles que se marcan con quimioluminiscencia son el luminol, el isoluminol, el éster de acridinio teromático, el imidazol, la sal de acridinio y el éster de oxalato.

De forma similar, se puede utilizar un compuesto bioluminiscente para marcar el anticuerpo de la presente invención. La bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia que se encuentra en sistemas biológicos en los que una proteína catalítica incrementa la eficacia de la reacción quimioluminiscente. La presencia de una proteína quimioluminiscente se determina detectando la presencia de luminiscencia. Los compuestos bioluminiscentes relevantes para los fines de la marcación son luciferina, luciferasa y secuorina.

Los anticuerpos (o fragmentos de los mismos) útiles en la presente invención, se pueden emplear histológicamente en la inmunofluorescencia o en la microscopía inmunoelectrónica, para la detección in situ de un fragmento de laminina de la presente invención. La detección in situ se puede realizar retirando un espécimen histológico de un paciente y proporcionando el anticuerpo marcado de la presente invención a dicho espécimen. El anticuerpo (o el fragmento) se proporciona preferentemente aplicando o sobreponiendo el anticuerpo marcado (o el fragmento) sobre una muestra biológica. Mediante el uso de un procedimiento tal, es posible determinar no sólo la presencia de un polipéptido de un fragmento de laminina, sino también su distribución sobre el tejido examinado. Los expertos en la técnica observarán fácilmente que cualquiera entre una amplia variedad de método histológicos (tales como procedimientos de tinción) se pueden modificar para conseguir dicha detección in situ.

Los anticuerpos contra laminina, fragmentos de laminina y/o polipéptidos obtenidos a partir de laminina, pueden interaccionar con A\beta u otras proteínas amiloides o derivados de las mismas. Estos anticuerpos se pueden utilizar para diversas aplicaciones importantes de diagnóstico y/o terapéuticas, tal y como se describen en esta memoria. Los anticuerpos policlonales y/o monoclonales preparados contra la laminina, fragmentos de laminina y/o polipéptidos obtenidos a partir de laminina que se unen a A\beta u otras proteínas amiloides, se pueden utilizar para análisis de transferencias de tipo Western (empleando técnicas convencionales de transferencia de tipo Western, conocidas por los expertos en la técnica) para detectar la presencia de fragmentos de laminina que se unen a la proteína amiloide o polipéptidos de laminina que se unen a la proteína amiloide en tejidos humanos y en tejidos de otras especies. El análisis de las transferencias de tipo Western se puede utilizar también para determinar el tamaño aparente de cada fragmento de laminina que se une a la proteína amiloide. Además, la transferencia de tipo Western seguida de densitometría de rastreo (conocida por los expertos en la técnica) se puede utilizar para cuantificar y comparar los niveles de cada uno de los fragmentos de laminina en muestras de tejido, fluidos biológicos o biopsias obtenidas a partir de individuos con enfermedades específicas (tales como enfermedades amiloides) en comparación con muestras de tejidos, fluidos biológicos o biopsias obtenidas a partir de individuos normales o de testigos. Los fluidos biológicos incluyen, sin estar limitados a los mismos, la sangre, el plasma, el suero, el fluido cerebroespinal, el esputo, la saliva, la orina y
las heces.

Anticuerpos policlonales y/o monoclonales preparados contra la laminina, fragmentos de laminina y/o péptidos obtenidos a partir de laminina que se unen a A\beta o a otras proteínas amiloides, se pueden utilizar para estudios de inmunoprecipitación (empleando técnicas convencionales de inmunoprecipitación conocidas por los expertos en la técnica) para detectar la laminina, los fragmentos de laminina y/o los péptidos obtenidos a partir de laminina que se unen a A\beta u a otras proteínas amiloides en tejidos, en células y/o en fluidos biológicos. El uso de anticuerpos de laminina, de fragmentos de laminina y/o de péptidos obtenidos a partir de laminina para estudios de inmunoprecipitación, también se puede cuantificar para determinar los niveles relativos de laminina, fragmentos de laminina y/o péptidos obtenidos a partir de laminina que interaccionan con A\beta o con otras proteínas amiloides, en tejidos, en células y/o en fluidos biológicos. La inmunoprecipitación cuantitativa se puede emplear para comparar niveles de laminina, fragmentos de laminina y/o péptidos que se unen a la proteína amiloide de laminina, en muestras de tejidos, fluidos biológicos o biopsias, obtenidas a partir de individuos con enfermedades específicas (tales como las enfermedades amiloides) en comparación con muestras de tejidos, fluidos biológicos o biopsias obtenidas a partir de individuos normales o testigos.

La presente invención proporciona el uso de laminina, fragmentos de laminina y/o polipéptidos obtenidos a partir de laminina, en la fabricación de medicamentos para el tratamiento de una enfermedad amiloide. Las secuencias o los fragmentos de péptidos obtenidos a partir de laminina se pueden sintetizar empleando técnicas convencionales (es decir, empleando un sintetizador automático). La laminina, los fragmentos de laminina y/o los polipéptidos obtenidos a partir de laminina que se unen a A\beta o a otras proteínas amiloides, se pueden emplear como agentes terapéuticos potenciales de bloqueo, para la interacción de la laminina en una variedad de procesos biológicos y enfermedades (tal como en las enfermedades amiloides descritas anteriormente). Los péptidos específicos preparados contra la secuencia de aminoácidos de la laminina contenida en el fragmento de laminina de \sim55 kDa (es decir, las repeticiones globulares dentro de la cadena A de la laminina; SEQ ID NO:3) descritos en la presente invención, se pueden utilizar in vitro para ayudar en la inhibición de la formación, el depósito, la acumulación y/o la persistencia de sustancia amiloide. Los anticuerpos anti-idiotípicos preparados contra la laminina, los fragmentos de laminina y/o los polipéptidos obtenidos a partir de laminina (tal y como se han descrito anteriormente) se pueden proporcionar a un paciente humano como anticuerpos potenciales de bloqueo para interrumpir la continua formación, depósito, acumulación y/o persistencia de sustancia amiloide en el paciente dado.

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Las preparaciones de polipéptidos obtenidos a partir de laminina para la administración parenteral incluyen soluciones estériles acuosas y no acuosas, suspensiones y emulsiones que pueden contener agentes auxiliares o excipientes que son conocidos en la técnica. Las composiciones farmacéuticas tales como píldoras, los comprimidos, las tabletas revestidas, los comprimidos oblongos, las cápsulas de gelatina dura y blanda, las grageas, los sellos, las cápsulas vegetales, gotas líquidas, elixires, suspensiones, emulsiones, soluciones, jarabes, bolsas de té, aerosoles (como un sólido o en un medio líquido), supositorios, soluciones inyectables estériles y/o polvos envasados estériles, se pueden preparar de acuerdo con métodos rutinarios y se conocen en la técnica.

La laminina, los fragmentos de laminina y/o los polipéptidos obtenidos a partir de laminina se pueden utilizar como una terapia eficaz para bloquear la formación, el depósito, la acumulación y/o la persistencia de sustancia amiloide, tal y como se observa en las enfermedades amiloides. Por ejemplo, una composición farmacéutica se puede utilizar en el tratamiento de amiloidosis, comprendiendo una cantidad farmacéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-idiotípico de la laminina, fragmento de laminina y/o polipéptido obtenido a partir de laminina y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones pueden contener el anticuerpo anti-idiotípico de la laminina, los fragmentos de laminina y/o los polipéptidos obtenidos a partir de laminina, de forma no modificada, conjugado con un compuesto potencialmente terapéutico, conjugado con una segunda proteína o una porción de proteína o en forma recombinante (es decir, un anticuerpo quimera o biespecífico de la laminina, los fragmentos de laminina y/o los polipéptidos obtenidos a partir de laminina). Las composiciones pueden incluir adicionalmente otros anticuerpos o conjugados. Las composiciones de anticuerpos se pueden administrar empleando modos convencionales de administración que incluyen, sin estar limitados a los mismos, la vía tópica, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, oral, intralinfática, intramuscular o intralumbar. La administración por vía intravenosa se prefiere. Las composiciones pueden tener una variedad de formas de dosificación, dependiendo la forma preferida del modo de administración y de la aplicación terapéutica. La dosificación óptima y los modos de administración para un paciente individual se pueden determinar fácilmente mediante protocolos convencionales.

La laminina, los fragmentos de proteína obtenida a partir de laminina y los polipéptidos obtenidos a partir de laminina, o los anticuerpos se pueden administrar mediante cualquier medio con el que se consiga el objeto pretendido, por ejemplo, para tratar patologías en las que está implicada la laminina, tales como la enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades amiloides, u otras patologías relacionadas, empleando un polipéptido obtenido a partir de laminina descrito en esta memoria, en forma de una composición farmacéutica.

Por ejemplo, la administración de una composición tal, se puede realizar mediante diversas rutas parenterales tales como la ruta subcutánea, intravenosa, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, transdérmica o bucal. Alternativamente, o en contraposición, la administración puede ser sólo por vía oral. La administración parenteral puede ser por inyección de bolo o mediante perfusión gradual durante un tiempo.

Un modo preferido de emplear un polipéptido obtenido a partir de laminina o una composición farmacéutica de anticuerpo es mediante la administración oral o la aplicación intravenosa.

Un régimen típico para evitar, suprimir o tratar las patologías en las que está implicadas la laminina, tales como la amiloidosis de la enfermedad de Alzheimer, comprende la administración de una cantidad eficaz de polipéptidos obtenidos a partir de laminina, administrados durante un periodo de tiempo de uno a varios días, hasta inclusive una semana y aproximadamente 24 meses.

Se entiende que la dosificación de los polipéptidos obtenidos a partir de laminina, administrados in vivo o in vitro, dependerá de la edad, el sexo, la salud y el peso del receptor, del tipo de tratamiento simultáneo, si es que hubiera alguno, de la frecuencia del tratamiento y de la naturaleza del efecto deseado. La dosificación más preferida se confeccionará para la persona de forma individual, tal y como lo entiende y lo puede determinar un experto en la técnica, sin una experimentación indebida.

La dosis total requerida para cada tratamiento se puede administrar mediante dosis múltiples o en una única dosis. Un polipéptido obtenido a partir de laminina se puede administrar solo o junto con otros agentes terapéuticos dirigidos a patologías en las que está implicada la laminina, tales como la enfermedad de Alzheimer o enfermedades amiloides, tal y como las que se describen en esta memoria.

Las cantidades eficaces de un polipéptido obtenido a partir de laminina o una composición que también puede incluir un anticuerpo obtenido a partir de un fragmento de laminina, son aproximadamente 0,01 \mug hasta aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, y preferentemente desde aproximadamente 10 \mug hasta 50 mg/kg de peso corporal, tales como 0,05, 0,07, 0,09, 0,1, 0,5, 0,7, 0,9, 1, 2, 5, 10, 20, 25, 30, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 mg/kg.

Las preparaciones para la administración parenteral incluyen soluciones acuosas o no acuosas estériles, suspensiones y emulsiones que pueden contener agentes auxiliares o excipientes que se conocen en la técnica. Las composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un polipéptido obtenido a partir de laminina, tales como 1-10 o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 polipéptidos obtenidos a partir de laminina, pueden incluir todas las composiciones en las que el polipéptido obtenido a partir de laminina está contenido en una cantidad eficaz para alcanzar el objeto deseado. Además de al menos un polipéptido obtenido a partir de laminina, una composición farmacéutica puede contener vehículos adecuados, farmacéuticamente aceptables, tales como excipientes, vehículos y/o auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que se pueden utilizar farmacéuticamente.

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Las composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un polipéptido obtenido a partir de laminina o un anticuerpo también pueden incluir soluciones adecuadas para la administración por vía intravenosa, subcutánea, dérmica, oral, mucosa, rectal o puede ser mediante inyección o por vía oral, y contienen desde aproximadamente 0,01 hasta 99 porciento, preferentemente aproximadamente 20 a 75 porciento de componente activo (es decir, polipéptido o anticuerpo) junto con el excipiente. Las composiciones farmacéuticas para administración oral incluyen las píldoras, los comprimidos, las tabletas revestidas, los comprimidos oblongos, las cápsulas de gelatina dura y blanda, las grageas, los sellos, las cápsulas vegetales, gotas líquidas, elixires, suspensiones, emulsiones, soluciones y jarabes.

La laminina, los fragmentos de proteínas obtenidos a partir de laminina y los polipéptidos obtenidos a partir de laminina para la enfermedad de Alzheimer y para otras amiloidosis del sistema nervioso central, se pueden perfeccionar para que crucen la barrera hematoencefálica. Los métodos de introducción incluyen, sin estar limitados a los mismos, la administración sistémica, la administración parenteral, es decir, a través de una vía intraperitoneal, intravenosa, perioral, subcutánea, intramuscular, intraarterial, intradérmica, intranasal, epidural y oral. La laminina, los fragmentos de proteínas obtenidos a partir de laminina y los polipéptidos obtenidos a partir de laminina se pueden administrar directamente al fluido cerebroespinal mediante inyección intraventricular. Será deseable administrar la laminina, los fragmentos de proteínas obtenidos a partir de laminina y los polipéptidos obtenidos a partir de laminina localmente al área o al tejido que requiera el tratamiento; esto se puede conseguir, por ejemplo, y no a modo de limitación, mediante infusión local durante la cirugía, aplicaciones tópicas, mediante inyección, mediante infusión empleando una cánula con bomba osmótica, mediante un catéter, mediante un supositorio o mediante un implante.

La laminina, los fragmentos de proteínas obtenidos a partir de laminina y los polipéptidos obtenidos a partir de laminina se pueden suministrar en un sistema de liberación controlada, tal como una bomba osmótica. Un sistema de liberación controlada se puede colocar cerca de la diana terapéutica, es decir, el cerebro, requiriendo de este modo sólo una fracción de la dosis sistémica.

Los compuestos peptidomiméticos modelados a partir de laminina, fragmentos de laminina y/o polipéptidos obtenidos a partir de laminina, identificados por su unión a A\beta o a otras proteínas amiloides, pueden servir como potentes inhibidores de la formación, el depósito, la acumulación y/o la persistencia de sustancia amiloide en la enfermedad de Alzheimer y en otras amiloidosis. El diseño de compuestos peptidomiméticos se implementa mediante procedimientos convencionales, conocidos por los expertos en la técnica.

Los compuestos que mimetizan el sitio de unión de A\beta tridimensional sobre la laminina, empleando un diseño por ordenador, pueden servir como potentes inhibidores de la formación, el depósito, la acumulación y/o la persistencia en la enfermedad de Alzheimer y en otras amiloidosis. El diseño y la producción de tales compuestos empleando tecnologías de modelado por ordenador, se implementa mediante procedimientos convencionales conocidos por los expertos en la técnica.

La tecnología de ADN recombinante, que incluye la terapia génica humana, se puede aplicar directamente a las proteínas de laminina y a sus fragmentos, de esta invención. Un experto en la técnica puede tomar las secuencias peptídicas descritas en esta memoria y crear secuencias de nucleótidos correspondientes que codifican las secuencias peptídicas correspondientes. Estas secuencias se pueden clonar en vectores tales como vectores retrovíricos y similares. Estos vectores pueden, a su vez, ser transfectados en células humanas tales como hepatocitos o fibroblastos y similares. Tales células transfectadas se pueden introducir en humanos para tratar enfermedades amiloides. Alternativamente, los genes se pueden introducir directamente en los pacientes. Las técnicas básicas de la tecnología de ADN recombinante son conocidas por los expertos en la técnica y se describen en la segunda edición de "Recombinant DNA", Watson y col., W.H. Freeman and Company, Nueva York, 1992.

Los anticuerpos policlonales y/o monoclonales contra la laminina, fragmentos de laminina y/o los polipéptidos obtenidos a partir de laminina, que se unen a A\beta o a otras proteínas amiloides, se podrían utilizar para detectar específicamente la laminina, los fragmentos de laminina y/o péptidos obtenidos a partir de laminina, en tejidos humanos y/o en fluidos biológicos. Los anticuerpos policlonales o monoclonales preparados contra una porción peptídica o un fragmento de laminina, se pueden utilizar para detectar y cuantificar laminina, fragmentos de laminina y/o polipéptidos obtenidos a partir de laminina en tejidos humanos y/o en fluidos biológicos. Los anticuerpos peptídicos monoclonales y/o policlonales también se pueden utilizar para detectar específicamente fragmentos de laminina y/o polipéptidos obtenidos a partir de laminina en tejidos humanos y/o en fluidos biológicos. Un anticuerpo policlonal o monoclonal preparado específicamente contra una porción de péptido o un fragmento de \sim55 kDa de proteína resistente a la elastasa, que se une a A\beta (tal y como se ha descrito anteriormente), se puede utilizar para detectar y cuantificar este fragmento de laminina en tejidos humanos y/o en fluidos biológicos. Un anticuerpo policlonal o monoclonal preparado específicamente contra una porción peptídica o un fragmento de \sim130 kDa de proteína obtenida a partir de laminina, que está presente en fluidos biológicos humanos y que se une a A\beta (tal y como se describe en esta memoria), se puede utilizar para detectar y cuantificar este fragmento de laminina en tejidos humanos y/o en fluidos biológicos. Se pueden preparar también anticuerpos policlonales o monoclonales preparados específicamente para una porción peptídica o un fragmento de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11, así como polipéptidos que tienen al menos 70% de similitud (preferentemente 70% de identidad) y más preferentemente 90% de similitud (más preferentemente 90% de identidad) con los polipéptidos descritos anteriormente.

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Para la detección de fragmentos de laminina y/o polipéptidos obtenidos a partir de laminina descritos anteriormente en tejidos, células y/o cultivos celulares humanos, los anticuerpos policlonales y/o monoclonales se pueden utilizar empleando técnicas convencionales inmunocitoquímicas e inmunohistoquímicas, conocidas por los expertos en la técnica.

Para detectar y cuantificar la laminina, los fragmentos de laminina y/o los polipéptidos obtenidos a partir de laminina en fluidos biológicos, que incluyen el fluido cerebroespinal, la sangre, el plasma, el suero, la orina, el esputo y/o las heces, se pueden utilizar varios tipos de ensayos ELISA, conocidos por los expertos en la técnica. Una molécula de anticuerpo se puede adaptar para uso en un ensayo inmunométrico, también conocido como un ensayo de "dos-sitios" o de tipo "sándwich". En un ensayo inmunométrico típico, una cantidad de anticuerpo sin marcar (o un fragmento de anticuerpo) se une a un soporte o un vehículo sólido, y una cantidad de anticuerpo soluble marcado de forma detectable, se añade para permitir la detección y/o la cuantificación del complejo ternario formado entre el anticuerpo en fase sólida, el antígeno y el anticuerpo marcado.

Un ELISA de tipo "sándwich" se puede utilizar. Empleando este método, se implementa en primer lugar un estudio piloto para determinar la cantidad de unión de cada anticuerpo monoclonal del fragmento de laminina en los pocillos de microtitulación. Una vez que se ha determinado, se permite que partes alícuotas (generalmente en 40 \mul de TBS; pH 7,4) del anticuerpo específico del fragmento de laminina, se unan durante una noche a los pocillos de microtitulación (placas Maxisorb C de Nunc) a 4ºC. Una serie de pocillos vacíos que no contienen ningún anticuerpo monoclonal específico del fragmento de laminina, también se emplea como testigo. Al día siguiente, el anticuerpo monoclonal no unido se retira por agitación de los pocillos de microtitulación. Todos los pocillos de microtitulación (incluyendo los pocillos vacíos) se bloquean a continuación incubando durante 2 horas con 300 \mul de solución salina tamponada con Tris, que contiene 0,05% de Tween-20 (TTBS) más 2% de seroalbúmina de bovino, seguido de 5 lavados con TTBS. A continuación se diluyen 200 \mul de muestra de fluido cerebroespinal, sangre, plasma, suero, orina, esputo y/o heces y/o otro tipo de muestra biológica (para ser determinada empíricamente) en TTBS que contiene 2% de seroalbúmina bovina y se colocan en pocillos (por triplicado) que contienen anticuerpo unido a un fragmento de laminina (o vacíos) y se incuban durante 2 horas a temperatura ambiente. Los pocillos se lavan a continuación 5 veces con TTBS. Después se añade un segundo anticuerpo monoclonal biotinilado contra el mismo fragmento obtenido a partir de laminina (pero que se dirige contra otro epítopo) a cada pocillo (generalmente en 40 \mul de TBS, pH 7,4) y se permite que durante 2 horas a temperatura ambiente, se una a cualquier fragmento de laminina capturado por el primer anticuerpo. Después de la incubación, se lavan los pocillos 5 veces con TTBS. Los materiales unidos se detectan a continuación incubando con 100 \mul de complejo de peroxidasa-avidina (dilución 1:250 en TTBS con 0,1% de BSA) durante una hora en un agitador rotatorio. Después de lavar 5 veces con TTBS, se añade una solución de sustrato (100 \mul, OPD-Sigma Fast de Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO, EE.UU.) y se permite el revelado del color hasta que aparece un cambio significativo de color (generalmente 8-10 minutos). La reacción se detiene con 50 \mul de ácido sulfúrico 4 N y se lee en un espectrofotómetro convencional a 490 nm. Este ELISA se puede utilizar para determinar diferencias en los fragmentos específicos de laminina (y/o en los fragmentos de laminina que se unen a A\beta) en fluidos biológicos, los cuales pueden servir como un marcador para el diagnóstico, para controlar la progresión en un paciente vivo durante la enfermedad (es decir, controlar la enfermedad amiloide, a modo de ejemplo). Además, los cambios cuantitativos en fragmentos de laminina también pueden servir como indicadores del pronóstico, vigilando cómo va a responder un paciente al tratamiento que se dirige contra una enfermedad amiloide dada, tal como la enfermedad de Alzheimer. Tales ensayos se pueden proporcionar en forma de equipo de reactivos.

También se puede emplear un ensayo competitivo en el que los anticuerpos específicos de la laminina, de fragmentos de laminina y/o de polipéptidos obtenidos a partir de laminina se fijan a un soporte sólido y la laminina, los fragmentos de laminina y/o los polipéptidos obtenidos a partir de laminina marcados y una muestra obtenida a partir de un hospedador se hacen pasar a través del soporte sólido y la cantidad de sustancia marcada detectada fijada al soporte sólido se puede correlacionar con la cantidad de laminina, de fragmentos de laminina y/o de polipéptidos obtenidos a partir de laminina en la muestra. Esta técnica convencional es conocida por los expertos en la técnica.

La laminina, los fragmentos de laminina y/o los polipéptidos obtenidos a partir de laminina junto con la laminina, los fragmentos de laminina y/o los anticuerpos peptídicos obtenidos a partir de laminina se pueden utilizar en un ensayo ELISA para detectar laminina, fragmentos de laminina y/o autoanticuerpos peptídicos obtenidos a partir de laminina, potenciales en fluidos biológicos humanos. Un ensayo de diagnóstico de este tipo se puede producir en forma de equipo de reactivos. Los péptidos que contienen las secuencias de laminina, de fragmentos obtenidos a partir de laminina y de polipéptidos obtenidos a partir de laminina, tales como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11, así como los polipéptidos que tienen al menos 70% de similitud (preferentemente 70% de identidad) y más preferentemente 90% de similitud (más preferentemente 90% de identidad) con los polipéptidos descritos anteriormente, se emplearán para unirse inicialmente a los pocillos de microtitulación en una placa de ELISA. Un estudio piloto se implementa en primer lugar para determinar la cantidad de unión de cada polipéptido de un fragmento de laminina, a los pocillos de microtitulación. Una vez que se ha determinado, se permite que partes alícuotas (generalmente 1-2 \mug en 40 \muI de TBS; pH 7,4) de polipéptidos de fragmentos específicos de laminina (tal y como se ha descrito en esta memoria) se unan durante una noche a los pocillos de microtitulación (placas Maxisorb C de Nunc) a 4ºC. Todos los pocillos de microtitulación (que incluyen pocillos vacíos sin polipéptidos de fragmentos de laminina) se bloquean incubando durante 2 horas con 300 \mul de solución salina tamponada con Tris (pH 7,4) con 0,05% de Tween-20 (TTBS) que contiene 2% de albúmina. A continuación se lava 5 veces con TTBS. Los fluidos biológicos de los pacientes (es decir, fluido cerebroespinal, sangre, plasma, suero, esputo, orina y/o heces) se utilizan posteriormente y se diluyen 200 \mul (que se determinarán empíricamente) con TTBS que contiene 2% de seroalbúmina bovina y se colocan en pocillos de microtitulación (por triplicado) que contienen un polipéptido de un fragmento específico de laminina o pocillos vacíos (que no contienen péptido) y se incuban durante 1,5 horas a temperatura ambiente. Cualquier autoanticuerpo presente en los fluidos biológicos para el fragmento de laminina, se unirá al polipéptido (o a sus fragmentos) del fragmento de laminina unido al sustrato. Los pocillos se lavan a continuación 5 veces con TTBS, 100 \mul de IgGs policlonales, antihumanas de cabra y biotiniladas (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, EE.UU.) se diluyen 1:500 en TTBS con 0,1% se seroalbúmina bovina, y a continuación se toman partes alícuotas en cada pocillo. Los materiales unidos se detectan incubando con 100 \mul de complejo de peroxidasa-avidina (dilución 1:250 en TTBS con 0,1% de seroalbúmina bovina) durante 1 hora en un agitador rotatorio. Después de 5 lavados con TTBS, se añade la solución de sustrato (100 \mul, OPD-Sigma Fast de Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, EE.UU.), se permitió el revelado hasta que se observó un cambio significativo de color (generalmente 8-10 minutos). La reacción se detuvo con 50 \mul de ácido sulfúrico 4 N añadidos a cada pocillo y se leyó en un espectrofotómetro convencional a 490 nm. Este sistema de ensayo se puede utilizar no sólo para detectar la presencia de autoanticuerpos para fragmentos de laminina en fluidos biológicos, sino también para vigilar el avance de la enfermedad por una elevación o disminución posterior de los niveles de autoanticuerpo de los fragmentos de laminina. Se cree que los pacientes que muestran una excesiva formación, depósito, acumulación y/o persistencia de los fragmentos de laminina, tal y como se observa en las enfermedades amiloides, también serán portadores de autoanticuerpos contra los fragmentos de laminina en sus fluidos biológicos. Diversos sistemas de ensayos de tipo ELISA, conocidos por los expertos en la técnica, se pueden utilizar para vigilar cuidadosamente el grado de fragmentos de laminina en fluidos biológicos como un indicador potencial de diagnóstico y un marcador de pronóstico para los pacientes, durante el avance de la enfermedad (es decir, vigilar, por ejemplo una enfermedad amiloide). Tales ensayos se pueden proporcionar en forma de equipo de reactivos. Además, los cambios cuantitativos en los niveles de autoanticuerpo contra un fragmento de laminina, también pueden servir como indicadores para el pronóstico, para vigilar cómo responderá un paciente vivo al tratamiento dirigido a una enfermedad amiloide dada.

Otros métodos de diagnóstico que emplean la invención, incluyen los ensayos de diagnóstico para medir niveles alterados de laminina, de fragmentos de laminina y/o de polipéptidos obtenidos a partir de laminina en diversos tejidos, comparados con muestras de tejido normal de testigos. Los ensayos empleados para detectar niveles de laminina, de fragmentos de laminina y/o de polipéptidos obtenidos a partir de laminina en una muestra obtenida a partir de un hospedador, son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen los radioinmunoensayos, los ensayos de unión competitiva, los análisis de transferencias de tipo Western y preferentemente los ensayos de tipo ELISA (tal y como se han descrito anteriormente).

Los anticuerpos que reconocen la laminina, los fragmentos de laminina y/o los polipéptidos obtenidos a partir de laminina, se pueden emplear para marcar, por ejemplo, con un radionucleótido, para la formación de imágenes o cirugía radioguiada, para el diagnóstico in vivo y/o para el diagnóstico in vitro. Los péptidos radiomarcados o los anticuerpos preparados (por un experto en la técnica) contra la laminina, los fragmentos de laminina y/o los polipéptidos obtenidos a partir de laminina, se pueden emplear como técnicas mínimamente invasivas para localizar laminina, fragmentos de laminina y/o polipéptidos obtenidos a partir de laminina y depósitos de sustancia amiloide simultáneos en un paciente vivo. Las mismas técnicas de formación de imágenes se podrían utilizar a continuación en intervalos regulares (es decir, cada 6 meses) para vigilar el avance de la enfermedad amiloide, siguiendo los niveles específicos de laminina, de fragmentos de laminina y/o de polipéptidos obtenidos a partir de laminina.

Se puede discurrir un método que pueda evaluar la capacidad de un compuesto para alterar (disminuir o eliminar) la afinidad de una proteína amiloide dada (tal y como se describe en esta memoria) o de una proteína precursora de sustancia amiloide, hacia la laminina, los fragmentos obtenidos a partir de laminina o los polipéptidos obtenidos a partir de laminina. Proporcionando un método para identificar compuestos que pueden influir en la unión de las proteínas amiloides, o las proteínas precursoras de sustancia amiloide para tales fragmentos obtenidos a partir de laminina, se pueden identificar compuestos que pueden evitar o impedir tal interacción en la unión. Por tanto, se pueden identificar los compuestos que influyen específicamente sobre un proceso ligado a la formación de sustancia amiloide, depósito de sustancia amiloide y/o un estado de persistencia de sustancia amiloide, asociado con la enfermedad de Alzheimer y con otras enfermedades amiloides, tal y como se describen en esta memoria.

Para identificar compuestos que permiten la interacción de proteínas amiloides o de precursores de proteínas, con fragmentos obtenidos a partir de laminina o de polipéptidos de laminina, se inmoviliza o la sustancia amiloide o los fragmentos de laminina y el otro se mantiene como una unidad libre. La unidad libre se pone en contacto con la unidad inmovilizada en presencia de un compuesto del ensayo, durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la unión de la unidad libre a la unidad inmovilizada, después de lo cual, se retira la unidad libre. Empleando anticuerpos que reconocen la unidad libre u otros medios para detectar la presencia de componentes unidos, la cantidad de unidad libre unida a la unidad inmovilizada se puede medir. Al realizar este ensayo en presencia de una serie de concentraciones conocidas del compuesto del ensayo y, como testigo, la ausencia total de compuesto del ensayo, se puede determinar la eficacia del compuesto del ensayo para permitir la unión de la unidad libre a la unidad inmovilizada y se puede realizar una determinación cuantitativa del efecto del compuesto del ensayo sobre la afinidad de la unidad libre con la unidad inmovilizada. Al comparar la afinidad de la unión del complejo del fragmento de amiloide-laminina, en presencia de un compuesto del ensayo, con la afinidad de la unión del complejo fragmento de amiloide-laminina en ausencia de un compuesto del ensayo, se puede determinar la capacidad del compuesto del ensayo para modular
la unión.

En el caso en el que se inmovilice la sustancia amiloide, se pone en contacto con fragmentos obtenidos a partir de laminina libres o con polipéptidos, en presencia de una serie de concentraciones del compuesto del ensayo. Como testigo, la sustancia amiloide inmovilizada se pone en contacto con polipéptidos libres obtenidos a partir de laminina o con fragmentos de los mismos, en ausencia del compuesto del ensayo. Empleando una serie de concentraciones de los polipéptidos obtenidos a partir de laminina, se puede determinar la constante de disociación (K_{d}) u otros indicadores de la afinidad de la unión del fragmento de laminina-amiloide. En el ensayo, después de poner en contacto los polipéptidos obtenidos a partir de laminina o fragmentos de los mismos, con la sustancia amiloide inmovilizada durante un tiempo suficiente para permitir la unión, se retiran los polipéptidos de laminina no unidos. Posteriormente, se puede observar el nivel de unión del fragmento de laminina-amiloide. Un método emplea anticuerpos de fragmentos obtenidos a partir de laminina para detectar la cantidad de fragmentos de laminina específicos, unidos a la sustancia amiloide o la cantidad de fragmentos de laminina libres que quedan en la solución. Esta información se emplea para determinar en primer lugar cualitativamente si el compuesto del ensayo puede permitir o no que continúe la unión entre los fragmentos obtenidos a partir de laminina y de sustancia amiloide. En segundo lugar, los datos recogidos a partir de ensayos realizados empleando una serie de compuestos del ensayo con diferentes concentraciones, se pueden utilizar para medir cuantitativamente la afinidad de la unión del complejo fragmento de laminina-amiloide y determinar de este modo el efecto del compuesto del ensayo sobre la afinidad entre los fragmentos de laminina y de sustancia amiloide. Empleando esta información, se pueden identificar compuestos que no modulan la unión de laminina específica con sustancia amiloide y de este modo permitir que los fragmentos de laminina reduzcan la formación, el depósito, la acumulación y/o la persistencia de sustancia amiloide y el desarrollo posterior y la persistencia de la amiloidosis.

Por tanto, un equipo de reactivos para poner en práctica un método para identificar compuestos útiles que no alteran la unión de la laminina, los fragmentos derivados de laminina o los polipéptidos obtenidos a partir de laminina, a una proteína amiloide inmovilizada, comprenderán a) un primer recipiente que tenga la proteína amiloide inmovilizada en la superficie interna, b) un segundo recipiente que contenga la laminina, los fragmentos obtenidos a partir de laminina o los polipéptidos obtenidos a partir de laminina disueltos en solución, c) un tercer recipiente que contenga anticuerpos específicos para dicha laminina, dichos fragmentos obtenidos a partir de laminina o dichos polipéptidos obtenidos a partir de laminina, estando dichos anticuerpos, disueltos en solución y d) un cuarto recipiente que contenga anticuerpos marcados específicos de laminina, de fragmentos obtenidos a partir de laminina o de polipéptidos obtenidos a partir de laminina, estando dichos anticuerpos disueltos en solución.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan para describir detalladamente las realizaciones preferidas de la interacción de la unión de la laminina con A\beta y los potentes efectos inhibidores de la laminina y de los fragmentos descritos, en la formación de fibrillas de A\beta. Sin embargo, no se debe interpretar que la invención está limitada a estos ejemplos específicos.

Ejemplo 1 Unión de la laminina a la proteína beta-amiloide (A\beta) de la enfermedad de Alzheimer

Se permitió que 2 \mug de A\beta (1-40) (Bachem Inc., Torrance, CA, EE.UU.; lote nº WM365) en 40 \mul de solución salina tamponada con Tris (TBS) (pH 7,0), se unieran durante una noche a 4ºC a pocillos de placas de microtitulación (placas Nunc, Maxisorb). Al día siguiente, se bloquearon todos los pocillos de microtitulación incubando con 300 \mul de solución salina tamponada con Tris que contenía Tris-HCl 100 mM, NaCl 50 mM, 0,05% de Tween-20 y NaN_{3} 3 mM (pH 7,4) (TTBS) más 2% se seroalbúmina bovina (BSA). Se colocaron en pocillos (por triplicado) diversas diluciones (es decir, 1:10, 1:30, 1:90, 1:270, 1:810, 1:2430 y 1:7290) de laminina de tumor de ratones Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) (1 mg/ml) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EE.UU.) en 250 \mul de TBS (pH 7,4), conteniendo cada uno A\beta (1-40) unida al sustrato o estando vacíos, y se permitió la unión durante una noche a 4ºC. Al día siguiente, se aclararon los pocillos 3 veces con TTBS y a continuación se sometieron a ensayo durante 2 horas con 100 \mul de anticuerpo de conejo anti-laminina (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) diluido 1:10.000 en TTBS. Después de tres aclarados con TTBS, los pocillos se incubaron a continuación durante 2 horas en un agitador rotatorio con 100 \mul de sonda secundaria que consistía en anticuerpo de cabra anti-conejo biotinilado (1:1000) y estreptavidina-peroxidasa (dilución 1:500 de una solución de 2 \mug/ml) en TTBS que contenía 0,1% de BSA. Los pocillos se aclararon a continuación 3 veces con TTBS y se añadieron 100 \mul de una solución de sustrato (OPD-Sigma Fast de Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) a cada pocillo y se permitió el revelado hasta que se observaron cambios significativos del color. La reacción se detuvo con 50 \mul de H_{2}SO_{4} 4 N y se realizó la lectura en un lector de microplacas modelo 450 (Biorad, Hercules, CA, EE.UU.) a 490 nm. Los puntos de entrada de datos que representan una media de las determinaciones por triplicado se representaron gráficamente y las constantes de afinidad (es decir, K_{d}) se determinaron empleando Ultrafit (versión 2.1, Biosoft, Cambridge, G.B.) tal y como se describe a continuación.

Los datos de la unión se analizaron asumiendo un equilibrio termodinámico para la formación del complejo BL, a partir del ligando de laminina en solución L y la A\beta sin formar complejo, adsorbida al pocillo de microtitulación, B, según la ecuación:

K_{d} = [B] X [L]/[BL]

Seleccionamos determinar las K_{d} empleando un inmunoensayo ligado a enzima que proporciona una señal con color que es proporcional a la cantidad de laminina sin modificar, unida a A\beta (Engel, J. y Schalch, W., Mol. Immunol 17:675-680, 1980; Mann, K. y col., Eur. J. Biochem. 178:71-80, 1988; Fox, J.W. y col., EMBO J. 10:3137-3146, 1991; Battaglia, C. y col., Eur. J. Biochem. 208:359-366, 1992).

Para justificar la unión no específica potencial, se incluyeron los pocillos testigos sin A\beta (por triplicado) para cada concentración de laminina empleada en cada experimento de ligación. Las densidades ópticas de los pocillos testigos nunca excedían a 0,050 con todas las concentraciones de laminina empleadas para estos experimentos. Las densidades ópticas de los pocillos testigos se descontaron de las densidades ópticas de los pocillos que contenían A\beta que habían recibido concentraciones de laminina similares. La absorbancia no específica obtenida a partir de los pocillos que contenían A\beta, que no recibían laminina, también se descontaron de todas las entradas de datos. Por tanto, la ecuación en forma de:

DO_{exp} = DO_{o}+(S x [laminina])+ (DO_{máx} x [laminina]/([laminina] + K_{d})

en donde (S x [laminina]) representa la unión no específica (pocillos testigo) y DO_{o} es la absorbancia no específica, se vuelve:

DO_{exp} = DO_{máx} x [laminina]/([laminina] + K_{d})

Por tanto, con un 50% de saturación, la DO_{exp} = 0,50 DO_{máx} y K_{d} = [laminina]. La determinación de [laminina] con 50% de saturación se realizó mediante un programa de mínimos cuadrados no lineales (Ultrafit de Biosoft, G.B.) empleando un modelo de un sitio.

Tal y como se muestra en la Figura 1, la laminina EHS se unía a A\beta inmovilizada (1-40) con una sola constante de unión, con una constante de disociación aparente de K_{d} = 2,7 X 10^{-3} M. Diversos experimentos repetidos que emplean este inmunoensayo de unión en fase sólida, indicaban que la laminina se unía a A\beta (1-40) repetidamente con una sola constante de unión aparente.

Ejemplo 2 Inhibición de la formación de fibrillas de A\beta en la enfermedad de Alzheimer mediante laminina

Los efectos de la laminina sobre la fibrilogénesis de A\beta también se determinó empleando el método descrito previamente de la fluorometría con tioflavina T (Naiki y col., Lab. Invest. 65:104-110, 1991; Levine III, Protein Sci. 2:404-410, 1992; Levine III, Int. J. Exp. Clin. Invest. 2:1-6, 1995; Naiki y Nakakuki, Lab. Invest. 74:374-383, 1996). En este ensayo, la tioflavina T se une específicamente al amiloide fibrilar y esta unión produce una mejora de la fluorescencia a 480 nm que es directamente proporcional a la cantidad de fibrillas amiloides formadas (Naiki y col., Lab. Invest. 65:104-110, 1991; Levine 111, Protein Sci. 2:404-410, 1993; Levine III, Int. J. Exp. Clin. Invest. 2:1-6, 1995; Naiki y Nakakuki, Lab. Invest. 74:374-383, 1996). En un primer estudio, se determinaron los efectos de la laminina EHS sobre la fibrilogénesis de A\beta (1-40). Para este estudio, se incubaron 25 \muM de A\beta (1-40) solubilizada recientemente (Bachem Inc., Torrance, CA, EE.UU.; lote nº WM365) en tubos de microcentrífuga a 37ºC durante 1 semana (por triplicado), tanto de forma aislada como en presencia de laminina EHS 100 nM (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, EE.UU.) en Tris 100 mM, NaCl 50 nM, pH 7,0 (TBS). 100 nM de la laminina empleada en estos estudios representaba una proporción molar de A\beta:laminina de 250:1. A continuación, se tomaron 50 \mul de partes alícuotas de cada tubo para analizar durante 1 h, 1 día, 3 días y 1 semana. En un segundo grupo de estudios, los efectos de la laminina sobre la formación de fibrillas de A\beta (1-40) se compararon directamente con otros componentes de la membrana basal que incluían la fibronectina, el colágeno de tipo IV y el perlecan. Para estos estudios, se incubaron 25 \muM de A\beta (1-40) solubilizada recientemente en tubos de microcentrífuga durante 1 semana (por triplicado) de forma aislada o en presencia de 100 nM de perlecan EHS (aislado, tal y como se ha descrito previamente) (Castillo y col., J. Biochem. 120:433-444, 1996), fibronectina (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, EE.UU.) o el colágeno de tipo IV (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, EE.UU.). A continuación se tomaron 50 \mul de partes alícuotas para analizar durante 1 hora, 1 día, 3 días y 1 semana. En un tercer grupo de estudios, se incubaron 25 \muM de A\beta (1-40) solubilizada recientemente, en tubos de microcentrífuga durante 1 semana (por triplicado) de forma aislada o en presencia de concentraciones crecientes de laminina (es decir, 5 nM, 15 nM, 40 nM y 100 nM). Se tomaron 50 \mul de partes alícuotas para analizar durante 1 hora, 1 día, 3 días y 1 semana.

Para cada determinación descrita anteriormente, después de cada periodo de incubación, péptidos A\beta +/- laminina, perlecan, fibronectina o colágeno de tipo IV se añadieron a 1,2 ml de tioflavina T 100 \muM (Sigma Chemicals Col., St. Louis, MO) en tampón fosfato 50 nM (pH 6,0). La emisión de fluorescencia a 480 nm se midió en un fluorómetro Turner, modelo 450, a una longitud de onda de excitación de 450 nm. Para cada determinación, se calibró el fluorómetro, ajustándolo a cero en presencia del reactivo tioflavina T solo y estableciendo 50 ng/ml de riboflavina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) en el reactivo de tioflavina T, a 1800 unidades de fluorescencia. Todas las determinaciones de la fluorescencia se basaban en estas referencias y cualquier fluorescencia de señal de fondo emitida por la laminina, el perlecan, el colágeno de tipo IV o la fibronectina de forma aislada, en presencia del reactivo tioflavina T, se restó siempre de todas las lecturas pertinentes.

Tal y como se muestra en la Figura 2, la A\beta (1-40) suspendida recientemente, seguido de una hora de incubación a 37ºC, mostraba una fluorescencia inicial de 41 unidades de fluorescencia. Durante el periodo de incubación de 1 semana, había un incremento gradual de la fluorescencia de A\beta (1-40) 25 \muM aislada, incrementándose 6,7 veces desde 1 hora hasta 1 semana, con un pico de la fluorescencia de 379 unidades de fluorescencia observado después de 1 semana. Este incremento se inhibía significativamente cuando A\beta (1-40) se incubaba junto con laminina, en comparación con A\beta de forma aislada. La A\beta (1-40) incubada junto con laminina mostraba valores de fluorescencia que eran 2,9 veces menores (p<0,001) al cabo de 1 hora, 4,6 veces menores (p<0,0001) en 1 día, 30,6 veces menores (p<0,0001) en 3 días y 27,1 veces menores (p<0,0001) en una semana. Este estudio indicaba que la laminina era un inhibidor potente de la formación de fibrillas de amiloide A\beta, inhibiendo casi completamente la formación de fibrillas amiloides A\beta incluso después de 1 semana de incubación.

Para determinar si los efectos inhibidores de la laminina eran específicos de este componente de la membrana basal, se realizó una comparación directa con otros componentes de la membrana basal conocidos que incluían perlecan, fibronectina y colágeno de tipo IV. En estos estudios, se incubaron 25 \muM de A\beta (1-40) en ausencia o en presencia de 100 nM de laminina, 100 nM de fibronectina, 100 nM de colágeno de tipo IV y 100 nM de perlecan (Figura 3). La A\beta (1-40) solubilizada recientemente, cuando se incubaba a 37ºC, incrementaba gradualmente los niveles de fluorescencia desde 1 hora hasta 1 semana (hasta 10,8 veces) (Figura 3), tal y como se ha mostrado previamente (Figura 2). El perlecan se encontró que aceleraba significativamente la formación de sustancia amiloide A\beta (1-40) en 1 día y 3 días, mientras que la fibronectina y el colágeno de tipo IV sólo mostraban una inhibición significativa de la fibrilogénesis de A\beta (1-40) al cabo de 1 semana. La laminina, por otro lado, se observó de nuevo que era un potente inhibidor de la fibrilogénesis de A\beta, que causaba una disminución de 9 veces al cabo de 1 y 3 días, y de 21 veces en 1 semana. Este estudio confirmaba de nuevo los efectos inhibidores de la laminina sobre la fibrilogénesis de A\beta y mostraba la especificidad de esta inhibición, puesto que ninguno de los otros componentes de la membrana basal (incluyendo la fibronectina, el colágeno de tipo IV y el perlecan) eran inhibidores muy eficaces.

Para determinar si los efectos inhibidores de la laminina sobre la fibrilogénesis de A\beta eran dependientes de la dosis, se sometieron a ensayo diferentes concentraciones de laminina (es decir, 5 nM, 15 nM, 40 nM y 100 nM). Tal y como se muestra en la Figura 4, la A\beta (1-40) solubilizada recientemente, cuando se incubaba a 37ºC se incrementaba gradualmente desde 1 hora hasta 1 semana, tal y como se ha mostrado previamente (Figuras 2 y 3). Cien nM de laminina inhibían significativamente la formación de fibrillas de A\beta en todos los puntos de tiempo estudiados, que incluían 1 hora, 1 día, 3 días y 7 días. También se observó que la laminina inhibía la formación de fibrillas de A\beta en una forma dependiente de la dosis, que era significativa (p<0,05) al cabo de 3 días de incubación. Al cabo de 3 días y de 7 días, la laminina 100 nM y la 40 nM inhibían ambas significativamente la formación de fibrillas de A\beta. Este estudio confirmaba de nuevo que la laminina era un potente inhibidor de la formación de fibrillas de A\beta y que esta inhibición tenía lugar en una forma dependiente de la dosis.

Ejemplo 3 La laminina causa una disolución dependiente de la dosis de las fibrillas amiloides formadas previamente de la enfermedad de Alzheimer

El siguiente estudio se implementó para determinar si la laminina era capaz de causar una disolución dependiente de la dosis de fibrillas amiloides A\beta (1-40) formadas previamente, de la enfermedad de Alzheimer. Este tipo de actividad será importante para cualquier fármaco potencial anti-amiloide de Alzheimer, el cual se podría utilizar en pacientes que ya tuvieran un depósito sustancial de sustancia amiloide en el cerebro. Por ejemplo, pacientes con la enfermedad de Alzheimer en un estado medio-avanzado de la enfermedad, tienen numerosos depósitos de sustancia amiloide en sus cerebros, formando parte de las placas neuríticas y de depósitos amiloides cerebrovasculares. Un agente terapéutico capaz de causar la disolución de la sustancia amiloide que existe previamente, sería ventajoso para el uso en estos pacientes que están en un estado más avanzado del proceso de la enfermedad.

Para este estudio, se disolvió 1 mg de A\beta (1-40) (Bachem Inc., Torrance, CA, EE.UU.; lote nº WM365) en 1,0 ml de agua bidestilada (1 mg/ml de solución) y se incubó a continuación durante 1 semana a 37ºC. A continuación se incubaron 25 \muM de A\beta fibrilada a 37ºC, en presencia o en ausencia de laminina (procedente de un tumor EHS, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, EE.UU.), con concentraciones de 125 nM, 63 nM, 31 nM y 16 nM que contenían Tris HCl 150 mM, NaCl 10 mM, pH 7,0. Después de 4 días de incubación, se añadieron 50 \mul de partes alícuotas a 1,2 ml de tioflavina T 100 \muM (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) en NaPO_{4} 50 mM (pH 6,0) para las lecturas fluorométricas, tal y como se han descrito en el Ejemplo 2.

Tal y como se muestra en la Figura 5, la disolución de las fibrillas amiloides de A\beta formadas previamente, en la enfermedad de Alzheimer, mediante laminina, tenía lugar en una forma dependiente de la dosis. Se observó una disolución significativa (p<0,001) de 41% de las fibrillas amiloides A\beta formadas previamente con 125 nM de laminina, mientras que 63 nM de laminina causaba una disolución significativa (p<0,001) de 39%. Además, 31 nM y 16 nM de laminina todavía causaban una disolución significativa (p<0,01) de 28% y 25% de las fibrillas amiloides A\beta formadas previamente. Estos datos muestran que la laminina causa la disolución de las fibrillas amiloides de la enfermedad de Alzheimer formadas previamente, en una forma dependiente de la dosis, después de una incubación durante 4 días.

Ejemplo 4 La laminina no inhibe significativamente la formación de fibrillas de polipéptido amiloide de los islotes (amilina)

En el siguiente estudio, la especificidad de los efectos inhibidores de la laminina sobre la sustancia amiloide de la enfermedad de Alzheimer, se determinó sometiendo a ensayo los efectos potenciales de la laminina sobre otro tipo de sustancia amiloide. La acumulación de sustancia amiloide tiene lugar en los islotes de Langerhans en \sim90% de los pacientes con diabetes de tipo II (Westermark y col., Am. J. Path. 127:414-417, 1987). La proteína principal en la sustancia amiloide de los islotes es un péptido de 37 aminoácidos, denominado polipéptido amiloide de los islotes o amilina, que se conoce por ser un producto normal de la secreción de las células beta del páncreas (Cooper y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8628-8632, 1987). Los efectos dependientes de la dosis de la laminina sobre la fibrilogénesis de la amilina, se determinaron empleando el ensayo de fluorometría con tioflavina T, 25 \muM de A\beta (1-40) (Bachem Inc., Torrance, CA, EE.UU.; lote nº WM365) se incubaron en tubos de microcentrífuga a 37ºC durante 1 semana (por triplicado), de forma aislada o en presencia de 5 nM, 15 nM, 40 nM y 100 nM de laminina en Tris HCl 150 mM, NaCl 10 mM, pH 7,0 (TBS). Se tomaron 50 \mul de partes alícuotas de cada tubo para analizar durante 1 h, 1 día, 3 días y 1 semana empleando fluorometría con tioflavina T, tal y como se ha descrito en el ejemplo 2.

Tal y como se muestra en la Figura 6, la amilina suspendida recientemente y aislada, después de 1 hora de incubación a 37ºC, alcanzaba una fluorescencia máxima de 1800 unidades fluorescentes que no cambiaba significativamente durante el periodo experimental de 1 semana. La fluorescencia inicialmente elevada de la amilina, se atribuía a la capacidad de la amilina para formar espontáneamente fibrillas amiloides en un periodo de incubación muy corto. La laminina 100 nM no inhibía significativamente la formación de fibrillas de amilina en ninguno los puntos de tiempo en la semana de periodo experimental (Figura 6). Además, no se observó una inhibición significativa de la fibrilogénesis de amilina con laminina a concentraciones menores (es decir, 40 nM, 15 nM y 5 nM), aunque se observó una disminución (pero no significativa) en la formación de fibrillas de amilina con 40 nM de laminina al cabo de 1 día, 3 días y 1 semana (Figura 6). Este estudio mostraba que los efectos inhibidores de la laminina no tenían lugar con la formación de fibrillas de amilina y mostraba la especificidad de los efectos inhibidores observados de la laminina sobre la sustancia amiloide de la enfermedad de Alzheimer.

Ejemplo 5 Identificación de V8 y de fragmentos de laminina resistentes a la tripsina que interaccionan con la proteína beta-amiloide de la enfermedad de Alzheimer

En el siguiente grupo de estudios, determinamos si los fragmentos pequeños de laminina generados por la digestión con V8 o tripsina, se unirían a A\beta. Esto permitiría determinar el(los) dominio(s) de laminina que se unen a A\beta y que podría tener una función en la inhibición de la formación de fibrillas de A\beta y causar la disolución de las fibrillas amiloides formadas previamente en la enfermedad de Alzheimer (tal y como se muestra en la invención).

Para estos experimentos, la A\beta (1-40) se biotiniló de acuerdo con el protocolo del fabricante (Pierce, Rockford, Illinois). Para los estudios del ligando, se dejó sin digerir laminina EHS intacta o se digirió con V8 o tripsina (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, EE.UU.). Más específicamente, se añadieron 2 \mug de tripsina o de proteasa V8 en 2 \mul de tampón Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) a 50 \mul de laminina (50 \mug) (en el mismo tampón) y se incubó durante una noche a 37ºC. Al día siguiente, se mezclaron 10 \mul de laminina digerida con proteasa (o laminina sin digerir) con 10 \mul de tampón de muestra para electroforesis en gel de 2X dodecil-sulfato sódico y poliacrilamida (SDS-PAGE), y se calentó durante 5 minutos en un baño de agua hirviendo. Se realizó el SDS-PAGE según el método de Laemmli (Laemmli, U.K. Nature 227:680-685, 1970) o según el método de Schägger y Jagow (Schägger y Jagow, Anal. Biochem. 166:368-379, 1987) empleando un sistema de electroforesis de Mini-Protean II (Biorad) con geles prefabricados de poliacrilamida con 4-15% de Tris-glicina o 10-20% de tricina, respectivamente y bajo condiciones no reductoras. La electroforesis tuvo lugar a 200 V durante 45 minutos junto con patrones para el peso molecular teñidos previamente.

Después de realizar el SDS-PAGE (geles con 10-20% de tricina, o 4-15% de Tris-glicina), tal y como se ha descrito previamente, la laminina separada y sus fragmentos (proteína total, 10 \mug/pista) se transfirieron a una membrana de poli(difluoruro de vinilideno) (PVDF), empleando una célula para transferencia de electroforesis Mini transblot (Biorad, Hercules, CA, EE.UU.). La electrotransferencia se realizó a 100 V durante 2 horas. Después de la transferencia, se lavaron las membranas con metanol y se secaron. El(los) fragmento(s) de laminina implicado(s) en la unión a A\beta, se detectaron a continuación empleando A\beta (1-40) biotinilada, tal y como se ha descrito anteriormente. Las transferencias se sometieron a ensayo durante 2 horas con A\beta (1-40) biotinilada 2 \muM en TTBS. Las membranas se lavaron a continuación tres veces (10 segundos cada lavado) con TTBS, se sometieron a ensayo durante 30 minutos con un conjugado de estreptavidina y fosfatasa alcalina (Vectastain), se aclararon de nuevo (tal y como se ha descrito anteriormente) y a continuación se añadió solución de sustrato de fosfatasa alcalina (Vectastain). Después del revelado del color, la reacción se detuvo mediante lavado rápido de las membranas con agua bidestilada.

Tal y como se observa en la Figura 7, la laminina digerida con V8 producía múltiples fragmentos proteicos que interaccionaban con A\beta (1-40) biotinilada. Empleando un sistema de gel de Tris-glicina al 4-15% (Figura 7, pista 1), los fragmentos de laminina resistentes a V8 interaccionaban con A\beta, incluidos fragmentos de \sim400 kDa (que probablemente representaban la laminina intacta que no se había digerido), fragmentos de \sim100-130 kDa, \sim85 kDa y un fragmento destacado de \sim55 kDa. Empleando un sistema de gel de tricina al 10-20% (Figura 7, pista 2), los fragmentos de laminina resistentes a V8 que interaccionaban con A\beta, incluían los fragmentos de \sim130 kDa, \sim85 kDa y un fragmento destacado de \sim55 kDa (Figura 7, pista 2, flecha). Es importante observar que el tamaño molecular expresado en kilodaltons (kDa), es generalmente aproximado. Este estudio mostraba que el fragmento proteico de laminina más pequeño y resistente a V8 que interaccionaba con A\beta (1-40), tenía \sim55 kDa.

Tal y como se muestra en la Figura 8, la laminina digerida con tripsina producía múltiples fragmentos proteicos que interaccionaban con A\beta (1-40) biotinilada. Empleando un sistema de gel de Tris-glicina de 4-15% (Figura 8, pista 1), los fragmentos de laminina resistente a la tripsina que interaccionaban con A\beta, incluyen fragmentos de \sim400 kDa (los cuales representan probablemente la laminina intacta que había quedado sin digerir), \sim150-200 kDa, \sim97 kDa, \sim65 kDa y un fragmento destacado de \sim30 kDa. Empleando un sistema de gel de tricina al 10-20% (Figura 8, pista 2), los fragmentos de laminina resistentes a la tripsina que interaccionaban con A\beta, incluían fragmentos de \sim97 kDa, \sim90 kDa, \sim65 kDa y un fragmento destacado de \sim30 kDa (Figura 8, pista 2, flecha). Este estudio mostraba que el fragmento de laminina más pequeño resistente a la tripsina, que interaccionaba con A\beta (1-40) tenía \sim30 kDa.

Ejemplo 6 Identificación de los fragmentos de laminina resistentes a la elastasa que interaccionan con la proteína beta-amiloide de la enfermedad de Alzheimer

En el siguiente grupo de estudios, determinamos si fragmento(s) pequeño(s) de laminina generados por la digestión con elastasa, se unirían a A\beta. Además, secuenciamos e identificamos la región dentro de la laminina resistente a la elastasa que interaccionaba con A\beta. Para estos experimentos, A\beta (1-40) se biotiniló según el protocolo del fabricante (Pierce, Rockford, Illinois). Para los estudios de ligandos, la laminina EHS intacta se dejó sin digerir o se digirió con elastasa (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, EE.UU.). Para la digestión con elastasa, se añadieron 2 \mug de elastasa en 8 \mul de tampón Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), a 50 \mul de laminina (50 \mug) (en el mismo tampón) y se incubó durante 1,5 horas o 2,5 horas a 37ºC. Adicionalmente, como testigo, se incubaron 2 \mug de elastasa en 50 \mul de tampón Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) durante 2,5 horas a 37ºC. Después de los tiempos de incubación adecuados, tal y como los indicados anteriormente, se mezclaron 10 \mul de cada una de las incubaciones anteriores con 10 \mul de 2X tampón de muestra para electroforesis SDS-PAGE y se calentó durante 5 minutos en un baño con agua hirviendo. El SDS-PAGE se realizó según el método de Laemmli (Laemmli, Nature 227:680-685, 1970) empleando un sistema de electroforesis Mini-Protean II con geles de poliacrilamida prefabricados con Tris-glicina al 4-15% y bajo condiciones no reductoras. La electroforesis tuvo lugar a 200 V durante 45 minutos junto con patrones del peso molecular teñidos previamente (Biorad).

Después de realizar el SDS-PAGE, tal y como se ha descrito anteriormente, los fragmentos de laminina separados se transfirieron a PVDF empleando una célula de transferencia de electroforesis Mini transblot (Millipore, Bedford, MA, EE.UU.). La electrotransferencia se realizó a 100 V durante 2 horas. Después de la transferencia, las membranas se lavaron con metanol, se secaron y se cortaron en dos partes iguales que se emplearon para la transferencia del ligando A\beta o para tinción con azul de Coomassie y una secuenciación posterior de los aminoácidos. El(los) fragmento(s) de laminina implicado(s) en la unión a A\beta, se detectaron a continuación empleando A\beta (1-40) biotinilada, tal y como se ha descrito anteriormente. Las transferencias se sometieron a ensayo durante 2 horas con A\beta (1-40) biotinilada 2 \muM en TTBS. Las membranas se lavaron a continuación tres veces (10 segundos cada vez) con TTBS, se sometieron a ensayo durante 30 minutos con fosfatasa alcalina conjugada con estreptavidina (Vectastain), se aclararon de nuevo (tal y como se ha descrito anteriormente) y a continuación se añadió una solución de sustrato de fosfatasa alcalina (Vectastain). Una vez que se observó color, la reacción se detuvo mediante lavado rápido de las membranas con agua bidestilada.

Para la tinción con azul de Coomassie, las membranas de PVDF se sumergieron en azul de Coomassie Brillante al 0,2% (p/v) en 50% de metanol, 10% de ácido acético y 40% de agua destilada, durante 2 minutos y a continuación se aclararon con 50% de metanol, 10% de ácido acético y 40% de agua destilada hasta que se observaron bandas visibles y se evitó una tinción de la señal de fondo. El fragmento de laminina de 55 kDa que se unía a A\beta, descrito a continuación, se envió a "Biotechnology Service Center" (una instalación para el análisis de secuencias en la Universidad de Toronto, Ontario, Canadá) y se sometió a una secuenciación de los aminoácidos empleando un microsecuenciador en fase gaseosa Porton 2090 (Porton Instruments, Tarzana, CA) con un análisis en-línea de los derivados de feniltiohidantoína.

En la Figura 9, el panel A representa una transferencia del ligando A\beta, mientras que el panel B representa la transferencia equivalente teñida con azul de Coomassie. Tal y como se observa en la Figura 9 (panel A, pistas 2 y 3), la laminina digerida con elastasa producía múltiples fragmentos de proteínas que se unían a A\beta (1-40) biotinilada. El panel A, pista 1 representa laminina EHS de ratón no digerida, mientras que las pistas 2 y 3 representan laminina que se ha digerido con elastasa durante 1,5 horas o 2,5 horas, respectivamente. El panel A, pista 4 representa la digestión con elastasa durante 2,5 horas en ausencia de laminina. La laminina sin digerir (Fig. 9, panel A, pista 1) que interacciona con A\beta, incluía múltiples bandas desde >\sim400 kDa hasta >\sim86 kDa, teniendo lugar la interacción de A\beta más sobresaliente con la laminina intacta (es decir, \sim400 kDa). Los fragmentos proteicos de laminina resistentes a la elastasa que interaccionaban con A\beta (Fig. 9, panel A, pistas 2 y 3) incluían los fragmentos de >\sim400 kDa, \sim130 kDa (punta de flecha), \sim80-90 kDa, \sim65 kDa y una banda destacada en \sim55 kDa (flecha). La interacción de estos fragmentos proteicos de laminina resistentes a la elastasa con A\beta, sólo se observó bajo condiciones no reductoras, sugiriendo que la interacción de A\beta también dependía de la conformación. El fragmento de laminina resistente a la elastasa de 130 kDa que interacciona con A\beta, se cree también que forma parte del fragmento E8 (véase la Figura 11) y es el mismo fragmento proteico de laminina que parece estar presente en el suero humano y en el fluido cerebroespinal (véanse los Ejemplos 10 y 11). La Figura 9, panel A, pista 4 muestra que la banda observada en \sim29 kDa, representa una unión a A\beta no específica, debido a la presencia de la enzima elastasa de forma aislada.

La Figura 9, panel B, muestra todas las múltiples bandas proteicas que se teñían con azul de Coomassie. Obsérvese, por ejemplo, en el panel B, pistas 2 y 3 que la digestión con elastasa de los múltiples fragmentos proteicos producidos de laminina, entre \sim55 kDa y \sim90 kDa, no se unen a A\beta y no se observaron en la transferencia del ligando A\beta (Figura 9, panel A, pistas 2 y 3).

Ejemplo 7 Un dominio de unión a A\beta dentro de la laminina ha sido identificado en las repeticiones globulares de la cadena A de laminina

El fragmento de laminina de 55 kDa (es decir, producido después de 1,5 horas de digestión con elastasa) que muestra una interacción positiva en la unión a A\beta, mediante la transferencia del ligando, se preparó a continuación (Fig. 9, panel B, pista 2, flecha) en grandes cantidades, para la secuenciación de los aminoácidos (tal y como se ha descrito en el Ejemplo 6). Los datos de la secuencia determinaron la posición exacta dentro de la laminina que estaba implicada en la unión a A\beta. Una secuencia de 11 aminoácidos se determinó a partir de la secuenciación de la banda de 55 kDa. La secuencia identificada era:

Leu-His-Arg-Glu-His-Gly-Glu-Leu-Pro-Pro-Glu

(SEQ ID NO:1)

El dominio de unión específica a A\beta dentro de la laminina se identificó a continuación comparando con la secuencia de laminina de ratón conocida (Sasaki y Yamada, J. Biol. Chem. 262:17111-17117, 1987; Sasaki y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 84:935-939, 1987; Durkin y col., Biochem. 27:5198-5204, 1988; Sasaki y col., J. Biol. Chem. 263:16536-16544, 1988), puesto que la laminina EHS de ratón se utilizaba en los estudios de la presente invención. Además, la secuencia completa de aminoácidos dentro de la laminina se recuperó del Centro Nacional de Información Biotecnológica de Bethesda, Maryland, EE.UU.

La Figura 10 muestra la secuencia de aminoácidos completa de la cadena A de la laminina de ratón (Genebank, número de entrada P19137; SEQ ID NO: 4). Se identifica el fragmento proteico de 11 aminoácidos secuenciado, procedente de la proteína de \sim55 kDa dentro de la laminina, que se une a A\beta (Figura 10, subrayado en negrita y punta de flecha; SEQ ID NO: 1) y que se empareja exactamente con la región en la tercera repetición del dominio globular de la cadena A de la laminina (Figura 11). La cuarta repetición del dominio globular de la cadena A de la laminina de ratón, se muestra en SEQ ID NO: 2 (número de entrada de Genebank P19137; aminoácidos nº 2746-2922), mientras que la cuarta repetición del dominio globular de la cadena A de la laminina humana se muestra en SEQ ID NO: 3 (número de entrada de Genebank P25391; aminoácidos nº 2737-2913).

La Figura 11 muestra dos representaciones esquemáticas de laminina (Colognato-Pyke y col., J. Biol. Chem. 270:9398-9406, 1995) y la región de unión a A\beta recientemente descubierta de laminina (mostrada en el panel a la izquierda; entre las dos puntas de flecha) que está situada dentro de los tres últimos dominios globulares de la cadena A de la laminina. El panel de la izquierda de la Figura 11 ilustra la laminina y los fragmentos generados después de digestiones con proteasa. Los fragmentos producidos por la elastasa E1', E1X (borde de línea oscura), E-alfa-35 y E4, corresponden todos a regiones de los brazos cortos de la laminina. Los fragmentos de los brazos largos son E8, E3 y el fragmento C8-9 de la catepsina G. El fragmento E8 producido por la digestión de la laminina con elastasa, contiene los fragmentos del brazo largo que contienen la parte distal del brazo largo y los subdominios 1-3 de G de 130-150 kDa (Yurchenco y Cheng. J. Biol. Chem. 268:17286-17299, 1993). Los fragmentos E3 también producidos por la digestión con elastasa de la laminina, contienen el glóbulo del brazo largo distal con los subdominios 4 y 5 de G. El fragmento E3 mostrado en la Figura 11, panel A, ha mostrado previamente que tiene un doblete en \sim60 kDa y \sim55 kDa (Yurchenco y Cheng, J. Biol. Chem. 268:17286-17299, 1993). Esto también confirma nuestro descubrimiento según el cual, el fragmento de \sim55 kDa que observamos que se unía a A\beta, está localizado dentro de la región E3 de la laminina (Figura 11, panel izquierdo).

El panel de la derecha de la Figura 11 describe el mapa funcional con las cadenas alfa (cadena A), \beta (cadena B1) y gamma (cadena B2) de la laminina que están sombreadas con una oscuridad decreciente. Las repeticiones EGF se indican con barrar en los dominios de varillas del brazo corto. Los dominios, que se basan en los análisis de las secuencias, se indican con números romanos y letras minúsculas. Las posiciones de los sitios de unión a heparina, de formación de polímeros y de unión a la integrina alfa1\beta1 activa, se muestran en negrita para el brazo corto de la cadena alfa. Las funciones del brazo largo de los sitios de unión a heparina (heparina), de reconocimiento de la integrina alfa6\beta1 y para distroglicano (DG), cartografiados en otros estudios, se indican con marcas de sombreado gris. Es interesante observar que la región que se une a A\beta de la laminina, también es una región implicada en la unión a heparina.

Se debe remarcar que las repeticiones del dominio globular de la cadena A de la laminina, interaccionan probablemente con A\beta en un modo dependiente de la conformación, puesto que la interacción de los fragmentos de proteína resistentes a la elastasa de \sim55 kDa, con A\beta sólo se observó bajo condiciones no reductoras.

Ejemplo 8 Identificación de la laminina y de los fragmentos proteicos de laminina en suero humano y en fluido cerebroespinal obtenido a partir de pacientes con la enfermedad de Alzheimer, con diabetes de tipo II y/o normales de edad avanzada

En el siguiente estudio, se emplearon técnicas de transferencia de tipo Western que usaban un anticuerpo policlonal contra la laminina para determinar si la laminina intacta y/o los fragmentos de laminina estaban presentes en el suero humano y en el fluido cerebroespinal obtenidos a partir de pacientes con la enfermedad de Alzheimer, con diabetes de tipo II y/o pacientes normales de edad avanzada. En este estudio, se obtuvo suero humano a partir del Centro de Investigaciones sobre la enfermedad Alzheimer de la Universidad de Washington, a partir de pacientes de edad avanzada vivos que podían haber tenido exámenes del estado mini-mental correspondientes (en donde una puntuación de 30 es normal, una puntuación de 15 sugiere una demencia moderada y una puntuación <10 sugiere demencia grave) o a partir de pacientes de edad avanzada vivos que murieron posteriormente y a los que se había diagnosticado en la autopsia la enfermedad de Alzheimer (después del examen de sus cerebros obtenidos post-mortem). Además se obtuvo suero humano a partir del Centro de Investigaciones de Endocrinología y Diabetes en la Universidad de Washington. Los siguientes sueros humanos se obtuvieron y se analizaron como partes de este estudio; 1) paciente nº 9; una mujer normal de 67 años de edad con una puntuación minimental de 30; 2) paciente nº 5226, una mujer de 70 años de edad con Alzheimer moderado confirmado, que también tenía una puntuación mini-mental de 12; 3) paciente nº 5211, un hombre de 66 años de edad con Alzheimer confirmado que también tenía una puntuación minimental de 25; 4) paciente B, un hombre de 63 años de edad que tenía diabetes de tipo II confirmada; 5) paciente nº 5223, una mujer de 68 años de edad con Alzheimer confirmada que también tenía una puntuación minimental de 22; 6) paciente nº 22, una mujer de 83 años de edad que también tenía una puntuación minimental de 30; 7) paciente nº C, un hombre de 68 años de edad con diabetes de tipo II confirmada. Cada uno de estos sueros se utilizó en este estudio y representan las pistas 1-7 (lado izquierdo) de la Figura 12 (en el mismo orden indicado más arriba).

Además, se obtuvo fluido cerebroespinal a partir del Centro de Investigaciones de la enfermedad de Alzheimer en la Universidad de Washington, a partir de pacientes vivos de edad avanzada que podían haber tenido exámenes del estado minimental correspondiente o procedentes de pacientes vivos de edad avanzada que se habían muerto posteriormente y a los que se había pronosticado en la autopsia la enfermedad de Alzheimer (después del examen de sus cerebros obtenidos post-mortem). Los siguientes fluidos cerebroespinales se obtuvieron como parte de este estudio: 1) paciente nº 6, una mujer normal de 64 años de edad que tenía una puntuación minimental de 30; 2) paciente nº 7, un hombre normal de 67 años de edad que tenía una puntuación minimental de 30; 3) paciente nº 8, una mujer normal de 80 años de edad que había tenido una puntuación minimental de 30; 4) paciente nº 9, una mujer normal de 67 años de edad que había tenido una puntuación minimental de 30; 5) paciente nº 1111P, una mujer normal de 78 años de edad que había tenido una puntuación minimental de 30; 6) paciente nº 50, un paciente masculino de 66 años de edad con una probable enfermedad de Alzheimer moderada, tal y como se indica con una puntuación minimental de 15; 7) paciente nº 54, un hombre de 73 años de edad con probable enfermedad de Alzheimer grave, tal y como se indica con una puntuación minimental de 8. Cada una de estas muestras de fluidos cerebroespinales se utilizó en este estudio y representan las pistas 1-7 (lado derecho) de la Figura 12 (en el mismo orden que más arriba).

Para el estudio, descrito anteriormente, se añadieron 10 \mul de suero humano diluido 1:10 o 10 \mul de fluido cerebroespinal humano no diluido, a 10 \mul de tampón de SDS-PAGE y se prepararon transferencias de ligando como en el Ejemplo 6. Las transferencias se sometieron a ensayo durante 2 horas con un anticuerpo policlonal (empleado en una dilución de 1:10.000 en TTBS) para la laminina EHS (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO). Las membranas se lavaron a continuación 3 veces (10 segundos cada vez) con TTBS y se incubaron durante 1 hora con un anticuerpo secundario de IgG de cabra anti-ratón, biotinilado, diluido 1:1000 con TTBS. Las membranas se aclararon a continuación tres veces (10 segundos cada vez) con TTBS, se sometieron a ensayo durante 30 minutos con un conjugado de estreptavidina y fosfatasa alcalina (Vectastain), se aclararon de nuevo (tal y como se ha descrito anteriormente), seguido de la adición de una solución de sustrato de fosfatasa alcalina (Vectastain). Después de observar el cambio de color, la reacción se detuvo mediante lavado rápido con agua bidestilada.

Tal y como muestra la Figura 12, la laminina intacta (puntas de flecha) estaba presente en el suero humano (pistas 1-7; lado izquierdo) pero no en el fluido cerebroespinal (pistas 1-7, lado derecho). Observaciones cualitativas sugieren que la laminina intacta (tal y como se ha descrito anteriormente) puede haber disminuido en el suero de los pacientes con Alzheimer en comparación con los testigos (es decir, comparando la laminina intacta en la Figura 12, pista 1, individuo normal en el lado izquierdo con la Figura 12, pista 2, paciente con enfermedad de Alzheimer en el lado izquierdo). Además de la laminina intacta, el suero humano obtenido a partir de pacientes con la enfermedad de Alzheimer, con diabetes de tipo II y de pacientes normales de edad avanzada, también contenía laminina inmunorreactiva en una serie de bandas, desde \sim120 kDa (Figura 12, bandas observadas entre las dos flechas). Por otro lado, las muestras de fluido cerebroespinal no contenían laminina intacta (Figura 12, pistas 1-7; lado derecho) pero sólo contenían una serie de fragmentos proteicos inmunorreactivos de laminina desde \sim120 kDa hasta \sim200 kDa (es decir, Figura 12, bandas observadas entre las dos flechas). Este estudio determinaba que una serie de fragmentos proteicos de laminina están presentes, en el suero humano y en el fluido cerebroespinal de pacientes con la enfermedad de Alzheimer, con diabetes de tipo II y en pacientes normales de edad avanzada, mientras que la laminina intacta está sólo presente en el suero humano. El nuevo descubrimiento de fragmentos de laminina en el fluido cerebroespinal, sugiere que se puede utilizar como marcador para determinar el grado de descomposición de la laminina en el cerebro durante la enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades cerebrales.

Ejemplo 9 Identificación de un fragmento proteico de laminina de \sim130 kilodalton en suero humano de pacientes con la enfermedad de Alzheimer, con diabetes de tipo II y pacientes normales de edad avanzada, que se une a A\beta

En el siguiente estudio, se emplearon técnicas de transferencia de ligando de A\beta para identificar si estaba presente la laminina o fragmentos de laminina en el suero humano que se une a A\beta. En este estudio, se obtuvo suero humano a partir del Centro de Investigaciones de la enfermedad de Alzheimer en la Universidad de Washington, partir de pacientes vivos a los que se había sometido a exámenes correspondientes del estado minimental (en donde una puntuación de 30 es normal, una puntuación de 15 sugiere demencia moderada y una puntuación <10 sugiere demencia grave) o a partir de pacientes vivos que se habían muerto posteriormente y a los que se había diagnosticado Alzheimer en la autopsia (después de examinar sus cerebros obtenidos post-mortem). Además, el suero humano se obtuvo a partir del Centro de Investigaciones de Endocrinología y Diabetes en la Universidad de Washington. Las seis primeras muestras de suero humano (es decir, la Figura 13, pistas 1-6) eran las mismas muestras de suero que las indicadas en el Ejemplo 8. Adicionalmente, las pistas 7-10 de la Figura 13 constaban de suero humano obtenido a partir de: pista 7) paciente nº E, un hombre de 54 años de edad con diabetes de tipo II confirmada, pista 8) paciente nº 5230, una mujer de 72 años de edad con Alzheimer moderada, confirmada que tenía una puntuación minimental de 19, pista 9) paciente nº E, un hombre de 54 años de edad con diabetes de tipo II confirmada y pista 10) paciente F, un hombre de 69 años de edad con diabetes de tipo II confirmada.

Para este estudio, se biotiniló A\beta (1-40) según las instrucciones del protocolo del fabricante (Pierce, Rockford, IL). Para los estudios de ligandos, después de una SDS-PAGE tal y como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 8, la laminina separada y sus fragmentos presentes en el suero humano, se transfirieron a una membrana de poli(difluoruro de vinilideno) (PVDF) empleando una célula de transferencia de electroforesis Mini transblot. La electrotransferencia se realizó a 1000 V durante 2 horas. Después de la transferencia, se aclararon las membranas con metanol y se secaron. El(los) fragmento(s) de laminina en el suero humano implicado en la unión a A\beta se detectó a continuación empleando A\beta (1-40) biotinilada. Las transferencias se sometieron a ensayo durante 2 horas con A\beta (1-40) biotinilada 1 \muM en TTBS. Las membranas se aclararon a continuación tres veces (10 segundos cada una) con TTBS, se sometieron a ensayo durante 30 minutos con conjugado de estreptavidina y fosfatasa alcalina (Vectastain), se aclararon de nuevo (tal y como se ha descrito anteriormente) y se continuó con la adición de una solución de sustrato de fosfatasa alcalina (Vectastain). Después de observar color, la reacción se detuvo mediante lavado rápido de las membranas con agua bidestilada.

Tal y como se muestra en la Figura 13, A\beta interaccionaba con laminina humana intacta (flecha) en la mayoría de las muestras de suero humano. Sin embargo, se observó sorprendentemente que la laminina intacta estaba virtualmente ausente en 2 de los sueros de los 4 pacientes con Alzheimer (Fig. 13, pistas 5 y 8), sugiriendo que los fragmentos obtenidos a partir de laminina pueden ser importantes en la enfermedad de Alzheimer como marcadores para diagnóstico. El descubrimiento más interesante era que todos los fragmentos proteicos inmunorreactivos de laminina, se encontraron en el suero humano (es decir, \sim120 kDa hasta \sim200 kDa, bandas observadas entre las flechas, Figura 12, pistas 1-7, lado derecho), sólo se encontró que una banda sobresaliente de 130 kDa interaccionaba con A\beta (Figura 13, punta de flecha). Esta misma banda sobresaliente tiene aproximadamente el mismo peso molecular que la banda E8, generada a partir de la laminina de ratón después de la digestión con elastasa (véase la Figura 9) y que también contiene las repeticiones del dominio globular de la cadena A de laminina. Por tanto, este estudio determinaba que además de la laminina intacta, el suero humano contiene un fragmento de la laminina de \sim130 kDa que se une a A\beta y que puede ser importante para mantener la A\beta soluble en fluidos biológicos, tales como la sangre. Este estudio también sugiere que la determinación cualitativa y cuantitativa de los fragmentos de laminina en el suero humano, podría probar el diagnóstico del grado y de la progresión de la enfermedad de Alzheimer, de la diabetes de tipo II y de otras amiloidosis.

Ejemplo 10 Identificación de un fragmento proteico de laminina de \sim130 kDa en fluido cerebroespinal humano de pacientes con Alzheimer y pacientes normales de edad avanzada, que se une a A\beta

En el siguiente estudio, se emplearon técnicas de transferencia de ligando de A\beta para identificar si los fragmentos proteicos de laminina (<200 kDa) presentes en el fluido cerebroespinal humano, se unen a A\beta. En este estudio, se obtuvo fluido cerebroespinal humano a partir del Centro de Investigaciones de la enfermedad de Alzheimer de la Universidad de Washington, procedente de pacientes vivos de edad avanzada que podían haber tenido exámenes minimentales correspondientes (en donde una puntuación de 30 es normal, una puntuación de 15 sugiere una enfermedad de Alzheimer moderada y una puntuación <10 sugiere una enfermedad de Alzheimer grave) o procedente de pacientes vivos de edad avanzada que habían muerto posteriormente y que en la autopsia se había diagnosticado enfermedad de Alzheimer (después de examinar sus cerebros obtenidos post-mortem). Los siguientes fluidos cerebroespinales humanos se obtuvieron y se analizaron como parte de este estudio (descrito en la Figura 14, pistas 1-10): 1) paciente nº 65 un hombre de 71 años de edad con una probable enfermedad de Alzheimer grave tal y como se indica con una puntuación minimental de 0; 2) paciente nº 54, un hombre de 73 años de edad con probable Alzheimer grave tal y como se indica con una puntuación minimental de 8; 3) paciente nº 6, una mujer normal de 64 años de edad que tiene una puntuación minimental de 30; 4) paciente nº 7, un hombre normal de 67 años de edad que tiene una puntuación minimental de 30; 5) paciente nº 8, una mujer normal de 80 años de edad que tiene una puntuación minimental de 30; 6) paciente nº 9, una mujer normal de 67 años de edad que tiene una puntuación minimental de 30; 7) paciente nº 1111P, una mujer normal de 78 años de edad que tiene una puntuación minimental de 30; 8) paciente nº 50, un paciente masculino de 66 años de edad con probable enfermedad de Alzheimer moderada, tal y como se indica con una puntuación minimental de 15; 9) paciente nº 52, un hombre de 69 años de edad con una probable enfermedad de Alzheimer moderada, tal y como se indica con una puntuación minimental de 16; 10) paciente nº 64, un hombre de 64 años de edad con probable enfermedad de Alzheimer grave, tal y como se indica con una puntuación minimental de 0. Cada una de las muestras de fluido cerebroespinal se empleó en este estudio y representan las pistas 1-10 de la Figura 14 (en el mismo orden que más arriba).

Para este estudio, las transferencias de ligando de A\beta se emplearon tal y como se ha descrito en el Ejemplo 9.
El(los) fragmento(s) de laminina en el fluido cerebroespinal humano implicado en la unión a A\beta, se detectó empleando A\beta (1-40) biotinilada. Las transferencias se sometieron a ensayo durante 2 horas con 50 nM de A\beta (1-40) biotinilada en TTBS. El resto del procedimiento de transferencia del ligando A\beta es tal y como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 9.

Tal y como se muestra en la Figura 14, A\beta interaccionaba con bandas de fragmentos de laminina entre \sim120 kDa y \sim200 kDa en la mayoría de las muestras de fluido cerebroespinal humano. Tal y como se ha observado en el suero humano, la mayoría de las muestras de fluido cerebroespinal humano también contenían un fragmento sobresaliente de laminina de \sim130 kDa (Figura 14, flecha) que interaccionaba con A\beta. Se encontró laminina no intacta que se unía a A\beta en el fluido cerebroespinal humano (no se muestra), tal y como se ha mostrado previamente (Figura 12, Ejemplo 8). De nuevo este mismo fragmento destacado de laminina que se une a A\beta de \sim130 kDa presente en el fluido cerebroespinal humano tiene aproximadamente el mismo peso molecular que la banda E8 generada a partir de laminina y que también contiene las repeticiones del dominio globular de la cadena A de la laminina. Este estudio determina por tanto que el fluido cerebroespinal humano también contiene un fragmento de laminina de \sim130 kDa que se une a A\beta y que puede ser importante para mantener la A\beta soluble en los fluidos biológicos tal como el fluido cerebroespinal.

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(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTES: Gerardo Castillo y Alan Snow

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico de la laminina y de fragmentos proteicos obtenidos a partir de la laminina

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 11

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0.4cm

INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 11 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

NUMERACIÓN DE LOS AMINOÁCIDOS SEGÚN LA TRADUCCIÓN DEL NÚMERO DE ENTRADA DE GENEBANK P19137

\vskip0.800000\baselineskip

TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA

\vskip0.800000\baselineskip

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu His Arg Glu His Gly Glu Leu Pro Pro Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0.4cm

INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 177 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

NUMERACIÓN DE LOS AMINOÁCIDOS SEGÚN LA TRADUCCIÓN DEL NÚMERO DE ENTRADA DE GENEBANK P19137 (AMINOÁCIDOS Nº 2746-2922)

\vskip0.800000\baselineskip

TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA

\vskip0.800000\baselineskip

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 2:

\vskip1.000000\baselineskip

5

\newpage

\hskip0.4cm

INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 177 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

NUMERACIÓN DE LOS AMINOÁCIDOS SEGÚN LA TRADUCCIÓN DEL NÚMERO DE ENTRADA DE GENEBANK P25391 (AMINOÁCIDOS Nº 2737-2913)

\vskip0.800000\baselineskip

TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA

\vskip0.800000\baselineskip

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 3:

\vskip1.000000\baselineskip

6

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0.4cm

INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3084 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

NUMERACIÓN DE LOS AMINOÁCIDOS SEGÚN LA TRADUCCIÓN DEL NÚMERO DE ENTRADA DE GENEBANK P19137

\vskip0.800000\baselineskip

TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA

\vskip0.800000\baselineskip

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 4:

7

8

9

10

11

12

\newpage

\hskip0.4cm

INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3075 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

NUMERACIÓN DE LOS AMINOÁCIDOS SEGÚN LA TRADUCCIÓN DEL NÚMERO DE ENTRADA DE GENEBANK P25391

\vskip0.800000\baselineskip

TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA

\vskip0.800000\baselineskip

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 5:

\vskip1.000000\baselineskip

13

14

15

16

17

18

\newpage

\hskip0.4cm

INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1786 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

NUMERACIÓN DE LOS AMINOÁCIDOS SEGÚN LA TRADUCCIÓN DEL NÚMERO DE ENTRADA DE GENEBANK P07942

\vskip0.800000\baselineskip

TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA

\vskip0.800000\baselineskip

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 6:

\vskip1.000000\baselineskip

19

20

21

22

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0.4cm

INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1786 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

NUMERACIÓN DE LOS AMINOÁCIDOS SEGÚN LA TRADUCCIÓN DEL NÚMERO DE ENTRADA DE GENEBANK P02469

\vskip0.800000\baselineskip

TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA

\vskip0.800000\baselineskip

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 7:

23

24

25

26

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0.4cm

INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1801 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

NUMERACIÓN DE LOS AMINOÁCIDOS SEGÚN LA TRADUCCIÓN DEL NÚMERO DE ENTRADA DE GENEBANK P15800

\vskip0.800000\baselineskip

TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA

\vskip0.800000\baselineskip

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 8:

27

28

29

30

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0.4cm

INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1798 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

NUMERACIÓN DE LOS AMINOÁCIDOS SEGÚN LA TRADUCCIÓN DEL NÚMERO DE ENTRADA DE GENEBANK P55268

\vskip0.800000\baselineskip

TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA

\vskip0.800000\baselineskip

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 9:

31

32

33

34

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0.4cm

INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1607 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

NUMERACIÓN DE LOS AMINOÁCIDOS SEGÚN LA TRADUCCIÓN DEL NÚMERO DE ENTRADA DE GENEBANK P02468

\vskip0.800000\baselineskip

TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA

\vskip0.800000\baselineskip

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 10:

35

36

37

38

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0.4cm

INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1609 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

NUMERACIÓN DE LOS AMINOÁCIDOS SEGÚN LA TRADUCCIÓN DEL NÚMERO DE ENTRADA DE GENEBANK P11047

\vskip0.800000\baselineskip

TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA

\vskip0.800000\baselineskip

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 11:

39

40

41

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

LISTADO DE SECUENCIAS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<110> Gerardo Castillo

\hskip1cm

Alan Snow

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Aplicaciones terapéuticas y para diagnóstico de la laminina y de fragmentos proteicos obtenidos a partir de laminina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> PROTEO.PO3EP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140> 09/938.275

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 2001-08-22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> FastSEQ para la versión 4.0 de Windows

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus Musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<308> Swissprot P19137

\vskip0.400000\baselineskip

<309> 1990-11-01

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu His Arg Glu His Gly Glu Leu Pro Pro Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

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<210> 2

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<211> 177

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<212> PRT

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<213> Mus Musculus

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<300>

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<308> Swissprot P19137

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<309> 1990-11-01

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<400> 2

43

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<210> 3

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<211> 177

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

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<300>

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<308> Swissprot P25391

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<309> 1992-05-01

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<400> 3

45

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<210> 4

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<211> 3084

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<212> PRT

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<213> Mus Musculus

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<300>

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<308> Swissprot P19137

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<309> 1990-11-01

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<400> 4

47

48

49

50

51

52

53

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<210> 5

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<211> 3075

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

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<300>

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<308> Swissprot P25391

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<309> 1992-05-01

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<400> 5

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54

55

56

57

58

59

60

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<210> 6

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<211> 1786

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

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<300>

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<308> Swissprot P07942

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<309> 1988-08-01

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<400> 6

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61

62

64

65

66

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<210> 7

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<211> 1786

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<212> PRT

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<213> Mus Musculus

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<300>

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<308> Swissprot P02469

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<309> 1989-07-01

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<400> 7

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67

68

69

70

71

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<210> 8

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<211> 1801

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<212> PRT

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<213> Rattus Norvegicus

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<300>

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<308> Swissprot P15800

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<309> 1990-04-01

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

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72

73

74

75

76

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<210> 9

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<211> 1798

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

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<300>

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<308> Swissprot P55268

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<309> 1996-10-01

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

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77

78

79

80

81

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<210> 10

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<211> 1607

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<212> PRT

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<213> Mus Musculus

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<300>

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<308> Swissprot P02468

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<309> 1989-07-01

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<400> 10

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82

85

86

87

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<210> 11

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<211> 1609

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

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<300>

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<308> Swissprot P11047

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<309> 1991-11-01

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<400> 11

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89

90

91

92

Claims (11)

1. El uso de laminina o de un fragmento de una proteína de laminina, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad amiloide en un paciente.

2. El uso según la reivindicación 1, en el que se sintetiza la laminina o el fragmento de la misma.

3. El uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el fragmento de laminina comprende una repetición del dominio globular dentro de la cadena A de la laminina o un fragmento de la misma.

4. El uso según cualquier reivindicación anterior, en el que la laminina o el fragmento de la misma se selecciona entre el grupo consistente en laminina humana, laminina de ratón, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y fragmentos de las mismas.

5. El uso según cualquier reivindicación anterior, en donde la enfermedad amiloide es la enfermedad de Alzheimer o el síndrome de Down.

6. El uso según cualquier reivindicación anterior, en donde la laminina o el fragmento de la misma está destinado a la administración con una dosificación entre 0,01 \mug y 100 mg/kg de peso corporal.

7. El uso según la reivindicación 6, en donde la dosificación está entre 10 \mug y 50 mg/kg de peso corporal.

8. Un método in vitro para inhibir o reducir la formación, el depósito o la acumulación de fibrillas de proteína beta-amiloide, comprendiendo el método administrar laminina o un fragmento de una proteína de laminina a un sitio que contiene proteína beta-amiloide.

9. El método según la reivindicación 8, en el que se sintetiza la laminina o el fragmento de la misma.

10. El método según la reivindicación 9 o la reivindicación 10, en el que el fragmento de laminina comprende una repetición del dominio globular dentro de la cadena A de la laminina o de un fragmento de la misma.

11. El método según la reivindicación 9, 10 o 11, en el que la laminina o el fragmento de la misma se selecciona entre el grupo consistente en laminina humana, laminina de ratón, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y fragmentos de las mismas.