CN110997727A - 用于确定微型猪样品中抗药物抗体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于确定微型猪样品中存在或不存在抗药物抗体(ADA)或药物/ADA免疫复合物的体外方法。本发明还涉及可应用于本发明方法中的与微型猪IgG特异性结合的抗体。

Description

用于确定微型猪样品中抗药物抗体的方法
技术领域
本发明涉及一种用于确定微型猪样品中抗药物抗体的体外方法和与微型猪IgG特异性结合的抗体。
发明背景
新治疗性抗体的临床开发需要通过适宜的测定法评估它们的潜在免疫原性(Kaliyaperumal,A.和Jing,S.,Curr.Pharm.Biotechnol.10(2009)352-358)。抗药物抗体(ADA)测试通常涉及一种两层方法：(1)检测ADA的测定法和(2)表征ADA的测定法。ADA检测测定法包括筛选和特异性验证(验证性)测定法。基于微量滴定板的酶联免疫吸附测定(ELISA)是使用最广泛的筛选ADA的样式，原因在于其高通量效率、简易性和高灵敏度(Geng,D.等人,J.Pharm.Biomed.Anal.39(2005)364-375)。ADA ELISA最经常以提供高度选择性、检测全部同种型和泛物种ADA检测能力的桥样式设计(Mire-Sluis,A.R.等人,J.Immunol.Methods 289(2004)1-16)。WO 2008031532A1中公开了一种用于检测衍生自猴物种的样品中ADA的ADA ELISA。
发明概述
本发明涉及一种确定微型猪样品中存在或不存在抗药物抗体(ADA)的体外方法，所述方法包括：
使样品与过量的药物接触，其中ADA与所述药物结合以形成药物/ADA复合物，
使药物/ADA复合物与特异性结合微型猪IgG的抗体接触，其中与微型猪IgG特异性结合的抗体不与人IgG特异性结合，
确定与微型猪IgG特异性结合的抗体对药物/ADA复合物的结合以确定样品中是否存在ADA。
在另一个方面，本发明涉及一种确定微型猪样品中存在或不存在包含药物和与药物特异性结合的抗体的免疫复合物(药物/ADA复合物)的体外方法，所述方法包括：
使微型猪样品与固定化抗体接触，所述固定化抗体特异性结合药物以固定存在于微型猪样品中的药物/ADA复合物，
使药物/ADA复合物与特异性结合微型猪IgG的抗体接触，其中与微型猪IgG特异性结合的抗体不与人IgG特异性结合，并且
确定与微型猪IgG特异性结合的抗体对药物/ADA复合物的结合以确定样品中是否存在ADA。
在本发明的一个实施方案中，与微型猪IgG特异性结合的抗体不与人IgG特异性结合。在本发明的一个实施方案中，与微型猪IgG特异性结合的抗体不与小鼠IgG特异性结合。
在本发明的一个实施方案中，与微型猪IgG特异性结合的抗体与微型猪IgG的Fc结构域特异性结合。在一个实施方案中，与微型猪IgG的Fc结构域特异性结合的抗体包含SEQID NO:3的重链的CDR1、SEQ ID NO:4的重链的CDR2、和SEQ ID NO:5的重链的CDR3、SEQ IDNO:6的轻链的CDR1、SEQ ID NO:7的轻链的CDR2、和SEQ ID NO:8的轻链的CDR3(它们对应于如本文中公开的抗体“2.8.14”的六个CDR)。
在本发明的一个实施方案中，与微型猪IgG特异性结合的抗体与微型猪IgG的Fab结构域特异性结合。在一个实施方案中，与微型猪IgG的Fab结构域特异性结合的抗体包含SEQ ID NO:11的重链的CDR1、SEQ ID NO:12的重链的CDR2、和SEQ ID NO:13的重链的CDR3、SEQ ID NO:14的轻链的CDR1、SEQ ID NO:15的轻链的CDR2、和SEQ ID NO:16的轻链的CDR3(它们对应于如本文中公开的抗体“1.2.6”的六个CDR)。在一个实施方案中，与微型猪IgG的Fab结构域特异性结合的抗体包含SEQ ID NO:19的重链的CDR1、SEQ ID NO:20的重链的CDR2、和SEQ ID NO:21的重链的CDR3、SEQ ID NO:22的轻链的CDR1、SEQ ID NO:23的轻链的CDR2、和SEQ ID NO:24的轻链的CDR3(它们对应于如本文中公开的抗体“2.3.8”的六个CDR)。在一个实施方案中，与微型猪IgG的Fab结构域特异性结合的抗体包含SEQ ID NO:27的重链的CDR1、SEQ ID NO:28的重链的CDR2、和SEQ ID NO:29的重链的CDR3、SEQ ID NO:30的轻链的CDR1、SEQ ID NO:31的轻链的CDR2、和SEQ ID NO:32的轻链的CDR3(它们对应于如本文中公开的抗体“2.11.16”的六个CDR)。
在本发明的一个实施方案中药物是药物抗体(DA)。
在本发明的一个实施方案中，该方法是夹心测定法，其中步骤a)中，使药物/ADA复合物与特异性结合人IgG的抗体接触，其中使特异性结合人IgG的抗体固定在支持物上，因而使药物/ADA复合物固定在支持物上，并且其中根据步骤b)使固定的药物/ADA复合物随后与抗体接触，所述抗体是与微型猪IgG特异性结合的抗体。
本发明的另一个方面是与微型猪IgG特异性结合的抗体，所述抗体包含SEQ IDNO:3的重链的CDR1、SEQ ID NO:4的重链的CDR2、和SEQ ID NO:5的重链的CDR3、SEQ ID NO:6的轻链的CDR1、SEQ ID NO:7的轻链的CDR2、和SEQ ID NO:8的轻链的CDR3(它们对应于如本文中公开的抗体“2.8.14”的六个CDR)。
本发明的另一个方面是与微型猪IgG特异性结合的抗体，所述抗体包含SEQ IDNO:11的重链的CDR1、SEQ ID NO:12的重链的CDR2、和SEQ ID NO:13的重链的CDR3、SEQ IDNO:14的轻链的CDR1、SEQ ID NO:15的轻链的CDR2、和SEQ ID NO:16的轻链的CDR3(它们对应于如本文中公开的抗体“1.2.6”的六个CDR)。
本发明的另一个方面是与微型猪IgG特异性结合的抗体，所述抗体包含SEQ IDNO:19的重链的CDR1、SEQ ID NO:20的重链的CDR2、和SEQ ID NO:21的重链的CDR3、SEQ IDNO:22的轻链的CDR1、SEQ ID NO:23的轻链的CDR2、和SEQ ID NO:24的轻链的CDR3(它们对应于如本文中公开的抗体“2.3.8”的六个CDR)。
本发明的另一个方面是与微型猪IgG特异性结合的抗体，所述抗体包含SEQ IDNO:27的重链的CDR1、SEQ ID NO:28的重链的CDR2、和SEQ ID NO:29的重链的CDR3、SEQ IDNO:30的轻链的CDR1、SEQ ID NO:31的轻链的CDR2、和SEQ ID NO:32的轻链的CDR3(它们对应于如本文中公开的抗体“2.11.16”的六个CDR)。
本发明的另一个方面是用于确定微型猪样品中存在或不存在抗药物抗体(ADA)的方法中的与微型猪IgG特异性结合的本发明抗体。
本发明的方法和抗体允许可靠地检测微型猪样品(例如血浆、玻璃体液和眼房水)中的ADA和药物/ADA复合物。本发明的抗体显示与来自人类或小鼠的IgG无相关交叉反应性。本发明的抗体特别合适应用于本发明的方法中，因为它们显示低的信噪比。本发明的方法允许在高药物剂量存在下(例如在玻璃体液样品中)可靠的检测。因此，这些方法例如有利于评估响应于眼科药物所形成的ADA。
附图简述
图1：单克隆抗微型猪IgG 2.8.14和从Abd-Serotec市售的HRP缀合多克隆抗猪IgG(pAb)和洋地黄毒苷化(digoxigenated)单克隆抗猪IgG(mAb)与来自微型猪、人、狒狒、恒河猴、食蟹猴、狨猴、犬、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠和兔的IgG的结合(如实施例3中所述那样评估)。
图2：单克隆抗微型猪IgG 2.8.14和2.3.8和市售的多克隆抗猪IgG抗体与不同的人IgG1类药物抗体的结合(如实施例4中所述那样评估)。
图3：用于检测来自微型猪样品的药物/ADA复合物的方法(无预温育的IC测定法)[本发明方法]的例举的示意图
图4：本发明的抗微型猪IgG单克隆抗体对比市售抗猪IgG抗体在用于检测微型猪样品中药物/ADA复合物的本发明方法(无与药物预温育的IC测定法)中的应用。关于实验的描述，参见实施例5。
图5：用于检测来自微型猪样品的ADA的方法(有预温育的IC测定法)[本发明方法]的例举的示意图
图6：本发明的抗微型猪IgG单克隆抗体对比市售抗猪IgG抗体在用于检测微型猪样品中ADA的本发明方法(有与药物预温育的IC测定法)中的应用。关于实验的描述，参见实施例6。
图7：与通过如实施例7中所述的桥接测定法的检测相比，使用本发明方法(有与药物预温育的IC测定法)检测来自微型猪样品的ADA。
本发明的详细描述
1.定义
除非本文另外定义，否则与本发明相关使用的科学和技术术语应当具有本领域普通技术人员通常理解的含义。另外，除非上下文所要求，单数术语应当包括复数并且复数术语应当包括单数。本公开的方法和技术总体上根据本领域熟知的常规方法进行。总体上，联系本发明使用的命名和本文所述的生物化学、酶学、分子与细胞生物学、微生物学、遗传学和蛋白质与核酸化学及杂交的技术是本领域熟知和常使用的那些。
除非本文另外规定，否则术语“包含(comprising of)”应当包括术语“由……组成”。
术语“抗体”在本文中以最广意义使用并且涵盖多种抗体结构物，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。
术语“抗微型猪IgG抗体”和“与微型猪IgG结合的抗体”指这样的抗体，所述抗体能够以足够亲和力结合微型猪IgG，从而该抗体可用作靶向微型猪IgG中的诊断剂。在某些实施方案中，与微型猪IgG结合的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM，或≤0.001nM(例如，10-8M或更小，例如，10-8M至10-13M，例如，10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。
当某抗体具有1μM或更小的Kd时，称该抗体与其靶“特异性结合”。因此，不与其靶特异性结合的抗体在此理解为具有超过1μM的Kd。
如本文所用的术语“药物”指治疗活性化合物。如本文所用的术语“药物抗体”指可以施用至个体以治疗疾病的抗体，例如，治疗用单克隆抗体。药物抗体(治疗用单克隆抗体)正在广泛地用于治疗多种疾病，如肿瘤学疾病(例如，血液学肿瘤和实体恶性肿瘤，包括非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌和结直肠癌)、免疫学疾病、中枢神经疾病、血管疾病或传染性疾病。这类抗体例如由Levene,A.P.等人,Journal of the Royal Society of Medicine 98(2005)145-152描述。这类抗体例如是针对CD20、CD22、HLA-DR、CD33、CD52、EGFR、G250、GD3、HER2、PSMA、CD56、VEGF、VEGF2、CEA、Lewis Y抗原、IL-6受体、或IGF-1受体的抗体。治疗性抗体还由Groner,B.等人,Curr.Mol.Meth.4(2004)539-547；Harris,M.,Lancet Oncol.5(2004)292-302描述。
如本文所用的“抗药物抗体”或“ADA”指与药物(例如，药物抗体)特异性结合的抗体。作为患者的免疫原性反应，ADA可能在抗体疗法期间形成(参见Pan,Y.等人,FASEB J.9(1995)43-49)。如若药物是药物抗体，则ADA可以特异性结合于药物抗体的任何区域，例如，药物抗体的可变结构域、恒定结构域或糖结构。然而，在许多情况下，ADA可以与药物抗体的一个或多个互补决定区结合。
如本文所用的“可变结构域”或“可变区”指直接参与抗体与抗原结合的每对轻链和重链。轻链的可变结构域缩写为“VL”并且轻链的可变结构域缩写为“VH”。人轻链和人重链的可变结构域具有相同的总体结构。每个可变结构域包含四个其序列广泛保守的构架(FR)区域。FR由三个“高变区”(或“互补决定区”，CDR)连接。每条链上的CDR由这类构架氨基酸分隔。因此，抗体的轻链和重链从N端至C端方向包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。FR采取β-折叠构象并且CDR可以形成连接β-折叠结构的环。每条链中CDR由FR按其三维结构固定并且与来自另一条链的CDR一起形成“抗原结合位点”。特别地，重链的CDR3是对抗原结合作用贡献最大的区域。根据Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991)的标准定义确定CDR区和FR区。
出于本文目的，“接纳体人类构架”是这样的构架，其包含从如下文定义的人免疫球蛋白构架或人共有序列构架衍生的轻链可变结构域(VL)构架或重链可变结构域(VH)构架的氨基酸序列。“衍生自”人免疫球蛋白构架或人共有构架的接纳体人类构架可以包含其相同的氨基酸序列，或它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10个或更小、9个或更小、8个或更小、7个或更小、6个或更小、5个或更小、4个或更小、3个或更小、或2个或更小。在一些实施方案中，VL接纳体人类构架在序列上与VL人免疫球蛋白构架序列或人类共有构架序列相同。
“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区(HVR)中存在一个或多个改变的抗体，其中与不拥有这些改变的亲本抗体相比，这类改变导致抗体对抗原的亲和力改善。
“抗体片段”指不同于完整抗体的分子，所述分子包括完整抗体的一部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和从抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文所用，“Fab片段”指这样的抗体片段，其包含轻链(CL)的含有VL结构域和恒定结构域的轻链片段以及重链的VH结构域和第一恒定结构域(CH1)。
术语“Fc区”在本文中用来定义免疫球蛋白重链的含有至少一部分恒定区的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。
抗体的“类别”指由其重链拥有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五个主要的抗体类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的几个类别可以进一步划分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称作α、δ、ε、γ和μ。
“构架”或“FR”指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR序列和FR序列通常按以下顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完好抗体”和“完整抗体”在本文中可互换地用来指一种抗体，所述抗体具有基本上与天然抗体结构相似的结构或具有含有如本文定义的Fc区的重链。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变结域的下述每个区域，所述区域在序列上高变(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上确定的环(“高变环”)，和/或含有抗原接触残基(“抗原触点”)。通常，抗体包含六个HVR：VH中三个(H1、H2、H3)和VL中三个(L1、L2、L3)。本文中的示例性HVR包括：
(a)出现在第26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)氨基酸残基处的高变环(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；
(b)出现在第24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)氨基酸残基处的CDR(Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；
(c)出现在氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处的抗原触点(MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；和
(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。
本文对抗微型猪IgG抗体所指的互补决定区(CDR)依据IMGT编号体系(Lefranc,M.-P.等人,Nucleic Acids Research,27,209-212(1999))确定。
相对于参比多肽序列的“百分数(％)氨基酸序列同一性”定义为对齐所述序列并根据需要引入空位以实现最大百分数序列同一性且出于比对目的，不将任何保性置换视为序列同一性的部分之后，候选序列中与参比多肽序列中氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。为了确定氨基酸序列同一性百分数的比对可以按本领域能力范围内的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、Clustal W、Megalign(DNASTAR)软件或FASTA程序包。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内最大比对所需要的任何算法。然而，为了本文的目的，使用FASTA软件包36.3.8c版或更新版本的ggsearch程序配合BLOSUM50比较矩阵，生成％氨基酸序列同一性值。FASTA程序包由W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988),“Improved Tools forBiological Sequence Analysis”,PNAS 85:2444-2448；W.R.Pearson(1996)“Effectiveprotein sequence comparison”Meth.Enzymol.266:227-258；和Pearson等人(1997)Genomics 46:24-36原创并且可从fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml公开获得。备选地，在fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi可访问的公共服务器可以用来使用ggsearch(global protein:protein)程序和默认选项(BLOSUM50；开口罚分：-10；延伸罚分：-2；Ktup＝2)，比较序列，以确保进行全局比对而非局部比对。输出比对结果标题中给出氨基酸同一性百分数。
在一个实施方案中，本发明的抗体是单克隆抗体。如本文所用，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指单一氨基酸组成的抗体分子制备物。
“人抗体”是这样一种抗体，其拥有对应于人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列或从利用人抗体库或其他编码人抗体的序列的非人来源衍生。人抗体的这种定义特别排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人源化”抗体指包含来自非人类HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个和一般两个可变结构域，其中全部或基本上全部的HVR(例如，CDR)与非人抗体的那些HVR对应并且全部或基本上全部的FR区与人抗体的那些FR对应。人源化抗体任选地可以包含从人抗体衍生的抗体恒定区的至少一部分。抗体例如非人抗体的“人源化形式”指已经历过人源化的抗体。
如本文所用的术语抗体显示“与来自人类的IgG无相关交叉反应性”或“与来自小鼠的IgG无相关交叉反应”或其等同物，指抗体分别不与人IgG或小鼠IgG特异性结合，即显示来自相应抗原的(Kd)10-7mol/L或更大的解离常数。
术语“微型猪样品”包括任何量的从微型猪分离的物质。这类物质包括但不限于来自这种个体的全血、血清或血浆，这些物质是临床前日常工作中最广泛使用的样品来源。这类物质还包括玻璃体液或眼房水。
如本文中联系本发明方法所用的术语“支持物”或“固相”意指适合使IgG分子于其上固定的固态物质。可以可互换地使用这两个术语。支持物包括由材料如聚合物、金属(顺磁性、铁磁性粒子)、玻璃和陶瓷制成的粒子(包括微粒子和珠)；凝胶物质如二氧化硅、氧化铝和聚合物凝胶；可以由聚合物、金属、玻璃、和/或陶瓷构成的毛细管；沸石和其他多孔物质；电极；微量滴定板；固态条；比色皿、管或其他谱仪样品容器。支持物可以是固定组件，如管、条、比色皿或微量滴定板，或可以是非固定组件，如珠和微粒子。
技术人员熟知免疫测定法。相关教材中总结了用于实施此类测定法的方法以及实际的应用和程序。相关教材的实例是Tijssen,P.,Preparation of enzyme-antibody orother enzyme-macromolecule conjugates,引自：Practice and theory of enzymeimmunoassays,Burdon,R.H.和v.Knippenberg,P.H.(编著),Elsevier,Amsterdam(1990)第221-278页；和Colowick,S.P.和Caplan,N.O.(编著),"Methods in Enzymology",AcademicPress中涉及免疫检测方法的各卷，尤其第70、第73、第74、第84、第92和第121卷。
如本文所用的术语“可检测标记物”指能够通过本领域已知手段检测到的物质。可检测标记物可以是直接可检测的，例如生色原(荧光或发光基团和染料)，或是间接可检测的，例如酶或半抗原，如洋地黄毒苷。在一个实施方案中，可检测标记物是半抗原，并且使用酶偶联半抗原特异性抗体，通过在颜色变化试验中评估酶活性，使半抗原特异性抗体与半抗原的结合可视化，实施检测。
2.本发明实施方案的详细描述
在一个方面，本发明提供一种从分离自微型猪的样品确定存在或不存在响应于施加至微型猪的药物所形成的抗药物抗体(ADA)的方法。该方法是一种免疫测定法，其允许检测使药物与微型猪样品接触时所形成的包含药物和ADA的免疫复合物(“药物/ADA复合物”)。药物/ADA复合物由特异性结合微型猪IgG的抗体(“抗微型猪IgG抗体”)结合，并且转而检测抗微型猪IgG抗体与药物/ADA复合物的结合并且所述结合提示样品中存在ADA。这种方法允许检测已经存在于微型猪样品中的药物/ADA复合物和来自初始样品的未复合的ADA。
因此，在一个方面，本发明涉及一种确定微型猪样品中存在或不存在抗药物抗体(ADA)的体外方法，所述方法包括：
a)使样品与过量的药物接触，其中ADA与所述药物结合以形成药物/ADA复合物，
b)使药物/ADA复合物与特异性结合微型猪IgG的抗体接触，其中与微型猪IgG特异性结合的抗体不与人IgG结合，并且
c)确定与微型猪IgG特异性结合的抗体对药物/ADA复合物的结合以确定样品中是否存在ADA。
在一个实施方案中，在步骤a)中，药物固定在支持物上。
在另一个方面，本发明提供一种确定微型猪样品中存在或不存在药物/ADA复合物的方法。该方法是一种免疫测定法，其允许从微型猪样品直接检测药物/ADA复合物，不包括将微型猪样品与药物预温育的步骤。来自样品的药物/ADA复合物由特异性结合药物的抗体结合，并且转而检测药物/ADA复合物与特异性结合药物的抗体的结合并且所述结合提示样品中存在药物/ADA复合物。
因此，在这个方面，本发明涉及一种确定微型猪样品中存在或不存在包含药物和与药物特异性结合的抗体的免疫复合物(药物/ADA复合物)的体外方法，所述方法包括：
a)使微型猪样品与固定化抗体接触，所述固定化抗体特异性结合药物以固定存在于微型猪样品中的药物/ADA复合物，
b)使药物/ADA复合物与特异性结合微型猪IgG的抗体接触，其中与微型猪IgG特异性结合的抗体不与人IgG结合，并且
c)确定与微型猪IgG特异性结合的抗体对药物/ADA复合物的结合以确定样品中是否存在ADA。
本发明的两种方法按所示的依次顺序实施，即步骤a)接着是步骤b)，转而接续步骤c)。以下实施方案适用于本发明的两种方法，即用于检测微型猪样品中存在或不存在ADA的方法以及用于检测微型猪样品中存在或不存在药物/ADA复合物的方法：
在本发明方法的一个实施方案中，与微型猪IgG特异性结合的抗体不与人IgG特异性结合。在本发明方法的一个实施方案中，与微型猪IgG特异性结合的抗体不与小鼠IgG特异性结合。在本发明方法的一个实施方案中，与微型猪IgG特异性结合的抗体不与人IgG和小鼠IgG特异性结合。
因而，该测定法的灵敏度和可靠性改进，原因是可以最大限度减少或甚至排除例如由结合于人类或小鼠物种的药物抗体所致的背景变化。
在本发明方法的一个实施方案中，与微型猪IgG特异性结合的抗体与微型猪IgG的Fc结构域特异性结合。
在本发明方法的一个实施方案中，与微型猪IgG特异性结合的抗体与微型猪IgG的Fab结构域特异性结合。
在本发明方法的一个实施方案中，至少一种与微型猪IgG的Fab结构域特异性结合的抗体和至少一种与微型猪IgG的Fc结构域特异性结合的抗体用于步骤b)中。
在本发明方法的一个实施方案中，将步骤a)中所使用的药物固定在支持物上。
在本发明方法的一个实施方案中，药物是药物抗体(DA)。在一个实施方案中，药物抗体是人抗体或人源化抗体。在一个实施方案中，药物抗体是IgG抗体。在一个实施方案中，药物抗体是人或人源化IgG抗体。在一个实施方案中，药物抗体是Fab片段。
在本发明方法的一个实施方案中，其中药物抗体是Fab片段，使用与微型猪IgG的Fab结构域特异性结合的抗体实施步骤b)。
在本发明方法的一个实施方案中，该方法是夹心测定法，其中使药物/ADA复合物与特异性结合人IgG的抗体接触，其中使特异性结合人IgG的抗体固定在支持物上，因而使药物/ADA复合物固定在支持物上，并且其中根据本发明方法的步骤b)使固定的药物/ADA复合物随后与抗体接触，所述抗体是与微型猪IgG特异性结合的抗体。
在本发明方法的一个实施方案中，与微型猪IgG特异性结合的抗体与可检测标记物缀合。在一个实施方案中，可检测标记物是半抗原。在一个实施方案中，可检测标记物是洋地黄毒苷。
本发明还涉及与微型猪IgG特异性结合的抗体。本发明的抗体特异性结合微型猪IgG的Fc或Fab部分并且显示与来自人类和小鼠的IgG无相关交叉反应性。本发明的抗体特别可用于确定微型猪样品中存在或不存在抗药物抗体(ADA)的本发明方法中。
在一个方面，本发明涉及与微型猪IgG特异性结合的抗体，所述抗体包含SEQ IDNO:3的重链的CDR1、SEQ ID NO:4的重链的CDR2、和SEQ ID NO:5的重链的CDR3、SEQ ID NO:6的轻链的CDR1、SEQ ID NO:7的轻链的CDR2、和SEQ ID NO:8的轻链的CDR3。在一个实施方案中，所述抗体包含VH序列和VL序列，所述VH序列与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少95％序列同一性，所述VL序列与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有具有至少95％序列同一性。在一个实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO:1的VH序列和SEQ ID NO:2的VL序列。CDR以及VH和VL氨基酸序列对应于如本文中公开的抗体“2.8.14”的CDR和可变结构域，所述抗体与微型猪IgG的Fc结构域特异性结合。
在一个方面，本发明涉及与微型猪IgG特异性结合的抗体，所述抗体包含SEQ IDNO:11的重链的CDR1、SEQ ID NO:12的重链的CDR2、和SEQ ID NO:13的重链的CDR3、SEQ IDNO:14的轻链的CDR1、SEQ ID NO:15的轻链的CDR2、和SEQ ID NO:16的轻链的CDR3。在一个实施方案中，所述抗体包含VH序列和VL序列，所述VH序列与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少95％序列同一性，所述VL序列与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有具有至少95％序列同一性。在一个实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO:9的VH序列和SEQ ID NO:10的VL序列。CDR以及VH和VL氨基酸序列对应于如本文中公开的抗体“1.2.6”的CDR和可变结构域，所述抗体与微型猪IgG的Fab结构域特异性结合。
在一个方面，本发明涉及与微型猪IgG特异性结合的抗体，所述抗体包含SEQ IDNO:19的重链的CDR1、SEQ ID NO:20的重链的CDR2、和SEQ ID NO:21的重链的CDR3、SEQ IDNO:22的轻链的CDR1、SEQ ID NO:23的轻链的CDR2、和SEQ ID NO:24的轻链的CDR3。在一个实施方案中，所述抗体包含VH序列和VL序列，所述VH序列与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少95％序列同一性，所述VL序列与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有具有至少95％序列同一性。在一个实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO:17的VH序列和SEQ ID NO:18的VL序列。CDR以及VH和VL氨基酸序列对应于如本文中公开的抗体“2.3.8”的CDR和可变结构域，所述抗体与微型猪IgG的Fab结构域特异性结合。
在一个方面，本发明涉及与微型猪IgG特异性结合的抗体，所述抗体包含SEQ IDNO:27的重链的CDR1、SEQ ID NO:28的重链的CDR2、和SEQ ID NO:29的重链的CDR3、SEQ IDNO:30的轻链的CDR1、SEQ ID NO:31的轻链的CDR2、和SEQ ID NO:32的轻链的CDR3。在一个实施方案中，所述抗体包含VH序列和VL序列，所述VH序列与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少95％序列同一性，所述VL序列与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有具有至少95％序列同一性。在一个实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO:25的VH序列和SEQ ID NO:26的VL序列。CDR以及VH和VL氨基酸序列对应于如本文中公开的抗体“2.11.16”的CDR和可变结构域，所述抗体与微型猪IgG的Fab结构域特异性结合。
本发明的另一个方面是本发明抗体在确定微型猪样品中存在或不存在抗药物抗体(ADA)的方法中的用途。在一个实施方案中，本发明的抗体用于本发明的方法中。
3.本发明的具体实施方案
在下文中列出本发明的以下具体实施方案。
1.确定微型猪样品中存在或不存在抗药物抗体(ADA)的体外方法，所述方法包括：
a)使样品与过量的药物接触，其中ADA与所述药物结合以形成药物/ADA复合物，
b)使药物/ADA复合物与特异性结合微型猪IgG的抗体接触，其中与微型猪IgG特异性结合的抗体不与人IgG结合，并且
c)确定与微型猪IgG特异性结合的抗体对药物/ADA复合物的结合以确定样品中是否存在ADA。
2.实施方案1的方法，其中步骤a)中，将药物固定在支持物上。
3.确定微型猪样品中存在或不存在包含药物和与药物特异性结合的抗体的免疫复合物(药物/ADA复合物)的体外方法，所述方法包括：
a)使微型猪样品与固定化抗体接触，所述固定化抗体特异性结合药物以固定存在于微型猪样品中的药物/ADA复合物，
b)使药物/ADA复合物与特异性结合微型猪IgG的抗体接触，其中与微型猪IgG特异性结合的抗体不与人IgG结合，并且
c)确定与微型猪IgG特异性结合的抗体对药物/ADA复合物的结合以确定样品中是否存在ADA。
4.实施方案1至3中任一实施方案的方法，其中与微型猪IgG特异性结合的抗体不与人IgG特异性结合。
5.实施方案1至4中任一实施方案的方法，其中与微型猪IgG特异性结合的抗体不与小鼠IgG特异性结合。
6.实施方案1至5中任一实施方案的方法，其中与微型猪IgG特异性结合的抗体与微型猪IgG的Fc结构域特异性结合。
7.实施方案6的方法，其中与微型猪IgG的Fc结构域特异性结合的抗体包含SEQ IDNO:3的重链的CDR1、SEQ ID NO:4的重链的CDR2、和SEQ ID NO:5的重链的CDR3、SEQ ID NO:6的轻链的CDR1、SEQ ID NO:7的轻链的CDR2、和SEQ ID NO:8的轻链的CDR3(它们对应于如本文中公开的抗体“2.8.14”的六个CDR)。
8.实施方案6或7的方法，其中与微型猪IgG的Fc结构域特异性结合的抗体包含SEQID NO:1的VH序列和SEQ ID NO:2的VL序列(它们对应于如本文中公开的抗体“2.8.14”的可变结构域)。
9.实施方案1至5中任一实施方案的方法，其中与微型猪IgG特异性结合的抗体与微型猪IgG的Fab结构域特异性结合。
10.实施方案9的方法，其中与微型猪IgG的Fab结构域特异性结合的抗体包含SEQID NO:11的重链的CDR1、SEQ ID NO:12的重链的CDR2、和SEQ ID NO:13的重链的CDR3、SEQID NO:14的轻链的CDR1、SEQ ID NO:15的轻链的CDR2、和SEQ ID NO:16的轻链的CDR3(它们对应于如本文中公开的抗体“1.2.6”的六个CDR)。
11.实施方案9或10的方法，其中与微型猪IgG的Fab结构域特异性结合的抗体包含SEQ ID NO:9的VH序列和SEQ ID NO:10的VL序列(它们对应于如本文中公开的抗体“1.2.6”的可变结构域)。
12.实施方案9的方法，其中与微型猪IgG的Fab结构域特异性结合的抗体包含SEQID NO:19的重链的CDR1、SEQ ID NO:20的重链的CDR2、和SEQ ID NO:21的重链的CDR3、SEQID NO:22的轻链的CDR1、SEQ ID NO:23的轻链的CDR2、和SEQ ID NO:24的轻链的CDR3(它们对应于如本文中公开的抗体“2.3.8”的六个CDR)。
13.实施方案9或12的方法，其中与微型猪IgG的Fab结构域特异性结合的抗体包含SEQ ID NO:17的VH序列和SEQ ID NO:18的VL序列(它们对应于如本文中公开的抗体“2.3.8”的可变结构域)。
14.实施方案9的方法，其中与微型猪IgG的Fab结构域特异性结合的抗体包含SEQID NO:27的重链的CDR1、SEQ ID NO:28的重链的CDR2、和SEQ ID NO:29的重链的CDR3、SEQID NO:30的轻链的CDR1、SEQ ID NO:31的轻链的CDR2、和SEQ ID NO:32的轻链的CDR3(它们对应于如本文中公开的抗体“2.11.16”的六个CDR)。
15.实施方案9或14的方法，其中与微型猪IgG的Fab结构域特异性结合的抗体包含SEQ ID NO:25的VH序列和SEQ ID NO:26的VL序列(它们对应于如本文中公开的抗体“2.11.16”的可变结构域)。
16.前述实施方案之一的方法，其中至少一种与微型猪IgG的Fab结构域特异性结合的抗体和至少一种与微型猪IgG的Fc结构域特异性结合的抗体用于步骤b)中。
17.实施方案1至16中任一实施方案的方法，其中药物是药物抗体(DA)。
18.实施方案17的方法，其中药物抗体是人抗体或人源化抗体。
19.实施方案17或18的方法，其中药物抗体是IgG抗体。
20.实施方案17至19中任一实施方案的方法，其中药物抗体是Fab片段。
21.实施方案20的方法，其中与微型猪IgG的Fab结构域特异性结合的抗体用于步骤b)中。
22.实施方案21的方法，其中与微型猪IgG的Fab结构域特异性结合的抗体选自实施方案7至13中所定义的抗体。
23.实施方案17至22中任一实施方案的方法，其中方法是夹心测定法，其中步骤a)中，使药物/ADA复合物与特异性结合人IgG的抗体接触，其中使特异性结合人IgG的抗体固定在支持物上，因而使药物/ADA复合物固定在支持物上，并且
其中根据步骤b)使固定的药物/ADA复合物随后与抗体接触，所述抗体是与微型猪IgG特异性结合的抗体。
24.实施方案1至23中任一实施方案的方法，其中与微型猪IgG特异性结合的抗体与可检测标记物缀合。
25.实施方案24的方法，其中可检测标记物是洋地黄毒苷。
26.与微型猪IgG特异性结合的抗体，所述抗体包含SEQ ID NO:3的重链的CDR1、SEQ ID NO:4的重链的CDR2、和SEQ ID NO:5的重链的CDR3、SEQ ID NO:6的轻链的CDR1、SEQID NO:7的轻链的CDR2、和SEQ ID NO:8的轻链的CDR3(它们对应于如本文中公开的抗体“2.8.14”的六个CDR)。
27.根据实施方案26的抗体，所述抗体包含VH序列和VL序列，所述VH序列与SEQ IDNO:1的氨基酸序列具有至少95％序列同一性，所述VL序列与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有具有至少95％序列同一性。
28.根据实施方案26或27的抗体，所述抗体包含SEQ ID NO:1的VH序列和SEQ IDNO:2的VL序列(它们对应于如本文中公开的抗体“2.8.14”的可变结构域)。
29.与微型猪IgG特异性结合的抗体，所述抗体包含SEQ ID NO:11的重链的CDR1、SEQ ID NO:12的重链的CDR2、和SEQ ID NO:13的重链的CDR3、SEQ ID NO:14的轻链的CDR1、SEQ ID NO:15的轻链的CDR2、和SEQ ID NO:16的轻链的CDR3(它们对应于如本文中公开的抗体“1.2.6”的六个CDR)。
30.实施方案29的抗体，所述抗体包含VH序列和VL序列，所述VH序列与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少95％序列同一性，所述VL序列与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有具有至少95％序列同一性。
31.实施方案29的抗体，所述抗体包含SEQ ID NO:9的VH序列和SEQ ID NO:10的VL序列(它们对应于如本文中公开的抗体“1.2.6”的可变结构域)。
32.与微型猪IgG特异性结合的抗体，所述抗体包含SEQ ID NO:19的重链的CDR1、SEQ ID NO:20的重链的CDR2、和SEQ ID NO:21的重链的CDR3、SEQ ID NO:22的轻链的CDR1、SEQ ID NO:23的轻链的CDR2、和SEQ ID NO:24的轻链的CDR3(它们对应于如本文中公开的抗体“2.3.8”的六个CDR)。
33.实施方案32的抗体，所述抗体包含VH序列和VL序列，所述VH序列与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少95％序列同一性，所述VL序列与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有具有至少95％序列同一性。
34.实施方案32的抗体，所述抗体包含SEQ ID NO:17的VH序列和SEQ ID NO:18的VL序列(它们对应于如本文中公开的抗体“2.3.8”的可变结构域)。
35.与微型猪IgG特异性结合的抗体，所述抗体包含SEQ ID NO:27的重链的CDR1、SEQ ID NO:28的重链的CDR2、和SEQ ID NO:29的重链的CDR3、SEQ ID NO:30的轻链的CDR1、SEQ ID NO:31的轻链的CDR2、和SEQ ID NO:32的轻链的CDR3(它们对应于如本文中公开的抗体“2.11.16”的六个CDR)。
36.实施方案35的抗体，所述抗体包含VH序列和VL序列，所述VH序列与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少95％序列同一性，所述VL序列与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有具有至少95％序列同一性。
37.实施方案35的抗体，所述抗体包含SEQ ID NO:25的VH序列和SEQ ID NO:26的VL序列(它们对应于如本文中公开的抗体“2.11.16”的可变结构域)。
38.实施方案26至37中之一的抗体，用于确定微型猪样品中存在或不存在抗药物抗体(ADA)的方法中。
39.实施方案26至37中之一的抗体，用于实施方案1至25中之一的方法中。
氨基酸序列的描述
Figure BDA0002380677130000181
Figure BDA0002380677130000191
实施例
提供以下实施例以辅助理解本发明，所附权利要求书中阐述本发明的真实范围。可以理解，可以对所述方法作修改而不脱离本发明的精神。
实施例1:
微型猪IgG的产生
来自微型猪的血清经
Figure BDA0002380677130000201
380脱脂并用硫酸铵(至2.0M)沉淀。将沉淀物在磷酸盐缓冲液中均化并对磷酸盐缓冲液，pH 7.0透析。在pH 7.0通过DEAE离子交换色谱分离混合物并且将流通物中的IgG浓缩并通过凝胶过滤纯化。
实施例2：
单克隆抗微型猪IgG抗体的产生
通过用衍生自微型猪血清的微型猪IgG免疫接种小鼠和后续杂交瘤选择，产生抗微型猪抗体。在人IgG存在下筛选适宜的克隆，以选择对检测针对人或人源化IgG药物抗体的ADA的预期应用最有强效的抗体。
a)小鼠的免疫
用90μg与CFA(弗氏完全佐剂)混合的微型猪IgG分别对雌性BALB/c或NMRI小鼠进行腹膜内初次免疫接种。初次免疫接种后6周和10周，接着用IFA(弗氏不完全佐剂)配制的90μg微型猪IgG进一步两次腹膜内免疫接种。随后，分别在处死动物前三天和前两天，用50μg微型猪IgG进行一次腹膜内强化免疫接种和用配制于PBS缓冲液中的25μg微型猪IgG进行一次静脉内强化免疫接种，并且将脾细胞如下文描述用于产生杂交瘤。
b)融合和克隆
使用聚乙二醇，通过标准程序将根据a)免疫接种的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合。简而言之，将大约1x 108个脾细胞与大约2x 107个骨髓瘤细胞(P3x63-Ag8.653)在RPMI-1640中混合并且离心(10分钟，250x g)。用RPMI-1640洗涤细胞一次并再次离心。此后，向细胞沉淀物逐滴添加1ml PEG(聚乙二醇)。在水浴槽于37℃温育1分钟后，向细胞逐滴添加5mlRPMI-1640。随后，用RPMI-1640填充细胞悬液直至30ml。在离心(10分钟，180x g)后，将细胞重悬于选择培养基(RPMI-1640，补充有10％FCS、100U/ml IL-6、2mM L-谷氨酰胺、100μMNEAA、1mM丙酮酸钠、24μM 2-巯基乙醇、1x偶氮丝氨酸/次黄嘌呤(Sigma-Aldrich))中。在37℃培养24小时后，将细胞铺种至96孔细胞培养平板中。在培养10天后，如下文描述那样分析原代培养物的微型猪IgG特异性抗体产生情况。使用流式细胞仪(FACSAria，BDBiosciences)，通过单细胞分选法克隆选择的原代培养物。在补充有10％FCS、50U/ml IL-6、2mM L-谷氨酰胺、100μM NEAA、1mM丙酮酸钠、24μM 2-巯基乙醇的RPMI-1640中培育细胞克隆。如下文描述对建立的单克隆杂交瘤细胞系复测特异性。
c)选择表达与人IgG无相关交叉反应性的抗微型猪抗体的杂交瘤
初次筛选
为了鉴定分泌抗微型猪抗体的杂交瘤，将链霉亲和素预包被的微量滴定板(MTP)(MicroCoat,Bernried,德国)用每孔100μl生物素酰化的微型猪IgG(PBS/1.0％(w/v)BSA中250ng/ml)在室温(RT)包被1小时。随后，用洗涤缓冲液(0.9％(w/v)NaCl/0.05％
Figure BDA0002380677130000211
20)洗涤各孔3次。此后，将75μL杂交瘤细胞培养上清液添加至每个孔并且在室温温育1小时。在洗涤后，添加100μL多克隆绵羊抗小鼠Fc抗体的辣根过氧化物酶标记F(ab')2片段，以检测结合的抗体，并且在室温温育1小时。在洗涤后，向每个孔添加100μL
Figure BDA0002380677130000212
(Roche，德国)并且在微量滴定板读数仪中于405nm和492nm 405/492测量消光(OD)。这种筛选导致选择与微型猪IgG结合的抗体。
第二筛选
为了鉴定那些对人IgG显示最低交叉反应性的抗微型猪抗体，进行以下竞争测定。将重组链霉亲和素预包被的MTP(MicroCoat)用每孔100μl生物素酰化的微型猪IgG(PBS/1.0％BSA中250ng/ml)如上文所述室温包被。随后，用0.9％NaCl/0.05％
Figure BDA0002380677130000213
洗涤包被的平板。在下一个步骤中，向各孔添加37.5μl抗微型猪抗体(杂交瘤细胞培养上清液)和37.5μl多克隆人IgG(终浓度40mg/ml)的混合物。在对照实验中，向各孔添加37.5μL相应的抗微型猪抗体(杂交瘤细胞培养上清液)和37.5μl缓冲液(PBS/1.0％BSA)的混合物。将平板在室温温育1小时。用0.9％NaCl/0.05％
Figure BDA0002380677130000214
洗涤后，添加100μl/孔多克隆绵羊抗小鼠Fc抗体的辣根过氧化物酶标记F(ab')2片段(100ng/ml)，以检测结合的样品抗体。在室温温育1小时后，将平板如上文所述洗涤。最后，添加100μl/孔
Figure BDA0002380677130000215
(RocheDiagnostics GmbH)并且在405nm和492nm[405/492]测量消光(OD)。在多克隆人IgG存在下(与缓冲液对照相比)显示信号下降最少的抗微型猪IgG抗体显示出最低的交叉反应性。
这种筛选方法导致选择与微型猪IgG良好结合以及对人IgG显示无相关交叉反应性的抗体。
d)鉴定已产生的抗微型猪抗体的结合区
为了鉴定抗微型猪抗体的结合区，将重组链霉亲和素预包被的MTP(MicroCoat)分别用每孔100μl生物素酰化的微型猪IgG(PBS/1.0％BSA中250ng/ml)、每孔100μl生物素酰化的微型猪Fab片段(PBS/1.0％BSA中250ng/ml)或每孔100μl生物素酰化的微型猪IgG Fc片段(PBS/1.0％BSA中250ng/ml)包被。用0.9％NaCl/0.05％
Figure BDA0002380677130000221
洗涤包被的MTP后，向各孔添加100μL抗微型猪抗体(杂交瘤细胞培养上清液；1:2稀释于PBS/1.0％BSA中)。将平板在室温温育1小时。随后，用0.9％NaCl/0.05％
Figure BDA0002380677130000222
洗涤包被的平板。用0.9％NaCl/0.05％
Figure BDA0002380677130000223
洗涤后，添加100μl/孔多克隆绵羊抗小鼠Fcγ抗体的辣根过氧化物酶标记F(ab')2片段(100ng/ml)，以检测结合的抗体。在室温温育1小时后，将平板如上文所述洗涤。最后，添加100μl/孔
Figure BDA0002380677130000224
(Roche Diagnostics GmbH)并且在405nm和492nm[405/492]测量消光(OD)。
为了确认上文描述的ELISA的结果，已经进行竞争ELISA。简而言之，将重组链霉亲和素预包被的MTP(MicroCoat)分别用每孔100μl生物素酰化的微型猪IgG(PBS/1.0％BSA中250ng/ml)、每孔100μl生物素酰化的微型猪Fab片段(PBS/1.0％BSA中250ng/ml)或每孔100μl生物素酰化的微型猪IgG Fc片段(PBS/1.0％BSA中250ng/ml)包被。随后，用0.9％NaCl/0.05％
Figure BDA0002380677130000225
洗涤包被的平板。在下一个步骤中，向各孔添加50μl抗微型猪抗体(杂交瘤细胞培养物上清液)和50μl多克隆微型猪Fab片段(PBS/1.0％BSA中终浓度5μg/ml，在室温预先温育30分钟)的混合物。在对照实验中，向各孔添加50μL相应的抗微型猪抗体(杂交瘤细胞培养上清液)和50μl缓冲液(PBS/1.0％BSA)的混合物。将平板在室温温育1小时。用0.9％NaCl/0.05％
Figure BDA0002380677130000226
洗涤后，添加100μl/孔多克隆绵羊抗小鼠Fcγ抗体的辣根过氧化物酶标记F(ab')2片段(100ng/ml)，以检测结合的样品抗体。在室温温育1小时后，将平板如上文所述洗涤。最后，添加100μl/孔
Figure BDA0002380677130000227
(Roche Diagnostics GmbH)并且在405nm和492nm[405/492]测量消光(OD)。
这个ELISA筛选方法导致鉴定与微型猪Fab片段或Fc片段结合的抗体。
选择以下克隆(表1)作为合适的候选物。
表1：抗微型猪IgG克隆
克隆 IgG类和亚类 免疫原 反应性
2.8.14 IgG1，κ 微型猪IgG 微型猪IgG，Fc片段
1.2.6 IgG1，κ 微型猪IgG 微型猪IgG，Fab片段
2.3.8 IgG1，κ 微型猪IgG 微型猪IgG，Fab片段
2.11.16 IgG1，κ 微型猪IgG 微型猪IgG，Fab片段
e)免疫球蛋白的产生
将产生的单克隆杂交瘤细胞系按初始细胞密度1.0x 105至2.2x 105个细胞/mL接种于补充有5％FCS、50U/ml IL-6、50μMβ-巯基乙醇和20μM乙醇胺的杂交瘤-SFM培养基(Gibco)。将细胞在旋转瓶中扩充7天至14天时间。随后，收获细胞培养上清液并且根据标准蛋白质化学方法从上清液纯化抗体(参见，例如Bruck,C.等人,Methods Enzymol.121(1986)587-596)。
实施例3：
产生的单克隆抗微型猪IgG抗体与来自其他物种的IgG的交叉反应性
评估如实施例2生成的抗微型猪IgG抗体2.8.14的交叉反应性并且将其与以下两种市售的抗微型猪IgG抗体比较：HRP缀合的山羊多克隆抗猪IgG抗体(AbD-Serotec，目录号AAI41P)和机构内洋地黄毒苷化的小鼠单克隆抗猪IgG抗体(AbD-Serotec，克隆K139 3C8，目录号MCA635GA)。出于清楚的目的，应当指出因为微型猪为猪类，抗猪抗体当然与微型猪抗原有反应，即，抗猪IgG抗体与微型猪-IgG特异性结合。比较了以下抗体：
-洋地黄毒苷化的抗微型猪IgG抗体“2.8.14”
-如上文“pAb”所示的来自Abd-Serotec的HRP缀合的多克隆抗猪IgG
-洋地黄毒苷化的单克隆抗猪IgG“mAb”
在免疫测定法中评估交叉反应性。简言之，使得来自12个不同物种的血清或血浆作为碱性NaHCO3缓冲液中5％基质浓缩的稀释物与NUNC Maxisorp平板结合。除来自狒狒、恒河猴、食蟹猴、狨猴、犬、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠和兔的样品之外，还使用两份人类样品和两份微型猪样品。将平板与三种受检抗微型猪IgG抗体在2μg/ml温育，如所示，所述抗体经洋地黄毒苷化或与辣根过氧化物酶(HRP)缀合。与洋地黄毒苷化的抗微型猪IgG温育，接着与HRP缀合的多克隆抗洋地黄毒苷Fab片段(Roche Diagnostics，目录号11633716001)温育。使用
Figure BDA0002380677130000241
底物并在405nm(参考波长：490nm([405/490]nm))使用标准ELISA读数仪检测信号，通过颜色变化评估法进行检测。
图1中显示结果。受检的市售多克隆抗体与来自众多物种的IgG显著地交叉反应。在这个测定法中，受检的市售单克隆抗体不显示与受检物种(包括微型猪)任一者不显著结合。
在这个测定法中，本发明的单克隆抗体2.8.14针对来自除微型猪之外的任一个受检物种的IgG不显示交叉反应性。
实施例4：
产生的单克隆抗微型猪IgG抗体与人IgG药物抗体的交叉反应性
在免疫测定法中评估了如实施例2中产生的抗微型猪IgG抗体2.8.14和2.3.8与几种人IgG药物抗体的交叉反应性并且与一种市售多克隆抗微型猪IgG抗体(“pAb”，如实施例3中所述)比较。
使用总计13种不同的人IgG同种型药物抗体进行该试验，所述药物是具有野生型抗体结构域排列的全长IgG(显示为“h-IgG”)、全长IgG CrossMabs(包含如Klein等人[MAbs.2012Nov-Dec；4(6):653-63]中所述的结构域交换；显示为“XMab”)或Fab片段(显示为“h-Fab”)。使用微型猪IgG(来自微型猪血清的机构内制品)作为阳性对照。对于作为全长IgG的药物3、5、7和8，测试并且在图2中指示抗体的片段。
为了检测针对抗药物抗体的交叉反应性，使阳性对照和药物抗体与Maxisorp平板结合并且使用洋地黄毒苷化的单克隆抗体2.8.14和2.3.8来检测，随后与HRP缀合的抗洋地黄毒苷抗体以及来自Abd-Serotec的HRP缀合的多克隆抗猪IgG(“pAb”，如实施例3中所述)温育。使用
Figure BDA0002380677130000242
底物并在405nm(参考波长：490nm([405/490]nm))使用标准ELISA读数仪检测信号，通过颜色变化评估法进行检测。
图2中显示结果。本发明的单克隆抗体2.8.14和2.3.8不与受检药物抗体或其片段显示交叉反应性。在测试情况下，受检的市售多克隆抗猪抗体与全部的全长IgG药物抗体及其Fc片段显著发生交叉反应。
实施例5：
产生的抗微型猪IgG单克隆抗体对比市售抗猪IgG抗体在用于检测微型猪样品中药物/ADA复合物的本发明方法(无与药物预温育)中的适用性
为了评估不同抗微型猪IgG抗体在从微型猪样品检测体内形成的药物/ADA复合物的本发明方法中的适用性，将几种市售抗体与本发明的抗体比较。使用了以下抗体：
-单克隆抗猪抗体MAb<Sw-IgG>M-F007-1241-IgG-Dig(BD Pharmingen，目录号552554)(“mAb1”)
-单克隆抗猪抗体MAb<Sw-IgG>M-K139-3E1-IgG(AbD Serotec，目录号MCA633GA)(“mAb2”)
-单克隆抗猪抗体MAb<Sw-IgG>M-K139-3C8-IgG(AbD Serotec，目录号MCA633GA)(“mAb3”)
-多克隆抗猪抗体PAb<猪-IgG-Fc>兔-IgG-HRP(Rockland，目录号614-4303)(“pAb1”)
-多克隆抗猪抗体PAb<猪-IgG-Fc>山羊-IgG-HRP(Bethyl(Biomol)，目录号A100-104P)(“pAb2”)
-多克隆抗猪抗体PAb<猪-IgG-Fc>山羊-IgG-HRP,(AbD-Serotec，目录号AAI41P)(“pAb3”)
-单克隆抗微型猪IgG抗体2.8.14
-单克隆抗微型猪IgG抗体2.3.8
-单克隆抗微型猪IgG抗体2.11.16
为了从微型猪样品检测体内形成的药物/ADA复合物，使用(本发明的)以下测定法：
在第一步骤中，使生物素酰化的抗人IgG-Fab(κ)单克隆抗体MAb<h-IgG-κ>M-1.7.10-Fab'(Roche，如WO 2012/022682中公开)与链霉亲和素包被的微量滴定板(SA-MTP)的各孔结合。通过洗涤移除过量的未结合的Fab’-片段。
为了模拟药物/ADA复合物，制备了人IgG/猪IgG缀合物。因此，使多克隆人IgG(纯化自人血清)化学缀合于多克隆猪IgG(纯化自猪血清)。将如此衍生的人IgG/猪IgG缀合物按照低、中等和高浓度掺入2％的微型猪合并血浆中并且作为阳性对照使用(其中“LPC”指低浓度阳性对照，“MPC”指中等浓度阳性对照并且“HPC”指高浓度阳性对照)。使用微型猪合并血浆(未用人IgG/猪IgG缀合物掺入)作为阴性对照。
因此，向各孔添加对照并在其中温育。在洗去未结合的物质后，用所示的洋地黄毒苷化抗微型猪抗体，随后与辣根过氧化物酶标记的抗洋地黄毒苷抗体温育，来检测人IgG/猪IgG缀合物(模拟drig/ADA复合物)。抗体-酶缀合物催化
Figure BDA0002380677130000261
底物的颜色反应。通过标准ELISA读数仪，在405nm波长(参考波长：490nm([405/490]nm))测量信号。一式两份测定每份样品的吸光度值。
图3中显示了例示这个适于直接检测药物/ADA复合物的试验体系的示意图。
图4中显示结果，“NC”指阴性对照，“LPC”指阳性对照具低水平人IgG/猪IgG缀合物的阳性对照，“MPC”指具中等水平人IgG/猪IgG缀合物的阳性对照；并且“HPC”指具高水平人IgG/猪IgG缀合物的阳性对照。
受检市售单克隆抗体显示出相当的高背景(mAb2)或根本没有显示明显信号(mAb1、mAb3)。受检的市售多克隆抗体显示合理的信噪比并且似乎适于这种检测方法。本发明的全部受检抗体均显示略微优于受检多克隆抗体的信噪比。
实施例6：
产生的抗微型猪IgG单克隆抗体对比市售抗猪IgG抗体在用于检测微型猪样品中ADA的本发明方法(有与药物预温育)中的适用性
为了评估不同抗微型猪IgG抗体在从微型猪样品检测ADA的本发明方法中的适用性，将如实施例5中使用的几种市售多克隆抗体与本发明的抗体比较。
为了从微型猪样品检测ADA，使用(本发明的)以下测定法：
在第一步骤中，使生物素酰化的抗人IgG-Fab(κ)单克隆抗体MAb<h-IgG-κ>M-1.7.10-Fab'与链霉亲和素包被的微量滴定板(SA-MTP)的各孔结合。通过洗涤移除过量的未结合的Fab’-片段。
如实施例5中所述使用对照样品(LPC、MPC、HPC和NC)。
为了分析，将对照样品添加至微量滴定板的各孔并在其中温育。在洗去未结合的物质后，用所示的洋地黄毒苷化抗微型猪抗体，随后与辣根过氧化物酶标记的抗洋地黄毒苷抗体温育，来检测人IgG/猪IgG缀合物(模拟drig/ADA复合物)。抗体-酶缀合物催化
Figure BDA0002380677130000271
底物的颜色反应。通过ELISA读数仪在405nm波长(参考波长：490nm([405/490]nm))测量信号。一式两份测定每份样品的吸光度值。
图5中显示了例示这个适于从微型猪样品检测ADA和药物/ADA复合物的试验体系的示意图。
图6中显示结果，“NC”指阴性对照，“LPC”指具低水平人IgG/猪IgG缀合物的阳性对照，“MPC”指具中等水平人IgG/猪IgG缀合物的阳性对照；并且“HPC”指具高水平人IgG/猪IgG缀合物的阳性对照。
受检的市售多克隆抗体显示低信噪比，显示相当高的背景噪声，这多半因与人IgG的交叉反应性而可能发生。本发明的全部受检抗体均显示比现有技术中的抗体更好的信噪比。
实施例7：
使用单克隆抗微型猪IgG 2.8.14，以本发明方法从微型猪样品检测ADA
以使用单克隆抗微型猪IgG 2.8.14的本发明方法实施从微型猪样品检测ADA，所述微型猪样品衍生自采用人IgG1药物抗体的不同体内研究。
将结果与从微型猪样品检测ADA的直接免疫测定法(“桥接测定法”)进行比较，使用适当缀合的药物抗体用于检测。
如下实施桥接测定法(比较实施例)：
简言之，将微型猪样品(取决于样品类型，适当地稀释)与作为捕获抗体的生物素酰化药物抗体和洋地黄毒苷偶联的药物抗体同时预温育。在链霉亲和素包被的微量滴定板上，通过与辣根过氧化物酶标记的抗洋地黄毒苷抗体温育检测来自微型猪样品的ADA对生物素偶联的药物抗体和洋地黄毒苷偶联的药物抗体的结合。抗体-酶缀合物催化
Figure BDA0002380677130000282
底物的颜色反应。通过ELISA读数仪在405nm波长(参考波长：490nm([405/490]nm))测量信号。
如实施例6中所述那样实施用本发明方法(本文进一步也称作“有预温育的IC测定法”)从微型猪样品检测ADA，差异在于替代之前筛选的微型猪样品，使用来自体内研究的所示样品并且按照1:20比率稀释。微型猪样品取自两种不同眼科用药物抗体的体内研究，药物A为人全长IgG1 CrossMab且药物B为人IgG1Fab片段。
作为阳性对照，使用掺入在2％微型猪CTAD血浆中的、化学缀合于猪IgG(纯化自猪血清，机构内制品)的人IgG(纯化自人血清，机构内制品)。使用微型猪合并血浆作为阴性对照。
表2至10中显示结果，在适用情况下，所述结果指示所示药物的施加途径和剂量、样品类型、接受所示处理的微型猪的受试者识别码、施加药物后的采样时间和ADA检测结果(分类为阳性[pos]和阴性[neg])。根据Shankar等人(J Pharm Biomed Anal.2008Dec 15；48(5):1267-81)，使用浮动CP和非参数确定法，评价筛选截断点(CP)。通过计算平板特异性CP(乘以归一化因数的已合并原初血浆的空白)，鉴定筛选阴性(<平板特异性CP，PSCP)样品和筛选阳性(≥PSCP)样品。完全根据现行指南进行方法验证。对本发明的每种测定法以及作为比较实施例使用的桥接测定法分别实施所述方法验证。
图7中还显示了下文如表7和表9中对玻璃体液样品所示的来自玻璃体内注射药物B的结果，其指示采用两种测定法评估的OD绝对值。
表2：玻璃体内注射1.5mg/眼药物A，血浆样品
Figure BDA0002380677130000281
Figure BDA0002380677130000291
表3：玻璃体内注射1.5mg/眼药物A，玻璃体液样品
Figure BDA0002380677130000292
Figure BDA0002380677130000301
表4：静脉内注射0.3mg/kg药物A(人IgG1)，血浆样品
Figure BDA0002380677130000302
表5：玻璃体内注射5mg/眼药物B，血浆样品
Figure BDA0002380677130000311
Figure BDA0002380677130000321
表6：玻璃体内注射10mg/眼药物B，血浆样品
Figure BDA0002380677130000322
Figure BDA0002380677130000331
Figure BDA0002380677130000341
表7：玻璃体内注射5mg/眼药物B，玻璃体液样品
Figure BDA0002380677130000342
表8：玻璃体内注射5mg/眼药物B，眼房水样品
Figure BDA0002380677130000351
表9：玻璃体内注射10mg/眼药物B，玻璃体液样品
Figure BDA0002380677130000352
表10：玻璃体内注射10mg/眼药物B，眼房水样品
Figure BDA0002380677130000361
总之，结果表明，本发明的方法可靠地从微型猪样品检出ADA。有预温育的IC测定法似乎比桥接测定法更灵敏，因为有预温育的IC测定法(本发明的方法)检出了某些样品ADA，但采用桥接测定法未检出。
实施例8
本发明方法的比较研究：使用单克隆抗微型猪IgG 2.8.14，使用有预温育的IC测定法检测微型猪样品中的ADA和使用无预温育的IC测定法检测药物/ADA复合物
在如实施例7中所述的实验设置(有预温育的IC测定法)中，以使用单克隆抗微型猪IgG 2.8.14的一种本发明方法实施从微型猪样品检测ADA，所述微型猪样品衍生自采用人IgG1药物抗体的不同体内研究。
以使用单克隆抗微型猪IgG 2.8.14的另一种本发明方法，即，实施例5中所述的设置，实施从微型猪样品检测药物/ADA复合物，所述微型猪样品衍生自采用人IgG1药物抗体的不同体内研究(这种用于检测体内形成的药物/ADA复合物的方法在此进一步也称作“无预温育的IC测定法”)。偏离于如实施例5中所述的设置，替代事先筛选的具有低水平、中等水平和高水平药物/ADA复合物的微型猪样品，如所示使用来自体内研究的样品并且将其以1:20比率稀释。微型猪样品取自两种不同眼科用药物抗体的体内研究，药物A为人全长IgG1CrossMab且药物B为人IgG1 Fab片段。
作为阳性对照，使用掺入在2％微型猪CTAD血浆中的、化学缀合于猪IgG(纯化自猪血清，机构内制品)的人IgG(纯化自人血清，机构内制品)。使用微型猪合并血浆作为阴性对照。
表11至16中显示结果，在适用情况下，所述结果指示所示药物的施加途径和剂量、样品类型、接受所示处理的微型猪的受试者识别码、施加药物后的采样时间和ADA检测结果(分类为阳性[pos]和阴性[neg])。根据Shankar等人(J Pharm Biomed Anal.2008Dec 15；48(5):1267-81)，使用浮动CP(floating CP)和非参数确定法，评价筛选截断点(CP)。通过计算平板特异性CP(乘以归一化因数的已合并原初血浆的空白)，鉴定筛选阴性(<平板特异性CP，PSCP)样品和筛选阳性(≥PSCP)样品。完全根据现行指南进行方法验证。对本发明的每种测定法以及作为比较实施例使用的桥接测定法分别实施所述方法验证。
表11：玻璃体内注射5mg/眼的药物B，血浆样品
Figure BDA0002380677130000371
Figure BDA0002380677130000381
表12：玻璃体内注射10mg/眼的药物B，血浆样品
Figure BDA0002380677130000391
Figure BDA0002380677130000401
表13：玻璃体内注射5mg/眼的药物B，玻璃体液样品
Figure BDA0002380677130000402
Figure BDA0002380677130000411
表14：玻璃体内注射5mg/眼的药物B，眼房水样品
Figure BDA0002380677130000412
表15：玻璃体内注射10mg/眼的药物B，玻璃体液样品
Figure BDA0002380677130000413
Figure BDA0002380677130000421
表16：玻璃体内注射10mg/眼的药物B，眼房水样品
Figure BDA0002380677130000422
Figure IDA0002380677180000011
Figure IDA0002380677180000021
Figure IDA0002380677180000031
Figure IDA0002380677180000041
Figure IDA0002380677180000051
Figure IDA0002380677180000061
Figure IDA0002380677180000071
Figure IDA0002380677180000081

Claims (14)

1.确定微型猪样品中存在或不存在抗药物抗体(ADA)的体外方法，所述方法包括：
a)使样品与过量的药物接触，其中ADA与所述药物结合以形成药物/ADA复合物，
b)使药物/ADA复合物与特异性结合微型猪IgG的抗体接触，所述抗体选自包含以下者的抗体
i.SEQ ID NO:3的重链的CDR1、SEQ ID NO:4的重链的CDR2、和SEQ ID NO:5的重链的CDR3、SEQ ID NO:6的轻链的CDR1、SEQ ID NO:7的轻链的CDR2和SEQ ID NO:8的轻链的CDR3；
ii.SEQ ID NO:19的重链的CDR1、SEQ ID NO:20的重链的CDR2、和SEQ ID NO:21的重链的CDR3、SEQ ID NO:22的轻链的CDR1、SEQ ID NO:23的轻链的CDR2、和SEQ ID NO:24的轻链的CDR3；或
iii.SEQ ID NO:27的重链的CDR1、SEQ ID NO:28的重链的CDR2、和SEQ ID NO:29的重链的CDR3、SEQ ID NO:30的轻链的CDR1、SEQ ID NO:31的轻链的CDR2、和SEQ ID NO:32的轻链的CDR3；和
其中与微型猪IgG特异性结合的抗体不与人IgG结合，和
c)确定与微型猪IgG特异性结合的抗体对药物/ADA复合物的结合以确定样品中是否存在ADA。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)中，将药物固定在支持物上。
3.确定微型猪样品中存在或不存在包含药物和与药物特异性结合的抗体的免疫复合物(药物/ADA复合物)的体外方法，所述方法包括：
a)使微型猪样品与固定化抗体接触，所述固定化抗体特异性结合药物以固定存在于微型猪样品中的药物/ADA复合物，
b)使药物/ADA复合物与特异性结合微型猪IgG的抗体接触，所述抗体选自包含以下者的抗体
i.SEQ ID NO:3的重链的CDR1、SEQ ID NO:4的重链的CDR2、和SEQ IDNO:5的重链的CDR3、SEQ ID NO:6的轻链的CDR1、SEQ ID NO:7的轻链的CDR2和SEQ ID NO:8的轻链的CDR3；
ii.SEQ ID NO:19的重链的CDR1、SEQ ID NO:20的重链的CDR2、和SEQ ID NO:21的重链的CDR3、SEQ ID NO:22的轻链的CDR1、SEQ ID NO:23的轻链的CDR2、和SEQ ID NO:24的轻链的CDR3；或
iii.SEQ ID NO:27的重链的CDR1、SEQ ID NO:28的重链的CDR2、和SEQ ID NO:29的重链的CDR3、SEQ ID NO:30的轻链的CDR1、SEQ ID NO:31的轻链的CDR2、和SEQ ID NO:32的轻链的CDR3；和
其中与微型猪IgG特异性结合的抗体不与人IgG结合，和
c)确定与微型猪IgG特异性结合的抗体对药物/ADA复合物的结合以确定样品中是否存在ADA。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中与微型猪IgG特异性结合的抗体不与小鼠IgG特异性结合。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中与微型猪IgG特异性结合的抗体包含
a)SEQ ID NO:1的VH序列和SEQ ID NO:2的VL序列；
b)SEQ ID NO:17的VH序列和SEQ ID NO:18的VL序列；或
c)SEQ ID NO:25的VH序列和SEQ ID NO:26的VL序列。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中与微型猪IgG特异性结合的抗体与微型猪IgG的Fab结构域特异性结合。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中药物是药物抗体(DA)。
8.根据权利要求7所述的方法，其中药物抗体是人或人源化IgG抗体。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中药物抗体是Fab片段。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述方法是夹心测定法，其中步骤a)中，使药物/ADA复合物与特异性结合人IgG的抗体接触，其中使特异性结合人IgG的抗体固定在支持物上，由此使药物/ADA复合物固定在支持物上，和
其中根据步骤b)使固定的药物/ADA复合物随后与抗体接触，所述抗体是与微型猪IgG特异性结合的抗体。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中与微型猪IgG特异性结合的抗体与可检测标记物缀合。
12.与微型猪IgG特异性结合的抗体，包含
a)SEQ ID NO:3的重链的CDR1、SEQ ID NO:4的重链的CDR2、和SEQ ID NO:5的重链的CDR3、SEQ ID NO:6的轻链的CDR1、SEQ ID NO:7的轻链的CDR2和SEQ ID NO:8的轻链的CDR3；
b)包含SEQ ID NO:19的重链的CDR1、SEQ ID NO:20的重链的CDR2、和SEQ ID NO:21的重链的CDR3、SEQ ID NO:22的轻链的CDR1、SEQ ID NO:23的轻链的CDR2、和SEQ ID NO:24的轻链的CDR3；或
c)SEQ ID NO:27的重链的CDR1、SEQ ID NO:28的重链的CDR2、和SEQ ID NO:29的重链的CDR3、SEQ ID NO:30的轻链的CDR1、SEQ ID NO:31的轻链的CDR2、和SEQ ID NO:32的轻链的CDR3。
13.根据权利要求13所述的抗体，其中所述抗体选自
a)包含VH序列和VL序列的抗体，所述VH序列与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少95％序列同一性，所述VL序列与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少95％序列同一性；
b)包含VH序列和VL序列的抗体，所述VH序列与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少95％序列同一性，所述VL序列与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少95％序列同一性，或
c)包含VH序列和VL序列的抗体，所述VH序列与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少95％序列同一性，所述VL序列与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。
14.根据权利要求13或14所述的抗体，用于确定微型猪样品中存在或不存在抗药物抗体(ADA)的方法中。
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