CN117715925A - 通过共施用Bri2 BRICHOS结构域和脂质微泡和/或纳米液滴促进通过血脑屏障 - Google Patents

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Abstract

提供了一种用于有效递送药物组合物穿过比如血脑屏障等组织并进入CNS中的神经元以治疗哺乳动物的阿尔茨海默病的便利方法，该哺乳动物包括人。该方法包括施用治疗有效量的分离的重组Bri2BRICHOS和脂质微泡的步骤，并且使得增加量的分离的重组蛋白到达脑以有效对抗Aβ42神经毒性。此外，本文描述了用于增强包含Bri2BRICHOS及其变体的蛋白穿过血脑屏障的递送、促进阿尔茨海默病和其他神经疾病的治疗和/或诊断的方法。该方法包括以下步骤：在不存在超声处理的情况下施用治疗有效量的蛋白和脂质微泡，这些蛋白包含作为第一蛋白部分的Bri2BRICHOS及其变体偶联至另一个(非Bri2)第二蛋白或多肽部分。

Description

通过共施用Bri2 BRICHOS结构域和脂质微泡和/或纳米液滴 促进通过血脑屏障
技术领域
本发明属于医学领域。更具体地，本发明涉及物质和药剂用于改善哺乳动物(比如人)阿尔茨海默病的医学治疗的用途。本发明还涉及用于在哺乳动物(包括人)中运输蛋白穿过血脑屏障的物质和药剂。
背景技术
越来越多的神经退行性疾病，例如阿尔茨海默病以及家族性英国痴呆或家族性丹麦痴呆与蛋白错误折叠和聚集有关。这些疾病的特征是蛋白沉积在脑实质和脑动脉中，并以遗传性和散发性形式发生。尽管这些疾病具有不同的临床症状，但它们具有一些共同的病理特征，例如神经元丢失、蛋白聚集和tau蛋白缠结的存在。从生化角度来看，所涉及的蛋白有形成β-折叠结构的倾向，并且容易聚集成淀粉样原纤维。阿尔茨海默病以及家族性英国痴呆或家族性丹麦痴呆表现出一些相似的神经病理学特征。观察到淀粉样斑块、神经原纤维缠结、嗜刚果红淀粉样血管病和神经变性。阿尔茨海默病是人类痴呆最常见的原因之一。它是一种与受影响个体的脑中的神经细胞变性相关的慢性致命疾病，其特征在于存在由淀粉样β-肽(Aβ-肽)的细胞外沉积物组成的淀粉样斑块。Aβ聚集引起的神经细胞萎缩导致乙酰胆碱和其他信号传导物质的缺乏。已知具有40-42个氨基酸残基的Aβ-肽是通过加工淀粉样前体蛋白(APP，695-770个氨基酸残基)产生的，淀粉样前体蛋白是I型膜蛋白，通常由中枢神经系统的神经元表达，但是这种加工的原因还不完全清楚。释放的Aβ肽包含APP跨膜区的一部分(Aβ残基29-40/42)，并包含不一致的螺旋，即由具有高度形成β链倾向的氨基酸构成的螺旋。当Aβ从其稳定膜环境中移除时，很容易发生错误折叠和聚集。
Bri2(SEQ ID NO:1，也称为整合膜蛋白2B，ITM2B)是遍在表达的266个残基的II型膜蛋白(图1)，其功能和折叠结构尚不清楚。Bri2在三个位置被蛋白水解切割；C末端区域中的弗林蛋白酶切割生成23个残基的肽(ABri23)，ADAM10对胞外结构域的加工导致BRICHOS结构域从膜结合的N末端部分释放，SPPL2a/2b进行的膜内切割则释放出细胞内结构域。家族性英国痴呆和家族性丹麦痴呆是由Bri2基因突变引起的，这些突变导致终止密码子丢失，这进而导致C末端部分出现两个不同的11个残基的延伸，并且在弗林蛋白酶切割后，产生34个残基的肽(分别为ABri和ADan)而不是正常释放的ABri23。较长的肽容易聚集成淀粉样原纤维并沉积在脑组织或脑血管中，并伴随神经元丢失和痴呆。
最近的研究表明，Bri2和Aβ共定位于脑实质和血管的淀粉样斑块中，这表明这两种蛋白在错误折叠和聚集过程中的某个阶段相互作用。使用转染的细胞系，发现Bri2与APP相互作用，并通过增加β-分泌酶生成的片段来调节APP加工。含有Bri2和Aβ40的融合蛋白的产生表明Bri蛋白可以影响Aβ聚集特性，并且使用转基因小鼠模型，提出了ABri23与Aβ42相互作用并防止其聚集(Kim等人J.Neurosci.[神经科学杂志]28:6030-6036(2008)；WO2009/009396)。还提出可以通过含有Bri2的前102个氨基酸残基的蛋白来减少或阻止Aβ产生(WO 2006/138355)。
BRICHOS结构域是一种天然存在的伴侣，在10个不同的人类前蛋白家族中发现具有抗淀粉样蛋白特性，其中一个(proSP-C)与淀粉样肺病相关，一个(Bri2/ITM2b)如前所述与淀粉样蛋白相关的痴呆家族性英国痴呆或家族性丹麦痴呆相关。来自proSP-C和Bri2的重组人(rh)BRICHOS结构域在体外和体内延迟Aβ40和Aβ42原纤维形成并减少与Aβ42原纤维形成相关的神经毒性(WO 2011/62655)。
血脑屏障(BBB)的作用是维持神经元正常功能所需的微妙的稳态。BBB还充当靶向脑的物质和药剂的屏障，较大的分子无法自发穿过BBB。然而，BBB提供了将比如药剂、药物和生物药物(比如蛋白)等组合物运输至中枢神经系统(CNS)的有效途径。只有小的亲脂性分子已被证明能够被动地穿过BBB。最近的研究表明，对野生型小鼠进行外周(静脉内)施用后，可以在脑实质中检测到带有用于免疫检测的AU1标签的分离的重组Bri2 BRICHOS蛋白(Bri2BRICHOS-AU1)，而重组proSP-C BRICHOS蛋白只能通过进入脑脊液(CSF)。这表明存在一种未知的Bri2 BRICHOS通过BBB运输的机制(Mikitsh等人Perspect Medicin Chem.[药物化学展望]6:11-24(2014)；Sanchez-Covarrubias等人Curr Pharm Des.[当前药物设计]20:1422-49(2014)；Tambaro等人J Biol Chem.[生物化学杂志]294:2606-2615(2019))。
已经开发了多种方法用于通过BBB递送组合物。聚焦超声与静脉内脂质微泡(MB)相结合，促使BBB局部可逆打开，从而允许将包括蛋白在内的大分子运输到超声靶向的区域周围的脑实质中(Mikitsh等人Perspect Medicin Chem.[透视医学化学]6:11-24(2014)；Brasnjevic等人Prog Neurobiol.[神经生物学进展]87:212-51(2009)；Konofagou等人Theranostics.[治疗诊断学]2:1223-37(2012)；Sierra等人J Cereb Blood Flow Metab.[脑血流和代谢杂志]37:1236-1250(2017))。这些方法需要专门的超声设备。还认为超声处理在某些条件下可能会引起血管损伤。
目前用于治疗阿尔茨海默病的治疗方法主要针对性治疗症状，包括胆碱能替代疗法，例如抑制乙酰胆碱酯酶、与可溶性Aβ寡聚体相互作用的小抑制剂以及防止已经形成的β-折叠结构伸长的所谓β-折叠破坏剂。此外，还关注能够降低治疗性药物的剂量，以便减少与超声处理和其他治疗组合相关的副作用。
发明内容
本发明的一个目的是提供用于治疗哺乳动物(包括人类)的阿尔茨海默病的新治疗选择。
本发明的另一个目的是提供用于有效递送蛋白(例如治疗剂)穿过血脑屏障并进入CNS的稳健且便利的方法和手段。
本发明的一个目的是提供一种简单且有效的方法和手段，用于在阿尔茨海默病的治疗中有效递送Bri2 BRICHOS及其变体穿过血脑屏障。
本发明的另一个目的是降低易于原纤化的蛋白聚集成淀粉样原纤维的趋势，或者甚至防止易于原纤化的蛋白聚集成淀粉样原纤维。
又另一个目的是减少淀粉样斑块的形成，这些斑块由易于原纤化的蛋白在哺乳动物的脑中的细胞外沉积物组成。
本发明的一个目的是影响分离的重组Bri2 BRICHOS及其变体的分布，使得到达脑的分离的重组Bri2 BRICHOS的治疗有效量增加以有效对抗Aβ42神经毒性。
本发明的另一个目的是提供用于哺乳动物(包括人)中阿尔茨海默病和其他神经疾病的改进治疗、体内诊断和预后、和/或成像的蛋白和方法。
本发明总体上基于这样的认识：当与脂质微泡和/或纳米液滴组合施用时，分离的重组蛋白Bri2 BRICHOS及其变体可以有效地递送穿过血脑屏障，而不需要哺乳动物的任何组织的超声处理步骤。出人意料的是，与(a)不存在脂质微泡和/或纳米液滴，和(b)存在超声处理这两种情况相比，在没有超声处理的情况下，与脂质微泡和/或纳米液滴的共同施用实现了Bri2 BRICHOS及其变体的改善的摄取。
本发明还基于这样的认识，即在没有超声处理的情况下，单独的微泡和/或纳米液滴可以用于增强包含Bri2 BRICHOS及其变体的蛋白(其作为第一蛋白部分与另一个(非Bri2)第二蛋白或多肽部分偶联)递送穿过血脑屏障，从而例如促进阿尔茨海默病和涉及该第二蛋白或多肽部分的其他神经疾病的治疗和/或诊断。
对于从以下描述和所附权利要求中将显而易见的这些和其他目的，本发明根据第一方面提供了包含Bri2 BRICHOS及其变体的分离的重组蛋白，用于在治疗阿尔茨海默病的方法中使用。根据第二方面，提供了治疗阿尔茨海默病的方法，该方法包括施用包含Bri2BRICHOS及其变体的分离的重组蛋白和脂质微泡和/或纳米液滴，而不进行任何超声处理。
根据第三方面，提供了一种蛋白，该蛋白包含作为Bri2 BRICHOS及其变体的第一蛋白部分和第二蛋白或多肽部分，及这些与脂质微泡和/或纳米液滴的组合。根据第四方面，该组合可用于在哺乳动物中运输蛋白穿过血脑屏障而无需任何超声处理的方法，
附图说明
图1显示了Bri2(SEQ ID NO:1)和加工位点的示意性梗概图。
图2显示一些哺乳动物Bri2 BRICHOS氨基酸序列(SEQ ID NO:5-10)的比对。
图3显示了实施例中的研究设计。
图4显示了在与脂质微泡和/或纳米液滴一起静脉内注射后，在非FUS靶向的脑半球中检测到了Bri2 BRICHOS，但未检测到proSP-C BRICHOS。
图5显示了在与脂质微泡和/或纳米液滴一起静脉内注射后，在两个半球中均检测到Bri2 BRICHOS。
图6显示了在与脂质微泡和/或纳米液滴一起静脉内注射后，皮质和海马中Bri2BRICHOS-AU1的细胞内免疫染色。
图7显示了与脂质微泡和/或纳米液滴一起全身注射后，Bri2 BRICHOS-AU1在两个脑半球中的蛋白印迹检测。
图8显示了与脂质微泡和/或纳米液滴组合全身注射后，在纹状体中发现Rh Bri2BRICHOS-mCherry。
附加序列表
SEQ ID NO:1人Bri2
SEQ ID NO:2人Bri2(113-231)
SEQ ID NO:3人Bri2(1-89)
SEQ ID NO:4人ABri23[Bri2(244-266)]
SEQ ID NO:5人Bri2BRICHOS[Bri2(137-231)]
SEQ ID NO:6黑猩猩Bri2BRICHOS
SEQ ID NO:7牛Bri2BRICHOS
SEQ ID NO:8猪Bri2BRICHOS
SEQ ID NO:9小鼠Bri2BRICHOS
SEQ ID NO:10大鼠Bri2BRICHOS
SEQ ID NO:11rh Bri2 BRICHOS-AU1
SEQ ID NO:12rh Bri2 BRICHOS-mCherry
具体实施方式
Bri2(SEQ ID NO:1)(也称为整合膜蛋白2B(ITM2B))含有跨残基137-231的进化保守BRICHOS结构域(SEQ ID NO:5)。BRICHOS结构域存在于多于10个不同的蛋白家族中，这些蛋白家族在功能上不相关并在不同的组织中表达。BRICHOS这个名称是指对与软骨肉瘤相关的Bri、软骨调节素-1和与呼吸系统疾病相关的肺表面活性蛋白C前体(proSP-C)中的结构域进行鉴定。
包含哺乳动物Bri2(ITM2B)的BRICHOS结构域的蛋白和结构相似的蛋白具有减少淀粉样原纤维形成以及Aβ肽和ABri/ADan肽聚集的能力。
血脑屏障(BBB)的作用是维持神经元正常功能所需的微妙的稳态，BBB还充当靶向脑的物质和药剂的屏障，较大的分子无法自发穿过BBB。尽管如此，BBB仍提供了将药物组合物作为蛋白运输至中枢神经系统(CNS)的有效途径。只有小的亲脂性分子已被证明能够被动地穿过BBB。
本发明一般基于这样的认识：分离的Bri2 BRICHOS蛋白本身或与第二蛋白或多肽部分偶联，可以与脂质微泡和/或纳米液滴组合地被有效地递送至脑中，并且因此将是有用于治疗阿尔茨海默病。
脂质微泡和/或纳米液滴和分离的蛋白可以组合施用。如本文所用，术语“组合”和/或“组合”是指分离的蛋白和脂质微泡和/或纳米液滴可以彼此独立地以任何顺序单独施用。该术语还可以指重组蛋白和脂质微泡和/或纳米液滴可以单独且同时施用。此外，该术语可以指分离的蛋白和脂质微泡和/或纳米液滴可以在相同的药物组合物中施用。
根据本发明的分离的蛋白可以掺入药物组合物中。此类组合物典型地包括根据本发明的分离的蛋白和合适的药学上可接受的载剂。如本文所用，“合适的药物载剂”包括与药物施用相容的溶剂、分散介质、包衣、等渗剂和吸收延迟剂等。还可以将补充性活性化合物掺入组合物中。
在现有技术方法中，超声是用于触发靶组织处的药物释放的重要局部刺激并且可以由频率为20kHz或更高的压力波组成。与光波和音频波一样，超声波通过介质聚焦、反射和折射。
微泡和/或纳米液滴与超声处理相组合通常用于医学诊断以及将药物组合物和基因非侵入性递送至不同组织。聚焦超声与静脉施用微泡和/或纳米液滴相组合是一种已经在多个体内模型中显示的技术，其以微创的方式有效地将小分子和大分子递送穿过BBB并到达特定靶向的脑区域。该技术涉及将基于脂质的微泡和/或纳米液滴与待递送的药物组合物一起施用。超声波使微泡和/或纳米液滴在脑中的毛细血管内空化。在这些低压下，微泡和/或纳米液滴表现出稳定的空化，从而导致BBB的开口增加。这使得内皮细胞之间的紧密连接短暂松弛，从而导致BBB短暂局部开放。结果，循环中存在的大分子被递送到脑实质中(Galan-Acosta等人Mol Cell Neurosci[分子和细胞神经科学],103498(2020))。
在这里，我们设计了一种有利的方法，用于将组合物有效地递送穿过血脑屏障等组织并进入CNS中的神经元。该方法将分离的蛋白的施用与脂质微泡和/或纳米液滴的施用相组合。重要的是，本方法不涉及超声处理的任何步骤。这是有利的，因为它不需要任何超声设备。此外，与超声处理相关的副作用，例如血管损伤是可以避免的。出人意料的是，与(a)不存在脂质微泡和/或纳米液滴，和(b)存在超声处理这两种情况相比，在没有超声处理的情况下，与脂质微泡和/或纳米液滴的共同施用实现了Bri2 BRICHOS及其变体的改善的摄取。
对于从以下描述中显而易见的这些和其他目的，本发明根据第一方面提供了一种分离的重组蛋白，其选自下组蛋白：由与来自人的Bri2的残基113-231(SEQ ID NO:2)具有至少70％同一性的氨基酸序列组成的组的蛋白；以及包含与来自人(SEQ ID NO:5)、黑猩猩(SEQ ID NO:6)、牛(SEQ ID NO:7)、猪(SEQ ID NO:8)、小鼠(SEQ ID NO:9)和大鼠(SEQ IDNO:10)的Bri2的BRICHOS结构域中的任一个具有至少70％同一性的氨基酸序列的蛋白；条件是所述蛋白不包含与来自人的Bri2的残基1-89(SEQ ID NO:3)具有至少70％同一性的氨基酸序列；并且所述蛋白不包含与人ABri23(SEQ ID NO:4)具有至少70％同一性的氨基酸序列；该分离的重组蛋白用于在治疗有需要的哺乳动物的阿尔茨海默病的方法中使用，该哺乳动物包括人，该方法包括以下步骤：
向所述哺乳动物施用多个脂质微泡和/或纳米液滴
向所述哺乳动物施用所述分离的重组蛋白；其中所述分离的重组蛋白不包含在所述微泡和/或纳米液滴内；以及
其中该方法不包括对哺乳动物的任何组织进行超声处理的任何步骤。
本文实验显示，单独的脂质微泡和/或纳米液滴，即在没有超声处理的情况下，能够介导Bri2 BRICHOS均匀转移穿过BBB，并且当Bri2 BRICHOS和脂质微泡和/或纳米液滴组合施用时，Bri2 BRICHOS被递送到脑实质中，并被皮层以及海马中的神经元有效吸收。
出人意料地发现，当与微泡和/或纳米液滴组合施用时，Bri2 BRICHOS蛋白被递送至野生型小鼠脑。考虑到先前已经开发的各种方法，这是特别出人意料的，在先前已经开发的各种方法中，聚焦超声组合静脉内脂质微泡和/或纳米液滴用于通过允许将包括蛋白在内的大分子运输到超声靶向区域周围的脑实质中而将药物和其他组合物递送穿过BBB。
本发明基于本文披露的出人意料的见解，即微泡和/或纳米液滴本身，无需与哺乳动物任何组织的任何超声处理步骤相组合，就具有介导分离的重组蛋白穿过BBB的转移增加的能力。微泡和/或纳米液滴增加了Bri2 BRICHOS穿过BBB和神经元的摄取。
本发明的该方面的优点在于，可以获得BBB的瞬时和局部打开，而不使用任何另外的处理步骤，例如超声处理和与此类另外的处理相关的另外设备。因此，提供了一种有利的方法，用于将组合物有效地递送穿过血脑屏障等组织并进入CNS中的神经元。如本文所示，另一个优点是，如WO 2011/162655中所述，与单独施用分离的重组蛋白相比，当与脂质微泡和/或纳米液滴组合施用时，分离的重组蛋白进入脑实质的摄取高度地增加。
如整个说明书和所附权利要求中使用的术语“相似度％(％similarity)”是如针对“同一性％”所计算的，除了疏水性残基Ala、Val、Phe、Pro、Leu、Ile、Trp、Met和Cys相似；碱性残基Lys、Arg和His相似；酸性残基Glu和Asp相似；并且亲水性、不带电荷的残基Gln、Asn、Ser、Thr和Tyr相似。在该背景下其余的天然氨基酸Gly与任何其他氨基酸均不相似。
在整个说明书中，可选实施方案代替了指定的同一性百分比而实现了相应的相似度百分比。其他可选实施方案实现了指定的同一性百分比以及另一更高的相似度百分比，其选自每个序列的优选同一性百分比。例如，分离的重组蛋白序列可能与另一个蛋白序列的相似度为70％；或其可能与另一个序列的同一性为70％；或其可能与另一个序列的同一性为70％并且此外，相似度为90％。
为了避免疑问，与来自人的Bri2的残基113-231或Bri2的任何一个BRICHOS结构域至少具有给定同一性的氨基酸序列由多于或等于70个、例如多于或等于80个，例如多于或等于90个氨基酸残基组成。优选的大小范围是70-100个氨基酸残基，比如80-100个氨基酸残基，例如90-100个氨基酸残基。
应注意，来自人(SEQ ID NO:5)、黑猩猩(SEQ ID NO:6)、牛(SEQ ID NO:7)、猪(SEQID NO:8)、小鼠(SEQ ID NO:9)和大鼠(SEQ ID NO:10)的Bri2的BRICHOS结构域高度保守，参见图2中的比对。不期望受任何特定理论束缚，预期BRICHOS结构域相对于Aβ和ABri/ADan肽具有所期望的活性。优选地，根据本发明的分离的重组蛋白选自由包含氨基酸序列的蛋白组成的组，该氨基酸序列与来自人(SEQ ID NO:5)、黑猩猩(SEQ ID NO:6)、牛(SEQ IDNO:7)、猪(SEQ ID NO:8)、小鼠(SEQ ID NO:9)和大鼠(SEQ ID NO:10)的Bri2的BRICHOS结构域中的任一个具有至少80％，优选至少90％，例如至少95％同一性。在优选的实施方案中，根据本发明的分离的重组蛋白含有在来自人(SEQ ID NO:5)、黑猩猩(SEQ ID NO:6)、牛(SEQ ID NO:7)、猪(SEQ ID NO:8)、小鼠(SEQ ID NO:9)和大鼠(SEQ ID NO:10)的Bri2的BRICHOS结构域中保守的所有氨基酸残基，即SEQ ID NO:5的所有氨基酸残基，除了残基42、76和82(对应于全长Bri2，即SEQ ID NO:1的残基178、212和218)。在具体的实施方案中，根据本发明的分离的重组蛋白选自由以下组成的组：包含来自人(SEQ ID NO:5)、黑猩猩(SEQID NO:6)、牛(SEQ ID NO:7)、猪(SEQ ID NO:8)、小鼠(SEQ ID NO:9)和大鼠(SEQ ID NO:10)的Bri2的BRICHOS结构域中的任一个的蛋白，即它含有这些BRICHOS结构域之一，优选人BRICHOS结构域(SEQ ID NO:5)。
在优选的实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中的位置221的氨基酸残基选自由Glu和Asp组成的组。在具体的实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中的位置221的氨基酸残基是Glu。
与之前的教导相反，根据本发明的分离的重组蛋白不包含与来自人的Bri2的残基1-89(SEQ ID NO:3)具有至少70％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，根据本发明的分离的重组蛋白不包含与来自人的Bri2的残基1-89(SEQ ID NO:3)具有至少50％同一性的氨基酸序列。这意味着根据本发明的分离的重组蛋白包含与来自人的Bri2的残基113-231(SEQ ID NO:2)和/或哺乳动物Bri2BRICHOS结构域(SEQ ID NO:5-10)显示高度相似性或同一性的核心氨基酸序列，以及任选的一个或多个其他氨基酸序列，这些其他氨基酸序列可能与来自人的Bri2的残基1-89(SEQ ID NO:3)不显示高度相似性或同一性。
为避免疑问，短于10个氨基酸残基的氨基酸序列在从根据本发明的分离的重组蛋白中排除的情况下不被认为是相关的。因此，根据本发明的分离的重组蛋白不包含由多于或等于10个与来自人的Bri2的残基1-89(SEQ ID NO:3)具有至少给定的同一性的氨基酸残基组成的氨基酸序列。
此外，根据本发明的分离的重组蛋白不包含与来自人的Bri2的残基244-266，即人ABri23(SEQ ID NO:4)具有至少70％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，根据本发明的分离的重组蛋白不包含与人ABri23(SEQ ID NO:4)残基具有至少50％同一性的氨基酸序列。如上所述，这意味着根据本发明的分离的重组蛋白包含与来自人的Bri2的残基113-231(SEQ ID NO:2)和/或哺乳动物Bri2 BRICHOS结构域(SEQ ID NO:5-10)显示高度相似性或同一性的核心氨基酸序列，以及任选的一个或多个其他氨基酸序列，这些其他氨基酸序列可能与人ABri23(SEQ ID NO:4)不显示高度相似性或同一性。
为避免疑问，短于10个氨基酸残基的氨基酸序列在从根据本发明的分离的重组蛋白中排除的情况下不被认为是相关的。因此，根据本发明的分离的重组蛋白不包含由多于或等于10个与人ABri23(SEQ ID NO:4)具有至少给定的同一性的氨基酸残基组成的氨基酸序列。
在优选的实施方案中，根据本发明使用的分离的重组蛋白选自由以下组成的组：包含与来自人的Bri2的残基113-231(SEQ ID NO:2)具有至少70％同一性的氨基酸序列的蛋白；以及包含与来自人的Bri2的BRICHOS结构域(SEQ ID NO:5)具有至少70％同一性的氨基酸序列的蛋白。
在优选的实施方案中，分离的重组蛋白选自下组：由与来自人的Bri2的残基113-231(SEQ ID NO:2)具有至少70％同一性的氨基酸序列组成的蛋白；以及包含与来自人(SEQID NO:5)、黑猩猩(SEQ ID NO:6)、牛(SEQ ID NO:7)、猪(SEQ ID NO:8)、小鼠(SEQ ID NO:9)和大鼠(SEQ ID NO:10)的Bri2的BRICHOS结构域中的任一个具有至少70％同一性的氨基酸序列的蛋白；条件是所述蛋白不包含与来自人的Bri2的残基1-89(SEQ ID NO:3)具有至少70％同一性的氨基酸序列；并且所述蛋白不包含与人ABri23(SEQ ID NO:4)具有至少70％同一性的氨基酸序列；该分离的重组蛋白用于在治疗有需要的哺乳动物的阿尔茨海默病的方法中使用，该哺乳动物包括人，该方法由以下步骤组成：
向所述哺乳动物施用多个脂质微泡和/或纳米液滴
向所述哺乳动物施用所述分离的重组蛋白；
其中所述分离的重组蛋白不包含在所述微泡和/或纳米液滴内。
在具体的实施方案中，分离的重组蛋白与脂质微泡和/或纳米液滴的组合用于在治疗有需要的哺乳动物(包括人)的阿尔茨海默病的方法中使用，该方法包括以下步骤：
向所述哺乳动物施用多个脂质微泡和/或纳米液滴
向所述哺乳动物施用所述分离的重组蛋白；
其中所述分离的重组蛋白不包含在所述微泡和/或纳米液滴内；以及
其中该方法不包括对哺乳动物的任何组织进行超声处理的任何步骤。
在具体的实施方案中，分离的重组蛋白与脂质微泡和/或纳米液滴的组合用于在治疗有需要的哺乳动物(包括人)的阿尔茨海默病的方法中使用，该方法由以下步骤组成：
向所述哺乳动物施用多个脂质微泡和/或纳米液滴
向所述哺乳动物施用所述分离的重组蛋白；
其中所述分离的重组蛋白不包含在所述微泡和/或纳米液滴内。
包含分离的重组蛋白的药物组合物可用作药物，特别是用于治疗哺乳动物(包括人)的病症例如阿尔茨海默病。
将药物组合物配制成与其预期的施用途径相容。施用途径的实例包括肠胃外(例如静脉内、动脉内)、腹膜内、肌内、皮内和鼻内。
微泡和/或纳米液滴以及分离的重组蛋白的施用可以包括注射。
可以通过以下各项来制备无菌可注射溶液：将根据本发明的分离的重组蛋白以所需的量，根据需要，与一种以上列举的成分或这些成分的组合掺入适当的溶剂中，然后进行过滤灭菌。一般而言，可以通过将本发明的分离的重组蛋白掺入含有分散介质和其他所需成分的无菌媒剂中来制备分散体。就用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末而言，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥，这些方法产生根据本发明的分离的重组蛋白的粉末以及来自其以前的无菌过滤溶液的任何另外的所期望的成分。
一般而言，可以制备脂质微泡和/或纳米液滴的无菌可注射溶液，如描述于例如Feshitan,J.A.等人,J.Colloid Interface Sci.[胶体和界面科学杂志]329(2),316-324(2009)。简言之，气体全氟丁烷(PFB)可用于形成微泡和/或纳米液滴。PFB可以充当气体核心，可以将气体核心引入以激活脂质微泡和/或纳米液滴，并且随后将微泡和/或纳米液滴分离。微泡和/或纳米液滴可以包被有1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)和聚氧乙烯-40硬脂酸酯(PEG40S)DSPC和PEG40S。获得的干燥脂质膜可以用过滤的PBS水合并混合成最终的脂质悬浮液。
可以对脂质混合物进行超声处理，以便将脂质聚集体分散成小的单层脂质体。PFB气体可通过使其流过脂质悬浮液的表面而引入。随后，可以对气液界面处的悬浮液应用更高功率的超声处理以产生微泡和/或纳米液滴。分离后，可以将根据本发明的微泡和/或纳米液滴掺入无菌媒剂中，例如，可以将微泡和/或纳米液滴悬浮液收集到30mL注射器中，可以通过离心实现洗涤和大小分级，以便将悬浮液中的所有微泡和/或纳米液滴收集到靠在注射器柱塞上的饼中。可以将剩余的悬浮液(在下方游动(infranatant))(其可能含有未形成微泡壳的一部分的残余脂质和囊泡)再循环以产生下一批微泡和/或纳米液滴。所有所得滤饼可合并并重新悬浮于PBS中以提高总产率。
在某些实施方案中，所述分离的重组蛋白和所述脂质微泡和/或纳米液滴通过静脉内施用。
当将根据本发明的分离的蛋白施用于动物(例如人)以治疗阿尔茨海默病时，医师、兽医或研究人员可以，例如首先开出相对低的剂量的处方，随后增加剂量直到获得适当的响应。另外，应理解，针对任何特定动物受试者的特定剂量水平将取决于多种因素，包括所用的特定的分离的重组蛋白的活性，受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食，施用时间、施用途径和排泄速率、任何药物组合以及要调节的表达或活性程度。
从细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于配制一系列的用于在人中使用的剂量。
剂量可根据所应用的剂型和所使用的施用途径在所述范围内变化。对于本发明的方法中使用的任何化合物，治疗有效剂量最初可以从细胞培养测定中估计，其中，例如观察原纤维形成的速率或细胞死亡的速率。可以在动物模型中配制剂量，以达到在细胞培养中确定的循环血浆浓度范围，该范围包括IC50(即，供试化合物达到半数最大症状抑制的浓度)。此类信息可用于更精确地确定在人中有用的剂量。可以例如通过高效液相色谱法来测量血浆中的水平。
如本文所定义，根据本发明的分离的重组蛋白的治疗有效量(即，有效剂量)范围为约1至50mg/kg体重。在一个实施方案中，施用至少1mg/kg、例如至少5mg/kg、更优选例如至少10mg/kg的治疗有效量的所述分离的重组蛋白。
在另一个实施方案中，施用小于50mg/kg、例如小于30mg/kg、更优选小于20mg/kg的治疗有效量的分离的重组蛋白。
分离的重组蛋白可以在延长的时间内施用给受试者，例如在受试者的一生中。1mg/kg至50mg/kg体重的剂量通常是合适的。通过将分离的重组蛋白与根据本发明的脂质微泡和/或纳米液滴组合施用，能够施用比先前在WO 2011/162655中描述的剂量显著更低的分离的重组蛋白。脂质微泡和/或纳米液滴的施用导致BBB的局部和可逆打开，从而允许有效运输分离的重组蛋白进入脑实质和增加分离的重组蛋白进入脑实质的摄取。本发明的这个方面也是有利的，因为与用于治疗患有阿尔茨海默病或处于患阿尔茨海默病风险(或易患阿尔茨海默病)的受试者的预防性和治疗性方法的治疗性组合物的施用相关的副作用的风险被最小化。
在一些情况下，脂质微泡和/或纳米液滴以及分离的重组蛋白可以每周施用一次，持续约1至10周，优选2至8周，更优选约3至7周，甚至更优选持续约4、5或6周。也可以长期施用化合物。技术人员将理解，某些因素可以影响有效治疗受试者所需的剂量和时程，包括但不限于疾病或障碍的严重性、先前的治疗、受试者的一般健康状况和/或年龄，以及存在的其他疾病。此外，用治疗有效量的脂质微泡和/或纳米液滴以及分离的重组蛋白治疗受试者可以包括单次治疗，或者优选地可以包括一系列治疗。
在进一步的实施方案中，分离的蛋白选自由以下组成的组：包含与来自人的Bri2的残基113-231(SEQ ID NO:2)具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列的蛋白；以及包含与来自人的Bri2的BRICHOS结构域(SEQ ID NO:5)具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列的蛋白。
在优选的实施方案中，分离的蛋白选自由以下组成的组：来自人的Bri2的残基113-231(SEQ ID NO:2)；以及来自人的Bri2的BRICHOS结构域(SEQ ID NO:5)。
根据相关方面，本发明提供了选自下组的分离的蛋白：包含与来自人(SEQ ID NO:5)、黑猩猩(SEQ ID NO:6)、牛(SEQ ID NO:7)、猪(SEQ ID NO:8)、小鼠(SEQ ID NO:9)和大鼠(SEQ ID NO:10)的Bri2的BRICHOS结构域中的任一个具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性的氨基酸序列的蛋白。
在另一个实施方案中，分离的蛋白选自由以下组成的组：包含来自人(SEQ ID NO:5)、黑猩猩(SEQ ID NO:6)、牛(SEQ ID NO:7)、猪(SEQ ID NO:8)、小鼠(SEQ ID NO:9)和大鼠(SEQ ID NO:10)的Bri2的BRICHOS结构域中的任一个的蛋白。
在具体的实施方案中，分离的蛋白自由以下组成的组：来自人(SEQ ID NO:5)、黑猩猩(SEQ ID NO:6)、牛(SEQ ID NO:7)、猪(SEQ ID NO:8)、小鼠(SEQ ID NO:9)和大鼠(SEQID NO:10)的Bri2的BRICHOS结构域中的任一个。
在某些实施方案中，分离的蛋白由少于或等于200个氨基酸残基，例如少于或等于150个氨基酸或甚至100个氨基酸残基组成。在某些实施方案中氨基酸残基，分离的蛋白由多于或等于90个氨基酸残基、比如多于或等于100个氨基酸残基组成。
分离的蛋白的优选大小范围是80-200个氨基酸残基，例如90-150个氨基酸残基，例如90-100个氨基酸残基。
微泡和/或纳米液滴是小的充气微球。它们可能由被脂质、脂聚合物或聚合物壳包围的气体组成。它们的大小也可能与红细胞相似，范围为0.5-10μm。
当施加声能场时，充气的微泡和/或纳米液滴会振荡和振动。具有与血流相互作用的亲水外层和容纳气体分子的疏水内层的微泡和/或纳米液滴是热力学最稳定的。空气、六氟化硫和全氟化碳气体可以作为微泡内部的组分。为了提高血液中的稳定性和持久性，高分子量且在血液中溶解度低的气体是微泡气体核心的有吸引力的候选者。微泡和/或纳米液滴可用于药物递送，它们不仅可以用作药物媒剂，还可以作为渗透其他不可穿透的屏障(特别是血脑屏障)的手段。
在本发明的进一步的实施方案中，微泡和/或所述纳米液滴被脂质包被。
如本文公开的，微泡和/或纳米液滴可包含1,2-二硬脂醇-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二硬脂醇-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(甲氧基(聚乙二醇)2000)和全氟丁烷气体核心。微泡和/或纳米液滴可以例如包含六氟化硫、聚乙二醇(PEG，Macrogol)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰甘油钠和棕榈酸。
在本发明的优选的实施方案中，根据本发明的各个微泡和/或纳米液滴具有在1-8μm范围内的直径，例如2-6μm，例如4-5μm。
技术人员将理解，上面关于本披露的第一方面讨论的实施方案同样相关并且适用于本文披露的第二、第三和另外的方面。这特别适用于与分离的重组蛋白和脂质微泡和/或纳米液滴相关的实施方案，本发明的组合使得重组的分离的蛋白有效且均匀地转移穿过BBB并进入脑实质中，以及被皮层和海马中的神经元有效摄取，并适用于与施用方式和途径相关的实施方案。为了简洁起见，这里不再重复或仅简单提及。
在本发明的第二方面，提供了治疗有需要的哺乳动物(包括人)的阿尔茨海默病的方法，该方法包括以下步骤：
向所述哺乳动物施用多个脂质微泡和/或纳米液滴
向所述哺乳动物施用选自下组的分离的重组蛋白：由与来自人的Bri2的残基113-231(SEQ ID NO:2)具有至少70％同一性的氨基酸序列组成的蛋白；以及包含与来自人(SEQID NO:5)、黑猩猩(SEQ ID NO:6)、牛(SEQ ID NO:7)、猪(SEQ ID NO:8)、小鼠(SEQ ID NO:9)和大鼠(SEQ ID NO:10)的Bri2的BRICHOS结构域中的任一个具有至少70％同一性的氨基酸序列的蛋白；条件是所述蛋白不包含与来自人的Bri2的残基1-89(SEQ ID NO:3)具有至少70％同一性的氨基酸序列；并且所述蛋白不包含与人ABri23(SEQ ID NO:4)具有至少70％同一性的氨基酸序列；
其中所述分离的重组蛋白不包含在所述微泡和/或纳米液滴内；并且其中该方法不包括对哺乳动物的任何组织进行超声处理的任何步骤。
在第二方面的实施方案中，提供了治疗有需要的哺乳动物(包括人)的阿尔茨海默病的方法，该方法由以下步骤组成：
向所述哺乳动物施用多个脂质微泡和/或纳米液滴
向所述哺乳动物施用选自下组的分离的重组蛋白：由与来自人的Bri2的残基113-231(SEQ ID NO:2)具有至少70％同一性的氨基酸序列组成的蛋白；以及包含与来自人(SEQID NO:5)、黑猩猩(SEQ ID NO:6)、牛(SEQ ID NO:7)、猪(SEQ ID NO:8)、小鼠(SEQ ID NO:9)和大鼠(SEQ ID NO:10)的Bri2的BRICHOS结构域中的任一个具有至少70％同一性的氨基酸序列的蛋白；条件是所述蛋白不包含与来自人的Bri2的残基1-89(SEQ ID NO:3)具有至少70％同一性的氨基酸序列；并且所述蛋白不包含与人ABri23(SEQ ID NO:4)具有至少70％同一性的氨基酸序列；
其中所述分离的重组蛋白不包含在所述微泡和/或纳米液滴内。
作为本发明的另一方面，提供了由来自人的Bri2的残基113-231(SEQ ID NO:2)组成的分离的重组蛋白。
本发明提供了治疗处于阿尔茨海默病风险(或易患阿尔茨海默病)的受试者的预防性和治疗性方法两者。如本文所用，术语“治疗”被定义为向患者应用或施用根据本发明的分离的重组蛋白和脂质微泡和/或纳米液滴，或者向来自患有阿尔茨海默病、具有疾病症状或易患疾病的体质的患者的分离的组织或细胞系应用或施用根据本发明的分离的重组蛋白和脂质微泡和/或纳米液滴，目的是治愈、愈合、缓解、减轻、改变、补救、改进、改善或影响疾病、疾病症状或易患疾病的体质。在具体实施方案中，治疗选自由预防性治疗、姑息性治疗和治愈性治疗组成的组。
在一个方面，本发明提供了一种用于通过向受试者施用根据本发明的减少多肽聚集的分离的重组蛋白和脂质微泡和/或纳米液滴来预防与由Aβ肽和/或ABri/ADan肽引起的原纤维形成相关的疾病或病症(即，降低感染风险，或降低与疾病或病症相关的症状出现的速率)的方法。可以通过例如本领域已知的适当的诊断或预后测定中任一种或组合来鉴定处于阿尔茨海默病风险的受试者。可以在疾病特征性症状表现之前施用预防剂，从而防止或可替代地延缓疾病的进展。
可以将根据本发明的分离的重组蛋白和脂质微泡和/或纳米液滴以治疗有效剂量施用于患者以预防、治疗或改进涉及与阿尔茨海默病相关的原纤维形成的障碍。治疗有效剂量是指足以导致障碍症状减轻的化合物的量。此类化合物的毒性和治疗功效可以通过如上所述的标准制药程序确定。
根据本发明的不同方面，Bri2 BRICHOS蛋白及其变体通过提供改善例如药物的治疗性潜力和药物靶向、体内诊断和预后以及体内成像的独特优势，可用于蛋白或多肽如治疗剂、抗体和蛋白标签的递送。因此，蛋白可以包含至少一种另外的蛋白或多肽部分，其中该蛋白部分可以是生物聚合物、寡聚物和寡肽，例如肽和多肽。
作为本发明的第三方面，提供了一种分离的蛋白，其包含
(i)选自下组的第一蛋白部分：包含与来自人的Bri2的残基113-231(SEQ ID NO:2)具有至少70％同一性的氨基酸序列的蛋白；以及包含与来自人(SEQ ID NO:5)、黑猩猩(SEQ ID NO:6)、牛(SEQ ID NO:7)、猪(SEQ ID NO:8)、小鼠(SEQ ID NO:9)和大鼠(SEQ IDNO:10)的Bri2的BRICHOS结构域中的任一个具有至少70％同一性的氨基酸序列的蛋白；以及
(ii)第二蛋白或多肽部分，优选含有至少50个氨基酸残基；
其中所述分离的蛋白不包含与来自人的Bri2的残基1-89(SEQ ID NO:3)具有至少70％同一性的氨基酸序列；并且
其中所述分离的蛋白不包含与人ABri23(SEQ ID NO:4)具有至少70％同一性的氨基酸序列。
当与微泡和/或纳米液滴组合使用时，包含第一蛋白部分的蛋白通过提供用于治疗和疗法、体内诊断和预后以及体内成像的药物的组织特异性靶向和/或释放而在其体内治疗性应用方面是独特的。
Bri2 BRICHOS结构域提供了在哺乳动物中运输第二蛋白或多肽部分穿过血脑屏障的能力，而无需任何超声处理。包含Bri2 BRICHOS结构域和第二蛋白或多肽部分(例如蛋白药物、多肽药物、蛋白标签、荧光蛋白、抗体、酶和/或神经营养因子)的分离的蛋白是有利的，因为它有利于和增强了阿尔茨海默氏病和其他神经疾病的治疗。
在实施方案中，分离的蛋白的第一蛋白部分选自下组：包含与来自人(SEQ ID NO:5)、黑猩猩(SEQ ID NO:6)、牛(SEQ ID NO:7)、猪(SEQ ID NO:8)、小鼠(SEQ ID NO:9)和大鼠(SEQ ID NO:10)的Bri2的BRICHOS结构域中的任一个具有至少70％，优选至少80％、85％、90％、95％或99％的同一性的氨基酸序列的蛋白。
在另一个实施方案中，第一蛋白部分选自下组：包含来自人(SEQ ID NO:5)、黑猩猩(SEQ ID NO:6)、牛(SEQ ID NO:7)、猪(SEQ ID NO:8)、小鼠(SEQ ID NO:9)和大鼠(SEQID NO:10)的Bri2的BRICHOS结构域中的任一个的蛋白。
在本发明的一个实施方案中，分离的蛋白的第一蛋白部分选自下组：包含与来自人的Bri2的残基113-231(SEQ ID NO:2)和来自人的Bri2的BRICHOS结构域(SEQ ID NO:5)中的任一个具有至少70％，优选至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列的蛋白。
在另一个实施方案中，第一蛋白部分选自由以下组成的组：来自人的Bri2的残基113-231(SEQ ID NO:2)；以及来自人的Bri2的BRICHOS结构域(SEQ ID NO:5)。
在一个实施方案中，第一蛋白部分中对应于SEQ ID NO:1中的位置221的氨基酸残基选自由Glu和Asp组成的组，优选Glu。
在一个实施方案中，第一蛋白部分由少于或等于200个氨基酸残基、例如少于或等于150个氨基酸残基组成。在一个实施方案中，第一蛋白部分由多于或等于90个氨基酸残基组成。
一般来说，将大的治疗性分子递送到脑中以治疗中枢神经系统(CNS)疾病是药物开发的主要挑战。BBB的作用是限制物质从循环血液向CNS运动。因此，只有大约0.1％的循环抗体穿过完整的BBB，严重限制了抗体疗法对CNS疾病的治疗效用。此外，BBB将100％的大分子神经治疗药物和所有小分子药物中的98％以上排除在脑之外。
在一个实施方案中，分离的蛋白不包含第一蛋白部分和Bri2-BRICHOS序列与第二蛋白或多肽部分之间的切割位点。在另一个实施方案中，分离的蛋白在第一蛋白部分和Bri2-BRICHOS序列与第二蛋白或多肽部分之间含有切割位点，例如Bri2中的切割位点，其在天然蛋白中被前蛋白转化酶天然切割以释放Abri肽。
本发明的一个目的是提供分离的蛋白，其中分离的蛋白的第二蛋白或多肽部分含有50至2000个氨基酸残基，例如50至1000个氨基酸残基，例如50至500个氨基酸残基，例如50至100个氨基酸残基。在本发明的另一个目的中，分离的蛋白的第二蛋白或多肽部分的大小是5-200kDa，例如5-100kDa，例如5-50kDa，例如5-10kDa。
发明人出人意料地发现，包含Bri2 BRICHOS和第二蛋白或多肽部分的分离的蛋白尽管其大小较大，但仍可以穿过BBB。
在本发明的一些实施方案中，分离的蛋白的第一蛋白部分直接或间接连接至第二蛋白或多肽部分的氨基末端或羧基末端。
在本发明的另一个实施方案中，分离的蛋白的第二蛋白或多肽部分构成分离的蛋白的氨基末端和/或羧基末端。
如前所述，BBB经常阻碍大的治疗性分子(例如蛋白药物、多肽药物、蛋白标签、荧光蛋白、抗体、酶和/或神经营养因子)的脑递送。
蛋白和多肽药物可用于替代特定疾病中异常或缺乏的蛋白。它们还可以增加人体有益蛋白的供应，以帮助减少疾病治疗的影响。常见且广泛使用的蛋白药物的实例是胰岛素、干扰素α和白细胞介素2。
蛋白标签是移植到蛋白上的肽序列，例如基因移植到重组蛋白上。
使用增溶标签，特别是用于在分子伴侣缺乏的物种(例如大肠杆菌)中表达的重组蛋白，以帮助蛋白正确折叠并防止其沉淀。
表位标签是短肽序列，之所以选择它是因为可以在许多不同物种中可靠地产生高亲和力抗体。
荧光标签和蛋白用于提供蛋白的视觉读出。它们可用于标记细胞、组织或器官中的组分，以便可以使用荧光光谱、荧光显微镜和其他成像技术对其进行研究。GFP及其变体是最常用的荧光标签。另一方面，mCherry是单体红色荧光蛋白(mRFP)的mFruits家族的成员，属于用作在实验中可视化基因并分析其功能的工具的荧光蛋白发色团的组。
在另一个实施方案中，分离的蛋白的第二蛋白或多肽部分选自由蛋白药物、多肽药物、蛋白标签、荧光蛋白、抗体、酶和/或神经营养因子组成的组。
抗体，也称为免疫球蛋白(Ig)，是较大的Y形蛋白，免疫系统使用它来鉴别和中和异物，例如致病细菌和病毒。利用它们的结合机制，抗体被广泛用于疗法中，其中它们被用来治疗疾病，例如类风湿性关节炎、多发性硬化症、牛皮癣和许多形式的癌症。已研究和/或用于治疗阿尔茨海默病的单克隆抗体是阿杜那单抗(aducanumab)、甘特内鲁单抗(gantenerumab)、3D6(巴皮尼珠单抗(bapineuzumab))和m266(茄尼醇单抗(solanezumab))。
在优选的实施方案中，分离的蛋白的第二蛋白或多肽部分是抗体。
神经营养因子(NTF)是生物分子家族，几乎全部都是支持发育和成熟神经元的生长、存活和分化的肽或小蛋白。神经营养因子还促进中枢神经系统和周围神经系统中的神经元的初始生长和发育，并且它们能够在试管和动物模型中再生受损的神经元。靶组织还释放一些神经营养因子，以引导发育中的轴突生长。在研究中，神经营养因子通常与其他技术结合使用，神经营养因子可以固定到支架结构上。在神经药物递送系统中，它们被松散地固定，以便可以在指定的时间和以指定的量选择性地释放。
在一个实施方案中，分离蛋白的第二蛋白或多肽部分是选自由以下组成的组的神经营养因子：脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、神经营养因子-3、神经营养因子-4、睫状神经营养因子(CNTF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、肝配蛋白、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板源性生长因子(PDGF)和/或白细胞介素。
酶是充当生物催化剂并加速化学反应的蛋白。许多维持生命并加速体内所有生化过程的化学相互转化都需要酶。这些特征使它们有别于其他类型的药物。由于这些特征，酶在医学上被广泛使用，无论是单独使用还是与其他疗法结合使用，目的是安全治疗各种疾病。用于各种障碍的治疗和不同疗法的治疗性酶的实例是α-L-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺4-硫酸酯酶、α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖脑苷脂酶和/或溶酶体酸性脂肪酶。
在另一个实施方案中，分离的蛋白的第二蛋白或多肽部分选自由以下组成的组：α-L-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺4-硫酸酯酶、α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖脑苷脂酶和/或溶酶体酸性脂肪酶。
融合蛋白是通过连接两个或更多个最初编码单独蛋白的基因而产生的蛋白。这些融合基因的翻译产生具有衍生自每个本来蛋白的功能特性的单蛋白。重组融合蛋白是通过重组DNA技术人工产生的，用于生物研究或疗法中。
在本发明的一些实施方案中，分离的蛋白是重组融合蛋白。
化学连接是化学连接两个或更多个蛋白分子的过程，例如将第一蛋白部分化学连接至第二蛋白或多肽部分。化学连接能够将部分(例如蛋白、多肽、蛋白药物、标签和荧光分子)附接到另一个蛋白分子上，以便运输到并靶向细胞和组织，提供靶标特异性疗法和治疗，和/或改进的体内诊断和预后、成像以及帮助检测一种或多种分子。
在本发明的另一个实施方案中，分离的蛋白的第一蛋白部分化学连接至所述第二蛋白或多肽部分。
作为本发明的另一方面，提供了如上文所披露的分离的蛋白和多个脂质微泡和/或纳米液滴的组合，其中所述分离的蛋白不包含在所述微泡和/或所述纳米液滴内。
在一个实施方案中，提供了一种试剂盒，其包含如上文所披露的分离的蛋白和多个脂质微泡和/或纳米液滴，其中分离的蛋白不包含在所述微泡和/或所述纳米液滴内。
除非药物穿过BBB，否则脑穿透性分子、重组蛋白和/或生物制剂通常不会成功。因此，BBB药物输送是未来开发脑新疗法的限制因素。
发明人设计了一种用于将组合物有效递送穿过BBB等组织并进入CNS中的神经元中的便利方法。
为了这些和其他目的，根据本发明的另外的方面，本发明提供了一种用于在有需要的哺乳动物(包括人)中运输本文披露的分离的蛋白穿过血脑屏障的方法，该方法由以下步骤组成：
向所述哺乳动物施用多个脂质微泡和/或纳米液滴；以及
向所述哺乳动物施用所述分离的蛋白。
在具体实施方案中，该方法不包括对哺乳动物的任何组织进行超声处理的任何步骤。根据又另外的方面，本发明提供了本文披露的分离的蛋白，其用于涉及在有需要的哺乳动物(包括人)中运输所述分离的蛋白穿过血脑屏障的治疗方法中，该治疗方法包括以下步骤：
向所述哺乳动物施用多个脂质微泡和/或纳米液滴；
向所述哺乳动物施用所述分离的蛋白；
其中所述分离的蛋白不包含在所述微泡和/或所述纳米液滴内。
在某个实施方案中，该方法不包括对哺乳动物的任何组织进行超声处理的任何步骤。
在具体的实施方案中，提供了本文披露的分离的蛋白，其用于涉及在有需要的哺乳动物(包括人)中运输所述分离的蛋白穿过血脑屏障的治疗方法中，该治疗方法由以下步骤组成：
向所述哺乳动物施用多个脂质微泡和/或纳米液滴；以及
向所述哺乳动物施用所述分离的蛋白；
其中所述分离的蛋白不包含在所述微泡和/或所述纳米液滴内。
出人意料地发现，与脂质微泡和/或纳米液滴一起施用后2小时，在脑实质中检测到与短肽标签或与球状蛋白融合的rh Bri2 BRICHOS。通过免疫组织化学和蛋白印迹对脑实质进行的分析清楚地表明，在施用rh Bri2 BRICHOS-AU1与微泡和/或纳米液滴后，两个半球中递送的蛋白的分布相似，其中在皮质、海马和脉络丛中具有强染色。观察到与微泡和/或纳米液滴一起递送的rh Bri2BRICHOS-AU1被细胞内化，这与从FUS介导的rh Bri2BRICHOS-AU1递送获得的结果一致(Galan-Acosta等人,Mol Cell Neurosci.[分子和细胞神经科学]2020:103498)。Bri2不仅在CNS中表达，还在外周组织中表达，并且可以预见存在允许两个位点之间串扰的运输系统。
药物进入脑脊液(CSF)的运输不能外推至通过BBB，与该概念一致，可以注意到，在小鼠静脉内注射后，在CSF中检测到了另一种BRICHOS蛋白rh proSP-C BRICHOS，但脑匀浆中未发现。这表明通过血液CSF屏障并不能确保运输穿过BBB或进入脑实质(Tambaro等人JBiol Chem.[生物化学杂志]294:2606-2615(2019))。不同脑区域之间的BBB的渗透性不同，例如在靠近脉络丛的区域中和在脑室周围区域中，渗透性高于脑的其他区域。
此外，通过夹心ELISA对到达脑实质的总rh Bri2 BRICHOS结构域进行的定量分析显示两个半球中都有大量的rh Bri2 BRICHOS-AU1。根据该分析，注射后2小时，在脑中检测到与脂质微泡和/或纳米液滴一起施用的完全注射的rh Bri2 BRICHOS结构域的1％，这比在没有微泡和/或纳米液滴的情况下(Tambaro等人,J Biol Chem.[生物化学杂志]2019；294(8):2606-15)或在有微泡和/或纳米液滴加FUS的情况下(Galan-Acosta等人,Mol CellNeurosci.[分子和细胞神经科学]2020:103498)施用rh Bri2 BRICHOS-AU1时观察到的通过多2-10倍。就rh Bri2BRICHOS-mCherry融合蛋白而言，微泡和/或纳米液滴介导的BBB通过增加的程度并未定量，但结果表明，只有当融合蛋白与微泡和/或纳米液滴一起施用时，才能在脑中检测到融合蛋白的效果。
综上所述，目前的数据表明，微泡和/或纳米液滴显著增加了rh Bri2BRICHOS通过BBB，当它与大的30kDa球状蛋白融合时也是如此。药物与脂质纳米颗粒的掺入或关联可以增加生物利用度，但在本发明中，rh Bri2 BRICHOS蛋白和微泡和/或纳米液滴是独立施用的，使得rh Bri2 BRICHOS不太可能与微泡和/或纳米液滴一起通过BBB。不希望受任何特定理论的束缚，发明人怀疑，在存在微泡和/或纳米液滴的情况下，rh Bri2 BRICHOS或rhBri2 BRICHOS-mCherry通过BBB的增加是由rh Bri2 BRICHOS在循环中的半衰期延长所介导的。增加rh Bri2 BRICHOS在循环中半衰期的其他手段很可能会增加其通过BBB的能力，并且与其他蛋白(包括例如抗体、酶或神经营养因子)融合的rh Bri2BRICHOS可能会增加它们通过进入脑实质的能力，因为功能性mCherry现在被证明能够被运输进入野生型小鼠的脑中。
本发明的发现表明，在存在微泡和/或纳米液滴的情况下，rh Bri2 BRICHOS通过BBB进入脑实质的程度(注射剂量的1％)高于外周施用的抗体所观察到的程度(注射剂量的约0.1％)(Bard等人Nat Med.[自然医学]2000；6(8):916-919和Zuchero等人2016；89(1):70-82)。Rh Bri2 BRICHOS BBB通过同样明显比旨在改善CNS摄取的亲和体(其在注射后仅在脑脊液中检测到少量)更有效(Meister等人Int J Mol Sci.[国际分子科学杂志]2020；21(8))。
还预期可以通过基因疗法，比如通过使用表达载体、质粒或病毒转染神经系统(优选地脑)中的细胞来施用根据本发明的分离的蛋白，使得分离的蛋白由中枢神经系统中的这些细胞表达。这可用于治疗阿尔茨海默病。这也可能有助于治疗其他神经疾病。
现在将通过以下非限制性实施例进一步说明本发明。
实施例
这些实施例证明微泡可用于增强Bri2 BRICHOS及其融合蛋白穿过BBB的递送并促进AD和其他神经疾病的治疗。
重组蛋白的表达和纯化
Rh Bri2 BRICHOS结构域(其对应于全长Bri2蛋白的残基113-231)在C末端连接到AU1标签或mCherry蛋白。含BRICHOS蛋白Bri2 BRICHOS-AU1(SEQ ID NO:11)和Bri2BRICHOS-mCherry(SEQ ID NO:12)在大肠杆菌中表达并纯化。在注射到小鼠中之前，将rhBri2 BRICHOS-AU1针对过滤和高压灭菌的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH 7.4)进行透析(6-8kDa膜，谱学实验室(Spectrum lab))。通过使蛋白通过皮尔斯高容量内毒素去除柱(赛默科技公司(Thermo Scientific))来消除内毒素。最终的蛋白制剂通过0.22μm Millex-GV过滤器(密理博公司(Millipore Ltd.))过滤，并将其储存在-20℃下，并在注射前几分钟解冻。
作为对照，按照以下中所述产生proSP-C BRICHOS结构域(proSP-C残基59-197)：Galan-Acosta等人,Mol Cell Neurosci.[分子和细胞神经科学]2020:103498。
动物
使用雌性和雄性C57BL/6J，4-6月龄，体重24-30g。所有动物均保持12小时的光暗周期，并分组在5个小鼠的笼子中，并可随意获取食物和水。所有实验均根据南斯德哥尔摩动物实验伦理委员会(Stockholms/> )(dnr 03049)、链环伦理委员会(/>Etiska/>)(ID855)或按照哥伦比亚大学机构动物护理和使用委员会(Columbia University Institutional Animal Care and Use Committee)的指导方针批准和进行。
实验设计
图3显示了实施例中的研究设计。(A)小鼠接受微泡和1、10或20mg/kg rh Bri2BRICHOS-AU1(SEQ ID NO:11)，或用于对照的PBS，尾静脉中两次静脉内注射。(B)小鼠接受20mg/kg的(i)rh Bri2 BRICHOS-mCherry(SEQ ID NO:12)和微泡，或(ii)仅rh Bri2BRICHOS-mCherry。
两种不同类型的市售微泡(兰瑟斯医学成像公司(Lantheus MedicalImaging)，马萨诸塞州，美国)或/>(Bracco公司，米兰，意大利)以5μl/g体重的剂量施用。对于该研究的一个部分(图3A)，总共14个小鼠被分为四组，分别接受静脉内注射微泡和PBS(n＝4)，微泡和1(n＝4)、10(n＝6)或20(n＝4)mg/kg体重的rh Bri2 BRICHOS-AU1(SEQ ID NO:11)。在研究的第二部分(图3B)中，总共3个小鼠被静脉内施用20mg/kg rhBri2 BRICHOS-mCherry(SEQ ID NO:12)(n＝1)或微泡+20mg/kg rh Bri2 BRICHOS-mCherry(n＝2)。两只接受10mg/kg rh Bri2 BRICHOS-AU1的小鼠注射/>微泡，其余小鼠施用/>微泡。
所有动物通过使用29号针头在侧尾静脉接受两次静脉内注射。在施用之前，通过机械搅拌20秒激活微泡小瓶，并经60秒将微泡溶液注射到尾静脉中，随后立即缓慢注射rhBri2 BRICHOS蛋白或PBS对照。注射前，用2％-4％异氟烷(携带2％氧气)麻醉小鼠，并将其置于热灯下以扩张尾静脉。注射后两小时，将小鼠麻醉并用120ml PBS经心灌注，一只施用和10mg/kg rh Bri2BRICHOS-AU1的小鼠用PBS灌注5分钟，然后用4％多聚甲醛(PFA)灌注7分钟。从头骨中提取脑，然后在干冰中快速冷冻并储存在-80℃下，或者在包埋在石蜡中之前在4％PFA中进行后固定48小时。
抗体
对于免疫组织化学(IHC)，使用1:200稀释的多克隆兔抗AU1(艾博抗公司(Abcam)Cat#ab3401)一抗，并将辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗兔二抗(通用健康医疗公司(GEHealthcare)Cat#NA934)稀释至1:2000。对于蛋白印迹，一抗是1:600稀释的多克隆兔抗AU1(艾博抗公司Cat#ab3401)，使用1:10,000稀释的荧光标记二抗兔(李科尔公司(Li-Cor)，Cat#926-32213)抗体。对于夹心ELISA，山羊抗Bri2 BRICHOS抗体以1:250稀释用于捕获，多克隆兔抗AU1(艾博抗公司Cat#ab3401)抗体以1:2000稀释用于检测。
使用兔抗proSP-C抗体，如先前报道于Galan-Acosta等人.,Mol Cell Neurosci.[分子和细胞神经科学]2020:103498。
免疫组织化学分析(IHC)
将石蜡包埋组织的5μm厚的冠状切片置于Superfrost Plus显微镜载玻片(赛默科技公司)上，并在室温(RT)下干燥过夜以除去残留的水。通过在二甲苯中洗涤使切片脱石蜡，并在浓度逐渐降低的乙醇中(从99％至70％)重新水合。将切片在脱舱室(DecloakingChamber)(邦健医疗公司(Biocare Medical))中浸入DIVA脱舱(decloaker)1X溶液(邦健医疗公司，康科德(Concord)，美国)中，在110℃下压力煮沸30分钟，或在95℃加热的水浴中温育30分钟。将载玻片在室温下冷却20分钟，然后用含有0.1％tween 20的PBS缓冲液(PBST)洗涤，并与过氧化物酶封闭溶液(Dako)一起温育5分钟。将切片用Tris缓冲盐水(TBS)洗涤，并用背景惩罚剂(Biocare)进行额外封闭10分钟。在DAKO(安捷伦公司(Agilent))抗体稀释液中稀释的一抗在室温下温育45分钟。然后在TBS中洗涤载玻片，并与含有碱性磷酸酶(AP)缀合的抗兔二抗的Mach 2双染色2(Mach 2Double stain 2)一起在室温下温育30分钟。AP染色用永久红(比斯特公司(Biosite))检测。切片用苏木精(梅耶尔公司(Mayer))复染，通过乙醇(从70％至99％)脱水，在二甲苯中透明，并用DEPEX封固剂(默克公司(Merck))封固。
显微镜检查
使用带有10x和20x放大倍数的Plan-Apochromate物镜的尼康(Nikon)EclipseE800M光学显微镜对染色切片进行可视化。使用尼康荧光显微镜检测脑样品中的rh Bri2BRICHOS-mCherry蛋白，并用20x物镜进行记录。
蛋白印迹
将一个用rh Bri2 BRICHOS-AU1+微泡处理的小鼠的脑组织和一个阴性对照在50mM Tris-HCl(pH 7.4)、150mM NaCl、1％(v/v)Triton X-100、0.1％(w/v)SDS和10mMEDTA补充以蛋白酶抑制剂混合物(罗氏公司(Roche)，印第安纳波利斯，印第安纳州)中匀化。将匀浆在4℃下以14,000rpm(20,800xg)离心30分钟，收集上清液并储存在-20℃下。通过BCA法测定蛋白浓度。将匀浆在匀浆缓冲液和1x SDS还原缓冲液(含有2-巯基乙醇)中稀释，以便每个样品和孔加载100μg总蛋白。将样品在97℃下加热10分钟，并在4％-20％预制聚丙烯酰胺凝胶(伯乐公司(Bio-Rad))上分离，并在硝酸纤维素(通用健康医疗公司)膜上印迹。印迹后，使用在0.1％Tween/TBS中制备的5％脱脂奶在室温下封闭膜1小时。此后，将这些膜用0.1％Tween/TBS冲洗，并添加稀释于0.1％Tween/TBS中的一抗在4℃下过夜。将这些膜用0.1％Tween/TBS洗涤三次，然后与在0.1％Tween/TBS中制备的二抗在室温下温育1小时。用0.1％Tween/TBS洗去未结合的二抗后，使用荧光成像系统(李科尔公司，OdysseyCLx)获取图像。
夹心ELISA
用在包被缓冲液(50mM碳酸盐pH 9.6)中稀释的抗Bri2 BRICHOS捕获抗体包被96孔板(Nunc MicroWellTM)，并在4℃下温育过夜。在0.05％Tween/PBS中洗涤三次后，用1％BSA/PBS封闭1小时。洗涤和封闭步骤之后，将用0.05％Tween/PBS稀释的脑样品(250μg/ml)和标准品在室温下温育2小时。洗涤板并夜添加稀释于0.05％Tween/PBS中的兔抗AU1一抗在4℃下过夜。将板洗涤三次并添加在0.05％Tween/PBS中稀释的抗兔二抗，在室温下2小时。洗涤后，添加四甲基联苯胺(TMB)(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))溶液并在黑暗中温育30分钟。通过添加TMB底物(赛默飞世尔公司)的终止溶液来终止反应，并使用来自未处理小鼠的脑匀浆的值作为空白在450nm处测量吸光度。标准曲线是从0.1至64ng范围内的rhBri2 BRICHOS-AU1蛋白获得的。
通过假设脑密度为1.04mg/ml、平均脑半球重量为225mg以及脑半球匀浆中总蛋白的平均值为25.6mg来评估每个脑半球中rh Bri2 BRICHOS-AU1的浓度和总量的计算。
结果
在存在脂质微泡的情况下，rh Bri2 BRICHOS但不是proSP-C BRICHOS在非超声处理半球中通过BBB
研究了脑实质中rh Bri2 BRICHOS-AU1(SEQ ID NO:11)的存在。图4表明，在与脂质微泡一起静脉内注射后，在非FUS靶向的脑半球中检测到了rh Bri2BRICHOS，但未检测到rh proSP-C BRICHOS。对来自用rh proSP-C BRICHOS+微泡(A-B、E-F、I-J)或rh Bri2BRICHOS-AU1+微泡(C-D、G-H)处理的小鼠的、来自对侧非FUS靶向半球(A-H)的皮质和海马切片进行免疫组织化学分析。(I-J)对照显示，在用静脉内proSP-C BRICHOS+微泡和FUS处理的小鼠的对侧或同侧中没有rh Bri2 BRICHOS-AU1染色。使用兔抗proSP-C抗体(A-B、E-F)或兔抗AU1抗体(C-D、G-H)对组织进行染色，然后使用AP缀合的二抗进行染色，并用永久性红色AP溶液进行显色。所有样品均用苏木精复染。A-H中的比例尺为100μm，I-J中的比例尺为200μm。
因此，在微泡存在下对野生型小鼠静脉内施用10mg/kg rh Bri2 BRICHOS-AU1后2小时，在非FUS靶向的对侧半球的皮质和海马中发现Rh Bri2BRICHOS-AU1(图4C-D，G-H)。在FUS处理的野生型小鼠中静脉内注射10mg/kg rh proSP-C BRICHOS和微泡后2小时，在未超声处理的半球中未观察到Rh proSP-C BRICHOS(图4A-B、E-F)。注射2小时后，用FUS+微泡处理并施用10mg/kg rh proSP-C BRICHOS的小鼠的脑切片中rh Bri2 BRICHOS-AU1的免疫组织化学染色呈阴性，表明与抗AU1抗体的免疫反应性不是由任何重组蛋白注射引起的假象(图4I-J)。
微泡增加野生型小鼠中rh Bri2 BRICHOS的BBB渗透性
通过施用具有与C末端遗传性连接的AU1标签(rh Bri2 BRICHOS-AU1；SEQ ID NO:11)或mCherry蛋白(rh Bri2 BRICHOS-mCherry；SEQ ID NO:12)的rh Bri2 BRICHOS结构域，进一步研究了单独微泡(即没有应用任何FUS)对rh Bri2 BRICHOS穿过BBB的渗透性的作用。将微泡(剂量为5μl/g体重)和不同剂量的rh Bri2 BRICHOS-AU1分别注射到成年野生型小鼠的侧尾静脉中，2小时后进行脑灌注并收集进行分析。给对照小鼠施用微泡和PBS。通过免疫组织化学和蛋白印迹研究了脑实质中rh Bri2 BRICHOS-AU1的存在，同时通过夹心ELISA评估了rh Bri2 BRICHOS-AU1的量(图3A)。
为了研究微泡对与折叠球状蛋白融合的rh Bri2 BRICHOS的BBB渗透性的作用，选择rh Bri2 BRICHOS-mCherry(总分子量为44kDa)，因为它可以通过折叠的mCherry(其在与rh Bri2 BRICHOS融合时也保持不变)的荧光特性来检测。在这种情况下，将和20mg/kg rh Bri2BRICHOS-mCherry(SEQ ID NO:12)的静脉内注射应用于两只野生型小鼠，而对照小鼠仅接受rh Bri2BRICHOS-mCherry(图3B)。注射后2小时收集脑并宏观地以及在荧光显微镜下进行分析。
发明人出人意料地发现，单独的微泡增加了rh Bri2 BRICHOS-AU1通过BBB的速度。
图5显示了在与脂质微泡一起静脉内注射后，在两个半球中均检测到Bri2BRICHOS。(A-G)来自用微泡+10mg/kg rh Bri2 BRICHOS-AU1处理的小鼠的皮质、海马和侧脑室的图像。(H-J)来自注射10mg/kg rh proSP-C BRICHOS和微泡的小鼠的图像。(K-M)来自未接受注射的对照小鼠的图像。所有切片均先与抗AU1抗体一起温育，然后与AP缀合的抗兔抗体一起温育，并用永久红AP溶液显色，并用苏木精复染。分图A中比例尺的尺寸为500μm，分图B-M中比例尺的尺寸为200μm。
以10mg/kg的剂量静脉内注射微泡和rh Bri2 BRICHOS-AU1后，使用针对AU1标签的抗体，通过免疫组织化学在皮质、海马和侧脑室脉络丛中检测到Rh Bri2 BRICHOS-AU1(图5A-G)。两个半球之间没有观察到染色强度的差异(图5A-G)。
图6表明在与脂质微泡一起静脉内注射后，观察到皮质和海马中rh Bri2BRICHOS-AU1的细胞内免疫染色。图像显示来自用微泡+10mg/kg rh Bri2BRICHOS-AU1(SEQ ID NO:11)处理的小鼠的右半球的皮层(A，B)和海马(C，D)。使用抗AU1抗体对切片进行rh Bri2BRICHOS-AU1染色，并用苏木精复染。(B)和(D)分图中的箭头表示rh Bri2 BRICHOS-AU1的细胞内染色。分图A、C的比例尺尺寸为100μm；并且分图B、D的比例尺尺寸为50μm。
因此在皮层中和海马中的细胞中观察到细胞内染色(图6A-D)。来自注射rhproSP-C BRICHOS或PBS的小鼠的对照脑以相同的方式用抗AU1抗体染色，但没有显示出免疫反应性(图5H-M)。
此外，使用抗AU1和抗Bri2抗体两者通过蛋白印迹分析来自施用微泡加10mg/kgrh Bri2 BRICHOS-AU1的小鼠的两个半球的匀浆，其揭示了迁移为rh Bri2BRICHOS-AU1和稍微更慢的条带，而相应的条带在对照样品中不存在。图7显示了与脂质微泡一起全身注射后，rh Bri2 BRICHOS-AU1(SEQ ID NO:11)在两个脑半球中的蛋白印迹检测。对静脉内注射微泡+rh Bri2 BRICHOS-AU1后两小时收集的一个小鼠的左(L)和右(R)半球以及来自未经处理的对照小鼠(阴性对照)的脑匀浆进行蛋白印迹分析。使用抗AU1抗体(A)和抗Bri2抗体(B)检测Rh Bri2 BRICHOS-AU1，如凝胶右侧的箭头所示。标记为Rec蛋白的泳道含有5ng rhBri2 BRICHOS-AU1。
与免疫组织化学和蛋白印迹结果一致，注射2小时后通过夹心ELISA对微泡加10mg/kg rh Bri2 BRICHOS-AU1处理的小鼠的两个半球的匀浆进行分析显示左半球中的rhBri2 BRICHOS-AU1浓度为390nM，而在右半球中为250nM，两者合计相当于施用总量的1％。值得关注的是，与未施用微泡相比，在施用脂质微泡且未进行超声处理的情况下，更高量的分离的重组Bri2 BRICHOS-AU1到达脑实质。静脉内注射后2小时，在脑中检测到以10mg/kg剂量与脂质微泡一起施用的总分离重组Bri2 BRICHOS-AU1的约1％，而在没有微泡的情况下以20mg/kg的剂量施用分离的重组Bri2 BRICHOS-AU1后，检测到0.1％至1％(平均0.5％)。这是出人意料的，因为尚未描述单独的微泡(未经超声处理)可以增加蛋白通过BBB或影响神经元的摄取。
发明人还发现，在注射脂质微泡情况下，rh Bri2 BRICHOS-mCherry通过进入野生型小鼠的脑实质，但在没有注射脂质微泡情况下不是如此。通过宏观地观察脑和在荧光显微镜下观察脑切片来评估在有或没有微泡的情况下注射rh Bri2BRICHOS-mCherry的野生型小鼠中rh Bri2 BRICHOS-mCherry的BBB渗透性。
图8显示了与脂质微泡组合全身注射后，在纹状体中发现Rh Bri2 BRICHOS-mCherry(SEQ ID NO:12)。(A-B)仅注射rh Bri2 BRICHOS-mCherry(A)或与微泡组合注射(B)后的小鼠脑照片。(C-H)注射(C，F)仅20mg/kg rh Bri2BRICHOS-mCherry和(D-E，G-H)微泡和20mg/kg rh Bri2 BRICHOS-mCherry后2小时收集的纹状体区域的荧光。分图C-E的比例尺尺寸为200μm，分图F-H的比例尺尺寸为100μm。分图C、D、E中用白色矩形标记的区域分别在分图F、G、H中放大。
注射仅rh Bri2 BRICHOS-mCherry(一个小鼠)或微泡和rh Bri2 BRICHOS-mCherry(两个小鼠)的完全灌注的小鼠的脑在注射后2小时收集，显示出仅在具有rh Bri2BRICHOS-mCherry加微泡的小鼠中，在皮层外层和小脑中出现清晰的颜色(图8中的白色)(图8A，B)。此外，在注射微泡和rh Bri2 BRICHOS-mCherry的两个小鼠的石蜡包埋切片的纹状体区域中检测到荧光(图8中的白色)(图8D、E、G、H)，但在注射仅rh Bri2 BRICHOS-mCherry的小鼠中未见(图8C、F)。数据强烈表明，当微泡注射入循环系统时，静脉内注射的rh Bri2BRICHOS-mCherry会通过进入脑实质。
实施方案清单
1.一种分离的重组蛋白，其选自下组：包含与来自人的Bri2的残基113-231(SEQID NO:2)具有至少70％同一性的氨基酸序列的蛋白；以及包含与来自人(SEQ ID NO:5)、黑猩猩(SEQ ID NO:6)、牛(SEQ ID NO:7)、猪(SEQ ID NO:8)、小鼠(SEQ ID NO:9)和大鼠(SEQID NO:10)的Bri2的BRICHOS结构域中的任一个具有至少70％同一性的氨基酸序列的蛋白；条件是所述蛋白不包含与来自人的Bri2的残基1-89(SEQ ID NO:3)具有至少70％同一性的氨基酸序列；并且所述蛋白不包含与人ABri23(SEQ ID NO:4)具有至少70％同一性的氨基酸序列；该分离的重组蛋白用于在治疗有需要的哺乳动物的阿尔茨海默病的方法中使用，该哺乳动物包括人，该方法包括以下步骤：
-向所述哺乳动物施用多个脂质微泡和/或纳米液滴
-向所述哺乳动物施用所述分离的重组蛋白；
其中所述分离的重组蛋白不包含在所述微泡和/或所述纳米液滴内；并且
其中该方法不包括对该哺乳动物的任何组织进行超声处理的任何步骤。
2.一种分离的重组蛋白，其选自下组：包含与来自人的Bri2的残基113-231(SEQID NO:2)具有至少70％同一性的氨基酸序列的蛋白；以及包含与来自人(SEQ ID NO:5)、黑猩猩(SEQ ID NO:6)、牛(SEQ ID NO:7)、猪(SEQ ID NO:8)、小鼠(SEQ ID NO:9)和大鼠(SEQID NO:10)的Bri2的BRICHOS结构域中的任一个具有至少70％同一性的氨基酸序列的蛋白；条件是所述蛋白不包含与来自人的Bri2的残基1-89(SEQ ID NO:3)具有至少70％同一性的氨基酸序列；并且所述蛋白不包含与人ABri23(SEQ ID NO:4)具有至少70％同一性的氨基酸序列；该分离的重组蛋白用于在治疗有需要的哺乳动物的阿尔茨海默病的方法中使用，该哺乳动物包括人，该方法由以下步骤组成：
-向所述哺乳动物施用多个脂质微泡和/或纳米液滴
-向所述哺乳动物施用所述分离的重组蛋白；
其中所述分离的重组蛋白不包含在所述微泡和/或所述纳米液滴内。
3.一种如前述项目中任一项所述的分离的重组蛋白和脂质微泡和/或纳米液滴的组合，该组合用于在治疗有需要的哺乳动物的阿尔茨海默病的方法中使用，该哺乳动物包括人，该方法包括以下步骤；
-向所述哺乳动物施用多个脂质微泡和/或纳米液滴
-向所述哺乳动物施用所述分离的重组蛋白；
其中所述分离的重组蛋白不包含在所述微泡和/或所述纳米液滴内；并且
其中该方法不包括对该哺乳动物的任何组织进行超声处理的任何步骤。
4.一种如前述项目中任一项所述的分离的重组蛋白和脂质微泡和/或纳米液滴的组合，该组合用于在治疗有需要的哺乳动物的阿尔茨海默病的方法中使用，该哺乳动物包括人，该方法由以下步骤组成：
-向所述哺乳动物施用多个脂质微泡和/或纳米液滴
-向所述哺乳动物施用所述分离的重组蛋白；
其中所述分离的重组蛋白不包含在所述微泡和/或所述纳米液滴内。
5.如前述项目中任一项所述使用的分离的重组蛋白或组合，其中所述分离的重组蛋白和所述微泡和/或所述纳米液滴静脉内施用。
6.如项目1-5中任一项所述使用的分离的重组蛋白或组合，其中施用至少1mg/kg、例如至少5mg/kg、更优选例如至少10mg/kg的治疗有效量的所述分离的重组蛋白。
7.如项目1-5中任一项所述的使用的分离的重组蛋白或组合，其中施用少于50mg/kg，例如少于30mg/kg，更优选少于20mg/kg的治疗有效量的所述分离的重组蛋白。
8.如项目1-7中任一项所述使用的分离的重组蛋白或组合，其中该分离的重组蛋白选自由以下组成的组：包含与来自人的Bri2的残基113-231(SEQ ID NO:2)具有至少70％、优选至少75％同一性的氨基酸序列的蛋白；以及包含与来自人的Bri2的BRICHOS结构域(SEQ ID NO:5)具有至少70％、优选至少75％同一性的氨基酸序列的蛋白。
9.如项目8中所述使用的分离的重组蛋白或组合，其中该分离的重组蛋白选自由以下组成的组：包含与来自人的Bri2的残基113-231(SEQ ID NO:2)具有至少80％、优选至少85％同一性的氨基酸序列的蛋白；以及包含与来自人的Bri2的BRICHOS结构域(SEQ IDNO:5)具有至少80％、优选至少85％同一性的氨基酸序列的蛋白。
10.如项目9中所述使用的分离的重组蛋白或组合，其中该分离的重组蛋白选自由以下组成的组：包含与来自人的Bri2的残基113-231(SEQ ID NO:2)具有至少90％、优选至少95％、优选至少99％同一性的氨基酸序列的蛋白；以及包含与来自人的Bri2的BRICHOS结构域(SEQ ID NO:5)具有至少90％同一性的氨基酸序列的蛋白。
11.如项目10中所述使用的分离的重组蛋白或组合，其中该分离的重组蛋白选自由以下组成的组：来自人的Bri2的残基113-231(SEQ ID NO:2)；以及来自人的Bri2的BRICHOS结构域(SEQ ID NO:5)。
12.如项目1-7中任一项所述使用的分离的重组蛋白或组合，其中该分离的重组蛋白选自下组：包含与来自人(SEQ ID NO:5)、黑猩猩(SEQ ID NO:6)、牛(SEQ ID NO:7)、猪(SEQ ID NO:8)、小鼠(SEQ ID NO:9)和大鼠(SEQ ID NO:10)的Bri2的BRICHOS结构域中的任一个具有至少70％同一性的氨基酸序列的蛋白。
13.如项目12所述使用的分离的重组蛋白或组合，其中该分离的重组蛋白选自下组：包含与来自人(SEQ ID NO:5)、黑猩猩(SEQ ID NO:6)、牛(SEQ ID NO:7)、猪(SEQ IDNO:8)、小鼠(SEQ ID NO:9)和大鼠(SEQ ID NO:10)的Bri2的BRICHOS结构域中的任一个具有至少80％，优选至少85％同一性的氨基酸序列的蛋白。
14.如项目13所述使用的分离的重组蛋白或组合，其中该分离的重组蛋白选自下组：包含与来自人(SEQ ID NO:5)、黑猩猩(SEQ ID NO:6)、牛(SEQ ID NO:7)、猪(SEQ IDNO:8)、小鼠(SEQ ID NO:9)和大鼠(SEQ ID NO:10)的Bri2的BRICHOS结构域中的任一个具有至少90％，优选至少95％同一性的氨基酸序列的蛋白。
15.如项目14所述使用的分离的重组蛋白或组合，其中该分离的重组蛋白选自由以下组成的组：来自人(SEQ ID NO:5)、黑猩猩(SEQ ID NO:6)、牛(SEQ ID NO:7)、猪(SEQID NO:8)、小鼠(SEQ ID NO:9)和大鼠(SEQ ID NO:10)的Bri2的BRICHOS结构域中的任一个。
16.如项目1-15中任一项所述使用的分离的重组蛋白或组合，其中，在该分离的重组蛋白中，该对应于SEQ ID NO:1中的位置221的氨基酸残基选自由Glu和Asp组成的组。
17.如项目16所述使用的分离的重组蛋白或组合，其中，在该分离的重组蛋白中，该对应于SEQ ID NO:1中的位置221的氨基酸残基是Glu。
18.如项目1-17中任一项所述使用的分离的重组蛋白或组合，其中该分离的重组蛋白由少于或等于200个氨基酸残基、例如少于或等于150个氨基酸残基组成。
19.如项目1-18中任一项所述使用的分离的重组蛋白或组合，其中该分离的重组蛋白由多于或等于90个氨基酸残基组成。
20.如前述项目中任一项所述使用的分离的重组蛋白或组合，其中所述微泡和/或所述纳米液滴被脂质包被。
21.如前述项目中任一项所述使用的分离的重组蛋白或组合，其中所述微泡和/或纳米液滴包含1,2-二硬脂醇-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二硬脂醇-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(甲氧基(聚乙二醇)2000)和全氟丁烷气体核心。
22.如项目1-21中任一项所述使用的分离的重组蛋白或组合，其中所述微泡和/或纳米液滴包含六氟化硫、聚乙二醇(PEG，Macrogol)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰甘油钠和棕榈酸。
23.如前述项目中任一项所述使用的分离的重组蛋白或组合，其中所述微泡和/或所述纳米液滴具有在1-8μm，例如2-6μm，例如4-5μm范围内的直径。
24.如项目1-23中任一项所述使用的分离的重组蛋白或组合，其中所述治疗选自由预防性治疗、姑息性治疗和治愈性治疗组成的组。
25.一种治疗有需要的哺乳动物的阿尔茨海默病的方法，该哺乳动物包括人，该方法包括以下步骤：
-向所述哺乳动物施用多个脂质微泡和/或纳米液滴
-向所述哺乳动物施用选自下组的分离的重组蛋白：包含与来自人的Bri2的残基113-231(SEQ ID NO:2)具有至少70％同一性的氨基酸序列的蛋白；以及包含与来自人(SEQID NO:5)、黑猩猩(SEQ ID NO:6)、牛(SEQ ID NO:7)、猪(SEQ ID NO:8)、小鼠(SEQ ID NO:9)和大鼠(SEQ ID NO:10)的Bri2的BRICHOS结构域中的任一个具有至少70％同一性的氨基酸序列的蛋白；条件是所述蛋白不包含与来自人的Bri2的残基1-89(SEQ ID NO:3)具有至少70％同一性的氨基酸序列；并且所述蛋白不包含与人ABri23(SEQ ID NO:4)具有至少70％同一性的氨基酸序列；
其中所述分离的重组蛋白不包含在所述微泡和/或所述纳米液滴内；并且
其中该方法不包括对该哺乳动物的任何组织进行超声处理的任何步骤。
26.一种治疗有需要的哺乳动物的阿尔茨海默病的方法，该哺乳动物包括人，该方法由以下步骤组成：
-向所述哺乳动物施用多个脂质微泡和/或纳米液滴
-向所述哺乳动物施用选自下组的分离的重组蛋白：包含与来自人的Bri2的残基113-231(SEQ ID NO:2)具有至少70％同一性的氨基酸序列的蛋白；以及包含与来自人(SEQID NO:5)、黑猩猩(SEQ ID NO:6)、牛(SEQ ID NO:7)、猪(SEQ ID NO:8)、小鼠(SEQ ID NO:9)和大鼠(SEQ ID NO:10)的Bri2的BRICHOS结构域中的任一个具有至少70％同一性的氨基酸序列的蛋白；条件是所述蛋白不包含与来自人的Bri2的残基1-89(SEQ ID NO:3)具有至少70％同一性的氨基酸序列；并且所述蛋白不包含与人ABri23(SEQ ID NO:4)具有至少70％同一性的氨基酸序列；
其中所述分离的重组蛋白不包含在所述微泡和/或所述纳米液滴内。
27.如项25-26中任一项所述的方法，其中该分离的重组蛋白选自下组：包含与来自人(SEQ ID NO:5)、黑猩猩(SEQ ID NO:6)、牛(SEQ ID NO:7)、猪(SEQ ID NO:8)、小鼠(SEQ ID NO:9)和大鼠(SEQ ID NO:10)的Bri2的BRICHOS结构域具有至少70％同一性的氨基酸序列的蛋白。
28.如项目27所述的方法，其中该分离的重组蛋白选自下组：包含与来自人(SEQID NO:5)、黑猩猩(SEQ ID NO:6)、牛(SEQ ID NO:7)、猪(SEQ ID NO:8)、小鼠(SEQ ID NO:9)和大鼠(SEQ ID NO:10)的Bri2的BRICHOS结构域中的任一个具有至少80％，优选至少85％同一性的氨基酸序列的蛋白。
29.如项目28所述的方法，其中该分离的重组蛋白选自下组：包含与来自人(SEQID NO:5)、黑猩猩(SEQ ID NO:6)、牛(SEQ ID NO:7)、猪(SEQ ID NO:8)、小鼠(SEQ ID NO:9)和大鼠(SEQ ID NO:10)的Bri2的BRICHOS结构域中的任一个具有至少90％，优选至少95％同一性的氨基酸序列的蛋白。
30.如项目29所述的方法，其中该分离的重组蛋白选自下组：包含来自人(SEQ IDNO:5)、黑猩猩(SEQ ID NO:6)、牛(SEQ ID NO:7)、猪(SEQ ID NO:8)、小鼠(SEQ ID NO:9)和大鼠(SEQ ID NO:10)的Bri2的BRICHOS结构域中的任一个的蛋白。
31.如项目25-26中任一项所述的方法，其中该分离的重组蛋白选自下组：包含与来自人的Bri2的残基113-231(SEQ ID NO:2)和来自人的Bri2的BRICHOS结构域(SEQ IDNO:5)中的任一个具有至少70％同一性的氨基酸序列的蛋白。
32.如项目31所述的方法，其中该分离的重组蛋白选自下组：包含与来自人的Bri2的残基113-231(SEQ ID NO:2)和来自人的Bri2的BRICHOS结构域(SEQ ID NO:5)中的任一个具有至少80％，优选至少85％同一性的氨基酸序列的蛋白。
33.如项目31所述的方法，其中该分离的重组蛋白选自下组：包含与来自人的Bri2的残基113-231(SEQ ID NO:2)和来自人的Bri2的BRICHOS结构域(SEQ ID NO:5)中的任一个具有至少90％、优选至少95％、优选至少99％同一性的氨基酸序列的蛋白。
34.如项目33所述的方法，其中该分离的重组蛋白选自由以下组成的组：来自人的Bri2的残基113-231(SEQ ID NO:2)；以及来自人的Bri2的BRICHOS结构域(SEQ ID NO:5)。
35.如项目25-34中任一项所述的方法，其中对应于SEQ ID NO:1中的位置221的氨基酸残基选自由Glu和Asp组成的组。
36.如项目35所述的方法，其中对应于SEQ ID NO:1中的位置221的氨基酸残基是Glu。
37.如项目25-34中任一项所述的方法，其中这些脂质微泡和/或纳米液滴如项目20-23中任一项所定义。
38.一种分离的蛋白，其包含
(i)选自下组的第一蛋白部分：包含与来自人的Bri2的残基113-231(SEQ ID NO:2)具有至少70％同一性的氨基酸序列的蛋白；以及包含与来自人(SEQ ID NO:5)、黑猩猩(SEQ ID NO:6)、牛(SEQ ID NO:7)、猪(SEQ ID NO:8)、小鼠(SEQ ID NO:9)和大鼠(SEQ IDNO:10)的Bri2的BRICHOS结构域中的任一个具有至少70％同一性的氨基酸序列的蛋白；以及
(ii)第二蛋白或多肽部分，优选含有至少50个氨基酸残基；
其中所述分离的蛋白不包含与来自人的Bri2的残基1-89(SEQ ID NO:3)具有至少70％同一性的氨基酸序列；并且
其中所述分离的蛋白不包含与人ABri23(SEQ ID NO:4)具有至少70％同一性的氨基酸序列。
39.如项目38所述的分离的蛋白，其中该第一蛋白部分选自下组：包含与来自人(SEQ ID NO:5)、黑猩猩(SEQ ID NO:6)、牛(SEQ ID NO:7)、猪(SEQ ID NO:8)、小鼠(SEQ IDNO:9)和大鼠(SEQ ID NO:10)的Bri2的BRICHOS结构域中的任一个具有至少70％同一性的氨基酸序列的蛋白。
40.如项目39所述的分离的蛋白，其中该第一蛋白部分选自下组：包含与来自人(SEQ ID NO:5)、黑猩猩(SEQ ID NO:6)、牛(SEQ ID NO:7)、猪(SEQ ID NO:8)、小鼠(SEQ IDNO:9)和大鼠(SEQ ID NO:10)的Bri2的BRICHOS结构域中的任一个具有至少80％，优选至少85％同一性的氨基酸序列的蛋白。
41.如项目40所述的分离的蛋白，其中该第一蛋白部分选自下组：包含与来自人(SEQ ID NO:5)、黑猩猩(SEQ ID NO:6)、牛(SEQ ID NO:7)、猪(SEQ ID NO:8)、小鼠(SEQ IDNO:9)和大鼠(SEQ ID NO:10)的Bri2的BRICHOS结构域中的任一个具有至少90％，优选至少95％同一性的氨基酸序列的蛋白。
42.如项目41所述的分离的蛋白，其中该第一蛋白部分选自下组：包含来自人(SEQID NO:5)、黑猩猩(SEQ ID NO:6)、牛(SEQ ID NO:7)、猪(SEQ ID NO:8)、小鼠(SEQ ID NO:9)和大鼠(SEQ ID NO:10)的Bri2的BRICHOS结构域中的任一个的蛋白。
43.如项目38所述的分离的蛋白，其中该第一蛋白部分选自下组：包含与来自人的Bri2的残基113-231(SEQ ID NO:2)和来自人的Bri2的BRICHOS结构域(SEQ ID NO:5)中的任一个具有至少70％同一性的氨基酸序列的蛋白。
44.如项目43所述的分离的蛋白，其中该第一蛋白部分选自下组：包含与来自人的Bri2的残基113-231(SEQ ID NO:2)和来自人的Bri2的BRICHOS结构域(SEQ ID NO:5)中的任一个具有至少80％，优选至少85％同一性的氨基酸序列的蛋白。
45.如项目44所述的分离的蛋白，其中该第一蛋白部分选自下组：包含与来自人的Bri2的残基113-231(SEQ ID NO:2)和来自人的Bri2的BRICHOS结构域(SEQ ID NO:5)中的任一个具有至少90％、优选至少95％同一性的氨基酸序列的蛋白。
46.如项目45所述的分离的蛋白，其中该第一蛋白部分选自由以下组成的组：来自人的Bri2的残基113-231(SEQ ID NO:2)；以及来自人的Bri2的BRICHOS结构域(SEQ ID NO:5)。
47.如项目38-46中任一项所述的分离的蛋白，其中该第一蛋白部分中对应于SEQID NO:1中的位置221的氨基酸残基选自由Glu和Asp组成的组。
48.如项目47所述的分离的蛋白，其中该第一蛋白部分中对应于SEQ ID NO:1中的位置221的氨基酸残基是Glu。
49.如项目38-48中任一项所述的分离的蛋白，其中该第一蛋白部分由少于或等于200个氨基酸残基、例如少于或等于150个氨基酸残基组成。
50.如项目38-48中任一项所述的分离的蛋白，其中该第一蛋白部分由多于或等于90个氨基酸残基组成。
51.如项目38-50中任一项所述的分离的蛋白，其中所述第二蛋白或多肽部分含有50至2000个氨基酸残基，例如50至1000个氨基酸残基，例如50至500个氨基酸残基，例如50至100个氨基酸残基。
52.如项目38-51中任一项所述的分离的蛋白，其中所述第二蛋白或多肽部分的大小是5-200kDa，例如5-100kDa，例如5-50kDa，例如5-10kDa。
53.如项目38-52中任一项所述的分离的蛋白，其中该第一蛋白部分直接或间接连接至该第二蛋白或多肽部分的氨基末端或羧基末端。
54.如项目38-53中任一项所述的分离的蛋白，其中该第二蛋白或多肽部分构成该蛋白的氨基末端和/或羧基末端。
55.如项目38-54中任一项所述的分离的蛋白，其中该第二蛋白或多肽部分选自由蛋白药物、多肽药物、蛋白标签、荧光蛋白、抗体、酶和/或神经营养因子组成的组。
56.如项目55所述的分离的蛋白，其中该第二蛋白或多肽部分是抗体。
57.如项目55所述的分离的蛋白，其中该第二蛋白或多肽部分是选自由以下组成的组的神经营养因子：脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、神经营养因子-3、神经营养因子-4、睫状神经营养因子(CNTF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、肝配蛋白、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板源性生长因子(PDGF)和/或白细胞介素。
58.如项目55所述的分离的蛋白，其中该第二蛋白或多肽部分选自由以下组成的组：α-L-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺4-硫酸酯酶、α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖脑苷脂酶和/或溶酶体酸性脂肪酶。
59.如项目38-58中任一项所述的分离的蛋白，其中所述分离的蛋白是重组融合蛋白。
60.如项目38-58中任一项所述的分离的蛋白，其中所述第一蛋白部分化学连接至所述第二蛋白或多肽部分。
61.一种如项目38-60中任一项所述的分离的蛋白和多个脂质微泡和/或纳米液滴的组合，其中所述分离的蛋白不包含在所述微泡和/或所述纳米液滴内。
62.一种试剂盒，其包含如第38-60项中任一项所述的分离的蛋白、和多个脂质微泡和/或纳米液滴，其中所述分离的蛋白不包含在所述微泡和/或所述纳米液滴内。
63.如项目61-62中任一项所述的组合或试剂盒，其中这些脂质微泡和/或纳米液滴如项目20-23中任一项所定义。
64.一种用于在有需要的哺乳动物中运输如项目38-60中任一项所述的分离的蛋白穿过血脑屏障的方法，该哺乳动物包括人，该方法由以下步骤组成；
-向所述哺乳动物施用多个脂质微泡和/或纳米液滴；
-向所述哺乳动物施用所述分离的蛋白。
65.如项目64所述的方法，其中该方法不包括对该哺乳动物的任何组织进行超声处理的任何步骤。
66.如项目64-65中任一项所述的方法，其中这些脂质微泡和/或纳米液滴如项目20-23中任一项所定义。
67.如项目38-60中任一项所述的分离的蛋白，其用于在涉及在有需要的哺乳动物中运输所述分离的蛋白穿过血脑屏障的治疗的方法中使用，该哺乳动物包括人，该方法包括以下步骤：
-向所述哺乳动物施用多个脂质微泡和/或纳米液滴
-向所述哺乳动物施用所述分离的蛋白；
其中所述分离的蛋白不包含在所述微泡和/或所述纳米液滴内。
68.用于如项目67所述的方法中的分离的蛋白，其中该方法不包括对该哺乳动物的任何组织进行超声处理的任何步骤。
69.如项目38-60中任一项所述的分离的蛋白，其用于在涉及在有需要的哺乳动物中运输所述分离的蛋白穿过血脑屏障的治疗的方法中使用，该哺乳动物包括人，该方法由以下步骤组成：
-向所述哺乳动物施用多个脂质微泡和/或纳米液滴
-向所述哺乳动物施用所述分离的蛋白；
其中所述分离的蛋白不包含在所述微泡和/或所述纳米液滴内。
70.如项目67-69中任一项使用的分离的蛋白，其中这些脂质微泡和/或纳米液滴如项目20-23中任一项所定义。
序列表
<110> 阿尔法贝塔公司
<120> 通过共施用Bri2 BRICHOS结构域和脂质微泡和/或纳米液滴促进通过血脑屏障
<130> 21117267
<160> 12
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 266
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
Met Val Lys Val Thr Phe Asn Ser Ala Leu Ala Gln Lys Glu Ala Lys
1 5 10 15
Lys Asp Glu Pro Lys Ser Gly Glu Glu Ala Leu Ile Ile Pro Pro Asp
20 25 30
Ala Val Ala Val Asp Cys Lys Asp Pro Asp Asp Val Val Pro Val Gly
35 40 45
Gln Arg Arg Ala Trp Cys Trp Cys Met Cys Phe Gly Leu Ala Phe Met
50 55 60
Leu Ala Gly Val Ile Leu Gly Gly Ala Tyr Leu Tyr Lys Tyr Phe Ala
65 70 75 80
Leu Gln Pro Asp Asp Val Tyr Tyr Cys Gly Ile Lys Tyr Ile Lys Asp
85 90 95
Asp Val Ile Leu Asn Glu Pro Ser Ala Asp Ala Pro Ala Ala Leu Tyr
100 105 110
Gln Thr Ile Glu Glu Asn Ile Lys Ile Phe Glu Glu Glu Glu Val Glu
115 120 125
Phe Ile Ser Val Pro Val Pro Glu Phe Ala Asp Ser Asp Pro Ala Asn
130 135 140
Ile Val His Asp Phe Asn Lys Lys Leu Thr Ala Tyr Leu Asp Leu Asn
145 150 155 160
Leu Asp Lys Cys Tyr Val Ile Pro Leu Asn Thr Ser Ile Val Met Pro
165 170 175
Pro Arg Asn Leu Leu Glu Leu Leu Ile Asn Ile Lys Ala Gly Thr Tyr
180 185 190
Leu Pro Gln Ser Tyr Leu Ile His Glu His Met Val Ile Thr Asp Arg
195 200 205
Ile Glu Asn Ile Asp His Leu Gly Phe Phe Ile Tyr Arg Leu Cys His
210 215 220
Asp Lys Glu Thr Tyr Lys Leu Gln Arg Arg Glu Thr Ile Lys Gly Ile
225 230 235 240
Gln Lys Arg Glu Ala Ser Asn Cys Phe Ala Ile Arg His Phe Glu Asn
245 250 255
Lys Phe Ala Val Glu Thr Leu Ile Cys Ser
260 265
<210> 2
<211> 119
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 2
Gln Thr Ile Glu Glu Asn Ile Lys Ile Phe Glu Glu Glu Glu Val Glu
1 5 10 15
Phe Ile Ser Val Pro Val Pro Glu Phe Ala Asp Ser Asp Pro Ala Asn
20 25 30
Ile Val His Asp Phe Asn Lys Lys Leu Thr Ala Tyr Leu Asp Leu Asn
35 40 45
Leu Asp Lys Cys Tyr Val Ile Pro Leu Asn Thr Ser Ile Val Met Pro
50 55 60
Pro Arg Asn Leu Leu Glu Leu Leu Ile Asn Ile Lys Ala Gly Thr Tyr
65 70 75 80
Leu Pro Gln Ser Tyr Leu Ile His Glu His Met Val Ile Thr Asp Arg
85 90 95
Ile Glu Asn Ile Asp His Leu Gly Phe Phe Ile Tyr Arg Leu Cys His
100 105 110
Asp Lys Glu Thr Tyr Lys Leu
115
<210> 3
<211> 89
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 3
Met Val Lys Val Thr Phe Asn Ser Ala Leu Ala Gln Lys Glu Ala Lys
1 5 10 15
Lys Asp Glu Pro Lys Ser Gly Glu Glu Ala Leu Ile Ile Pro Pro Asp
20 25 30
Ala Val Ala Val Asp Cys Lys Asp Pro Asp Asp Val Val Pro Val Gly
35 40 45
Gln Arg Arg Ala Trp Cys Trp Cys Met Cys Phe Gly Leu Ala Phe Met
50 55 60
Leu Ala Gly Val Ile Leu Gly Gly Ala Tyr Leu Tyr Lys Tyr Phe Ala
65 70 75 80
Leu Gln Pro Asp Asp Val Tyr Tyr Cys
85
<210> 4
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 4
Glu Ala Ser Asn Cys Phe Ala Ile Arg His Phe Glu Asn Lys Phe Ala
1 5 10 15
Val Glu Thr Leu Ile Cys Ser
20
<210> 5
<211> 95
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 5
Phe Ala Asp Ser Asp Pro Ala Asn Ile Val His Asp Phe Asn Lys Lys
1 5 10 15
Leu Thr Ala Tyr Leu Asp Leu Asn Leu Asp Lys Cys Tyr Val Ile Pro
20 25 30
Leu Asn Thr Ser Ile Val Met Pro Pro Arg Asn Leu Leu Glu Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Ile Lys Ala Gly Thr Tyr Leu Pro Gln Ser Tyr Leu Ile His
50 55 60
Glu His Met Val Ile Thr Asp Arg Ile Glu Asn Ile Asp His Leu Gly
65 70 75 80
Phe Phe Ile Tyr Arg Leu Cys His Asp Lys Glu Thr Tyr Lys Leu
85 90 95
<210> 6
<211> 95
<212> PRT
<213> 普通黑猩猩（Pan troglodytes）
<400> 6
Phe Ala Asp Ser Asp Pro Ala Asn Ile Val His Asp Phe Asn Lys Lys
1 5 10 15
Leu Thr Ala Tyr Leu Asp Leu Asn Leu Asp Lys Cys Tyr Val Ile Pro
20 25 30
Leu Asn Thr Ser Ile Val Met Pro Pro Arg Asn Leu Leu Glu Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Ile Lys Ala Gly Thr Tyr Leu Pro Gln Ser Tyr Leu Ile His
50 55 60
Glu His Met Val Ile Thr Asp Arg Ile Glu Asn Ile Asp His Leu Gly
65 70 75 80
Phe Phe Ile Tyr Arg Leu Cys His Asp Lys Glu Thr Tyr Lys Leu
85 90 95
<210> 7
<211> 95
<212> PRT
<213> 奶牛（Bos taurus）
<400> 7
Phe Ala Asp Ser Asp Pro Ala Asn Ile Val His Asp Phe Asn Lys Lys
1 5 10 15
Leu Thr Ala Tyr Leu Asp Leu Asn Leu Asp Lys Cys Tyr Val Ile Pro
20 25 30
Leu Asn Thr Ser Ile Val Met Pro Pro Lys Asn Leu Leu Glu Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Ile Lys Ala Gly Thr Tyr Leu Pro Gln Ser Tyr Leu Ile His
50 55 60
Glu His Met Val Ile Thr Asp Arg Ile Glu Asn Ile Asp His Leu Gly
65 70 75 80
Phe Tyr Ile Tyr Arg Leu Cys His Asp Lys Glu Thr Tyr Lys Leu
85 90 95
<210> 8
<211> 95
<212> PRT
<213> 野猪（Sus scrofa）
<400> 8
Phe Ala Asp Ser Asp Pro Ala Asn Ile Val His Asp Phe Asn Lys Lys
1 5 10 15
Leu Thr Ala Tyr Leu Asp Leu Asn Leu Asp Lys Cys Tyr Val Ile Pro
20 25 30
Leu Asn Thr Ser Ile Val Met Pro Pro Arg Asn Leu Leu Glu Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Ile Lys Ala Gly Thr Tyr Leu Pro Gln Ser Tyr Leu Ile His
50 55 60
Glu His Met Val Ile Thr Asp Arg Ile Glu Asn Ile Asp His Leu Gly
65 70 75 80
Phe Tyr Ile Tyr Arg Leu Cys His Asp Lys Glu Thr Tyr Lys Leu
85 90 95
<210> 9
<211> 95
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 9
Phe Ala Asp Ser Asp Pro Ala Asn Ile Val His Asp Phe Asn Lys Lys
1 5 10 15
Leu Thr Ala Tyr Leu Asp Leu Asn Leu Asp Lys Cys Tyr Val Ile Pro
20 25 30
Leu Asn Thr Ser Ile Val Met Pro Pro Lys Asn Leu Leu Glu Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Ile Lys Ala Gly Thr Tyr Leu Pro Gln Ser Tyr Leu Ile His
50 55 60
Glu His Met Val Ile Thr Asp Arg Ile Glu Asn Val Asp Asn Leu Gly
65 70 75 80
Phe Phe Ile Tyr Arg Leu Cys His Asp Lys Glu Thr Tyr Lys Leu
85 90 95
<210> 10
<211> 95
<212> PRT
<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）
<400> 10
Phe Ala Asp Ser Asp Pro Ala Asn Ile Val His Asp Phe Asn Lys Lys
1 5 10 15
Leu Thr Ala Tyr Leu Asp Leu Asn Leu Asp Lys Cys Tyr Val Ile Pro
20 25 30
Leu Asn Thr Ser Ile Val Met Pro Pro Arg Asn Leu Leu Glu Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Ile Lys Ala Gly Thr Tyr Leu Pro Gln Ser Tyr Leu Ile His
50 55 60
Glu His Met Val Ile Thr Asp Arg Ile Glu Asn Val Asp His Leu Gly
65 70 75 80
Phe Phe Ile Tyr Arg Leu Cys His Asp Lys Glu Thr Tyr Lys Leu
85 90 95
<210> 11
<211> 127
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<221> 结构域
<222> 3..121
<223> Rh Bri2 BRICHOS结构域
<220>
<221> 结构域
<222> 122..127
<223> AU1标签
<400> 11
Gly Ser Gln Thr Ile Glu Glu Asn Ile Lys Ile Phe Glu Glu Glu Glu
1 5 10 15
Val Glu Phe Ile Ser Val Pro Val Pro Glu Phe Ala Asp Ser Asp Pro
20 25 30
Ala Asn Ile Val His Asp Phe Asn Lys Lys Leu Thr Ala Tyr Leu Asp
35 40 45
Leu Asn Leu Asp Lys Cys Tyr Val Ile Pro Leu Asn Thr Ser Ile Val
50 55 60
Met Pro Pro Arg Asn Leu Leu Glu Leu Leu Ile Asn Ile Lys Ala Gly
65 70 75 80
Thr Tyr Leu Pro Gln Ser Tyr Leu Ile His Glu His Met Val Ile Thr
85 90 95
Asp Arg Ile Glu Asn Ile Asp His Leu Gly Phe Phe Ile Tyr Arg Leu
100 105 110
Cys His Asp Lys Glu Thr Tyr Lys Leu Asp Thr Tyr Arg Tyr Ile
115 120 125
<210> 12
<211> 363
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<221> 结构域
<222> 3..121
<223> Rh Bri2 BRICHOS结构域
<220>
<221> 结构域
<222> 129..363
<223> mCherry
<400> 12
Gly Ser Gln Thr Ile Glu Glu Asn Ile Lys Ile Phe Glu Glu Glu Glu
1 5 10 15
Val Glu Phe Ile Ser Val Pro Val Pro Glu Phe Ala Asp Ser Asp Pro
20 25 30
Ala Asn Ile Val His Asp Phe Asn Lys Lys Leu Thr Ala Tyr Leu Asp
35 40 45
Leu Asn Leu Asp Lys Cys Tyr Val Ile Pro Leu Asn Thr Ser Ile Val
50 55 60
Met Pro Pro Arg Asn Leu Leu Glu Leu Leu Ile Asn Ile Lys Ala Gly
65 70 75 80
Thr Tyr Leu Pro Gln Ser Tyr Leu Ile His Glu His Met Val Ile Thr
85 90 95
Asp Arg Ile Glu Asn Ile Asp His Leu Gly Phe Phe Ile Tyr Arg Leu
100 105 110
Cys His Asp Lys Glu Thr Tyr Lys Leu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ile Ile Lys Glu Phe Met
130 135 140
Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Glu
145 150 155 160
Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala
165 170 175
Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile
180 185 190
Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His Pro
195 200 205
Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys
210 215 220
Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val Thr
225 230 235 240
Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys Leu
245 250 255
Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr
260 265 270
Met Gly Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly Ala
275 280 285
Leu Lys Gly Glu Ile Lys Gln Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His
290 295 300
Tyr Asp Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val Gln
305 310 315 320
Leu Pro Gly Ala Tyr Asn Val Asn Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser His
325 330 335
Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly Arg
340 345 350
His Ser Thr Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
355 360

Claims (15)

1.一种分离的重组蛋白，其选自下组：包含与来自人的Bri2的残基113-231(SEQ IDNO:2)具有至少70％同一性的氨基酸序列的蛋白；以及包含与来自人(SEQ ID NO:5)、黑猩猩(SEQ ID NO:6)、牛(SEQ ID NO:7)、猪(SEQ ID NO:8)、小鼠(SEQ ID NO:9)和大鼠(SEQID NO:10)的Bri2的BRICHOS结构域中的任一个具有至少70％同一性的氨基酸序列的蛋白；条件是所述蛋白不包含与来自人的Bri2的残基1-89(SEQ ID NO:3)具有至少70％同一性的氨基酸序列；并且所述蛋白不包含与人ABri23(SEQ ID NO:4)具有至少70％同一性的氨基酸序列；该分离的重组蛋白用于在治疗有需要的哺乳动物的阿尔茨海默病的方法中使用，该哺乳动物包括人，该方法包括以下步骤：
-向所述哺乳动物施用多个脂质微泡和/或纳米液滴
-向所述哺乳动物施用所述分离的重组蛋白；
其中所述分离的重组蛋白不包含在所述微泡和/或所述纳米液滴内；并且
其中该方法不包括对该哺乳动物的任何组织进行超声处理的任何步骤。
2.一种如前述权利要求中任一项所述的分离的重组蛋白和脂质微泡和/或纳米液滴的组合，该组合用于在治疗有需要的哺乳动物的阿尔茨海默病的方法中使用，该哺乳动物包括人，该方法包括以下步骤：
-向所述哺乳动物施用多个脂质微泡和/或纳米液滴
-向所述哺乳动物施用所述分离的重组蛋白；
其中所述分离的重组蛋白不包含在所述微泡和/或所述纳米液滴内；并且
其中该方法不包括对该哺乳动物的任何组织进行超声处理的任何步骤。
3.如权利要求1-2中任一项所述使用的分离的重组蛋白，其选自由以下组成的组：包含与来自人的Bri2的残基113-231(SEQ ID NO:2)具有至少70％同一性的氨基酸序列的蛋白；以及包含与来自人的Bri2的BRICHOS结构域(SEQ ID NO:5)具有至少70％同一性的氨基酸序列的蛋白。
4.如权利要求1-3中任一项所述使用的分离的重组蛋白，其由少于或等于200个氨基酸残基组成。
5.如权利要求1-4中任一项所述使用的分离的重组蛋白，其中所述微泡和/或所述纳米液滴具有在1-8μm范围内的直径。
6.一种治疗有需要的哺乳动物的阿尔茨海默病的方法，该哺乳动物包括人，该方法包括以下步骤：
-向所述哺乳动物施用多个脂质微泡和/或纳米液滴
-向所述哺乳动物施用选自下组的分离的重组蛋白：包含与来自人的Bri2的残基113-231(SEQ ID NO:2)具有至少70％同一性的氨基酸序列的蛋白；以及包含与来自人(SEQ IDNO:5)、黑猩猩(SEQ ID NO:6)、牛(SEQ ID NO:7)、猪(SEQ ID NO:8)、小鼠(SEQ ID NO:9)和大鼠(SEQ ID NO:10)的Bri2的BRICHOS结构域中的任一个具有至少70％同一性的氨基酸序列的蛋白；条件是所述蛋白不包含与来自人的Bri2的残基1-89(SEQ ID NO:3)具有至少70％同一性的氨基酸序列；并且所述蛋白不包含与人ABri23(SEQ ID NO:4)具有至少70％同一性的氨基酸序列；
其中所述分离的重组蛋白不包含在所述微泡和/或所述纳米液滴内；并且
其中该方法不包括对该哺乳动物的任何组织进行超声处理的任何步骤。
7.如权利要求6所述的方法，其中该分离的重组蛋白选自下组：包含与来自人的Bri2的残基113-231(SEQ ID NO:2)和来自人的Bri2的BRICHOS结构域(SEQ ID NO:5)中的任一个具有至少70％同一性的氨基酸序列的蛋白。
8.一种分离的蛋白，其包含
(i)选自下组的第一蛋白部分：包含与来自人的Bri2的残基113-231(SEQ ID NO:2)具有至少70％同一性的氨基酸序列的蛋白；以及包含与来自人(SEQ ID NO:5)、黑猩猩(SEQID NO:6)、牛(SEQ ID NO:7)、猪(SEQ ID NO:8)、小鼠(SEQ ID NO:9)和大鼠(SEQ ID NO:10)的Bri2的BRICHOS结构域中的任一个具有至少70％同一性的氨基酸序列的蛋白；以及
(ii)第二蛋白或多肽部分，优选含有至少50个氨基酸残基；
其中所述分离的蛋白不包含与来自人的Bri2的残基1-89(SEQ ID NO:3)具有至少70％同一性的氨基酸序列；并且
其中所述分离的蛋白不包含与人ABri23(SEQ ID NO:4)具有至少70％同一性的氨基酸序列。
9.如权利要求8所述的分离的蛋白，其中该第一蛋白部分选自下组：包含与来自人的Bri2的残基113-231(SEQ ID NO:2)和来自人的Bri2的BRICHOS结构域(SEQ ID NO:5)中的任一个具有至少70％同一性的氨基酸序列的蛋白。
10.如权利要求8-9中任一项所述的分离的蛋白，其中该第一蛋白部分由少于或等于200个氨基酸残基组成；和/或
其中所述第二蛋白或多肽部分的大小是5-200kDa。
11.如权利要求8-10中任一项所述的分离的蛋白，其中该第二蛋白或多肽部分选自由蛋白药物、多肽药物、蛋白标签、荧光蛋白、抗体、酶和/或神经营养因子组成的组。
12.一种如权利要求8-11中任一项所述的分离的蛋白和多个脂质微泡和/或纳米液滴的组合，其中所述分离的蛋白不包含在所述微泡和/或所述纳米液滴内。
13.如权利要求12所述的组合，其中所述微泡和/或所述纳米液滴具有在1-8μm范围内的直径。
14.一种用于在有需要的哺乳动物中运输如权利要求8-11中任一项所述的分离的蛋白穿过血脑屏障的方法，该哺乳动物包括人，该方法由以下步骤组成：
-向所述哺乳动物施用多个脂质微泡和/或纳米液滴；
-向所述哺乳动物施用所述分离的蛋白。
15.如权利要求8-11中任一项所述的分离的蛋白或如权利要求12-13中任一项所述的组合，用于在涉及在有需要的哺乳动物中运输所述分离的蛋白穿过血脑屏障的治疗的方法中使用，该哺乳动物包括人，该方法包括以下步骤：
-向所述哺乳动物施用多个脂质微泡和/或纳米液滴
-向所述哺乳动物施用所述分离的蛋白；
其中所述分离的蛋白不包含在所述微泡和/或所述纳米液滴内。
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