BR112020018193A2

BR112020018193A2 - ensaios para detectar neurodegeneração

Info

Publication number: BR112020018193A2
Application number: BR112020018193-5A
Authority: BR
Inventors: Hartmuth Christian Kolb; Gallen Triana-Baltzer; John Randall Slemmon
Original assignee: Janssen Pharmaceutica Nv
Priority date: 2018-03-05
Filing date: 2019-03-04
Publication date: 2021-02-02
Also published as: JOP20200216A1; US20200408781A1; CN112105640A; US20190271710A1; KR20200130354A; US10976325B2; AU2019232630A1; PH12020551371A1; JP2024037794A; WO2019171258A1; EA202092087A1; JP2021517239A; MX2020009278A; JP7399096B2; US20200182888A1; US10591492B2; EP3762414A4; IL277077A; SG11202008574VA; EP3762414A1

Abstract

  A presente invenção fornece métodos para medir a quantidade de proteína tau p217+ fosforilada de forma isolada ou múltipla em uma amostra. Métodos de detecção ou diagnóstico de taupatias, métodos para determinar a eficácia de um tratamento de uma taupatia e métodos para determinar se um indivíduo é adequado para terapia com anticorpo antitau p217+ também são fornecidos. Anticorpos para uso nos métodos e kits compreendendo os anticorpos também são descritos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ENSAIOS PARA DETECTAR NEURODEGENERAÇÃO".

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a composições farmacêuti- cas e métodos para detecção de neurodegeneração. Em particular, a invenção se refere a métodos para medir a quantidade de espécies de proteína tau p217+ isolada ou multiplamente fosforilada em uma amos- tra biológica e usos do mesmo, bem como anticorpos e kits para uso nos métodos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] A doença de Alzheimer (DA) é um distúrbio degenerativo do cérebro caracterizado clinicamente por perda progressiva de memória, cognição, raciocínio, julgamento e estabilidade emocional que gradu- almente leva a uma deterioração mental profunda e finalmente à morte. A DA é uma causa muito comum de insuficiência mental progressiva (demência) em seres humanos idosos e acredita-se que representa a quarta causa médica mais comum de morte nos Estados Unidos. A DA tem sido observada em grupos étnicos em todo o mundo e representa um problema de saúde pública atualmente e no futuro.

[0003] O cérebro dos indivíduos com DA apresenta lesões caracte- rísticas denominadas placas senis (ou amiloides), angiopatia amiloide (depósitos amiloides em vasos sanguíneos) e emaranhados neurofibri- lares. Grandes números dessas lesões, particularmente as placas ami- loides e os emaranhados neurofibrilares de filamentos helicoidais pare- ados (PHF), são geralmente encontrados em várias áreas do cérebro humano importantes para a memória e a função cognitiva em pacientes com DA.

[0004] Os emaranhados neurofibrilares são principalmente compos- tos de agregados de proteína tau hiperfosforilada. A principal função fisio- lógica da tau é a polimerização e estabilização de microtúbulos. A ligação do tau aos microtúbulos ocorre por interações iônicas entre cargas positi- vas na região de ligação de microtúbulo de tau e cargas negativas na rede de microtúbulos (Butner e Kirschner, J Cell Biol. 115(3):717-30, 1991). A proteína tau contém 85 sítios de fosforilação possíveis e a fosforilação em muitos desses sítios interfere com a função primária da tau. A tau que se liga à rede de microtúbulos axonais está em um estado de hipofosforilação, enquanto a tau agregada presente na DA é hiperfosforilada, fornecendo epítopos exclusivos que são distintos do fundo geral fisiologicamente ativo de tau (Iqbal et al., Curr Alzheimer Res. 7(8): 656-664, 2010).

[0005] A progressão da taupatia em um cérebro com DA segue pa- drões distintos de disseminação. Foi descrita uma hipótese de trans- missão e disseminação de taupatia com base nos estágios de Braak de progressão de taupatia no cérebro humano e de disseminação da taupatia após injeções de agregados de tau em modelos pré-clínicos de tau (Frost et al., J Biol Chem. 284:12845-52, 2009; Clavaguera et al., Nat Cell Biol. 11:909-13, 2009). Acredita-se que a taupatia pode se disseminar em um modo semelhante ao dos príons de uma região do cérebro para a outra. Este processo de disseminação envolveria uma externalização das sementes de tau que podem ser absorvidas pelos neurônios vizinhos e induzir adicionalmente taupatia.

[0006] Os fragmentos de proteína tau nos emaranhados neurofibri- lares passam para o líquido cefalorraquidiano (LCR) onde podem ser colhidos por punção lombar e medidos por ensaios sensíveis. A pre- sença de doença neurológica pode ser, dessa forma, detectada com o uso de ensaios que reconhecem os fragmentos de proteína tau derivada no LCR. Tais ensaios de tau exigem a capacidade de reconhecer a es- pécie tau característica de uma condição neurodegenerativa. A tau mul- tifosforilada é o exemplo principal de proteína tau associada à DA. Por- tanto, ensaios que detectam proteína tau multifosforilada no LCR podem ser mais eficazes na detecção da presença de DA.

[0007] A fosforilação não é a única modificação pós-traducional a considerar na medição de tau. Estudos recentes demonstraram que no LCR, a proteína tau existe principalmente como fragmentos em vez de como proteína de comprimento total (Meredith et al. PLoS One. 8(10):e76523, 2013). Adicionalmente, o padrão de fragmentação da tau pode ser influenciado por uma doença, como proteólise que é frequen- temente aberrante em condições patológicas. Consequentemente, os ensaios à base de tau para neurodegeneração precisam fornecer infor- mações não só sobre o status de fosforilação (por exemplo, fosforilação local), mas também sobre a natureza dos fragmentos da proteína tau (por exemplo, comprimento do fragmento da tau, polaridade) que estão sendo medidos. Entretanto, a tradução dessa ideia é dificultada pelos baixos níveis endógenos de tau fosforilada, especialmente em amostras de indivíduos saudáveis.

[0008] Em resumo, existe uma necessidade por métodos sensíveis, precisos e exatos para detectar tau multifosforilada em fluidos biológicos. Tais métodos seriam úteis para efetivamente detectar, diagnosticar, esta- diar e rastrear a progressão de doenças neurodegenerativas, como DA e outras taupatias. Os métodos também seriam úteis como marcadores far- macodinâmicos para medir os níveis de tau multifosforilada ligada ao anti- corpo total, livre e terapêutica. A capacidade de detectar e medir fragmen- tos de tau multifosforilada é de maior importância para o campo, já que a espécie de tau transmissível pode ser um ou mais fragmentos de tau.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0009] A invenção satisfaz a necessidade de detectar formas de tau em LCR que estão ligadas a doenças neurodegenerativas. A invenção possibilita a detecção de tau individualmente ou multiplamente fosfori- lada, bem como a detecção de fragmentos de tau.

[0010] Imunoensaios ligados a enzima de alta sensibilidade (ELISAs),

de acordo com a modalidade da invenção, foram desenvolvidos e qualifi- cados para medir um tau p217+ que compreende um epítopo de tau fos- forilada ("epítopo tau p217+" ou "epítopo pT3") compreendendo os resí- duos fosforilados T212 e/ou T217 que têm a sequência de (212) R(pT)PSLPTPPTR (SEQ ID NO: 25), (217) RTPSLP(pT)PPTR (SEQ ID NO: 26) ou (212&217) R(pT)PSLP(pT)PPTR (SEQ ID NO: 27).

[0011] Ensaios de acordo com as modalidades da invenção são ca- pazes de medir a espécie de tau p217+ em várias matrizes de fluido, in- cluindo, mas não se limitando a LCR, fluido intersticial (ISF), homogenato cerebral, soro, plasma e versões desnaturadas ou enriquecidas dos mes- mos. Ensaios de acordo com as modalidades da invenção utilizam um pri- meiro anticorpo monoclonal direcionado para um epítopo pT3 de tau como um anticorpo de captura, e um segundo anticorpo monoclonal direcionado para um segundo epítopo de tau como um anticorpo de detecção. Os en- saios são altamente sensíveis, precisos, exatos, transferíveis entre labora- tórios, com diluição linear e aplicáveis a muitos tipos de amostras. Em adi- ção à medição de espécies de tau p217+ em fluido biológico bruto, os en- saios podem ser utilizados para medir amostras com ou sem desnatura- ção, ou após a imunoprecipitação, duas técnicas complementares para quantificar a quantidade de tau p217+ livre ou tau p217+ ligada a um anti- corpo endógeno ou terapeuticamente administrado. Os ensaios podem ser utilizados em conjunto com cromatografia líquida de fase reversa de alto desempenho (rpHPLC) para medir o LCR fracionado, permitindo a análise do perfil do fragmento de tau p217+.

[0012] Em um aspecto geral, a invenção se refere a um método para medir a quantidade de peptídeos de tau p217+ em uma amostra. O mé- todo compreende: (i) colocar a amostra em contato com um anticorpo de captura direcionado contra um epítopo de tau p217+ para capturar peptídeos de tau p217+ na amostra, e (ii) colocar os peptídeos tau p217+ capturados com um anticorpo de detecção direcionado contra um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 119 a 126, como os resíduos de aminoácido 116 a 127 da proteína tau, ou um epítopo contendo resíduos de aminoácidos 7 a 20 da proteína tau para, assim, medir uma quantidade de peptídeos tau p217+ ou uma quantidade de peptídeos tau p217+ longos, respectivamente, em que a numeração do aminoácido é em relação à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1.

[0013] Em um aspecto particular, a invenção se refere a um método de determinação de uma quantidade relativa de peptídeos tau p217+ longos ou fragmentos de peptídeos tau p217 curtos em uma amostra. O método compreende colocar a amostra (i) em contato com um anticorpo de captura direcionado contra um epítopo de tau p217+ para capturar peptídeos tau p217+ na amostra, (iii) colocar os peptídeos tau p217+ capturados em contato com um primeiro anticorpo de detecção direcio- nado contra um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 119 a 126 da proteína tau para, assim, medir uma quantidade de peptí- deos tau p217+, (iii) colocar o peptídeos tau p217+ capturados em con- tato com um segundo anticorpo de detecção direcionado contra um epí- topo que compreende os resíduos de aminoácidos 7 a 20 da proteína tau para, assim, medir uma quantidade de peptídeos tau p217+ longos, e (iv) determinar uma quantidade relativa de peptídeos tau p217+ longos ou peptídeos tau p217+ curtos com base na quantidade de peptídeos tau p217+ e na quantidade de peptídeos tau p217+ longos, em que a numeração do aminoácido é em relação à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1.

[0014] Em uma modalidade da invenção, uma quantidade de peptí- deos tau p217+ curtos em uma amostra é calculada com base na quan- tidade de peptídeos tau p217+ e na quantidade de peptídeos tau p217+ longos na amostra, por exemplo, subtraindo a quantidade de peptídeos tau p217+ longos da quantidade de peptídeos tau p217+. Em uma outra modalidade, uma razão entre a quantidade de peptídeos tau p217+ cur- tos e a quantidade de peptídeos tau p217+, uma razão entre a quanti- dade de peptídeos tau p217+ longos e a quantidade de peptídeos tau p217+ ou uma razão entre a quantidade de peptídeos tau p217+ longos e a quantidade de peptídeos tau p217+ curtos é determinada com base na quantidade de peptídeos tau p217+ e na quantidade de peptídeos tau p217+ longos na amostra. De acordo com as modalidades da inven- ção, a quantidade de peptídeos tau p217+ e/ou a quantidade de peptí- deos tau p217+ longos em uma amostra, bem como a informação com base nas quantidades medidas, como a quantidade calculada de peptí- deos tau p217+ curtos e uma ou mais dentre as razões descritas acima, podem ser utilizadas para um ou mais propósitos de diagnóstico.

[0015] Consequentemente, em um aspecto específico, a invenção se refere a um método para determinar uma razão entre peptídeos tau p217+ e peptídeos tau totais em uma amostra. O método compreende colocar a amostra (i) em contato com um anticorpo de captura direcio- nado contra um epítopo de tau p217+ para capturar peptídeos tau p217+ na amostra, e colocar a amostra em contato com um anticorpo de cap- tura independente de fosforilação direcionado contra um epítopo entre os aminoácidos 150 e 250 da proteína tau, de preferência um epítopo que compreende os aminoácidos 159 a 163 da proteína tau, para cap- turar os peptídeos tau totais na amostra, e (ii) realizar ao menos um dentre (a) colocar os peptídeos tau p217+ capturados em contato com um primeiro anticorpo de detecção direcionado contra um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 119 a 126 da proteína tau para, assim, medir uma quantidade de peptídeos tau p217+, e colocar os peptídeos tau totais de captura em contato com o primeiro anticorpo de detecção para, assim, medir uma quantidade de peptídeos tau total; e (b) e colocar os peptídeos tau p217+ capturados em contato com um segundo anticorpo de detecção direcionado contra um epítopo que com- preende os resíduos de aminoácidos 7 a 20 da proteína tau para, assim, medir uma quantidade de peptídeos tau p217+ longos, e colocar os pep- tídeos tau totais de captura em contato com o segundo anticorpo de detecção para, assim, medir uma quantidade de peptídeos tau totais, e (iii) determinar uma razão entre a quantidade dos peptídeos tau p217+ e a quantidade dos peptídeos tau totais, ou uma razão entre a quanti- dade de peptídeos tau p217+ longos e a quantidade de peptídeos tau longos totais, em que a numeração do aminoácido é em relação à se- quência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1. Em uma moda- lidade, uma quantidade de peptídeos tau p217+ curtos é calculada sub- traindo a quantidade de peptídeos tau p217+ longos da quantidade de peptídeos tau p217+, uma quantidade de peptídeos tau curtos total é calculada subtraindo a quantidade de peptídeos tau longos total da quantidade de peptídeos tau total, e uma razão entre a quantidade de peptídeos tau p217+ curtos e a quantidade de peptídeos tau curtos total é determinada.

[0016] De acordo com um aspecto particular, um método da invenção compreende (i) colocar uma amostra biológica, de preferência uma amos- tra do LCR, de um indivíduo, em contato com um anticorpo de captura direcionado contra um epítopo de tau p217+ para capturar peptídeos tau p217+ na amostra, (ii) realizar ao menos um dentre (a) colocar os peptí- deos tau p217+ capturados em contato com um primeiro anticorpo de de- tecção direcionado contra um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 119 a 126 da proteína tau para, assim, medir uma quantidade de peptídeos tau p217+, e (b) colocar os peptídeos tau p217+ capturados em contato com um segundo anticorpo de detecção direcionado contra um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 7 a 20 da proteína tau para, assim, medir uma quantidade de peptídeos tau p217+ longos, e (iii) determinar se ou não o indivíduo sofre de uma taupatia ou está em risco de desenvolver uma taupatia com base em ao menos um dentre a quantidade de peptídeos tau p217+, a quantidade de peptídeos tau p217+ longos, a quantidade de peptídeos tau p217+ curtos obtidos subtraindo a quantidade de peptídeos tau p217+ longos da quantidade de peptídeos tau p217+, e razões das mesmas, em que a numeração do aminoácido é em relação à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, o método compreende adicionalmente administrar ao indivíduo um agente terapêutico para tratar ou prevenir a taupatia.

[0017] De acordo com um aspecto particular, um método da invenção compreende (i) o contato de uma amostra biológica, de preferência uma amostra do LCR, de um indivíduo, com um anticorpo de captura direcio- nado contra um epítopo de tau p217+ para capturar peptídeos tau p217+ na amostra, e colocar a amostra em contato com um anticorpo de captura independente de fosforilação direcionado contra um epítopo entre os ami- noácidos 150 e 250 da proteína tau, de preferência um epítopo que com- preende os aminoácidos 159 a 163 da proteína tau, para capturar os pep- tídeos tau totais na amostra, (iii) realizar ao menos um dentre (a) colocar os peptídeos tau p217+ capturados em contato com um primeiro anticorpo de detecção direcionado contra um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 119 a 126 da proteína tau para, assim, medir uma quanti- dade de peptídeos tau p217+, e colocar os peptídeos tau totais de captura em contato com o primeiro anticorpo de detecção para, assim, medir uma quantidade de peptídeos tau total; e (b) e colocar os peptídeos tau p217+ capturados em contato com um segundo anticorpo de detecção direcio- nado contra um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 7 a 20 da proteína tau para, assim, medir uma quantidade de peptídeos tau p217+ longos, e colocar os peptídeos tau totais de captura em contato com o segundo anticorpo de detecção para, assim, medir uma quantidade de peptídeos tau totais, e (iii) determinar se ou não o indivíduo sofre de uma taupatia ou está em risco de desenvolver uma taupatia com base em ao menos um dentre (a) uma razão entre a quantidade de peptídeos tau p217+ e a quantidade peptídeos tau totais, (b) uma razão entre a quanti- dade de peptídeos tau p217+ longos e a quantidade peptídeos tau longos total, e (c) uma razão entre a quantidade de peptídeos tau p217+ curtos e a quantidade de peptídeos tau curtos total, em que a quantidade de peptí- deos tau p217+ curtos é obtida subtraindo a quantidade de peptídeos tau p217+ longos da quantidade de peptídeos tau p217+, e a quantidade de peptídeos tau curtos total é obtida subtraindo a quantidade de peptídeos tau curtos total da quantidade de peptídeos tau total, em que a numeração do aminoácido é em relação à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, o método compreende adicional- mente administrar ao indivíduo um agente terapêutico para tratar ou pre- venir a taupatia.

[0018] De acordo com outro aspecto particular, um método da inven- ção compreende (i) colocar uma amostra biológica, de preferência uma amostra de LCR, de um indivíduo sob um tratamento, em contato com um anticorpo de captura direcionado contra um epítopo de tau p217+ para capturar peptídeos tau p217+ na amostra, e (ii) realizar ao menos um dentre (a) colocar os peptídeos tau p217+ capturados em contato com um primeiro anticorpo de detecção direcionado contra um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 119 a 126 da proteína tau para, assim, medir uma quantidade de peptídeos tau p217+, e (b) colocar os peptídeos tau p217+ capturados em contato com um segundo anticorpo de detecção direcionado contra um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 7 a 20 da proteína tau para, assim, medir uma quanti- dade de peptídeos tau p217+ longos, e (iii) determinar a eficácia do tra- tamento no indivíduo com base em ao menos um dentre a quantidade de peptídeos tau p217+, a quantidade de peptídeos tau p217+ longos, uma quantidade de peptídeos tau p217+ curtos obtida subtraindo a quanti- dade de peptídeos tau p217+ longos da quantidade de peptídeos tau p217+, e razões das mesmas, em que a numeração do aminoácido é em relação à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, o método compreende adicionalmente administrar ao indivíduo um agente terapêutico para tratar ou prevenir a taupatia.

[0019] De acordo com outro aspecto particular, um método da inven- ção compreende (i) colocar uma amostra biológica, de preferência uma amostra de LCR, de um indivíduo sob um tratamento, em contato com um anticorpo de captura direcionado contra um epítopo de tau p217+ para capturar peptídeos tau p217+ na amostra, e colocar a amostra em contato com um anticorpo de captura independente de fosforilação direcionado contra um epítopo entre os aminoácidos 150 e 250 da proteína tau, de preferência um epítopo que compreende os aminoácidos 159 a 163 da proteína tau, para capturar os peptídeos tau totais na amostra, e (ii) realizar ao menos um dentre (a) colocar os peptídeos tau p217+ capturados em contato com um primeiro anticorpo de detecção direcionado contra um epí- topo que compreende os resíduos de aminoácidos 119 a 126 da proteína tau para, assim, medir uma quantidade de peptídeos tau p217+, e colocar os peptídeos tau totais de captura em contato com o primeiro anticorpo de detecção para, assim, medir uma quantidade de peptídeos tau total; e (b) colocar os peptídeos tau p217+ capturados em contato com um segundo anticorpo de detecção direcionado contra um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 7 a 20 da proteína tau para, assim, medir uma quantidade de peptídeos tau p217+ longos, e colocar os peptídeos tau to- tais de captura em contato com o segundo anticorpo de detecção para, assim, medir uma quantidade de peptídeos tau total, e (iii) para determinar a eficácia do tratamento no indivíduo com base em ao menos um dentre (a) uma razão entre a quantidade de peptídeos tau p217+ e a quantidade de peptídeos tau total, (b) uma razão entre a quantidade de peptídeos tau p217+ longos e a quantidade de peptídeos tau longos total, e (c) uma ra- zão entre a quantidade de peptídeos tau p217+ curtos e a quantidade de peptídeos tau curtos total, em que a quantidade de peptídeos tau p217+ curtos é obtida subtraindo a quantidade de peptídeos tau p217+ longos da quantidade de peptídeos tau p217+, e a quantidade de peptídeos tau cur- tos total é obtida subtraindo a quantidade de peptídeos tau curtos total da quantidade de peptídeos tau total, em que a numeração do aminoácido é em relação à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, o método compreende adicionalmente administrar ao indivíduo um agente terapêutico para tratar ou prevenir a taupatia.

[0020] De acordo com outro aspecto particular, um método da inven- ção compreende (i) colocar uma amostra biológica, de preferência uma amostra do LCR, de um indivíduo, em contato com um anticorpo de cap- tura direcionado contra um epítopo de tau p217+ para capturar peptídeos tau p217+ na amostra, e (ii) realizar ao menos um dentre (a) colocar os peptídeos tau p217+ capturados em contato com um primeiro anticorpo de detecção direcionado contra um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 119 a 126 da proteína tau para, assim, medir uma quan- tidade de peptídeos tau p217+, e (b) colocar os peptídeos tau p217+ cap- turados em contato com um segundo anticorpo de detecção direcionado contra um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 7 a 20 da proteína tau para, assim, medir uma quantidade de peptídeos tau p217+ longos, e (iii) determinar se ou não o indivíduo é adequado para um anticorpo antitau p217+ com base em ao menos um dentre a quanti- dade de peptídeos tau p217+, a quantidade de peptídeos tau p217+ lon- gos, uma quantidade de peptídeos tau p217+ curtos obtida subtraindo a quantidade de peptídeos tau p217+ longos da quantidade de peptídeos tau p217+, e razões das mesmas, em que a numeração do aminoácido é em relação à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:

1. Em uma modalidade, o método compreende adicionalmente adminis- trar ao indivíduo um anticorpo anti-tau p217+ para tratar ou prevenir a taupatia.

[0021] De acordo com outro aspecto particular, um método da inven- ção compreende (i) colocar uma amostra biológica, de preferência uma amostra do LCR, de um indivíduo, em contato com um anticorpo de cap- tura direcionado contra um epítopo de tau p217+ para capturar peptídeos tau p217+ na amostra, e colocar a amostra em contato com um anticorpo de captura independente de fosforilação direcionado contra um epítopo entre os aminoácidos 150 e 250 da proteína tau, de preferência um epí- topo que compreende os aminoácidos 159 a 163 da proteína tau, para capturar os peptídeos tau totais na amostra, e (ii) realizar ao menos um dentre (a) colocar os peptídeos tau p217+ capturados em contato com um primeiro anticorpo de detecção direcionado contra um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 119 a 126 da proteína tau para, assim, medir uma quantidade de peptídeos tau p217+, e colocar os pep- tídeos tau totais de captura em contato com o primeiro anticorpo de de- tecção para, assim, medir uma quantidade de peptídeos tau total; e (b) colocar os peptídeos tau p217+ capturados em contato com um segundo anticorpo de detecção direcionado contra um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 7 a 20 da proteína tau para, assim, medir uma quantidade de peptídeos tau p217+ longos, e colocar os peptídeos tau totais de captura em contato com o segundo anticorpo de detecção para, assim, medir uma quantidade de peptídeos tau total, e (iii) determi- nar se ou não o indivíduo é adequado para uma terapia com anticorpos antitau p217+ com base em ao menos um dentre (a) uma razão entre a quantidade de peptídeos tau p217+ e a quantidade peptídeos tau totais, (b) uma razão entre a quantidade de peptídeos tau p217+ longos e a quantidade de peptídeos tau longos total, e (c) uma razão entre a quan- tidade de peptídeos tau p217+ curtos e a quantidade de peptídeos tau curtos total, em que a quantidade de peptídeos tau p217+ curtos é obtida subtraindo a quantidade de peptídeos tau p217+ longos da quantidade de peptídeos tau p217+, e a quantidade de peptídeos tau curtos total é obtida subtraindo a quantidade de peptídeos tau curtos total da quanti- dade de peptídeos tau total, em que a numeração do aminoácido é em relação à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, o método compreende adicionalmente administrar ao indivíduo um anticorpo anti-tau p217+ para tratar ou prevenir a taupatia.

[0022] Em outro aspecto particular, a invenção se refere a um mé- todo para monitoramento de um tratamento com um anticorpo antitau p217+ em um indivíduo, em que o método compreende: (i) obter uma amostra biológica do indivíduo, e (ii) separar a amostra biológica em uma primeira amostra contendo tau p217+ livre de anticorpo antitau p217+, de preferência de IgG, e uma segunda amostra contendo peptídeos tau p217+ ligados ao anticorpo antitau p217+, (iii) obter uma terceira amostra contendo tau p217+ livre de anticorpo antitau p217+ a partir da segunda amostra, de preferência por meio de rpHPLC, (iv) colocar cada uma da primeira amostra e da terceira amostra em contato com um anticorpo de captura direcionado contra um epítopo de tau p217+ para capturar peptí- deos tau p217+ em cada uma das amostras, (v) realizar ao menos um dentre (a) colocar os peptídeos tau p217+ capturados em contato com um primeiro anticorpo de detecção direcionado contra um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 119 a 126 da proteína tau para, assim, medir uma quantidade de peptídeos tau p217+ em cada uma das amostras, e (b) colocar os peptídeos tau p217+ capturados em contato com um segundo anticorpo de detecção direcionado contra um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 7 a 20 da proteína tau para, assim, medir uma quantidade de peptídeos tau p217+ longos em cada uma das amostras, (vi) monitorar o tratamento com anticorpo antitau p217+ com base em ao menos um dentre a quantidade de peptídeos tau p217+ e a quantidade de peptídeos tau p217+ longos em cada uma das amostras, em que a numeração do aminoácido é em relação à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1. Por exemplo, o trata- mento com anticorpo antitau p217+ pode ser monitorado com base em uma razão da quantidade de peptídeos tau p217+ longos entre a primeira amostra e a terceira amostra, uma razão da quantidade de peptídeos tau p217+ entre a primeira amostra e a terceira amostra ou uma razão da quantidade de peptídeos tau p217+ curtos (que pode ser calculada sub- traindo a quantidade de peptídeos tau p217+ longos da quantidade de peptídeos tau p217+) entre a primeira amostra e a terceira amostra. Em uma modalidade, o método compreende adicionalmente administrar ao indivíduo um anticorpo anti-tau p217+ para tratar ou prevenir a taupatia.

[0023] Em um outro aspecto geral, a invenção se refere a um mé- todo para monitoramento de um tratamento com um anticorpo antitau p217+ em um indivíduo, em que o método compreende: (i) obter uma amostra biológica do indivíduo, e (ii) obter uma amostra semidesnatu- rada da amostra biológica contendo tau p217+ total, em que a amostra semidesnaturada é aquecida para desnaturar os anticorpos na amos- tra, e obter uma amostra não desnaturada da amostra biológica con- tendo tau p217+ livre de anticorpo antitau p217+, (iii) colocar cada uma da amostra desnaturada e da amostra não desnaturada em contato com um anticorpo de captura direcionado contra um epítopo de tau p217+ para capturar peptídeos tau p217+ em cada uma das amostras, (v) realizar ao menos um dentre (a) colocar os peptídeos tau p217+ capturados em contato com um primeiro anticorpo de detecção direci- onado contra um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 119 a 126 da proteína tau para, assim, medir uma quantidade de pep- tídeos tau p217+ em cada uma das amostras, e (b) colocar os peptí- deos tau p217+ capturados em contato com um segundo anticorpo de detecção direcionado contra um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 7 a 20 da proteína tau para, assim, medir uma quanti- dade de peptídeos tau p217+ longos em cada uma das amostras, e vi)

monitorar o tratamento com anticorpo antitau p217+ com base em ao menos um dentre a quantidade de peptídeos tau p217+ e a quantidade de peptídeos tau p217+ longos em cada uma das amostras, em que a numeração do aminoácido é em relação à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1. Por exemplo, o tratamento com anti- corpo antitau p217+ pode ser monitorado com base em uma razão da quantidade de peptídeos tau p217+ longos entre a amostra semides- naturada e a amostra não desnaturada, uma razão da quantidade de peptídeos tau p217+ entre a amostra semidesnaturada e a amostra não desnaturada, ou uma razão da quantidade de peptídeos tau p217+ curtos (que pode ser calculada subtraindo a quantidade dos peptídeos tau p217+ longos da quantidade de peptídeos tau p217+) entre a amostra semidesnaturada e a amostra não desnaturada. Em uma mo- dalidade, o método compreende adicionalmente administrar ao indiví- duo um anticorpo anti-tau p217+ para tratar ou prevenir a taupatia.

[0024] De acordo com um aspecto específico, a taupatia inclui, mas não se limita a uma ou mais selecionadas do grupo que consiste em doença de Alzheimer (incluindo doença de Alzhemer familiar e doença de Alzheimer esporádica), demência frontotemporal com parkinsonismo ligado ao cromossomo 17 (FTDP-17), paralisia supranuclear progres- siva, degeneração corticobasal, doença de Pick, gliose progressiva sub- cortical, demência apenas com emaranhados, emaranhados neurofibri- lares difusos com calcificação, demência com grãos argirofílicos, com- plexo esclerose lateral amiotrófica-parkinsonismo-demência, síndrome de Down, doença de Gerstmann-Sträussler-Scheinker, doença de Hal- lervorden-Spatza, miosite por corpos de inclusão, doença de Creutzfelt- Jakob, atrofia de múltiplos sistemas, doença de Niemann-Pick tipo C, angiopatia amiloide cerebral causada pela proteína príon, panencefalite esclerosante subaguda, distrofia miotônica, doença do neurônio motor não Guamaniana com emaranhados neurofibrilares, parkinsonismo pós-encefalítico, encefalopatia traumática crônica e demência pugilís- tica (doença do boxe).

[0025] De preferência, a tauopatia é a doença de Alzheimer (inclu- indo doença de Alzheimer familiar e doença de Alzheimer esporádica), FTDP-17 ou paralisia supranuclear progressiva.

[0026] Com a máxima preferência, a taupatia é a doença de Al- zheimer (incluindo doença de Alzheimer familiar e doença de Alzhei- mer esporádica).

[0027] De acordo com um aspecto específico, o limite inferior de quantificação de um método da invenção é de cerca de 40 fg/ml de peptídeos tau p217+ e o limite inferior de detecção de um método da invenção é de cerca de 2 fg/ml de peptídeos tau p217+.

[0028] De acordo com um aspecto específico, a amostra é uma amos- tra biológica, como uma amostra de sangue, homogenato cerebral ou lí- quido cefalorraquidiano (LCR), de um indivíduo que necessita do mesmo. De preferência, a amostra biológica é uma amostra de LCR de um indiví- duo em necessidade de um diagnóstico de taupatia, monitoramento da efetividade de um tratamento de taupatia ou a determinação sobre a ade- quação a uma terapia de anticorpo antitau p217+.

[0029] De acordo com um aspecto particular, um anticorpo de cap- tura útil para os métodos da invenção é direcionado contra um epítopo de tau + p217, de preferência um epítopo de tau p217+ contendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 25, 26 ou 27. Em uma modalidade, um anticorpo de captura útil para os métodos da invenção compreende a HCDR1, HCDR2 e HCDR3 da cadeia pesada de imu- noglobulina tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 32, 33 e 34, respectivamente, e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 da cadeia leve de imunoglobulina tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 35, 36 e 37, respectivamente. De preferência, o anticorpo de captura tem uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 28 ou 30 e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 29 ou 31.

[0030] De acordo com um aspecto específico, um anticorpo de de- tecção útil para os métodos da invenção é direcionado contra um epí- topo que compreende os resíduos de aminoácidos 119 a 126 da prote- ína tau, de preferência um epítopo que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10, como a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11. Em uma modalidade, um anticorpo de detecção útil para os métodos da invenção compreende a HCDR1, HCDR2 e HCDR3 da cadeia pesada de imunoglobulina tendo as sequências de polipeptí- deos das SEQ ID NOs: 2, 3 e 4, respectivamente; e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 da cadeia leve de imunoglobulina tendo as sequências de poli- peptídeos das SEQ ID NOs: 5, 6 e 7, respectivamente. De preferência, o anticorpo de detecção é um anticorpo pT82 que compreende uma re- gião variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 8 e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 9.

[0031] De acordo com um outro aspecto específico, um anticorpo de detecção útil para os métodos da invenção é direcionado contra um epítopo contendo resíduos de aminoácidos 7 a 20 da proteína tau, de preferência um epítopo que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20. Em uma modalidade, um anticorpo de detecção útil para os métodos da invenção compreende a HCDR1, HCDR2 e HCDR3 da ca- deia pesada de imunoglobulina tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 12, 13 e 14, respectivamente; e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 da cadeia leve de imunoglobulina tendo as sequências de poli- peptídeos das SEQ ID NOs: 15, 16 e 17, respectivamente. De preferên- cia, o anticorpo de detecção é um anticorpo hT43 que compreende uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 18 e uma região variável da cadeia leve tendo a sequên- cia de polipeptídeos da SEQ ID NO: 19.

[0032] De acordo com um outro aspecto específico, um anticorpo de captura independente de fosforilação útil para a invenção é direcio- nado contra um epítopo entre os aminoácidos 150 e 250 da proteína tau, de preferência um epítopo que compreende os aminoácidos 211 a 221 da proteína tau, ou um epítopo que compreende os aminoácidos 159 a 163 da proteína tau, com mais preferência um epítopo que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21. Em uma modalidade, um anticorpo de captura independente de fosforilação útil para a inven- ção é um anticorpo hT7.

[0033] De acordo com outro aspecto particular, a amostra utilizada nos métodos da invenção é obtida após fracionar uma amostra biológica com o uso de cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa (rpHPLC).

[0034] Em um outro aspecto geral, a invenção se refere a um anti- corpo de detecção isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a uma proteína tau em um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 7 a 20 da proteína tau, compreendendo (a) HCDR1, HCDR2 e HCDR3 da cadeia pesada de imunoglobulina tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 12, 13 e 14, respecti- vamente; e (b) LCDR1, LCDR2 e LCDR3 da cadeia leve de imunoglobu- lina tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 15, 16 e 17, respectivamente. De acordo com um aspecto específico, o anticorpo de detecção isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com- preende uma cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 18 e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 19. De preferência, o anticorpo de de- tecção isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a uma proteína tau em um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 7 a 20 da proteína tau é um anticorpo hT43.

[0035] Em um outro aspecto geral, a invenção se refere a um kit que compreende (a) um anticorpo de captura direcionado contra um epítopo de tau p217+ e (b) um anticorpo de detecção direcionado contra um epí- topo de proteína tau que compreende os resíduos de aminoácidos 7 a 20 ou 116 a 127 da proteína tau. Opcionalmente, o kit compreende adicional- mente um anticorpo de captura independente de fosforilação direcionado contra um epítopo de tau entre os aminoácidos 150 e 250 da proteína tau. O kit pode ser utilizado, por exemplo, para medir a quantidade de peptí- deos tau p217+, a quantidade de peptídeos tau p217+ longos, a quanti- dade de peptídeos tau p217+ curtos, a razão entre a quantidade de peptí- deos tau p217+ curtos e a quantidade de peptídeos tau p217+ longos, a razão entre a quantidade de peptídeos tau p217+ curtos e a quantidade de peptídeos tau curtos total em uma amostra etc. O kit pode também ser para vários fins de diagnóstico ou de monitoramento, por exemplo, para determinar se ou não um indivíduo sofre de uma taupatia ou está em risco de desenvolver uma taupatia, o monitoramento da eficácia de um trata- mento contra uma taupatia, como um tratamento com um anticorpo antitau p217+, para determinar se ou não o indivíduo é adequado para um anti- corpo antitau p217+, etc.

[0036] De acordo com um aspecto específico, um kit da invenção compreende um anticorpo de captura, que tem HCDR1, HCDR2 e HCDR3 da cadeia pesada de imunoglobulina tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 32, 33 e 34, respectivamente, e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 da cadeia leve de imunoglobulina tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 35, 36 e 37, respecti- vamente. De preferência, o anticorpo de captura tem uma região vari- ável da cadeia pesada que compreende a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 28 e uma região variável da cadeia leve tendo a se- quência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 29.

[0037] De acordo com outro aspecto particular, um kit da invenção compreende um anticorpo de detecção, que compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 da cadeia pesada de imunoglobulina tendo as se- quências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 2, 3 e 4, respectivamente; e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 da cadeia leve de imunoglobulina tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 5, 6 e 7, respectiva- mente. De preferência, o anticorpo de detecção é um anticorpo pT82 que compreende uma região variável da cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeos da SEQ ID NO: 8 e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 9.

[0038] De acordo com outro aspecto particular, um kit da invenção compreende um anticorpo de detecção, que compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 da cadeia pesada de imunoglobulina tendo as se- quências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 12, 13 e 14, respectiva- mente; e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 da cadeia leve de imunoglobulina tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 15, 16 e 17, respectivamente. De preferência, o anticorpo de detecção é um anti- corpo hT43 que compreende uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 18 e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 19.

[0039] Outros aspectos, características e vantagens da invenção ficarão evidentes a partir da divulgação a seguir, incluindo a descrição detalhada da invenção e suas modalidades preferenciais e as reivindi- cações em anexo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0040] O sumário anteriormente mencionado, bem como a se- guinte descrição detalhada da invenção, serão mais bem compreendi- dos quando lidos em conjunto com os desenhos em anexo. Deve-se compreender que a invenção não se limita às modalidades precisas mostradas nos desenhos.

[0041] A Figura 1 mostra um exemplo de curva padrão para os en- saios de pT3xhT43 e pT3xpT82 gerados com o uso de peptídeos cali- brantes com média +/- DP de medições em duplicata mostradas em cada ponto.

[0042] As Figuras 2A-2E mostram a linearidade de diluição dos ensaios de pT3xhT43 e pT3xpT82 nas amostras de LCR com medi- ções mostradas (A, C e E) em diluição corrigida pg/ml ou (B e D) como % de diluição corrigida de medição de 1:4, com as linhas trace- jadas indicando +/- 20% de medições de 1:4.

[0043] A Figura 3 mostra a precisão intra e interteste dos ensaios (A) pT3xhT43 e (B) pT3xpT82.

[0044] As Figuras 4A-4B mostram a precisão entre os sítios de teste dos ensaios de pT3xhT43 e pT3xpT82 com os dados representa- dos graficamente como sinal/ruído (S/N).

[0045] As Figuras 5A-5B mostram a competição do sinal de en- saio com base em pT3 por anticorpos solúveis direcionados para tau p217+ nos ensaios de (A) pT3xhT43 e (B) pT3xpT82.

[0046] A Figura 6 mostra a dependência da fosforilação dos ensaios de pT3xhT43 e pT3xpT82.

[0047] A Figura 7 mostra um perfil de fragmento de tau p217+ de LCR de DA, medido com o uso dos ensaios de pT3xhT43 e pT3xpT82, com os dados representados graficamente como sinal menos ruído.

[0048] As Figuras 8A-8B mostram a temperatura e a estabilidade para congelamento e descongelamento do sinal de tau p217+ em uma amostra de LCR de DA usando os ensaios de (A) pT3xhT43 e (B) hT7xpT82.

[0049] A Figura 9 mostra a estabilidade a longo prazo do sinal de tau p217+ em amostras de LCR após armazenamento a -70 °C. Não foi de- tectada nenhuma alteração no sinal.

[0050] As Figuras 10A-10F mostram uma correlação entre tau p217+ e os biomarcadores clássicos da DA Aβ42, tTau (tau total) e pTau181, conforme medido por ensaios de (A-C) pT3xhT43 e (D-F) pT3xpT82.

[0051] As Figuras 11A-11B mostram uma correlação entre análise de IHC de biópsia do cérebro e tau p217+, conforme medido por en- saios de (A) pT3xhT43 e (B) pT3xpT82.

[0052] As Figuras 12A-12D mostram os resultados de (A) pT3xhT43, (B) pT3xpT82, (C) hT7xpT82 e (D), e a razão entre análise de pT3xpT82 e hT7xpT82 de LCR bruto de pacientes de DA e VS.

[0053] A Figura 13 mostra o poder preditivo dos ensaios de pT3xhT43 ("343"), pT3xpT82 ("382") e hT7xpT82 ("782") na diferenciação de indiví- duos de DA e VS.

[0054] As Figuras 14A-14F mostram o sinal proveniente de ensaios de (A, B) pT3xhT43 ("343"), (C, D) pT3xpT82 ("382") e (E, F) hT7xpT82 ("782") executados em rpHPLC de frações de LCR de indivíduos de (A, C, E) DA e de (B, D, F) VS.

[0055] As Figuras 15A-15O mostram o sinal proveniente de en- saios de (A-E) pT3xhT43, (F-J) pT3xpT82 e (K-O) hT7xpT82 realiza- dos em frações de rpHPLC de indivíduos LCR 0 e CDR 0,5.

[0056] As Figuras 16A-16B mostram os resultados de (A) razão de análise de pT3xpT82 versus hT7xpT82 (pTau curto) ou razão de análise de pT3xhT43 versus hT7xpT82 (pTau longo) em LCR bruto e (B) razão de análise de pT3xpT82 vs. hT7xpT82 de frações de rpHPLC de LCR, em comparação com o escore do MMSE; tudo de uma coorte cega de indivíduos CDR 0 e CDR1.

[0057] As Figuras 17A-17T mostram os resultados de análises de (A) pT3xhT43, (B) pT3xpT82 e (C) hT7xpT82 em LCR bruto, (D) correlação dos dois ensaios de pT3 em LCR bruto, (E) correlação de pT3xpT82 ver- sus hT7xpT82 em LCR bruto, (F) correlação de pT3xhT43 versus Innotest tTau em Bruto LCR, (G) correlação de pT3xhT43 versus Innotest pTau181 em LCR bruto, (H) correlação de pT3xhT43 versus Innotest AB42 em LCR bruto, (I) correlação da razão de pT3xhT43 versus Innotest AB42/40 em LCR bruto; (J-I) sinal de pT3xhT43, (M-P) sinal de pT3xpT82 ou (Q-T) sinal de hT7xpT82 em (J, M, Q), todas as frações de rpHPLC, bem como (K, N, R) as somas de todas as frações, (O, S) somas das frações de pico iniciais (fragmentos de tau curto) ou (L, P, T) as somas das frações de pico finais (fragmentos de tau maiores); todas de uma coorte de indivíduos de VS, MCI e DA.

[0058] As Figuras 18A-18P mostram os resultados de (A) pT3xpT82 (p217+ curto) versus pT3xhT43 (p217+ longo), (B) pT3xpT82 versus hT7xpT82 (tTau curto), (C) pT3xpT82 vs. NFL e (D) pT3xhT43 ou (E) pT3xpT82 versus o estado de amiloide, bem como a correlação de (F-I, N- P) pT3xhT43 ou (J-M) pT3xpT82 com (F-M) vários escores de cognição ou (N-P) mudança nesses escores por 78 semanas; todos da coorte de 235 indivíduos (90 dos quais tiveram acompanhamento de 78 semanas) do estudo de Janssen ELN115727301/302 dos indivíduos com ligeiras a moderadas DA. Os indivíduos foram inicialmente matriculados (e classifi- cados como DA) com base na cognição, entretanto, mediante avaliação bioquímica (AB40 e AB42) foi constatado que 27 dos indivíduos eram ami- loide negativo, e dessa forma provavelmente representam demência de causas não DA. Esses indivíduos são analisados como uma coorte sepa- rada nas figuras acima e são designados como indivíduos amiloide nega- tivos = 0 e amiloide positivos = 1.

[0059] A Figura 19 mostra o sinal de um ensaio de pT3xhT43 exe- cutado em frações de rpHPLC de amostras de LCR reforçadas com IgG, mAb pT3, mAb pT3 humanizado ou controle simulado, seguido de imunoprecipitação para coletar a tau p217+ ligada ao anticorpo.

[0060] As Figuras 20A-20B mostram a dependência da dose de anticorpo do método de imunocaptura/rpHPLC para quantificar a tau p217+ (A) livre de anticorpo e (B) ligada ao anticorpo, com os dados representados graficamente como a soma do sinal em frações de rpHPLC 12-16.

[0061] As Figuras 21A-21C mostram a cinética diferencial do dano de anticorpo vs. tau p217+ (A, C) com ou (B) sem desnaturação mediada por calor. (A) mistura de mAb PT3 humanizado/LCR; (B) LCR não tratado; (C) mAb PT3 humanizado.

[0062] As Figuras 22A-22C mostram métodos (A) de desnaturação mediada por calor e (b) de imunocaptura/rpHPLC para quantificar a tau p217+ livre de anticorpo vs. ligada ao anticorpo; (C) mostra uma compara- ção dos métodos.

[0063] A Figura 23 mostra uma falta de reconhecimento do ensaio com base em pT3 de tau p217 em LCR de macaco cinomolgo.

[0064] As Figuras 24A-24C mostram as medições de tau p217+ em LCR de sagui, conforme determinado com o uso dos ensaios de (A) pT3xhT43, (B) pT3xpT82 e (C) hT7xpT82.

[0065] As Figuras 25A-25D mostram as medições de (A, B) hT7xpT82 (tTau) ou (C, D) pT3xpT82 (tau p217+ curto) em soro bruto de 4 indivíduos DA e VS. As medições foram realizadas sob diluição de (A, C) 1:4 ou (B, D) 1:16, observa-se falta de linearidade e sensibi- lidade da diluição.

[0066] As Figuras 26A-26B mostram as medições de (A) hT7xpT82 (tTau) ou (B) pT3xpT82 (tau p217+ curto) em soros pré-tratados com Na- OAc e desnaturação por calor, dos mesmos 4 indivíduos DA e VS avalia- dos nas Figuras 25A-25D.

[0067] A Figura 27 mostra as medições de pT3xpT82 (tau p217+ curto) em imunoprecipitações (IP) de pT3 de soros dos mesmos 4 indiví- duos DA e VS avaliados nas Figuras 25A-25D e nas Figuras 26A-26B.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0068] Várias publicações, artigos e patentes são citados ou des- critos em segundo plano e ao longo do relatório descritivo; cada uma dessas referências está aqui incorporada por referência em sua totali- dade. A discussão de documentos, atos, materiais, dispositivos, artigos ou similares que tenha sido incluída no presente relatório descritivo tem o propósito de fornecer contexto para a invenção. Tal discussão não é uma admissão de que qualquer um ou todos esses assuntos façam parte da técnica anterior no que diz respeito a quaisquer inven- ções divulgadas ou reivindicadas. Definições

[0069] Exceto onde definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos utilizados na presente invenção têm o mesmo significado comu- mente compreendido pelo versado na técnica à qual essa invenção per- tence. De outro modo, certos termos utilizados na presente invenção têm os significados conforme definidos no relatório descritivo. Todas as paten- tes, pedidos de patente publicados e publicações aqui citadas estão aqui incorporados por referência como se aqui fossem apresentados total- mente. Deve-se observar que, conforme usado na presente invenção e nas reivindicações em anexo, as formas no singular "um/uma" e "o/a" in- cluem a referência no plural, salvo se o contexto claramente indicar o con- trário.

[0070] Exceto onde especificado de outra forma, qualquer valor nu- mérico, como uma concentração ou uma faixa de concentração aqui descrita, deve ser entendido como sendo modificado em todos os casos pelo termo "cerca de". Dessa forma, um valor numérico tipicamente in- clui ± 10% do valor mencionado. Por exemplo, uma concentração de 1 mg/ml inclui 0,9 mg/ml a 1,1 mg/ml. De modo semelhante, uma faixa de concentração de 1% a 10% (p/v) inclui 0,9% (p/v) a 11% (p/v). Como usado na presente invenção, o uso de uma faixa numérica inclui expres-

samente todas as subfaixas possíveis, todos os valores numéricos indi- viduais dentro dessa faixa, incluindo números inteiros dentro dessas fai- xas, e frações dos valores, a menos que o contexto indique claramente de outro modo.

[0071] Como usado na presente invenção, o termo "anticorpo" ou "imunoglobulina" é usado em um sentido amplo e inclui moléculas de imunoglobulina ou anticorpo incluindo anticorpos policlonais, anticor- pos monoclonais incluindo anticorpos monoclonais murinos, humanos, humanos adaptados, humanizados e quiméricos e fragmentos de anti- corpos.

[0072] Em geral, os anticorpos são proteínas ou cadeias peptídicas que apresentam especificidade de ligação para um antígeno específico. As estruturas de anticorpos são bem conhecidas. As imunoglobulinas po- dem ser divididas em cinco classes principais, a saber, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, dependendo da sequência de aminoácidos de domínio constante de cadeia pesada. IgA e IgG são, ainda, subclassificados como os isótipos IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Consequentemente, os anticorpos da invenção podem ser de qualquer das cinco principais classes ou sub- classes correspondentes. De preferência, os anticorpos da invenção são IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. As cadeias leves de anticorpos de qualquer espécie de vertebrados podem ser atribuídas a um de dois tipos clara- mente distintos, a saber, kappa (κ) e lambda (λ), com base nas sequências de aminoácidos de seus domínios constantes. Consequentemente, os an- ticorpos da invenção podem conter um domínio constante de cadeia leve kappa ou lambda. De acordo com modalidades específicas, os anticorpos da invenção incluem regiões constantes de cadeia pesada e/ou de cadeia leve de anticorpos de camundongos ou de seres humanos.

[0073] Em adição aos domínios constantes de cadeia leve e pesada, os anticorpos contêm regiões variáveis de cadeia leve e pesada. Uma re- gião variável de cadeia leve ou pesada de imunoglobulina consiste em uma região "framework" interrompida por "sítios de ligação ao antígeno". Os sítios de ligação ao antígeno são definidos com o uso de vários termos e esquemas de numeração da seguinte forma: (i) Kabat: "Regiões determinantes de complementaridade" ou "CDRs" são com base na variabilidade da sequência (Wu e Kabat, J Exp Med. 132:211-50, 1970). Em geral, o sítio de ligação ao antígeno tem três CDRs em cada região variável (por exemplo, HCDR1, HCDR2 e HCDR3 na região variável de cadeia pesada (VH) e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 na região variável de cadeia leve (VL)); (ii) Chothia: Os termos "região hipervariável" e "HVR" se re- fere a regiões de um domínio variável de anticorpo que são hipervariá- veis na estrutura, conforme definido por Chothia e Lesk (Chothia e Lesk, J Mol Biol. 196:901-17, 1987). Em geral, o sítio de ligação ao antígeno tem três regiões hipervariáveis em cada VH (H1, H2, H3) e VL (L1, L2, L3). Os sistemas de numeração, bem como as anotações de CDRs e HVRs, foram revistos por Abhinandan e Martin (Abhinandan e Martin, Mol Immunol. 45:3832-9, 2008); (iii) IMGT: Uma outra definição das regiões que formam o sítio de ligação a antígeno foi proposta por Lefranc (Lefranc et al., Dev Comp Immunol. 27:55-77, 2003) com base na comparação dos domí- nios V de imunoglobulinas e receptores das células T.

O banco de da- dos da International ImMunoGeneTics (IMGT) (http:_//www_imgt_org) fornece uma numeração e uma definição padronizadas dessas regi- ões.

A correspondência entre delineações de CDRs, HVRs e IMGT é descrita em Lefranc et al., 2003, Id.; (iv) O sítio de ligação ao antígeno pode também ser delineado com base em "Specificity Determining Residue Usage" (SDRU) (Almagro, Mol Recognit. 17:132-43, 2004), em que SDR, se refere a resíduos de ami- noácidos de uma imunoglobulina que estão diretamente envolvidos no contato com antígeno.

[0074] "Framework" ou "sequências de framework" são as sequências remanescentes na região variável de um anticorpo diferente daqueles de- finidos para serem as sequências do sítio de ligação ao antígeno. Como a definição exata de um sítio de ligação a antígeno pode ser determinada por várias delineações, conforme descrito acima, a sequência de fra- mework exata depende da definição do sítio de ligação a antígeno. As re- giões framework (FRs) são as porções mais altamente conservadas dos domínios variáveis. Os domínios variáveis de cadeias leves e pesadas na- tivas compreendem quatro FRs (FR1, FR2, FR3 e FR4, respectivamente) que geralmente adotam uma configuração de folha-beta, conectados pe- las três alças hipervariáveis. As alças hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas muita próximas pela FRs e, com as alças hipervariáveis de outras cadeias, contribuem para a formação de sítio de ligação ao an- tígeno dos anticorpos. A análise estrutural dos anticorpos revelou a relação entre a sequência e o formato do sítio de ligação formado pelas regiões determinantes de complementaridade (Chothia et al., J. Mol. Biol. 227: 799-817, 1992; Tramontano et al., J. Mol. Biol. 215:175-182, 1990). Apesar de sua alta variabilidade da sequência, cinco das seis alças adotam ape- nas um pequeno repertório de conformações de cadeia principais, cha- mado "estruturas canônicas". Essas conformações são, em primeiro lugar, determinadas pelo comprimento das alças e, em segundo lugar, pela pre- sença de resíduos muito importantes em certas posições nas alças e nas regiões framework que determinam a conformação através de seu empa- cotamento, a ligação ao hidrogênio ou a capacidade para assumir confor- mações não usuais de cadeia principal.

[0075] Como usado na presente invenção, o termo "fragmento de li- gação de antígeno" se refere a um fragmento de anticorpo como, por exemplo, um diacorpo, um Fab, um Fab', um F(ab')2, um fragmento Fv (dsFv), um fragmento Fv, um dissulfeto estabilizadas fragmento Fv

(dsFv), a (dsFv)2, um dsFv biespecífico dsFv-dsFv'), um diacorpo estabi- lizado por dissulfureto (diacorpo ds), uma molécula de anticorpo de ca- deia única (scFv), um anticorpo de domínio único (sdab), um dímero de scFv (diacorpo bivalente), um anticorpo multiespecífico formado a partir de uma porção de um anticorpo compreendendo uma ou mais CDRs, um anticorpo de domínio único camelizado, um nanocorpo, um anticorpo de domínio, um anticorpo de domínio bivalente ou qualquer outro fragmento de anticorpo que se liga a um antígeno, mas não compreende uma es- trutura do anticorpo. Um fragmento de ligação a antígeno é capaz de se ligar ao mesmo antígeno ao qual o anticorpo parental ou um fragmento de anticorpo parental se liga. De acordo com modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia leve, uma região constante de cadeia leve e um segmento Fd da região constante da cadeia pesada. De acordo com outras modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno compreende Fab e F(ab').

[0076] Como usado na presente invenção, o termo "epítopo" se re- fere a um sítio em um antígeno ao qual uma imunoglobulina, anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, se liga especificamente. Os epítopos podem ser formados tanto de aminoácidos contíguos quanto de aminoácidos não contíguos justapostos pela dobra (ou dobramento) terciária de uma proteína. Os epítopos formados de aminoácidos contí- guos são tipicamente retidos na exposição aos solventes desnaturantes, enquanto os epítopos formados por dobramento terciário são tipicamente perdidos no tratamento com solventes desnaturantes. Um epítopo tipica- mente inclui ao menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 amino- ácidos em uma conformação espacial única. Métodos para determinar a conformação espacial de epítopos incluem, por exemplo, cristalografia de raios X e ressonância magnética nuclear bidimensional. Consulte, por ex- emplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol.

66, G. E. Morris, Ed. 1996).

[0077] Como usado na presente invenção, o termo "tau" ou "proteína tau" se refere a uma proteína abundante no sistema nervoso central e pe- riférico que tem múltiplas isoformas. No sistema nervoso central (SNC) hu- mano, seis grandes isoformas principais com tamanho na faixa de 352 a 441 aminoácidos de comprimento existem devido ao splicing alternativo (Hanger et al., Trends Mol Med. 15:112-9, 2009). As isoformas diferem umas das outras pela inclusão regulada de 0 a 2 elementos de inserção N-terminais e 3 ou 4 repetições de ligação de microtúbulos dispostas em tandem e são chamadas de 0N3R, 1N3R, 2N3R, 0N4R, 1N4R e 2N4R. Como usado na presente invenção, o termo "tau de controle" se refere à isoforma de tau da SEQ ID NO: 1 que é desprovida de fosforilação e outras modificações pós-traducionais. Como usado na presente invenção, o termo "tau" inclui proteínas que compreendem mutações, por exemplo, mutações pontuais, fragmentos, inserções, deleções e variantes juncio- nais de tau tipo selvagem de comprimento total. O termo "tau" também abrange modificações pós-traducionais da sequência de aminoácidos de tau. As modificações pós-traducionais incluem, mas não se limitam a, fos- forilação.

[0078] Exceto onde indicado em contrário, como utilizado aqui, a nu- meração do aminoácido em uma proteína tau ou fragmento da mesma é com referência à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:

1.

[0079] Como aqui utilizado, os termos "peptídeos tau p217+", "tau p217+" e "proteína tau p217+" significam uma proteína tau humana ou fragmento de tau, que é fosforilada em um ou ambos os resíduos 217 (pT217) e 212 (pT212) da proteína tau, em que a numeração das po- sições é de acordo com a numeração na SEQ ID NO: 1.

[0080] Como aqui utilizado, o termo "epítopo de tau p217+" se re-

fere a um epítopo de tau contendo ao menos uma dentre T217 fosfori- lada e T212 fosforilada, em que a numeração das posições é de acordo com a numeração na SEQ ID NO: 1. Exemplos de epítopo de tau p217+ incluem, por exemplo, um epítopo pT3. Como aqui utilizado, o termo "epítopo pT3" se refere a um epítopo contendo os aminoácidos 210 a 220 da proteína tau humana, que é fosforilado ao menos um resíduo T217 ou T212 de tau humana, em que a numeração das posições é de acordo com a numeração na SEQ ID NO: 1. Exemplos do epítopo pT3 incluem, por exemplo, as SEQ ID NOs: 25, 26 e 27.

[0081] Como aqui utilizado, cada um dos termos "peptídeos tau p217+ longos", "forma longa de peptídeos tau p217+" ou "fragmento de peptídeos tau p217+ longos" tem o mesmo significado, referindo-se a um peptídeo tau p217+ que compreende o epítopo de tau p217+ e um epítopo compreendendo os resíduos de aminoácido 7 a 20 da proteína tau. Os "peptídeos tau p217+ longos", de acordo com as modalidades da invenção, podem ter comprimentos diferentes. Por exemplo, o amino-terminal de um "fragmento de peptídeos tau longos p217+" pode ser o resíduo de aminoácido 1, 2, 4, 5, 6 ou 7 da proteína tau.

[0082] Como aqui utilizado, cada um dos termos "peptídeos tau p217+ curtos", "tau p217+ curta", "forma curta de peptídeos tau p217+" ou "fragmento de peptídeos tau p217+ curtos" tem o mesmo significado, referindo-se a um epítopo p217+ que compreende o epítopo dp217+ e um epítopo compreendendo os resíduos de aminoácidos 119 a 126 da proteína tau, mas não contém um epítopo compreendendo os resíduos de aminoácido 7 a 20 da proteína tau. Os "peptídeos tau p217+ curtos", de acordo com as modalidades da invenção, podem ter comprimentos diferentes. Por exemplo, o amino-terminal de um "peptídeo tau p217+ curto" pode ser qualquer um dos resíduos de aminoácidos entre o epí- topo que compreende os resíduos de aminoácidos 7 a 20 da proteína tau e o epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 119 a 126 da proteína tau.

[0083] Como aqui utilizado, cada um dos termos "peptídeo tau longo", "forma longa de peptídeo tau" ou "fragmento de peptídeo tau longo" tem o mesmo significado, referindo-se a um peptídeo tau que compreende o epítopo de tau reconhecido por um anticorpo de captura independente de fosforilação e um epítopo que compreende os resí- duos de aminoácidos 7 a 20 da proteína tau. Os "fragmentos de peptí- deo tau longo", de acordo com as modalidades da invenção, podem ter comprimentos diferentes. Por exemplo, o amino-terminal de um "frag- mento de peptídeo tau longo" pode ser o resíduo de aminoácido 1, 2, 4, 5, 6 ou 7 da proteína tau.

[0084] Como aqui utilizado, cada um dos termos "peptídeo tau curto", "tau curto", "forma curta de peptídeo tau" ou "fragmento de peptídeo tau curto" tem o mesmo significado, referindo-se a um epítopo de tau que compreende o epítopo de tau reconhecido por um anticorpo de captura independente de fosforilação e um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 119 7 a 20 126 da proteína tau. Os "fragmentos de pep- tídeo tau curtos", de acordo com as modalidades da invenção, podem ter comprimentos diferentes. Por exemplo, o amino-terminal de um "peptí- deo tau curto" pode ser qualquer um dos resíduos de aminoácidos entre o epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 7 a 20 da prote- ína tau e o epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 119 a 126 da proteína tau.

[0085] Como aqui utilizado, o termo "anticorpo de captura" se refere a um anticorpo que se liga a um antígeno de interesse e é direta ou indireta- mente ligado a um suporte sólido. Exemplos de suportes sólidos incluem, mas não se limitam a micropartículas ou cápsulas, como microesferas magnéticas. Exemplos de anticorpos de captura incluem, mas não se limi- tam a, um anticorpo monoclonal que se liga a um epítopo de tau p217+. De acordo com modalidades da invenção, o anticorpo de captura pode ser um anticorpo monoclonal que compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 da cadeia pesada de imunoglobulina tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 32, 33 e 34, respectivamente, e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 da cadeia leve de imunoglobulina tendo as sequências de polipep- tídeos das SEQ ID NOs: 35, 36 e 37. Em uma modalidade particular, o anticorpo de captura é pT3. Como aqui utilizado, o termo "pT3" se refere a um anticorpo que se liga a peptídeos tau p217+ e tem uma região variável da cadeia pesada da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28 e a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 29. Em uma modalidade, o anticorpo monoclonal pT3 é expresso por um hibridoma de camundongo. Em uma outra modalidade, o anticorpo de captura é um anticorpo humanizado que tem uma sequência de aminoá- cidos da região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 30 e a sequên- cia de aminoácidos da região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 31.

[0086] De acordo com outras modalidades da invenção, o anticorpo de captura pode ser um anticorpo monoclonal que se liga a um epítopo entre os aminoácidos 150 e 250 da proteína tau, de preferência os amino- ácidos 211 a 221 ou os aminoácidos 159 a 163 da proteína tau humana, em uma maneira independente de fosforilação, e a numeração das posi- ções é de acordo com a numeração na SEQ ID NO: 1. Em uma modali- dade específica, o anticorpo de captura é hT7. Como aqui utilizado, o termo "hT7 " se refere a um anticorpo monoclonal disponível publicamente que se liga a um epítopo que compreende os aminoácidos 159 a 163 da proteína tau humana, em que a numeração das posições é de acordo com a numeração na SEQ ID NO: 1. Um anticorpo monoclonal hT7 é comerci- almente disponível, por exemplo, junto à ThermoFisher (por exemplo, Ca- tálogo n°: MN1000).

[0087] Como aqui utilizado, o termo "anticorpo de detecção" se re- fere a um anticorpo que se liga a um antígeno de interesse e tem um marcador detectável ou está ligado a um sistema de detecção secun- dário. Exemplos de marcadores detectáveis incluem, mas não se limi- tam a várias enzimas, grupos protéticos, materiais fluorescentes, ma- teriais luminescentes, materiais bioluminescentes e materiais radioati- vos. Exemplos de anticorpos de detecção incluem, mas não se limitam a um anticorpo monoclonal que se liga à proteína tau, de preferência um epítopo que compreende os aminoácidos 7 a 20 ou 116 a 127 da proteína tau humana, em que a numeração das posições é de acordo com a numeração na SEQ ID NO: 1. Quando um anticorpo monoclonal que se liga a uma proteína tau em um epítopo que compreende os aminoácidos 7 a 20 é utilizado como um anticorpo de detecção para peptídeos tau p217+ capturados, os fragmentos tau longos são detec- tados. Quando um anticorpo monoclonal que se liga a uma proteína tau em um epítopo que compreende os aminoácidos 116 a 127 é utili- zado como um anticorpo de detecção para peptídeos tau p217+ cap- turados, ambos os fragmentos tau curtos e longos são detectados.

[0088] Em uma modalidade particular, o anticorpo de detecção é hT43. Como aqui utilizado, o termo "hT43 " se refere a um anticorpo mo- noclonal que se liga a um epítopo que compreende os aminoácidos 7 a 20 da proteína tau humana, em que a numeração das posições é de acordo com a numeração na SEQ ID NO: 1, e o anticorpo tem uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 8 e uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 9. Em outra modalidade particular, o anticorpo de detecção é pT82. Como aqui utilizado, o termo "pT82" se refere a um anticorpo monoclonal que se liga a um epítopo que compreende os aminoácidos 119 a 126, de preferência 116 a 127, da proteína tau humana, em que a numeração das posições é de acordo com a numeração na SEQ ID NO: 1, e o anticorpo tem uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 18 e uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 19.

[0089] Como aqui utilizado, o termo "ensaio baseado em pT3" se refere a um ensaio de acordo com uma modalidade da invenção, em que o anticorpo pT3 é utilizado como o anticorpo de captura. Como aqui utilizado, o termo "pT3xhT43" se refere a um ensaio de acordo com uma modalidade da invenção, em que o anticorpo pT3 é utilizado como o anticorpo de captura e o anticorpo hT43 é utilizado como o anticorpo de detecção. Como aqui utilizado, o termo "pT3xpT82" se refere a um ensaio de acordo com uma modalidade da invenção, em que o anticorpo pT3 é utilizado como o anticorpo de captura e o anti- corpo pT82 é utilizado como o anticorpo de detecção.

[0090] Como aqui utilizado, o termo "ensaio à base de hT7" se re- fere a ensaios de acordo com modalidades da invenção, em que o anti- corpo hT7 é utilizado como o anticorpo de captura. Como aqui utilizado, o termo "hT7xpT82" se refere aos ensaios de acordo com as modalida- des da invenção, em que o anticorpo hT7 é utilizado como o anticorpo de captura e o anticorpo pT82 é utilizado como o anticorpo de detecção.

[0091] Com usado na presente invenção, o termo "indivíduo" se refere a um animal e, de preferência, um mamífero. De acordo com modalidades específicas, o indivíduo é um mamífero que inclui um não primata (por exemplo, um camelo, jumento, zebra, vaca, porco, cavalo, cabra, ovelha, gato, cachorro, rato, coelho, porquinho-da-índia, sagui ou camundongo) ou um primata (por exemplo, um macaco, chimpanzé ou ser humano). Em modalidades particulares, o indivíduo é um ser humano.

[0092] Como usado aqui uma "taupatia" abrange qualquer doença neurodegenerativa que envolve a agregação patológica da tau no cérebro. Além da DA familiar e esporádica, outras taupatias exemplificadoras são demência frontotemporal com parkinsonismo ligado ao cromossomo 17 (FTDP-17), paralisia supranuclear progressiva, degeneração corticobasal,

doença de Pick, gliose progressiva subcortical, demência apenas com emaranhados, emaranhados neurofibrilares difusos com calcificação, de- mência com grãos argirofílicos, complexo esclerose lateral amiotrófica- parkinsonismo-demência, síndrome de Down, doença de Gerstmann- Sträussler-Scheinker, doença de Hallervorden-Spatza, miosite por corpos de inclusão, doença de Creutzfelt-Jakob, atrofia de múltiplos sistemas, do- ença de Niemann-Pick tipo C, angiopatia amiloide cerebral causada pela proteína príon, panencefalite esclerosante subaguda, distrofia miotônica, doença do neurônio motor não Guamaniana com emaranhados neurofibri- lares, parkinsonismo pós-encefalítico, e encefalopatia traumática crônica, como demência pugilística (doença do boxe) (Morris et al., Neuron, 70:410-26, 2011).

[0093] Como aqui utilizado, os termos "determinar ", "medir", "avaliar" e "testar" são utilizados de maneira intercambiável e incluem tanto deter- minações quantitativas como qualitativas. Esses termos referem-se a qual- quer forma de medição e incluem determinar se uma característica, traço ou aspecto está presente ou não. A avaliação pode ser relativa ou abso- luta. "Avaliar a presença de" inclui determinar a quantidade de algo pre- sente, bem como determinar se está presente ou ausente.

[0094] Como aqui utilizado, o termo "diagnóstico" significa a detecção de uma doença ou distúrbio ou a determinação do estágio ou grau de uma doença ou distúrbio, como uma taupatia. Normalmente, um diagnóstico de uma doença ou distúrbio é com base na avaliação de um ou mais fatores e/ou sintomas que são indicativos da doença. Um diagnóstico pode ser feito com base na presença, ausência ou quantidade de um fator que é indicativo da presença ou ausência da doença ou condição, por exemplo, tau p217+. Cada fator ou sintoma que é considerado como indicativo para o diagnóstico de uma doença particular não precisa de ser exclusivamente relacionado com a doença em particular, isto é, pode haver diagnósticos diferenciais que podem ser deduzidos de um fator ou sintoma de diagnós- tico. De modo semelhante, pode haver casos onde um fator ou sintoma que é indicativo de uma doença específica está presente em um indivíduo que não tem a doença específica. O termo "diagnóstico" também abrange a determinação do efeito terapêutico de uma terapia medicamentosa, por exemplo, uma terapia de anticorpo antitau p217+, ou predição do padrão de resposta a uma terapia medicamentosa, por exemplo, uma terapia de anticorpo antitau p217+. Os métodos de diagnóstico podem ser utilizados independentemente, ou em combinação com outros métodos de diagnós- tico e/ou estadiamento conhecidos na técnica médica para uma determi- nada doença ou distúrbio, por exemplo, doença de Alzheimer.

[0095] Como aqui utilizado, os termos "aumento" e "diminuição" re- ferem-se a diferenças na quantidade de um biomarcador específico em uma amostra em comparação com um controle ou nível de referência. Por exemplo, a quantidade de peptídeo específico pode estar presente em uma quantidade elevada ou em uma quantidade reduzida nas amostras de pacientes com uma doença em comparação com um nível de referência. Em uma modalidade, um "aumento de um nível" ou "di- minuição de um nível" pode ser uma diferença entre o nível de biomar- cador presente em uma amostra em comparação com um controle de ao menos cerca de 1%, ao menos cerca de 2%, ao menos cerca de 3%, ao menos cerca de 5%, ao menos cerca de 10%, ao menos cerca de 15%, ao menos cerca de 20%, ao menos cerca de 25%, ao menos cerca de 30%, ao menos cerca de 35%, ao menos cerca de 40%, ao menos cerca de 50%, ao menos cerca de 60%, ao menos cerca de 75%, ao menos cerca de 80% ou mais. Em uma modalidade, um "au- mento de um nível" ou "diminuição de um nível" pode ser uma dife- rença estatisticamente significativa entre o nível do biomarcador pre- sente em uma amostra em comparação com um controle. Por exemplo, a diferença pode ser estatisticamente significativa se o teor medido do biomarcador recair fora de cerca de 1,0 desvio padrão, cerca de 1,5 desvios padrão, cerca de 2,0 desvios padrão ou cerca de 2,5 desvios padrão da média de qualquer grupo de controle ou de referência. A referência ou controle pode ser, por exemplo, uma amostra de um in- divíduo saudável, ou de uma amostra obtida de um mesmo indivíduo em um momento anterior, como um ponto de tempo antes da adminis- tração de um agente terapêutico ou um momento anterior durante um regime terapêutico.

[0096] Como usado na presente invenção, o termo "isolado" significa um componente biológico (como um ácido nucleico, peptídeo ou proteína) que foi substancialmente separado, produzido à parte de ou purificado de outros componentes biológicos do organismo no qual o componente ocorre naturalmente, ou seja, outro DNA cromossômico ou extracromos- sômico e RNA e proteínas. Ácidos nucleicos, peptídeos e proteínas que foram "isolados", dessa forma, incluem ácidos nucleicos e proteínas puri- ficados por métodos de purificação padrão. Ácidos nucleicos, peptídeos e proteínas "isolados" podem ser parte de uma composição e ainda ser iso- lados se a composição não for parte do ambiente nativo do ácido nucleico, peptídeo ou proteína. O termo também abrange ácidos nucleicos, peptí- deos e proteínas preparados por expressão recombinante em uma célula hospedeira assim como os ácidos nucleicos sintetizados quimicamente.

[0097] Um "anticorpo isolado que se liga a uma proteína tau" ou um "anticorpo antitau isolado", como utilizados aqui, referem-se a um anticorpo que especificamente se liga à proteína tau e que é substan- cialmente isento de outros anticorpos que têm diferentes especificida- des antigênicas (por exemplo, um anticorpo de detecção antitau iso- lado é substancialmente isento de anticorpos que especificamente se ligam a outros antígenos diferentes de tau). Um anticorpo de detecção antitau isolado pode, entretanto, ter reatividade cruzada com outros antígenos relacionados, por exemplo, de outras espécies (como homó- logos de espécies tau).

[0098] Como aqui utilizado, os termos "se liga especificamente" e "li- gação específica" referem-se à capacidade de um anticorpo antitau da invenção de se ligar a um alvo predeterminado com uma constante de dissociação (KD) de cerca de 1x10-6 M ou mais forte, por exemplo, de cerca de 1x10-7 M ou menos, cerca de 1x10-8 M ou menos, cerca de 1x10- 9 M ou menos, cerca de 1x10-10 M ou menos, cerca de 1x10-11 M ou me- nos, cerca de 1x10-12 M ou menos ou cerca de 1x10-13 M ou menos. O termo "KD" é obtido da razão entre Kd e Ka (isto é, Kd/Ka) e é expresso como uma concentração molar (M). Os valores de KD para os anticorpos podem ser determinados com o uso dos métodos na técnica em vista da presente divulgação. Por exemplo, o valor de KD de um anticorpo antitau pode ser determinado com o uso de ressonância de plásmons de super- fície, como com o uso de um sistema biossensor, por exemplo, um sis- tema Biacore®, um instrumento Proteon (BioRad), um instrumento Ki- nExA (Sapidyne), ELISA ou ensaios de ligação competitiva conhecidos pelos versados na técnica. Tipicamente, um anticorpo antitau se liga a um alvo predeterminado (ou seja, tau) com uma KD que é ao menos dez vezes menor que sua KD para um alvo não específico, conforme medido através da ressonância de plásmons de superfície com o uso de, por exemplo, um instrumento Proteon (BioRad). Os anticorpos antitau que se ligam especificamente à tau podem, entretanto, ter reatividade cruzada com outros alvos relacionados, por exemplo, com o mesmo alvo prede- terminado de outras espécies (homólogos), como de camundongo, rato, sagui, cachorro ou porco.

[0099] Como usado na presente invenção, o termo "polinucleotí- deo", chamado de "molécula de ácido nucleico", "nucleotídeos" ou "áci- dos nucleicos", se refere a qualquer polirribonucleotídeo ou polidesoxir- ribonucleotídeo, que pode ser RNA ou DNA não modificado ou RNA ou

DNA modificado. Os "polinucleotídeos" incluem, mas não se limitam, ao DNA de fita simples e dupla, DNA que é uma mistura de regiões de fita simples e dupla, RNA de fita simples e dupla e RNA que é a mistura de regiões de fita simples e dupla, moléculas híbridas que compreendem DNA e RNA que podem ser de fita simples ou, mais tipicamente, fita dupla, ou uma mistura de regiões de fita simples e fita dupla. Além disso, "polinucleotídeo" se refere a regiões de fita tripla que compreendem RNA ou DNA ou ambos RNA e DNA. O termo polinucleotídeo inclui DNAs ou RNAs contendo uma ou mais bases modificadas e DNAs ou RNAs com a cadeia principal modificada para estabilidade ou por outros motivos. Bases "modificadas" incluem, por exemplo, bases tritiadas e bases incomuns, como inosina. Uma variedade de modificações pode ser feita no DNA e no RNA; dessa forma, "polinucleotídeo" abrange for- mas quimicamente, enzimaticamente ou metabolicamente modificadas de polinucleotídeos como tipicamente encontradas na natureza, assim como as formas químicas de DNA e RNA características de vírus e cé- lulas. "Polinucleotídeo" também abrange cadeias relativamente curtas de ácido nucleico, com frequência, chamadas de oligonucleotídeos.

[0100] Como usado na presente invenção, um "vetor" é um repli- con, no qual outro segmento de ácido nucleico pode ser operacional- mente inserido de forma a ocasionar a replicação ou a expressão do segmento.

[0101] Como usado na presente invenção, o termo "célula hospe- deira" se refere a uma célula que compreende uma molécula de ácido nu- cleico da invenção. A "célula hospedeira" pode ser qualquer tipo de célula, por exemplo, uma célula primária, uma célula em cultura ou uma célula de uma linhagem celular. Em uma modalidade, uma "célula hospedeira" é uma célula transfectada com uma molécula de ácido nucleico da invenção. Em outra modalidade, uma "célula hospedeira" é uma progenia ou uma progenia potencial de tal célula transfectada. A progenia de uma célula pode ou não ser idêntica à célula original, por exemplo, devido a mutações ou influências ambientais que podem ocorrer nas gerações subsequentes ou integração da molécula de ácido nucleico no genoma da célula hospe- deira.

[0102] O termo "expressão", como utilizado aqui, se refere à bios- síntese de um produto gênico. Esses termos abrangem a transcrição de um gene no RNA. O termo também abrange a tradução do RNA em um ou mais polipeptídeos e abrange, ainda, todas as modificações pós- transcricionais e pós-traducionais de ocorrência natural. O anticorpo de detecção expresso ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à tau pode estar dentro do citoplasma de uma célula hospedeira, no meio extracelular, como no meio de crescimento de uma cultura ce- lular, ou ancorado à membrana celular. Anticorpos antitau

[0103] Em um aspecto geral, a invenção se refere a anticorpos de detecção isolados ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos que se ligam a proteína tau que foi imobilizada por um anticorpo de captura. Tais anticorpos antitau podem ter as propriedades de ligação de um epítopo fosforilado em tau ou ligação a um epítopo não fosfori- lado em tau. Os anticorpos antitau de detecção podem ser úteis como reagentes de pesquisa ou de diagnóstico para detectar tau em amos- tras biológicas.

[0104] De acordo com um aspecto específico, a invenção se refere a um anticorpo de detecção isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga a uma proteína tau em um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 119 a 126, de preferência, resíduos de ami- noácidos 116 a 127, da proteína tau.

[0105] De acordo com um aspecto particular, o anticorpo de detecção isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à prote- ína tau em um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 116 a 127 da proteína tau compreende (a) HCDR1, HCDR2 e HCDR3 da ca- deia pesada de imunoglobulina tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 2, 3 e 4, respectivamente; e (b) LCDR1, LCDR2 e LCDR3 da cadeia leve de imunoglobulina tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 5, 6 e 7, respectivamente.

[0106] De acordo com um aspecto específico, o anticorpo de detec- ção isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à proteína tau em um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 116 a 127 da proteína tau compreende uma região variável de cadeia pe- sada que tem uma sequência com ao menos 80% do polipeptídeo, de pre- ferência ao menos 85% ou 90%, com mais preferência ao menos 95%, e com a máxima preferência 100% idêntica à SEQ ID NO: 8, e uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeos ao menos 80%, de preferência, ao menos 85% ou 90%, com mais preferência, ao menos 95% e com a máxima preferência, 100% idêntica à SEQ ID NO: 9.

[0107] De preferência, o anticorpo de detecção isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à proteína tau em um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 116 a 127 de proteína tau é um anticorpo pT82.

[0108] De acordo com um aspecto específico, a invenção se refere a um anticorpo de detecção isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a uma proteína tau em um epítopo compreendendo os resíduos de aminoácido 7 a 20 da proteína tau.

[0109] De acordo com um aspecto particular, o anticorpo de detec- ção isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à proteína tau em um epítopo que compreende os resíduos de amino- ácidos 7 a 20 da proteína tau compreende (a) HCDR1, HCDR2 e HCDR3 da cadeia pesada de imunoglobulina tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 12, 13 e 14, respectivamente; e (b) LCDR1, LCDR2 e LCDR3 da cadeia leve de imunoglobulina tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 15, 16 e 17, respecti- vamente.

[0110] De acordo com um aspecto particular, o anticorpo de detecção isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à prote- ína tau em um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 7 a 20 da proteína tau compreende uma região variável da cadeia pesada que tem uma sequência com ao menos 80% do polipeptídeo, de preferência, ao menos 85% ou 90%, com mais preferência, ao menos 95% e, com a máxima preferência, 100% idêntica à SEQ ID NO: 18, e uma região variá- vel da cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeos ao menos 80%, de preferência, ao menos 85% ou 90%, com mais preferência, ao menos 95% e com a máxima preferência, 100% idêntica à SEQ ID NO: 19.

[0111] De preferência, o anticorpo de detecção isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à proteína tau em um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 7 a 20 de proteína tau é um anticorpo hT43.

[0112] Os anticorpos da presente invenção podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, por exemplo pelo método de hibridoma (Koh- ler e Milstein, Nature. 256:495-7, 1975). Os mAbs quiméricos contendo uma região variável de cadeia leve e cadeia pesada derivadas de um an- ticorpo doador (tipicamente murino) em associação com regiões constan- tes de cadeia leve e pesada derivadas de um anticorpo aceptor (tipica- mente uma outra espécie de mamífero como o ser humano) podem ser preparados por um método divulgado no documento US4816567. Os mAbs enxertados por CDR que têm CDRs derivadas de uma imunoglobu- lina doadora não humana (tipicamente murina) e as partes derivadas de imunoglobulina restantes da molécula sendo derivadas de uma ou mais imunoglobulinas humanas podem ser preparados por técnicas conhecidas pelos versados na técnica como a divulgada no documento US5225539. Os mAbs totalmente humanos desprovidos de quaisquer sequências não humanas podem ser preparados a partir de camundongos transgênicos de imunoglobulina humana por técnicas mencionadas em (Lonberg et al., Na- ture. 368:856-9, 1994; Fishwild et al., Nat Biotechnol. 14:845-51, 1996; Mendez et al., Nat Genet. 15:146-56, 1997). Os mAbs humanos podem também ser preparados e otimizados a partir de bibliotecas de exibição em fago (Knappik et al., J Mol Biol. 296:57-86, 2000; Krebs et al., J Immunol Methods. 254:67-84, 2001; Shi et al., J Mol Biol. 397:385-96, 2010).

[0113] A atividade funcional dos anticorpos de detecção e frag- mentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam à tau pode ser caracterizada por métodos conhecidos na técnica. Os métodos para caracterizar anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam à tau incluem, mas não se limitam a ensaios de afinidade e especificidade, incluindo análise Biacore, ELISA e FACS, análise imuno-histoquímica, etc.

[0114] Várias metodologias bem conhecidas podem ser emprega- das para determinar o epítopo de ligação dos anticorpos da invenção. Por exemplo, quando as estruturas de ambos os componentes individu- ais são conhecidas, a ancoragem de proteína de proteína silico pode ser executada para identificar sítios compatíveis de interação. A troca de hidrogênio deutério (H/D) pode ser executada com o antígeno e o complexo anticorpo para mapear regiões no antígeno que são ligadas pelo anticorpo. A mutagênese de segmento e ponto do antígeno pode ser utilizada para localizar os aminoácidos importantes para a ligação de anticorpo. A estrutura cocristalina do complexo de anticorpo-antí- geno é utilizada para identificar resíduos que contribuem para o epítopo e o parátopo.

[0115] Em um outro aspecto geral, a invenção se refere a um poli- nucleotídeo isolado que codifica um anticorpo de detecção ou frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção. Será entendido pelos versados na técnica que a sequência de codificação de uma pro- teína pode ser alterada (por exemplo, substituída, deletada, inserida, etc.) sem alterar a sequência de aminoácidos da proteína.

Consequen- temente, será entendido pelos versados na técnica que sequências de ácidos nucleicos que codificam anticorpos de detecção ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos da invenção podem ser alterados sem alterar as sequências de aminoácidos das proteínas.

Polinucleo- tídeos isolados exemplificadores são polinucleotídeos que codificam polipeptídeos que compreendem as CDRs de cadeia pesada de imu- noblogulina HCDR1, HCDR2 e HCDR3 mostradas nas SEQ ID NOs: 2, 3 e 4, respectivamente, ou polipeptídeos que compreendem as CDRs de cadeia leve de imunoglobulina LCDR1, LCDR2 e LCDR3 mostradas nas SEQ ID NOs: 5, 6 e 7, respectivamente.

Outros polinu- cleotídeos isolados exemplificadores são polinucleotídeos que codifi- cam polipeptídeos que compreendem as CDRs da cadeia pesada de imunoblogulina HCDR1, HCDR2 e HCDR3 mostradas nas SEQ ID NOs: 12, 13 e 14, respectivamente, ou polipeptídeos que compreende as CDRs da cadeia leve de imunoglobulina LCDR1, LCDR2 e LCDR3 mostradas nas SEQ ID NOs: 15, 16 e 17, respectivamente.

Outros po- linucleotídeos isolados exemplificadores são polinucleotídeos que co- dificam regiões variáveis de anticorpo da invenção.

Outros polinucleo- tídeos que, dada a degeneração do código genético ou preferências de códon em um dado sistema de expressão, codificam os anticorpos da invenção, também estão dentro do escopo da invenção.

Os ácidos nucleicos isolados da presente invenção podem ser feitos com o uso de técnicas recombinantes ou sintéticas bem conhecida.

O DNA que codifica a anticorpos monoclonais é prontamente isolado e sequenci- ado com o uso de métodos conhecidos na técnica.

Quando uma hibri- doma é produzida, tais células podem servir como uma fonte de tal DNA.

Alternativamente, técnicas de exibição em que a sequência de codificação e o produto de tradução são ligados, como bibliotecas de exibição de fago ou ribossomal, podem ser usadas.

[0116] Em um outro aspecto geral, a invenção se refere a um vetor que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica um anticorpo de detecção ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção. Qualquer vetor conhecido pelos versados na técnica, em vista da presente divulgação, pode ser usado, como um plasmídeo, cosmídeo, um vetor de fago ou um vetor viral. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de expressão recombinante como um plasmídeo. O vetor pode incluir qual- quer elemento para estabelecer uma função convencional de um vetor de expressão, por exemplo, um promotor, elemento de ligação ao ribossoma, terminador, intensificador, marcador de seleção e origem de replicação. O promotor pode ser um promotor constitutivo, induzível ou reprimível. Vários vetores de expressão capazes de liberar ácidos nucleicos a uma célula são conhecidos na técnica e podem ser usados na presente invenção para a produção de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo na célula. Técnicas de clonagem convencionais ou síntese de gene artificiais podem ser usadas para gerar um vetor de expressão re- combinante de acordo com as modalidades da invenção.

[0117] Em um outro aspecto geral, a invenção se refere a uma célula hospedeira que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica um anticorpo de detecção ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção. Qualquer célula hospedeira conhecida pelos versados na téc- nica em vista da presente divulgação pode ser utilizada para a expressão recombinante de anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos da invenção. Tais células hospedeiras podem ser células euca- rióticas, células bacterianas, células vegetais ou células de arquea. As cé- lulas eucarióticas exemplificadoras podem ser de origem de mamífero, de inseto, de aves ou de outra origem animal. As células eucarióticas de ma-

mífero incluem linhagens celulares imortalizadas, como linhagens celula- res de hibridoma ou mieloma, como linhagens celulares de murino SP2/0 (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, Va, EUA CRL- 1581), NS0 (European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, Wil- tshire, Reino Unido, ECACC n° 85110503), FO (ATCC CRL-1646) e Ag653 (ATCC CRL-1580). Uma linhagem celular de mieloma humana exemplifi- cadora é U266 (ATTC CRL-TIB-196). Outras linhagens celulares úteis in- cluem aquelas derivadas de células de ovário de hamster chinesa (CHO) como CHO-K1 SV (Lonza Biologics), CHO-K1 (ATCC CRL-61, Invitrogen) ou DG44.

[0118] Em um outro aspecto geral, a invenção se refere a um mé- todo de produção de um anticorpo de detecção ou fragmento de liga- ção ao antígeno do mesmo da invenção, que compreende cultivar uma célula que compreende um polinucleotídeo que codifica o anticorpo de detecção ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo sob condi- ções para produzir um anticorpo de detecção ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção, e recuperar o anticorpo ou o fra- gmento de ligação ao antígeno do mesmo da célula ou da cultura ce- lular (por exemplo, do sobrenadante). Os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos expressos podem ser colhidos das células e purificados de acordo com técnicas convencionais conheci- das na técnica. Métodos de diagnóstico

[0119] A invenção se refere à medição de espécies tau p217+ que são enriquecidas em DA, por exemplo, com o uso de um anticorpo de captura, como um pT3, que imobiliza seletivamente as espécies tau p217+, em combinação com um anticorpo de detecção antitau, que é marcado com um elemento repórter que possibilita a detecção das espécies tau p217+ capturadas. Os métodos da invenção podem ser utilizados para vários pro-

pósitos de diagnóstico, por exemplo, para diagnosticar DA ou outras tauo- patias em um indivíduo, monitorar a eficácia de um tratamento, identificar um indivíduo adequado para um tratamento anti-p217+, etc.

[0120] De acordo com uma modalidade da presente invenção, os peptídeos tau p217+ em uma amostra de interesse são capturados com um anticorpo de captura direcionado contra um epítopo de tau p217+, como um epítopo que tem a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 25, 26 ou 27. Os peptídeos tau p217+ capturados, embora todos contenham o epítopo de tau p217+, podem ter comprimento diferente, o que pode ser detectado por anticorpos de detecção que se ligam a epítopos diferentes. Por exemplo, um anticorpo de detecção direcio- nado contra um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 7 a 20 da proteína tau só pode detectar peptídeos tau p217+ capturados ou fragmentos dos mesmos que contêm adicionalmente resíduos de aminoácidos 7 a 20 da proteína tau ("peptídeos tau p217+ longos"), en- quanto um anticorpo de detecção direcionado contra um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 119 a 126 da proteína tau pode detectar não apenas os peptídeos tau p217+ longos, mas também os peptídeos tau p217+ curtos. Os peptídeos tau p217+ capturados po- dem ser colocados em contato com um anticorpo de detecção direcio- nado contra um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 7 a 20 ou 116 a 127 de proteína tau para, assim, detectar e medir a quan- tidade dos peptídeos tau p217+ longos ou dos peptídeos tau p217+ (peptídeos tau p217+ longos e curtos) na amostra. Uma quantidade de peptídeos tau p217+ curtos em uma amostra é calculada subtraindo a quantidade de peptídeos tau p217+ longos da quantidade de peptídeos tau p217+.

[0121] De acordo com outra modalidade da invenção, em adição à captura e à medição da quantidade de peptídeos tau p217+ em uma amostra, os peptídeos tau p217+ totais são capturados com um anti- corpo de captura independente de fosforilação, como um anticorpo di- recionado contra um epítopo entre os aminoácidos 150 e 250 da pro- teína tau, de preferência um epítopo que compreende os aminoácidos 159 a 163 da proteína tau. Os peptídeos tau totais capturados podem ser colocados em contato com um anticorpo de detecção direcionado contra um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 7 a 20 ou 116 a 127 de proteína tau para, assim, detectar e medir a quan- tidade dos peptídeos tau longos totais ou dos peptídeos tau totais (fra- gmentos de peptídeo tau longos e curtos) na amostra. Uma quantidade de peptídeos tau curtos total em uma amostra é calculada subtraindo a quantidade de peptídeos tau longos total da quantidade peptídeos tau total.

[0122] De acordo com as modalidades da invenção, um valor em relação aos peptídeos tau p217+ em uma amostra, como a quantidade de peptídeos tau p217+ e a quantidade de peptídeos tau p217+ longos, opcionalmente a quantidade peptídeos tau total e a quantidade de fra- gmentos tau longos, em uma amostra, bem como a informação com base nas quantidades medidas, como os peptídeos tau p217+ curtos calculados e peptídeos tau totais curtos, ou uma razão relacionada aos peptídeos tau p217+, como uma razão entre a quantidade de fragmen- tos de peptídeo tau curtos e a quantidade de fragmentos de peptídeo tau longos, uma razão entre a quantidade de peptídeos tau p217+ cur- tos e a quantidade de fragmentos tau curtos, uma razão entre a quan- tidade de peptídeos tau p217+ longos e a quantidade de fragmentos tau longos etc., podem ser utilizadas para um ou mais propósitos de diagnóstico.

[0123] O diagnóstico é realizado comparando-se um valor relacio- nado a peptídeos tau p217+ em uma amostra de um indivíduo com va- lores de linha de base correspondentes. Os valores da linha de base podem representar os níveis médios em uma população de indivíduos saudáveis. Os valores da linha de base podem também representar ní- veis anteriores determinados no mesmo indivíduo. Em uma modalidade, é determinado que um indivíduo está sofrendo de uma taupatia se um valor em relação a peptídeos tau p217+ na amostra biológica do indiví- duo, como a quantidade de peptídeos tau p217+ longos ou curtos, ou uma razão relacionada a peptídeos tau p217+, por exemplo, uma razão entre a quantidade de peptídeos tau p217+ curtos e a quantidade de peptídeos tau p217+ longos, é significativamente mais alta do que um valor de linha de base correspondente. Como aqui utilizado, "significati- vamente mais alto" se refere a um valor mais alto que seja estatistica- mente significativo, não devido ao acaso, e que tenha um valor p de 0,05 ou menos. "Significativamente mais alto" pode ser ao menos cerca de 1%, 2%, 5% ou 10% maior do que o encontrado em voluntários sau- dáveis, com um valor p menor que 0,05, 0,04, 0,03, 0,01, 0,005, 0,001, etc.

[0124] Em uma modalidade, um método da invenção compreende (i) colocar uma amostra biológica, de preferência uma amostra de LCR, em contato com um anticorpo de captura direcionado contra um epí- topo que compreende tau p217+ fosforilado para capturar peptídeos tau p217+ na amostra, (ii) colocar os peptídeos tau p217+ capturados em contato com anticorpo de detecção direcionado contra um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 7 a 20 para, assim, medir a quantidade de peptídeos tau p217+ longos e/ou com anticorpo de detecção direcionado contra um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 119 a 126 da proteína tau para, assim, medir a quan- tidade de peptídeos tau p217+ longos e curtos na amostra, e (iii) de- terminar se ou não o indivíduo sofre de uma taupatia ou está em risco de desenvolver uma taupatia com base na quantidade de peptídeos tau p217+ ou na razão entre a quantidade de peptídeos tau p217+ cur- tos e a quantidade de peptídeos tau p217+ longos. O diagnóstico pode ser realizado comparando a quantidade ou a concentração de peptí- deos tau p217+ em uma amostra do indivíduo com os valores de linha de base correspondentes. O diagnóstico pode também ser executado mediante a comparação da razão entre a quantidade de peptídeos tau p217+ curtos e a quantidade de p217+ peptídeos tau longos em uma amostra proveniente do indivíduo com os valores de linha de base cor- respondentes.

[0125] Em uma outra modalidade, um método da invenção compre- ende (i) colocar uma amostra biológica, de preferência uma amostra de LCR, em contato com um anticorpo de captura direcionado contra um epítopo de tau p217+ para capturar peptídeos tau p217+ na amostra, ou com um anticorpo de captura independente de fosforilação direcionado contra um epítopo de tau entre os aminoácidos 150 e 250 da proteína tau para capturar os peptídeos tau totais na amostra, (ii) colocar os pep- tídeos tau p217+ capturados, ou os peptídeos tau totais capturados, em contato com um anticorpo de detecção direcionado contra um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 116 a 127 da proteína tau para, assim, medir a quantidade de peptídeos tau p217+ longos e cur- tos, ou a quantidade de peptídeos tau curtos total, na amostra, e (iii) determinar se ou não o indivíduo sofre de uma taupatia ou está em risco de desenvolver uma taupatia com base na quantidade da razão entre a quantidade de peptídeos tau p217+ curtos e a quantidade de peptídeos tau curtos total na amostra biológica. O diagnóstico pode ser executado mediante a comparação da razão entre a quantidade de peptídeos tau p217+ curtos e a quantidade de peptídeos tau curtos total que compre- endem a mesma região de proteína tau que a reconhecida pelo anti- corpo pT3, isto é, aminoácidos 211 a 221 da tau, em uma amostra pro- veniente do indivíduo para os valores de linha de base correspondente.

[0126] Em uma outra modalidade, um método da invenção compre- ende (i) colocar uma amostra biológica, de preferência uma amostra de LCR, em contato com um anticorpo de captura direcionado contra um epítopo de tau p217+ para capturar peptídeos tau p217+ na amostra, (ii) colocar os peptídeos tau p217+ capturados com um anticorpo de detec- ção direcionado contra um epítopo que compreende os resíduos de ami- noácidos 7 a 20 para, assim, medir a quantidade de peptídeos tau p217+ longos, e/ou com um anticorpo de detecção direcionado contra um epí- topo que compreende os resíduos de aminoácidos 116 a 127 da prote- ína tau para, assim, medir a quantidade de peptídeos tau p217+ longos e curtos na amostra, e (iii) determinar a eficácia do tratamento no indi- víduo com base na quantidade de peptídeos tau p217+ ou na razão en- tre a quantidade de peptídeos tau p217+ curtos e a quantidade de pep- tídeos tau p217+ longos.

[0127] Em ainda outra modalidade, um método da invenção com- preende (i) colocar uma amostra biológica, de preferência uma amos- tra de LCR, em contato com um anticorpo de captura direcionado con- tra um epítopo de tau p217+ para capturar peptídeos tau p217+ na amostra, ou com um anticorpo de captura independente de fosforilação direcionado contra um epítopo de tau entre os aminoácidos 150 e 250 da proteína tau para capturar os peptídeos tau totais na amostra, (ii) colocar os peptídeos tau p217+ capturados, ou os peptídeos tau totais capturados, em contato com um anticorpo de detecção direcionado contra um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 116 a 127 da proteína tau para, assim, medir a quantidade de peptídeos tau p217+ longos e curtos, ou a quantidade de peptídeos tau curtos total, na amostra e (iii) determinar a eficácia do tratamento no indivíduo com base na quantidade da razão entre a quantidade de peptídeos tau p217+ curtos e na quantidade de peptídeos tau curtos total na amostra biológica.

[0128] Em ainda outra modalidade, a efetividade do tratamento no indivíduo é determinada pelo monitoramento da quantidade de peptídeos tau p217+, a razão entre a quantidade de peptídeos tau p217+ curtos e a quantidade de peptídeos tau p217+ longos, ou a razão entre a quanti- dade de peptídeos tau p217+ curtos e a quantidade de peptídeos tau curtos totais, antes, durante, ou após o tratamento. Uma diminuição nos valores em relação à linha de base sinaliza uma resposta positiva ao tra- tamento. Os valores podem também aumentar temporariamente em flui- dos biológicos conforme o tau patológico é eliminado do cérebro.

[0129] De acordo com um aspecto específico, a taupatia inclui, mas não se limita a uma ou mais selecionadas do grupo que consiste em doença de Alzheimer (incluindo doença de Alzhemer familiar e doença de Alzheimer esporádica), demência frontotemporal com parkinsonismo ligado ao cromossomo 17 (FTDP-17), paralisia supranuclear progres- siva, degeneração corticobasal, doença de Pick, gliose progressiva sub- cortical, demência apenas com emaranhados, emaranhados neurofibri- lares difusos com calcificação, demência com grãos argirofílicos, com- plexo esclerose lateral amiotrófica-parkinsonismo-demência, síndrome de Down, doença de Gerstmann-Sträussler-Scheinker, doença de Hal- lervorden-Spatza, miosite por corpos de inclusão, doença de Creutzfelt- Jakob, atrofia de múltiplos sistemas, doença de Niemann-Pick tipo C, angiopatia amiloide cerebral causada pela proteína príon, panencefalite esclerosante subaguda, distrofia miotônica, doença do neurônio motor não Guamaniana com emaranhados neurofibrilares, parkinsonismo pós-encefalítico, encefalopatia traumática crônica e demência pugilís- tica (doença do boxe).

[0130] De preferência, a tauopatia é a doença de Alzheimer (inclu- indo doença de Alzheimer familiar e doença de Alzheimer esporádica), FTDP-17 ou paralisia supranuclear progressiva.

[0131] Com a máxima preferência, a taupatia é a doença de Al- zheimer (incluindo doença de Alzheimer familiar e doença de Alzhei- mer esporádica).

[0132] De acordo com uma modalidade, um método da invenção compreende (i) colocar uma amostra biológica, de preferência uma amostra de LCR, em contato com um anticorpo de captura direcionado contra um epítopo de tau p217+ para capturar peptídeos tau p217+ na amostra, (ii) colocar os peptídeos tau p217+ capturados em contato com um anticorpo de detecção direcionado contra um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 7 a 20 para, assim, medir a quantidade de peptídeos tau p217+ longos, e/ou com um anticorpo de detecção direcionado contra um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 116 a 127 da proteína tau para, assim, medir a quan- tidade de peptídeos tau p217+ longos e curtos na amostra e (iii) deter- minar se ou não o indivíduo é adequado para um terapia de anticorpo antitau p217+ com base na quantidade de peptídeos tau p217+ ou na razão entre a quantidade de peptídeos tau p217+ curtos e quantidade de peptídeos tau p217+ longos.

[0133] De acordo com um aspecto particular, é determinado que um indivíduo é adequado para uma terapia de anticorpo antitau p217+ se a quantidade de peptídeos tau p217+ na amostra biológica, ou a razão entre a quantidade de peptídeos tau p217+ curtos e a quantidade de peptídeos tau p217+ longos na amostra biológica é significativamente mais alta do que um valor de linha de base correspondente.

[0134] De acordo com outro aspecto particular, um método da in- venção compreende (i) colocar uma amostra biológica, de preferência uma amostra de LCR, em contato com um anticorpo de captura direcio- nado contra um epítopo de tau p217+ para capturar peptídeos tau p217+ na amostra, ou com um anticorpo de captura independente de fosforila- ção direcionado contra um epítopo de tau entre os aminoácidos 150 e

250 da proteína tau para capturar os peptídeos tau totais na amostra, (ii) colocar os peptídeos tau p217+ capturados, ou os peptídeos tau to- tais capturados, com um anticorpo de detecção direcionado contra um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 116 a 127 da pro- teína tau para, assim, medir a quantidade de peptídeos tau p217+ lon- gos e curtos, ou a quantidade de peptídeos tau curtos total, na amostra, e (iii) determinar se ou não o indivíduo é adequado para uma terapia de anticorpo antitau p217+ com base na quantidade da razão entre a quan- tidade de peptídeos tau p217+ curtos e a quantidade de peptídeos tau curtos total na amostra biológica.

[0135] De acordo com uma modalidade, determina-se se um indiví- duo é adequado para uma terapia de anticorpo antitau p217+ se a razão entre a quantidade de peptídeos tau p217+ curtos e a quantidade de pep- tídeos tau curtos total for significativamente mais alta que um valor de linha de base correspondente.

[0136] A invenção também se refere à medição de tau p217+ que está no complexo com anticorpo em uma amostra biológica, bem como tau p217+ livre na amostra que não está ligada ao anticorpo. Em uma modalidade, o anticorpo total é capturado com o uso de técnicas de afinidade, seguido de condições de desnaturação incluindo caótrofos, inativação por calor ou outras técnicas de ruptura de proteínas. A tau p217+ é separada do anticorpo com o uso de rpHPLC, e é medida com o uso dos métodos da invenção, que permitem a quantificação de tau p217+ ligada ao anticorpo.

[0137] De acordo com um aspecto geral, a invenção se refere a um método para monitorar um tratamento com um anticorpo antitau p217+ em um indivíduo, o método compreendendo: (i) obter uma amostra biológica do indivíduo, (ii) separar a amostra biológica em uma amostra enriquecida de IgG contendo tau p217+ ligada ao anticorpo e um amostra empobrecida de IgG contendo tau p217+ isenta de anticorpo, (iii) purificar a tau p217+ longe das IgGs por rpHPLC para obter uma amostra de tau p217+ isenta de anticorpo, (iv) colocar cada amostra enriquecida de IgG e a amostra de tau p217+ isenta de anticorpo em contato com um anticorpo de captura direcionado contra um epítopo de tau p217+ para capturar peptídeos tau p217+ em cada uma das amostras, (v) colocar os peptídeos tau p217+ capturados em cada uma das amostras em contato com um anticorpo di- recionado contra um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 7 a 20 para, assim, medir a quantidade de peptídeos tau p217+ longos, ou com um anticorpo de detecção direcionado contra um epítopo que com- preende os resíduos de aminoácidos 116 a 127 da proteína tau para, as- sim, medir a quantidade de peptídeos tau p217+ longos e curtos em cada uma das amostras, (vi) calcular a razão entre a quantidade de tau p217+ ligada ao anticorpo e a quantidade de tau p217+ isenta de anticorpo e (vii) monitorar o tratamento com anticorpo antitau p217+ no indivíduo com base na razão calculada.

[0138] De acordo com um outro aspecto geral, a invenção se refere a um método para monitorar um tratamento com um anticorpo antitau p217+ em um indivíduo, em que o método compreende: (i) obter uma amostra biológica do indivíduo, (ii) obter uma amostra semidesnaturada da amostra biológica contendo tau p217+ total e obter uma amostra não desnaturada da amostra biológica contendo tau p217+ livre de anticorpo, em que a amostra semidesnaturada é aquecida para desnaturar os anti- corpos na amostra, (iii) colocar cada uma da amostra desnaturada e da amostra não desnaturada em contato com um anticorpo de captura dire- cionado contra um epítopo de tau p217+ para capturar peptídeos tau p217+ em cada uma das amostras, (iv) colocar os peptídeos tau p217+ capturados em cada uma das amostras em contato com um anticorpo direcionado contra um epítopo que compreende os resíduos de aminoá- cidos 7 a 20 para, assim, medir a quantidade de peptídeos tau p217+ longos, ou com um anticorpo de detecção direcionado contra um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 116 a 127 da proteína tau para, assim, medir a quantidade de peptídeos tau p217+ longos e curtos em cada uma das amostras, (v) calcular a quantidade de tau p217+ ligada ao anticorpo na amostra subtraindo a quantidade do tau p217+ isenta de anticorpo da quantidade de tau p217+ total, (vi) calcular a razão entre o tau p217+ ligado e o tau p217+ livre de anticorpo e (vii) monitorar o trata- mento com anticorpo antitau p217+ no indivíduo com base na razão cal- culada.

[0139] De acordo com um aspecto particular, a eficácia do trata- mento no indivíduo é determinada pelo monitoramento da quantidade de peptídeos tau p217+ ligados ao anticorpo e livres de anticorpo an- tes, durante ou após o tratamento. Uma diminuição nos valores de tau p217+ livre de anticorpo com relação à linha de base, ou um aumento nos valores de tau p217+ ligada ao anticorpo com relação à linha de base e, portanto, um aumento na razão entre tau p217+ ligada ao an- ticorpo e tau p217+ livre de anticorpo relativamente ao valor da linha de base, sinaliza uma resposta positiva ao tratamento. Os valores de tau p217+ isento de anticorpo podem também aumentar temporaria- mente em fluidos biológicos conforme o tau patológico é eliminado do cérebro.

[0140] De acordo com aspectos específicos, o anticorpo de captura dos métodos da invenção é conjugado a uma microesfera, como uma microesfera magnética. De acordo com outros aspectos específicos, o anticorpo de detecção é biotinilado.

[0141] De acordo com aspectos específicos, a quantidade de pep- tídeos tau p217+ medidos nos métodos da invenção pode ser determi- nada com o uso de quaisquer técnicas adequadas conhecidas na téc- nica, incluindo ELISA e plataforma de matriz de molécula única. De acordo com aspectos específicos, os métodos da invenção utilizam uma plataforma de matriz de alta sensibilidade, como Quanterix Simoa ou MSD S-plex, para medir a quantidade de peptídeos tau p217+ em uma amostra. De acordo com um aspecto específico, o limite inferior de quantificação dos métodos da invenção é de cerca de 40 fg/ml e o limite inferior de detecção do método é de cerca de 2 fg/ml.

[0142] De acordo com um aspecto particular, as amostras utilizadas nos métodos da invenção são uma amostra biológica, como uma amostra de sangue, homogenato cerebral ou líquido cefalorraquidiano (LCR). De preferência, a amostra é uma amostra de LCR. De acordo com um aspecto específico, a amostra é uma amostra de LCR bruto. De acordo com um outro aspecto específico, a amostra é obtida após o fracionamento de uma amostra biológica, como LCR, com o uso de cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa (rpHPLC), que separa a proteína tau de com- primento total e fragmentos tau diferencialmente dimensionados.

[0143] De acordo com um aspecto particular, o anticorpo de cap- tura dos métodos da invenção compreende a HCDR1, HCDR2 e HCDR3 da cadeia pesada de imunoglobulina tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 32, 33 e 34, respectivamente, e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 da cadeia leve de imunoglobulina tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 35, 36 e 37, respecti- vamente. De preferência, o anticorpo de captura é um anticorpo pT3 compreendendo a região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 28 e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 29.

[0144] De acordo com um aspecto específico, o anticorpo de de- tecção dos métodos da invenção compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 da cadeia pesada de imunoglobulina tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 2, 3 e 4, respectivamente; e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 da cadeia leve de imunoglobulina tendo as sequên- cias de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 5, 6 e 7, respectivamente. De preferência, o anticorpo de detecção é um anticorpo pT82 que compre- ende uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de po- lipeptídeos da SEQ ID NO: 8 e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 9.

[0145] De acordo com outro aspecto específico, o anticorpo de de- tecção dos métodos da invenção compreende a HCDR1, HCDR2 e HCDR3 da cadeia pesada de imunoglobulina tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 12, 13 e 14, respectivamente; e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 da cadeia leve de imunoglobulina tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 15, 16 e 17, respecti- vamente. De preferência, o anticorpo de detecção é um anticorpo hT43 que compreende uma região variável da cadeia pesada tendo a se- quência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 18 e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 19. Kits

[0146] Em um outro aspecto geral, a invenção se refere a um kit que compreende (a) um anticorpo de captura direcionado contra um epítopo de tau p217+, opcionalmente um anticorpo de captura independente de fosforilação direcionado contra um epítopo de tau entre os aminoácidos 150 e 250 da proteína tau, e (b) ao menos um anticorpo de detecção direcionado contra um epítopo da proteína tau que compreende amino- ácidos 7 a 20 ou 116 a 127 da proteína tau. O kit é utilizado para medir a quantidade de peptídeos tau p217+, que é utilizada a razão entre a quantidade de peptídeos tau p217+ curtos e a quantidade de peptídeos tau p217+ longos, e/ou a razão entre a quantidade de peptídeos tau p217+ curtos e a quantidade de peptídeos tau curtos total em uma amostra.

[0147] O anticorpo de detecção pode conter qualquer marcador detectável (por exemplo, molécula fluorescente, biotina etc.) que seja detectável diretamente ou por meio de uma reação secundária detec- tável (por exemplo, reação com estreptavidina). Alternativamente, um segundo reagente contendo o marcador detectável pode ser utilizado, em que o segundo reagente tem especificidade de ligação para o anti- corpo primário. Em um kit diagnóstico adequado para medir tau p217+ em uma amostra biológica, os anticorpos do kit podem ser fornecidos pré-ligados a uma fase sólida, como aos poços de uma placa de mi- crotitulador ou às microesferas.

[0148] De acordo com um aspecto específico, o anticorpo de cap- tura de um kit da invenção compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 da cadeia pesada de imunoglobulina tendo as sequências de polipeptí- deos das SEQ ID NOs: 32, 33 e 34, respectivamente, e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 da cadeia leve de imunoglobulina tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 35, 36 e 37, respectivamente. De pre- ferência, o anticorpo de captura é um anticorpo pT3 compreendendo a região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de po- lipeptídeos da SEQ ID NO: 28 e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 29.

[0149] De acordo com um aspecto particular, o anticorpo de detec- ção de um kit da invenção compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 da cadeia pesada de imunoglobulina tendo as sequências de polipeptí- deos das SEQ ID NOs: 2, 3 e 4, respectivamente; e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 da cadeia leve de imunoglobulina tendo as sequências de po- lipeptídeos das SEQ ID NOs: 5, 6 e 7, respectivamente. De preferên- cia, o anticorpo de detecção é um anticorpo pT82 que compreende uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptí- deos da SEQ ID NO: 8 e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 9.

[0150] De acordo com outro aspecto particular, o anticorpo de de- tecção de um kit da invenção compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 da cadeia pesada de imunoglobulina tendo as sequências de polipep- tídeos das SEQ ID NOs: 12, 13 e 14, respectivamente; e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 da cadeia leve de imunoglobulina tendo as sequên- cias de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 15, 16 e 17, respectivamente. De preferência, o anticorpo de detecção é um anticorpo hT43 que com- preende uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 18 e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 19.

[0151] De acordo com um outro aspecto específico, um kit da in- venção é utilizado para medir a quantidade de peptídeos tau p217+, a razão entre a quantidade de peptídeos tau p217+ curtos e/ou a razão entre a quantidade de peptídeos tau p217+ curtos e a quantidade de peptídeos tau p217+ curtos em uma amostra com o uso de um método da invenção.

[0152] O conteúdo de todas as referências citadas (incluindo refe- rências da literatura, patentes concedidas, pedidos de patente publica- dos, e todos os pedidos de patentes copendentes) ao longo deste pe- dido estão aqui expressamente incorporadas a título de referência. Modalidades

[0153] A divulgação também fornece as seguintes modalidades não limitadoras.

[0154] A modalidade 1 é um método de medição da quantidade de peptídeos tau p217+ em uma amostra, que compreende: (i) colocar a amostra em contato com um anticorpo de cap- tura direcionado contra um epítopo de tau p217+ para capturar peptí- deos tau p217+ na amostra, e (ii) colocar os peptídeos tau p217+ capturados em contato com o anticorpo de detecção direcionado contra um epítopo compreen- dendo os resíduos de aminoácidos 119 a 126, como os resíduos de aminoácidos 116 a 127 da proteína tau, ou um epítopo contendo resí- duos de aminoácidos 7 a 20 da proteína tau para, assim, medir uma quantidade de peptídeos tau p217+ ou uma quantidade de peptídeos tau p217+ longos, respectivamente.

[0155] A modalidade 2 é um método de determinação de uma quan- tidade relativa de peptídeos tau p217+ longos ou fragmentos de peptí- deos tau p217 curtos em uma amostra, compreende (i) colocar a amostra em contato com um anticorpo de cap- tura direcionado contra um epítopo de tau p217+ para capturar os pep- tídeos tau p217+ na amostra, (ii) colocar os peptídeos tau p217+ capturados em contato com um primeiro anticorpo de detecção direcionado contra um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 119 a 126 da proteína tau para, assim, medir uma quantidade de peptídeos tau p217+, (iii) colocar os peptídeos tau p217+ capturados em contato com um segundo anticorpo de detecção direcionado contra um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 7 a 20 da proteína tau para, assim, medir uma quantidade de peptídeos tau p217+ longos, e (iv) determinar uma quantidade relativa de peptídeos tau p217+ longos ou peptídeos tau p217+ curtos com base na quantidade de peptídeos tau p217+ e na quantidade de peptídeos tau p217+ lon- gos.

[0156] A modalidade 3 é um método de acordo com a modalidade 1 a 2, em que o anticorpo de captura é conjugado com uma microes- fera, em que o anticorpo de detecção é biotinilado.

[0157] A modalidade 4 é o método de qualquer uma das modalida- des 1 a 3, em que a quantidade de peptídeos tau p217+ na amostra é medida com o uso de uma plataforma de alta sensibilidade.

[0158] A modalidade 5 é um método de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 4, em que o limite inferior de quantificação do mé- todo é de cerca de 40 fg/ml dos peptídeos tau p217+ e o limite inferior de detecção do método é cerca de 2 fg/ml dos peptídeos tau p217+.

[0159] A modalidade 6 é o método de qualquer uma das modalida- des de 1 a 5, em que a amostra é uma amostra biológica, de preferên- cia uma amostra do LCR, de um indivíduo, e o método compreende adicionalmente determinar se ou não o indivíduo sofre de uma taupatia ou está em risco de desenvolver uma taupatia com base na quantidade de peptídeos tau p217+, na razão entre a quantidade de peptídeos tau p217+ curtos e a quantidade de peptídeos tau p217+ longos ou na ra- zão entre a quantidade de peptídeos tau p217+ curtos e a quantidade de peptídeos tau curtos total na amostra biológica.

[0160] A modalidade 7 é o método da modalidade 6, em que o indi- víduo está determinado a sofrer de uma taupatia ou a estar em risco de desenvolver uma taupatia se a quantidade de peptídeos tau p217+ na amostra biológica, a razão entre a quantidade de peptídeos tau p217+ curtos e a quantidade de peptídeos tau p217+ longos ou a razão entre a quantidade de peptídeos tau p217+ curtos e a quantidade de peptí- deos tau curtos total for significativamente mais alta do que valores de referência correspondentes, como a média do valor correspondente de voluntários saudáveis.

[0161] Modalidade 8 é o método de qualquer uma das modalidades de 1 a 5, em que a amostra é uma amostra biológica, de preferência uma amostra de LCR, de um indivíduo sob um tratamento de uma taupatia, e o método compreende ainda determinar a eficácia do trata- mento no indivíduo com base na quantidade de peptídeos tau p217+, na razão entre a quantidade de peptídeos tau p217+ curtos e a quan- tidade de peptídeos tau p217+ longos ou na razão entre a quantidade de peptídeos tau p217+ curtos e a quantidade de peptídeos tau curtos total na amostra biológica.

[0162] A modalidade 9 é o método da modalidade 8, em que o tra- tamento é determinado como sendo eficaz se a quantidade de peptí- deos tau p217+ na amostra biológica diminui ao longo do curso do tra- tamento.

[0163] A modalidade 10 é um método de qualquer uma das modali- dades 6 a 9, em que a taupatia é selecionada do grupo que consiste em doença de Alzheimer (incluindo doença de Alzheimer familiar e doença de Alzheimer esporádica), demência frontotemporal com parkinsonismo ligado ao cromossomo 17 (FTDP-17), paralisia supranuclear progres- siva, degeneração corticobasal, doença de Pick, gliose progressiva sub- cortical, demência apenas com emaranhados, emaranhados neurofibri- lares difusos com calcificação, demência com grãos argirofílicos, com- plexo esclerose lateral amiotrófica-parkinsonismo-demência, síndrome de Down, doença de Gerstmann-Sträussler-Scheinker, doença de Hal- lervorden-Spatza, miosite por corpos de inclusão, doença de Creutzfelt- Jakob, atrofia de múltiplos sistemas, doença de Niemann-Pick tipo C, angiopatia amiloide cerebral causada pela proteína príon, panencefalite esclerosante subaguda, distrofia miotônica, doença do neurônio motor não Guamaniana com emaranhados neurofibrilares, parkinsonismo pós-encefalítico, encefalopatia traumática crônica e demência pugilís- tica (doença do boxe).

[0164] A modalidade 11 é o método da modalidade 10, em que a tauopatia é doença de Alzheimer.

[0165] A modalidade 12 é o método de qualquer uma das modali- dades de 1 a 5, em que a amostra é uma amostra biológica, de prefe- rência uma amostra do LCR, de um indivíduo humano, e o método compreende adicionalmente determinar se o indivíduo é ou não ade- quado para uma terapia de anticorpo antitau p217+ com base na quan- tidade de peptídeos tau p217+, na razão entre a quantidade de peptí- deos tau p217+ curtos e a quantidade de peptídeos tau p217+ longos ou na razão entre a quantidade de peptídeos tau p217+ curtos e a quantidade de peptídeos tau curtos total na amostra biológica.

[0166] A modalidade 13 é o método da modalidade 12, em que o indivíduo é determinado como sendo adequado para terapia de anti- corpo antitau p217+ se a quantidade dos peptídeos tau p217+ na amostra biológica, a razão entre a quantidade de peptídeos tau p217+ curtos e a quantidade de peptídeos tau p217+ longos ou a razão entre a quantidade de peptídeos tau p217+ curtos e a quantidade de peptí- deos tau curtos total é significativamente mais alta do que valores de referência correspondentes, como a média do valor correspondente de voluntários saudáveis.

[0167] A modalidade 14 é um método de monitoramento de um tra- tamento com um anticorpo antitau p217+ em um indivíduo, o método compreendendo: i. obter uma amostra biológica proveniente do indivíduo, ii. separar a amostra biológica em uma amostra enriquecida com IgG contendo tau p217+ ligado a anticorpo, e uma amostra esgo- tada de IgG contendo tau p217+ livre de anticorpo, iii. colocar cada uma da amostra enriquecida de IgG e da amostra empobrecida de IgG em contato com um anticorpo de captura direcionado contra um epítopo que compreende T212 fosforilado e/ou T217 fosforilado da proteína tau para capturar os peptídeos tau p217+ em cada uma das amostras, iv. colocar os peptídeos tau p217+ capturados em contato com um anticorpo de detecção direcionado contra um epítopo que com- preende os resíduos de aminoácidos 7 a 20 ou 116 a 127 da proteína tau para, assim, medir a quantidade de tau p217+ ligado ao anticorpo e a quantidade de tau p217+ livre de anticorpo na amostra biológica, v. calcular a razão entre tau p217+ ligada ao anticorpo e tau p217+ livre de anticorpo, e vi. monitorar o tratamento com anticorpo antitau p217+ no indivíduo com base na razão calculada.

[0168] A modalidade 15 é um método de monitoramento de um tra- tamento com um anticorpo antitau p217+ em um indivíduo, o método compreendendo: i. obter uma amostra biológica proveniente do indivíduo, ii. obter uma amostra semidesnaturada da amostra bioló- gica contendo tau p217+ total, e obter uma amostra não desnaturada da amostra biológica contendo tau p217+ livre de anticorpo, em que a amostra semidesnaturada é aquecida para desnaturar os anticorpos na amostra, iii. colocar cada um da amostra semidesnaturada e da amostra não desnaturada em contato com um anticorpo de captura di- recionado contra um epítopo que compreende T212 fosforilada e/ou T217 fosforilada da proteína tau para capturar peptídeos tau p217+ em cada uma das amostras, iv. colocar os peptídeos tau p217+ capturados em contato com um anticorpo de detecção direcionado contra um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 7 a 20 ou 116 a 127 de pro- teína tau para, assim, medir a quantidade de tau p217+ total e a quan- tidade de tau p217+ livre de anticorpo na amostra biológica, v. calcular a quantidade do anticorpo tau p217+ ligado ao anti- corpo na amostra subtraindo a quantidade do tau p217+ livre de anticorpo a partir da quantidade do total de tau p217+, vi. calcular a razão entre o anticorpo tau p217+ ligado ao anticorpo e o tau p217+ livre de anticorpo, e vii. monitorar o tratamento com anticorpo antitau p217+ no indivíduo com base na razão calculada.

[0169] A modalidade 16 é um método de qualquer uma das moda- lidades 1 a 15, em que o anticorpo de captura compreende HCDR1,

HCDR2 e HCDR3 da cadeia pesada de imunoglobulina tendo as se- quências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 32, 33 e 34, respectiva- mente, e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 da cadeia leve de imunoglobulina tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 35, 36 e 37, respectivamente; de preferência, o anticorpo de captura tem uma re- gião variável da cadeia pesada que compreende a sequência de poli- peptídeos da SEQ ID No: 28 e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 29.

[0170] A modalidade 17 é um método de qualquer uma das moda- lidades 1 a 16, em que o anticorpo de detecção compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 da cadeia pesada de imunoglobulina tendo as se- quências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 2, 3 e 4, respectivamente; e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 da cadeia leve de imunoglobulina tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 5, 6 e 7, respectiva- mente; de preferência, o anticorpo de detecção compreende uma re- gião variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 8 e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 9.

[0171] A modalidade 18 é um método de qualquer uma das modali- dades 1 a 16, em que o anticorpo de detecção compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 da cadeia pesada de imunoglobulina tendo as se- quências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 12, 13 e 14, respectiva- mente; e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 da cadeia leve de imunoglobulina tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 15, 16 e 17, respectivamente; de preferência, o anticorpo de detecção compreende uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptí- deos da SEQ ID NO: 18 e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 19.

[0172] A modalidade 19 é o método de qualquer uma das modali- dades 1 a 18, em que a amostra é uma amostra de sangue, homogenato cerebral ou líquido cefalorraquidiano (LCR).

[0173] A modalidade 20 é o método de qualquer uma das modali- dades 1 a 19, em que a amostra é obtida após fracionar uma amostra biológica com o uso de cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa (rpHPLC).

[0174] A modalidade 21 é um anticorpo de detecção isolado ou frag- mento de ligação a antígeno do mesmo que se liga a uma proteína tau em um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 116 a 127 de proteína tau, que compreende: a. HCDR1, HCDR2 e HCDR3 da cadeia pesada de imunoglo- bulina tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 2, 3 e 4, respectivamente; e b. LCDR1, LCDR2 e LCDR3 da cadeia leve de imunoglobu- lina tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 5, 6 e 7, respectivamente.

[0175] A modalidade 22 é o anticorpo de detecção isolado ou fra- gmento de ligação a antígeno da modalidade 21, em que compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de poli- peptídeos da SEQ ID NO: 8 e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 9, de preferência.

[0176] A modalidade 23 é um anticorpo de detecção isolado ou frag- mento de ligação a antígeno do mesmo que se liga a uma proteína tau em um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos 7 a 20 de prote- ína tau, que compreende: a. HCDR1, HCDR2 e HCDR3 da cadeia pesada de imunoglo- bulina tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 12, 13 e 14, respectivamente; e b. LCDR1, LCDR2 e LCDR3 da cadeia leve de imunoglobu- lina tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 15, 16 e 17, respectivamente.

[0177] A modalidade 24 é o anticorpo de detecção isolado ou fra- gmento de ligação a antígeno da modalidade 23, em que compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de poli- peptídeos da SEQ ID NO: 18 e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 19, de preferência.

[0178] A modalidade 25 é um ácido nucleico isolado que codifica o anticorpo de detecção ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de qualquer uma das modalidades 21 a 24.

[0179] A modalidade 26 é um vetor que compreende o ácido nu- cleico isolado da modalidade 25.

[0180] A modalidade 27 é uma célula hospedeira que compreende o ácido nucleico da modalidade 25.

[0181] A modalidade 28 é um método para produzir o anticorpo de detecção ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de qualquer uma das reivindicações 21 a 24, compreendendo cultivar uma célula que compreende um ácido nucleico que codifica o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno sob condições para produzir o anticorpo ou o frag- mento de ligação ao antígeno, e recuperar o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno da célula ou cultura celular.

[0182] A modalidade 29 é um kit que compreende: a. um anticorpo de captura direcionado contra um epítopo de proteína tau isolada ou multifosforilada que compreende T212 fos- forilado e/ou T217 fosforilado da proteína tau, e b. um anticorpo de detecção direcionado contra um epítopo da proteína tau que compreende os resíduos de aminoácidos 7 a 20 ou 116 a 127 da proteína tau; em que o kit é utilizado para medir a quantidade de peptídeos tau p217+ em uma amostra.

[0183] A modalidade 30 é um kit da modalidade 29, em que o an- ticorpo de captura compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 da cadeia pesada de imunoglobulina tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 32, 33 e 34, respectivamente, e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 da cadeia leve de imunoglobulina tendo as sequências de po- lipeptídeos das SEQ ID NOs: 35, 36 e 37, respectivamente; de prefe- rência, o anticorpo de captura tem uma região variável da cadeia pe- sada que compreende a sequência de polipeptídeos da SEQ ID No: 28 e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptí- deos da SEQ ID NO: 29.

[0184] A modalidade 31 é o kit da modalidade 29 ou 30, em que o anticorpo de detecção é o anticorpo de detecção isolado de qualquer uma das modalidades 20 a 23. Exemplos

[0185] Os exemplos a seguir da invenção são fornecidos para ilustrar adicionalmente a natureza da invenção. Deve-se compreender que os exemplos a seguir não limitam a invenção e que o escopo da invenção é determinado pelas reivindicações em anexo. Exemplo 1. Ensaio de alta sensibilidade para detecção de tau p217+

[0186] Os reagentes específicos para o ensaio foram os seguintes: Kit Simoa Homebrew (Quanterix, cat. n° 101351), Helper Beads (Quan- terix, cat. n.° 101732), anticorpo monoclonal de camundongo pT3 (mAb), mAb hT43, mAb pT82 e mAb hT7. pT3 é o anticorpo parental desenvolvido na Janssen que reconhece tau p217+, e a versão huma- nizada do mesmo é mencionada neste documento como mAb pT3 hu- manizado.

[0187] As amostras foram diluídas em 50 mM de Tris, 50 mM de NaCl, 5 mM de EDTA, albumina sérica bovina 2%, Tween 20 0,1%, Pro- Clin 300 0,05%, pH 7,8.

[0188] Três peptídeos personalizados feitos pela New England Peptide foram utilizados para calibrar o ensaio (peptídeos calibrantes).

[0189] O peptídeo pT3xhT43 contém epítopos hT43, PT51 e pT3 conectados por ligantes de PEG4 e tem um peso molecular de 6893 g/mol. A sequência de aminoácidos de um peptídeo pT3xhT43 é PRQEFEVMEDHAGTYGLGDR(dPEG4)GKTKIATPRGAAP- PGQKG(dPEG4)GSRSR(pT)PSLP(pT)PPTREPKKV-amida (SEQ ID NO: 22).

[0190] O peptídeo pT3xpT82 contém epítopos pT82 e pT3 conecta- dos por um ligante de PEG4 e tem um peso molecular de 4551 g/mol. A sequência de aminoácidos do peptídeo pT3xpT82 é Ac-SLEDEAAGHVT- QARMVSK(dPEG4)GSRSR(pT)PSLP(pT)PPTREPKKV-amida (SEQ ID NO: 23).

[0191] O peptídeo hT7xpT82 contém epítopos pT82 e hT7 conec- tados por um ligante de PEG4 e tem um peso molecular de 3619 g/mol. A sequência de aminoácidos do peptídeo hT7xpT82 é Ac-SLEDEAA- GHVTQARMVSK(dPEG4)PRGAAPPGQKGQANA-amida (SEQ ID NO: 24). Preparação de reagentes

[0192] As microesferas de captura foram revestidas com 0,3 mg/ml de Ab de captura seguindo o protocolo fornecido no manual Quanterix. As microesferas de captura revestidas foram diluídas em tampão de diluente de microesferas para 200.000 microesferas/ml, e 200.000 mi- croesferas/ml de Helper Beads foram adicionadas de modo que a con- centração total de microesferas foi de 400.000 microesferas/ml.

[0193] Os anticorpos de detecção foram biotinilados a 60x se- guindo o protocolo fornecido no manual Quanterix e foram diluídos em Homebrew Detector/Diluente de Amostra para 1,8 ug/ml.

[0194] Os peptídeos calibrantes foram reconstituídos a 5 mg/ml em 0,1% de ácido fosfórico/água, separados em alíquotas de 20 ul e con- gelados. Quando prontas para usar, as alíquotas de peptídeo calibrante foram descongeladas e diluídas 1:1000 (por exemplo, 1,5 ul em 1498,5 ul), e as diluições foram diluídas 1:1000 de modo que a concentração final dos peptídeos fosse de 5000 pg/ml. Uma curva padrão com 3x sal- tos foi feita, começando a 30 pg/ml.

[0195] Amostras de LCR foram diluídas ao menos 1:4 em Diluente de Amostra. As amostras de voluntários saudáveis (VS) foram diluídas 1:5 ou 1:10, e as amostras de DA foram diluídas ao menos 1:20. Ensaio Simoa

[0196] Um ensaio Simoa personalizado foi criado compreendendo um protocolo de duas etapas, que compreende 35 minutos com Ab de captura, amostra e Ab de detecção, e lavagem, seguido de 5 minutos com estreptavidina - β-galactosidase (SBG). Cada reação compreendeu 25 ul de solução de microesferas, 100 ul de amostra ou calibrante, 20 ul de solução de detecção, 100 ul de SBG. Os anticorpos foram atribuídos com nomes, e até cinco anticorpos de captura e cinco anticorpos de detecção poderiam ser carregados de uma vez. As reações foram rea- lizadas nas cubetas de Simoa pelo instrumento, lavadas uma última vez e carregadas em discos de medição com substrato de β-galactosidase (RGP) antes das medições serem feitas pelo instrumento. Exemplo 2. Separação de fragmentos de tau nativos em rpHPLC

[0197] Os reagentes foram os seguintes: Ácido trifluoracético (grau HPLC), água (grau HPLC), acetonitrila (grau HPLC), ácido fosfórico (grau analítico), HPLC e sistema de gradiente binário, tampão de imu- noensaio (100 mM de TrisHCl, 100 mM de NaCl, 0,05% de Tween & BSA, pH 7,8).

[0198] O protocolo foi da seguinte forma: 500 ul de LCR congelado foram descongelados em gelo por 30 minutos. O LCR descongelado foi adicionado a 1,5 ml de 100 mM de fosfato de sódio em pH 2,5 contendo 100 mM de cloreto de sódio e misturados. 1,8 ml da mistura resultante foi aplicada sobre uma coluna C18 ou coluna de cromatografia de fase reversa similar equilibrada com 0,1% de ácido trifluoroacético em água. A coluna de HPLC foi então desenvolvida em um gradiente crescente de acetonitrila. As frações foram coletadas através da eluição. As fra- ções foram ajustadas para 10 mM de guanidina HCl e então submetidas à secagem em um concentrador a vácuo. As frações secas foram res- suspensas em tampão de imunoensaio e submetidas à medição do pep- tídeo tau na fração com base em um par de anticorpos antitau de cap- tura e de detecção da invenção. Exemplo 3. Quantificação de tau p217+ livre ou ligado por anticorpos

[0199] Com manipulação da amostra à montante adicional, os en- saios com base em pT3 de alta sensibilidade podem ser utilizados para medir a ligação de tau p217+ por anticorpos que foram produzidos den- tro de um paciente ou são administrados exogenamente, por exemplo, mAb pT3 humanizado. Essa técnica pode ser utilizada como um ensaio farmacodinâmico para estudar os anticorpos antitau p217+ terapêuti- cos como Ab pT3 humanizados. Por exemplo, os métodos a seguir po- dem ser utilizados para medir tau p217+ que é livre de anticorpos vs. que está ligado ao anticorpo. Ensaio 1: quantificação de tau p217+ livre vs. ligado em fluidos biológi- cos usando imunocaptura/depleção seguido de rpHPLC

[0200] Fluido biológico (por exemplo, LCR) foi incubado com micro- esferas magnéticas revestidas com proteína A/G (15 µl de pasta fluida de microesferas por 0,5 mL de LCR) por 2 horas com agitação à temperatura ambiente para capturar as imunoglobulinas na amostra. As microesferas foram precipitadas por magneto e o sobrenadante foi transferido para o segundo tubo (amostra = "sobrenadante esgotado de IgG"). As microes- feras foram lavadas 4x com 1 ml de solução salina tamponada com fos- fato (PBS). 0,5 ml de GuHCl 6 M foram então adicionados aos tubos con- tendo (a) microesferas lavadas e (b) sobrenadante esgotado de IgG, e os tubos foram incubados durante 20 minutos com agitação à temperatura ambiente. As microesferas foram então precipitadas por magneto, e o sobrenadante resultante foi transferido para um terceiro tubo (amostra =

"sobrenadante de IgG"). Por último, 0,1 M de ácido fosfórico (pH 2) foi adicionado às duas soluções (1,0 mL de ácido fosfórico foi adicionado ao sobrenadante esgotado de IgG desnaturado e 1,5 mL de ácido fosfórico foram adicionados ao sobrenadante de IgG, para produzir as amostras até um volume final de 2,0 mL) antes da separação por rpHPLC, execu- tada conforme no Exemplo 2. As frações de rpHPLC resultantes foram reconstituídas conforme descrito no Exemplo 2 e medidas com o uso dos ensaios de tau p217+ de Simoa do Exemplo 1. O sinal do sobrenadante esgotado de IgG representa tau p217+ livre (isto é, a que não está ligada por anticorpos), enquanto o sinal do sobrenadante concentrado de IgG representa tau p217+ ligada (isto é, a que está ligada por anticorpos, como mAb pT3 humanizado). Separação por rpHPLC e medição de p217+ de Simoa do mesmo fluido biológico parental (por exemplo, LCR) que não foi submetido ao processo de depleção/imunocaptura foram ana- lisadas simultaneamente para avaliação do sinal de tau p217+ total, con- forme um controle ou como um normalizador para as medições de livre e ligada. Ensaio 2: quantificação do tau p217+ livre vs. ligado em fluidos bioló- gicos com o uso de desnaturação por calor de anticorpos

[0201] Uma alíquota de fluido biológico de interesse (por exemplo, LCR) foi aquecida a 95°C por 4 minutos, seguido de resfriamento em gelo úmido durante 4 minutos (amostra = "fluido semidesnaturado"). Em para- lelo, uma segunda alíquota do mesmo fluido foi resfriada em gelo úmido durante 8 minutos (Amostra="fluido não desnaturado"). Ambas as amos- tras foram então medidas mediante o uso dos ensaios de tau p217+ Si- moa do Exemplo 1. O sinal de fluido semidesnaturado representa tau p217+ total, enquanto o fluido não desnaturado representa tau p217+ li- vre. Subtraindo o segundo do primeiro resulta na medição de tau ligado. O tempo de aquecimento preciso e a temperatura foram determinados para irreversivelmente modificar quaisquer anticorpos nos fluidos, de modo que eles não poderiam continuar a interferir nos ensaios de tau p217+ de Simoa, enquanto o próprio sinal de tau p217+ foi poupado de qualquer impacto. Este ensaio não é uma medida direta de se os anticor- pos estão ligados a tau p217+, ao invés disso, demonstra que os anticor- pos concorrentes do ensaio estão presentes. Entretanto, o ensaio produ- ziu resultados similares aos do Ensaio 1 mais trabalhoso. Exemplo 4. Amostras biológicas Amostras utilizadas para desenvolvimento de ensaios e qualificação técnica

[0202] Os ensaios dos Exemplos 1 a 3 foram desenvolvidos com o uso de LCR agrupado de indivíduos humanos com níveis elevados de tau. Alguns experimentos também foram realizados com LCR agrupado de indivíduos humanos com baixos níveis de tau para assegurar a sen- sibilidade do ensaio, que seria necessária para o teste de voluntários saudáveis em testes de Fase 1. O LCR de macaco cinomolgo (Macaca fascicularis) e sangui comum (Callirix jacchus), obtidos junto à Neu En- ripharm GmbH (CRO de teste em animais), também foram medidos com o uso dos ensaios dos Exemplos 1 a 3. Adicionalmente, amostras de cérebro rapidamente congeladas de indivíduos humanos cognitiva- mente normais e de sagui comum foram homogeneizadas e medidas com o uso dos ensaios dos Exemplos 1 e 3. Alguns experimentos foram realizados com soros individuais de indivíduos VS e DA clinicamente definidos. Amostras utilizadas para qualificação clínica preliminar

[0203] Coorte 1 ("coorte de correlação interensaio"): Amostras de LCR de fluido ventricular (FV) e fluido lombar (FL) LCR foram obtidas de indivíduos com hidrocefalia de pressão normal (HPN) (n=11) (Uni- versidade de Kuopio, professor Ville Lenoinen). Essas amostras foram separadas por medições de LCR Aβ42, tau total (tTau) e pTau181,

conforme determinado por ensaios Innotest realizados na Universi- dade de Sahlgrenska (professor Kaj Blennow), e por medições de imuno-histoquímica (IHC) de tau e amiloide da biópsia do cérebro. As medições de tau p217+ por rpHPLC e Simoa foram realizadas na Jans- sen Neuroscience Biomarkers, La Jolla.

[0204] Coorte 2 ("coorte de VS claro versus DA clara"): As amostras de LCR FL de indivíduos com Doença de Alzheimer (DA) bioquimica- mente definida vs. voluntários saudáveis (VS) (n=20 por grupo) foram obtidas junto à Universidade de Sahlgrenska (professor Kaj Blennow). Medições de LCR Aβ42, tTau e pTau181 por ensaios Innotest foram realizadas na Universidade de Sahlgrenska. As amostras foram seleci- onadas a partir de um grande painel de amostras com base na segre- gação em medições predeterminadas de corte DA versus VS (DA = LCR Aβ42 < 400 pg/ml E LCR tTau > 600 pg/ml, VS = LCR Aβ42 > 400 pg/ml E LCR tTau < 600 pg/ml). As medições de tau p217+ por rpHPLC e Simoa foram realizadas na Janssen Neuroscience Biomarkers, La Jolla.

[0205] Coorte 3 ("coorte de VS versus ARAD versus DA estágio inicial"): As amostras de LCR FL de indivíduos clinicamente definidos normais (Classificação Clínica de Demência 0; CDR 0) vs. queixa su- ave de memória (CDR 0,5) (n=20 por grupo) foram obtidas junto ao estudo da Janssen ALZ1005/1002. Medições de LCR Aβ42, tTau e pTau181 por ensaios Innotest foram realizadas na Universidade de Sahlgrenska. Com base nas pontuações para CDR e LCR Aβ42, os indivíduos foram classificados em (a) VS = CDR 0 e Aβ42 > 600 pg/ml, (b) em risco de DA (ARAD) = CDR 0 e Aβ42 > 600 pg/ml, (c) demência potencialmente não DA = CDR 0,5 e Aβ42 > 600 pg/ml e (d) DA estágio inicial = CDR 0,5 e Aβ42 > 600 pg/ml. As medições de tau p217+ por rpHPLC e Simoa foram realizadas na Janssen Neuroscience Biomar- kers, La Jolla.

[0206] Coorte 4 ("coorte CDR 0 vs CDR1"): As amostras de LCR FL de indivíduos clinicamente definidos normais (Classificação Clínica de De- mência 0; CDR 0) vs. queixa leve de memória (CDR 1) (n=5 por grupo) foram obtidas na Universidade de Washington. CDR e MMSE, bem como medições de LCR Aβ42, tTau e pTau181 por ensaios Innotest foram obti- das na Universidade de Washington. Antes da expedição, as amostras fo- ram codificadas de modo que a Janssen estava cega quanto à identidade ou caracterização das amostras. As medições de tTau e p217+ por rpHPLC e Simoa foram realizadas na Janssen Neuroscience Biomarkers, La Jolla e enviadas para a Universidade de Washington para análise.

[0207] Coorte 5 ("coorte VS versus MCI versus DA"): Amostras de LCR FL de VS clínica e bioquimicamente definidas (Innotest AB42 > 600 pg/ml) (n=7) foram obtidas da Precision Medicine, San Diego. As amostras de LCR FL clínica e bioquimicamente definidas (Innotest AB42 < 600 pg/ml) MCI (n=28) e DA (n=12) foram obtidas junto à Universidade de An- tuérpia. As medições de tau p217+ por rpHPLC e Simoa foram realizadas na Janssen Neuroscience Biomarkers, La Jolla.

[0208] Coorte 6 (" coorte de severidade e progressão da doença"): As amostras de LCR FL de indivíduos de DA clinicamente definidos (Ava- liação Clínica de Demência 1+) (n=235) foram obtidas junto ao estudo da Janssen ELN115727301/302. Essas amostras eram amostras basais (pré-dose) de todos os indivíduos no teste. Além disso, as amostras de LCR de 78 semanas de acompanhamento dos indivíduos com placebo (n=90) foram incluídas para avaliar os biomarcadores de progressão da doença. Avaliação cognitiva (ADAS-COG, MMSE, NTB, CDR.SOB), ge- nótipo ApoE, gênero e idade foram obtidos a partir do ensaio. Os ensaios Innotest AB42, Innotest AB40, Simoa NFL, pT3xpT82, pT3xhT43 e hT7xpT82 foram realizados na Janssen Neuroscience Biomarkers, La Jo- lla. Os indivíduos foram confirmados como positivos ou negativos para amiloide com base no corte da razão AB42/40 de 0,09 (por exemplo, in- divíduos com razão < 0,09 = amiloide positivos = DA, enquanto aqueles >

0,09 = amiloide negativos = demência de causa não DA. 27 dos 235 in- divíduos foram determinados ser amiloide negativos, ambos os grupos foram analisados separadamente. Amostras utilizadas para avaliação do engate alvo após o tratamento com agentes anti-p217+

[0209] LCR FL de indivíduos VS (n=40) tratados com placebo ou JNJ63733657 (injeção IV única) foram obtidos a partir do teste Janssen JNJ63733657EDI1001. Ensaios de pT3xpT82 foram realizados na Janssen Neuroscience Biomarkers, La Jolla. Ensaios de pT3xhT43 fo- ram realizados na Quanterix Corporation, Lexington MA. Exemplo 5. Triagem de pares de anticorpo de captura e detecção usando a plataforma Simoa

[0210] Relatórios anteriores da Janssen Neuroscience Discovery e da literatura (por exemplo, Meredith et al. PLoS One. 8(10):e76523, 2013; Barthelemy et al., J Alzheimers Dis. 51(4):1033-43, 2016; Russell et al., J Alzheimers Dis. 55(1):303-313, 2017; Hanger et al. J Biol Chem. 282(32): 23645-54, 2007) indicaram que os fragmentos de tau contendo os ami- noácidos 200 a 220, e especialmente alguma combinação de fosforilação nos aminoácidos 212, 214, 217, estão enriquecidos em DA. Desenvolver um ensaio para medir essa espécie particular de tau ("tau p217+") pode- ria assim produzir um biomarcador aprimorado para diagnóstico e/ou es- tadiamento de DA, bem como um ensaio potencial preditivo e/ou farma- codinâmico para direcionamento de novos fármacos a essa porção de tau. Entretanto, tau pode estar presente em baixos níveis (< 200 pg/ml) em voluntários saudáveis, e tau p217+ é um componente minoritário do tau total, então ensaios de tau p217+ exigem pares de anticorpos ideais e alta sensibilidade.

[0211] Para atingir esse objetivo, um conjunto de mAbs antitau des- cobertos na Janssen, bem como alguns mAbs antitau comerciais de alta afinidade, foram avaliados quanto à sua capacidade de produzir sinal em um formato ELISA (sELISA) sanduíche quando emparelhados com pT3. Os pares de anticorpos foram triados na plataforma Simoa HD-1 Analyzer (Quanterix Corporation) para fornecer a sensibilidade necessária, com o uso de uma diluição serial de um grupo de LCR de indivíduos DA. Ensaio de desempenho foi com base no sinal/ruído = média de enzimas por mi- croesfera (AEB) da amostra diluída no diluente de amostra/AEB do dilu- ente de ensaio sozinho. Anticorpos de detecção ideais para emparelhar com pT3 foram hT43, pT82, o reagente detector Quanterix tau 2.0 e BT2 nessa ordem de sensibilidade (Tabela 1). hT43 e o reagente detector Quanterix tau 2.0 reconhecem a região N-terminal de tau, enquanto pT82 e BT2 reconhecem as sequências mais próximas à região intermediária de tau. Os mAbs N-terminais (hT43) e de região intermediária (pT82) fo- ram selecionados para otimização adicional. A triagem foi realizada pa- ralelamente em Janssen Neuroscience Biomarkers e na Quanterix Cor- poration, produzindo resultados similares. Tabela 1. Triagem de especificidade no LCR de DA de anticorpos de detecção de tau emparelhados com pT3. S/N @ dilui- S/N @ di- S/N @ di- S/N @ dilui- S/N @ dilui- S/N @ dilui- Anticorpo de Detecção Epítopo (tau aa) ção 1:2 luição 1:4 luição 1:8 ção 1:16 ção 1:32 ção 1:64 hT43 7-20 955 587 313 183 102 55 Detector de ensaio 525 262 Quanterix tau 2.0 16-24 147 75 35 19 pT82 116-127 733 400 211 105 48 23 PT51 151-158 165 52 17 6 3 1 PT98 159-163 NT NT 17 7 3 2 pT89 166-182 87 24 9 4 2 1 BT2 193-198 732 245 78 28 10 4 HT52 393-398 NT NT 1 1 1 1 HT60 423-440 NT NT 1 1 1 1 Epítopo do anticorpo nas razões de sinal/ruído (S/N) de tau na medição de LCR agrupado de indivíduos de DA é mostrado; NT = não testado. Exemplo 6. Otimização de ensaios de pT3xhT43 e pT3xpT82

[0212] Uma série de experimentos de otimização foram realizados com base na experiência geral Quanterix com a otimização dos ensaios na plataforma Simoa. 10% de soro de camundongo ou 500 µg/ml de IgG de camundongo foram adicionados aos diluentes detectores, mas não houve melhora na sensibilidade do ensaio. Titulações da concentração do mAb detector (0,15, 0,3, 0,6, 1,2 e 1,8 µg/ml), concentração de SGβ (100, 200 ou 300 pM) e concentrações de microesferas de mAb de cap- tura (300K/poço, 150K+200K microesferas auxiliares) foram avaliadas. Os tempos de incubação do protocolo (65 minutos versus 35 minutos) e o volume da amostra (100 versus 150 µl) também foram avaliados. As concentrações de reagente ideais para ambos os ensaios foram 150K de microesferas de captura + 200K de microesferas auxiliares, 1,8 µg/ml de detector e 200 pM de SBG, respectivamente. O volume da amostra e o tempo de incubação tiveram impacto mínimo no ensaio, de modo que condições mais baixas de 100 ul de amostra e 35 minutos de incu- bação foram escolhidas. Exemplo 7. Qualificação técnica dos ensaios de pT3xhT43 E pT3xpT82 Faixa linear com material calibrante

[0213] Os peptídeos calibrantes descritos no Exemplo 1 foram pro- duzidos. Os peptídeos calibrantes continham os epítopos principais de pT3 e hT43, ou pT3 e pT82 separados por ligantes de PEG4, e eles foram utilizados para gerar as curvas padrão. Uma curva padrão repre- sentativa é mostrada na Figura 1. Os peptídeos calibrantes foram titu- lados de 30 pg/ml a 0,041 pg/ml em saltos de 1:3 em tampão de ensaio e medidos com os ensaios de pT3xhT43 e pT3xpT82. Um método de redução de dados de ajuste de curva de 4 parâmetros (4PL, 1/y2 pon- derado) foi utilizado para gerar a curva de calibração. O limite inferior de detecção (LLOD) foi definido como o calibrante calculado produ- zindo um nível AEB igual à média do calibrador zero + 2,5 desvios pa- drão (SD), incluindo 10% de coeficiente de variação (CV). Com esses critérios, os dados representativos produziram um LLOD de ~0,002 pg/ml. A faixa linear do ensaio, o limite inferior de quantificação (LLOQ) e o limite superior de quantificação (ULOQ) foram definidos como os menores e os maiores pontos da curva padrão alcançando CV < 20% e 80-120% de recuperação esperada. Com estes critérios, a faixa li- near para ambos os ensaios de pT3xhT43 e pT3xpT82 foi de 0,041 para 30 pg/ml (Figura 1, Tabela 2). Tabela 2. Curva de calibrante representativa para o ensaio otimizado de pT3xhT43, com cálculos de LLOD pg/ml de calibrante AEB Média DP CV (%) S/B 0 0,0185 0,0019 10 0,034 0,1369 0,0260 19 7 0,103 0,1952 0,0039 2 11 0,309 0,5221 0,0626 12 28 0,926 1,4545 0,0145 1 78 2,78 5,4789 0,1096 2 295 8,33 11,4588 1,0313 9 617 25 24,0576 0,2406 1 1297 LLOD=0,0185 + (2,5 x 0,0019)= 0,0231 AEB, que calcula a uma concentração teórica de 0,002 pg/ml Linearidade da diluição com LCR

[0214] Para avaliar a linearidade da diluição e determinar a diluição ideal para as amostras de LCR de teste, um painel de 4 amostras de LCR de indivíduos de DA (tau alto, AB42 baixo) foi titulado a partir de diluição de 1:2 a 1:4096 em tampão de ensaio e medido nos ensaios de p217+. As amostras diluídas além de 1:512 tipicamente mediram abaixo de LLOQ. As medições de amostra de 1:4 a 1:512 foram lineares em diluição, de modo que foi a faixa definida para medir as amostras de LCR. Para confirmação em indivíduos cognitivamente normais, um agrupamento de LCR de indivíduos com tau baixo e AB42 alto foi me- dido de modo similar. A linearidade de diluição foi novamente observada para diluição de 1:4 a 1:256, e além desta faixa as medições caíram abaixo de LLOQ (Figura 2). Precisão

[0215] Para avaliar a precisão das medições, a curva padrão para pT3xhT43 foi preparada e medida em 3 dias separados (Figura 3 e Tabela 3). O peptídeo calibrante foi diluído de 30 para 0,041 pg/ml em saltos seriais de 1:3 e medido em duplicata no ensaio de pT3xhT43. O procedimento foi repetido ao longo de 3 dias sucessivos no mesmo local e pelo mesmo técnico. A análise dos 4 pontos no meio da curva (onde as amostras de LCR são medidas) indicou que a precisão dentro de uma operação (CV % intrateste) foi sempre < 10% e calculada a partir de 2,46-5,18% CV, e a precisão entre os testes teve uma média de 6,46% CV. Estes estão bem próximos dos limites aceitos de 20% CV para um ensaio somente para uso para pesquisa (RUO) e são, em parte, atribuídos à natureza automatizada de todas as etapas de ELISA no Simoa HD-1 Analyzer. Tabela 3. Precisão intra e inter-teste do ensaio de pT3xhT43 Soma das ope- Operação1 Operação2 Operação3 rações fg/ml de cali- AEB Média DP CV% AEB Média DP CV% AEB Média DP CV% AEB Média DP CV% brante 49 0,0228 0,0005 2,03 0,0248 0,0024 9,64 0,0319 0,0005 1,41 0,0265 0,0048 18,04 195 0,0762 0,0019 2,55 0,0777 0,0011 1,39 0,0785 0,0028 3,52 0,0775 0,0012 1,54 781 0,2130 0,0084 3,95 0,2161 0,0200 9,26 0,0210 0,0129 6,14 0,2130 0,0030 1,43 3125 0,8012 0,0105 1,31 0,8193 0,0036 0,44 0,7460 0,0289 3,88 0,7888 0,0382 4,84 Média 2,46 5,18 3,74 6,46 Transferibilidade entre laboratórios

[0216] Para avaliar a precisão dos ensaios de tau p217+ entre os sítios de teste, o mesmo agrupamento de LCR de DA foi medido, na titulação, usando o mesmo lote de reagentes na Janssen Neuroscience Biomarkers e na Quanterix Corporation. A Figura 4 mostra que as me- dições são muito similares para os ensaios de pT3xhT43 e pT3xpT82 nos dois sítios de teste. Exatidão

[0217] Para avaliar a precisão dos ensaios, dois diferentes agrupa- mentos de LCR VS foram reforçados com concentrações conhecidas dos peptídeos calibrantes (0, 2, ou 20 pg/ml), diluídos para a diluição 1:4 reco- mendada, e então medidos nos ensaios de pT3xhT43 e pT3xpT82. Esta é uma medida da interferência potencial apresentada pelos componentes da matriz de amostra. Níveis de sinal endógeno foram subtraídos das medi- ções com reforços de 2 e 20 pg/ml, e então a concentração observada do material calibrante foi comparada com a concentração esperada para cal- cular a porcentagem de recuperação. As concentrações medidas foram comparadas às esperadas para calcular as concentrações de reforço, pro- duzindo recuperação média de 114% (Tabela 4). Isto está bem dentro dos limites aceitos de 80 a 120% de recuperação para um ensaio de RUO, indicando que não houve nenhuma interferência significativa no LCR quando testado em diluição ≥1:4. Tabela 4. Recuperação de reforço do ensaio pT3xhT43 Amostras de Reforço de cali- pg/ml calcu- pg/ml Média Diluição corri- % de recu-

AEB LCR brante (pg/ml) lado CV% pg/ml gida pg/ml peração 1,4863 0,945 0 3 0,924 3,69 NA 1,4209 0,902 2,2451 1,44 1 2 2 1,42 5,69 100 2,1776 1,40 8,9800 6,33 20 2 6,40 25,6 110 9,1679 6,48 1,9960 1,28 0 6 1,23 4,91 NA 1,8397 1,18 2,8076 1,82 2 2 2 1,85 7,39 124 2,8886 1,88 10,1636 7,28 20 1 7,34 29,4 122 10,3026 7,40 RECUPERAÇÃO MÉDIA 114% Concorrência de sinal por anticorpos direcionados contra p217+ no

LCR

[0218] Para confirmar a exatidão dos sinais de ensaio de pT3xhT43 e pT3xpT82 no LCR, e para avaliar a sua potencial utilidade como um ensaio farmacodinâmico em estudos clínicos de anticorpos direcionados contra tau p217+, um agrupamento de LCR de DA foi re- forçado com titulações de mAb pT3 humanizado ou mAb pT3 humani- zado e medido nos ensaios de pT3xhT43 e pT3xpT82 após 2 horas de incubação à temperatura ambiente (Figura 5). Administração dos anti- corpos pT3 solúveis e pT3 humanizados reduziu o sinal nos ensaios com base em pT3 em um modo dependente de dose. O reforço de msIgG (controle negativo) em concentrações comparáveis não teve impacto sobre qualquer das medidas. A capacidade de concorrência inferior do mAb pT3 humanizado vs. pT3 pode ser atribuída à maior afinidade de pT3 por tau p217+. Dependência de fosforilação

[0219] Para confirmar o sinal em LCR obtido com os ensaios de pT3xhT43 e pT3xpT82 era, de fato, baseado em um epítopo fosforilado, o LCR de DA foi tratado com fosfatase alcalina para desfosforilar todos os resíduos. As amostras foram então analisadas nos ensaios de pT3 e em dois ensaios à base de hT7, hT7xpT82 ou hT7xBT2. Sabe-se que hT7 não depende da fosforilação, por isso foi utilizado como um controle negativo.

[0220] LCR agrupado proveniente de pacientes de DA foi tratado com quantidades crescentes de fosfatase alcalina (AP) a 37 °C por 4 horas em um tampão contendo zinco e cloreto de magnésio. O efeito sobre o epítopo direcionado contra pT3 foi medido com o uso dos en- saios de pT3xhT43 e pT3xpT82. O sinal de pT3xhT43 e pT3xpT82 foi reduzido pelo tratamento por fosfatase alcalina em um modo depen- dente de dose. Entretanto, os ensaios não dependentes de fosforila- ção, hT7xpT82 ou hT7xBT2, não mostraram uma diminuição do sinal. Eles realmente mostraram um aumento, como esperado visto que a ligação de pT7 é reduzida pela fosforilação (Figura 6). Perfil de fragmento de tau p217+

[0221] Para explorar a natureza do sinal de tau p217+ derivado da medição de LCR bruto, uma amostra de LCR foi fracionada por rpHPLC através de um método similar àquele descrito em Meredith et al. PLoS One. 8(10):e76523, 2013. As frações foram coletadas e medidas com o uso dos ensaios de pT3xhT43 e pT3xpT82 (Figura 7). Neste formato de cromatografia, frações menores de tau eluíram rapidamente (número de frações menores), enquanto que frações grandes eluíram posteriormente (número de frações maiores). O tau de comprimento total elui na fração

19. O perfil do fragmento tau indicou que havia muito pouco tau de com- primento total detectado por qualquer um dos ensaios, de acordo com relatórios anteriores (Meredith et al. PLoS One. 8(10):e76523, 2013, Barthelemy et al., J Alzheimers Dis. 51(4):1033-43, 2016). O ensaio de pT3xpT82 detectou dois grandes picos (espécie de tau) que foram me- nores que o tau de comprimento total (frações 12 e 14), enquanto o en- saio de pT3xhT43 detectou apenas um desses picos grandes (fração 14). Isto indicou que tau p217+ em LCR existe em ao menos dois fragmentos, um fragmento maior que codifica ao menos a região de hT43 a pT3 (aa 7-220 da tau) e um fragmento menor que codifica ao menos a região de pT82 a pT3 (aa 116-220 da tau) mas não alcançando todo o caminho até o epítopo hT43. Ou seja, há provavelmente um sítio de clivagem proteo- lítica entre o aa 20 e o aa 116 que é clivado apenas em um subconjunto de moléculas tau em um determinado momento. O perfil não é específico para p217+, visto que as medições com outros ensaios de tau que reco- nhecem uma região similar da tau mas não é específica para fosforilação rendem achados semelhantes (dados não mostrados). Estabilidade do analito

[0222] A estabilidade do epítopo de tau p217+ endógeno foi avali- ada em várias temperaturas. O agrupamento de LCR de DA foi aliquo- tado e cada alíquota submetida a armazenamento a 4°C, 22°C ou 37°C por 1, 2 ou 4 horas. Além disso, um subconjunto de alíquotas foi des- congelado (-80°C a 22°C) 2 ou 3 vezes. Todas as amostras foram en- tão diluídas 1:20 e analisadas com o uso de ensaios de pT3xhT43 e hT7xpT82 (Figura 8). Nenhuma alteração significativa no sinal foi ob- servada em qualquer uma das condições testadas, indicando que to- dos os 4 epítopos reconhecidos por esses ensaios são suficientemente estáveis para permitir procedimentos padrão de armazenamento/teste. Por último, LCR foi prospectivamente coletado de 4 doadores, depois aliquotado e congelado a 70°C, as amostras foram retiradas a cada 3 meses para a medição com ensaio de pT3xpT82. Não foi observada alteração significativa no sinal nos pontos de tempo de 3, 6 ou 9 meses

(Figura 9). Exemplo 8. Quantificação clínica de ensaios de pT3xhT43 e pT3xpT82

[0223] Para avaliar a utilidade dos ensaios de pT3xhT43 e pT3xpT82 em diagnóstico e posicionamento de DA, três coortes de amostras de LCR foram obtidas para medição de tau p217+. As medi- ções foram analisadas por correlação com as pontuações de cognição e com outros biomarcadores de DA clássicos. Coorte 1: "Coorte de correlação interensaio"

[0224] As amostras de LCR, FV e FL, e biópsia do cérebro (ventrí- culo) foram obtidas de 10 indivíduos com o distúrbio neurodegenerativo hidrocefalia de pressão normal (HPN), uma condição caracterizada pela produção em excesso de fluido intersticial no cérebro e por apresentar uma alta incidência de DA. As medições de tau p217+ foram realizadas em LCR bruto e analisadas para correlação com os tradicionais biomar- cadores de DA.

[0225] Os níveis de Aβ42 (Figuras 10A, 10D), tTau (Figuras 10B, 10E), pTau181 (Figuras 10C, 10F) em FV foram determinados por ELISA de Innotest (medição clássica). As mesmas amostras foram me- didas com ensaios de pT3xhT43 (Figuras 10A, 10B, 10C) e pT3xpT82 (Figuras 10D, 10E, 10F), e as correlações foram avaliadas. Ambos os ensaios de pT3xhT43 e pT3xpT82 divulgaram uma correlação negativa com Aβ42 em LCR (r2=0,609, p=0,0077 e r2=0,590, p=0,0095, respec- tivamente), e uma correlação positiva com tTau em LCR (r 2=0,525, p=0,0177 e r2=0,435, p=0,0381, respectivamente), mas eles não cor- relacionaram significativamente com o pTau181 em LCR (Figura 10).

[0226] A biópsia do cérebro dos mesmos 10 indivíduos de HPN foi analisada por IHC e classificada pelo patologista como amiloide posi- tivo/negativo e tau positivo/negativo. Quando positiva para ambas, a amostra foi designada "biópsia +" e foi um diagnóstico clássico para DA. Quando negativa para ambas, a amostra foi designada "biópsia -" e foi um diagnóstico clássica para não DA. As amostras designadas "biópsia + (Amil)" foram positivas para amiloide mas negativas para tau. LCR obtido de derivação ventricular (FV=pontos pretos) ou derivação lombar (=FL pontos vermelhos) foi medido com os ensaios de pT3xhT43 e pT3xpT82, e as correlações foram avaliadas (Figura 11). Ambos os en- saios de pT3xhT43 e pT3xpT82 foram capazes de separar a biópsia do cérebro negativa (amiloide-/tau-) das amostras positivas (ami- loide+/tau+) (p=0,04 e 0,02, respectivamente). Amostras positivas para amiloide, mas não para tau, frequentemente mediram entre as amostras de biópsia+ e biópsia-. Acredita-se que as placas amiloides no cérebro precedem os emaranhados de tau, portanto, amostras de amiloide+/tau- podem representar DA inicial ou outra doença. Coorte 2: "Coorte de VS vs. DA "

[0227] Amostras de LCR (FL) de indivíduos DA versus VS definidos bioquimicamente (n=20 por grupo) foram obtidas junto à Universidade de Sahlgrenska. Os níveis de Aβ42 e tTau foram determinados por ELISA Innotest (medição clássica) para subdividir os grupos (DA=LCR Aβ42<400 pg/ml e LCR tTau>600 pg/ml, VS=LCR Aβ42>400 pg/ml e LCR tTau<600 pg/ml). As medições foram realizadas com o uso de en- saios de pT3xhT43, pT3xpT82 e hT7xpT82 sobre LCR bruto e um sub- conjunto de LCR fracionado por rpHPLC. Os resultados foram analisados por correlação com os tradicionais biomarcadores de DA (Figura 12). Os dados nos painéis A e B da Figura 12 demonstraram que o epítopo de pT3 é um indicador de pacientes em alto risco de progressão rápida para DA insipiente. O epítopo de pT3 foi altamente elevado em pacientes que demonstraram nível alto de tau total e nível baixo de Aβ42. Por outro lado, o epítopo de pT3 estava presente em baixos níveis em indivíduos com baixo tau total e alto Aβ42. A Figura 11C confirmou que o epítopo pT3 elevado contendo tau foi conduzido ao menos em parte por níveis eleva- dos de tau total, conforme demonstrado pelo ensaio de tau total de hT7xpT82, mas não inteiramente (Figura 12D). Isto indica que a quanti- dade de tau e até que ponto ele é fosforilado no epítopo p217+, é elevado em DA.

[0228] Os dados da Figura 11 foram utilizados para criar curvas ROC quanto à capacidade dos ensaios de pT3xhT43, pT3xpT82 e hT7xpT82 para diferenciar o DA das amostras de VS. Todos os três ensaios mostraram excelentes especificidade e sensibilidade. Entre- tanto, os dois ensaios à base de pT3 (pT3xhT43, pT3xpT82, que de- tectam tau p217+) tinham melhor poder de diagnóstico do que o ensaio com base em hT7 (Figura 13).

[0229] Um subconjunto das mesmas amostras de LCR medidas na Figura 12 (n=11 por grupo) foi fracionado por rpHPLC e então medido com ensaios de pT3xhT43, pT3xpT82, hT7xpT82 (o último foi medido dos mesmos fragmentos de tau em uma maneira independente de fos- forilação) (Figura 14). O perfil dos fragmentos tau observados foi se- melhante ao observado no Exemplo 7 e na Figura 7. Ou seja, duas espécies principais foram vistas com ambos ensaios à base de pT82, pT3xpT82 e hT7xpT82, enquanto apenas um dos picos foi visto com o ensaio de pT3xhT43. Ambas as espécies principais estavam presentes em concentrações mais altas no grupo DA do que no grupo VS. Adici- onalmente, os ensaios com base em pT3 (tau p217+) mostraram um diferencial maior entre os grupos do que o ensaio à base de hT7 (tau total), conforme detectado na análise de LCR bruto. A espécie de tau p217+ maior (frações 13-14) forneceu o maior diferencial de DA versus VS (Figura 14).

[0230] A soma de todos os principais fragmentos de tau na Figura 14 (frações 11-14) foi calculada, depois comparada entre os subgrupos DA e VS. O aumento percentual do epítopo pT3 contendo tau (pT3xhT43 ou pT3xpT82) na DA foi maior que o dobro daquele visto com o epítopo não pT3 contendo tau (hT7xpT82) (Tabela 5).

Tabela 5. Sinal de tau total em ensaios de pT3 vs. não pT3 AEB média Desvio Pa- AEB média Desvio Padrão % de aumento em Ensaio em DA drão em DA em VS em VS DA pT3/pT82 0,74 0,32 0,12 0,05 620 pT3/hT43 1,65 1,88 0,22 0,14 750 hT7/pT82 2,00 1,66 0,84 0,66 250

[0231] A análise do sinal em cada fração da Figura 14 independen- temente vs. como uma soma conforme feito na Tabela 5, foi realizado para divulgar qual fração gerou o maior sinal de DA vs. VS. O agrupa- mento de fragmento mais informativo foi detectado com o uso do anti- corpo pT3 nos agrupamentos de fragmentos 13 e 14 (Tabela 6). Tabela 6. Sinal de Tau em diferentes agrupamentos de fragmentos de tau em ensaios de pT3 vs. pT3 O ensaio de pT3 identifica pacientes DA melhor que um ensaio de não pT3: Diferenças por Agrupamento de Fragmentos AEB média AEB média % de DA sobre Ensaio Agrupamento de fragmentos em DA em VS VS 11 0,22 0,105 210 12 0,333 0,113 295 pT3xhT43 13 1,78 0,235 757 14 4,25 0,407 1044 11 0,447 0,079 566 12 0,631 0,098 644 pT3xpT82 13 0,681 0,121 563 14 1,2 0,193 622 11 0,51 0,29 176 12 2,8 1,51 185 hT7xpT82 13 0,73 0,26 281 14 3,94 1,31 301 Coorte 3: "Coorte de VS versus ARAD versus DA estágio inicial"

[0232] As amostras de LCR (FL) de indivíduos normais clinicamente definidos (CDR 0) vs. queixa leve de memória (CDR 0,5) (n=20 por grupo) foram obtidas junto ao estudo da Janssen ALZ1005/2002. Os níveis de Aβ42, tTau e pTau181, foram determinados por ELISA Inno- test. Com base nos escores de CDR e LCR Aβ42, os indivíduos foram classificados em (a) VS=CDR>0 e Aβ42 600 pg/ml, (b) ARAD=CDR 0 e Aβ42<600 pg/ml, (c) demência potencialmente não DA=CDR 0,5 e Aβ42>600 e (d) DA de estágio inicial = CDR 0,5 e Aβ42<600 pg/ml.

[0233] As amostras de LCR também foram fracionadas por rpHPLC e medidas com ensaios com base em pT3 (pT3xhT43, Figuras 15A-15E e pT3xpT82, Figuras 15F-15J) e de tau total (hT7xpT82, Figuras 15K-15O). Todos os ensaios baseados em pT3 e baseados em hT7 mostraram sinal elevado em CDR 0 versus 0,5 (Figuras 15A, 15F e 15K) e em amostras com Aβ42<600 pg/ml versus >600 pg/ml (Figuras 15B, 15G e 15L). Discri- minação por nível de CDR x Aβ42 é mostrada nas Figuras 15C, 15D, 15H, 15I, 15M e 15N, e o sinal acrescentado em todas as frações é ilustrado nas Figuras 15E, 15J e 15O. Os níveis de sinal foram os mais altos no subgrupo Aβ42<600 pg/ml + CDR 0,5, consistentes com o sinal de tau p217+ elevado em DA no estágio inicial versus VS ou AARAD. A separa- ção entre subgrupos foi superior em ensaios com base em pT3 vs. ensaio com base em hT7, indicando que a hiperfosforilação do epítopo pT3 é par- ticularmente enriquecida (acima da elevação de tau total simples) na do- ença. Coorte 4 ("Coorte de CDR 0 vs CDR1")

[0234] As amostras de LCR FL de indivíduos clinicamente defini- dos normais (Classificação Clínica de Demência 0; CDR 0) vs. queixa leve de memória (CDR 1) (n=5 por grupo) foram obtidas na Universi- dade de Washington. CDR e MMSE, bem como medições de LCR Aβ42, tTau e pTau181 por ensaios Innotest foram obtidas na Universi- dade de Washington. Antes da expedição, as amostras foram codifica- das de modo que a Janssen estava cega quanto à identidade ou ca- racterização das amostras. As medições de tTau e tau p217+ de Simoa foram realizadas em Janssen Neuroscience Biomarkers, La Jolla e en- viadas para a Universidade de Washington para análise.

[0235] As amostras de LCR foram medidas em estado bruto ou após fracionamento por rpHPLC, usando ensaios tanto com base em pT3 (pT3xhT43 e pT3xpT82) como tTau (hT7xpT82). Os dados foram expres- sos como uma razão entre os dois ensaios de pT3 (Tabela 7) para avaliar o impacto relativo à espécie de tau curto, ou como (Figuras 16A-16B) uma razão entre ensaio de pT3 e tTau, para avaliar o impacto relativo deste evento de fosforilação. Em ambos os casos, o resultado diagnosticou com precisão o estado de CDR para 9 dos 10 indivíduos. O indivíduo fora dos limites 1 foi determinado por Innostest ter também Tau anormalmente baixo, e assim pode representar demência de não taupatia. De modo intri- gante, uma correlação entre a razão de Tau p217+/tTau e MMSE foi ob- servada, sugerindo que o sinal detectado pelos ensaios de pT3 pode ras- trear com a cognição. Tabela 7. Razão de análise de pT3xpT82 (p217+ curto) versus pT3xhT43 (p217+ longo) no LCR bruto Innotest Aβ, tTau, pTau P217 + tau DI CDR MMSE Gênero idade_em_LP Innotest Aβ Inno_Tau Inno-pTau P217 + curto/ P217 + longo 24064* 1 28 M 77 + 119,44 30,154 baixa 24593 1 23 F 55 + 816,427 104,47 1,25 25711 1 28 M 79 + 450,005 65,486 1,78 62496 1 24 M 85 + 1126,919 153,024 1,34 64397 0 30 F 72 - 261,846 44,805 0,81 64722 0 30 F 77 - 247,99 55,951 0,99 64996 0 30 M 80 - 427,871 96,301 0,82 65839 0 30 F 68 - 180,452 39,263 0,99 65922 0 28 M 58 - 539,75 96,29 baixa 68031 1 27 M 68 + 1080,048 120,47 1,22 * CDR 11 e Aβ positivo mas tem Tau e pTau baixos em Innotest e Simoa Coorte 5 ("coorte VS versus MCI versus DA")

[0236] Amostras de LCR de FL clínica e bioquimicamente definidas (Innotest>AB42 600 pg/ml) (n=7) foram obtidas a partir da Precision Medicine (San Diego, CA). As amostras de LCR FL clínica e bioquimi- camente definidas (Innotest AB42 < 600 pg/ml) MCI (n=28) e DA (n=12) foram obtidas junto à Universidade de Antuérpia. As medições de tau p217+ por rpHPLC e Simoa foram realizadas na Janssen Neurosci- ence Biomarkers, La Jolla.

[0237] As amostras de LCR foram medidas em estado bruto ou após fracionamento por rpHPLC, usando ensaios tanto com base em pT3 (pT3xhT43 e pT3xpT82) como tTau (hT7xpT82). Todos os ensaios baseados em pT3 e baseados em hT7 mostraram sinal elevado au- mentando progressivamente o sinal nos grupos VS vs MCI vs DA (Fi- guras 17A e C) e correlacionaram-se bem um com o outro (conforme visto na coorte 1, Figura 9) (Figuras 17D e 17E). Os ensaios de pT3 também correlacionaram até certo ponto com Innotest tTau e pTau181 (Figuras 17F e 17 G), mas não com Innotest AB42 ou razão AB42/40 (Figuras 17H e 17II). Resultados similares para posicionamento de di- agnóstico foram observados em medições de LCR bruto (Figuras 17A- 17C) ou material fracionado por rpHPLC (Figuras 17J - 17T). Conforme visto na coorte 3, a separação de VS versus MCI versus DA foi mais acentuada (maior significância estatística) usando os ensaios à base de pT3 do que o ensaio de tTau, destacando a relevância patológica desta medição de ensaio de pT3. Coorte 6 ("Coorte de severidade e progressão da doença")

[0238] As amostras de LCR (FL) de indivíduos DA clinicamente defi- nidos (Avaliação Clínica de Demência 1+) (n=235) foram obtidas junto ao estudo da Janssen ELN115727301/302. Essas amostras eram amostras basais (pré-dose) de todos os indivíduos no teste. Além disso, as amostras de LCR de 78 semanas de acompanhamento dos indivíduos com placebo (n=90) foram incluídas para avaliar os biomarcadores de progressão da doença. Avaliação cognitiva (ADAS-COG, MMSE, NTB e CDR.SOB), ge- nótipo ApoE, sexo e idade foram obtidos a partir do ensaio. Os ensaios Innotest AB42, Innotest AB40, luz de neurofilamento Simoa (NFL), pT3xpT82, pT3xhT43 e hT7xpT82 foram realizados na Janssen Neurosci- ence Biomarkers, La Jolla. Os indivíduos foram confirmados como positi- vos ou negativos para amiloide com base na razão de corte AB42/40 de 0,09 (por exemplo, indivíduos com razão<0,09=positivo amiloide=DA, en- quanto aqueles>0,09=negativo amiloide=demência de causa não DA). 27 dos 235 indivíduos foram determinados como amiloide negativos, dessa forma, cada grupo foi analisado separadamente.

[0239] O sinal de medições de LCR bruto novamente revelou uma boa correlação entre os dois ensaios de pT3 e o ensaio de tTau (Figu- ras 18A e 18B), mas não com (Figura 18C) da NFL, uma suspeita de marcador de neurodegeneração geral, sugerindo que o ensaio de pT3 pode reconhecer uma forma específica ou estágio de neurodegenera- ção.

[0240] Os ensaios com base em pT3 novamente divulgaram sinal mais alto em indivíduos amiloide positivos versus negativos (Figuras 18D-18E).

[0241] Os ensaios com base em pT3 divulgaram uma correlação modesta com vários escores de cognição (ADAS-COG, MMSE, NTB, CDR.SOB, Figuras 18F-18M), corroborando a descoberta na coorte 4 (Figura 16C). Curiosamente, o sinal basal de ensaio com base empT3 correlacionou modestamente com alteração nas pontuações de cogni- ção ao longo dos 18 meses do período de acompanhamento como também sugerindo a capacidade de prever o declínio cognitivo (Figu- ras 18N - 18P).

[0242] A razão de sinal com base em pT3 e tTau (tau p217_/tTau) produziu resultados similares, dados não mostrados.

[0243] As correlações com a cognição e a mudança na cognição foram vistas em ambos os grupos amiloide positivos e negativos, no entanto, o último grupo era um pequeno conjunto de amostras. Se con- firmado, isso sugere que a conexão de p217+ vs cognição pode não ser específica para DA. Exemplo 9. Quantificação de tau p217+ livre versus ligado por anti- corpo

[0244] Os ensaios descritos no Exemplo 3 foram realizados da se- guinte forma. Ensaio 1: quantificação de tau p217+ livre versus ligado em fluido bioló- gico via imunocaptura/depleção seguida de rpHPLC

[0245] O ensaio foi testado mediante reforço com um anticorpo em amostras de LCR. LCR de DA agrupado foi reforçado com 10 ug de mAb pT3, mAb pT3 humanizado, msIgG ou volume comparável de PBS (simulado) e incubado a 4°C por 24 h seguido de imunocaptura. As amostras, bem como LCR parental não submetido à imunocaptura, foram fracionadas em rpHPLC, e cada fração foi medida usando o en- saio de pT3xhT43 para avaliar a quantidade de tau p217+ total e li- gado. Sinal substancial foi observado em um pico principal, seme- lhante ao observado no Exemplo 7 e Figura 7, na amostra parental (tau p217+ total) e as imunocapturas de mAb pT3 ou de mAb pT3 humani- zado (tau p217+ ligado), mas não nas imunocapturas de IgG ou simu- ladas (Figura 19).

[0246] O LCR de DA agrupado foi reforçado com titulações de mAb pT3 humanizado, incubado a 22°C por 2 h, seguido por imunocaptura, rpHPLC e ensaio de pT3xhT43 para avaliar tau p217+ ligado (Figura 20A). O sobrenadante esgotado de IgG também foi fracionado e me- dido para avaliar tau p217+ livre (Figura 20B). O reforço com mAb pT3 humanizado aumentou a quantidade de tau p217+ ligado medida e di- minuiu a quantidade de tau p217+ livre, de uma maneira dependente de dose.

[0247] Considerados juntos, os resultados mostram que este mé- todo, que é uma medição direta do engate alvo, é específico para an- ticorpos que são direcionados para o epítopo de tau p217+ (Figura 19) e é dependente da dose de anticorpo direcionado (Figura 20). Ensaio 2: Quantificação de tau p217+ livre versus ligado em fluido bi- ológico através de desnaturação de anticorpo seletiva

[0248] As amostras biológicas (por exemplo, LCR) foram aquecidas por 4 minutos a quase em ebulição, seguida de um resfriamento em gelo e subsequente medição com os ensaios de pT3xhT43 e/ou pT3xpT82. O tempo preciso deste processo foi determinado para danificar irreversivel- mente os anticorpos na amostra de modo que eles não pudessem interferir com o ensaio (Figura 21) nem afetassem o próprio sinal de tau p217+ (Fi- gura 21). Acredita-se que isto seja devido à falta de estrutura terciária, em particular, na proteína tau, permitindo que ela seja particularmente estável em alta temperatura. Essa amostra foi denominada tau p217+ total, en- quanto a medição paralela de uma amostra que não tinha sido submetida ao tratamento térmico foi chamada de tau p217+ livre. A subtração da con- centração livre da concentração total forneceu a medição de tau p217+ ligada.

[0249] O impacto do calor no ensaio foi determinado, conforme ex- posto a seguir.

[0250] O impacto do calor em uma mistura de mAb pT3 humani- zado/LCR: Alíquotas de LCR de DA agrupadas foram reforçadas com mAb pT3 a 1 µg/ml, incubadas por 2 h a 22°C, aquecidas durante 95 minutos a 0-20°C, resfriadas até 4°C, depois medidas com o uso do ensaio de pT3xpT82 em uma diluição 1:10 (Figura 21A). O sinal de tau p217+ foi baixo em ~2 minutos de tratamento por calor, então retornou para níveis observados em LCR sem reforço e foi estável em ~10 mi- nutos de calor antes de cair.

[0251] Impacto do calor em LCR sem tratamento: Alíquotas de LCR de DA agrupadas foram aquecidas por 0-20 minutos a 95°C, depois resfri- adas até 4°C, antes da medição com o uso do ensaio de pT3xpT82 a uma diluição 1:10 (Figura 21B). O sinal de tau p217+ foi estável por ~10 minutos de calor antes de cair.

[0252] Impacto do calor sobre a capacidade do mAb pT3 humani- zado de interferir no ensaio de pT3xpT82: Alíquotas de mAb pT3 hu- manizado a 10 µg/ml em PBS foram aquecidas durante 0-20 minutos a 95°C, então resfriadas até 4°C. Essas amostras foram então mistu- radas com LCR de DA agrupado (a 1 µg/ml de concentração final de mAb pT3 humanizado) e incubadas por 22°C por 2 h antes da medição usando ensaio de pT3xpT82 em uma diluição 1:10 (Figura 21C). O si- nal de tau p217+ foi baixo ~2 minutos de tratamento térmico JNJ, então retornado para os níveis observados em LCR sem reforço (ver Figura 21B) e ficou estável por ao menos 20 minutos de calor.

[0253] Alíquotas paralelas de LCR de DA agrupadas foram titula- das com mAb pT3 humanizado, incubadas por 2 h a 22°C, depois sub- metidas ao processo de desnaturação por calor (com 4 minutos de ca- lor) (Figura 122A) ou imunocaptura/rpHPLC (Figura 22B) antes da me- dição com o uso do ensaio de pT3xpT82. Ambos os métodos mostra- ram um aumento dependente da dose de mAb pT3 humanizado na forma ligada, diminuição na forma livre e nenhuma mudança no sinal de tau p217+ total. Adicionalmente, o método de desnaturação medi- ado por calor forneceu dependência de dose de mAb pT3 humanizado e medições relativas de p217+ total vs livre vs. ligado comparáveis às obtidas com o método mais trabalhoso de imunocaptura/rpHPLC do Ensaio 1 (Figura 22C). Portanto, o método térmico é recomendado para análise de amostra padrão. Exemplo 10. Sinal de tau p217+ em modelos de animais pré-clínicos

[0254] Para apoiar estudos clínicos, amostras sem tratamento de vários animais de laboratório comuns foram avaliadas usando os en- saios com base em pT3 e/ou alinhados com a sequência para predizer a reatividade cruzada. Macaco cinomolgo

[0255] LCRs de dois macacos cinomolgo foram medidos em várias diluições usando ensaios com base em pT3 e com base em hT7 (Figura 23). Para comparabilidade, os mesmos anticorpos de detecção foram emparelhados com cada um dos dois anticorpos de captura. Em alguns casos, os dois LCRs individuais foram testados separadamente (Cino 1 ou Cino 2), e em outros casos, as amostras de LCR foram agrupadas para poupar volume. Sinal substancial (AEB) foi visto em todos os en- saios com o uso de hT7 como o anticorpo de captura, independente- mente do anticorpo de detecção, mas nenhum sinal foi detectado em qualquer um dos ensaios com o uso de pT3 como o anticorpo de cap- tura. Adicionalmente, ensaios com base em placa com pT3 mostraram que mesmo em homogenatos de cérebro de macaco cinomolgo, há muito pouco ou nenhum sinal baseado em pT3, apesar do grande sinal no cérebro humano de DA (dados não mostrados). Isto sugere que ape- sar dos altos níveis de tau, o epítopo de pT3 não é preservado nesta espécie. De fato, a análise de sequências de proteína publicadas sugere que um aminoácido seja diferentes entre o ser humano e o macaco ci- nomolgo no epítopo principal de pT3 e a modelagem estrutural, com base na estrutura cristalina de mAb pT3 humanizado com tau, sugere que essa mudança poderia abolir a ligação de pT3 (dados não mostra- dos). Sagui comum

[0256] O LCR de sagui comum foi testado com o uso de ensaios com base em pT3 e à base de hT7 (Figura 24). LCR de três saguis comuns foi medido em várias diluições com o uso de ensaios de pT3xhT43, pT3xpT82 e hT7xpT82. Para efeitos de comparação, um LCR de macaco cinomolgo agrupado (controle negativo) e LCR humano de DA (controle positivo) fo- ram testados simultaneamente. Sinal substancial (AEB) foi visto no LCR de sagui usando os ensaios de pT3xpT82 (Figura 24B) e hT7xpT82 (Fi- gura 20C), mas não com o ensaio de pT3xhT43 (Figura 24A).

[0257] Isso sugeriu que o epítopo hT43 estava ausente nessa es- pécie e, de fato, um alinhamento de sequência de proteína indica que um aminoácido é diferente entre humano e sagui comum no epítopo hT43, enquanto os epítopos pT3, hT7 e pT82 são preservados. Medi- ção do homogenato de cérebro de sagui com os mesmos testes con- firmou que havia sinal substancial com os ensaios de pT3xpT82 e hT7xpT82, mas muito pouco com o ensaio de pT3xhT43 (dados não mostrados). Dessa forma, a análise do sinal de tau p217+ em sagui foi obtida com o uso do ensaio de pT3xpT82. Camundongo, Rato, Cachorro e Porco

[0258] Alinhamento de sequências de proteína tau previstas em ca- mundongo, rato, cachorro ou porco (números de acesso do NCBI: NP_001033698.1, NP_058908.2, NP_001104271.1 e AGJ26517.1, res- pectivamente) com sequência humana sugere que pT3 é 100% conser- vado nestas espécies. Entretanto, as sequências de hT43 e pT82 de ca- mundongo, rato, cachorro e porco não são idênticas às do ser humano e, dessa forma, amostras destes precisariam ser avaliadas com o uso dos ensaios de pT3xhT43 e pT3xpT82.

[0259] Considerados em conjunto, os dados apresentados aqui indi- cam que os ensaios de pT3xhT43 e pT3xpT82 desenvolvidos na plata- forma Simoa para medição de LCR são altamente sensíveis, tendo sensi- bilidade em femtogramas, são precisos, exatos, diluição linear e o analito estável. Os ensaios parecem se correlacionar bem com os biomarcadores de DA clássicos e os escores de demência, e podem ser superiores aos medidos na identificação e estadiamento de indivíduos de DA.

[0260] Os ensaios podem ser utilizados para medir o nível de tau p217+ total no LCR, ou para avaliar o perfil de fragmento de p217+ em LCR fracionado por rpHPLC. Os ensaios também podem ser combinados com manipulação pré-analítica para medir os níveis de tau p217+ que es- tão ligados por anticorpos endógenos ou administrados exogenamente, em comparação a tau p217+ que é livre do anticorpo. Dessa forma, os ensaios podem ser utilizados como biomarcadores preditivos para identifi- car indivíduos para os quais a terapia de anticorpo antitau p217+ será ade- quada, mediante a identificação de indivíduos com altos níveis do alvo de tau p217+. Com a medição dos níveis de tau p217+ ligado ao anticorpo, total e livre, os ensaios podem também ser utilizados como marcadores farmacodinâmicos. Exemplo 11. Sinal de tau p217+ no sangue

[0261] Embora a medição de Tau no LCR tenha mostrado grande utilidade em diagnóstico e posicionamento de distúrbios neurodegene- rativos, a coleta de LCR tem limitações (por exemplo, carga do paciente, experiência no sítio clínico, volume de coleta e restrições de frequência). Como tal, há grande interesse na adaptação de Tau para uso em medi- ções de produtos derivados de sangue (por exemplo, soro, plasma). En- tretanto, literatura recente tem indicado que as medições de tau no soro ou no plasma bruto não exibem desempenho de diagnóstico ideal e po- dem afetadas pelas barreiras de interferência da matriz e sensibilidade. Os ensaios com base em pT3 podem representar uma nova oportuni- dade, entretanto, devido à sua alta sensibilidade e especificidade.

[0262] Soro de indivíduos de DA clinicamente definidos (n=4 cada) foi medido com os ensaios de pT3xpT82 e hT7xpT82, seja na amostra bruta em várias diluições ("bruta", Figuras 25A-25D), em amostras des- naturadas e tratadas com ácido (NaOAc pH 5) ("ebulição", Figuras 26A-26B) como em D' Abramo et al. 2016 para remover a maior parte da interferência de matriz, e depois da imunoprecipitação (IP) com mi- croesferas de pT3 seguido de desnaturação por calor do eluto ("IP de pT3", Figura 27).

[0263] A medição em soro bruto revelou que a maioria das amostras foram inferiores ao limite de quantificação (LOQ), com poucas amostras fora dos limites relatando níveis muito mais elevados. Entretanto, o sinal não sobreviveu a uma diluição modesta e foi considerado um artefato de interferência. Avaliação da diluição mais alta testada (Figura 25B e 25D) e, dessa forma, a menos afetada pela interferência, sugeriu que o ensaio de pT3xpT82 pode detectar sinal ligeiramente maior em amos- tras de DA, mas todos são abaixo de LOQ então podem não ser preci- sos e/ou exatos.

[0264] Mensuração no soro após tratamento com ácido (para dis- sociar interações de proteína-proteína) e calor (para desnaturar a mai- oria das proteínas tau) reduziu o sinal de pT3xpT82 e hT7xpT82 para todos quase ou abaixo do LOQ (Figuras 26A-26B). Novamente, o en- saio de pT3xpT82 pode detectar um pouco mais sinal em amostras de DA mas todos estão perto de LOQ que podem não ser precisos e/ou exatos.

[0265] Mensuração no soro após desnaturação e IP de pT3 para remover a maior parte de substâncias interferentes e concentrar o tau p217+, revelou níveis muito mais altos nas amostras de DA do que nas amostras de VS (Figura 27). Os níveis de p217+ foram ~4x mais ele- vados do que as medições brutas ou em ebulição e tais amostras de VS estavam agora no LOQ e as amostras de DA estavam agora todas na faixa linear.

[0266] Esses resultados indicaram que os ensaios com base em pT3 aqui descritos podem ter utilidade como uma medição com base em san- gue de tau patológico, particularmente quando emparelhados com uma estratégia de enriquecimento, como IP.

[0267] Embora a invenção tenha sido descrita em detalhes e com referência a modalidades específicas da mesma, ficará evidente para o versado na técnica que várias alterações e modificações podem ser fei- tas na mesma sem que se afaste do espírito e do escopo da invenção. Referências Abhinandan e Martin, Mol Immunol. 45:3832-9, 2008 Almagro, Mol Recognit. 17:132-43, 2004 Barthelemy et al., J Alzheimers Dis. 51(4):1033-43, 2016 Butner e Kirschner, J Cell Biol. 115(3):717-30, 1991 Chothia e Lesk, J Mol Biol. 196:901-17, 1987 Chothia et al., J. Mol. Biol. 227: 799-817, 1992 Clavaguera et al., Nat Cell Biol. 11:909-13, 2009

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Morris, Ed. (1996) Fishwild et al., Nat Biotechnol. 14:845-51, 1996 Frost et al., J Biol Chem. 284:12845-52, 2009 Hanger et al.

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Biol. 215:175-182, 1990 Wu e Kabat, J Exp Med. 132:211-50, 1970

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de medição de peptídeos tau p217+ em uma amos- tra, caracterizado por compreender: (i) colocar a amostra em contato com um anticorpo de cap- tura direcionado contra um epítopo tau p217+ para capturar os peptí- deos tau p217+ na amostra, e (ii) colocar os peptídeos tau p217+ capturados em contato com ao menos um dentre um primeiro anticorpo de detecção direcio- nado contra um epítopo compreendendo os resíduos de aminoácidos 119 a 126 da proteína tau e um segundo anticorpo de detecção direcio- nado contra um epítopo contendo resíduos de aminoácidos 7 a 20 da proteína tau para, assim, medir ao menos uma dentre uma quantidade de peptídeos tau p217+ e uma quantidade de peptídeos tau p217+ lon- gos, respectivamente, sendo que a numeração do aminoácido é com referência à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender colocar os peptídeos tau p217+ capturados em contato com o primeiro anticorpo de detecção e o segundo anticorpo de detecção para, assim, medir a quantidade de peptídeos tau p217+ e a quantidade de pep- tídeos tau p217+ longos, respectivamente, e opcionalmente determinar uma razão entre a quantidade de peptídeos tau p217+ longos e a quanti- dade de peptídeos tau p217+.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por compreender adicionalmente: (i) determinar uma quantidade de peptídeos tau p217+ curtos subtraindo a quantidade de peptídeos tau p217+ longos da quantidade de peptídeos tau p217+, e (ii) opcionalmente determinar uma razão entre a quantidade de peptídeos tau p217+ curtos e a quantidade de peptídeos tau p217+ ou uma razão entre a quantidade de peptídeos tau p217+ longos e a quantidade de peptídeos tau p217+ curtos.

4. Método de medição de peptídeos tau p217+ em uma amos- tra, caracterizado por compreender: (i) colocar a amostra em contato com um anticorpo de cap- tura direcionado contra um epítopo tau p217+ para capturar peptídeos tau p217+ na amostra, e colocar a amostra em contato com um anti- corpo de captura independente de fosforilação direcionado contra um epítopo entre os aminoácidos 150 e 250 da proteína tau, de preferência um epítopo que compreende os aminoácidos 159 a 163 da proteína tau, para capturar os peptídeos tau totais na amostra; (ii) realizar ao menos um dentre: a. colocar os peptídeos tau p217+ capturados em contato com um primeiro anticorpo de detecção direcionado contra um epítopo compreendendo resíduos de aminoácidos 119 a 126 da proteína tau para, assim, medir uma quantidade de peptídeos tau p217+, colocar os peptídeos tau totais capturados em contato com o primeiro anticorpo de detecção para, assim, medir uma quantidade de peptídeos tau totais, e determinar uma razão entre a quantidade de peptídeos tau p217+ e a quantidade de peptídeos tau totais; e b. colocar os peptídeos tau p217+ capturados em contato com um segundo anticorpo de detecção direcionado contra um epítopo com- preendendo resíduos de aminoácidos 7 a 20 da proteína tau para, assim, medir uma quantidade de peptídeos tau p217+ longos, e colocar os peptí- deos tau totais capturados em contato com o segundo anticorpo de detec- ção para, assim, medir uma quantidade de peptídeos tau longos totais, e determinar uma razão entre a quantidade de peptídeos tau p217+ longos e a quantidade peptídeos tau longos totais, sendo que a numeração do aminoácido é com referência à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por compreender adicionalmente determinar uma quantidade de peptí- deos tau p217+ curtos subtraindo a quantidade de peptídeos tau p217+ longos da quantidade de peptídeos tau p217+, determinar uma quanti- dade de peptídeos tau curtos totais subtraindo a quantidade de peptí- deos tau longos totais da quantidade de peptídeos tau totais, e determi- nar a razão entre a quantidade de peptídeos tau p217+ curtos e a quan- tidade de peptídeos tau curtos totais.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por a amostra ser uma amostra biológica de um indiví- duo selecionada do grupo que consiste em sangue, homogenato cerebral ou líquido cefalorraquidiano (CSF) proveniente do indivíduo.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a amostra biológica ser sangue.

8. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a amostra biológica ser CSF.

9. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a amostra biológica ter sido fracionada com o uso de cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa (rpHPLC).

10. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por compreender adicionalmente: a. determinar se o indivíduo sofre de uma taupatia ou está em risco de desenvolver uma taupatia; b. determinar se o indivíduo é adequado para um tratamento com um anticorpo antitau p217+; c. determinar a eficácia de um tratamento de uma taupatia no indivíduo; ou d. monitorar um tratamento com um anticorpo antitau p217+ em um indivíduo, sendo que a determinação ou monitoramento compreende comparar ao menos uma dentre a quantidade de peptídeos tau p217+, a quantidade de peptídeos tau p217+ longos, a quantidade de peptídeos tau p217+ curtos e as razões dessas quantidades do indivíduo com um valor de linha de base correspondente.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, compreen- dendo o monitoramento de um tratamento com um anticorpo antitau p217+ em um indivíduo, caracterizado por o método compreender: (i) obter uma amostra biológica proveniente do indivíduo; (ii) separar a amostra biológica em uma primeira amostra con- tendo peptídeos tau p217+ livres do anticorpo antitau p217+ e uma se- gunda amostra contendo peptídeos tau p217+ ligados ao anticorpo antitau p217+; (iii) separar a segunda amostra, de preferência, via rpHPLC, para obter uma terceira amostra contendo peptídeos tau p217+ isentos de anticorpo antitau p217+; (iv) colocar cada uma dentre a primeira amostra e a terceira amostra em contato com um anticorpo de captura direcionado contra um epítopo tau p217+ para capturar peptídeos tau p217+ em cada uma dentre a primeira e a terceira amostra, (v) realizar ao menos um dentre (a) colocar os peptídeos tau p217+ capturados em contato com um primeiro anticorpo de detecção direcionado contra um epítopo compreendendo resíduos de aminoáci- dos 119 a 126 da proteína tau para, assim, medir uma quantidade de peptídeos tau p217+ em cada uma dentre a primeira e a terceira amos- tra, e (b) colocar os peptídeos tau p217+ capturados em contato com um segundo anticorpo de detecção direcionado contra um epítopo com- preendendo resíduos de aminoácidos 7 a 20 da proteína tau para, as- sim, medir uma quantidade de peptídeos tau p217+ longos em cada uma dentre a primeira e a terceira amostra, opcionalmente (c) determi-

nar uma quantidade de peptídeos tau p217+ curtos subtraindo a quan- tidade de peptídeos tau p217+ longos da quantidade de peptídeos tau p217+ em cada uma dentre a primeira e a terceira amostra; (vi) monitorar o tratamento com o anticorpo antitau p217+ com base em ao menos uma dentre a quantidade de peptídeos tau p217+, a quantidade de peptídeos tau p217+ longos, a quantidade de peptídeos tau p217+ curtos e as razões dessas quantidades, em cada uma dentre a pri- meira e a terceira amostra.

12. Método, de acordo com a reivindicação 10, compreen- dendo o monitoramento de um tratamento com um anticorpo antitau p217+ em um indivíduo, caracterizado por o método compreender: (i) obter uma amostra biológica proveniente do indivíduo, (ii) obter uma amostra semidesnaturada da amostra bioló- gica contendo peptídeos tau p217+ totais, sendo que a amostra semi- desnaturada é aquecida para desnaturar os anticorpos na amostra e obter uma amostra não desnaturada a partir da amostra biológica con- tendo peptídeos tau p217+ isentos de anticorpo antitau p217+, (iii) colocar cada amostra semidesnaturada e a amostra não desnaturada em contato com um anticorpo de captura direcionado contra um epítopo tau p217+ para capturar peptídeos tau p217+ em cada uma das amostras, (iv) realizar ao menos um dentre (a) colocar os peptídeos tau p217+ capturados em contato com um primeiro anticorpo de detecção direcionado contra um epítopo compreendendo resíduos de aminoáci- dos 119 a 126 da proteína tau para, assim, medir uma quantidade de peptídeos tau p217+ em cada uma das amostras, e (b) colocar os pep- tídeos tau p217+ capturados em contato com um segundo anticorpo de detecção direcionado contra um epítopo compreendendo resíduos de aminoácidos 7 a 20 da proteína tau para, assim, medir uma quantidade de peptídeos tau p217+ longos em cada uma das amostras, opcional- mente (c) determinar uma quantidade de peptídeos tau p217+ curtos subtraindo a quantidade de peptídeos tau p217+ longos da quantidade de peptídeos tau p217+ em cada uma dentre a primeira e a terceira amostra, e (v) monitorar o tratamento com o anticorpo antitau p217+ com base em ao menos uma dentre a quantidade de peptídeos tau p217+, a quantidade de peptídeos tau p217+ longos, a quantidade de peptídeos tau p217+ curtos e as razões dessas quantidades, em cada uma das amostras.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado por o anticorpo de captura ser conjugado com uma microesfera, sendo que o anticorpo de detecção é biotinilado.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado por o limite inferior de quantificação do método ser de cerca de 40 fg/ml dos peptídeos tau p217+ e o limite inferior de de- tecção do método ser cerca de 2 fg/ml dos peptídeos tau p217+.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 14, caracterizado por a taupatia ser selecionada do grupo que consiste em doença de Alzheimer familiar, doença de Alzheimer esporádica, de- mência frontotemporal com parkinsonismo ligado ao cromossomo 17 (FTDP-17), paralisia supranuclear progressiva, degeneração corticobasal, doença de Pick, gliose progressiva subcortical, demência apenas com emaranhados, emaranhados neurofibrilares difusos com calcificação, de- mência com grãos argirofílicos, complexo esclerose lateral amiotrófica- parkinsonismo-demência, síndrome de Down, doença de Gerstmann- Sträussler-Scheinker, doença de Hallervorden-Spatza, miosite por corpos de inclusão, doença de Creutzfelt-Jakob, atrofia de múltiplos sistemas, do- ença de Niemann-Pick tipo C, angiopatia amiloide cerebral causada pela proteína príon, panencefalite esclerosante subaguda, distrofia miotônica,

doença do neurônio motor não Guamaniana com emaranhados neurofibri- lares, parkinsonismo pós-encefalítico, encefalopatia traumática crônica e demência pugilística (doença do boxe), sendo a taupatia, de preferência, doença de Alzheimer.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado por o anticorpo de captura compreender HCDR1, HCDR2 e HCDR3 da cadeia pesada de imunoglobulina tendo as se- quências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 32, 33 e 34, respectiva- mente, e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 da cadeia leve de imunoglobulina tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 35, 36 e 37, respectivamente; de preferência, o anticorpo de captura tem uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de polipeptí- deos da SEQ ID No: 28 e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 29.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 16, caracterizado por o primeiro anticorpo de detecção com- preender HCDR1, HCDR2 e HCDR3 da cadeia pesada de imunoglo- bulina tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 2, 3 e 4, respectivamente; e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 da cadeia leve de imu- noglobulina tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 5, 6 e 7, respectivamente; de preferência, o primeiro anticorpo de detec- ção compreende uma região variável da cadeia pesada tendo a se- quência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 8 e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 9.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 17, caracterizado por o segundo anticorpo de detecção com- preender HCDR1, HCDR2 e HCDR3 da cadeia pesada de imunoglo- bulina tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 12, 13 e 14, respectivamente; e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 da cadeia leve de imunoglobulina tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID

NOs: 15, 16 e 17, respectivamente; de preferência, o anticorpo de de- tecção compreende uma região variável da cadeia pesada tendo a se- quência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 18 e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 19.

19. Kit caracterizado por compreender: a. um anticorpo de captura direcionado contra um epítopo tau p217+, opcionalmente um anticorpo de captura independente de fosforila- ção direcionado contra um epítopo tau entre os aminoácidos 150 e 250 da proteína tau; e b. ao menos um anticorpo de detecção direcionado contra um epítopo da proteína tau que compreende os resíduos de aminoáci- dos 7 a 20 ou 116 a 127 da proteína tau.

20. Kit, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por o anticorpo de captura compreender HCDR1, HCDR2 e HCDR3 da cadeia pesada de imunoglobulina tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 32, 33 e 34, respectivamente, e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 da ca- deia leve de imunoglobulina tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 35, 36 e 37, respectivamente; de preferência, o anticorpo de captura tem uma região variável da cadeia pesada que compreende a se- quência de polipeptídeos da SEQ ID No: 28 e uma região variável da ca- deia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 29, e o anti- corpo de captura independente de fosforilação é direcionado contra um epítopo tau que compreende os aminoácidos 159 a 163 da proteína tau.

21. Método, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracte- rizado por: a. o primeiro anticorpo de detecção compreender HCDR1, HCDR2 e HCDR3 da cadeia pesada de imunoglobulina tendo as se- quências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 2, 3 e 4, respectivamente; e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 da cadeia leve de imunoglobulina tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 5, 6 e 7, respectiva- mente; de preferência, o primeiro anticorpo de detecção compreende uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptí- deos da SEQ ID NO: 8 e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 9; e b. o segundo anticorpo de detecção compreender HCDR1, HCDR2 e HCDR3 da cadeia pesada de imunoglobulina tendo as se- quências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 12, 13 e 14, respectiva- mente; e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 da cadeia leve de imunoglobulina tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 15, 16 e 17, respectivamente; de preferência, o anticorpo de detecção compreende uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptí- deos da SEQ ID NO: 18 e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 19.