CN113508300A - 用于人类阿尔茨海默病的新型生物标记物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于确定发生阿尔茨海默氏病或与所述疾病类似的认知障碍的风险的体外方法，在患有轻度认知障碍的受试者中设计个性化疗法的体外方法和用于筛选易于用预防和/或治疗阿尔茨海默病或与所述疾病类似的认知障碍的疗法治疗的患者的体外方法，基于确定受试者样品中转铁蛋白或功能等同变体中目标丝氨酸，酪氨酸和/或苏氨酸残基的磷酸化水平。本发明还涉及转铁蛋白或其功能等同变体的用途，其中转铁蛋白或变体被磷酸化作为确定具有发展为阿尔茨海默氏病或与阿尔茨海默氏病类似的认知障碍的风险的标志物。最后，本发明涉及一种试剂盒，其包含能够确定转铁蛋白中目标残基的磷酸化水平的试剂，以及所述试剂盒的用途。

Description

用于人类阿尔茨海默病的新型生物标记物

优先申请信息

本申请要求2018年10月4日提交的名称为“用于人类阿尔茨海默病的新型生物标志物”的美国临时专利申请62/741,148的权益，出于所有目的将其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及用于确定发生阿尔茨海默病的风险的方法，以及其方法、用途和试剂盒，以检测有发生阿尔茨海默病或其相关认知障碍的风险的受试者中磷酸化的转铁蛋白。

背景技术

钙离子(Ca²⁺)是最普遍存在的第二信使之一，并且在许多信号传导通路中，尤其是在神经元组织中发挥着关键作用(Kawamoto等人，2012)。钙调蛋白(钙调节蛋白：CaM)是一种细胞内Ca²⁺受体，能够结合四种Ca²⁺离子(Swulius和Waxham，2008)。钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶2(CaMKK2)是丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)激酶，其通过Ca²⁺和CaM结合激活(Racioppi和Means，2012)。活性CaMKK2随后磷酸化并分别激活三种主要的下游激酶CaMKI、CaMKIV和AMPK(Marcelo等人，2016)，其导致了神经突延伸和分支中的细胞生长调控(Wayman等人，2004)、细胞周期调控(Kahl和Means，2004)、能量平衡(Anderson等人，2008；Lin等人，2011；Anderson等人，2012)以及基因表达和蛋白质合成(Oury等人，2010；Lin等人，2015)。CaMKK2在人脑中普遍表达，并且表达最强(Uhlen等人，2015)。CaMKK2的失调与许多人类疾病包括神经退行性和癌症强烈相关(Uhlen等人，2017)。为了了解CaMKK2在神经元中的作用，我们敲低了培养的成年大鼠背根神经节(DRG)神经元中的CaMKK2，并根据净电荷(等电点：pI)和分子量对总细胞蛋白进行了分析。蛋白质谱分析，然后对差异电荷蛋白质的质谱研究确定了CaMKK2敲低DRG神经元中多个氨基酸残基处的磷酸化转铁蛋白(P-TF)的降低。

转铁蛋白(TF)是铁转运糖蛋白。铁是血红素和铁-硫(Fe-S)簇的组成部分，并且是参与代谢反应的众多关键酶的辅助因子(Rouault，2013)。游离铁可促进自由基形成，导致氧化损伤(Gomme等人，2005)。因此，TF可以在氧化还原非活性状态下安全地输送铁。循环的TF捕获主要从肠上皮细胞或网状内皮巨噬细胞释放到血浆中的铁(Abbascound等人，2014)，然后与细胞表面TF受体(TFR)结合并被内化(Gomme等人，2005)。内化的铁可以通过伴侣蛋白被供给至胞质靶蛋白(Philpott，2012)，或被运输至线粒体以合成血红素或Fe-S簇(Barupala等人，2016)，或被储存在胞质铁蛋白中(Arosio等人，2009)。铁代谢失调会导致多种人类疾病，包括铁过载疾病(Fleming和Ponka，2012)、神经退行性脑疾病(Rouault，2013)、动脉粥样硬化(Sullivan，1981)和癌症(Bogdan等人，2016)。

CaMKK2和上游激酶、细胞周期蛋白依赖性激酶5(CDK5)和糖原合成酶激酶3(GSK3)的功能障碍(Green等，2011)，与多种人类疾病有关，包括阿尔茨海默氏病(AD)、帕金森氏病(PD)、2型糖尿病、双相障碍疾病和癌症(Frame和Cohen，2001；Kockeritz等人，2006)。CDK5是一种神经元特异性激酶，其与一系列神经变性疾病包括阿尔茨海默氏病(AD)、帕金森氏病(PD)和亨廷顿病有关(Cheung和Ip，2012；Kawauchi，2014)。此外，另一种CaMKK2上游激酶cAMP依赖性蛋白激酶(PKA)信号的下降(Wayman等人，1997；Cao等人，2011)，也导致了几种神经退行性疾病，包括AD和PD(Dagda和Das Banerjee，2015)。铁水平在衰老的大脑中通常会增加(Bartzokis等人，1997)，但是在AD和PD中，脑中铁含量会急剧增加(Altamura和Muckenthaler，2009)。在AD中，铁聚集在以淀粉样蛋白-β肽(Aβ)为特征的同一大脑区域，例如海马体，顶叶皮层和运动皮层(Dedman等人，1992；Good等人，1992)。在PD中，病理特征之一是神经变性，伴有脑铁积累和弥漫性路易体形成(Altamura和Muckenthaler，2009)。路易体主要由α-突触核蛋白聚集体组成(Goedert，2001)，并且多项研究表明，铁促进了α-突触核蛋白的聚集(Hashimoto等人，1999；Golts等人，2002)。尽管脑铁在这些疾病中积累的原因尚不清楚，但其与神经退行性疾病具有标志性的ROS产生和氧化损伤有关(Altamura和Muckenthaler，2009)。有趣的是，对参与胞吞作用的人类激酶的全基因组分析表明，HeLa细胞中CaMKK2亚型-1的沉默导致扩大的胞质结构中荧光转铁蛋白(TF)的积累减少，表明TF转运存在缺陷(Pelkmans等人，2005)。

发明内容

根据本发明的第一方面，提供了一种筛选患有痴呆症风险的个体以进行痴呆症诊断的方法，该方法包括：

提供个人样品；测量样品中转铁蛋白的至少一个等电点组分的水平；以及将所述至少一种等电点组分的样品水平与来自健康个体的所述至少一种等电点组分的对照水平进行比较，其中对于阳性结果，所述样品水平和所述对照水平是不同的。

根据本发明的另一方面，提供了一种用于筛查有患痴呆症风险的个体以进行痴呆症诊断的方法，该方法包括：

提供个人样品；确定样品的转铁蛋白谱；以及将样本的转铁蛋白谱与来自健康个体的参考值进行比较，其中对于阳性结果，样本的转铁蛋白谱和参考值是不同的。

在第一方面，本发明涉及用于确定受试者中发生阿尔茨海默病或与所述疾病类似的认知障碍风险的体外方法，所述方法包括：

a)测定来自受试者的样品中转铁蛋白或功能等同变体中目标残基的磷酸化水平，和

b)将a)中获得的磷酸化水平与参考值进行比较，

其中与参考值相比，转铁蛋白或功能等同变体中目标残基中磷酸化水平的升高/降低表明所述受试者具有高风险发生阿尔茨海默病或类似于所述疾病的认知障碍。

在第二方面，本发明涉及一种用于在患有轻度认知障碍的受试者中设计个性化疗法的体外方法，该方法包括：

a)在来自受试者的样品中确定转铁蛋白或功能等同变体目标残基的磷酸化水平，和

b)将a)中获得的磷酸化水平与参考值进行比较，

其中与参考值相比转铁蛋白或功能等同变体目标残基磷酸化水平的升高/降低表明所述受试者易于接受预防和/或治疗阿尔茨海默病或与所述疾病相似的认知障碍的疗法。

在第三方面，本发明涉及一种筛选易于用预防和/或治疗阿尔茨海默病或与所述疾病类似的认知障碍的疗法治疗的患者的体外方法，所述方法包括：

a)测定来自受试者的样品中转铁蛋白或功能等同变体中目标残基的磷酸化水平，和

b)将a)中获得的磷酸化水平与参考值进行比较，

其中与参考值相比，转铁蛋白或功能等同变体目标残基的磷酸化水平的升高/降低表明所述受试者是接受预防和/或治疗阿尔茨海默病或与所述疾病相似的认知障碍的疗法的候选者。

在第四方面，本发明涉及转铁蛋白或其功能等同变体的用途，其中所述在目标残基中的转铁蛋白或变体中被磷酸化，作为发生阿尔茨海默病或类似于阿尔茨海默病的认知障碍的风险标志物。

在第五方面，本发明涉及一种试剂盒，其包含能够测定转铁蛋白目标残基的磷酸化水平的试剂，用于测定受试者患阿尔茨海默病或类似于阿尔茨海默病的认知障碍的风险，用于设计受试者的个性化疗法或用于筛选易于用预防和/或治疗阿尔茨海默病或与阿尔茨海默病相似的认知障碍的疗法治疗的患者。

在第六方面，本发明涉及根据本发明的试剂盒在确定受试者发生阿尔茨海默病或类似于所述疾病的认知障碍的风险、用于患有轻度认知损害的受试者设计个性化疗法或用于筛选易于用预防和/或治疗阿尔茨海默病或与阿尔茨海默病相似的认知障碍的疗法治疗的患者的用途。

附图说明

图1：CaMKK2敲低培养的成年原代大鼠DRG神经元中的蛋白质谱。A：CaMKK2基因结构的示意图显示用于敲低CaMKK2的3个siRNA(SEQ ID No1-3)的位置和序列。外显子由垂直线划分。B：显示CaMKK2、TF和GAPDH表达的免疫印迹。CTRL：加扰对照，KD：敲低。基于siRNA递送的LNP在DRG神经元中敲低了98％的CaMKK2。C：显示聚焦蛋白的经Oriole染色的IEF/SDS-PAGE凝胶。文中描述了详细的方法。绿色和蓝色矩形标记的区域显示带电荷的蛋白质部分的显著差异。凝胶图像为假色，并覆盖D上以突出差异。罗马数字表示用于凝胶内胰蛋白酶消化和蛋白质质谱鉴定的凝胶点。F：表中总结了质谱分析结果log(e)：以随机进行任何特定蛋白质分配的预期以10为底的log(E值)。

图2：CaMKK2敲低DRG神经元中降低的P-TF(pH～3-4部分)。A：显示CaMKK2、GAPDH和TF在CaMKK2在敲低的DRG神经元中的相对表达的免疫印迹。CTRL：加扰对照，KD：敲低。B：显示DRG神经元中TF的带电荷部分的免疫印迹。红色矩形表示原始TF的pH/pI～3、～5-6和～9-10部分。蓝色矩形表示TF的较高分子量形式，这可能是由于翻译后修饰赋予质量。C：显示CaMKK2敲低细胞中P-TF的相对百分比的散点图。相对于pH～9-10的部分计算百分比。N＝6，来自3个独立实验。通过t检验测定P值(未配对)。

图3：CaMKK2敲除小鼠DRG组织中TF的丰度降低和磷酸化改变。A：在成年、出生后(P7)和胚胎15.5期脊髓和DRGs中TF启动子捕获的GFP报道基因的表达(始建系：IF181)。上图：GFP-免疫染色石蜡包埋切片。下图：冷冻切片中的GFP荧光。图像获自美国纽约洛克菲勒大学(Rockefeller University)GENSAT项目。B：分别显示CaMKK2、TF和ERK1/2在成年小鼠DRG组织中表达的免疫印迹。C：，显示DRG组织中TF的相对量的散点图(归一化为ERK1/2)。N＝8，每个类别中的4只小鼠的重复，p值通过t-检验(未配对)。D：显示DRG组织中TF的带电荷部分的免疫印迹。矩形区域表示在不同pH下TF电荷的改变。红色和黑色箭头表示TF带电部分的差异。底部的2个图表示2只CaMKK2 KO小鼠的免疫印迹。E：显示了从D中显示的3种免疫印迹的矩形区域获得的相对强度与像素距离的关系的叠加线图。3个点用阿拉伯数字编号。黑色箭头表示变化显著。F：显示E中峰“2”的相对强度的散点图。在CaMKK2 KO小鼠中完全不存在峰2。红色箭头表示TF pH～3部分转变为酸性更低的pH。

图4：CaMKK2 KO小脑和嗅球组织中TF的丰度增加和磷酸化降低。A：TF启动子捕获的GFP报道基因在成人脑组织中的表达(始建系：IF181)。上图：GFP免疫染色石蜡包埋切片。下图：冷冻切片中的GFP荧光。图像获自美国纽约洛克菲勒大学(Rockefeller University)GENSAT项目。B&F：显示CaMKK2、GAPDH、TF、核仁素(B23)和VDAC1在成年小鼠嗅球和小脑组织中表达的免疫印迹。C&G：显示归一化为GAPDH/B23的TF的相对量的散点图。分别从3只KO小鼠和野生型小鼠中重复N＝10/5，p值通过t-检验测定(未配对)。D&H：显示TF的带电荷部分(PTMs)的免疫印迹。矩形区域表示在不同pH值下TF电荷的改变。蓝色矩形表示赋予额外质量的PTM。E&I：显示TF pH～3部分的相对量的散点图。N＝2，分别从3只KO小鼠和野生型小鼠中重复。通过t-检验测定p值(未配对)。将pH～3部分的强度归一化为pH～10部分的百分比(红色虚线矩形)，并在E中绘制。

图5：CaMKK2 KO大脑皮层和肝组织中TF的丰度和磷酸化。A&E：显示CaMKK2、TF、VDAC1和组蛋白-1(H1)的表达的免疫印迹。B&F：显示TF的相对量的散点图(分别归一化为VDAC1/H1)。N＝8/6，分别从3只CaMKK2 KO小鼠和野生型小鼠中重复。C&G：显示TF的带电荷部分的免疫印迹。矩形区域表示在不同pH值下TF电荷的改变。每个印迹代表单个小鼠。D&H：显示TF pH～3-4部分的相对量的散点图。N＝8/9，分别从3只KO小鼠和野生型小鼠中重复。将TF pH～3-4部分(红色矩形)的强度标归一化为pH～5-6部分(黑色/绿色矩形)的百分比并作图。通过t检验测定P值(未配对)。

图6：CaMKK2敲低DRG神经元中TF的细胞囊泡异常运输：A-B：显示培养的DRG神经元中细胞渗透性TMR-配体标记的Halo-TF的细胞内定位的实时共聚焦图像。Halo-TF在加扰对照和CaMKK2敲低培养的成年大鼠原代DRG神经元中表达48小时，并用细胞渗透Halo-TMR试剂标记，并进行实时成像。Halo-TMR通过氯代烷烃(反应性连接基)基团与Halo-Tag中的Phe272残基共价连接到Halo-tag上。白色箭头表示神经突，蓝色矩形表示核周体。核周体以更高的放大率成像，并显示在右图中。Z：Z维光学切片。C：B中标记区域的阈值调整和去斑图像。使用ImageJ自动颗粒计数插件(Sbalzarini和Koumouskos，2005)对TMR-halo-TF阳性囊泡颗粒(蓝色箭头)定量。参数如下：循环-0-1(0＝无限延长的多边形至1＝完美的圆)，粒度50-50,000像素。标尺-5μM。D：显示核周体/神经元中颗粒计数的晶须图。N＝50，来自2个独立研究的重复，通过t-检验测定p值(未配对)。E：D中所示数据的分级(Binning)。F：显示TRM-halo-TF和Rab5/Rab 1在培养的DRG神经元中的共定位的免疫荧光图像。小的GTP酶-Rab5是早期的内体小泡特异性标记，Rab11主要与循环内体有关(Mills等人，2010)。标尺-5μM。白色箭头表示泡状结构。

图7：3xTg-AD小鼠中P-CaMKK2和P-TF的改变。A：显示在6个月雌性野生型和3xTg-AD小鼠中CaMKK2亚型1和2(isoform 1和2)的带电荷部分的免疫印迹。彩色箭头表示不同的带电部分。使用线性pH4-7的IPG胶条来分辨紧密间隔的CaMKK2带电部分。B：显示聚焦的CaMKK2亚型-1斑点的相对强度的分布曲线。C：显示CaMKK2亚型-1的相对更带负电荷的部分(红色箭头)的相对百分比的散点图。黑色箭头标记的点用于归一化。D-E：显示TF带电荷的部分的免疫印迹。彩色矩形表示不同的带电部分。F-G：显示TF的pH～3部分的相对强度的散点图。pH～5-6部分的强度用于归一化。N＝6，来自每个分类中3只小鼠的重复。通过t检验测定P值(未配对)。

图8：在3xTg-AD中TF和CaMKK2相关蛋白复合物的改变。A-B：分别显示DRG、大脑皮层和DRG组织中TF和CaMKK2相关蛋白质复合物的免疫印迹。垂直虚线表示共迁移的蛋白质复合物的垂直排列。彩色圆圈表示不同的蛋白质复合物，ns：非特异性的。上图中考马斯染色的凝胶条带表示天然分子量梯度。C：显示～1000kDa TF相关蛋白复合物的相对强度的散点图。使用～720kDa的复合物进行归一化。D：显示血清中TF水平的免疫印迹。下图：Oriole染色的SDS-PAGE凝胶用以显示总蛋白上样量。E：显示血清中TF的带电荷部分的免疫印迹。红色虚线矩形表示TF带负电荷的部分。蓝色虚线矩形表示高分子量d的TF PTMs。F：显示血清中P-TF的相对丰度的散点图。pH～3部分根据pH～6部分的强度进行归一化(蓝色矩形)，N＝6，所有实验在3只小鼠中重复，通过t检验测定P值(未配对)。

图9：从早期和晚期3xTg-AD和年龄匹配的对照小鼠获得的血清样品中TF的相对丰度和磷酸化。A&D：上图：显示血清中TF水平的免疫印迹。下图：Oriole染色的SDS-PAGE凝胶用以显示总蛋白上样量。黑色箭头表示用于归一化的TF量。B：显示血清中TF的相对丰度的散点图。N＝8(每个类别中在4只小鼠中重复2次)。通过t检验测定P值(未配对)。C&F：显示TF的带电荷部分的免疫印迹。C中的红色虚线矩形表示TF的负电荷部分。F中的彩色虚线矩形表示TF不同的电荷部分。

图10：CSFs和从死后人早发性期阿尔茨海默病(EOAD)患者获得匹配的血清中TF的相对丰度和磷酸化。A&B：上图：显示CSF和匹配血清中TF表达的免疫印迹。下图：Oriole染色的SDS-PAGE凝胶用以显示总蛋白上样量。在每条泳道中分别上样CSFs(15μl)和血清(3μl)。黑色箭头表示用于TF表达归一化的条带。C：显示TF的相对丰度的散点图，N＝4(2个样品重复2次)。通过t检验测定P值(未配对)。D&E：显示TF的带电荷部分的免疫印迹。红色虚线矩形表示TF的负电荷部分。F：显示E中免疫印迹中聚焦斑点的相对强度的图谱。G：表示详细患者信息的表格。

图11：从死后人EOAD患者中获得的CSF中TF的相对丰度和磷酸化。A：上图：显示在CSF中TF的表达的免疫印迹。下图：Oriole染色的SDS-PAGE凝胶用以显示总蛋白上样量。在每条泳道中分别上样CSF(15μl)和血清(3μl)。黑色箭头表示用于CSF和血清中TF表达归一化的条带。B：显示在EOAD CSFs和匹配的血清样品中TF的相对丰度的散点图，N＝2/3(每个类别重复2次)。通过t检验测定P值(未配对)。C：显示TF的带电荷部分的免疫印迹。红色虚线矩形表示TF的负电荷部分。D：图C和图10D中显示的免疫印迹中聚焦斑点的相对强度的图谱。灰色矩形显示AD(除了2个样品)中P-TF的损失。E：表示详细患者信息的表格。

图12：从死后的人迟发性阿尔茨海默病(LOAD)患者获得的CSFs中TF的相对丰度和磷酸化。A&B：上图：显示CSF和匹配血清中TF表达的免疫印迹。下图：Oriole染色的SDS-PAGE凝胶用以显示总蛋白上样量。在每条泳道中分别上样CSF(15μl)和血清(3μl)。C&D：显示TF的带电荷部分的免疫印迹。红色虚线矩形表示TF的负电荷部分。绿色和蓝色矩形显示TF的高分子量部分。E：表示详细患者信息的表格。

具体实施方式

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料可用于本发明的实践或测试，但现在描述优选的方法和材料。下下文提及的所有出版物均通过引用并入本文。

我们假设CaMKK2控制TF磷酸化和细胞内运输，并且异常CaMKK2可在AD的发生和进展期间使TF丰度和磷酸化不平衡。因此，我们使用CaMKK2敲除(KO)小鼠、基于CRISPR/Cas9的CaMKK2敲除人细胞系(HEK293和HepG2)和基于siRNA的敲低方法研究了TF在体内和体外的相对表达、带电荷部分(通过等电聚焦：IEF)和细胞内运输。此外，我们分析了在早期和晚期AD发展中的AD(3xTg-AD)小鼠海马和皮质组织的三重转基因小鼠模型中CaMKK2和TF带电部分和TF相关蛋白复合物。基于3xTg-AD小鼠的研究表明AD发展/进展期间异常的CaMKK2导致脑中P-TF的量显著降低(其对应于转铁蛋白的酸性部分，在一些情况下，对应于pH3-4的带电荷部分，如本文所讨论的)。这一发现的意义是巨大的，因为它表明从患病器官分泌到血清和/或脑脊液(CSF)中的P-TF可以用作人AD诊断和预后的侵入性(CSF)或微创性(血清)生物标志物。

我们分析了从死后人早期和晚期发作AD(分别为EOAD和LOAD)患者以及3xTg-AD小鼠(仅血清)获得的CSF和血清样品中TF的丰度和带电状态。我们的发现表明异常的CaMKK2磷酸化导致P-TF的显著降低，可能是由于囊泡运输受损所致。血清和脑脊液中磷酸化TF组分被成功地用于鉴定人死后患者的EOAD和LOAD。我们的研究表明了一种新的CaMKK2介导的TF信号传导通路。我们提供的证据表明，磷酸化的TF(

部分)可以用作人类AD的新型诊断和预后的生物标志物。

具体地，在本研究中，我们报道CaMKK2的丧失显著降低神经元细胞中多个Ser/Tyr/Thr残基处的TF磷酸化。通过质谱分析在pH～3-4部分中鉴定P-TF残基。在随后的研究中，我们描述了TF中pH～3-4部分作为P-TF水平的量度。我们的研究表明CaMKK2直接或间接以组织特异性方式导致体内的TF磷酸化和转换(turnover)。此外，我们已经表明CaMKK2的敲低导致会TF的囊泡运输异常，这可能是其转换减少的原因。此外，我们已经表明了CaMKK2和TF在多个蛋白质复合物中的可能关联及其体内的动力学。此外，我们提供了在基于3xTg-AD小鼠的研究中将失调的CaMKK2和异常转铁蛋白磷酸化和转换联系起来的新机制，这可能为神经变性机制的提供新的了解。我们还评价了在人类AD中P-TF(pH～3-4部分)作为潜在的CSF和基于血清的预后和诊断的生物标志物。这在AD的早期诊断、治疗和患者护理中具有巨大的意义。

AD是世界范围内最普遍的痴呆之一(Sharma和Singh，2016)。目前AD的诊断标准包括CSF生物标记(Aβ肽、Tau和P-Tau)，其通过侵入性腰椎穿刺获得，会引起老年人恶心、严重背痛和虚弱(Lehmann和Teunissen，2016)。因此迫切需要一种基于血清的微创诊断或预后的生物标志物，这种标志物在时间效率和成本效率以及患者接受度方面具有显著优势(Sharma和Singh，2016；O′Bryant等人，2017)。目前正在研究淀粉样蛋白病理学的血浆蛋白、循环miRNA、细胞因子、激酶、轴突蛋白、脂质和已知的AD标记物片段作为基于血液的AD生物标记物的潜力，参见综述(Lista等人，2013；Huynh和Mohan，2017)。此外，血清TF水平(Squitti等人，2010)、血清TF-铁的去饱和水平(Hare等，2015)、CSF中糖基化的TF(Guevara等人，1998；van Rensburg等人，2000；Taniguchi等人，2008；Shirotani等人，2011)和血清(Yu等人，2003)已经被提议作为潜在的AD生物标志物。我们关于EOAD和LOAD患者的CSF中TF水平显著降低的观察结果证实了先前的发现。血清TF水平在CaMKK2 KO小鼠、3xTg-AD小鼠和人患者中保持不变，使得其不适合作为诊断的生物标志物。另外，我们的发现CaMKK2的损失改变了TF高分子量部分，这表明糖基化TF(高分子量部分)可以反映AD患病的大脑状态。然而，由于聚糖的固有复杂性和变异性，糖基化TF作为诊断生物标记物是一项艰巨的分析挑战，在我们的研究和其他研究中都被强调(Zhang等人，2016)。CaMKK2 KO小鼠、3xTg-AD小鼠的血清中，以及EOAD和LOAD死后人类患者的CSF和血清中P-TF(pH～3-4部分)的损失的一致发现表明TF磷酸化是一种有前景的新型AD预后和诊断标记物。

因此，在第一方面，本发明涉及用于确定受试者为发展与所述疾病相似的痴呆的风险的体外方法(本发明的第一种方法)，该方法包括

a)测定来自受试者的样品中转铁蛋白或功能等同变体的磷酸化水平，和

b)将a)中获得的磷酸化水平与参考值进行比较，

其中与参考值相比，转铁蛋白或其功能等同变体的磷酸化水平降低表明所述对象具有发生痴呆的高危风险。

在一个具体实施方案中，所述受试者患有阿尔茨海默病或与所述疾病相似的认知障碍。在一个替代实施方案中，受试者患有轻度认知障碍。

处于痴呆风险中的个体可以是表现出一种或多种、有时两种或更多种与痴呆相关的症状或具有一种或多种与痴呆相关的风险因素的个体。这些症状和风险因素是本领域公知的，并且可以通过参考各种来源来容易地确定。

例如，痴呆的症状包括但不限于：破坏日常生活的记忆力减退；规划或解决问题中的挑战；难以在家中、工作中或休闲中完成熟悉的任务；与时间或地点混淆；难以理解视觉图像和空间关系；口语或写作时出现新问题；错放东西并失去折回脚步的能力；判断力下降或判断力差；退出工作或社会活动；并改变心情和个性。

痴呆的危险因素包括但不限于年龄，例如，如果该人是65岁或以上；家族史，例如，该人的近亲患有痴呆；严重的头部损伤，特别是反复的创伤或如果创伤涉及意识丧失；心脏病；糖尿病；中风；高血压；和高胆固醇。

如本文中所使用的，“轻度认知障碍(mild cognitive impairment)”也称为初期痴呆或孤立性认知障碍，是指试图描述痴呆发作前的症状学的病理学实体，受影响的个体遭受比他们的年龄和教育水平所预期的更严重的损伤，但这些损伤不显著影响他们的日常活动，其被认为是正常衰老和痴呆之间的界限，本领域技术人员能够基于例如在精神障碍诊断和统计手册(DSM)和国际疾病分类中所提出的诊断标准由医生作出诊断，来确定受试者是否具有轻度认知障碍。

在本发明的一个具体实施方案中，所述受试者是人，所述神经退行性疾病是阿尔茨海默病。

如本文所用，表述“发展痴呆或阿尔茨海默病或与所述疾病相似的认知障碍的风险”是指受试者发展为痴呆或阿尔茨海默病或与所述疾病相似的认知障碍的倾向性、易感性、倾向性或可能性。发生神经变性疾病、痴呆、阿尔茨海默氏病或与所述疾病相似的认知障碍的风险通常意味着存在高或低风险或较高或较低的风险。因此，具有发展为痴呆、或阿尔茨海默病或与所述疾病相似的认知障碍的高风险的受试者发生所述疾病的可能性为至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少95％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或至少100％的可能性。类似地，具有发展为痴呆、阿尔茨海默病或与所述疾病相似的认知障碍的低风险受试者发生所述疾病的可能性为至少0％、或至少1％、或至少2％、或至少3％、或至少5％、或至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少49％。

一般而言，“预测风险(predicting the risk)”、“风险预测(prediction of therisk)”或类似表述，是指患者发展为痴呆或阿尔茨海默病或类似于所述疾病的认知障碍的风险，无论其高或低。本领域技术人员可以理解，尽管预测(或风险)是优选的，但是不一定要对所有待评估的对象都是正确的，尽管优选的是这样的。然而，该术语需要将受试者的统计学显著部分确定为对于特定结果展现出较高的可能性。本领域技术人员可以使用不同的公知统计评估工具，例如置信区间的确定、p值的确定、与分类指数的交叉验证等，来轻松地确定一个部分是否具有统计学显著性。优选的置信区间为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。p值优选为0.1、0.05、0.02、0.01或更小。

术语“阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease)”或“AD”或“阿尔茨海默(Alzheimer’s)”是指与特定的退化性脑疾病相关的精神障碍，其特征在于出现老年斑、神经原纤维缠结和进行性神经元丧失，临床表现为进行性记忆缺陷、精神错乱、行为问题、无法自理、身体逐渐恶化和最终死亡。阿尔茨海默病也可以根据Braak量表定义为处于任何阶段的疾病：

阶段I-II：受神经纤维缠结影响的脑区域对应于脑的横嗅区域(transentorhinalregion)

分阶段，受影响的脑区域还延伸到边缘区域，例如海马体

阶段V-VI：受影响的大脑区域还涉及新皮质区。

这种神经病理学阶段的分类与疾病的临床进展相关，记忆力下降与神经原纤维变化和内嗅皮质和海马中神经炎斑块形成之间存在平行关系(阶段I至IV)。同样，这些变化(V和VI期)的同皮质存在与临床上的严重改变相关。横嗅(transentorhinal)阶段(I-II)对应于疾病的临床沉默期。边缘期(III-IV)对应于临床初期AD。新皮质阶段对应于完全发展的AD。此外，阿尔茨海默病可以定义为早发型阿尔茨海默病(EOAD)和晚发型阿尔茨海默病(LOAD)。EOAD发生在约5％的65岁之前出现症状的阿尔茨海默病患者中。这些患者中的大多数具有散发性疾病形式，但10-15％的遗传形式通常以常染色体显性方式遗传。LOAD是该疾病最常见的形式，发生于65岁及以上的人群中。

本发明可以应用于尚未被诊断为患有相应疾病和病症(例如预防性筛查)的受试者，或已被诊断为患有相应疾病和病症的受试者，或被怀疑患有相应疾病和病症(例如显示一种或多种特征性体征和/或症状)的受试者，或处于发展相应疾病和病症的风险中(例如遗传素因；存在一种或多种发育、环境或行为风险因素)的受试者。所述试剂盒、方法和用途也可用于检测疾病和病症的进展或严重性的各个阶段。所述试剂盒、方法和用途还可用于检测疾病和病症对预防性或治疗性治疗或其它干预的反应。所述试剂盒、方法和用途还可用于帮助医学从业者决定受试者从疾病和病症中的恶化、现状、部分恢复或完全恢复，导致进一步的治疗或观察或导致患者从医疗护理中心离开。此外，本文教导的测试组、方法和用途可以用于群体筛选，例如在一般群体中或在基于一个或多个标准例如年龄、血统、职业、是否存在相应疾病和病症的风险因素等而分层的群体中进行筛选。

本发明中生物标记物(例如转铁蛋白或其功能等同变体、抗体和抗抗原等的磷酸化)和参数(例如生物标记的水平、年龄、疾病程度、参考值等)的各自的量、测量或评分可以分别和单独地评估，即，各自与其相应的参考值进行比较。更有利地，生物标记物和参数的量、测量或评分可以用于建立生物标记和参数曲线图，其可以适当地与相应的多参数参考值进行比较。在又一替代方案中，生物标记物和参数的量、测量或评分可以各自通过适当的加权因子来调节并且相加以产生单个值，然后可以将其适当地与相应的参考值适进行比较。应当理解，此类加权因子可取决于用于定量生物标志物和测量或评分的方法，并且对于每个特定的实验设置，可确定并包含在适于如本文所教导的疾病和病状的诊断、预测和/或预后的模型中。各种方法可用于建立此类模型，例如支持向量机(support vectormachine)、贝叶斯分类器(Bayes classifiers)、逻辑回归(logistic regression)等(Cruz等人，Applications of Machine Learning in Cancer Prediction andPrognosis.Cancer Informatics 2007；2；59-77)。

在本发明方法的一个具体实施方案中，第一步包括测定转铁蛋白的磷酸化，更特别是表1中所列肽的磷酸化。在一个替代实施方案中，第一步包括测定SEQ ID Nos：4-12中一个或多个序列的磷酸化，更特别地是表1中所列的肽的一种或多种丝氨酸、酪氨酸或苏氨酸的磷酸化。在另一个实施方案中，第一步骤包括测定选自下组的转铁蛋白的一个或多个氨基酸残基的过渡后修饰(优选磷酸化)：K359；K37；K508；K546；S31；S47；S51；S55；S63；S124；S136；S144；S227；S267；S298；S305；S306；S378；S381；S389；S409，S434，S454，S468；S511；S512；S520；S685；S687；S688；T24；T36；T139；T184；T200；T228；T340；T349；T355；T440；T445；T476；T537；T654；T686；T694；Y64；Y155；Y207；Y257；Y333；Y431；Y445；Y487；Y533；Y534；Y536；Y593；Y64；Y666；Y669；和转铁蛋白的Y674，特别是人运铁蛋白，或在磷酸化的、如通过多个氨基酸序列比对所定义的另一运铁蛋白的位置等同的氨基酸残基中或在功能上等同的变体中。

如本文所用，术语“位置等同(positionally equivalent)”指转铁蛋白的氨基酸位置，其通过转铁蛋白的多氨基酸序列比对，对应于K359；K37；K508；K546；S31；S47；S51；S55；S63；S124；S136；S144；S227；S267；S298；S305；S306；S378；S381；S389；S409，S434，S454，S468；S511；S512；S520；S685；S687；S688；T24；T36；T139；T184；T200；T228；T340；T349；T355；T440；T445；T476；T537；T654；T686；T694；Y64；Y155；Y207；Y257；Y333；Y431；Y445；Y487；Y533；Y534；Y536；Y593；Y64；Y666；Y669；和人转铁蛋白的Y674。多序列比对可以借助于CLUSTALW2程序中实施的算法来实现(使用标准参数(alignment type：slow；matrix：Gonnet；gap open：10；gap extension：0.1；KTUP：1；Window length：5；Sc oretype：percent；Top Diags：5 and Pair Gap：3)。在另一个实施方案中，多序列比对可以借助于CLUSTAL OMEGA程序中实施的算法来实现(具有默认参数的HHalign算法和默认转移矩阵是Gonnet，具有6位空位开放罚分和1位空位延伸)。

本发明方法的第二步包括将在该方法的第一步(本文进一步描述)中获得的磷酸化水平与参考值进行比较。

如本文所用，术语“参考值(reference value)”是指用作评估从受试者收集的样品获得的值或数据的参考的预定标准。参考值或参考水平可以是绝对值、相对值、具有上限或下限的值、值的范围、平均值、中值、平均值或与特定对照或基线值相比的值。在一些实施例中，参考值不必每次都确定。参考值可以基于单个样品的值，例如，从来自被分析的受试者的样品但在较早的时间点获得的值。该较早时间可以在个体被诊断为患有痴呆之前，或者可以在治疗干预之前，例如但不限于治疗处方，例如，如本文所讨论的治疗药物和/或生活方式改变等。以这种方式，可以监测痴呆的进展和/或治疗干预的有效性。参考值可以基于大量样品，例如匹配的年龄组的受试者群体，或基于包括或排除正被分析的样品的样品池。在一个具体实施方案中，转铁蛋白中磷酸化氨基酸残基的参考值来自受试者或健康受试者或对照受试者群体(即不显示任何神经变性疾病，特别是不显示阿尔茨海默氏病或类似于所述疾病的认知障碍)的样品中所述蛋白质残基的磷酸化水平。典型的参考样品通常从临床上有据可查的受试者中获得。

本文所用的参考值可以根据先前用于包含生物标志物和/或临床参数的其它测试组的已知程序来建立。参考值可以在如本文所教导的方法和用途之内(即，构成其步骤)或之外(即，不构成其步骤)中建立。因此，本文教导的方法或用途中的任何一种可以包括建立必要参考值的步骤。

在本发明的一些实施方式中，在阳性结果之后，对该个体进行认知测试和/或脑成像，以确定该个体是否患有阿尔茨海默病或类似于阿尔茨海默氏症的另一种认知障碍，例如帕金森氏病或另一种痴呆。如本领域技术人员将理解的，随后的筛选或测试可显示阳性结果实际上是假阳性。

在本发明的一些实施方式中，在阳性结果之后，安排个体进行认知测试和/或脑成像以确定个体是否患有阿尔茨海默病。

在本发明的一些实施方案中，阳性结果指示个体患有痴呆。痴呆症可能与阿尔茨海默病、帕金森病或其它形式的痴呆有关。

因此，在第二方面，本发明涉及用于在患有轻度认知障碍的受试者中设计个性化治疗的体外方法(本发明的第二种方法)，所述方法包括：

a)测定来自受试者的样品中转铁蛋白或其功能等同变体的磷酸化水平，和

b)将a)中获得的磷酸化水平与参考值进行比较，

其中与参考值相比，转铁蛋白或其功能等同变体的磷酸化水平的升高/降低表明所述受试者易于接受预防和/或治疗阿尔茨海默病或与所述疾病相似的认知障碍的疗法。

在第三方面，本发明涉及用于筛选易于用预防和/或治疗阿尔茨海默病或与所述疾病类似的认知障碍的疗法治疗的患者的体外方法(本发明的第三种方法)，所述方法包括

a)测定来自受试者的样品中转铁蛋白或其功能等同变体的磷酸化水平，和

b)将a)中获得的磷酸化水平与参考值进行比较，

其中与参考值相比，转铁蛋白或其功能等同变体的磷酸化水平的升高/降低表明所述受试者是接受预防和/或治疗阿尔茨海默病或与所述疾病相似的认知障碍的疗法的候选者。

在本发明的一些实施方案中，在阳性结果后，如痴呆治疗和/或患有痴呆领域的技术人员或只是所推荐的，对个体进行评估和分配或采用或者生活方式的改变。如本领域已知和如本文所讨论的，可向个体分配预防性护理和/或抢先治疗。

在其它实施方案中，将个体被分配或参与研究。

在本发明第二种方法的一个具体实施方案中，所述受试者是人，并且所述治疗是用于预防和/或治疗痴呆或阿尔茨海默病或其它与所述疾病类似的认知障碍。

如本文所用，术语“预防性治疗(preventive therapy)”是指预防疾病以预防或延迟疾病症状发作的预防或一组预防措施。特别地，所述术语是指预防与痴呆或阿尔茨海默病或与所述疾病类似的认知障碍相关的临床症状的发作或延迟所述临床症状的措施或一组措施。与向受试者施用所述治疗相关的期望临床结果包括但不限于稳定疾病的病理状态、延迟疾病的进展或改善受试者的生理状态。

本发明的第一、第二和第三种方法包括在第一步中测定来自受试者的样品中转铁蛋白或其功能等同变体中酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基的磷酸化水平。

如本文所用，“样品(sample)”是指从受试者分离的生物材料。样品可以从任何合适的生物流体或组织中分离，包括，作为说明性和非限制性实例，脑脊液(CSF)，血清，血浆，眼泪，汗液、唾液，尿液和粪便。

在本发明方法的一个具体实施方案中，样品选自脑脊液、血清、血浆、血液和外周血单核细胞组成的组。例如，可以从患者收集全血，并通过使血液凝结而从中制备血清。在一些实施方案中，血清样品可以用去糖基化酶和/或磷酸盐和蛋白酶抑制剂处理。如本领域技术人员将理解的，血清侵入性较小并且易于收集。但是，如果患者接受另一治疗并收集了CSF，则可筛选该CSF。

如本文所用，术语“受试者(subject)”是指哺乳动物物种的成员，包括但不限于家畜、灵长类动物和人。在一个具体的实施方案中，受试者优选是任何年龄或种族的男性或女性。在另一个具体实施方案中，所述受试者是狗。在一个具体实施方案中，受试者患有痴呆，例如轻度认知障碍、阿尔茨海默病或其它类似的认知障碍。

本实施方案的“转铁蛋白(transferring)”“(TF)”是指与的679个氨基酸的糖蛋白基本相同的蛋白质，通常称为转铁蛋白，并且还包括其遗传多形体、遗传变体或剪接变体。转铁蛋白是主要在肝脏中产生的血浆蛋白，其通过结合其每个分子的两个铁原子而充当铁转运分子，并且已知其参与体内造血功能和铁代谢。人“转铁蛋白”蛋白对应于Uniprot数据库中鉴定为P02787的蛋白(2018年09月12日)。

在本发明的上下文中，术语“转铁蛋白的功能等同变体(functionallyequivalent variant of transferrin protein)”包括(i)转铁蛋白的变体，其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选一个保守氨基酸残基)取代，其中这种取代的氨基酸残基可以是或不是由遗传密码编码的残基，(ii)包含一个或多个氨基酸的插入或缺失并起到与转铁蛋白相同功能的变体，及其(iii)片段。

根据本发明的变体优选与运铁蛋白氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。变体和上面定义的转铁蛋白的特定序列之间的同一性可以使用本领域技术人员熟知的算法和计算方法来确定。优选使用BLASTP算法确定两个氨基酸序列之间的同一性[BLAST Manual，Altschul，S.等人，NCBI NLM NIHBethesda，Md.20894，Altschul，S.等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)]

本文提及的任何转铁蛋白生物标志物、核酸、蛋白质或多肽也可包括其片段。因此，本文提及测量(或测量其量)任何一种生物标志物、核酸、蛋白质或多肽可以包括测量所述生物标志物、核酸、蛋白质或多肽，例如测量其成熟和/或加工的可溶/分泌形式(例如血浆循环形式)和/或测量其中一个或多个片段。

术语转铁蛋白、多肽或肽的“片段(fragment)”通常指所述蛋白、多肽或肽的N-末端和/或C-末端缺失或截短的形式。在一个实施方案中，与相应的成熟全长蛋白或其可溶性或血浆循环形式相比，片段可以在N-末端和/或C-末端截短1至约20个氨基酸，例如1至约15个氨基酸，或1至约10个氨基酸，或1至约5个氨基酸。在一个实施方案中，转铁蛋白片段是包含表1中所列任何序列的氨基酸序列，或所述序列之一的片段，其中所述片段长为四至二十个氨基酸，并包括磷酸化的酪氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸。在本发明的备选实施方案中，转铁蛋白片段包含一个或多个选自如下转铁蛋白的氨基酸残基组成的组：K359；K37；K508；K546；S31；S47；S51；S55；S63；S124；S136；S144；S227；S267；S298；S305；S306；S378；S381；S389；S409、S434、S454、S468；S511；S512；S520；S685；S687；S688；T24；T36；T139；T184；T200；T228；T340；T349；T355；T440；T445；T476；T537；T654；T686；T694；Y64；Y155；Y207；Y257；Y333；Y431；Y445；Y487；Y533；Y534；Y536；Y593；Y64；Y666；Y669；以及Y674。

如本文所述，“目标残基(residues of interest)”指可被转铁蛋白磷酸化的氨基酸残基，包括表1中所列，SEQ ID NOs：4-12，或残基K359；K37；K508；K546；S31；S47；S51；S55；S63；S124；S136；S144；S227；S267；S298；S305；S306；S378；S381；S389；S409、S434、S454、S468；S511；S512；S520；S685；S687；S688；T24；T36；T139；T184；T200；T228；T340；T349；T355；T440；T445；T476；T537；T654；T686；T694；Y64；Y155；Y207；Y257；Y333；Y431；Y445；Y487；Y533；Y534；Y536；Y593；Y64；Y666；Y669；和人转铁蛋白Y674，或其位置等价物。

在另一方面，本发明公开了磷酸化位点特异性结合分子，其特异性结合本发明的新的酪氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸磷酸化位点，并区分磷酸化和未磷酸化形式。在一个实施方案中，结合分子是抗体或其抗原结合片段。抗体可以特异性结合包含表1中的磷酸化位点的氨基酸序列。

如本文所用，术语“抗体(antibody)”包括嵌合或重组抗体和单克隆抗体和多克隆抗体或其蛋白水解片段，如Fab或F(ab′)2片段等。此外，编码抗体可变区的DNA可以插入到其它抗体中，从而产生嵌合抗体。单链抗体(scFv)可以是由具有抗原结合抗体的特有能力并且包含与免疫球蛋白的轻链和重链的可变区同源或类似的一对氨基酸序列(VH-VL或scFv结合)的单链形成的多肽。如果需要，与抗体轻链和重链可变区类似的多肽可以通过结合多肽结合。用于产生抗体的方法是公知的，并且在现有技术中进行了描述。

在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段特异性结合磷酸化位点。在其它实施方案中，抗体或其抗原结合片段特异性结合未磷酸化的位点。当抗体或其抗原结合片段不显著结合亲本蛋白质(parent protein)中的任何其它位点并且不显著结合除亲本蛋白质之外的蛋白质时，其特异性结合表1中包含的新的酪氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸磷酸化位点的氨基酸序列。本发明的抗体在本文中有时称为“磷酸特异性(phospho-specific)”抗体。

当解离常数为≤1mM，优选为≤100nM，更优选为≤10nM时，抗体或其抗原结合片段可特异性地结合抗原。

在特别优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段特异性结合包含新的酪氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸磷酸化位点的氨基酸序列，所述磷酸化位点在表1列出的序列中以小写字母″y″、″s″或″t″表示。

在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段特异性结合包含表1中列出的任何序列的氨基酸序列或所述序列之一的片段，其中所述片段长为四至二十个氨基酸并包括可磷酸化的酪氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸。

在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段特异性结合通过用蛋白酶对亲本蛋白质进行蛋白水解而产生的肽的氨基酸序列，其中所述肽包含本发明的新的酪氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸磷酸化位点。在一些实施方案中，所述肽由亲本蛋白质的胰蛋白酶消化产生。包含新的酪氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸磷酸化位点的亲本蛋白质可以来自任何物种，优选来自哺乳动物，包括但不限于非人灵长类，兔，小鼠，大鼠，山羊，牛，绵羊和豚鼠。在一些实施方案中，亲本蛋白是人蛋白，抗体结合包含表1中小写字母″y″、″s″或″t″所示的新酪氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸磷酸化位点的表位(epitope)。这样的肽包括SEQ ID NOs：4-12的任何一个。

本发明的抗体可以是完整的，包含两条重链和两条轻链的四条免疫球蛋白链抗体。抗体的重链可以是任何同种型，包括IgM、IgG、IgE、IgG、IgA或IgD，或亚同种型，包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE1、IgE2等。轻链可以是kappa(K)轻链或lambda(λ)轻链。

本发明还包括具有少于4条链的抗体分子，包括单链抗体、骆驼科抗体等以及抗体组分，包括重链或轻链。术语“抗体(antibody或antibodies)”指所有类型的免疫球蛋白。术语“抗体的抗原结合片段(an antigen-binding fragment of an antibody)”是指保持完整抗体特异性结合的抗体的任何部分。抗体的示例性抗原结合片段是重链和/或轻链CDR，或重链和/或轻链可变区。当上下文中出现抗体与序列的一种磷酸形式(例如磷酸化形式)结合时，术语“不结合(does not bind)”是指抗体基本上不与相同序列的另一种磷酸形式(例如非磷酸化形式)反应。本领域技术人员可以理解，表达可适用于以下情况：(1)磷酸特异性抗体或者不明显结合抗原的非磷酸形式，如在常用实验检测系统(Western印迹、IHC、免疫荧光等)中所确定的；(2)其中与周围的氨基酸序列具有一定的反应性，但是磷酸化残基是反应的免疫显性特征。在这种的情况下，对两个序列的亲和力存在明显差异。对这些抗体的稀释分析表明，抗体对磷酸化形式的表观亲和力比对非磷酸化形式的表观亲和力至少高10-100倍；或其中(3)磷酸特异性抗体的反应不超过在相同实验条件下适当的对照抗体的反应。对照抗体制剂可以是例如来自相同物种的免疫前动物的纯化免疫球蛋白，同种型和物种匹配的单克隆抗体。本领域技术人员认为使用对照抗体来证明特异性的测试是合适且确定的。

在一些实施方案中，免疫球蛋白链可按顺序从5′至3′包含可变区(variableregion)和恒定区(constant region)。可变区可包含散布构架区(FR)的三个互补决定区(CDRs)，结构为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4的散布框架区(FR)。本发明还包括重链或轻链可变区、框架区和CDRs。本发明的抗体可以包含重链恒定区，其包含部分或全部CH1区、铰链、CH2和CH3区。

本发明的抗体的结合亲和力(K_D)为1×10^-7M或更低。在其它实施方案中，抗体的亲和力K_D为1×10^-8M、1×10^-9M、1×10^-10M、1×10^-11M、1×10^-12M或更低，在某些实施方案中，K_D为1pM到500pM，500pM到1mM，1mM到100nM，或100mM到10nM。

本发明的抗体可来源于任何种类的动物，优选哺乳动物。非限制性的示例性天然抗体包括来自人，鸡，山羊和啮齿动物(例如大鼠，小鼠，仓鼠和兔)的抗体，包括基因工程改造以产生人抗体转基因啮齿动物的抗体(参见，例如Lonberg等人，WO93/12227；美国专利号5,545,806；和Kucherlapati等人，WO91/10741；美国专利号6,150,584，其通过引用整体并入本文)，天然抗体是宿主动物产生的抗体。“基因改造抗体(Genetically alteredantibodies)”是指氨基酸序列与天然抗体的氨基酸序列不同的抗体。由于重组DNA技术与本申请的相关性，因此不必将其限制在天然抗体中发现的氨基酸序列。抗体可以重新设计以获得所需的特性。可能的变化是多种多样的，范围从仅改变一个或几个氨基酸到完全重新设计例如可变区或恒定区。通常，进行恒定区的改变以改善或改变特征，例如补体结合(complement fixation)、与膜的相互作用和其它效应子功能。将进行可变区中的改变以便改善抗原结合特性。

本发明的抗体包括任何同种型的抗体，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，和任何亚同种型的抗体，包括IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgG4、IgE1、IgE2等。抗体的轻链可以是kappa(κ)轻链或lambda(λ)轻链。

本发明公开的抗体可以是多克隆的或单克隆的。如本文所用，术语“表位(epitope)”是指能够选择性结合抗体的抗原结合位点的蛋白质的最小部分。本领域技术人员公认的是，能够选择性结合抗体的抗原结合位点的蛋白质表位的大小最小是约五或六至七个氨基酸。

其它特别考虑的抗体是寡克隆抗体。如本文所用，术语“寡克隆抗体(oligoclonalantibodies)”指不同单克隆抗体的预定混合物。参见，例如，PCT申请WO95/20401；美国专利号5,789,208和6,335,163。在一个实施方案中，在单个细胞中产生针对一个或多个表位的抗体的预定混合物组成的寡克隆抗体。在其它实施方案中，寡克隆抗体包含多个能够与共同轻链配对的重链，以产生具有多种特异性的抗体(例如，PCT申请WO04/009618)。当期望寡克隆抗体靶向单一目标分子上的多个表位时，寡克隆抗体是特别有用的。鉴于本文公开的测定法和表位，本领域技术人员可以生成或选择适用于预期目的和所需要求的抗体或抗体混合物。

本申请中还包括针对本发明鉴定的磷酸化位点的重组抗体。在本申请中，这些重组抗体具有与天然抗体相同的氨基酸序列或具有天然抗体的改变的氨基酸序列。它们可以在任何表达系统中制备，包括原核和真核表达系统或使用噬菌体展示方法(参见，例如，Dower等人，WO91/17271和McCafferty等人，WO92/01047；美国专利号5,969,108，其通过引用的方式整体并入本文)。

抗体可以通过多种方式进行工程改造。它们可以制备成单链抗体(包括小模块免疫药物或SMIPs^TM)、Fab和F(ab′)2片段等。抗体可以是人源化的、嵌合化的、去免疫化的或完全人源化的。许多出版物记载了许多类型的抗体和工程改造此类抗体的方法。例如，参见美国专利号6,355,245；6,180,370；5,693,762；6,407,213；6,548,640；5,565,332；5,225,539；6,103,889；和5,260,203。遗传改造的抗体与上述天然抗体在功能上等同。

保留完整抗体的结合特异性的本发明抗体的抗原结合片段也包括在本发明中。这些抗原结合片段的实例包括但不限于本文所述的任何磷酸化位点特异性抗体的部分或完整重链或轻链、可变区或CDR区。

在本申请的一个实施方案中，抗体片段是截短的链(在羧基末端截短)。在某些实施方案中，这些截短的链具有一种或多种免疫球蛋白活性(例如，补体固定活性)。截短的链的实例包括但不限于Fab片段(由VL、VH、CL和CHI结构域组成)；Fd片段(由VH和CHI结构域组成)；Fv片段(由抗体单链的VL和VH结构域组成)；dAb片段(由VH结构域组成)；分离的CDR区；(Fab′)₂片段，二价片段(包括在铰链区由二硫键连接的两个Fab片段)。截短的链可以通过常规生物化学技术如酶裂解或重组DNA技术来产生，其中每一种技术是本领域已知的。这些多肽片段可以通过本领域公知的方法通过完整抗体的蛋白水解性切割来产生，或通过使用定点诱变在载体期望的位置插入终止密码子来产生，如在CH1之后产生Fab片段或在铰链区之后产生(Fab′)₂片段。单链抗体可通过将VL-和VH-编码区与编码连接VL和VH蛋白片段的肽接头的DNA连接而产生。

“Fv”通常指含有完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密非共价结合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体组成。在该构型中，各可变结构域的三个CDR相互作用以在VH-VL二聚体的表面上限定抗原结合位点。总体上，CDR共同赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使是单个可变结构域(或包含三个抗原特异性的CDR的Fv的一半)也具有识别并结合抗原的能力，尽管其亲和力可能比完整结合位点低。

因此，在某些实施方案中，本申请的抗体可包含1、2、3、4、5、6或更多个识别表1中鉴定的磷酸化位点的CDRs。

Fab片段还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端添加了几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH在本文中是指恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离巯基的Fab′。F(ab′)₂抗体片段最初是作为在它们之间具有铰链半胱氨酸的Fab′片段对产生的。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。

“单链Fy”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在一条多肽链中。在某些实施方案中，Fv多肽还进一步包含V_H和V_L结构域之间的多肽接头，使得scFv能够形成抗原结合期望的结构。关于scFv的综述，参见Pluckthun in ThePharmacology of Monoclonal Antibodies，vol.113，Rosenburg and Moore，eds.(Springer-Verlag：New York，1994)，pp.269-315。

SMIPs是一类经基因工程改造而包含靶结合区和效应结构域(effect domain)(CH2和CH3结构域)的单链肽。参见例如美国专利号20050238646。靶结合区可以来自抗体的可变区或CDRs，例如本申请的磷酸化位点特异性抗体，或者来自于结合磷酸化位点的目标结合区域。

双特异性抗体可以单克隆的、人的或人源化的、具有对至少两种不同抗原具有结合特异性的抗体。在本发明的情况下，结合特异性之一是针对磷酸化位点，另一个是针对任何其它抗原，例如细胞表面蛋白或受体亚基。或者，治疗剂可以放在一个臂上。治疗剂可以是药物、毒素、酶、DNA、放射性核素等。

在一些实施方案中，抗原结合片段可以是双抗体。术语“双价抗体(diabody)”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包含于同一多肽链(V_H-V_L)中连接的轻链可变结构域(V_L)和重链可变结构域(V_H)。通过使用太短而不能允许在相同链上的两个结构域之间配对的接头，所述结构域被迫与另一链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双抗体更全面地描述在例如EP404，097；WO93/11161；和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)。

骆驼科动物抗体是指缺乏轻链的独特类型的抗体，其最初从骆驼科动物中发现。这些所谓的重链抗体的重链通过一个单一结构域结合其抗原，所述单一结构域是免疫球蛋白重链的可变结构域，称为VHH。VHHs显示出与人VHIII家族的重链的可变结构域的同源性。从免疫的骆驼、单峰骆驼或美洲驼获得的VHHs具有许多优势，例如可在微生物如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中有效生产。

在某些实施方案中，包含来源于不同物种的部分的单链抗体和嵌合型抗体、人源化抗体或灵长源化的(CDR-移植)抗体以及嵌合型或CDR-移植的单链抗体也作为抗体的抗原结合片段包含在本公开内容中。这些抗体的不同部分可以通过常规技术化学结合在一起，或者可以使用基因工程技术制备为连续蛋白。例如，可以表达编码嵌合或人源化单链的核酸以产生连续蛋白质。参见，例如，美国专利号4,816,567和6,331,415；美国专利号4,816,397；欧洲专利号0,120,694；WO86/01533；欧洲专利号0,194,276 Bl；美国专利号5,225,539；和欧洲专利号0,239,400 Bl。涉及灵长源化抗体，参见Newman等人，BioTechnology，10：1455-1460(1992)。关于单链抗体，参见，例如，Ladner等人，美国专利号4,946,778；以及Bird等人，Science，242：423-426(1988))。

此外，还可产生抗体的功能性片段，包括嵌合型抗体、人源化抗体、灵长源化抗体或单链抗体的片段。受试抗体的功能片段保持它们所来源的全长抗体的至少一种结合功能和/或调节功能。

由于免疫球蛋白相关基因包含各自具有一个或多个不同生物活性的单独功能区，因此抗体片段的基因可融合至来自其它基因(例如，酶，美国专利US5,004,692，其以引用方式全文并入本文中)的功能区以产生具有新颖性质的融合蛋白或缀合物。

还考虑了非免疫球蛋白结合多肽。例如，可将本文公开的抗体的CDR插入合适的非免疫球蛋白支架中以产生非免疫球蛋白结合多肽。合适的候选支架结构可以来自例如III型纤连蛋白和钙粘蛋白超家族。

还考虑了其它等价的非抗体分子，如蛋白质结合结构域或适体(aptamers)，其以磷酸特异性方式结合包含本发明的新的磷酸化位点的氨基酸序列。参见，例如Neuberger等人(Neuberger等人，1984)。适体是结合特定靶分子的寡核酸或肽分子。DNA或RNA适体通常是短寡核苷酸，通过重复的选择进行工程化以结合分子靶标。肽适体通常由在两端均附接至蛋白质支架的可变肽环组成。这种双重结构限制通常将肽A结合的亲和力提高到与抗体相当的水平(纳摩尔范围)。

本发明中公开的磷酸化位点特异性抗体可以单独使用或组合使用。抗体还可以以阵列形式用于高通量用途。抗体微阵列是固定抗体的集合，通常点样并固定在固体表面(例如玻璃、塑料和硅芯片)上。

在某些实施方案中，本发明公开的磷酸化位点特异性抗体特别适用于本文所述的诊断和治疗应用。因此，所述抗体可用于治疗，包括联合治疗，用于疾病的诊断和预后，以及用于监测疾病进展。因此，本发明还包括包含本文所述的本发明的抗体或抗原结合部分的一个或多个实施方案的组合物。该组合物可进一步包含药学上可接受的载体。所述组合物可以包含两种或更多种抗体或抗原结合部分，其分别对本发明的不同的新的酪氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸磷酸化位点具有特异性，或两种或更多种不同的抗体或抗原结合部分，其均对本发明的相同的新的酪氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸磷酸化位点具有特异性。本发明的组合物可包含一种或多种本发明的抗体或抗原结合部分和一种或多种其它试剂、诊断剂或治疗剂。

本申请提供了编码本文所述的抗体和抗体片段及其类似物的多核苷酸分子。由于遗传密码的简并性，多种核酸序列编码每种抗体氨基酸序列。所需的核酸序列可以通过denovo固相DNA合成或通过PCR诱变早期制备的所需多核苷酸的变体来产生。在一个实施方案中，所用的密码子包括人或小鼠典型的密码子(参见，例如，Nakamura，Y，Nucleic AcidsRes.28：292(2000))。

本发明还提供了产生本发明抗体的永生化细胞系。例如，还提供了如上所述构建的杂交瘤克隆，其产生针对本文公开的靶向信号蛋白磷酸化位点的单克隆抗体。类似地，本发明包括产生本发明抗体的重组细胞，所述细胞可通过公知技术构建；例如，可利用PCR克隆单克隆抗体的抗原组合位点，并在大肠杆菌中将单链抗体产生为噬菌体展示的重组抗体或可溶性抗体(参见，例如，ANTIBODY ENGINERING PROTOCOLS，1995，Humana Press，SudhirPaul Editor.)。

另一方面，本发明提供了制备磷酸化位点特异性抗体的方法。

本发明的多克隆抗体可以根据标准技术通过包含本发明的磷酸化或未磷酸化状态的新的酪氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸磷酸化位点(即表1中所示的磷酸化位点)的抗原免疫合适的动物(例如兔、山羊等)来产生。取决于抗体的所需特异性，从动物收集免疫血清，并根据已知方法从免疫血清分离多克隆抗体，并筛选和分离新的酪氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸磷酸化位点特异性的多克隆抗体，如下文进一步描述的。免疫非人动物如小鼠、大鼠、绵羊、山羊、猪、牛和马的方法是本领域公知的。参见，例如，Harlow和Lane，Antibodies：Antibodies：A Laboratory Manual，New York：Cold Spring Harbor Press，1990。

免疫原可以是全长蛋白或包含目的新酪氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸磷酸化位点的肽。在一些实施方案中，免疫原是长为4至20个氨基酸，或者长为约8至17个氨基酸的肽。在一些实施方案中，肽抗原期望在可磷酸化的酪氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸的每一侧上包含约3至8个氨基酸。在其它实施方案中，肽抗原期望地将包含位于可磷酸化氨基酸两侧并包围它的四个或更多个氨基酸。可以根据公知的技术设计、构建和使用适合于产生本发明抗体的肽抗原。参见，例如，Antibodies：A Laboratory Manual，Chapter 5，p.75-76，Harlow&Lane Eds.，Cold Spring Harbor Laboratory(1988)；Czernik，Methods In Enzymology，201：264-283(1991)；Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85：21-49(1962)。

合适的肽抗原可以包括表1中所示片段的全部或部分序列。

特别优选的免疫原是包含任一如表1中选自包含SEQ ID NOs：4-12的组所列出的小写字母″y″、″s″或″t″所示的新的酪氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸磷酸化位点的肽。在本发明的一个实施方案中，本发明的肽包含选自下组的转铁蛋白的一个或多个氨基酸残基的片段：K359；K37；K508；K546；S31；S47；S51；S55；S63；S124；S136；S144；S227；S267；S298；S305；S306；S378；S381；S389；S409，S434，S454，S468；S511；S512；S520；S685；S687；S688；T24；T36；T139；T184；T200；T228；T340；T349；T355；T440；T445；T476；T537；T654；T686；T694；Y64；Y155；Y207；Y257；Y333；Y431；Y445；Y487；Y533；Y534；Y536；Y593；Y64；Y666；Y669；以及Y674。

在一些实施方案中，免疫原与佐剂一起施用。合适的佐剂是本领域技术人员公知的。示例性佐剂包括完全或不完全弗氏佐剂(Freund′s adjuvant)、RIBI(胞壁酰二肽muramyl dipeptides)或ISCOM(免疫刺激复合物immunostimulating complexes)。

当使用上述方法生产多克隆抗体时，在免疫后，可以使用已知的技术回收分泌到血流中的多克隆抗体。当然，这些抗体的纯化形式可以通过标准纯化技术容易地制备，例如用蛋白A(Protein A)、抗免疫球蛋白或抗原本身的亲和层析。在任何情况下，为了监测免疫的成功，使用标准技术如ELISA、RIA等监测血清中相对于抗原的抗体水平。

本发明的单克隆抗体可以通过本领域熟知的许多方法中的任何一种来产生。在一些实施方案中，产生抗体的B细胞分离自用如上所述的肽抗原免疫的动物。B细胞可以来自脾、淋巴结或外周血。分离单个B细胞，并如下所述进行筛选，以鉴定产生对目标新酪氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸磷酸化位点特异的抗体的细胞。然后培养鉴定出细胞以产生本发明的单克隆抗体。

或者，本发明的单克隆磷酸化位点特异性抗体可以使用已知的杂交瘤技术在杂交瘤细胞系中产生，参见Kohler和Milstein的公知技术(Nature 265：495-97(1975)；Kohlerand Milstein，Eur.J.Immunol.6：511(1976)；以及Current Protocols in MolecularBiology，Ausubel et al.Eds.(1989))。这样产生的单克隆抗体是高度特异性的，并且改善了本发明提供的诊断测定方法的选择性和特异性。例如，可以将含有适当抗原的溶液注射到小鼠或其它物种中，并且在足够的时间(与常规技术一致)后，处死动物并获得脾细胞。然后通过许多标准方法中的任何一种使脾细胞永生化。永生化细胞的方法包括但不限于，用致癌基因转染它们，用致癌病毒感染它们，在选择永生化细胞的条件下培养它们，使它们经受致癌或突变化合物，使它们与永生化细胞融合。参见，例如，Harlow和Lane同上。通常，抗体产生细胞和与其融合的永生化细胞来自相同的物种。例如，兔融合杂交瘤，例如可以如美国专利号5,675,063(C.Knight，1997年10月07日公布)中所描述的来产生。永生化的抗体生产细胞，如杂交瘤细胞，在合适的选择培养基如次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)中生长，并如下所述筛选上清液中具有期待特异性的单克隆抗体。分泌的抗体可通过常规方法如沉淀、离子交换或亲和层析等从组织培养上清液中回收。

本发明还包括如上所述的抗体产生细胞和细胞系，例如杂交瘤。

多克隆或单克隆抗体也可以通过体外免疫获得。例如，噬菌体展示技术可用于提供含有对特定抗原具有不同亲和力的抗体库的文库。从这些文库中鉴定高亲和力人抗体的技术描述于Griffiths等人，(1994)EMBO J.，13：3245-3260；Nissim et al.，ibid，pp.692-698 and by Griffiths et al.，ibid，12：725-734，其内容通过引用结合于此。

抗体可以使用本领域已知的方法重组产生，例如，根据美国专利号4,349,893(Reading)或美国专利号4,816,567(Cabilly等人)中公开的方法，抗体还可以通过根据美国专利号4,676,980(Segel等人)中公开的方法制备化学构建的特异性抗体。

一旦鉴定出所需的磷酸化位点特异性抗体，编码抗体的多核苷酸，例如重链，轻链或两者(或在单链抗体的情况下为单链)或其部分如编码可变区就可以使用本领域已知的方法从抗体产生细胞中克隆和分离。例如，可利用PCR克隆单克隆抗体的抗原组合位点，并在大肠杆菌中将单链抗体产生为噬菌体展示的重组抗体或可溶性抗体(例如参见AntibodyEngineering Protocols，1995，Humana Press，Sudhir Paul editor.)。

因此，在另一方面，本发明提供了编码本发明抗体的重链、轻链、可变区、构架区或CDR的核酸。在一些实施方案中，核酸可操作地与表达控制序列连接。因此，本发明还提供了用于重组表达本发明的抗体或其抗原结合部分的载体和表达控制序列。本领域技术人员将能够选择适合于其中表达抗体或抗原结合部分的宿主细胞的载体和表达系统。本发明的单克隆抗体可以通过在合适的宿主细胞中在合适的条件下表达编码核酸而重组产生。因此，本发明还提供了包含上述核酸和载体的宿主细胞。

单克隆Fab片段也可以通过本领域技术人员已知的重组技术在大肠杆菌中产生。例如参见W.Huse，Science 246：1275-81(1989)；Mullinax等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.87：8095(1990)。

如果对于特定应用，优选一个同种型的单克隆抗体，则可通过从初始融合物选择来直接制备特定同种型，或者通过从分泌不同同种型单克隆抗体的亲本杂交瘤中进行二次制备，使用sib选择技术分离类别转换的变体(Steplewski等人，Proc.Nat′l.Acad.Sci.，82：8653(1985)；Spira et al.，J.Immunol.Methods，74：307(1984))。或者，可以使用本领域熟知的抗体工程技术改变具有所需特性的单克隆抗体的同种型。

可以根据已知技术筛选本发明的磷酸化位点特异性抗体，无论是多克隆还是单克隆的，以获得表位和磷酸特异性。参见，例如，Methods in Enzymology，201：264-283(1991)。例如，可以通过ELISA抗磷酸化和/或非磷酸化的肽文库筛选抗体，以确保对所需抗原具有特异性(即包括本发明的磷酸化位点的表位和仅与磷酸化(或非磷酸化)形式的抗原的反应性)，可以进行肽竞争测定以确认缺乏与亲本蛋白上的其它磷酸化表位的反应性，还可以通过Western印迹针对含有亲本信号蛋白的细胞制备物(例如过量表达亲本蛋白的细胞系)来测试抗体，以确认与所需磷酸化表位/靶标的反应性。

对于所需磷酸化表位的特异性的检测，可以通过构建在所需表位之外的位置缺乏已知被磷酸化的可磷酸化残基的突变体，或通过突变所需的磷酸化表位并确认缺乏反应性。本发明的磷酸化位点特异性抗体可对非靶蛋白中的相关表位表现出一些有限的交叉反应性。这并不出乎意料，因为大多数抗体表现出一定程度的交叉反应性，并且抗肽抗体通常与和免疫肽具有高度同源性的表位交叉反应。参见，例如Czernik同上。与非靶标蛋白的交叉反应性很容易通过蛋白质印迹法与已知分子量的标记物进行表征。可以检查测交叉反应蛋白的氨基酸序列，以鉴定具有与本发明的磷酸化位点高度同源的侧翼序列的磷酸化位点。

在某些情况下，多克隆抗血清可能对磷酸酪氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸本身表现出一些不良的一般交叉反应性，这可以通过进一步纯化抗血清，例如在磷酸酪胺柱上将其除去。本发明的抗体仅在磷酸化时(或视情况而定，仅在未磷酸化时)特异性结合其靶蛋白(即表1中所列的蛋白)，且(基本上)不结合其它形式(与抗体特异性的形式相比)。

可以使用正常和患病组织通过免疫组织化学(IHC)染色来进一步表征抗体，以测试患病组织中磷酸化和活化状态以及磷酸化位点的水平。IHC可以根据公知的技术进行。参见，例如，Antibodies：A Laboratory Manual，Chapter 10，Harlow&Lane Eds.，ColdSpring Harbor Laboratory(1988)。

抗体可以通过根据标准方法进行的流式细胞术来进一步表征。参见Chow等人，Cytometry(Communications in Clinical Cytometry)46：72-78(2001)。简要地并举例来说，可以使用以下细胞计数分析的方案：样品在Ficoll梯度上离心以除去溶解的红细胞和细胞碎片。可以将粘附的细胞从板上刮下并用PBS洗涤。然后，细胞可以用2％多聚甲醛在37℃固定10分钟。然后在冰上在90％甲醇中透化30分钟。然后，用本发明的第一磷酸化位点特异性抗体(其检测表1中列举的亲代信号蛋白)对细胞染色，洗涤并用荧光标记的二抗标记。此时也可加入其它荧光染料缀合的标记抗体(例如CD45、CD34)，以帮助随后鉴定特定的造血细胞类型。然后根据所用仪器的具体方案在流式细胞仪(例如Beckman Coulter FC500)上分析细胞。

本发明的抗体还可以有利地与荧光染料(例如Alexa488、PE)缀合，以与其它信号转导(磷酸-CrkL、磷酸-Erk1/2)和/或细胞标记(CD34)抗体一起用于多参数分析。

蛋白质的磷酸化程度可以使用本领域技术人员已知的任何常规方法来确定。已知有多种测定方法可用于测定蛋白质的磷酸化状态，或特定蛋白质中磷酸化的氨基酸残基，例如，使用放射性标记的ATP进行的体外激酶活性测定；对磷酸化并标记的蛋白质进行二维电泳(可以分析蛋白质中多少氨基酸残基被磷酸化)；对预先纯化的蛋白质进行质谱分析，其磷酸化状态待测量；定向诱变，接着用纯化的蛋白质进行体外激酶活性测定；磷酸肽分析，其包括在胰蛋白酶消化后将磷酸化的蛋白质分离成二维，或技术上不太复杂的蛋白质印迹，其考虑使用针对特异性识别磷酸化的蛋白质的氨基酸残基或表位的所述蛋白质的抗体。用于检测蛋白质中磷酸化残基的技术是本领域技术人员熟知的，并且在现有技术中有所描述。或者，可免疫沉淀转铁蛋白，并通过Western印迹测定目的残基中磷酸化的总水平。

MS可以识别具有出色特异性的翻译后修饰位点，而不需要亲和试剂。将诸如iTRAQ同量异序(isobaric labeling)标记的技术集成到发现模式(全局)蛋白质组学工作流程中的方案可在单个实验中从多个样品定量数万个磷位点，前提是可获得足够的样品(Chan，CY等人，″Expert Rev Proteomics，13(4)：421-33，(2016))。大规模磷酸化蛋白质组分析的典型工作流程由四个主要步骤组成：提取蛋白质，酶解；肽被同量异序标记；富集样品中的磷酸肽，最通常使用固定化金属亲和层析(IMAC)或带有TiO₂的金属氧化物亲和层析(MOAC)；然后对样品进行液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析。

通过将nanoLC与高分辨率、快速扫描串联MS联用，研究人员已经从低至100μg的蛋白质起始材料中分析出了多达10,000个磷酸肽(Jimenez，CR，Verheul，HM，Am Soc ClinOncol Educ Book，e504-10，(2014))。例如，其它方法将是增加样品的数量，同时使用靶向(通常多反应监测，MRM，也称为选择反应监测(SRM))方法将范围缩小至仅假设可能不同的分析物，以增加统计学功效。使用MRM/SRM的一种方法是使用三重四级杆质谱仪，其中第一和第三四级杆用作质量过滤器以特异性地选择与预设质荷比相同的肽离子(前体离子)。碎片离子(产物离子)通过CID(Collision Induced Dissociation)方式经第二个四级杆作为碰撞池，使前体离子裂解产生离子。SRM技术具有高选择性，降低了背景噪声和离子干扰。

在另一方面，本发明提供了检测和定量本发明的新的酪氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸磷酸化位点的磷酸化的方法。例如，肽，包括本发明的肽，和本发明的抗体可用于癌症的诊断和预后评估，其中所述疾病与表1中新磷酸化位点的磷酸化状态有关，无论磷酸化还是去磷酸化。

诊断方法可以使用来自受试者的生物样品在体外进行。可以评估表1中鉴定的酪氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸残基的磷酸化状态或水平。与对照相比，磷酸化位点的磷酸化状态或水平的变化表明受试者患有痴呆或易患痴呆。

在另一个实施方案中，磷酸化位点的磷酸化状态或水平通过抗体或其抗原结合片段来测定，其中所述抗体特异性结合磷酸化位点。所述抗体可以是仅当酪氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸残基被磷酸化时结合磷酸化位点，但当酪氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸未被磷酸化时不结合相同序列的抗体；反之亦然。这些可以用ELISA相似的方法测定，例如，正向和反向蛋白质阵列、流式细胞术、Western印迹和免疫组化。

在具体实施方案中，本申请的抗体连接至标记部分，例如可检测的标记物。一个或多个可检测标记可以连接于抗体。示例性的标记部分包括不透射线的染料、放射造影剂、荧光分子、自旋标记的分子、酶或其它具有诊断价值的标记部分，特别是在放射学或磁共振成像技术中。

根据本发明公开的放射性标记的抗体可用于体外诊断测试。抗体、其结合部分、探针或配体的比活性取决于放射性标记的半衰期、同位素纯度和如何将标记掺入生物试剂中。在免疫测定试验中，通常比活性越高，灵敏度越好。用作标记的放射性同位素，例如用于诊断，包括碘(¹³¹I或¹²⁵I)、铟(¹¹¹In)、锝(⁹⁹Tc)、磷(³²P)、碳(¹⁴C)和氚(³H)，或上面列出的治疗同位素之一。

荧光团和发色团标记的生物试剂可以由本领域已知的标准部分制备。由于抗体和其它蛋白质吸收波长高达约310nm的光，因此可以选择荧光部分在高于310nm的波长处，例如高于400nm处具有实质性吸收。Stryer，Science，162：526(1968)和Brand等人，AnnualReview of Biochemistry，41：843-868(1972)中描述了多种合适的荧光剂和生色团，在此通过引用并入本文。抗体可以通过常规方法用荧光发色团基团标记，例如美国专利号3,940,475、4,289,747和4,376,110中公开的那些，其通过引用并入本文。

对照可以是提供比较基础的平行样品，例如，从健康受试者抽取的生物样品，或从相同受试者的健康组织抽取的生物样品。或者，对照可以是预定的参考量或阈值量。如果受试者正在用治疗剂治疗，通过检测本发明的磷酸化位点的酪氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸磷酸化状态水平来监测治疗的进展，则对照可以来源于在治疗之前或治疗过程中从受试者抽取的生物样品。

在某些实施方案中，本申请中用于诊断用途的抗体缀合物旨在在体外使用，其中抗体与第二结合配体或与酶(酶标记物)连接，所述酶在与显色底物接触时将产生有色产物。合适的酶的例子包括脲酶、碱性磷酸酶、(辣根)过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶。在某些实施方案中，第二结合配体是生物素、抗生物素蛋白或链霉抗生物素化合物。

或者，本发明的抗体可用于免疫组织化学(IHC)染色中，以检测正常和患病组织中信号转导或蛋白活性的差异。IHC可以根据公知的技术进行，参见例如上文中Antibodies：ALaboratory Manual，supra。

本发明的肽和抗体也可以被优化用于其它临床上合适的应用，例如基于珠(bead-based)的多重类型测定，如IGEN、Luminex^TM和/或Bioplex^TM测定形式，或另外被优化用于抗体阵列形式，如反相阵列应用(参见，例如Paweletz等人，Oncogene 20(16)：1981-89(2001))。因此，在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于在生物样品中多重检测本发明(表1)的两个或多个磷酸化位点的磷酸化状态或水平的方法，所述方法包括利用本发明的两种或多种抗体。在某些实施方案中，本申请的诊断方法可以与其它诊断测试组合使用。

所分析的生物样品可以是任何怀疑在本发明的新磷酸化位点具有异常酪氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸磷酸化的样品。

另一方面，本申请涉及用于结合、纯化、定量和其它一般性检测本发明的新磷酸化位点的磷酸化状态或水平的免疫测定。

测定可以是均相测定或非均相测定。在均相测定中，免疫反应通常涉及本发明的磷酸化位点特异性抗体、标记的分析物和目的样品。在抗体与标记的分析物结合时，直接或间接地修饰由标记产生的信号。免疫反应和其程度的检测都在均相溶液中进行。可以使用的免疫化学标记包括自由基、放射性同位素、荧光染料、酶、噬菌体、辅酶等。

在非均相测定方法中，试剂通常是样品、本发明的磷酸化位点特异性抗体和用于产生可检测信号的手段。可以使用如上所述的类似样本。抗体通常固定在支持物上，如珠、板或载玻片，并与怀疑含有抗原的样品在液相中接触。然后将支持物与液相分离，并使用产生可检测信号的手段检查支持物相或液相的这种信号，该信号与分析物在样本中的存在有关。产生可检测信号的方法包括使用放射性标记、荧光标记、酶标记等。

本文公开的磷酸化位点特异性抗体可以根据已知技术(例如沉淀)缀合至适于诊断测定的固体支持物(例如，珠、板、载玻片或由诸如胶乳或聚苯乙烯的材料形成的或孔)。

在某些实施方案中，免疫测定法是本领域已知的各种类型的酶联免疫吸附测定法(ELISA)和放射免疫测定法(RIA)。使用组织切片的免疫组织化学检测也是特别有用的。然而，很容易理解检测并不限于这些技术，也可以使用Western印迹、斑点和狭缝印迹(dotand slot blotting)、FACS分析等。

另一方面，本发明涉及一种试剂盒，其包含能够测定转铁蛋白的目标残基中磷酸化水平的试剂，用于测定受试者发展阿尔茨海默病或类似于阿尔茨海默病的认知障碍的风险，用于设计受试者的个性化疗法或用于筛选易于用预防和/或治疗阿尔茨海默病或类似于阿尔茨海默病的认知障碍的疗法治疗的患者。

如本文所用，“试剂盒(kit)”是指含有进行本发明方法所需的不同试剂的产品，其被包装以便运输和储存。适于包装试剂盒的组分的材料包括玻璃、塑料(聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯等)、瓶、小瓶、纸、小袋等。另外，本发明的试剂盒可以含有用于同时、依次或分开使用包含在试剂盒中不同组分的说明书。所述说明书可以呈印刷材料的形式或呈能够存储说明书使得它们可以被受试者读取的电子载体的形式存在，例如电子存储介质(磁盘、磁带等)、光学介质(CD-ROM、DVD)等。另外或可选地，该介质可以包含提供所述指令的因特网地址。

如本文所用，“能够测定磷酸化水平的试剂(reagent capable of determiningthe level of phosphorylation)”应理解为能够检测蛋白质的磷酸化残基的化合物。

在一个具体实施方案中，能够测定转铁蛋白磷酸化水平的试剂选自：

a)能够确定人转铁蛋白蛋白质的目标残基或通过多个氨基酸序列比对所定义的另一种转铁蛋白蛋白质的可磷酸化的位置等效氨基酸残基中的功能等效变体的磷酸化水平的试剂。

在另一个实施方案中，本发明的试剂盒包含一种或多种上述试剂。

另外，本发明的试剂盒包含能够特异性结合转铁蛋白的试剂。在一个更具体的实施方案中，所述试剂是抗体。

如本文所用，“特异性识别或特异性结合”当指具有磷酸化残基的肽或蛋白质时，是指所述试剂仅在目的残基中被磷酸化时识别肽或蛋白质，而在未被磷酸化时不显示任何反应。当提及肽或蛋白质时而不考虑其磷酸化水平时，是指与非特异性相互作用相反，试剂能够与肽或蛋白质的至少一个表位反应的事实。

如本文所用，术语“抗体(antibody)”可以是天然多克隆或单克隆抗体或非天然抗体，例如，单结构域抗体、单链可变片段抗体、微抗体等。用于产生此类抗体的方法是本领域众所周知的。

在一些实施方案中，用于本发明的特异性抗体用可检测标记物(例如，荧光染料或可检测酶)标记，或经修饰以使检测更容易(例如，用生物素以允许用抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白检测)。在其它实施方案中，试剂将不被直接标记或修饰。

在某些实施方案中，试剂盒包括阵列形式的试剂。该阵列包括至少两种不同的试剂，其适于测定以预定模式(例如，网格)结合至底物的一个或多个目的残基的磷酸化水平。因此，本发明提供了包含适用于测定本发明中提到的一个或多个氨基酸残基的磷酸化水平的试剂的阵列。

放置不同的试剂(“捕获试剂capture reagents”)允许在同一反应中测量许多不同氨基酸残基的磷酸化水平。包括阵列形式试剂的试剂盒通常以夹心形式存在，因此这种试剂盒也可以含有检测试剂。试剂盒中通常包括不同的检测试剂，其中每种检测试剂对不同的抗体是特异性的。在这样的实施方案中的检测试剂通常是对与结合到基质的试剂相同的蛋白质特异的试剂(尽管检测试剂通常结合到不同的部分或结合到基质结合试剂的蛋白质位点中)，并且通常是亲和型检测试剂。与任何其它测定形式的检测试剂一样，检测试剂可以用可检测残基修饰，对其进行修饰以允许可检测残基的单独结合，或者可以不对其进行修饰。包括经修饰或未经修饰以允许结合可检测残基的检测试剂的阵列型试剂盒也可含有额外的可检测残基(例如，与检测试剂结合的可检测残基，所述检测试剂如结合经标记的未经修饰的检测试剂或者用于生物素检测的可检测残基修饰的链霉亲和素、经修饰的检测试剂)。

抗体可以通过本领域已知的方法产生。例如，哺乳动物如小鼠、仓鼠或兔可以用在特定的目的残基中磷酸化的转铁蛋白的免疫原性形式免疫(例如，可以引起抗体应答的抗原片段，例如含有磷酸化氨基酸的合成肽)。赋予蛋白质或肽免疫原性的技术包括载体缀合或本领域众所周知的其它技术。例如，多肽的肽基部分可以在佐剂存在下施用。免疫的进展可以通过检测血浆或血清抗体滴度来监测。标准ELISA或其它免疫测定可与作为抗原的免疫原一起用于评价抗体水平。

免疫后，可获得与多肽反应的抗血清，如果需要，可从血清中分离多克隆抗体。为了获得单克隆抗体，可从免疫动物中收集抗体产生细胞(淋巴细胞)，并使用标准方法将体细胞与永生化细胞的融合以产生杂交瘤细胞。这些技术是本领域众所周知的，包括例如杂交瘤技术，如用于产生人单克隆抗体的人B细胞杂交瘤技术和EVB杂交瘤技术。可以通过免疫化学筛选杂交瘤细胞，以产生与多肽和分离的单克隆抗体特异性反应的抗体。

在另一个更具体的实施方案中，能够特异性结合转铁蛋白的试剂固定在支持物上。

上述术语同样适用于这个方面。

在另一方面，本发明涉及本发明的试剂盒用于确定受试者发展阿尔茨海默病或类似于所述疾病的认知障碍的风险、用于在患有轻度认知损害的受试者中设计个性化疗法或用于筛选易于用预防和/或治疗阿尔茨海默病或类似于所述疾病的认知障碍的疗法治疗的患者的用途。

本发明的抗体和肽也可以用于试剂盒中，用于检测本发明的新的磷酸化位点的磷酸化状态或水平，包括以下至少一种：一种抗体或其抗原结合片段，其与包含转铁蛋白磷酸化位点的氨基酸序列结合。这种试剂盒可以进一步包括预定量的试剂与进行诊断测定的说明书的包装组合。当抗体用酶标记时，试剂盒将包括酶所需的底物和辅助因子。此外，可以包括其它添加剂，例如稳定剂、缓冲剂等。各种试剂的相对量可以在很大范围内变化，以提供试剂在溶液中的浓度，该浓度基本上优化了测定的灵敏度。特别地，试剂可以以干粉形式提供，通常是冻干的，包括赋形剂，其在溶解时将提供具有适当浓度的试剂溶液。

根据本发明的一个方面，提供了一种用于筛选患有痴呆的个体以进行痴呆诊断的方法，包括：

提供来自所述个体的样品；测量样品中转铁蛋白的至少一个等电点组分的水平；以及将所述至少一种等电点部分的样品水平与来自健康个体的所述至少一种等电点部分的对照水平进行比较，其中对于阳性结果，所述样品水平和所述对照水平是不同的。

根据本发明的一个方面，提供了一种筛选患有痴呆症风险的个体以进行痴呆症诊断的方法，包括：

提供来自所述个体的样品；确定样品的转铁蛋白特性谱；以及将样本的转铁蛋白谱与参考值进行比较，其中对于阳性结果，样本的转铁蛋白谱与参考值不同。

如本文所讨论的，本发明人已经证明来自早发性阿尔茨海默病和迟发性阿尔茨海默病的样品都具有异常的转铁蛋白特性。尽管不希望受特定理论或假说的束缚，但认为异常转铁蛋白谱是由转铁蛋白磷酸化降低引起的，例如CaMKK2或另一种激酶，例如CaMKK2下游的激酶如CaMK4功能失调，或者可能是由活化的磷酸酶引起的。

除了磷酸化对pI的影响之外，乙酰化也将引起向负pI的转变。

如本文所讨论的，当集中于IPG pH3-10带时，转铁蛋白有三个主要的pI基团：在pH值为9-10(碱性)、pH值为5-6(中性)和pH值为3-4(酸性)的条件下。本领域技术人员将理解，通过使用较窄范围的pH胶条可以分辨每组内的不同亚组分。如下面所讨论的，可以测量特定的部分或亚部分，或者可以确定转铁蛋白谱。

如本文所讨论的，测定转铁蛋白谱以将有患痴呆风险个体的转铁蛋白谱与需要测量和/或观察一种或多种等电形式的转铁蛋白的参考值进行比较。如本文所述，该图谱可以是转铁蛋白的一个或多个带电荷部分的图谱或测量或显示。

如本领域技术人员所理解的，转铁蛋白特性曲线可采取许多不同的形式，并仍被认为是本文所用的“转铁蛋白谱transferrin profile”。

例如，如本文所述，合适的样品可经受pI分离和用一种或多种抗转铁蛋白抗体进行免疫印迹。

如本领域技术人员所理解的，在以这种方式产生的转铁蛋白谱中，组分的数量将取决于样品所经历的分离的性质，如本文所讨论的。

此外，测定或目测的组分不一定需要是酸性(pH3-4)部分，而可以是其它级分或亚级分之一。在优选的实施方案中，来自测试个体或目标个体的样品的蛋白质浓度和来自健康个体的对照样品的蛋白质浓度是已知的或更优选地近似平衡的。

如本领域技术人员所理解的，以这种方式，如本文所讨论的，可分析含有一种或多种等电形式的转铁蛋白的一个或多个组分，以提供转铁蛋白谱。

如本文所用，“等电形式的转铁蛋白(isoelectric form of transferrin)”指在特定残基磷酸化/非磷酸化和/或在特定残基乙酰化/非乙酰化的转铁蛋白的翻译后修饰形式。本领域技术人员将理解，转铁蛋白“最简单”的等电形式是未磷酸化和未乙酰化的，而其它等电形式将在一个或多个残基处磷酸化和/或在一个或多个残基处乙酰化，并将具有特定的等电点。如本领域技术人员所理解的，一些等电形式可具有相似的pI，因此当测定样品的转铁蛋白谱图时，可作为IPG上相同部分的一部分被检测或显现。

在本发明的其它实施方案中，可以测定或查询转铁蛋白在特定氨基酸残基处的修饰状态，或可以测定或测量在该特定残基处具有该特定修饰状态的肽的数目。如本领域技术人员所理解的，这代表了测量至少一个转铁蛋白等电点组分和/或测定样品的转铁蛋白谱的另一种方法。

在一些实施方案中，通过测定选自下组的运铁蛋白的一个或多个氨基酸残基的修饰状态来测定运铁蛋白等电点组分的转铁蛋白谱或水平：K359；K37；K508；K546；S31；S47；S51；S55；S63；S124；S136；S144；S227；S267；S298；S305；S306；S378；S381；S389；S409，S434，S454，S468；S511；S512；S520；S685；S687；S688；T24；T36；T139；T184；T200；T228；T340；T349；T355；T440；T445；T476；T537；T654；T686；T694；Y64；Y155；Y207；Y257；Y333；Y431；Y445；Y487；Y533；Y534；Y536；Y593；Y64；Y666；Y669；以及Y674。

如本领域技术人员所知，可以产生特异性抗体以检测特定残基的乙酰化/磷酸化。检测潜在磷酸化/乙酰化残基的抗体可以通过以下2种方法制备：

方法-1：单克隆抗体：

·使用线性表位预测模型(linear epitope prediction models)例如BepiPred(Larsen等人，2006)评价TF中包含潜在磷酸化/乙酰化残基的大约15个氨基酸残基的肽序列(Kringelum等人，2013)的抗原潜力。或者，使用生物信息学工具，例如DiscoTope2.0(Haste Andersen等人，2006；Kringelum等人，2012)，评价构象表位模型的抗原潜力。

·合成肽与适当佐剂用于小鼠免疫。

·免疫后，从脾或淋巴结收集淋巴细胞，随后用骨髓瘤细胞(如X63.Ag8.653细胞系)无限增殖化。选择杂交瘤，并通过ELISA或WBLOT筛选上清液以检测抗原。

·扩展所选杂交瘤，并进一步表征同种型、表位作图、特异性和灵敏度。杂交瘤还将针对单克隆抗体的表达、溶解性、稳定性、亲和力和亲合力进行表征。

·产生所需抗体的合适杂交瘤扩增以进行大规模生产。然后检测该单克隆抗体以检测TF的pH3-4组分，并用于诊断试剂盒的制备。

方法-2：筛选噬菌体展示文库：

·通过筛选市售的人scFv文库、人Fab文库、小鼠scFv/Fab文库、兔Fab文库、鸡scFv文库和单结构域抗体文库，我们得到乙酰化或磷酸化肽(如上所述)特异性单链可变片段(scFv)或抗原结合片段(Fab)抗体。

这些修饰特异性抗体可用于检测特定的等电形式。或者，其它抗转铁蛋白单克隆抗体或抗运铁蛋白多克隆抗体可用于鉴定和定量转铁蛋白等电组分的方法中，例如本文所述的pH～3-4组分。

方法-1：等电聚焦和SDS-PAGE，随后进行免疫印迹：

·沉淀血清/CSF蛋白，然后溶解在尿素中，随后聚焦在含有线性或非线性pH梯度3-10/3-7/3-6的固定化聚丙烯酰胺梯度凝胶条带上。

·选择性地，血清/CSF蛋白将用脱糖基酶(以去除N-和O-连接的聚糖)和羟胺(以去除硫酯)处理。处理后，蛋白质将沉淀并聚集。

·蛋白质在基于电荷的第一维分离后，蛋白质将进一步基于分子量使用变性SDS-PAGE进行第2维分离。然后将第2维分离的蛋白质还原和烷基化，并转移到硝酸纤维素/PVDF膜上，并使用抗-转铁蛋白或抗-P-转铁蛋白特异性抗体进行免疫印迹，并与标准年龄匹配的健康人分离的转铁蛋白谱比较。

方法-2：使用pI-TRAP血清/CSF蛋白无凝胶预分离，对随后免疫印迹或质谱鉴定：

·血清/CSF蛋白将被脱盐并通过使用pI-TRAP(Biomotif)溶液等电聚焦方法通过无凝胶分离。

·收集30个不同pI值的组分，通过ELISA、免疫印迹或基于质谱的方法定量哪些组分中存在转铁蛋白。

方法-3：芯片上基于表面等离子体共振(SPR)磷-铁传递蛋白的检测：

·基于SPR技术通过使用包覆抗转铁蛋白抗体的微流体传感器芯片，在血清/CSF中检测和定量并比较特定的磷酸运铁蛋白。

方法-4：免疫测定。

用于定量测定人CSF或血清中P-TF的固相酶免疫测定法。本发明现在将通过实施例来描述。但是，本发明并不限于这些实施例。

方法-5：免疫沉淀后基于质谱的磷酸化转铁蛋白测定：

来自血清或CSF的运铁蛋白被免疫沉淀，然后进行转铁蛋白的蛋白水解消化和质谱定量。使用基于多重反应监测(MRM)的或等效的质谱分析来定量转铁蛋白中的多个特征磷酸肽。

实施例1-基于蛋白质分布型分析和质谱分析的研究揭示了DRG神经元中CaMKK2敲低影响P-TF。

为了了解CaMKK2在外周神经元中的作用，我们在敲低了培养的成年原代大鼠DRG神经元中的CaMKK2，并在第1维IEF中分离总细胞蛋白，随后在第2维SDS-PAGE中找出带差异电荷的蛋白组分(图1A-D)。聚焦蛋白的比较揭示了在pH～3-4下多个～75kDa的聚焦点的丰度降低，然后通过凝胶内胰蛋白酶消化分析，接着通过质谱鉴定蛋白(图1C-E，矩形区域中的标记点)。质谱鉴定该点为多个P-TF(图IE)。对照(混杂siRNA)中潜在的P-TF残基分别是P-Tyr257/333/336/338，P-Ser381/389/409/500/511/512和P-Thr392/393/586，在CaMKK2敲低组中被发现不存在或降低(表1)。

实施例2-使用抗TF抗体的免疫印迹证实CaMKK2的损失影响TF磷酸化。

人/大鼠TF(Swissport：P02787/P12346)的分子量和pI分别为77/76kDa和6.81/7.14。在确定的DRG神经元培养基中添加部分饱和的重组人TF(71-81kDa)。因此，我们可以预期蛋白质分析中不同种的TF的混合。在CaMKK2敲低DRG神经元中TF的相对量未改变但带电组分不同(图2AB)。在2D IEF/SDS-PAGE中，TF出现3个主要组分，分别在pH～3-4、～5-6和～9-10(图2B，红色矩形)。TF的pH～3-4部分对应于多个磷酸化残基，其先前通过MS-MS分析，且发现其在CaMKK2敲低神经元中显著降低(图2BC，红色矩形)。这证实了图1中所示的蛋白质谱分析和基于质谱的发现。此外，CaMKK2敲低DRG神经元在～130/＞180kDa和在pH～5-6和pH～9-10区域显示存在另外的聚焦斑点，而加扰对照细胞仅在pH-9-10组分显示＞180kDa(图2B，蓝色矩形)。高分子量形式可能是由于翻译后修饰增加了额外的分子量，例如糖基化，并且似乎受CaMKK2功能丧失的控制。

实施例3-CaMKK2的缺失降低了CaMKK2 KO小鼠DRG组织中TF的丰度和磷酸化。

TF启动子捕获的GFP报告基因表达显示CaMKK2在小鼠脊髓神经元中的表达(图3A)。免疫印迹揭示了相当于75和70kDa蛋白质的CaMKK2同种型在DRG组织中的表达，而KO小鼠中不存在(图3B)。基于免疫印迹的定量分析揭示了CaMKK2 KO DRG组织中TF的相对量显著降低(图3BC)。2D IEF/SDS-PAGE表明野生型和CaMKK2 KO小鼠DRG组织之间TF pH～3-4组分(P-TF)显著不同(图3D-F)。

实施例4-CamKK2的缺失以组织特异性方式影响TF的相对丰度和磷酸化。

TF启动子捕获的GFP报告基因小鼠显示TF在嗅球、皮层和小脑的神经元中的表达(图4A)。基于免疫印迹的定量分析揭示了的CaMKK2 KO嗅球和小脑中显著高水平的TF(图4BC和FG)。IEF/SDS-PAGE显示在CaMKK2 KO嗅球、大脑皮层、小脑和肝组织中P-TF(pH～3-4组分)的量显著降低(图4DE&HI，5CD&GH)。CamKK2的缺失对皮质中TF的相对量没有影响(图5AB)。然而，CaMKK2的缺失显著降低肝脏中TF的相对量(图5EF)。

实施例5-敲低CaMKK2影响培养的成年大鼠DRG神经元中TF的囊泡运输：

Halo标记的TF(Halo-TF)表达的神经元的共聚焦活细胞成像揭示Halo-TF分布在核周体以及神经突中(图6A)。核周围的高倍放大图像显示了在对照(加扰)中含有独特的囊泡结构(颗粒)，其中包含大量TMR标记的Halo-TF。在CaMKK2敲低细胞中囊状结构明显较少(图6B-E)。免疫荧光揭示了多数与Halo-TF相关的囊泡结构是Rab5阳性早期内体，相当一部分是Rab11阳性循环内体(图6F)(Mills等人，2010)。CaMKK2敲低神经元中Halo-TF相关囊泡结构的缺乏表明细胞内运输受损。

实施例7-CaMKK2和TF(磷酸化)的带负电荷部分在早期和晚期发作的3xTg-AD小鼠大脑皮层中显著降低：

细胞内Ca²⁺稳态失调是AD发展的潜在因素(Hermes等人，2010；Berridge，2011)。用转基因3xTg-AD小鼠研究AD进展期间CaMKK2和TF(P-CaMKK2和P-TF)的带负电荷部分。仅使用雌性3xTg-AD小鼠以避免神经病理学和行为学中的性别报道差异(Hirata-Fukae等人，2008；Gimenez-Llort等人，2010；Garcia-Mesa等人，2011；Hebda-Bauer等人，2013)。早在3-4个月，在3xTg-AD小鼠的一些脑区检测到Aβ肽沉积的进行性增加(Oddo等人，2003)。在3xTgAD小鼠6个月时突触传递和长期增强被削弱(Oddo等人，2003)。在12-15个月时，在3xTg-AD小鼠的海马中检测到构象改变和超磷酸化的tau(Oddo等人，2003)。因此，6个月(早期)和14个月(晚期)被认为是3xTg-AD小鼠模型的早期和晚期以及研究。

通过ExPASy-Compute pi/MW工具预测小鼠CaMKK2亚型(转录物ID分别为ENSMUST00000111668.7和ENSMUST00000200109.4)的分子量和pi分别为73/59kDa和5.27/5.31(Gasteiger等人，2003)。早期3xTg-AD和年龄匹配的野生型皮质组织的IEF/SDS-PAGE揭示存在的～73kDa和～59kDa的CaMKK2蛋白，分别对应于亚型-1和亚型-2(图7A)。IEF/SDS-PAGE也揭示CaMKK2亚型-1在早期3xTg-AD皮层中是带差异电荷的(图7A，红色和蓝色箭头)。之前使用IEF/SDS-PAGE分析哺乳动物细胞免疫沉淀的CaMKK2的研究揭示，在我们的研究中观察到的多个磷酸化的点对P-Ser呈阳性，并且S129A、S133A和S137A的突变导致大部分点消失(Green等人，2011)。经过验证的P-CaMKK2抗体是不可用的。因此，我们认为CaMKK2的更带负电荷的部分为P-CaMKK2，并且相对定量显示在早期3xTg-AD皮质中P-CaMKK2(红色箭头标记的部分)显著降低(图7A-C)。在3xTg-AD早期皮质中TF在pH～10、7-8、5-6和3-4分别显示为4个主要带电组分(图7D，彩色矩形)。在早期3xTg-AD皮质中，TF pH～3-4组分显着降低(图9DF)。相反，在14个月大的小鼠皮层中，TF分别在pH～5-6和～3-4时以2个主要组分出现(图7E)。在3xTg-AD皮质晚期中TF的pH～3-4组分显着降低(图7G)。

实施例8-CaMKK2 KO和3xTg-AD显示CaMKK2和TF相关多蛋白复合物的改变：

二维BN-PAGE/SDS-PAGE用于研究TF和CaMKK2相关蛋白复合物。我们假设，由于相互作用蛋白的聚集/解离，磷酸化的降低可能影响TF/CaMKK2相关蛋白复合物的动力学。BN-PAGE/SDS-PAGE揭示TF在野生型DRG组织中分别形成了4种主要的蛋白复合物，分别为-720、-480、-242和约100kDa(图8A；分别为蓝色、绿色和橙色圆圈)。CaMKK2亚型分别形成4个大于1200、-720、-480和-66kDa的蛋白质复合物(图8A；分别为橙色、蓝色、绿色和粉红色圆圈)。CaMKK2亚型-1(～73kDa)形成＞1200和约66kDa的复合物，而CaMKK2亚型-2(～59kDa)形成-720和约480kDa的复合物(图10A)。大于1200kDa、-720kDa和约480kDa的CaMKK2复合物似乎包含较高分子量形式，这可能是由于相应复合物中的一部分蛋白质PTMs所致。在BN-PAGE/SDS-PAGE分析中，同一复合物中相互作用的蛋白质显示在一条垂线上。-720和-480kDa CaMKK2复合物与TF相关复合物的垂直比对表明这些蛋白质在相同复合物中可能结合(图8A，蓝色和绿色虚线)。这也表明CaMKK2亚型-2可能参与TF磷酸化。有趣的是，在CaMKK2 KO DRG组织中，所有CaMKK2蛋白复合物如预期那样消失。此外，在CaMKK2 KO DRG组织中，-720和～480kDa TF相关蛋白复合物的相对位置移动，-242和～100kDa TF复合物消失，这表明这些复合物的动力学依赖于CaMKK2。

我们研究了TF相关蛋白在3xTg-AD晚期大脑皮层和海马组织中的动力学。TF在皮层和海马中分别在-1000和～720kDa处以为2种主要复合物出现(图8B)。在晚期3xTg-AD小鼠的海马和皮层中，～1000kDa TF相关蛋白复合物显著降低(图8B(红色矩形)和8C)。这表明3xTg-AD小鼠脑中P-CaMKK2降低导致P-TF降低，从而影响TF相关蛋白复合物的动力学。

实施例9-3 xTg-AD中P-CaMKK2降低影响血清TF丰度和磷酸化：

因此，我们假设从脑产生和分泌的TF进入体循环，CaMKK2 KO和3xTg-AD小鼠脑中P-TF的降低可能反映在血清P-TF水平的降低，其反过来可以作为AD的基于血清的最小侵袭性生物标记物。TF的相对丰度在CaMKK2 KO小鼠和早期3xTG-AD中保持不变，但在晚期3xTg-AD血清中显著降低(图8D，9A-E)。血清中的TF以75和50kDa蛋白出现，分别为p75-TF和p50-TF。IEF/SDS-PAGE表明在CaMKK2 KO血清中P-TF(pH～3-4组分)显著减少(图8E-F)，在早期和晚期3xTg AD血清中pH～3-4P-TF相对较少(图9CF)。这表明血清TF水平不反映CaMKK2 KO小鼠的生理状态，但磷酸化水平可反映这一点。类似地，AD早期血清的TF水平不反映疾病状态，但P-TF可提供AD的准确预测。

实施例10-在早期和晚期发病的人死后AD患者的CSF和血清中TF的相对丰度和磷酸化被改变。

我们分析了死后人CSF和来自早发性AD(EOAD＜65岁)和迟发性AD(LOAD＞65岁)的血清样品中TF的相对丰度和磷酸化(pH～3-4部分)(Tellechea等人，2018)，以测试P-TF作为诊断和预后标记的适用性。来自EOAD患者的CSF中TF的相对丰度显著降低，但血清水平未受影响(图10A-C)。7个EOAD CSF样品的IEF/SDS-PAGE显示除了一个EOAD样品(患者ID：12772)之外，TF的pH～3-4组分含量相对降低(图10D&11C)。有趣的是，在2名EOAD患者中，匹配的血清是可获得的，并且IEF/SDS-PAGE检测到TF pH～3-4组分的相对损失(图10E&F，虚线矩形)。这表明人血清中的P-TF组分可检测人的EOAD，并且可作为AD早期诊断的生物标志物。在LOAD的CSF中TF的丰度相对降低，但血清水平保持不受影响(图12AB)。IEF/SDS-PAGE显示血清和CSF中TF pH～3-4组分的相对降低。这表明基于P-TF组分的生物标志物也可以用作AD预后的生物标志物。

材料和方法：

转基因小鼠(CaMKK2 KO和3xTg-AD)和来自阿尔茨海默病患者的死后人胞外液：

CaMKK2 KO小鼠的脑和脊髓是由美国印第安纳大学医学院(Indiana UniversitySchool of Medicine，USA)Uma Sankar博士提供的解剖速冻组织。CaMKK2敲除小鼠通过外显子2-4侧翼序列的靶向缺失产生(Anderson等人，2008)。3xTg-AD小鼠大脑皮层、海马和血清样品由加拿大曼托巴大学(University of Manitoba，Canada)Benedict C Albensi博士提供。3xTg-AD是含有PS1(M146V)、APP(Swe)和tau(P301L)转基因的三重转基因模型(Oddo等人，2003)。通过NIH NeurobioBank(申请#937)获得死后人脑脊液(CSF)和来自阿尔茨海默病患者和未受影响的对照的匹配血清样品。

细胞培养

如前所述，解剖来自成年雄性Sprague-Dawley大鼠的DRG，并在含有10mM D-葡萄糖(N4888，Sigma，St Louis，MO，USA)的改良Hams F12培养基中培养，并添加改良的不含胰岛素的Bottenstein’s N2添加剂(0.1mg/ml TF，20nM孕酮，100μM腐胺，30nM亚硒酸钠，0.1mg/ml BSA；所有的添加剂来自Sigma，St Louis，MO，USA)(Akude等人.，2011；RoyChowdhury等人，2012；Saleh等人，2013；Calcutt等人，2017))。在所有实验中，培养基中还补充了0.146g/L的L-谷氨酰胺，一种低剂量神经营养因子混合物(0.1ng/ml NGF、1.0ng/mlGDNF和1ng/ml NT-3-ALL，所有来自Promega，Madison，WI，USA)，0.1nM胰岛素和IX抗生素抗真菌溶液(A5955，Sigma)。

敲低CaMKK2：

通过2种方法实现培养的DRG神经元中CamKK2的敲低。在蛋白质谱分析实验中，通过用脂质纳米颗粒(LNP)封装的3种siRNA的混合物分别转染细胞来进行敲低，所述siRNA分别对CaMKK2基因的外显子5、8和12(si35956、sl35958和si35957)具有特异性(Rungta等人，2013)。通过使用Precision NanoSystems公司的微流体微混合器，将在乙醇中适当体积的不同阳离子脂质储备溶液与含有siRNA多链的水相混合制备siRNA-LNPs。为了封装，将所需量的siRNA(0.056mg siRNA/毫摩尔脂质)溶解在配制的缓冲液中(25mmol/L乙酸钠，pH4.0)。随后，使用双注射泵在微流体微混合器中合并1×体积乙醇中的脂质混合物和3×体积的在配制缓冲液中的siRNA以产生LNP。将含有siRNA的LNP微粒加入DRG培养物中，神经元生长48小时，然后分析蛋白质。在所有其它实验中，在新鲜解离的DRG神经元中转染siRNAs，使用大鼠神经元核转染试剂盒(VPG-1003，Amaxa，Lonza Inc.，Allendale，NJ，USA)和Amaxa Nucleofector-II装置(程序0-003)，在涂覆有聚-L-鸟氨酸(P8638，Sigma)和层粘连蛋白的μ-Plate-24孔板(Ibidi USA，Inc.Madison，Wisconsin，USA)中培养。

二维等电聚焦和SDS-PAGE：

IEF基于等电点(pI)分离蛋白质，等电点取决于蛋白质中的净电荷。在聚集过程中，蛋白质将迁移到固定化pH梯度(IPG)上的点，在该点上蛋白质的净电荷为零(Freeman和Hemby，2004)。在第2维SDS-PAGE中基于其分子量进一步分离电荷分离的蛋白质。使总细胞蛋白质沉淀并溶解在再水合缓冲液(补液)中，其中含有8M尿素、2％CHAPS、50mM二硫苏糖醇(DTT)和0.2％Bio-Lyte两性电解质pH 3-10。然后将溶解的蛋白质在IPG胶条(ThermoFisher)中孵育1小时，并在175伏(V)聚焦15分钟，在175-2000V斜坡聚焦45/109分钟(取决于pH梯度)和在2000V聚焦30分钟。在一些实验中，使用来自GE Healthcare LifeSciences(Immobiline DryStrip^TM pH3-10L)和Biorad(ReadyStrip^TM IPGstrips pH4-7L)的IPG胶条，并使用Biorad

i12 IEF系统按照制造商的说明聚焦蛋白质。聚焦后，将条带中的蛋白质还原(通过DTT)、烷基化(通过碘乙酰胺)并在2D SDS-PAGE上分析。对于蛋白质谱分析实验，用胶体考马斯染色凝胶，成像并比较蛋白点(Dybala和Metzger，2009)。对于免疫印迹实验，将凝胶转移至硝酸纤维素膜并使用不同抗体进行免疫印迹。

内凝胶消化和质谱：

切下的凝胶的内凝胶消化如下。将点切片、脱色、脱水和干燥，然后将干燥的凝胶切片在0.01％ProteaseMAX^TM表面活性剂(胰蛋白酶增强剂，V2071，Promega)：50mM NH₄HCO₃中20μl的12μg/μl胰蛋白酶金(V5280，Promega)再水合10分钟，然后用30μl的0.01％ProteaseMAX^TM表面活性剂：50mM NH₄HCO₃覆盖，轻轻混合并在水平摇床上37℃孵育过夜。洗脱的肽用Pierce^TM C-18吸头(ThermoFisher，87782)清洗，通过串联质谱(MS)分析进行分析，使用的是并用Manitoba大学蛋白质组学和系统生物学中心的AB SCIEXTripleTOF^TM5600系统(Applied Biosystems/MDS Sciex，Foster City，CA)。

活细胞共聚焦成像

扩增小鼠TF cDNA并克隆到pHTN-halo标记质粒中。使用大鼠神经元核转染试剂盒(VPG-1003，Amaxa，Lonza公司，Allendale，NJ，USA)和Amaxa Nucleofector-II仪器(程序0-003)，将pHTN-halo-TF质粒共转染于培养的成人原代DRG神经元中，并在涂覆有聚-L-鸟氨酸(P8638，Sigma)和层粘连蛋白的μ-Plate-24孔板(Ibidi USA，Inc.Madison，Wisconsin，USA)上培养48小时。使用100nM细胞可渗透的Halo-Tag TMRDirect配体(G8251，Promega)标记Halo-TF蛋白，并5％CO₂中于37℃的孵育15分钟。洗涤细胞，在LSM510(Zeiss)显微镜中成像。

二维BN-PAGE/SDS-PAGE分析：

在2D BN-PAGE/SDS-PAGE中，第一维天然分离多蛋白复合物，第2维变性SDS-PAGE分离MPC中相互作用的蛋白成分，其出现在垂直线上(Sabbir等人，2016)。第一维BN-PAGE和第2维SDS-PAGE如前所述进行(Sabbir等人，2016)。简而言之，细胞裂解物在补充有1X Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(1861281，Thermo Scientific)和1.5％正十二烷基b-D-麦芽糖苷(D4641，Sigma)的1X磷酸缓冲盐水(PBS)中制备并超声处理。然后在4-15％梯度蓝色-非变性聚丙烯酰胺凝胶中分离蛋白质。小心切下包括3.2％堆积凝胶的凝胶条带(各泳道)，并浸入含有新鲜制备的DTT(54mg/ml)的Laemmli样品缓冲液中。将凝胶切片在55℃下于样品缓冲液中孵育30分钟，然后将凝胶切片中的蛋白质第2维SDS-PAGE中分离并免疫印迹。

Western印迹和化学发光检测：

通过总蛋白质的SDS-PAGE分离，随后转移至硝酸纤维素膜，并使用HRP缀合的二抗进行免疫印迹检测。使用ChemiDoc^TM成像系统和Image Lab软件版本5.0 Build-18(BioRad)检测化学发光并成像。表2总结了本研究中使用的所有第一抗体和其它试剂。在添加了1XHalt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(目录号：78441，ThermoFisher Scientific)的1X RIPA裂解和提取缓冲液(目录号：89900，ThermoFisher Scientific)中制备细胞裂解物。

免疫荧光：

免疫荧光检测如下进行。将培养的DRG神经元在2％多聚甲醛(pH7.5)中固定10分钟，在1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤，用在PBS中的0.5％Triton X-100透化(PBST)，然后用在PBST中1％BSA封闭。然后将透化的神经元与一抗一起孵育，用荧光缀合物二抗检测，并在LSM510(Zeiss)共聚焦显微镜中成像。

统计分析

使用Prism7.00版(GraphPad软件)进行统计分析。使用单向ANOVA，然后进行多重比较测试(Siegel，1956；Dunn，1964)比较两组或更多组的平均值。通过Dunnett的事后多重比较测试将多个实验组的平均值与对照组进行比较，而通过Sidak的事后多重比较测试(Dunn，1964)将两个实验组之间的平均值进行比较。使用Student′s t检验(未配对)进行两组之间的比较。对于P＜0.05，结果被认为是显著的。

权利要求的范围不应被实施例中阐述的优选实施方案所限制，而应给予与说明书整体一致的最宽泛的解释。

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Z

表1：通过LC-MS/MS分析鉴定的磷酸肽列表。肽的log(e)代表谱到序列(spectrum-to-sequence)分配的期望值。

表2：使用的抗体和试剂

Claims (33)

1.一种用于确定受试者发生阿尔茨海默病或与所述疾病类似的认知障碍的风险的体外方法，所述方法包括a)测定来自所述受试者的样品中转铁蛋白或功能等同变体中目标残基的磷酸化水平，和b)将a)中获得的磷酸化水平与参考值比较，其中与参考值比较转铁蛋白或功能等同变体中目标残基的磷酸化水平的升高/降低表明所述受试者具有发展为阿尔茨海默病或与所述疾病类似的认知障碍的高危风险。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者患有轻度认知障碍。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述受试者是人，并且所述神经退行性疾病是阿尔茨海默病。

4.一种用于在患有轻度认知障碍的受试者中设计个性化疗法的体外方法，所述方法包括a)测定来自所述受试者的样品中转铁蛋白或功能等同变体中目标残基的磷酸化水平，和b)将a)中获得的磷酸化水平与参考值比较，其中与所述参考值比较转铁蛋白或功能等同变体中目标残基的磷酸化水平的升高/降低表明所述对象易于接受预防和/或治疗阿尔茨海默病或与所述疾病类似的认知障碍的治疗。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述受试者是人，并且所述疗法用于预防和/或治疗阿尔茨海默病。

6.一种用于筛选易于用预防和/或治疗阿尔茨海默病或与所述疾病类似的认知障碍的疗法治疗的患者的体外方法，所述方法包括a)测定来自受试者的样品中转铁蛋白或功能等同变体中目标残基的磷酸化水平，和b)将a)中获得的磷酸化水平与参考值比较，其中转铁蛋白或功能等同变体中目标残基的磷酸化水平与参考值比较的升高/降低表明所述受试者是接受预防和/或治疗阿尔茨海默病或与所述疾病类似的认知障碍的疗法的候选者。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述受试者是人，并且所述疗法用于预防和/或治疗阿尔茨海默病。

8.根据权利要求1至7任一项所述的方法，其中确定转铁蛋白中目标残基的磷酸化水平包括确定人转铁蛋白的丝氨酸、酪氨酸和/或苏氨酸残基的磷酸化，所述丝氨酸、酪氨酸和/或苏氨酸残基选自SEQ ID Nos 4-12中列出的片段中的丝氨酸、酪氨酸和/或苏氨酸残基，及其组合，或人转铁蛋白，或在磷酸化表中通过多个氨基酸序列比对所定义的另一转铁蛋白的位置上等同的氨基酸残基或在功能上等同的变体。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述样品选自脑脊液、血清、血浆、血液和外周血单核细胞。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，通过ELISA测定磷酸化水平。

11.磷酸化的转铁蛋白或其功能等同的变体的用途，其中所述磷酸化的转铁蛋白或变体在目标残基中被磷酸化，作为具有发展为阿尔茨海默病或类似于阿尔茨海默病的认知障碍风险的标记物。

12.根据权利要求11的用途，其中所述转铁蛋白是人源的，并且在选自下组中的一个或多个丝氨酸，酪氨酸和/或苏氨酸残基处被磷酸化：K359；K37；K508；K546；S31；S47；S51；S55；S63；S124；S136；S144；S227；S267；S298；S305；S306；S378；S381；S389；S409、S434、S454、S468；S511；S512；S520；S685；S687；S688；T24；T36；T139；T184；T200；T228；T340；T349；T355；T440；T445；T476；T537；T654；T686；T694；Y64；Y155；Y207；Y257；Y333；Y431；Y445；Y487；Y533；Y534；Y536；Y593；Y64；Y666；Y669；和Y674，及其组合，并且所述疾病是阿尔茨海默病。

13.一种试剂盒，其包含能够测定转铁蛋白中目标残基磷酸化水平的试剂。

14.根据权利要求13所述的试剂盒，其中能够测定转铁蛋白磷酸化水平的试剂选自a)一种或多种能够测定转铁蛋白磷酸化水平的试剂，其中每种所述试剂能够测定选自下组中的丝氨酸、酪氨酸和/或苏氨酸残基：K359；K37；K508；K546；S31；S47；S51；S55；S63；S124；S136；S144；S227；S267；S298；S305；S306；S378；S381；S389；S409、S434、S454、S468；S511；S512；S520；S685；S687；S688；T24；T36；T139；T184；T200；T228；T340；T349；T355；T440；T445；T476；T537；T654；T686；T694；Y64；Y155；Y207；Y257；Y333；Y431；Y445；Y487；Y533；Y534；Y536；Y593；Y64；Y666；Y669；和人转铁蛋白或其可磷酸化的功能等同变体的Y674，以及通过多个氨基酸序列比对所定义的另一转铁蛋白的位置等同的氨基酸残基。

15.根据权利要求14所述的试剂盒，其中：a)能够确定人转铁蛋白磷酸化水平的试剂是特异性识别包含表1所列人转铁蛋白序列的磷酸肽的抗体。

16.根据权利要求13至15任一项的试剂盒，其另外包含能够特异性结合磷酸化转铁蛋白的试剂。

17.根据权利要求16的试剂盒，其中能特异性结合磷酸化转铁蛋白的试剂是抗体。

18.根据权利要求16或17的试剂盒，其中能特异性结合磷酸化转铁蛋白的试剂固定在支持物上。

19.根据权利要求13至18中任一项所述的试剂盒在用于确定受试者发展为阿尔茨海默病或类似于所述疾病的认知障碍的风险、用于在患有轻度认知障碍的受试者中设计个性化疗法或用于筛选易于用预防和/或治疗阿尔茨海默病或类似于所述疾病的认知障碍的疗法治疗的患者中的用途。

20.一种筛选有患痴呆风险的个体以诊断痴呆的方法，包括：提供来自所述个体的样品；测量样品中转铁蛋白的至少一个等电点组分的水平；以及将所述至少一种等电点组分的样品水平与来自健康个体的所述至少一种等电点组分的对照水平进行比较，其中对于阳性结果，所述样品水平和所述对照水平是不同的。

21.一种筛选有患痴呆风险的个体以诊断痴呆的方法，包括：提供来自所述个体的样品；确定样品的转铁蛋白特性谱；并将样品的转铁蛋白分布与参考值比较，

其中对于阳性结果，样品的转铁蛋白谱和参考值不同。

22.根据权利要求21的方法，其中所述参考值来自已知未患有痴呆的健康个体。

23.根据权利要求20或21所述的方法，其中在阳性结果之后，对所述个体进行认知测试和/或脑成像以确定所述个体是否患有阿尔茨海默病、帕金森病或其他形式的痴呆。

24.根据权利要求20或21所述的方法，其中在阳性结果之后，安排所述个体进行认知测试和/或脑成像以确定所述个体是否患有阿尔茨海默病。

25.根据权利要求20或21的方法，其中阳性结果表明个体患有痴呆。

26.权利要求25的方法，其中所述痴呆与阿尔茨海默病、帕金森病或其他形式的痴呆相关。

27.根据权利要求20或21所述的方法，其中在阳性结果之后，向所述个体开出乙酰胆碱酯酶抑制剂和/或N-甲基-D-天冬氨酸受体抑制剂(NMDA)的处方。

28.根据权利要求20或21的方法，其中所述样品是血清样品或脑脊液样品。

29.权利要求20的方法，其中所述转铁蛋白等电点组分的水平通过测定转铁蛋白的一个或多个氨基酸残基处的修饰状态来测定，所述氨基酸残基选自：K359；K37；K508；IC546；S31；S47；S51；S55；S63；S124；S136；S144；S227；S267；S298；S305；S306；S378；S381；S389；S409、S434、S454、S468；S511；S512；S520；S685；S687；S688；T24；T36；T139；T184；T200；T228；T340；T349；T355；T440；T445；T476；T537；T654；T686；T694；Y64；Y155；Y207；Y257；Y333；Y431；Y445；Y487；Y533；Y534；Y536；Y593；Y64；Y666；Y669；以及Y674。

30.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，通过确定选自下组的转铁蛋白的一个或多个氨基酸残基的修饰状态来确定所述转铁蛋白谱：K359；K37；K508；K546；S31；S47；S51；S55；S63；S124；S136；S144；S227；S267；S298；S305；S306；S378；S381；S389；S409、S434、S454、S468；S511；S512；S520；S685；S687；S688；T24；T36；T139；T184；T200；T228；T340；T349；T355；T440；T445；T476；T537；T654；T686；T694；Y64；Y155；Y207；Y257；Y333；Y431；Y445；Y487；Y533；Y534；Y536；Y593；Y64；Y666；Y669；以及Y674。

31.根据权利要求21所述的方法，其中所述参考值来自健康个体。

32.权利要求31的方法，其中所述健康个体与所述个体年龄匹配。

33.根据权利要求21所述的方法，其中所述参考值来自所述较早时间点的个体。

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