JP2022531937A - 筋萎縮性側索硬化症を治療するための方法と薬剤 - Google Patents

Abstract

本発明は、被験者に治療有効量のプラスミノーゲン経路活性化剤を投与することを含む、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療するための方法に係る。本発明はまた、プラスミノーゲン経路活性化剤を含む、筋萎縮性側索硬化症を治療するための医薬組成物、製品およびキットに係る。【選択図】なし

Description

本発明は、筋萎縮性側索硬化症および関連障害に罹患している被験者に、有効量のプラスミノーゲンなどのフィブリンプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物を投与することで、損傷した神経を修復し、臨床症状および徴候を改善することを含む、筋萎縮性側索硬化症および関連障害を治療する方法に関する。

筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＡＬＳ）は、段階的凍結疾患としても知られ、主に錐体路、脳幹、脊髄の前角細胞に係る致命的な神経系変性疾患であり、臨床症状として、筋萎縮、アクラチア、および痙攣が徐々に悪化する。患者の６０％以上が、この疾患の発症から３～５年後に呼吸筋麻痺で死亡した（Ｋｉｅｒｎａｎ ＭＣ，Ｖｕｃｉｓ Ｓ， Ｃｈｅａｈ ＢＣ， ｅｔ ａｌ． Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ． Ｌａｎｃｅｔ， ２０１１， ３７７：９４２－９５５）。

筋萎縮性側索硬化症の臨床症状は、主な症状と徴候として、上位運動ニューロン変性（主に腱反射亢進と筋緊張の増加を特徴とする）と下位運動ニューロン変性（筋萎縮、筋力低下、線維束性収縮、腱反射の喪失）である。一般に、症状は非対称であり、病変の位置から他の部位に徐々に進行するが、外眼筋と括約筋はほとんど関与していない。一部の患者は軽度の感覚症状を示す場合があるが、通常、感覚系は陰性として検査される。伝統的に、筋萎縮性側索硬化症の患者の認知機能はよく保存されていると考えられている。しかし、神経画像診断や神経心理学などの診断技術の発展に伴い、認知機能障害も筋萎縮性側索硬化症の一般的な特徴であることがわかっていた。

この病気の有病率は約４～６／１００，０００である。現在、唯一の治療薬は興奮性アミノ酸拮抗薬であるＲｉｌｕｔｅｋであり、各国の薬規制当局によって承認されているが、病気の進行を遅らせることしかできない。

本発明は研究によって、プラスミノーゲンなどのプラスミノーゲン経路活性化剤が、脊髄前角運動ニューロン損傷を有意に改善し、ＡＬＳを治療し、ＡＬＳの症状を改善することができることを見出した。

本発明は下記のことに係る。
１、プラスミノーゲン活性化経路の成分、プラスミノーゲンを直接活性化し得るか、またはプラスミノーゲン活性化経路の上流成分を活性化することによって間接的にプラスミノーゲンを活性化し得る化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミンの活性を模倣する化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミノーゲン活性化剤の発現をアップレギュレートすることができる化合物、プラスミノーゲン類似体、プラスミン類似体、ｔＰＡまたはｕＰＡ類似体および線維素溶解阻害剤の拮抗剤から選択される１つ以上の有効量のプラスミノーゲン経路活性剤を、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に罹患している被験者に投与することを含む、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療する方法。
２、前記プラスミノーゲン活性化経路の成分が、プラスミノーゲン、組換えヒトプラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン、プラスミン、プラスミノーゲンとプラスミンの１つ以上のｋｒｉｎｇｌｅドメインおよびプロテアーゼドメインを含むプラスミノーゲンおよびプラスミン変異体並びに類似体、ミニプラスミノーゲン（ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）、ミニプラスミン（ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎ）、マイクロプラスミノーゲン（ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）、マイクロプラスミン（ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎ）、ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲン、ｄｅｌｔａ－プラスミン（ｄｅｌｔａ－ｐｌａｓｍｉｎ）、プラスミノーゲン活性化剤、ｔＰＡ、およびｕＰＡから選択されるものである、項１に記載の方法。
３、前記線維素溶解阻害剤の拮抗剤は、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２抗プラスミンまたはα２マクログロブリンの拮抗剤、例えば、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２抗プラスミンまたはα２マクログロブリンの抗体である、項１に記載の方法。
４、前記筋萎縮性側索硬化症は、遺伝性および孤発性のＡＬＳを含む、項１～３のいずれか１項に記載の方法。
５、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が前記筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に罹患している被験者に対して、寿命と生存期間の中央値の延伸、筋肉の萎縮と筋力の低下の遅延、体重減少の速度の緩和、脊髄の前角における細胞損傷、変性および壊死の低減、脊髄の前角におけるｃｈＡＴの合成の促進、コリン作動性ニューロン機能の回復の促進、脊髄の前角におけるシナプトフィジンの発現の促進、脊髄の前角におけるＳＭＮタンパク質の発現の促進、脊髄の前角の炎症の修復の促進、およびシナプス損傷の修復の促進から選択される１つ以上の活性を有する、項１～４のいずれか１項に記載の方法。
６、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、被験者の筋萎縮、筋力低下、けいれん、および／または線維束性収縮の症状を改善する、項１～５のいずれか１項に記載の方法。
７、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、被験者の体重減少を軽減し、および／または生存期間を延長する、項１～６のいずれか１項に記載の方法。
８、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、被験者の筋緊張を改善する、項１～７のいずれか１項に記載の方法。
９、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、被験者の筋肉機能の回復を促進する、項１～８のいずれか１項に記載の方法。
１０、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、被験者の脊髄前角のニューロン損傷の修復を促進する、項１～９のいずれか１項に記載の方法。
１１、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、１つ以上の他の薬剤および／または治療方法と組み合わせて投与され、好ましくは、前記治療方法が、細胞治療（例えば、幹細胞治療）および遺伝子治療、アンチセンスＲＮＡ、小分子スプライシング修飾剤などを含む、項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
１２、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、プラスミノーゲン活性化経路の成分、例えば、プラスミノーゲンである、項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
１３、前記プラスミノゲンが、配列２、６、８、１０または１２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノーゲン活性および／またはリジン結合活性を有する、項１２に記載の方法。
１４、前記プラスミノーゲンがプラスミノーゲン活性および／またはリジン結合活性フラグメントを含み、且つ依然としてプラスミノーゲン活性および／またはリジン結合活性を有するタンパク質である、項１２に記載の方法。
１５、前記プラスミノーゲンがＧｌｕ－プラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、ミニプラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン、ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲンまたはそれらの、プラスミノーゲン活性を保持した変異体から選択されるものである、項１２に記載の方法。
１６、前記プラスミノーゲンが、天然または合成のヒトプラスミノーゲン、または依然としてプラスミノーゲン活性および／またはリジン結合活性を保持した変異体若しくはフラグメントである、項１２に記載の方法。
１７、前記プラスミノーゲンが、静脈内、筋肉内、髄腔内、鼻吸入、エアロゾル吸入、点鼻薬または点眼薬の投与によって投与される、項１２に記載の方法。

本願の上記いずれか１つの実施形態において、前記プラスミノゲンが配列２、６、８、１０または１２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノーゲン活性および／またはリジン結合活性を有し得る。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、配列２、６、８、１０または１２に基づいて、１～１００、１～９０、１～８０、１～７０、１～６０、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３、１～２、１個のアミノ酸を付加、欠失、および／または置換され、かつ依然としてプラスミノーゲン活性および／またはリジン結合活性を有するタンパク質である。

一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンはプラスミノーゲン活性および／またはリジン結合活性フラグメントを含有し、且つ依然としてプラスミノーゲン活性および／またはリジン結合活性を有するタンパク質である。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、ミニプラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン、δ－プラスミノーゲンまたはそれらのプラスミノーゲン活性および／またはリジン結合活性を保持した変異体である。上記実施形態において、前記プラスミノーゲンは、天然または合成のヒトプラスミノーゲン、または依然としてプラスミノーゲン活性および／またはリジン結合活性を保持した変異体若しくはフラグメントである。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するヒトプラスミノーゲンのオルソログ、または依然としてプラスミノーゲン活性および／またはリジン結合活性を保持した変異体若しくはフラグメントである。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンのアミノ酸は配列２、６、８、１０または１２に示される。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンはヒト天然プラスミノーゲンである。

一部の実施形態において、前記被験者はヒトである。一部の実施形態において、前記被験者はプラスミノーゲンが不足、または欠乏している。一部の実施形態において、前記不足または欠乏は、先天的、続発的及び／または局所的である。

前記方法の一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは全身または局所にて投与される。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、鼻吸入、エアロゾル吸入、点鼻薬または点眼薬の投与によって投与される。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、静脈内、筋肉内、皮下、髄腔内注射によってプラスミノーゲンを投与することで治療する。前記方法の一部の実施形態において、前記プラスミノゲンは毎日０．０００１～２０００ｍｇ／ｋｇ、０．００１～８００ｍｇ／ｋｇ、０．０１～６００ｍｇ／ｋｇ、０．１～４００ｍｇ／ｋｇ、１～２００ｍｇ／ｋｇ、１～１００ｍｇ／ｋｇ、１０～１００ｍｇ／ｋｇ（体重１キロあたりで計算）または０．０００１～２０００ｍｇ／ｃｍ^２、０．００１～８００ｍｇ／ｃｍ^２、０．０１～６００ｍｇ／ｃｍ^２、０．１～４００ｍｇ／ｃｍ^２、１～２００ｍｇ／ｃｍ^２、１～１００ｍｇ／ｃｍ^２、１０～１００ｍｇ／ｃｍ^２（体表面積平方センチメートルあたりで計算）の用量で投与し、一回以上繰り返し、好ましくは少なくとも毎日、２日ごと、３日ごとに投与する。

一部の実施形態において、本願は下記の実施形態に係る。
１、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に罹患している被験者に治療有効量のプラスミノーゲン経路活性化剤を投与することを含む、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療する方法。
２、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が前記筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に罹患している被験者に対して、寿命と生存期間の中央値の延伸、筋肉の萎縮と筋力の低下の遅延、体重減少の速度の緩和、脊髄の前角における細胞損傷、変性および壊死の低減、脊髄の前角におけるｃｈＡＴの合成の促進、コリン作動性ニューロン機能の回復の促進、脊髄の前角におけるシナプトフィジンの発現の促進、脊髄の前角におけるＳＭＮタンパク質の発現の促進、脊髄の前角の炎症の修復の促進、およびシナプス損傷の修復の促進から選択される１つ以上の活性を有する、項１に記載の方法。
３、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、被験者の筋萎縮、筋力低下、けいれん、および／または線維束性収縮の症状を改善する、項１に記載の方法。
４、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、被験者の体重減少を軽減し、および／または生存期間を延長する、項１に記載の方法。
５、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、被験者の筋緊張を改善する、項１に記載の方法。
６、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、被験者の筋肉機能の回復を促進する、項１に記載の方法。
７、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、被験者の脊髄前角のニューロン損傷の修復を促進する、項１に記載の方法。
８、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、１つ以上の他の薬剤および／または治療方法と組み合わせて投与される、項１～７のいずれか１項に記載の方法。
９、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、静脈内、皮下、筋肉内、髄腔内、鼻吸入、エアロゾル吸入、点鼻薬または点眼薬の投与によって投与される、項１～８のいずれか１項に記載の方法。
１０、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、プラスミノーゲン活性化経路の成分である、項１～９のいずれか１項に記載の方法。
１１、前記プラスミノーゲン活性化経路の成分がプラスミノーゲンである、項１０に記載の方法。
１２、前記プラスミノゲンが、配列２、６、８、１０または１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノーゲン活性を有する、項１１に記載の方法。
１３、前記プラスミノーゲンがプラスミノーゲン活性フラグメントを含み、且つ依然としてプラスミノーゲン活性および／またはリジン結合活性を有するタンパク質である、項１１に記載の方法。
１４、前記プラスミノーゲンがＧｌｕ－プラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、ミニプラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン、ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲンまたはそれらの、プラスミノーゲン活性を保持した変異体から選択されるものである、項１１に記載の方法。
１５、前記プラスミノーゲンが、天然または合成のヒトプラスミノーゲン、または依然としてプラスミノーゲン活性および／またはリジン結合活性を保持した変異体若しくはフラグメントである、項１１に記載の方法。

本発明はまた、治療有効量のプラスミノーゲン経路活性化剤を含む、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療のための医薬組成物、薬剤、製剤、キット、および製品に関する。

一部の実施形態において、前記プラスミノーゲン経路活性化剤は前記筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に罹患している被験者に対して、寿命と生存期間の中央値の延伸、筋肉の萎縮と筋力の低下の遅延、体重減少の速度の緩和、脊髄の前角における細胞損傷、変性および壊死の低減、脊髄の前角におけるｃｈＡＴの合成の促進、コリン作動性ニューロン機能の回復の促進、脊髄の前角におけるシナプトフィジンの発現の促進、脊髄の前角におけるＳＭＮタンパク質の発現の促進、脊髄の前角の炎症の修復の促進、およびシナプス損傷の修復の促進から選択される１つ以上の活性を有する。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、被験者の筋萎縮、筋力低下、けいれん、および／または線維束性収縮の症状を改善する。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、被験者の体重減少を軽減し、および／または生存期間を延長する。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、被験者の筋緊張を改善する。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、被験者の筋肉機能の回復を促進する。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、被験者の脊髄前角のニューロン損傷の修復を促進する。

一部の実施形態において、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、プラスミノーゲン活性化経路の成分である。一部の実施形態において、プラスミノーゲン活性化経路の成分がプラスミノーゲンである。一部の実施形態において、前記プラスミノゲンが、配列２、６、８、１０または１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノーゲン活性および／またはリジン結合活性を有する。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンがプラスミノーゲン活性および／またはリジン結合活性フラグメントを含み、且つ依然としてプラスミノーゲン活性および／またはリジン結合活性を有するタンパク質である。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンがＧｌｕ－プラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、ミニプラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン、ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲンまたはそれらの、プラスミノーゲン活性を保持した変異体から選択されるものである。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンが、天然または合成のヒトプラスミノーゲン、または依然としてプラスミノーゲン活性および／またはリジン結合活性を保持した変異体若しくはフラグメントである。

一部の実施形態において、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、例えば、プラスミノーゲンなどのプラスミノーゲン活性化経路の成分が１つ以上の他の薬剤および／または治療方法と組み合わせて投与される。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、例えば、プラスミノーゲンなどのプラスミノーゲン活性化経路の成分が静脈内、皮下、筋肉内、髄腔内、鼻吸入、エアロゾル吸入、点鼻薬または点眼薬の投与によって投与される。

一部の実施形態において、前記医薬組成物、薬剤、製剤は、薬学的に許容される担体および、例えば、プラスミノーゲンなどのプラスミノーゲン活性化経路の成分のようなプラスミノーゲン経路活性化剤を含む。一部の実施形態において、前記キットおよび製品は、前記医薬組成物、薬剤または製剤を含む１つ以上の容器を含む。一部の実施形態において、前記キットまたは製品は、例えば、プラスミノーゲンのようなプラスミノーゲン活性化経路の成分などのプラスミノーゲン経路活性化剤の使用による筋萎縮性側索硬化症の治療方法を指示するラベルまたはプロトコルをさらに含む。

一部の実施形態において、前記キットまたは製品は、他の薬剤を含む別の１つ以上の容器をさらに含む。

本発明は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療する医薬組成物、薬剤、製剤、キット、及び製品の調製における、治療有効量のプラスミノーゲン経路活性化剤の使用にも係る。

一部の実施形態において、前記プラスミノーゲン経路活性化剤は前記筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に罹患している被験者に対して、寿命と生存期間の中央値の延伸、筋肉の萎縮と筋力の低下の遅延、体重減少の速度の緩和、脊髄の前角における細胞損傷、変性および壊死の低減、脊髄の前角におけるｃｈＡＴの合成の促進、コリン作動性ニューロン機能の回復の促進、脊髄の前角におけるシナプトフィジンの発現の促進、脊髄の前角におけるＳＭＮタンパク質の発現の促進、脊髄の前角の炎症の修復の促進、およびシナプス損傷の修復の促進から選択される１つ以上の活性を有する。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、被験者の筋萎縮、筋力低下、けいれん、および／または線維束性収縮の症状を改善する。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、被験者の体重減少を軽減し、および／または生存期間を延長する。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、被験者の筋緊張を改善する。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、被験者の筋肉機能の回復を促進する。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、被験者の脊髄前角のニューロン損傷の修復を促進する。

一部の実施形態において、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、プラスミノーゲン活性化経路の成分である。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲン活性化経路の成分がプラスミノーゲンである。一部の実施形態において、前記プラスミノゲンが、配列２、６、８、１０または１２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノーゲン活性および／またはリジン結合活性を有する。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンがプラスミノーゲン活性および／またはリジン結合活性フラグメントを含み、且つ依然としてプラスミノーゲン活性および／またはリジン結合活性を有するタンパク質である。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンがＧｌｕ－プラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、ミニプラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン、ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲンまたはそれらの、プラスミノーゲン活性を保持した変異体から選択されるものである。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンが、天然または合成のヒトプラスミノーゲン、または依然としてプラスミノーゲン活性および／またはリジン結合活性を保持した変異体若しくはフラグメントである。

一部の実施形態において、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、例えば、プラスミノーゲンなどのプラスミノーゲン活性化経路の成分が１つ以上の他の薬剤および／または治療方法と組み合わせて投与される。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、例えば、プラスミノーゲンなどのプラスミノーゲン活性化経路の成分が静脈内、筋肉内、皮下、髄腔内、鼻吸入、エアロゾル吸入、点鼻薬または点眼薬の投与によって投与される。

一部の実施形態において、前記医薬組成物、薬剤、製剤は、薬学的に許容される担体および、例えば、プラスミノーゲンなどのプラスミノーゲン活性化経路の成分のようなプラスミノーゲン経路活性化剤を含む。一部の実施形態において、前記キットおよび製品は、前記医薬組成物、薬剤または製剤を含む１つ以上の容器を含む。一部の実施形態において、前記キットまたは製品は、例えば、プラスミノーゲンのようなプラスミノーゲン活性化経路の成分などのプラスミノーゲン経路活性化剤の使用による筋萎縮性側索硬化症の治療方法を指示するラベルまたはプロトコルをさらに含む。

一部の実施形態において、前記キットまたは製品は、他の薬剤を含む別の１つ以上の容器をさらに含む。

本発明は、本発明の実施形態に属する技術的特徴のすべての組み合わせを明確にカバーし、これらの組み合わせ後の技術構成は、上記の技術構成が別個に明確に開示されたのと同様に、本出願において明確に開示された。さらに、本発明はまた、各実施形態とそれらの要素との間の組み合わせを明確にカバーし、組み合わせ後の技術構成は、本明細書に明確に開示されている。

図１は、プラスミノーゲン投与後のＡＬＳモデルマウスの寿命と生存期間の統計結果を示す図である。図１Ａは寿命の統計結果を示し、図１Ｂは生存期間の統計結果を示す。その結果、プラスミノーゲン投与群のマウスの平均寿命は１６４±８．６日であり、溶媒対照群のマウスの平均寿命は１５３±０日であり、溶媒対照群と比べて、プラスミノーゲン投与群の寿命は約１１日長かった。プラスミノーゲン投与群のマウスの生存期間の中央値は５３±９日であり、溶媒対照群の生存期間の中央値は４０±０日であり、溶媒対照群と比べて、プラスミノーゲン投与群の生存期間の中央値は約１３日長く、約３０％延長された。この結果は、プラスミノーゲンがＡＬＳマウスの寿命と生存期間の中央値を延長できることを示している。 その結果、２つの群のマウスのサスペンション潜伏時間は投与期間中に減少したが、プラスミノーゲン投与群のマウスのサスペンション潜伏時間は常に溶媒対照群のマウスよりも長かく、しかも投与の６、２１、および２３日目に、溶媒群と比べて、プラスミノーゲン投与群のサスペンション潜伏時間は統計学的に有意または非常に有意であり、Ｐ値はそれぞれ０．０３、０．０２、および０．００８であった。これは、プラスミノーゲンがＡＬＳマウスの筋力低下を遅らせることができることを示している。 図３は、プラスミノーゲン投与後のＡＬＳモデルマウスにおける２点神経行動が現れた時間を示す図である。その結果、プラスミノーゲン投与群のマウスの２点神経行動が現れた時点は、溶媒群より有意に遅く、統計学的差は有意であった（＊はＰ＜０．０５を表す）。 図４は、プラスミノーゲン投与後、１日目の体重に対する正常マウスとＡＬＳモデルマウスの体重の割合の統計結果を示す図である。その結果、投与中、ブランク対照群のマウスの体重はあまり変動することなく徐々に上昇する傾向があり、溶媒対照群のマウスの体重は徐々に減少し、プラスミノーゲン投与群のマウスの体重は、最初の２５日間で大きく変動していたが、ブランク対照群のマウスの体重に近いかわずかに多く、２５日後に体重は徐々に減少していたが、溶媒対照群のマウスの体重よりも常に多く、溶媒対照群と比較して、Ｐ値は０．００１を下回るか０．００１に近かった。これは、プラスミノーゲンがＡＬＳモデルマウスの体重減少率を有意に緩和し、ＡＬＳの悪化を遅らせることができることを示している。 図５は、プラスミノーゲン投与後の正常マウスおよびＡＬＳモデルマウスの脊髄前角のＨ＆Ｅ染色における液胞面積の統計結果を示す図である。Ａはブランク対照群、Ｂは溶媒群、Ｃは投与群、Ｄは液胞面積の統計結果を示す図である。その結果、ブランク対照群マウスの脊髄の前角に一定レベルの液胞面積が示され、溶媒群マウスの脊髄の前角の液胞面積がブランク対照群マウスのそれよりも有意に大きく（Ｐ＜０．００１）、投与群のマウスの脊髄前角の液胞面積は、溶媒群のマウスよりも有意に低く、しかも統計学的差は非常に有意である。これは、プラスミノーゲンがＡＬＳモデルマウスの脊髄の前角の空胞面積を減少させ、脊髄の前角の運動ニューロンの死を減少させることができることを示唆している。 図６は、プラスミノーゲン投与後の正常マウスとＡＬＳモデルマウスの脊髄前角におけるｃｈＡＴの免疫組織化学的染色結果を示す図である。Ａはブランク対照群、Ｂは溶媒群、Ｃは投与群、Ｄは平均光学密度の統計結果を示す図である。その結果、ブランク対照群マウスの脊髄前角で一定量のｃｈＡＴが発現し、溶媒群マウスのｃｈＡＴ発現レベルはブランク対照群マウスよりも有意に低く、投与群マウスの脊髄前角のｃｈＡＴ発現は溶媒群マウスよりも有意に高く、統計学的差は有意であった（Ｐ＜０．０５）。これは、プラスミノーゲンがＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスの脊髄前角におけるｃｈＡＴの合成と発現を促進し、コリン作動性ニューロン機能の回復を促進できることを示している。 図７は、プラスミノーゲン投与後の正常マウスおよびＡＬＳモデルマウスの脊髄前角におけるシナプトフィジンの免疫組織化学的染色結果を示す図である。Ａはブランク対照群、Ｂは溶媒群、Ｃは投与群、Ｄは平均光学密度の統計結果を示す図である。その結果、ブランク対照群マウスの脊髄前角で一定量のシナプトフィジンが発現し、溶媒群マウスのシナプトフィジンの発現レベルはブランク対照群マウスよりも有意に低く、投与群マウスの脊髄前角のシナプトフィジン発現は溶媒群マウスよりも有意に高く、統計学的差は有意であった（Ｐ＜０．０５）。これは、プラスミノーゲンがモデルマウスの脊髄前角におけるシナプトフィジンの発現を促進し、シナプス損傷の修復を促進できることを示している。 図８は、プラスミノーゲン投与後の正常マウスおよびＡＬＳモデルマウスの脊髄前角におけるＩｂａ－１の免疫組織化学的染色結果を示す図である。Ａはブランク対照群、Ｂは溶媒群、Ｃは投与群、Ｄは平均光学密度の統計結果を示す図である。その結果、ブランク対照群マウスの脊髄前角で一定レベルのＩｂａ－１が発現し、投与群マウスの脊髄前角におけるＩｂａ－１の発現レベルは溶媒群とブランク対照群マウスよりも有意に高く、統計学的差は有意であった（Ｐ＜０．０５または０．０１）。これは、プラスミノーゲンがモデルマウスの脊髄前角の炎症の修復を促進できることを示している。 図９は、プラスミノーゲン投与後の正常マウスおよびＡＬＳモデルマウスにおける腓腹筋のＨ＆Ｅ染色の代表的な画像を示す図である。Ａはブランク対照群、Ｂは溶媒群、Ｃは投与群である。その結果、ブランク対照群マウスの腓腹筋線維は構造が完全であり、形状とサイズが比較的に均一であるに対し、溶媒群の腓腹筋線維は、局所的な炎症性細胞浸潤（赤い矢印）および筋線維の真円度の変化を伴う重度の萎縮を示す。投与群の筋線維萎縮は、溶媒群よりも重症度は低いが、炎症性細胞浸潤もあった。これは、プラスミノーゲンがモデルマウスの筋萎縮を改善できることを示している。 図１０は、プラスミノーゲン投与後の正常マウスおよびＡＬＳモデルマウスの臀筋のＨ＆Ｅ染色の代表的な画像を示す図である。Ａはブランク対照群、Ｂは溶媒群、Ｃは投与群である。その結果、ブランク対照群マウスの筋線維は構造が比較的に完全であり、形状とサイズが比較的に均一である。溶媒群マウスの臀筋の筋線維は、真円度の変化、異なるサイズ、重度の萎縮、および炎症性細胞の浸潤を示す。投与群のマウスの臀筋線維の構造及び形状は、溶媒群のそれと比較してある程度回復している。これは、プラスミノーゲンがモデルマウスの筋萎縮を改善できることを示している。 図１１は、プラスミノーゲン投与後のＡＬＳモデルマウスの脊髄前角におけるＳＭＮタンパク質の免疫組織化学的染色の代表的な画像を示す図である。Ａはブランク対照群、Ｂは溶媒群、Ｃは投与群である。その結果、投与群マウスの脊髄前角におけるＳＭＮタンパク質の発現レベルは、溶媒群よりも有意に高い。これは、プラスミノーゲンがモデルマウスの脊髄前角におけるＳＭＮタンパク質の発現を促進できることを示している。

発明の詳細な説明

本発明において、「筋萎縮性側索硬化症」は、運動ニューロン損傷によって引き起こされる一連の病理学的変化を指す。前記病理学的変化には、運動ニューロン変性、神経膠症（グリオーシス）、神経線維異常、皮質脊髄路および脊髄神経の前根における有髄線維の喪失が含まれる。延髄運動ニューロンの損傷の症状には、例えば、顔の筋肉、言語、嚥下機能障害などがある。脊髄運動ニューロンの損傷の症状には、筋肉のけいれん、筋力低下、筋萎縮、麻痺、および呼吸不全が含まれる。

ＡＬＳは、下位運動ニューロンと上位運動ニューロンの機能障害の進行性の症状を特徴としている。下位運動ニューロンは、脳幹と脊髄を筋線維に接続し、それらの機能不全は、筋萎縮、けいれん、および線維束性収縮を引き起こす。上位運動ニューロンは、大脳皮質または脳幹の運動領域から発生し、標的筋肉を刺激するために直接応答する運動ニューロンに運動情報を伝達する。それらの機能不全は、けいれん（歩行、運動、および発話を妨げる継続的な筋収縮）および病理学的反射を引き起こす。ＡＬＳは、家族性の遺伝があるかどうかに応じて、孤発性ＡＬＳ（ｓＡＬＳ）と家族性ＡＬＳ（ｆＡＬＳ）に分けることができる。孤発性ＡＬＳにはＡＬＳ家族歴はなく、家族性ＡＬＳの家族には複数のＡＬＳ患者がいる。遺伝のさまざまな方法によって、家族性ＡＬＳは、常染色体優性遺伝、常染色体劣性遺伝、およびＸ染色体を伴う遺伝に分けることができる。

運動神経は筋肉組織に栄養を与えることができる。運動神経を遮断した後、筋肉内でグリコーゲン合成が遅くなり、タンパク質の分解が加速し、筋肉が徐々に萎縮する。本出願は、プラスミノーゲンによる、運動神経損傷によって引き起こされる筋萎縮および関連する障害の治療にも係る。

線維素溶解系（Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍ）は、線維素溶解（線溶）の過程に関与する一連の化学物質からなる系であり、主にプラスミノーゲン（PLG）、プラスミン、プラスミノーゲン活性化因子、および線維素溶解阻害剤を含む。プラスミノーゲン活性化因子には、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ－ＰＡ）、およびウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕ－ＰＡ）が含まれる。ｔ－ＰＡはセリンプロテアーゼであり、血管内皮細胞によって合成される。ｔ－ＰＡはプラスミノーゲンを活性化し、このプロセスは主にフィブリンで行われる。ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕ－ＰＡ）は、尿細管上皮細胞と血管内皮細胞によって産生され、補因子としてフィブリンを必要とすることなくプラスミノーゲンを直接活性化することができる。プラスミノーゲン（ＰＬＧ）は肝臓で合成される。血液が凝固すると、ＰＬＧはフィブリンネットに大量に吸着され、ｔ－ＰＡまたはｕ－ＰＡの作用によりプラスミンに活性化されて線維素溶解を促進する。プラスミナーゼ（ＰＬ）はセリンプロテアーゼであり、フィブリンとフィブリノーゲンを分解し、様々な凝固因子Ｖ、ＶＩＩＩ、Ｘ、ＶＩＩ、ＸＩ、ＩＩなどを加水分解し、プラスミノーゲンをプラスミンに変換し、補体を加水分解するなどの作用がある。線維素溶解阻害剤には、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤（ＰＡＩ）、およびα２－抗チプラスミン（α２－ＡＰ）が含まれる。ＰＡＩには主にＰＡＩ－１とＰＡＩ－２の２つの形態があり、ｔ－ＰＡに１：１の比率で特異的に結合し、それによってそれを不活性化すると同時にＰＬＧを活性化することができる。α２－ＡＰは肝臓で合成され、ＰＬと１：１の比率で結合して複合体を形成し、それによってＰＬ活性を阻害する。ＦＸＩＩＩはα２－ＡＰをフィブリンと共有結合させ、それによってＰＬに対するフィブリンの感受性を弱める。インビボでの線維素溶解系の活性を阻害する物質としては、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２抗プラスミン、およびα２－マクログロブリンが挙げられる。

本明細書で使用される「プラスミノーゲン経路活性化剤」または「フィブリンプラスミノーゲン経路活性化剤」という用語は、プラスミノーゲン活性化経路の成分、プラスミノーゲンを直接活性化できる、若しくはプラスミノーゲン活性化経路の上流成分を活性化することによってプラスミノーゲンを間接に活性化できる化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミンの活性を模倣する化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミノーゲン活性化剤の発現をアップレギュレートすることができる化合物、プラスミノーゲン類似体、プラスミン類似体、ｔＰＡまたはｕＰＡ類似体、および線維素溶解阻害剤の拮抗剤をカバーする。

本明細書で使用される「プラスミノーゲン活性化経路の成分」または「フィブリンプラスミノーゲン活性化経路の成分」という用語は、
１、プラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン（ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）、ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲン、それらの変異体または類似体；
２、プラスミンおよびそれらの変異体または類似体;および
３、プラスミノーゲン活性化剤、例えば、ｔＰＡおよびｕＰＡ、ならびにｔＰＡまたはｕＰＡの１つ以上のドメイン（１つ以上のｋｒｉｎｇｌｅドメインおよびタンパク質加水分解ドメインなど）を含むｔＰＡまたはｕＰＡ変異体および類似体をカバーする。

「線維素溶解阻害剤の拮抗剤」という用語は、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２－抗プラスミンまたはα２－マクログロブリンの拮抗剤、例えば、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２－抗プラスミンまたはα２－マクログロブリンをカバーする。

上記プラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡおよびｕＰＡの「変異体」は、すべての天然に存在するヒトの遺伝的変異体およびこれらのタンパク質の他の哺乳動物型、並びに、例えば、１～１００、１～９０、１～８０、１～７０、１～６０、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３、１～２、１個のアミノ酸を付加、欠失、および／または置換されてかつ依然としてプラスミノーゲン活性、プラスミン活性、ｔＰＡまたはｕＰＡ活性を有するタンパク質を含む。例えば、プラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡまたはｕＰＡの「変異体」は、例えば、１～１００、１～９０、１～８０、１～７０、１～６０、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３、１～２、１個の保存的アミノ酸によって置換されて得られるこれらのタンパク質の突然変異体を含む。

本発明の「プラスミノゲン変異体」は、配列２、６、８、１０または１２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノーゲン活性および／またはリジン結合活性を有するタンパク質をカバーする。例えば、本発明の「プラスミノーゲン変異体」は、配列２、６、８、１０または１２に基づいて、１～１００、１～９０、１～８０、１～７０、１～６０、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３、１～２、１個のアミノ酸を付加、欠失、および／または置換し、且つ依然としてプラスミノーゲン活性および／またはリジン結合活性を有するタンパク質であり得る。具体的には、本発明のプラスミノーゲン変異体は、すべての天然に存在するヒトの遺伝的変異体およびこれらのタンパク質の他の哺乳動物型、並びに、例えば、１～１００、１～９０、１～８０、１～７０、１～６０、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３、１～２、１個のアミノ酸をの保存的置換によって得られるこれらのタンパク質の突然変異体を含む。

本発明のプラスミノーゲンは、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するヒトプラスミノーゲンのオルソログ、または依然としてプラスミノーゲン活性および／またはリジン結合活性を保持した変異体、例えば、配列２、６、８、１０または１２に示されるプラスミノーゲン、例えば、配列２に示されるヒト天然プラスミノーゲンであり得る。

上記プラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡおよびｕＰＡの「類似体」はそれぞれ、プラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡまたはｕＰＡと実質的に同様の効果を提供する化合物を含む。

上記プラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡおよびｕＰＡの「変異体」および「類似体」は、１つ以上のドメイン（例えば、１つ以上のｋｒｉｎｇｌｅドメインおよびタンパク質加水分解ドメイン）を含むプラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡおよびｕＰＡの「変異体」および「類似体」をカバーする。例えば、プラスミノーゲンの「変異体」および「類似体」は、１つ以上のプラスミノーゲンドメイン（例えば、１つ以上のｋｒｉｎｇｌｅドメインおよびタンパク質加水分解ドメイン）を含むプラスミノーゲン変異体および類似体、例えば、ミニプラスミノーゲン（ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）をカバーする。プラスミンの「変異体」および「類似体」は、１つ以上のプラスミンドメイン（例えば、１つまたは複数のｋｒｉｎｇｌｅドメインおよびタンパク質加水分解ドメイン）を含むミニプラスミン（ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎ）やδ－プラスミン（ｄｅｌｔａ－ｐｌａｓｍｉｎ）などのプラスミンの「変異体」および「類似体」をカバーする。

上記プラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡまたはｕＰＡの「変異体」または「類似体」がそれぞれプラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡまたはｕＰＡの活性を有するかどうか、またはそれらがプラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡまたはｕＰＡと実質的に同様の効果をそれぞれ提供するかどうかは、当技術分野で知られている方法、例えば、エンザイモグラフィ（ｅｎｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ）、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）およびＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞ソーティング法）を使用して、活性化されたプラスミン活性のレベルによって測定できる。例えば、次の文献に記載されている方法を参照して測定することができる。Ｎｙ，Ａ．，Ｌｅｏｎａｒｄｓｓｏｎ，Ｇ．，Ｈａｇｇｌｕｎｄ，Ａ．Ｃ，Ｈａｇｇｌｏｆ，Ｐ．，Ｐｌｏｐｌｉｓ，Ｖ．Ａ．，Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｐ． ａｎｄ Ｎｙ，Ｔ． （１９９９）． Ｏｖｕｌａｔｉｏｎ ｉｎｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４０，５０３０－５０３５；Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ ＲＬ， Ｌｅｕｎｇ ＬＬ， Ｈａｒｐｅｌ ＰＣ， Ｎａｃｈｍａｎ ＲＬ （Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９８４）． “Ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ ｗｉｔｈ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ． Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｉｓｓｕｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ”． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７４ （５）： １６２５-３３；Ｇｒａｖａｎｉｓ Ｉ， Ｔｓｉｒｋａ ＳＥ （Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００８）． “Ｔｉｓｓｕｅ－ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ａｓ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｉｎ ｓｔｒｏｋｅ”． Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｔａｒｇｅｔｓ． １２ （２）： １５９-７０；Ｇｅｉｇｅｒ Ｍ， Ｈｕｂｅｒ Ｋ， Ｗｏｊｔａ Ｊ， Ｓｔｉｎｇｌ Ｌ， Ｅｓｐａｎａ Ｆ， Ｇｒｉｆｆｉｎ ＪＨ， Ｂｉｎｄｅｒ ＢＲ （Ａｕｇ １９８９）． “Ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ”． Ｂｌｏｏｄ． ７４ （２）： ７２２-８。

本発明の一部の実施形態において、本発明の「プラスミノーゲン活性化経路の成分」はプラスミノーゲンであり、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、ミニプラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン、δ－プラスミノーゲンまたはそれらのプラスミノーゲン活性を保持した変異体から選択される。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、天然または合成のヒトプラスミノーゲン、または依然としてプラスミノーゲン活性および／またはリジン結合活性を保持した保存的突然変異体若しくはそのフラグメントである。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するヒトプラスミノーゲンのオルソログ、または依然としてプラスミノーゲン活性および／またはリジン結合活性を保持した保存的突然変異体若しくはそのフラグメントである。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンのアミノ酸は配列２、６、８、１０または１２に示される。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンはヒト天然プラスミノーゲンである。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは配列２に示されるヒト天然プラスミノーゲンである。

「プラスミノーゲンを直接活性化できる、若しくはプラスミノーゲン活性化経路の上流成分を活性化することによってプラスミノーゲンを間接に活性化できる化合物」とは、プラスミノーゲンを直接活性化できる、若しくはプラスミノーゲン活性化経路の上流成分を活性化することによってプラスミノーゲンを間接に活性化できる任意の化合物を指し、例えば、ｔＰＡ、ｕＰＡ、ストレプトキナーゼ、サルプラーゼ、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ、アニストレプラーゼ、モンテプラーゼ、ラノテプラーゼ、パミテプラーゼ、およびスタフィロキナーゼが挙げられる。

本発明の「線維素溶解阻害剤の拮抗薬」は、線維素溶解阻害剤の作用に拮抗し、その作用を弱め、遮断し、阻止する化合物である。前記線維素溶解阻害剤は、例えば、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２－抗プラスミン、およびα２－マクログロブリンである。前記拮抗剤は、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２－抗プラスミンもしくはα２－マクログロブリンの抗体、または、例えばＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２－抗プラスミンもしくはα２－マクログロブリンの発現を遮断またはダウンレギュレートするアンチセンスＲＮＡもしくはミニＲＮＡ、または、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２－抗プラスミンまたはα２－マクログロブリンの結合部位を占めるが、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２－抗プラスミンまたはα２－マクログロブリンの機能を持たない化合物、または、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２－抗プラスミンもしくはα２－マクログロブリンの結合ドメインおよび／または活性ドメインをブロックする化合物である。

プラスミンはプラスミノゲン活性化系（ＰＡ系）の重要な成分である。それは広スペクトルのプロテアーゼであり、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の幾つかの成分を加水分解することができ、これらの成分はフィブリン、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン及びプロテオグリカンを含む。また、プラスミンは一部のプロマトリックスメタロプロテアーゼ（ｐｒｏ－ＭＭＰ）を活性化させて活性のあるマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）にすることができる。そのためプラスミンは細胞外タンパク加水分解作用の一つの重要な上流調節因子である。プラスミンはプラスミノゲンが二種類の生理性のＰＡ：組織型プラスミノゲン活性化剤（ｔＰＡ）またはウロキナーゼプラスミノゲン活性化剤（ｕＰＡ）をタンパク質加水分解することで形成されるものである。プラスミノゲンは血漿及び他の体液中において、相対的レベルが比較的高く、従来的にはＰＡ系の調節は主にＰＡの合成及び活性レベルよって実現されると考えられている。ＰＡ系成分の合成は例えばホルモン、成長因子及びサイトカインなどの異なる要素によって厳格な調節を受ける。また、この他に、プラスミンとＰＡｓの特定の生理的阻害剤が存在する。プラスミンの主な阻害剤はα２－抗プラスミン（α２－ａｎｔｉｐｌａｓｍｉｎ）である。ＰＡｓの活性は、ｕＰＡとｔＰＡのプラスミノーゲン活性化剤阻害剤－１（ＰＡＩ－１）に同時に阻害され、ｕＰＡを主に阻害するプラスミノーゲン活性化剤阻害剤－２（ＰＡＩ－２）によって調節される。一部の細胞表面には直接加水分解する活性のあるｕＰＡ特異性細胞表面受容体（ｕＰＡＲ）がある。

プラスミノゲンは単一鎖の糖タンパクであり、７９１個のアミノ酸からなり、分子量は約９２ｋＤａである。プラスミノゲンは主に肝臓で合成され、大量に細胞外液に存在している。血漿中に含まれるプラスミノゲンの含有量は約２μＭである。そのためプラスミノゲンは組織及び体液中のタンパク質加水分解活性の大きな潜在的な由来である。プラスミノゲンには二種類の分子の形が存在する：グルタミン酸－プラスミノゲン（Ｇｌｕ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）及びリジン－プラスミノゲン（Ｌｙｓ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）である。天然的に分泌され及び分解していない形のプラスミノゲンは一つのアミノ基末端（Ｎ－末端）グルタミン酸を有し、そのためグルタミン酸－プラスミノゲンと称される。しかし、プラスミンが存在する場合、グルタミン酸－プラスミノゲンはＬｙｓ７６－Ｌｙｓ７７においてリジン－プラスミノゲンに加水分解される。グルタミン酸－プラスミノゲンと比較して、リジン－プラスミノゲンはフィブリンとより高い親和力を有し、さらにより高い速度でＰＡによって活性化されることができる。この二種類の形のプラスミノゲンのＡｒｇ５６０－Ｖａｌ５６１ペプチド結合はｕＰＡまたはｔＰＡによって切断され、これによりジスルフィド結合によって接続された二重鎖プロテアーゼプラスミンの形成をもたらす。プラスミノゲンのアミノ基末端部分は五つの相同トリクル環（homologous tricyclic rings）を含み、即ちいわゆるｋｒｉｎｇｌｅｓであり、カルボキシル基末端部分はプロテアーゼドメインを含む。一部のＫｒｉｎｇｌｅｓはプラスミノゲンとフィブリン及びその阻害剤α２－ＡＰの特異的相互作用を介在するリジン結合部位を含む。最も新しく発見されたのは３８ｋＤａのフィブリンプラスミノゲンフラグメントであり、ｋｒｉｎｇｌｅｌ－４を含み、血管生成の有効的な阻害剤である。このフラグメントはアンギオスタチンと命名され、幾つかのプロテアーゼ加水分解プラスミノゲンから生成される。

プラスミンの主な基質はフィブリンであり、フィブリンの溶解は病理性血栓の形成を予防するキーポイントである。プラスミンはさらにＥＣＭの幾つかの成分に対する基質特異性を有し、これらはラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン及びゼラチンを含み、これはプラスミンがＥＣＭ再建において重要な作用を有することを示している。間接的に、プラスミンはさらにいくつかのプロテアーゼ前駆体を活性プロテアーゼに変換することによりＥＣＭのその他の成分を分解し、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３及びＭＭＰ－９を含む。そのため、以下のように提唱する人がいる。プラスミンは細胞外タンパク加水分解の重要な上流調節因子である。また、プラスミンはいくつかの潜在的な形の成長因子を活性化させる能力を有する。体外において、プラスミンはさらに補体系の成分を加水分解させて走化性の補体フラグメントを放出することができる。

「プラスミン」は血液中に存在する非常に重要な酵素であり、フィブリン凝塊をフィブリン分解生成物及びＤ－二量体に加水分解する。

「プラスミノーゲン」はプラスミンの酵素前駆体の形であり、ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔ中の配列に基づいて、シグナルペプチドを含む天然ヒト由来プラスミノーゲンのアミノ酸配列（配列４）は計算によれば８１０個のアミノ酸からなり、分子量は約９０ｋＤであり、主に肝臓において合成され且つ血液中で循環できる糖タンパク質であり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列３に示される通りである。フルサイズのプラスミノーゲンは七つのドメインを含む：Ｃ末端に位置するセリンプロテアーゼドメイン、Ｎ末端に位置するＰａｎ Ａｐｐｌｅ（ＰＡｐ）ドメイン及び５つのＫｒｉｎｇｌｅドメイン（Ｋｒｉｎｇｌｅ１－５）を含む。ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔ中の配列を参照すれば、そのシグナルペプチドは残基Ｍｅｔ１－Ｇｌｙ１９を含み、ＰＡｐは残基Ｇｌｕ２０－Ｖａｌ９８を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ１は残基Ｃｙｓ１０３－Ｃｙｓ１８１を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ２は残基Ｇｌｕ１８４－Ｃｙｓ２６２を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ３は残基Ｃｙｓ２７５－Ｃｙｓ３５２を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ４は残基Ｃｙｓ３７７－Ｃｙｓ４５４を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ５は残基Ｃｙｓ４８１－Ｃｙｓ５６０を含む。ＮＣＢＩデータによれば、セリンプロテアーゼドメインは残基Ｖａｌ５８１－Ａｒｇ８０４を含む。

Ｇｌｕ－プラスミノーゲンは天然のフルサイズのプラスミノーゲンであり、７９１個のアミノ酸からなる（１９個のアミノ酸からなるシグナルペプチドを含まない）。該配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列１に示される通りであり、そのアミノ酸配列は配列２に示される通りである。体内において、さらにＧｌｕ－プラスミノーゲンの第７６－７７位のアミノ酸の位置で加水分解することにより形成されたＬｙｓ－プラスミノーゲンが存在し、例えば配列６に示されるものであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列５が示す通りである。Ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲン（δ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はフルサイズのプラスミノーゲンにＫｒｉｎｇｌｅ２－Ｋｒｉｎｇｌｅ５構造の欠損が生じているフラグメントであり、Ｋｒｉｎｇｌｅ１及びセリンプロテアーゼドメインしか含有せず、δ－プラスミノーゲンのアミノ酸配列（配列８）を報告している文献があり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は例えば配列７である。ミニプラスミノーゲン（Ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はＫｒｉｎｇｌｅ５及びセリンプロテアーゼドメインからなり、残基Ｖａｌ４４３－Ａｓｎ７９１（シグナルペプチドを含まないＧｌｕ－プラスミノーゲン配列のＧｌｕ残基を開始アミノ酸とする）について文献が報告しており、そのアミノ酸配列は配列１０に示される通りであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列９が示す通りである。しかしマイクロプラスミノーゲン（Ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はセリンプロテアーゼドメインのみ含有し、そのアミノ酸配列は残基Ａｌａ５４３－Ａｓｎ７９１（シグナルペプチドを含まないＧｌｕ－プラスミノーゲン配列のＧｌｕ残基は開始アミノ酸である）と文献が報告し、特許文献ＣＮ１０２１５４２５３Ａはそれが残基Ｌｙｓ５３１－Ａｓｎ７９１を含むと開示し（シグナルペプチドを含まないＧｌｕ－プラスミノーゲン配列のＧｌｕ残基を開始アミノ酸とする）、本特許の配列は特許文献ＣＮ１０２１５４２５３Ａを参照でき、そのアミノ酸配列は配列１２に示される通りであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列１１に示される通りである。

本発明の「プラスミン」と「フィブリンプラスミン」、「繊維タンパクプラスミン」は互いに置き換えて使用でき、その意味は同じである。「プラスミノーゲン」と「フィブリンプラスミノーゲン」、「繊維タンパクプラスミノーゲン」は互いに置き換えて使用でき、その意味は同じである。

本願において、前記プラスミノーゲンの「欠乏」とは、被験者体内のプラスミノーゲンの含有量または活性が正常な人より低く、前記被験者の正常な生理学的機能に影響を及ぼすのに十分に低いことをいう。前記プラスミノーゲンの「欠乏」の意味は、被験者体内のプラスミノーゲンの含有量または活性が正常な人より明らかに低く、活性または発現が極微量であり、外部供給によってのみ正常な生理学的機能を維持できることである。

当業者は以下のように理解できる。本発明のプラスミノーゲンのすべての技術構成はプラスミンに適用でき、そのため、本発明に記載の技術構成はプラスミノーゲン及びプラスミンをカバーするものである。循環プロセスにおいて、プラスミノーゲンは閉鎖した非活性コンフォメーションであるが、血栓または細胞表面に結合した際、プラスミノーゲン活性化剤（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ，ＰＡ）の介在下において、開放性のコンフォメーションを有する活性プラスミンとなる。活性を有するプラスミンはさらにフィブリン凝塊をフィブリン分解生成物及びＤ－二量体に加水分解させ、これにより血栓を溶解させる。そのうちプラスミノーゲンのＰＡｐドメインはプラスミノーゲンを非活性閉鎖コンフォメーションにする重要なエピトープであり、しかしＫＲドメインは受容体及び基質上のリジン残基と結合できるものである。プラスミノーゲン活性化剤としての酵素は、既に複数種類知られ、組織プラスミノーゲン活性化剤（ｔＰＡ）、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化剤（ｕＰＡ）、カリクレイン及び凝固因子ＸＩＩ（ハーゲマン因子）などを含む。

本願において、「プラスミノーゲン活性フラグメント」は、１）プラスミノーゲンタンパク質において、基質中のターゲット配列と結合できる活性フラグメント、リジン結合フラグメントとも呼ばれ、例えば、Ｋｒｉｎｇｌｅ １、Ｋｒｉｎｇｌｅ ２、Ｋｒｉｎｇｌｅ ３、Ｋｒｉｎｇｌｅ ４、及び／またはＫｒｉｎｇｌｅ ５を含むフラグメント（前記プラスミノーゲンの構造について、Ａｉｓｉｎａ Ｒ Ｂ ， Ｍｕｋｈａｍｅｔｏｖａ Ｌ Ｉ ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ／ｐｌａｓｍｉｎ ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］． Ｒｕｓｓｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２０１４， ４０（６）：５９０－６０５を参照されたい）；２）プラスミノーゲンタンパク質においてタンパク質加水分解機能を発揮できる活性フラグメント、例えば、配列１４に示されるプラスミノーゲン活性（タンパク質加水分解機能）を有するフラグメント；３）プラスミノーゲンタンパク質において、基質中のターゲット配列と結合する活性（リジン結合活性）とプラスミノーゲン活性（タンパク質加水分解機能）との両方を有するフラグメントを含む。本願の一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、配列１４に示されるプラスミノーゲン活性フラグメントを含むタンパク質である。本願の一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンはＫｒｉｎｇｌｅ １、Ｋｒｉｎｇｌｅ ２、Ｋｒｉｎｇｌｅ ３、Ｋｒｉｎｇｌｅ ４、及び／またはＫｒｉｎｇｌｅ ５のリジン結合フラグメントを含むタンパク質である。一部の実施形態において、本願のプラスミノーゲン活性フラグメントは配列１４、配列１４と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性のアミノ酸配列を含有するタンパク質を含む。そのため、本発明に記載のプラスミノーゲンは該プラスミノーゲン活性フラグメントを含み、且つ依然として該プラスミノーゲン活性を有するタンパク質を含む。一部の実施形態において、本願のプラスミノーゲンは、Ｋｒｉｎｇｌｅ １、Ｋｒｉｎｇｌｅ ２、Ｋｒｉｎｇｌｅ ３、Ｋｒｉｎｇｌｅ ４、及び／またはＫｒｉｎｇｌｅ ５を含むか、またはＫｒｉｎｇｌｅ １、Ｋｒｉｎｇｌｅ ２、Ｋｒｉｎｇｌｅ ３、Ｋｒｉｎｇｌｅ ４、及び／またはＫｒｉｎｇｌｅ ５と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有しながら依然としてリジン結合活性を有するタンパク質を含む。

現在、血液中のプラスミノーゲン及びその活性測定方法は以下を含む：組織フィブリンプラスミノーゲン活性化剤の活性に対する測定（ｔ－ＰＡＡ）、血漿組織プラスミノーゲン活性化剤抗原に対する測定（ｔ－ＰＡＡｇ）、血漿組織プラスミノーゲン活性に対する測定（ｐｌｇＡ）、血漿組織プラスミノーゲン抗原に対する測定（ｐｌｇＡｇ）、血漿組織プラスミノーゲン活性化剤の阻害物活性に対する測定、血漿組織プラスミノーゲン活性化剤の阻害物抗原に対する測定、血漿プラスミン－抗プラスミン複合物に対する測定（ＰＡＰ）。最もよく見られる測定方法は発色基質法である：測定対象(被験者)の血漿中にストレプトキナーゼ（ＳＫ）と発光基質を添加し、測定対象の血漿中のＰＬＧはＳＫの作用下においてＰＬＭとなり、後者は発光基質に作用し、それから分光光度計で測定し、吸光度の増加はプラスミノーゲンの活性と正比例の関係となる。この他にも免疫化学法、ゲル電気泳動法、免疫比濁法、放射免疫拡散法などを用いて血液中のフィブリンプラスミノーゲン活性に対して測定を行うことができる。

「オーソロガス（ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅ）またはオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは異なる種どうしのホモログであり、タンパク質の相同物もＤＮＡの相同物も含み、オーソロガスホモログおよび垂直ホモログともいう。それは具体的に異なる種どうしの同じ祖先の遺伝子から進化して得られるタンパク質または遺伝子を言う。本発明のプラスミノーゲンはヒト天然プラスミノーゲンを含み、さらには異なる種に由来する、プラスミノーゲン活性を有するプラスミノーゲンオーソロガスまたはオルソログを含む。

「保存的置換バリアント」とはそのうちの一つの指定されたアミノ酸残基が改変されたがタンパク質または酵素の全体のコンフォメーション及び機能を変えないものであり、これは類似の特性（例えば酸性、アルカリ性、疎水性など）のアミノ酸でペアレントタンパク質中のアミノ酸配列中のアミノ酸を置換するものを含むがこれらに限られない。類似の性質を有するアミノ酸は知られている通りである。例えば、アルギニン、ヒスチジン及びリジンは親水性のアルカリ性アミノ酸であり且つ互いに置き換えることができる。同じように、イソロイシンは疎水アミノ酸であり、ロイシン、メチオニンまたはバリンによって置換されることができる。そのため、機能の類似する二つのタンパク質またはアミノ酸配列の類似性は異なる可能性もある。例えば、ＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づいて７０％～９９％の類似性（同一性）を有する。「保存的置換バリアント」はさらにＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムに基づいて６０％以上のアミノ酸同一性を有するポリペプチドまたは酵素を含み、７５％以上に達すればさらによく、最も好ましくは８５％以上に達し、さらには９０％以上に達するのが最も好ましく、さらに天然またはペアレントタンパク質または酵素と比較して同じまたは基本的に類似する性質または機能を有する。

「分離された」プラスミノーゲンとは天然環境から分離及び／または回収されたプラスミノーゲンタンパク質である。いくつかの実施形態において、前記プラスミノーゲンは（１）９０％を超える、９５％を超える、または９８％を超える純度（重量で計算した場合）になるまで精製し、例えばＬｏｗｒｙ法によって決まるもので、例えば９９％（重量で計算した場合）を超えるまで精製する、（２）少なくともスピニングカップ配列分析装置によりＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基が得られる程度になる精製する、または（３）同質性になるまで精製する。該同質性はクマシーブリリアントブルーまたは銀染色により還元性または非還元性条件下のドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミノゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって決まるものである。分離されたプラスミノーゲンはバイオエンジニアリング技術により組み換え細胞から製造することができ、さらに少なくとも一つの精製ステップで分離されたプラスミノーゲンを含む。

用語の「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は本明細書において互いに置き換えて使用でき、いかなる長さのアミノ酸の重合体を指し、遺伝的にコードされた及び非遺伝的にコードされたアミノ酸、化学的または生化学的に修飾されまたは派生したアミノ酸、及び修飾されたペプチド主鎖を有するポリペプチドを含む。該用語は融合タンパク質を含み、異種性アミノ酸配列を有する融合タンパク質を含むがこれに限られず、異種性と同種性由来のリーダー配列（Ｎ端メチオニン残基を有するか有しない）を含む融合物；等々である。

参照ペプチド配列の「アミノ酸配列同一性パーセンテージ（％）」の定義は、必要に応じてギャップを導入することで最大のパーセンテージ配列の同一性を実現した後、如何なる保存的な置換も配列同一性の一部として見なさない場合、候補配列中における参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同じアミノ酸残基のパーセンテージである。パーセンテージのアミノ酸配列の同一性を測定することを目的とした比較は本分野の技術範囲における複数種類の方式によって実現でき、例えば公衆が入手できるコンピュータソフトウエア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアによって実現できる。当業者は配列をアライメントするための適切なパラメータを決めることができ、該パラメータが比較対象の配列のフルサイズに対して最大比較の要求を実現するための如何なるアルゴリズムも含む。しかし、本発明の目的のために、アミノ酸配列の同一性パーセンテージは配列比較コンピュータソフトウエアＡＬＩＧＮ－２により得られるものである。

ＡＬＩＧＮ－２を用いることによりアミノ酸配列を比較する場合、所定のアミノ酸配列Ａの所定のアミノ酸配列Ｂに対するアミノ酸配列同一性％（または所定のアミノ酸配列Ｂに対して、と、またはについてのあるアミノ酸配列と同一性を有する又は含む所定のアミノ酸配列Ａともいう）は以下のように計算される：
分数Ｘ／Ｙ×１００

そのうちＸは配列アライメントプログラムＡＬＩＧＮ－２において該プログラムのＡ及びＢのアライメントにおいて同一でマッチングすると評価したアミノ酸残基の数であり、且つそのうちＹはＢにおけるアミノ酸残基の総数である。以下のように理解するべきである：アミノ酸配列Ａの長さとアミノ酸配列Ｂの長さが等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列の同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％とは異なる。特に断りのない限り、本文中において使用するすべてのアミノ酸配列同一性値％は前記の段落に記載の通りであり、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムによって得られるものである。

本文において使用されているように、用語の「治療」は期待される薬理及び／または生理的効果が得られることを言う。前記効果は疾患またはその症状を完全または一部予防すること、及び／または疾患及び／またはその症状を一部または完全に治癒するものとすることができる。さらに以下を含む：（ａ）疾患が被験者の体内で発生することを予防し、前記被験者は疾患の要因を持っているが、該疾患を有すると診断されていない状況であること；（ｂ）疾患を抑制し、その形成を阻害すること；及び（ｃ）疾患及び／またはその症状を減軽し、即ち疾患及び／またはその症状を減退させること。

用語の「個体」、「被験者」及び「患者」は本明細書中において互いに置き換えて使用でき、哺乳動物を指し、ネズミ（ラット、マウス）、ヒト以外の霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、有蹄動物（例えばウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）などを含むがこれらに限られない。

「治療上有効量」または「有効量」とは、哺乳動物またはその他の被験者に投与して疾患の治療に用いられる際に疾患の前記予防及び／または治療を実現できるプラスミノーゲンの量である。「治療上有効量」は使用するプラスミノーゲン、治療しようとする被験者の疾患及び／または症状の重症度及び年齢、体重などに従って変化するものである。

本発明のプラスミノーゲンの調製
プラスミノーゲンは治療の用途に用いられるために、自然界から分離及び精製されるものでもよく、標準的な化学ペプチド合成技術によって合成することでもよい。化学的手法によりポリペプチドを合成する際、液相または固相で合成を行うことができる。固相ポリペプチド合成（ＳＰＰＳ）（配列のＣ末端アミノ酸を不溶性支持体に附着させ、順番に配列中の残りのアミノ酸を添加する）はプラスミノーゲンの化学的合成に適したものである。各種形式のＳＰＰＳ、例えばＦｍｏｃ及びＢｏｃは、プラスミノーゲンの合成に用いることができる。固相合成に用いられる技術は以下に記載されている：Ｂａｒａｎｙ及びＳｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；３－２８４ページ、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ．第二巻：Ｓｐｅｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐａｒｔ Ａ．，Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，ｔら Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９－２１５６（１９６３）；Ｓｔｅｗａｒｔら，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．（１９８４）；及びＧａｎｅｓａｎ Ａ．２００６Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ．Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．６：３－１０及びＣａｍａｒｅｒｏ ＪＡら ２００５Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｌｅｔｔ．１２：７２３－８。簡単に言えば、その上にペプチド鎖が構築されている機能性ユニットにより小さい不溶性の多孔ビーズを処理する。カップリング／脱保護の繰り返し循環後に、附着した固相の遊離Ｎ末端アミンと単一のＮ保護を受けているアミノ酸ユニットをカップリングさせる。それから、該ユニットを脱保護し、他のアミノ酸と接続する新しいＮ末端アミンを露出させる。ペプチドを固相上に固定したままにし、それからそれを切除する。

標準的な組み換え方法により本発明のプラスミノーゲンを生産する。例えば、プラスミノーゲンをコードする核酸を発現ベクター中に挿入し、それと発現ベクター中の制御配列を操作可能に接続させる。発現制御配列はプロモーター（例えば天然に関連されているプロモーター、または異種由来のプロモーター）、シグナル配列、エンハンサーエレメント及び転写終了配列を含むが、これらに限られない。発現の制御はベクター中の真核プロモーターシステムとすることができ、前記ベクターは真核宿主細胞（例えばＣＯＳまたはＣＨＯ細胞）を形質転換またはトランスフェクションさせる。一旦ベクターを適切な宿主に導入すれば、ヌクレオチド配列の高レベル発現及びプラスミノーゲンの収集及び精製に適した条件下において宿主を維持する。

適切な発現ベクターは通常宿主体内において附加体または宿主染色体ＤＮＡの整合部分として複製される。通常、発現ベクターは選択マーカー（例えばアンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性またはネオマイシン耐性）を含み、インビトロで所望のＤＮＡ配列によって形質転換されたそれらの細胞に対して測定を行うことに有用である。

大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）はターゲット抗体をコードするポリヌクレオチドをクローンする原核宿主細胞の例である。その他の使用に適した微生物宿主は桿菌を含み、例えばバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びその他の腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例えばサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、及び各種シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種である。これらの原核宿主において、発現ベクターを生成でき、通常は宿主細胞と相容する発現制御配列（例えば複製開始点）を含むものである。また、多くの公知のプロモーターが存在し、例えば乳糖プロモーターシステム、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム、β－ラクタマーゼプロモーターシステム、またはファージλ由来のプロモーターシステムである。プロモーターは一般的に発現を制御し、必要に応じて遺伝子配列を制御する場合に、転写及び翻訳を起動するために、さらにリボソームの結合位置配列を有してもよい。

その他の微生物、例えば酵母も発現に用いることができる。酵母（例えばサッカロミセス（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））及びピキア（Ｐｉｃｈｉａ）が適した酵母宿主細胞の例であり、そのうちの適切な担体は必要に応じて発現制御配列（例えばプロモーター）、複製開始点、終止配列など含む。典型的なプロモーターは３－ホスホグリセリン酸キナーゼ及びその他の糖分解酵素を含む。誘導型酵母プロモーターにはアルコール脱水素酵素、イソチトクロムＣ、及び麦芽糖とガラクトースの利用のための酵素のプロモーターを含む。

微生物以外に、哺乳動物細胞（例えば体外細胞培養物中において培養された哺乳動物細胞）も本発明のプラスミノーゲンの発現および生成に用いることができる（例えばプラスミノーゲンをコードするポリヌクレオチド）。例えばＷｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．（１９８７）参照。適した哺乳動物宿主細胞はＣＨＯ細胞系、各種Ｃｏｓ細胞系、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞系、及び形質転換されたＢ細胞またはハイブリドーマを含む。これらの細胞に用いられる発現ベクターは発現制御配列、例えば複製開始点、プロモーター、及びエンハンサー（Ｑｕｅｅｎら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９（１９８６））、及び必要とされる加工情報サイト、例えばリボソームの結合サイト、ＲＮＡの切断サイト、ポリアデノシン酸化サイト、及び転写ターミネーター配列を含むことができる。適切な発現制御配列の例はウサギ免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウィルス、サイトメガロウイルスなど由来のプロモーターである。Ｃｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）を参照すること。

一旦合成（化学または組み換え的に）されれば、本分野の標準的な手順、例えば硫酸アンモニウム沈殿、アフィニテイカラム、カラムクロマトグラフィー、高速液相クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ゲル電気泳動などにより本発明に記載のプラスミノーゲンを精製することができる。該プラスミノーゲンは基本的に純粋なものであり、例えば少なくとも約８０％から８５％の純度で、少なくとも約８５％～９０％の純度で、少なくとも約９０％～９５％の純度で、または９８％～９９％の純度またはさらに純度が高いものであり、例えば汚染物を含まず、前記汚染物は例えば細胞破片、プラスミノーゲン以外の大分子などである。

薬物配合剤
所望の純度のプラスミノーゲンと必要に応じた薬用担体、賦形剤、または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．ｅｄ．（１９８０））を混合して凍結乾燥製剤または水溶液を形成して治療用の配合剤を得る。許容可能な担体、賦形剤、安定化剤は所要の用量及び濃度下において被験者に対して毒性がなく、さらに例えばリン酸塩、クエン酸塩及びその他の有機酸などの緩衝剤を含む。抗酸化剤はアスコルビン酸和メチオニンを含む；防腐剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメチレンジアミン；塩化ベンザルコニウム（ｂｅｎｚａｌｋｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブタノールまたはベンジルアルコール；アルキルパラヒドロキシ安息香酸エステル、例えばメチルまたはプロピルパラヒドロキシ安息香酸エステル；ピロカテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；ｍ－クレゾール）；低分子量ポリペプチド（少なくとも１０個の残基を有するもの）；タンパク質例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン酸、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンである；単糖、二糖及びその他の炭水化物はグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む；キレート剤は例えばＥＤＴＡである；糖類は例えばショ糖、マンニトール、フコースまたはソルビトールである；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えば亜鉛－タンパク複合体）；及び／または非イオン界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。

本発明の配合剤は治療を必要とする具体的な症状の必要とする一種類以上の活性化合物を含有してもよく、好ましくは活性が相補的で互いに副作用を有しないものである。例えば、血圧降下薬、抗不整脈薬、糖尿病治療薬等である。

本発明のプラスミノーゲンは例えば凝集技術または界面重合によって作られるマイクロカプセル中に内包ことができ、例えば、膠質薬物輸送系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン剤、ナノ粒子及びナノカプセル）中に入れまたは粗エマルジョン状液中のヒドロキシメチルセルロースまたはゲルーマイクロカプセル及びポリ―（メタアクリル酸メチル）マイクロカプセル中に入れることができる。これらの技術はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。。

体内に投与することに用いられる本発明のプラスミノーゲンは必ず無菌である必要がある。これは凍結乾燥及び再度配合する前または後に除菌濾過膜で濾過することで容易に実現できる。

本発明のプラスミノーゲンは緩衝製剤を調製できる。緩衝製剤の適切な実例は一定の形状を有し且つ糖タンパクを含む固体の疎水性重合体の半透過マトリックスを含み、例えば膜またはマイクロカプセルである。緩衝基質の実例はポリエステル、水性ゲル（例えばポリ（２－ヒドロキシエチル－メタアクリル酸エステル）（Ｌａｎｇｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７－２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８－１０５（１９８２））またはポリ（ビニールアルコール）、ポリラクチド（米国特許３７７３９１９，ＥＰ ５８，４８１）、Ｌ－グルタミン酸とエチル－Ｌ－グルタミン酸の共重合体（Ｓｉｄｍａｎ，ら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７（１９８３）），分解できないエチレン－ビニルアセテート（ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｖｉｎｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）（Ｌａｎｇｅｒ，ら，出所は前記と同じ）、または分解可能な乳酸－ヒドロキシ酢酸共重合体、例えばＬｕｐｒｏｎ ＤｅｐｏｔＴＭ（乳酸－ヒドロキシ酢酸共重合体及びリュープロレリン（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）酢酸エステルからなる注射可能なミクロスフェア体）、及びポリＤ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸を含む。重合体、例えばエチレン－酢酸エチル及び乳酸－ヒドロキシ酢酸は、持続的に分子を１００日間以上放出することができ、しかしいくつかの水性ゲルがタンパク質を放出する時間は比較的短い。関連のメカニズムに応じてタンパク質を安定化させる合理的なストラテジーにより設計できる。例えば、凝集のメカニズムが硫化ジスルフィド結合の交換によって分子間Ｓ－Ｓ結合を形成するであれば、メルカプト基残基を修飾することにより、酸性溶液中から凍結乾燥させ、湿度を制御し、適切な添加剤を用いて、及び特定の重合体基質組成物を開発することで安定化を実現できる。

投与及び使用量
異なる方式、例えば静脈内、腹膜内、皮下、頭蓋骨内、髄腔内、動脈内（例えば頸動脈）、筋肉内により本発明の薬物組成物の投与を実現できる。

胃腸外での投与に用いられる製造物は無菌水性または非水性溶液、懸濁液及び乳剤を含む。非水性溶媒の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、例えばオリーブオイルのような植物油、及び注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体は水、アルコール性／水性溶液、乳剤または懸濁液を含み、食塩水及び緩衝媒介を含む。胃腸外媒介物は塩化ナトリウム溶液、リンガ―デキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、または固定油を含む。静脈内媒介物は液体及び栄養補充物、電気分解補充物などを含む。されには防腐剤及びその他の添加剤、例えば抗微生物製剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなども存在してもよい。

医療関係者は各種臨床的要素により用量案を決めることができる。例えば医学分野で公知のように、任意の患者の用量は複数の要素によって決められ、これらの要素は患者の体型、体表面積、年齢、投与される具体的な化合物、性別、投与回数及び経路、全体の健康度、及び同時に投与するその他の薬物を含む。本発明が含有するプラスミノーゲンの薬物組成物の用量の範囲は例えば被験者体重に対して毎日約０．０００１～２０００ｍｇ／ｋｇであり、または約０．００１～５００ｍｇ／ｋｇ（例えば０．０２ｍｇ／ｋｇ，０．２５ｍｇ／ｋｇ，０．５ｍｇ／ｋｇ，０．７５ｍｇ／ｋｇ，１０ｍｇ／ｋｇ，５０ｍｇ／ｋｇなど）とすることができる。例えば、用量は１ｍｇ／ｋｇ体重または５０ｍｇ／ｋｇ体重または１－５０ｍｇ／ｋｇの範囲とすることができ、または少なくとも１ｍｇ／ｋｇである。この例示性の範囲より高いまたは低い用量もカバーされ、特に前記の要素を考慮した場合である。前記範囲中の中間用量も本発明の範囲内に含まれるものである。被験者は毎日、隔日、毎週または経験分析によって決められた任意のスケジュール表に従ってに従ってこのような用量を投与できる。例示的な用量のスケジュール表は連続数日１－１０ｍｇ／ｋｇ投与することである。本発明の薬物の投与過程において治療効果及び安全性をリアルタイムに評価する必要がある。

製品または薬物キット
本発明の一つの実施形態は製品または薬物キットに係るものであり、糖尿病に起因する心血管疾患および関連疾患を治療するための本発明のプラスミノーゲンまたはプラスミンを含有する。前記製品は好ましくは一つの容器、ラベルまたはプロトコルを含む。適切な容器はボトル、バイアル、注射器などである。容器は各種材料例えばガラスまたはプラスチックから作られることができる。前記容器は組成物を含有し、前記組成物は本発明の疾患または症状を有効に治療し且つ無菌の入口を有する（例えば前記容器は静脈輸液用パックまたはバイアルであり、皮下注射針によって貫通される栓を含む）。前記組成物中の少なくとも一種類の活性化剤がプラスミノーゲン／プラスミンである。前記容器上にあるまたは添付されているラベルは前記組成物を本発明の糖尿病に起因する心血管疾患および関連疾患の治療に用いられると説明するものである。前記製品はさらに薬用緩衝液を含有する第二容器を含み、前記薬用緩衝液は例えばリン酸塩緩衝の食塩水、リンガー溶液及びグルコース溶液を含む。さらには商業及び使用者の角度から見ると必要とされるその他の物質、即ちその他の緩衝液、希釈剤、濾過物、針及び注射器を含むことができる。また、前記製品は使用説明を有するプロトコルを含み、これは例えば前記組成物の使用者にプラスミノーゲン組成物及び疾患の治療に伴うその他の薬物を患者に投与することを指示するものである。

［実施例１］
実施例１は、プラスミノーゲンが筋萎縮性側索硬化症のモデルマウスの寿命と生存期間中央値を延長ことに関するものである。
本実施例に使用されているヒトプラスミノーゲンはドナー血漿に由来し、文献^{［１－３］}に記載されている方法に基づいてプロセスを最適化し、精製して得られた。ヒトプラスミノーゲン単体の純度は９５％を上回った。以下の実施例でも同じである。
トランスジェニック突然変異ＳＯＤ１は、孤発性および家族性筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｌａｔｅｒａｌ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ＡＬＳ）の臨床で観察される組織病理学的特徴を持っている。本願のＡＬＳモデルマウスはＢ６．Ｃｇ－Ｔｇ（ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊトランスジェニックマウス（略してＳＯＤ１－Ｇ９３Ａ）であり、Ｊａｃｋｓｏｎ研究所から購入し、ＳＰＦレベルの環境で動物関連の実験を行った。ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａモデルマウスでは、約１００日目に後肢振戦が現れ、その後急速に悪化し、５０％生存率は１５７．１±９．３日であった^［４］。現在、ＡＬＳのメカニズムの研究や新薬開発の前臨床試験研究に広く利用されている。
１６週齢のオスＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウス９匹を取り、体重によってマウスをランダムに２群に分け、溶媒対照群で５匹、プラスミノーゲン投与群で４匹とした。溶媒対照群マウスに０．１ｍｌ／日で溶媒（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を尾静脈注射により投与し、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍｌ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、マウスの生存を毎日観察して記録した。
その結果、プラスミノーゲン投与群のマウスの平均寿命は１６４±８．６日であり、溶媒対照群のマウスの平均寿命は１５３±０日であり、溶媒対照群と比べて、プラスミノーゲン投与群の寿命は約１１日長かった（図１Ａ）。プラスミノーゲン投与群のマウスの生存期間の中央値は５３±９日であり、溶媒対照群の生存期間の中央値は４０±０日であり、溶媒対照群と比べて、プラスミノーゲン投与群の生存期間の中央値は約１３日長く、約３０％延長された（図１Ｂ）。この結果は、プラスミノーゲンがＡＬＳマウスの寿命と生存期間の中央値を延長できることを示している。

［実施例２］
実施例２は、プラスミノーゲンがＡＬＳモデルマウスの神経筋機能を改善することに関するものである。
１６週齢のオスＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウス９匹を取り、体重によってマウスをランダムに２群に分け、溶媒対照群で５匹、プラスミノーゲン投与群で４匹とした。溶媒対照群マウスに０．１ｍｌ／日で溶媒（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を尾静脈注射により投与し、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍｌ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、３４日間連続して投与した。投与し始めた日を０日目とし、投与の６、８、１２、１６、２１、２３、２７、３０、３４日目に次のようにサスペンショングリップ強度テストを行い、ＡＬＳモデルマウスの神経筋機能に対するプラスミノーゲンの効果を考察し、次のようにＡＬＳマウスの神経行動を統計分析した。
サスペンショングリップ強度テスト
サスペンション実験は、一般的にマウスの運動能力（筋力）を評価するために使用される。マウスケージの金属製のふたの上に１匹のマウスを置き、ふたを軽く振ってマウスにふたをつかませてから、ふたをひっくり返す。そして、マウスの後肢がふたを放すまでの潜伏時間を記録する^［５］。各マウスに対して３回の実験を行ない、１回の実験の最長期間は９０秒であり、各マウスの最長の潜伏時間を統計分析に使用する。
その結果、２つの群のマウスのサスペンション潜伏時間は投与期間中に減少したが、プラスミノーゲン投与群のマウスのサスペンション潜伏時間は常に溶媒対照群のマウスよりも長かく、しかも投与の６、２１、および２３日目に、溶媒群と比べて、プラスミノーゲン投与群のサスペンション潜伏時間は統計学的に有意または非常に有意であり、Ｐ値はそれぞれ０．０３、０．０２、および０．００８であった（図２）。これは、プラスミノーゲンがＡＬＳマウスの筋力低下を遅らせることができることを示している。
ＡＬＳジスキネジア特性スコア、０点：運動機能障害の兆候なし。１点：尾懸垂中の後肢の著しい震え；２点：歩行異常、７５ｃｍの歩行中につま先が少なくとも２回カールするか、または足がケージの底に沿って引きずられる。３点：後肢が少なくとも１日間引きずられ、硬くて弱く（硬い麻痺）、脚を前方に動かすことができない。４点：マウスは仰臥位に置かれ、３０秒以内に腹臥位に戻ることができない（死にかけている状態と判断される）^［５］。
その結果、プラスミノーゲン投与群のマウスの２点神経行動が現れた時点は、溶媒群より有意に遅く、統計学的差は有意であった（＊はＰ＜０．０５を表す）（図３）。
上記の結果は、プラスミノーゲンがＡＬＳ疾患の筋力低下を大幅に遅らせ、ＡＬＳ疾患の進行を遅らせることができることを示している。

実施例３は、プラスミノーゲンがＡＬＳモデルマウスの体重減少を遅らせることに関するものである。
週齢の近い野生型マウス２０匹、オスＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウス２９匹、およびメスＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウス３１匹を取り、野生型マウスをブランク対照群とし（何ら投与治療はない）、ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスは１４週目に後肢振戦が現れた時点から観察記録し、各マウスの発症時刻を記録し、発症から１４日後に投与を始めた。発症状況によってすべてのマウスをランダムに溶媒対照群とプラスミノーゲン投与群に分け、溶媒対照群マウスが３２匹であり、毎日０．１ｍｌ／匹で溶媒（１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４）を尾静脈注射により投与し、プラスミノーゲン投与群で２８匹、毎日１ｍｇ／０．１ｍｌ／匹でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、ＳＰＦ環境下で３５日間連続して投与した。投与し始めた日を０日目とし、投与期間中３日ごとに体重を１回測定し、ＡＬＳモデルマウスの体重減少に対するプラスミノーゲンの影響を調べた。
ＡＬＳは通常、大幅な体重減少が伴われ、ＡＬＳの主な特徴の１つである^［５］。毎回体重測定の結果は、０日目の体重で標準化され、つまり、毎回体重測定値／０日目の体重＊１００で処理された。
その結果、投与中、ブランク対照群のマウスの体重はあまり変動することなく徐々に上昇する傾向があり、溶媒対照群のマウスの体重は徐々に減少し、プラスミノーゲン投与群のマウスの体重は、最初の２５日間で大きく変動していたが、ブランク対照群のマウスの体重に近いかわずかに多く、２５日後に体重は徐々に減少していたが、溶媒対照群のマウスの体重よりも常に多く、溶媒対照群と比較して、Ｐ値は０．００１を下回るか０．００１に近かった（図４）。これは、プラスミノーゲンがＡＬＳモデルマウスの体重減少率を有意に緩和し、ＡＬＳの悪化を遅らせることができることを示している。

［実施例４］
実施例４は、プラスミノーゲンがＡＬＳモデルマウス脊髄の前角の液胞面積を減少させることに関するものである。
週齢の近い野生型オスマウス５匹、およびオスＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウス９匹を取り、野生型マウスをブランク対照群とし、ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスは１４週目に後肢振戦が現れた時点から観察記録し、各マウスの発症時刻を記録し、発症から１４日後に投与を始めた。発症状況によってすべてのマウスをランダムに溶媒対照群とプラスミノーゲン投与群に分け、溶媒対照群マウスが５匹であり、毎日０．１ｍｌ／匹で溶媒（１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４）を尾静脈注射により投与し、プラスミノーゲン投与群で４匹、毎日１ｍｇ／０．１ｍｌ／匹でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、ＳＰＦ環境下で連続して投与した。マウスが死にかけていたときに取材し、最長の投与は６１日間であった。脊髄を採取し、ホルマリン固定液で固定した。固定後の組織をアルコールで段階的に脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ、さらに浸水して水で１回洗浄し、ヘマトキシリンで１０分間染色させた後、流水で５分間流した。１％塩酸エタノールで１０秒分別させ、流水で１０分間流し、０．２％エオシンで１０秒染色させ、さらに段階的に脱水させて透徹化して封入させた。切片を光学顕微鏡下で４００倍にて観察した。
脊髄の前角における運動ニューロンの変性と死亡は、ＡＬＳの主な病理学的特徴の１つである^［６］。その結果、ブランク対照群（図５Ａ）マウスの脊髄の前角に一定レベルの液胞面積が示され、溶媒群（図５Ｂ）マウスの脊髄の前角の液胞面積がブランク対照群マウスのそれよりも有意に大きく（Ｐ＜０．００１）、投与群（図５Ｃ）のマウスの脊髄前角の液胞面積は、溶媒群のマウスよりも有意に低く、しかも統計学的差は非常に有意である（図５Ｄ）。これは、プラスミノーゲンがＡＬＳモデルマウスの脊髄の前角の空胞面積を減少させ、脊髄の前角の運動ニューロンの死を減少させることができることを示唆している。

［実施例５］
実施例５は、プラスミノーゲンがＡＬＳモデルマウスの脊髄の前角におけるアセチルコリントランスフェラーゼの発現を促進することに関するものである。
週齢の近い野生型オスマウス５匹、およびオスＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウス９匹を取り、野生型マウスをブランク対照群とし、ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスは１４週目に後肢振戦が現れた時点から観察記録し、各マウスの発症時刻を記録し、発症から１４日後に投与を始めた。発症状況によってすべてのマウスをランダムに溶媒対照群とプラスミノーゲン投与群に分け、溶媒対照群マウスが５匹であり、毎日０．１ｍｌ／匹で溶媒（１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４）を尾静脈注射により投与し、プラスミノーゲン投与群で４匹、毎日１ｍｇ／０．１ｍｌ／匹でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、ＳＰＦ環境下で連続して投与した。マウスが死にかけていたときに取材し、最長の投与は６１日間であった。脊髄を採取し、ホルマリン固定液で固定した。固定後の組織をアルコールで段階的に脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。組織の切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ、さらに浸水して水で１回洗浄した。ＰＡＰペンで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗アセチルコリントランスフェラーゼ抗体（ａｂ１７８８５０、Ａｂｃａｍ）を滴加して４℃で一晩インキュベーションした後、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）の二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、水で３回洗浄した後にヘマトキシリンで３０秒対比染色して、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で４００倍にて観察した。
アセチルコリントランスフェラーゼ（ｃｈＡＴ）は、コリン作動性ニューロンのマーカー酵素であり、神経細胞で合成される。研究によると、ＡＬＳ動物モデルの動物脊髄の運動ニューロンおよび患者のｃｈＡＴレベルが低下していることが示されている^{［７，８］}。
その結果、ブランク対照群（図６Ａ）マウスの脊髄前角で一定量のｃｈＡＴが発現し、溶媒群（図６Ｂ）マウスのｃｈＡＴ発現レベルはブランク対照群マウスよりも有意に低く、投与群（図６Ｃ）マウスの脊髄前角のｃｈＡＴ発現は溶媒群マウスよりも有意に高く、統計学的差は有意であった（Ｐ＜０．０５）（図６Ｄ）。これは、ＴＰ０１ＨＮ１０６がＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスの脊髄前角におけるｃｈＡＴの合成と発現を促進し、コリン作動性ニューロン機能の回復を促進できることを示している。

［実施例６］
実施例６は、プラスミノーゲンがＡＬＳモデルマウスの脊髄の前角におけるシナプトフィジンの発現を促進することに関するものである。
週齢の近い野生型オスマウス５匹、およびオスＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウス９匹を取り、野生型マウスをブランク対照群とし、ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスは１４週目に後肢振戦が現れた時点から観察記録し、各マウスの発症時刻を記録し、発症から１４日後に投与を始めた。発症状況によってすべてのマウスをランダムに溶媒対照群とプラスミノーゲン投与群に分け、溶媒対照群マウスが５匹であり、毎日０．１ｍｌ／匹で溶媒（１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４）を尾静脈注射により投与し、プラスミノーゲン投与群で４匹、毎日１ｍｇ／０．１ｍｌ／匹でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、ＳＰＦ環境下で連続して投与した。マウスが死にかけていたときに取材し、最長の投与は６１日間であった。脊髄を採取し、ホルマリン固定液で固定した。固定後の組織をアルコールで段階的に脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。組織の切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ、さらに浸水して水で１回洗浄した。ＰＡＰペンで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗シナプシン抗体（１７７８５－１－ＡＰ、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ）をを滴加して４℃で一晩インキュベーションした後、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）の二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、水で３回洗浄した後にヘマトキシリンで３０秒対比染色して、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で４００倍にて観察した。
シナプトフィジン（ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ）は、軸索の成長とシナプス形成のマーカーとして、シナプス前膜上のリン酸化タンパク質であり、シナプスの柔軟性と密接に関連している。ＡＬＳモデルマウスは、臨床症状が現れる前に、明らかなシナプス変性と運動ニューロン細胞体の喪失を示す^［９］。
その結果、ブランク対照群（図７Ａ）マウスの脊髄前角で一定量のシナプトフィジンが発現し、溶媒群（図７Ｂ）マウスのシナプトフィジンの発現レベルはブランク対照群マウスよりも有意に低く、投与群（図７Ｃ）マウスの脊髄前角のシナプトフィジン発現は溶媒群マウスよりも有意に高く、統計学的差は有意であった（Ｐ＜０．０５）（図７Ｄ）。これは、プラスミノーゲンがモデルマウスの脊髄前角におけるシナプトフィジンの発現を促進し、シナプス損傷の修復を促進できることを示している。

［実施例７］
実施例７は、プラスミノーゲンがＡＬＳモデルマウスの脊髄の前角の炎症の修復を促進することに関するものである。
週齢の近い野生型オスマウス５匹、およびオスＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウス９匹を取り、野生型マウスをブランク対照群とし、ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスは１４週目に後肢振戦が現れた時点から観察記録し、各マウスの発症時刻を記録し、発症から１４日後に投与を始めた。発症状況によってすべてのマウスをランダムに溶媒対照群とプラスミノーゲン投与群に分け、溶媒対照群マウスが５匹であり、毎日０．１ｍｌ／匹で溶媒（１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４）を尾静脈注射により投与し、プラスミノーゲン投与群で４匹、毎日１ｍｇ／０．１ｍｌ／匹でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、ＳＰＦ環境下で連続して投与した。マウスが死にかけていたときに取材し、最長の投与は６１日間であった。脊髄を採取し、ホルマリン固定液で固定した。固定後の組織をアルコールで段階的に脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。組織の切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ、さらに浸水して水で１回洗浄した。ＰＡＰペンで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗Ｉｂａ－１（ａｂ１７８８４７、Ａｂｃａｍ）を滴加して４℃で一晩インキュベーションした後、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）の二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、水で３回洗浄した後にヘマトキシリンで３０秒対比染色して、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で４００倍にて観察した。
イオン化カルシウム結合アダプター分子－１（Ｉｏｎｉｚｅｄ ｃａｌｃｉｕｍ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｄａｐｔｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅ－１、Ｉｂａ－１）は、中枢神経系のミクログリアの表面マーカーである。中枢神経系の免疫細胞として、ミクログリアは、その病変または損傷した時に神経障害をすばやく感知して活性化される。活性化されたミクログリアは、数と形態に大きな変化があり、損傷部位に移動して、死細胞の食作用や炎症性サイトカインの産生の増加など、さまざまな機能を発揮する^［１０］。
その結果、ブランク対照群（図８Ａ）マウスの脊髄前角で一定レベルのＩｂａ－１が発現し、投与群（図８Ｃ）マウスの脊髄前角におけるＩｂａ－１の発現レベルは溶媒群（図８Ｂ）とブランク対照群マウスよりも有意に高く、統計学的差は有意であった（Ｐ＜０．０５または０．０１）（図８Ｄ）。これは、プラスミノーゲンがモデルマウスの脊髄前角の炎症の修復を促進できることを示している。

［実施例８］
実施例８は、プラスミノーゲンがＡＬＳモデルマウスの筋萎縮を改善することに関するものである。
週齢の近い野生型オスマウス５匹、およびオスＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウス９匹を取り、野生型マウスをブランク対照群とし、ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスは１４週目に後肢振戦が現れた時点から観察記録し、各マウスの発症時刻を記録し、発症から１４日後に投与を始めた。発症状況によってすべてのマウスをランダムに溶媒対照群とプラスミノーゲン投与群に分け、溶媒対照群マウスが５匹であり、毎日０．１ｍｌ／匹で溶媒（１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４）を尾静脈注射により投与し、プラスミノーゲン投与群で４匹、毎日１ｍｇ／０．１ｍｌ／匹でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、ＳＰＦ環境下で連続して投与した。マウスが死にかけていたときに取材し、最長の投与は６１日間であった。腓腹筋を採取し、ホルマリン固定液で固定した。固定後の組織をアルコールで段階的に脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ、さらに浸水して水で１回洗浄し、ヘマトキシリンで１０分間染色させた後、流水で５分間流した。１％塩酸エタノールで１０秒分別させ、流水で１０分間流し、０．２％エオシンで１０秒染色させ、さらに段階的に脱水させて透徹化して封入させた。切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
その結果、ブランク対照群（図９Ａ）マウスの腓腹筋線維は構造が完全であり、形状とサイズが比較的に均一であるに対し、溶媒群（図９Ｂ）の腓腹筋線維は、局所的な炎症性細胞浸潤（赤い矢印）および筋線維の真円度の変化を伴う重度の萎縮を示す。投与群（図９Ｃ）の筋線維萎縮は、溶媒群よりも重症度は低いが、炎症性細胞浸潤もあった。これは、プラスミノーゲンがモデルマウスの筋萎縮を改善できることを示している。

［実施例９］
実施例９は、プラスミノーゲンがＡＬＳモデルマウスの筋萎縮を改善することに関するものである。
週齢の近い野生型オスマウス５匹、およびオスＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウス９匹を取り、野生型マウスをブランク対照群とし、ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスは１４週目に後肢振戦が現れた時点から観察記録し、各マウスの発症時刻を記録し、発症から１４日後に投与を始めた。発症状況によってすべてのマウスをランダムに溶媒対照群とプラスミノーゲン投与群に分け、溶媒対照群マウスが５匹であり、毎日０．１ｍｌ／匹で溶媒（１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４）を尾静脈注射により投与し、プラスミノーゲン投与群で４匹、毎日１ｍｇ／０．１ｍｌ／匹でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、ＳＰＦ環境下で連続して投与した。マウスが死にかけていたときに取材し、最長の投与は６１日間であった。臀筋を採取し、ホルマリン固定液で固定した。固定後の組織をアルコールで段階的に脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ、さらに浸水して水で１回洗浄し、ヘマトキシリンで１０分間染色させた後、流水で５分間流した。１％塩酸エタノールで１０秒分別させ、流水で１０分間流し、０．２％エオシンで１０秒染色させ、さらに段階的に脱水させて透徹化して封入させた。切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
その結果、ブランク対照群（図１０Ａ）マウスの筋線維は構造が比較的に完全であり、形状とサイズが比較的に均一である。溶媒群（図１０Ｂ）マウスの臀筋の筋線維は、真円度の変化、異なるサイズ、重度の萎縮、および炎症性細胞の浸潤を示しす。投与群（図１０Ｃ）のマウスの臀筋線維の構造及び形状は、溶媒群のそれと比較してある程度回復している。これは、プラスミノーゲンがＡＬＳモデルマウスの筋萎縮を改善できることを示している。

［実施例１０］
実施例１０は、プラスミノーゲンがＡＬＳモデルマウスの脊髄の前角におけるＳＭＮタンパク質の発現を促進することに関するものである。
週齢の近い野生型オスマウス５匹、およびオスＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウス９匹を取り、ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスは１４週目に後肢振戦が現れた時点から観察記録し、各マウスの発症時刻を記録し、発症から１４日後に投与を始めた。発症状況によってすべてのマウスをランダムに溶媒対照群とプラスミノーゲン投与群に分け、溶媒対照群マウスが５匹であり、毎日０．１ｍｌ／匹で溶媒（１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４）を尾静脈注射により投与し、プラスミノーゲン投与群で４匹、毎日１ｍｇ／０．１ｍｌ／匹でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、ＳＰＦ環境下で連続して投与した。マウスが死にかけていたときに取材し、最長の投与は６１日間であった。脊髄を採取し、ホルマリン固定液で固定した。固定後の組織をアルコールで段階的に脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。組織の切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ、さらに浸水して水で１回洗浄した。ＰＡＰペンで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗ＳＭＮ抗体（Ａｂｃａｍ）を滴加して４℃で一晩インキュベーションした後、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）の二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、水で３回洗浄した後にヘマトキシリンで３０秒対比染色して、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で４００倍にて観察した。
生存運動ニューロン（Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｍｏｔｏｒ Ｎｅｕｒｏｎ、ＳＭＮ）タンパク質に関する研究は、ＳＯＤ１－ＡＬＳモデルの生存運動ニューロン（Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｍｏｔｏｒ Ｎｅｕｒｏｎ、ＳＭＮ）タンパク質のレベルが低下し、ＳＭＮタンパク質の増加が疾患の表現型を改善できることを示している^［１１］。
その結果、投与群（図１１Ｂ）マウスの脊髄前角におけるＳＭＮタンパク質の発現レベルは、溶媒群（図１１Ａ）よりも有意に高い。これは、プラスミノーゲンがモデルマウスの脊髄前角におけるＳＭＮタンパク質の発現を促進できることを示している。

参考文献：
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Claims (15)

1. 筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に罹患している被験者に治療有効量のプラスミノーゲン経路活性化剤を投与することを含む、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療する方法。
2. 前記プラスミノーゲン経路活性化剤が前記筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に罹患している被験者に対して、寿命と生存期間の中央値の延伸、筋肉の萎縮と筋力の低下の遅延、体重減少の速度の緩和、脊髄の前角における細胞損傷、変性および壊死の低減、脊髄の前角におけるｃｈＡＴの合成の促進、コリン作動性ニューロン機能の回復の促進、脊髄の前角におけるシナプトフィジンの発現の促進、脊髄の前角におけるＳＭＮタンパク質の発現の促進、脊髄の前角の炎症の修復の促進、およびシナプス損傷の修復の促進から選択される１つ以上の活性を有する、請求項１に記載の方法。
3. 前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、被験者の筋萎縮、筋力低下、けいれん、および／または線維束性収縮の症状を改善する、請求項１に記載の方法。
4. 前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、被験者の体重減少を軽減し、および／または生存期間を延長する、請求項１に記載の方法。
5. 前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、被験者の筋緊張を改善する、請求項１に記載の方法。
6. 前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、被験者の筋肉機能の回復を促進する、請求項１に記載の方法。
7. 前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、被験者の脊髄前角のニューロン損傷の修復を促進する、請求項１に記載の方法。
8. 前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、１つ以上の他の薬剤および／または治療方法と組み合わせて投与される、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、静脈内、皮下、筋肉内、髄腔内、鼻吸入、エアロゾル吸入、点鼻薬または点眼薬の投与によって投与される、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、プラスミノーゲン活性化経路の成分である、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記プラスミノーゲン活性化経路の成分がプラスミノーゲンである、請求項１０に記載の方法。
12. 前記プラスミノゲンが、配列２、６、８、１０または１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノーゲン活性を有する、請求項１１に記載の方法。
13. 前記プラスミノーゲンがプラスミノーゲン活性フラグメントを含み、且つ依然としてプラスミノーゲン活性および／またはリジン結合活性を有するタンパク質である、請求項１１に記載の方法。
14. 前記プラスミノーゲンがＧｌｕ－プラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、ミニプラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン、ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲンまたはそれらの、プラスミノーゲン活性を保持した変異体から選択されるものである、請求項１１に記載の方法。
15. 前記プラスミノーゲンが、天然または合成のヒトプラスミノーゲン、または依然としてプラスミノーゲン活性および／またはリジン結合活性を保持した変異体若しくはフラグメントである、請求項１１に記載の方法。

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