TWI787767B - 一種治療亨廷頓病的方法和藥物 - Google Patents

Abstract

本發明涉及一種治療亨廷頓病的方法和藥物，包括給藥受試者治療有效量的纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分或其相關化合物。本發明還涉及用於治療亨廷頓病的包含上述組分或化合物的藥物、藥物組合物、製品、試劑盒。

Description

一種治療亨廷頓病的方法和藥物

本發明涉及亨廷頓病的治療，包括給藥受試者有效量的纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分或其相關化合物，例如纖溶酶原，以治療亨廷頓病。

亨廷頓病（Huntington's disease，縮寫 HD），又稱大舞蹈病或亨廷頓舞蹈症(Huntington's chorea)，是一種常染色體顯性遺傳性神經退行性疾病。其致病基因爲位於染色體4p16.3位置的IT-15基因（又稱HTT基因），該基因在亨廷頓病患者中存在胞嘧啶-腺嘌呤-鳥嘌呤（CAG）三核苷酸重複序列異常擴增，當其拷貝數目＞40次時即具備完全外顯率。一般患者在中年發病，主要症狀包括以舞蹈樣症狀爲典型表現的進行性加重的運動障礙、認知功能衰退及精神症狀。目前對舞蹈樣症狀的控制多採用丁苯那嗪或奧氮平等第2代抗精神病藥物；對抑鬱等精神症狀的改善多借助抗抑鬱藥。然而這些藥物並不能延緩病程進展。目前也有一些研究在積極探索通過基因治療方法進行病因治療，但基因治療的方法存在諸多不確定性。因此，如何另闢蹊徑，尋找更爲有效的治療方法，成爲該疾病研究的焦點。

本發明研究發現纖溶酶原可以明顯改善亨廷頓病及其相關的症狀，例如改善亨廷頓病受試者運動障礙、改善認知功能障礙、減緩體重下降、保護未損傷神經元，促進已損傷神經元的修復和/或改善神經精神症狀，爲亨廷頓病提供了一種有效的治療方法。

本發明涉及如下各項：

1. 一方面，本申請涉及一種治療亨廷頓病的方法，包括給藥患亨廷頓病受試者治療有效量的選自如下的一種或多種化合物：纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分、能夠直接激活纖維蛋白溶酶原或通過激活纖維蛋白溶酶原激活途徑上游組分而間接激活纖維蛋白溶酶原的化合物、模擬纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶之活性的化合物、能夠上調纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶原激活劑表達的化合物、纖維蛋白溶酶原類似物、纖維蛋白溶酶類似物、tPA或uPA類似物和纖溶抑制劑的拮抗劑。

一方面，本申請涉及選自如下的一種或多種化合物在製備治療亨廷頓病的藥物中的用途，所述一種或多種化合物選自：纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分、能夠直接激活纖維蛋白溶酶原或通過激活纖維蛋白溶酶原激活途徑上游組分而間接激活纖維蛋白溶酶原的化合物、模擬纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶之活性的化合物、能夠上調纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶原激活劑表達的化合物、纖維蛋白溶酶原類似物、纖維蛋白溶酶類似物、tPA或uPA類似物和纖溶抑制劑的拮抗劑。

一方面，本申請涉及用於治療亨廷頓病的包含選自如下的一種或多種化合物的藥物或藥物組合物，所述一種或多種化合物選自：纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分、能夠直接激活纖維蛋白溶酶原或通過激活纖維蛋白溶酶原激活途徑上游組分而間接激活纖維蛋白溶酶原的化合物、模擬纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶之活性的化合物、能夠上調纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶原激活劑表達的化合物、纖維蛋白溶酶原類似物、纖維蛋白溶酶類似物、tPA或uPA類似物和纖溶抑制劑的拮抗劑。

2. 項1所述的方法、用途、藥物或藥物組合物，其中所述纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分選自纖維蛋白溶酶原、重組人纖維蛋白溶酶、Lys-纖維蛋白溶酶原、Glu-纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、含有纖維蛋白溶酶原和纖維蛋白溶酶的一個或多個kringle結構域和蛋白酶結構域的纖維蛋白溶酶原和纖維蛋白溶酶變體及類似物、小纖維蛋白溶酶原(mini-plasminogen)、小纖維蛋白溶酶(mini-plasmin)、微纖溶酶原（micro-plasminogen）、微纖溶酶（micro-plasmin）、delta-纖溶酶原、delta-纖溶酶（delta-plasmin）、纖維蛋白溶酶原激活劑、tPA和uPA。

3. 項1的方法、用途、藥物或藥物組合物，所述纖溶抑制劑的拮抗劑爲PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白的抑制劑，例如抗體。

4. 項1-3任一項的方法、用途、藥物或藥物組合物，其中所述化合物對所述亨廷頓病受試者具有選自如下一項或多項作用：改善或緩解運動障礙、改善認知功能障礙、減緩體重下降、促進已損傷神經元的修復、改善神經精神症狀、緩解焦慮、減少海馬GFAP的表達、減少海馬體細胞凋亡、促進小腦、海馬體或紋狀體神經元尼氏體數量恢復、修復海馬體、紋狀體或嗅結節的損傷、促進海馬體或紋狀體BDNF的表達、和促進紋狀體髓鞘再生。

5. 項1-4任一項的方法、用途、藥物或藥物組合物，其中所述化合物與一種或多種其它藥物或治療方法聯用。

6. 項5的方法、用途、藥物或藥物組合物，其中所述其它藥物或治療方法選自如下的一種或多種：抗多巴胺能藥物、多巴胺受體抑制劑、抗精神病藥物（例如丁醯苯類藥物和吩噻嗪類藥物）、γ-氨基丁酸轉移酶抑制劑、細胞移植治療和基因治療。

7. 項1-6任一項的方法、用途、藥物或藥物組合物，其中所述化合物爲纖溶酶原。

8. 項1-7任一項的方法、用途、藥物或藥物組合物，其中所述纖溶酶原爲人全長纖溶酶原或其保守取代變體。

9. 項1-7任一項的方法、用途、藥物或藥物組合物，其中所述纖溶酶原與序列2具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖溶酶原的賴氨酸結合活性或蛋白水解活性。

10. 項1-7任一項的方法、用途、藥物或藥物組合物，所述纖溶酶原包含與序列14具有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列、並且仍然具有纖溶酶原的蛋白水解活性的蛋白質。

11. 項1-7任一項的方法、用途、藥物或藥物組合物，所述纖溶酶原選自Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、小纖溶酶原、微纖溶酶原、delta-纖溶酶原或它們的保留纖溶酶原的蛋白水解活性的變體。

12. 項1-7任一項的方法、用途、藥物或藥物組合物，所述纖溶酶原包含序列2、6、8、10、12所示的氨基酸序列或包含序列2、6、8、10、12所示氨基酸序列的保守取代變體。

13. 項1-12任一項的方法、用途、藥物或藥物組合物，其中所述化合物通過鼻腔吸入、霧化吸入、滴鼻液、滴眼液、滴耳液、靜脈內、腹膜內、皮下、顱內、鞘內、動脈內(例如經由頸動脈)或肌肉內給藥。

在本發明的上述任一實施方案中，所述纖溶酶原可與序列2、6、8、10或12具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖溶酶原活性，例如賴氨酸結合活性或蛋白水解活性。在一些實施方案中，所述纖溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基礎上，添加、删除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個氨基酸，並且仍然具有纖溶酶原活性，例如賴氨酸結合活性或蛋白水解活性的蛋白質。

在一些實施方案中，所述纖溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、並且仍然具有纖溶酶原活性，例如賴氨酸結合活性或蛋白水解活性的蛋白質。在一些實施方案中，所述纖溶酶原選自Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、小纖溶酶原、微纖溶酶原、delta-纖溶酶原或它們的保留纖溶酶原活性，例如蛋白水解活性的變體。在一些實施方案中，所述纖溶酶原爲天然或合成的人纖溶酶原、或其仍然保留纖溶酶原活性，例如賴氨酸結合活性或蛋白水解活性的變體或片段。在一些實施方案中，所述纖溶酶原爲來自靈長類動物或嚙齒類動物的人纖溶酶原直向同系物或其仍然保留纖溶酶原活性，例如賴氨酸結合活性或蛋白水解活性的變體或片段。在一些實施方案中，所述纖溶酶原的氨基酸如序列2、6、8、10或12所示。在一些實施方案中，所述纖溶酶原是人天然纖溶酶原。

在一些實施方案中，所述受試者是人。在一些實施方案中，所述受試者缺乏或缺失纖溶酶原。在一些實施方案中，所述缺乏或缺失是先天的、繼發的和/或局部的。

在一些實施方案中，所述藥物組合物包含藥學上可接受的載劑和用於前述方法的纖溶酶原。在一些實施方案中，所述試劑盒可以是預防性或治療性試劑盒，其包含：(i)用於前述方法的纖溶酶原和(ii)用於遞送所述纖溶酶原至所述受試者的構件(means)。在一些實施方案中，所述構件爲注射器或小瓶。在一些實施方案中，所述試劑盒還包含標籤或使用說明書，該標籤或使用說明書指示將所述纖溶酶原投予所述受試者以實施前述任一方法。

在一些實施方案中，所述製品包含：含有標籤的容器；和包含(i)用於前述方法的纖溶酶原或包含纖溶酶原的藥物組合物，其中所述標籤指示將所述纖溶酶原或組合物投予所述受試者以實施前述任一方法。

在一些實施方案中，所述試劑盒或製品還包含另外的一個或多個構件或容器，該構件或容器中含有其他藥物。

在前述方法的一些實施方案中，所述纖溶酶原通過全身或局部給藥，較佳通過以下途徑施用：靜脈內、肌內、皮下給予纖溶酶原來進行治療。在前述方法的一些實施方案中，所述纖溶酶原與適當的多肽載體或穩定劑組合施用。在前述方法的一些實施方案中，所述纖溶酶原以每天0.0001-2000 mg/kg、0.001-800 mg/kg、0.01-600 mg/kg、0.1-400mg/kg、1-200mg/kg、1-100mg/kg、10-100mg/kg（以每公斤體重計算）或0.0001-2000mg/cm2、0.001-800 mg/cm2、0.01-600 mg/cm2、0.1-400 mg/cm2、1-200 mg/cm2、1-100 mg/cm2、 10-100 mg/cm2（以每平方公分體表面積計算）的劑量施用，較佳至少重複一次，較佳至少每天施用。

本發明明確涵蓋了屬於本發明實施方案之間的技術特徵的所有組合，並且這些組合後的技術方案在本申請中已經明確公開，就像上述技術方案  已經單獨且明確公開一樣。另外，本發明還明確涵蓋各個實施方案及其要素的之間的組合，該組合後的技術方案在本文中明確公開。

亨廷頓病（HD）是一種單基因常染色體顯性遺傳性神經系統變性疾病，其發病機制以mHtt蛋白毒性作用爲主，主要症狀包括以舞蹈樣症狀爲典型表現的進行性加重的運動障礙、認知功能衰退及精神症狀。基因突變引起CAG拷貝數目異常增加時，可使突變型Htt（mHtt）蛋白氨基端（N端）多聚穀氨醯胺鏈（polyQ）延長而形成包括片層結構在內的異常構象，造成mHtt蛋白喪失正常功能和獲得毒性作用。

亨廷頓病的“運動障礙”主要包括兩大方面，不自主運動（最常見的爲舞蹈症）以及自主運動障礙（包括運動不協調和動作遲緩）。進行性發展的運動障礙表現爲四肢、面、軀幹的突然、快速的跳動或抽動，這些運動預先不知道，無法可控制，也可以表現爲不能控制的緩慢運動。檢查時可發現舞蹈樣不自主運動和肌張力減低。舞蹈樣不自主運動是本病最突出特徵，大多開始表現爲短暫的不能控制的裝鬼臉、點頭和手指屈伸運動，類似無痛性的抽搐，但較慢且非刻板式。隨病情發展，不隨意運動進行性加重，出現典型的抬眉毛和頭屈曲，當注視物體時頭部跟著轉動，患者行走時出現不穩，騰越步態，加上不斷變換手的姿勢，全身動作像舞蹈。在疾病後期患者因全身不自主運動而不能站立和行走。當病情發展時，隨意運動受損越發明顯，動作笨拙、遲緩、僵直，不能維持複雜的隨意運動，出現吞咽困難、講話吞吞吐吐和構音障礙。出現不正常的眼球活動異常。在疾病的晚期可出現四肢不能活動的木僵狀態。

舞蹈樣運動障礙是成年型亨廷頓病的典型表現。20歲前起病的少年型患者，以不動性肌强直爲主要運動障礙，表現爲肌强直、肌陣攣，至晚期則呈角弓反張。此外與成人患者不同，約50%的少年型亨廷頓病患者有全身性癲癇發作。

亨廷頓病的“認知功能障礙”可在運動症狀發生之前數年就已出現，進展較緩慢。進行性痴呆​是亨廷頓病患者另一個特徵。痴呆在早期具有皮質下痴呆的特徵，後期表現爲皮質和皮質下混合性痴呆。

認知障礙在亨廷頓病的早期即可出現。開始表現爲日常生活和工作中的記憶和計算能力下降，患者記住新信息僅有輕度損害，但回憶有顯著缺陷。言語的改變，包括口語不流利，輕度找詞困難和構音障礙。口語流利性損害是亨廷頓病最早的認知功能障礙之一。在病的中期和晚期，患者不能完成需回憶不常用詞的命名測試。舞蹈樣運動障礙常可累及舌和唇，破壞了發音的韵律和敏捷性，妨礙了言語的量、速度、節律和短語的長度，因此，構音和韵律障礙爲本病患者的突出特徵。

亨廷頓病的“神經精神症狀”可在很早期出現，甚至是首發症狀，例如抑鬱、易激惹和淡漠，更嚴重的症狀包括妄想或精神分裂樣症狀。

纖維蛋白溶解系統（Fibrinolytic system）亦稱纖溶系統，爲參與纖維蛋白溶解（纖溶）過程的一系列化學物質組成的系統，主要包括纖維蛋白溶解酶原（纖溶酶原）、纖溶酶、纖溶酶原激活物、纖溶抑制劑。纖溶酶原激活物包括組織型纖溶酶原激活物（t-PA）和尿激酶型纖溶酶原激活物（u-PA）。t-PA是一種絲氨酸蛋白酶，由血管內皮細胞合成。t-PA激活纖溶酶原，此過程主要在纖維蛋白上進行；尿激酶型纖溶酶原激活物（u-PA）由腎小管上皮細胞和血管內皮細胞産生，可以直接激活纖溶酶原而不需要纖維蛋白作爲輔因子。纖溶酶原（PLG）由肝臟合成，當血液凝固時，PLG大量吸附在纖維蛋白網上，在t-PA或u-PA的作用下，被激活爲纖溶酶，促使纖維蛋白溶解。纖溶酶（PL）是一種絲氨酸蛋白酶，作用如下：降解纖維蛋白和纖維蛋白原；水解多種凝血因子Ⅴ、Ⅷ、Ⅹ、Ⅶ、Ⅺ、Ⅱ等；使纖溶酶原轉變爲纖溶酶；水解補體等。纖溶抑制物：包括纖溶酶原激活物抑制劑（PAI）和α2抗纖溶酶（α2-AP）。PAI主要有PAI-1和PAI-2兩種形式，能特異性與t-PA以1：1比例結合，從而使其失活，同時激活PLG。α2-AP由肝臟合成，與PL以1：1比例結合形成複合物，抑制PL活性；FⅩⅢ使α2-AP以共價鍵與纖維蛋白結合，減弱了纖維蛋白對PL作用的敏感性。體內抑制纖溶系統活性的物質：PAI-1，補體C1抑制物；α2抗纖溶酶；α2巨球蛋白。

本發明的術語“纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分”涵蓋：

1. 纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、Glu-纖維蛋白溶酶原、微纖溶酶原（micro-plasminogen）、delta-纖溶酶原；它們的變體或類似物；

2. 纖維蛋白溶酶以及它們的變體或類似物；和

3. 纖維蛋白溶酶原激活劑，例如tPA和uPA以及包含一個或多個tPA或uPA的結構域(如一個或多個kringle結構域和蛋白水解結構域)的tPA或uPA變體和類似物。

上述纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA和uPA的“變體”包括所有天然存在的人類遺傳變體以及這些蛋白質的其他哺乳動物形式，以及通過添加、删除和/或取代例如1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個氨基酸、仍然具有纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA或uPA活性的蛋白質。例如，纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA和uPA的“變體”包括通過例如1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個保守性氨基酸取代獲得的這些蛋白質的突變變體。

本發明的“纖溶酶原變體”涵蓋與序列2、6、8、10或12具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖溶酶原活性，例如賴氨酸結合活性或蛋白水解活性的蛋白質。例如本發明的“纖溶酶原變體”可以是在序列2、6、8、10或12的基礎上，添加、删除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個氨基酸，並且仍然具有纖溶酶原活性，例如賴氨酸結合活性或蛋白水解活性的蛋白質。具體地，本發明纖溶酶原變體包括所有天然存在的人類遺傳變體以及這些蛋白質的其他哺乳動物形式，以及通過保守性氨基酸取代例如1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個氨基酸獲得的這些蛋白質的突變變體。

本發明的纖溶酶原可以爲來自靈長類動物或嚙齒類動物的人纖溶酶原直向同系物或其仍然保留纖溶酶原活性，例如賴氨酸結合活性或蛋白水解活性的變體，例如序列2、6、8、10或12所示的纖溶酶原，例如序列2所示的人天然纖溶酶原。

上述纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA和uPA的“類似物”包括分別提供與纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA或uPA基本相似的作用的化合物。

上述纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA和uPA的“變體”和“類似物”涵蓋包含一個或多個結構域(例如一個或多個kringle結構域和蛋白水解結構域)的纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA和uPA的“變體”和“類似物”。例如，纖維蛋白溶酶原的“變體”和“類似物”涵蓋包含一個或多個纖溶酶原結構域(例如一個或多個kringle結構域和蛋白水解結構域)的纖維蛋白溶酶原變體和類似物，例如小纖維蛋白溶酶原(mini-plasminogen)。纖維蛋白溶酶的“變體”和“類似物”涵蓋包含一個或多個纖維蛋白溶酶結構域(例如一個或多個kringle結構域和蛋白水解結構域)的纖維蛋白溶酶 “變體”和“類似物”，例如小纖維蛋白溶酶(mini-plasmin)和δ-纖維蛋白溶酶(delta-plasmin)。

上述纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA或uPA的“變體”或“類似物”是否分別具有纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA或uPA的活性，或者是否分別提供與纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA或uPA基本相似的作用可以通過本領域習知方法進行檢測，例如，通過基於酶譜法(enzymography)、ELISA(酶聯免疫吸附測定)和FACS(螢光激活細胞分選方法)通過激活的纖維蛋白溶酶活性水平來衡量，例如可以參照選自如下文獻中記載的方法測量：Ny，A.，Leonardsson，G.，Hagglund，A.C，Hagglof，P.，Ploplis，V.A.，Carmeliet，P. and Ny，T. (1999). Ovulation inplasminogen-deficient mice. Endocrinology 140，5030-5035；Silverstein RL, Leung LL, Harpel PC, Nachman RL (November 1984). "Complex formation of platelet thrombospondin with plasminogen. Modulation of activation by tissue activator". J. Clin. Invest. 74 (5): 1625–33；Gravanis I, Tsirka SE (February 2008). "Tissue-type plasminogen activator as a therapeutic target in stroke". Expert Opinion on Therapeutic Targets. 12 (2): 159–70；Geiger M, Huber K, Wojta J, Stingl L, Espana F, Griffin JH, Binder BR (Aug 1989). "Complex formation between urokinase and plasma protein C inhibitor in vitro and in vivo". Blood. 74 (2): 722–8.

在本發明的一些實施方案中，本發明的“纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分”爲纖溶酶原。在一些實施方案中，所述纖溶酶原爲人全長纖溶酶原或其保留纖溶酶原活性（例如其賴氨酸結合活性和蛋白水解活性）的保守取代變體。在一些實施方案中，所述纖溶酶原選自Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、小纖溶酶原、微纖溶酶原、delta-纖溶酶原或它們的保留纖溶酶原活性（例如其賴氨酸結合活性或蛋白水解活性）的變體。在一些實施方案中，所述纖溶酶原爲天然或合成的人纖溶酶原、或其仍然保留纖溶酶原活性（例如其賴氨酸結合活性或蛋白水解活性）的保守取代變體或其片段。在一些實施方案中，所述纖溶酶原爲來自靈長類動物或嚙齒類動物的人纖溶酶原直向同系物或其仍然保留纖溶酶原活性的保守取代變體或其片段。在一些實施方案中，所述纖溶酶原包含如序列2、6、8、10或12所示氨基酸序列。在一些實施方案中，所述纖溶酶原包含序列2、6、8、10或12所示的氨基酸序列的保守取代序列。在一些實施方案中，所述纖溶酶原的氨基酸如序列2、6、8、10或12所示。在一些實施方案中，所述纖溶酶原爲序列2、6、8、10或12所示的纖溶酶原的保守取代變體。在一些實施方案中，所述纖溶酶原是人天然纖溶酶原或其保守突變體。在一些實施方案中，所述纖溶酶原是如序列2所示的人天然纖溶酶原或其保守取代變體。

“能夠直接激活纖維蛋白溶酶原或通過激活纖維蛋白溶酶原激活途徑上游組分而間接激活纖維蛋白溶酶原的化合物”指能夠直接激活纖維蛋白溶酶原或通過激活纖維蛋白溶酶原激活途徑上游組分而間接激活纖維蛋白溶酶原的任何化合物，例如tPA、uPA、鏈激酶、沙蘆普酶、阿替普酶、瑞替普酶、替奈普酶、阿尼普酶、孟替普酶、拉諾替普酶、帕米普酶、葡激酶。

本發明“纖溶抑制劑的拮抗劑”爲拮抗、減弱、封閉、阻止纖溶抑制劑作用的化合物。所述纖溶抑制劑例如PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶和α2巨球蛋白。所述拮抗劑例如PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白的抗體，或阻斷或下調例如PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白表達的反義RNA或小RNA，或占據PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白的結合位點但無PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白功能的化合物”，或 封閉PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白的結合結構域和/或活性結構域的化合物。

纖溶酶是纖溶酶原激活系統（PA系統）的關鍵組分。它是一種廣譜的蛋白酶，能夠水解細胞外基質（ECM）的幾個組分，包括纖維蛋白、明膠、纖連蛋白、層粘連蛋白和蛋白聚糖。此外，纖溶酶能將一些金屬蛋白酶前體(pro-MMPs)激活形成具有活性的金屬蛋白酶（MMPs）。因此纖溶酶被認爲是胞外蛋白水解作用的一個重要的上游調節物。纖溶酶是由纖溶酶原通過兩種生理性的PAs：組織型纖溶酶原激活劑（tPA）或尿激酶型纖溶酶原激活劑（uPA）蛋白水解形成的。由於纖溶酶原在血漿和其他體液中相對水平較高，傳統上認爲PA系統的調節主要通過PAs的合成和活性水平實現。PA系統組分的合成受不同因素嚴格調節，如激素、生長因子和細胞因子。此外，還存在纖溶酶和PAs的特定生理抑制劑。纖溶酶的主要抑制劑是α2-抗纖溶酶（α2-antiplasmin）。PAs的活性同時被uPA 和tPA 的纖溶酶原激活劑抑制劑-1（PAI-1）抑制以及主要抑制uPA的溶酶原激活劑抑制劑-2（PAI-2）調節。某些細胞表面具有直接水解活性的uPA特異性細胞表面受體(uPAR)。

纖溶酶原是一個單鏈糖蛋白，由791個氨基酸組成，分子量約爲92 kDa。纖溶酶原主要在肝臟合成，大量存在於胞外液中。血漿中纖溶酶原含量約爲2 μM。因此纖溶酶原是組織和體液中蛋白質水解活性的一個巨大的潜在來源。纖溶酶原存在兩種分子形式：谷氨酸-纖溶酶原（Glu-plasminogen）和賴氨酸-纖溶酶原(Lys-plasminogen)。天然分泌和未裂解形式的纖溶酶原具有一個氨基末端（N-末端）谷氨酸，因此被稱爲谷氨酸-纖溶酶原。然而，在纖溶酶存在時，谷氨酸-纖溶酶原在Lys76-Lys77處水解成爲賴氨酸-纖溶酶原。與谷氨酸-纖溶酶原相比，賴氨酸-纖溶酶原與纖維蛋白具有更高的親和力，並可以更高的速率被PAs激活。這兩種形式的纖溶酶原的Arg560-Val561肽鍵可被uPA或tPA切割，導致二硫鍵連接的雙鏈蛋白酶纖溶酶的形成。纖溶酶原的氨基末端部分包含五個同源三環，即所謂的kringles，羧基末端部分包含蛋白酶結構域。一些kringles含有介導纖溶酶原與纖維蛋白及其抑制劑α2-AP特異性相互作用的賴氨酸結合位點。最新發現一個纖溶酶原爲38 kDa的片段，其中包括kringles1-4，是血管生成的有效抑制劑。這個片段被命名爲血管抑素，可通過幾個蛋白酶水解纖溶酶原産生。

纖溶酶的主要底物是纖維蛋白，纖維蛋白的溶解是預防病理性血栓形成的關鍵。纖溶酶還具有對ECM幾個組分的底物特異性，包括層粘連蛋白、纖連蛋白、蛋白聚糖和明膠，表明纖溶酶在ECM重建中亦起著重要作用。間接地，纖溶酶還可以通過轉化某些蛋白酶前體爲活性蛋白酶來降解ECM的其他組分，包括MMP-1，MMP-2，MMP-3和MMP-9。因此，有人提出，纖溶酶可能是細胞外蛋白水解的一個重要的上游調節器。此外，纖溶酶具有激活某些潜在形式的生長因子的能力。在體外，纖溶酶還能水解補體系統的組分並釋放趨化補體片段。

“纖溶酶”是存在於血液中的一種非常重要的酶，能將纖維蛋白凝塊水解爲纖維蛋白降解産物和D-二聚體。

“纖溶酶原”是纖溶酶的酶原形式，根據swiss prot中的序列，按含有信號肽的天然人源纖溶酶原氨基酸序列（序列4）計算由810個氨基酸組成，分子量約爲90kD，主要在肝臟中合成並能夠在血液中循環的糖蛋白，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列3所示。全長的纖溶酶原包含七個結構域：位於C末端的絲氨酸蛋白酶結構域、N末端的Pan Apple(PAp)結構域以及5個Kringle結構域(Kringle1-5)。參照swiss prot中的序列，其信號肽包括殘基Met1-Gly19，PAp包括殘基Glu20-Val98，Kringle1包括殘基Cys103-Cys181，Kringle2包括殘基Glu184-Cys262，Kringle3包括殘基Cys275-Cys352，Kringle4包括殘基Cys377-Cys454，Kringle5包括殘基Cys481-Cys560。根據NCBI數據，絲氨酸蛋白酶域包括殘基Val581-Arg804。

Glu-纖溶酶原是人天然全長的纖溶酶原，由791個氨基酸組成（不含有19個氨基酸的信號肽），編碼該序列的cDNA序列如序列1所示，其氨基酸序列如序列2所示。 在體內，還存在一種是從Glu-纖溶酶原的第76-77位氨基酸處水解從而形成的Lys-纖溶酶原，如序列6所示，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列5所示。Delta-纖溶酶原 (δ-plasminogen)是全長纖溶酶原缺失了Kringle2-Kringle5結構的片段，僅含有Kringle1和絲氨酸蛋白酶域（亦稱蛋白酶結構域（protease domain，PD）），有文獻報導了delta-纖溶酶原的氨基酸序列（序列8），編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列7所示。小纖溶酶原（Mini-plasminogen）由Kringle5和絲氨酸蛋白酶域組成，有文獻報導其包括殘基Val443-Asn791（以不含有信號肽的Glu-纖溶酶原序列的Glu殘基爲起始氨基酸），其氨基酸序列如序列10所示，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列9所示。而微纖溶酶原（Micro-plasminogen）僅含有絲氨酸蛋白酶結構域，有文獻報導其氨基酸序列包括殘基Ala543-Asn791（以不含有信號肽的Glu-纖溶酶原序列的Glu殘基爲起始氨基酸），亦有專利文獻CN102154253A報導其序列包括殘基Lys531-Asn791（以不含有信號肽的Glu-纖溶酶原序列的Glu殘基爲起始氨基酸），在本專利申請中微纖溶酶原序列參考專利文獻CN102154253A，其氨基酸序列如序列12所示，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列11所示。

全長纖溶酶原的結構亦描述在Aisina等(Aisina R B , Mukhametova L I . Structure and function of plasminogen/plasmin system[J]. Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 2014, 40(6):590-605)的文章中。在該文章中，Aisina等描述纖溶酶原包括Kringle1、2、3、4、5結構域和絲氨酸蛋白酶結構域（亦稱蛋白酶結構域（protease domain，PD）），其中，Kringles負責纖溶酶原與低分子量和高分子量的配體結合（即賴氨酸結合活性），導致纖溶酶原轉變成一個更加開放的構型，從而更容易被活化；蛋白酶結構域（PD）爲殘基Val562-Asn791，tPA和UPA特異性切割纖溶酶原的Arg561-Val562位活化鍵，從而使纖溶酶原形成纖溶酶，因此，蛋白酶結構域（PD）是賦予纖溶酶原蛋白水解活性的區域。本發明的“纖溶酶”與“纖維蛋白溶酶”、“纖維蛋白溶解酶”可互換使用，含義相同；“纖溶酶原”與“纖維蛋白溶酶原”、“纖維蛋白溶解酶原”可互換使用，含義相同。

在本申請中，所述纖溶酶原“缺乏”的含義或活性爲受試者體內纖溶酶原的含量比正常人低，低至足以影響所述受試者的正常生理功能；所述纖溶酶原“缺失”的含義或活性爲受試者體內纖溶酶原的含量顯著低於正常人，甚至活性或表達極微，只有通過外源提供才能維持正常生理功能。

所屬技術領域中具有通常知識者可以理解，本發明纖溶酶原的所有技術方案適用於纖溶酶，因此，本發明描述的技術方案涵蓋了纖溶酶原和纖溶酶。在循環過程中，纖溶酶原採用封閉的非活性構象，但當結合至血栓或細胞表面時，在纖溶酶原激活劑(plasminogen activator，PA)的介導下，其轉變爲呈開放性構象的活性纖溶酶。具有活性的纖溶酶可進一步將纖維蛋白凝塊水解爲纖維蛋白降解産物和D-二聚體，進而溶解血栓。其中纖溶酶原的PAp結構域包含維持纖溶酶原處於非活性封閉構象的重要决定簇，而KR結構域則能夠與存在於受體和底物上的賴氨酸殘基結合。習知多種能夠作爲纖溶酶原激活劑的酶，包括：組織纖溶酶原激活劑(tPA)、尿激酶纖溶酶原激活劑(uPA)、激肽釋放酶和凝血因子XII(哈格曼因子)等。

“纖溶酶原活性片段” 是指具有與底物靶序列中賴氨酸結合的活性（賴氨酸結合活性）、或發揮蛋白水解功能的活性（蛋白水解活性）、或蛋白水解活性和賴氨酸結合活性的片段。本發明涉及纖溶酶原的技術方案涵蓋了用纖溶酶原活性片段代替纖溶酶原的技術方案。在一些實施方案中，本發明所述的纖溶酶原活性片段包含纖溶酶原的絲氨酸蛋白酶結構域或由纖溶酶原的絲氨酸蛋白酶結構域組成。在一些實施方案中，本發明所述的纖溶酶原活性片段包含序列14、或包含與序列14具有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列，或由序列14組成、或由與序列14具有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列組成。在一些實施方案中，本發明所述的纖溶酶原活性片段包含選自Kringle 1、Kringle 2、Kringle 3、Kringle 4、Kringle 5中一個或多個的區域或其保守取代變體，或由選自Kringle 1、Kringle 2、Kringle 3、Kringle 4、Kringle 5中一個或多個的區域或其保守取代變體組成。在一些實施方案中，本發明所述的纖溶酶原包括含有上述纖溶酶原活性片段的蛋白質。

目前，對於血液中纖溶酶原及其活性測定方法包括：對組織纖溶酶原激活劑活性的檢測(t-PAA)、血漿組織纖溶酶原激活劑抗原的檢測(t-PAAg)、對血漿組織纖溶酶原活性的檢測(plgA)、血漿組織纖溶酶原抗原的檢測(plgAg) 、血漿組織纖溶酶原激活劑抑制物活性的檢測、血漿組織纖溶酶原激活劑抑制物抗原的檢測、血漿纖維蛋白溶酶-抗纖維蛋白溶酶複合物檢測(PAP)。其中最常用的檢測方法爲發色底物法：向受檢血漿中加鏈激酶(SK)和發色底物，受檢血漿中的PLG在SK的作用下，轉變成PLM，後者作用於發色底物，隨後用分光光度計測定，吸光度增加與纖溶酶原活性成正比。此外亦可採用免疫化學法、凝膠電泳、免疫比濁法、放射免疫擴散法等對血液中的纖溶酶原活性進行測定。

“直系同源物或直系同系物（ortholog）”指不同物種之間的同源物，既包括蛋白同源物亦包括DNA同源物，亦稱爲直向同源物、垂直同源物。其具體指不同物種中由同一祖先基因進化而來的蛋白或基因。本發明的纖溶酶原包括人的天然纖溶酶原，還包括來源於不同物種的、具有纖溶酶原活性的纖溶酶原直系同源物或直系同系物。

“保守取代變體”是指其中一個給定的氨基酸殘基改變但不改變蛋白質或酶的整體構象和功能，這包括但不限於以相似特性（如酸​​性，鹼性，疏水性，等）的氨基酸取代親本蛋白質中氨基酸序列中的氨基酸。具有類似性質的氨基酸是衆所周知的。例如，精氨酸、組氨酸和賴氨酸是親水性的鹼性氨基酸並可以互換。同樣，異亮氨酸是疏水氨基酸，則可被亮氨酸，蛋氨酸或纈氨酸替換。因此，相似功能的兩個蛋白或氨基酸序列的相似性可能會不同。例如，基於MEGALIGN算法的70％至99％的相似度（同一性）。“保守取代變體”還包括通過BLAST或FASTA算法確定具有60％以上的氨基酸同一性的多肽或酶，若能達 75％以上更好，最好能達85％以上，甚至達90％以上爲最佳，並且與天然或親本蛋白質或酶相比具有相同或基本相似的性質或功能。

“分離的”纖溶酶原是指從其天然環境分離和/或回收的纖溶酶原蛋白。在一些實施方案中，所述纖溶酶原會純化(1)至大於90%、大於95%、或大於98%的純度(按重量計)，如通過Lowry法所確定的，例如超過99% (按重量計)，(2)至足以通過使用旋轉杯序列分析儀獲得N端或內部氨基酸序列的至少15個殘基的程度，或(3)至同質性，該同質性是通過使用考馬斯藍或銀染在還原性或非還原性條件下的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)確定的。分離的纖溶酶原亦包括通過生物工程技術從重組細胞製備，並通過至少一個純化步驟分離的纖溶酶原。

術語“多肽”、“肽”和“蛋白質”在本文中可互換使用，指任何長度的氨基酸的聚合形式，其可以包括遺傳編碼的和非遺傳編碼的氨基酸，化學或生物化學修飾的或衍生化的氨基酸，和具有經修飾的肽主鏈的多肽。該術語包括融合蛋白，包括但不限於具有異源氨基酸序列的融合蛋白，具有異源和同源前導序列(具有或沒有N端甲硫氨酸殘基)的融合物；等等。

關於參照多肽序列的“氨基酸序列同一性百分數（%）”定義爲在必要時引入缺口以實現最大百分比序列同一性後，且不將任何保守替代視爲序列同一性的一部分時，候選序列中與參照多肽序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分率。爲測定百分比氨基酸序列同一性目的的對比可以以本領域技術範圍內的多種方式實現，例如使用公衆可得到的計算機軟件，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign（DNASTAR）軟件。所屬技術領域中具有通常知識者能决定用於比對序列的適宜參數，包括對所比較序列全長實現最大對比需要的任何算法。然而，爲了本發明的目的，氨基酸序列同一性百分數值是使用序列比較計算機程序ALIGN-2産生的。

在採用ALIGN-2來比較氨基酸序列的情况中，給定氨基酸序列A相對於給定氨基酸序列B的%氨基酸序列同一性（或者可表述爲具有或包含相對於、與、或針對給定氨基酸序列B的某一%氨基酸序列同一性的給定氨基酸序列A）如下計算：

分數X/Y 乘 100

其中X是由序列比對程序ALIGN-2在該程序的A和B比對中評分爲相同匹配的氨基酸殘基的數目，且其中Y是B中的氨基酸殘基的總數。應當領會，在氨基酸序列A的長度與氨基酸序列B的長度不相等的情况下，A相對於B的%氨基酸序列同一性會不等於B相對於A的%氨基酸序列同一性。除非另有明確說明，本文中使用的所有%氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2計算機程序獲得的。

如本文中使用的，術語“治療”指獲得期望的藥理和/或生理效果。所述效果可以是完全或部分預防疾病或其症狀的發生、發作，部分或完全減輕疾病和/或其症狀，和/或部分或完全治癒疾病和/或其症狀，包括：(a)預防疾病在受試者體內發生或發作，所述受試者可以具有疾病的素因，但是尚未診斷爲具有疾病；(b)抑制疾病，即阻滯其形成；和(c)減輕疾病和/或其症狀，即引起疾病和/或其症狀消退或消失。

術語“個體”、“受試者”和“患者”在本文中可互換使用，指哺乳動物，包括但不限於鼠(大鼠、小鼠)、非人靈長類、人、犬、猫、有蹄動物(例如馬、牛、綿羊、猪、山羊)等。

“治療有效量”或“有效量”指在對哺乳動物或其它受試者施用以治療疾病時足以實現對疾病的所述預防和/或治療的纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分或其相關化合物（例如纖溶酶原）的量。“治療有效量”會根據所使用的纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分或其相關化合物（例如纖溶酶原）、要治療的受試者的疾病和/或其症狀的嚴重程度以及年齡、體重等而變化。

本發明纖溶酶原的製備

纖溶酶原可以從自然界分離並純化用於進一步的治療用途，亦可以通過標準的化學肽合成技術來合成。當通過化學合成多肽時，可以經液相或固相進行合成。固相多肽合成(SPPS) (其中將序列的C末端氨基酸附接於不溶性支持物，接著序貫添加序列中剩餘的氨基酸)是適合纖溶酶原化學合成的方法。各種形式的SPPS，諸如Fmoc和Boc可用於合成纖溶酶原。用於固相合成的技術描述於Barany和Solid-Phase Peptide Synthesis; 第3-284頁於The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology.第2卷：Special Methods in Peptide Synthesis, Part A., Merrifield,等 J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2156 (1963); Stewart等, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed. Pierce Chem. Co., Rockford, Ill. (1984);和Ganesan A. 2006 Mini Rev. Med Chem. 6:3-10和Camarero JA等 2005 Protein Pept Lett. 12:723-8中。簡言之，用其上構建有肽鏈的功能性單元處理小的不溶性多孔珠。在偶聯/去保護的重複循環後，將附接的固相游離N末端胺與單個受N保護的氨基酸單元偶聯。然後，將此單元去保護，露出可以與別的氨基酸附接的新的N末端胺。肽保持固定在固相上，之後將其切掉。

可以使用標準重組方法來生産本發明的纖溶酶原。例如，將編碼纖溶酶原的核酸插入表達載體中，使其與表達載體中的調控序列可操作連接。表達調控序列包括但不限於啓動子(例如天然關聯的或異源的啓動子)、信號序列、增强子元件、和轉錄終止序列。表達調控可以是載體中的真核啓動子系統，所述載體能夠轉化或轉染真核宿主細胞(例如COS或CHO細胞)。一旦將載體摻入合適的宿主中，在適合於核苷酸序列的高水平表達及纖溶酶原的收集和純化的條件下維持宿主。

合適的表達載體通常在宿主生物體中作爲附加體或作爲宿主染色體DNA的整合部分複製。通常，表達載體含有選擇標誌物(例如氨苄青黴素抗性、潮黴素抗性、四環素抗性、卡那黴素抗性或新黴素抗性)以有助於對外源用期望的DNA序列轉化的那些細胞進行檢測。

大腸桿菌(Escherichia coli)是可以用於複製主題抗體編碼多核苷酸的原核宿主細胞的例子。適合於使用的其它微生物宿主包括桿菌，諸如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和其他腸桿菌科(enterobacteriaceae)，諸如沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、和各種假單胞菌屬(Pseudomonas)物種。在這些原核宿主中，亦可以生成表達載體，其通常會含有與宿主細胞相容的表達控制序列(例如複製起點)。另外，會存在許多公知的啓動子，諸如乳糖啓動子系統，色氨酸(trp)啓動子系統，beta-內醯胺酶啓動子系統，或來自噬菌體λ的啓動子系統。啓動子通常會控制表達，任選在操縱基因序列的情况中，並且具有核糖體結合位點序列等，以啓動並完成轉錄和翻譯。

其他微生物，諸如酵母亦可用於表達。酵母(例如釀酒酵母(S. cerevisiae))和畢赤酵母(Pichia)是合適的酵母宿主細胞的例子，其中合適的載體根據需要具有表達控制序列(例如啓動子)、複製起點、終止序列等。典型的啓動子包含3-磷酸甘油酸激酶和其它糖分解酶。誘導型酵母啓動於特別包括來自醇脫氫酶、異細胞色素C、和負責麥芽糖和半乳糖利用的酶的啓動子。

在微生物外，哺乳動物細胞(例如在體外細胞培養物中培養的哺乳動物細胞)亦可以用於表達並生成本發明的抗-Tau抗體(例如編碼主題抗-Tau抗體的多核苷酸)。參見Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987)。合適的哺乳動物宿主細胞包括CHO細胞系、各種Cos細胞系、HeLa細胞、骨髓瘤細胞系、和經轉化的B細胞或雜交瘤。用於這些細胞的表達載體可以包含表達控制序列，如複製起點，啓動子和增强子(Queen等, Immunol. Rev. 89:49 (1986))，以及必需的加工信息位點，諸如核糖體結合位點，RNA剪接位點，多聚腺苷酸化位點，和轉錄終止子序列。合適的表達控制序列的例子是白免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳頭瘤病毒、巨細胞病毒等衍生的啓動子。參見Co等, J. Immunol. 148:1149 (1992)。

一旦合成(化學或重組方式)，可以依照本領域的標準規程，包括硫酸銨沉澱，親和柱，柱層析，高效液相層析(HPLC)，凝膠電泳等來純化本發明所述的纖溶酶原。該纖溶酶原是基本上純的，例如至少約80%至85%純的，至少約85%至90%純的，至少約90%至95%純的，或98%至99%純的或更純的，例如不含污染物，所述污染物如細胞碎片，除目標産物以外的大分子，等等。

藥物配製劑

可以通過將具有所需純度的纖溶酶原與可選的藥用載體，賦形劑，或穩定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16版，Osol, A. ed.(1980))混合形成凍乾製劑或水溶液製備治療配製劑。可接受的載體、賦形劑、穩定劑在所用劑量及濃度下對受者無毒性，並包括緩衝劑例如磷酸鹽，檸檬酸鹽及其它有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化己烷雙胺；氯化苄烷銨(benzalkonium chloride)，苯索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；烷基對羥基苯甲酸酯如甲基或丙基對羥基苯甲酸酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；間甲酚)；低分子量多肽(少於約10個殘基)；蛋白質如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，穀氨醯胺、天冬醯胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA；糖類如蔗糖、甘露醇、岩藻糖或山梨醇；成鹽反離子如鈉；金屬複合物(例如鋅-蛋白複合物)；和/或非離子表面活性劑，例如 TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。較佳凍乾的抗-VEGF抗體配製劑在WO 97/04801中描述，其包含在本文中作爲參考。

本發明的配製劑亦可含有需治療的具體病症所需的一種以上的活性化合物，較佳活性互補並且相互之間沒有副作用的那些。例如，抗高血壓的藥物，抗心律失常的藥物，治療糖尿病的藥物等。

本發明的纖溶酶原可包裹在通過諸如凝聚技術或界面聚合而製備的微膠囊中，例如，可置入在膠質藥物傳送系統(例如，脂質體，白蛋白微球，微乳劑，納米顆粒和納米膠囊)中或置入粗滴乳狀液中的羥甲基纖維素或凝膠-微膠囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊中。這些技術公開於Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.(1980)。

用於體內給藥的本發明的纖溶酶原必需是無菌的。這可以通過在冷凍乾燥和重新配製之前或之後通過除菌濾膜過濾而輕易實現。

本發明的纖溶酶原可製備緩釋製劑。緩釋製劑的適當實例包括具有一定形狀且含有糖蛋白的固體疏水聚合物半通透基質，例如膜或微膠囊。緩釋基質實例包括聚酯、水凝膠(如聚(2-羥基乙基-異丁烯酸酯)(Langer等，J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277(1981)；Langer, Chem. Tech., 12:98-105(1982))或聚(乙烯醇)，聚交酯(美國專利3773919, EP 58,481)，L-谷氨酸與γ乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman，等，Biopolymers 22:547(1983))，不可降解的乙烯－乙烯乙酸酯(ethylene-vinyl acetate)(Langer，等，出處同上)，或可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如Lupron DepotTM(由乳酸-羥基乙酸共聚物和亮氨醯脯氨酸(leuprolide)乙酸酯組成的可注射的微球體)，以及聚D-(-)-3-羥丁酸。聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羥基乙酸能持續釋放分子100天以上，而一些水凝膠釋放蛋白的時間却較短。可以根據相關機理來設計使蛋白穩定的合理策略。例如，如果發現凝聚的機理是通過硫代二硫鍵互換而形成分子間S-S鍵，則可通過修飾巰基殘基、從酸性溶液中凍乾、控制濕度、採用合適的添加劑、和開發特定的聚合物基質組合物來實現穩定。

給藥和劑量

可以通過不同方式，例如通過鼻腔吸入、霧化吸入、滴鼻液或滴眼液，靜脈內，腹膜內、皮下、顱內、鞘內、動脈內(例如經由頸動脈)、肌內、直腸給藥來實現本發明藥物組合物的施用。

用於胃腸外施用的製備物包括無菌水性或非水性溶液、懸浮液和乳劑。非水性溶劑的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油，和可注射有機酯，如油酸乙酯。水性載體包括水、醇性/水性溶液、乳劑或懸浮液，包括鹽水和緩衝介質。胃腸外媒介物包含氯化鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化鈉、或固定油。靜脈內媒介物包含液體和營養補充物、電解質補充物，等等。亦可以存在防腐劑和其他添加劑，諸如，抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、和惰性氣體，等等。

醫務人員會基於各種臨床因素確定劑量方案。如醫學領域中公知的，任一患者的劑量取决於多種因素，包括患者的體型、體表面積、年齡、要施用的具體化合物、性別、施用次數和路徑、總體健康、和同時施用的其它藥物。本發明包含纖溶酶原的藥物組合物的劑量範圍可以爲每天約0.0001至2000 mg/kg，或約0.001至500 mg/kg (例如0.02 mg/kg，0.25 mg/kg，0.5 mg/kg，0.75 mg/kg，10 mg/kg，50 mg/kg等等)受試者體重。例如，劑量可以是1 mg/kg體重或50 mg/kg體重或在1-50 mg/kg的範圍，或至少1 mg/kg。高於或低於此例示性範圍的劑量亦涵蓋在內，特別是考慮到上述的因素。上述範圍中的中間劑量亦包含在本發明的範圍內。受試者可以每天、隔天、每周或根據通過經驗分析確定的任何其它日程表施用此類劑量。例示性的劑量日程表包括連續幾天0.01-100 mg/kg。在本發明的藥物施用過程中需要實時評估治療效果和安全性。

製品或藥盒

本發明的一個實施方案涉及一種製品或藥盒，其包含可用於治療由糖尿病引起的心血管病及其相關病症的本發明纖溶酶原或纖溶酶。所述製品較佳包括一個容器，標籤或包裝插頁。適當的容器有瓶子，小瓶，注射器等。容器可由各種材料如玻璃或塑料製成。所述容器含有組合物，所述組合物可有效治療本發明的疾病或病症並具有無菌入口(例如所述容器可爲靜脈內溶液包或小瓶，其含有可被皮下注射針穿透的塞子的)。所述組合物中至少一種活性劑爲纖溶酶原/纖溶酶。所述容器上或所附的標籤說明所述組合物用於治療本發明所述由糖尿病引起的心血管病及其相關病症。所述製品可進一步包含含有可藥用緩衝液的第二容器，諸如磷酸鹽緩衝的鹽水，林格氏溶液以及葡萄糖溶液。其可進一步包含從商業和使用者角度來看所需的其它物質，包括其它緩衝液，稀釋劑，過濾物，針和注射器。此外，所述製品包含帶有使用說明的包裝插頁，包括例如指示所述組合物的使用者將纖溶酶原組合物以及治療伴隨的疾病的其它藥物給藥患者。

實施例

以下所有實施例中使用的人纖溶酶原來自人捐贈者血漿，基於如下文獻描述的方法：KennethC Robbins, Louis Summaria, David Elwyn et al. Further Studies on the Purification and Characterization of Human Plasminogen and Plasmin. Journal of Biological Chemistry, 1965, 240 (1) :541-550；Summaria L, Spitz F, Arzadon L et al. Isolation and characterization of the affinity chromatography forms of human Glu- and Lys-plasminogens and plasmins. J Biol Chem. 1976 Jun 25;251(12):3693-9；HAGAN JJ, ABLONDI FB, DE RENZO EC. Purification and biochemical properties of human plasminogen. J Biol Chem. 1960 Apr; 235:1005-10，並進行製程優化，從人捐贈者血漿中純化所得。纖溶酶原單體的純度＞98%。

實施例 1 纖溶酶原改善亨廷頓模型小鼠自發活動及趨避性行爲

取6周齡雄性C57小鼠，造模前3天所有小鼠稱重並進行簡單曠場實驗，觀察5min，排除隨機動物中的自發性差異，最終確定實驗動物23隻，按曠場實驗中小鼠的總運動路程將小鼠隨機分爲2組，空白對照組6隻，模型組17隻。空白對照組小鼠腹腔注射PBS溶液125μL，模型組小鼠按照50mg/kg體重腹腔注射硝基丙酸(3-Nitropropionic acid，3-NP )溶液，每天2次（間隔12小時），連續注射5天，建立亨廷頓模型^[1] 。3-NP溶液配製：將3-NP粉末( sigma,貨號N5636)用PBS溶液溶解至濃度爲10mg/ml。造模完成後的第二天，定爲給藥第0天，所有小鼠稱量體重並進行曠場實驗，模型組小鼠根據曠場實驗中總運動路程隨機分爲2組，溶媒對照組（9隻）和給纖溶酶原組（8隻），溶媒對照組小鼠按照0.1ml/隻每天尾靜脈注射溶媒（10mM檸檬酸鈉溶液，pH7.4），給纖溶酶原組小鼠按照1mg/0.1ml/隻每天尾靜脈注射人纖溶酶原，連續給藥7天。於給藥第7天進行曠場實驗。

3-NP是一種天然真菌毒素，可以不可逆地抑制粒線體琥珀酸脫氫酶，通過血腦屏障引起神經毒性，導致神經元死亡，模擬人類HD症狀^[1] 。

曠場實驗

實驗時，小鼠放入曠場（40x40x40cm）底面中心，同時進行攝像和計時，觀察持續5分鐘，每隻小鼠進行3次實驗。Smart系統是一個完整且方便使用的視頻跟踪系統，用於評估實驗動物的行爲。 它允許記錄運動軌跡，活動，特定行爲（如旋轉，拉伸和飼養）和事件，並執行各種分析參數的計算。本實驗使用Smart3.0系統記錄分析小鼠的運動情况，參數包括總移動距離、邊界靜息時間率、中心區平均運動速度和邊界平均運動速度。每次實驗後採用70%酒精擦拭箱體防止嗅覺産生的偏好^[1] 。

曠場實驗的設計原理是基於小鼠的趨避性，指的是小鼠畏懼開闊、未知、可能存在潜在危險的場所，因而其有“貼牆”活動的天性。趨避性是以小鼠在曠野周邊區（四個角和四個邊）的活動來評價的。從反映趨避性的周邊區活動時間看，時間減少，說明小鼠更富有“冒險”傾向。在中央區活動時間顯著增多，說明趨避性和焦慮（抑鬱）水平較低。

總運動路程

總運動路程是指規定測試時間內運動軌跡的長度。結果顯示，空白對照組在實驗期間會運動一定距離；溶媒對照組小鼠總運動路程明顯長於空白對照組；給纖溶酶原組小鼠總運動路程明顯短於溶媒對照組，統計差異顯著（*表示P＜0.05），且給纖溶酶原組總運動路程接近於空白對照組（圖1）。說明纖溶酶原可促進亨廷頓模型小鼠自發活動行爲的恢復。

邊界區靜息時間率

邊界區爲曠野周邊區（四個角和四個邊）。邊界區靜息時間率是指：邊界區靜息時間與總靜息時間（包括邊界區靜息時間和中心區靜息時間）的比值。結果顯示，空白對照組小鼠具有一定的邊界區靜息時間率；溶媒對照組小鼠邊界區靜息時間率明顯小於空白對照組；給纖溶酶原組小鼠邊界區靜息時間率明顯大於溶媒對照組，統計差異極爲顯著（***表示P＜0.001），且給纖溶酶原組邊界靜息時間率接近於空白對照組（圖2）。說明纖溶酶原可緩解亨廷頓模型小鼠的焦慮行爲。

中央區平均運動速度

中央區是指曠場中央20x20cm的區域。中央區平均運動速度是指中央區總運動路程與中央區總停留時間（包括運動和靜息時間）的比值。結果顯示，空白對照組小鼠具有一定的中央區運動速度；溶媒對照組小鼠中央區平均運動速度明顯小於空白對照組；給纖溶酶原組小鼠中央區平均運動速度明顯大於溶媒對照組，統計差異顯著（*表示P＜0.05），且給纖溶酶原組中央區平均運動速度接近於空白對照組（圖3）。說明纖溶酶原可促進亨廷頓模型小鼠自發活動，緩解焦慮行爲。

邊界區平均運動速度

邊界區平均運動速度是指邊界區總運動路程與邊界區總停留時間的比值。結果顯示，空白對照組具有一定的邊界區運動速度；溶媒對照組小鼠邊界區平均運動速度明顯大於空白對照組；給纖溶酶原組小鼠邊界區平均運動速度明顯小於溶媒對照組，統計差異顯著（*表示P＜0.05），且給纖溶酶原組邊界區平均運動速度接近於空白對照組（圖4）。說明纖溶酶原可促進亨廷頓模型小鼠自發活動及，緩解焦慮行爲。

運動軌跡

結果顯示，空白對照組（圖5A）小鼠中央區運動少，邊界區運動多，運動軌跡有規律；相對於空白對照組，溶媒組(圖5B)小鼠中央區運動和運動總路程明顯增多，運動軌跡混亂無規律；纖溶酶原組(圖5C)小鼠中央區運動和運動總路程明顯少於溶媒組，運動軌跡與空白對照組相似。說明纖溶酶原可促進亨廷頓模型小鼠自發活動及趨避性行爲恢復。

實施例 2 纖溶酶原減緩亨廷頓模型小鼠體重下降

取6周齡雄性C57小鼠，造模前3天所有小鼠稱重並進行的簡單曠場實驗，觀察5min，排除隨機動物中的自發性差異，最終確定實驗動物23隻，按曠場實驗中小鼠總運動路程隨機分爲2組，空白對照組6隻，模型組17隻。空白對照組小鼠腹腔注射PBS溶液125μL，模型組小鼠按照50mg/kg體重腹腔注射硝基丙酸(3-Nitropropionic acid, 3-NP )溶液，每天2次（間隔12小時），連續注射5天，建立亨廷頓模型^[1] 。3-NP溶液配製：將3-NP粉末( sigma,貨號N5636)用PBS溶液溶解至濃度爲10mg/ml。造模完成後的第二天，定爲給藥第0天，所有小鼠稱量體重並進行曠場實驗，模型組小鼠根據曠場實驗中總運動路程隨機分爲2組，溶媒對照組（9隻）和給纖溶酶原組（8隻），溶媒對照組小鼠按照0.1ml/隻每天尾靜脈注射溶媒（10mM檸檬酸_檸檬酸鈉溶液，pH7.4），給纖溶酶原組小鼠按照1mg/0.1ml/隻每天尾靜脈注射人纖溶酶原，連續給藥7天。於給藥第7天測量小鼠體重，計算第7天與第0天體重百分比。

體重減輕是亨廷頓常見的非神經表型，通常是進行性的，可導致營養不良或惡病質^[5] 。

結果顯示，空白對照組體重百分比大於1，體重呈增加趨勢；溶媒對照組小鼠體重百分比小於空白對照組；給纖溶酶原組小鼠體重百分比明顯高於溶媒對照組，且統計差異接近顯著（P=0.07）（圖6）。該結果提示纖溶酶原可促進亨廷頓模型小鼠體重增加。

實施例 3 纖溶酶原減少亨廷頓模型小鼠海馬體 GFAP 表達

取6周齡雄性C57小鼠，造模前3天所有小鼠稱重並進行的簡單曠場實驗，觀察5min，排除隨機動物中的自發性差異，最終確定實驗動物23隻，按曠場實驗中小鼠總運動路程隨機分爲2組，空白對照組6隻，模型組17隻。空白對照組小鼠腹腔注射PBS溶液125μL，模型組小鼠按照50mg/kg體重腹腔注射硝基丙酸(3-Nitropropionic acid, 3-NP )溶液，每天2次（間隔12小時），連續注射5天，建立亨廷頓模型^[1] 。3-NP溶液配製：將3-NP粉末( sigma,貨號N5636)用PBS溶液溶解至濃度爲10mg/ml。造模完成後的第二天，定爲給藥第0天，所有小鼠稱量體重並進行曠場實驗，模型組小鼠根據曠場實驗中總運動路程隨機分爲2組，溶媒對照組（9隻）和給纖溶酶原組（8隻），溶媒對照組小鼠按照0.1ml/隻每天尾靜脈注射溶媒（10mM檸檬酸_檸檬酸鈉，pH7.4），給纖溶酶原組小鼠按照1mg/0.1ml/隻每天尾靜脈注射人纖溶酶原，連續給藥7天。於給藥第7天犧牲小鼠取材海馬於10%中性甲醛溶液固定24-48小時。固定後的海馬組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度爲3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液（Vector laboratories, Inc., USA）封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔源抗GFAP抗體(ab7260, Abcam) 4°C孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔 IgG (HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明幷中性樹膠封片，切片在400倍光學顯微鏡下觀察。

膠質細胞纖維酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein, GFAP）是星形膠質細胞中標誌性的中間絲蛋白，參與細胞骨架的構成並維持其張力强度。星形膠質細胞是中樞神經系統的主要膠質細胞之一，有研究報導，亨廷頓病伴有星形膠質細胞增生和其活性的增强，表現爲GFAP表達上調和細胞肥大^[6-7] 。

結果顯示，空白對照組(圖7A)小鼠海馬體表達一定量的GFAP；溶媒對照組(圖7B)小鼠海馬體GFAP表達明顯多於空白對照組，統計差異極爲顯著（***表示P＜0.001）(圖7D)；給纖溶酶原組(圖7C)小鼠海馬體GFAP表達明顯少於溶媒對照組，統計差異極爲顯著，並且與空白對照組小鼠海馬體GFAP的表達相比無統計學差異。該結果表明纖溶酶原能夠減少亨廷頓模型小鼠海馬體GFAP的表達，抑制星形膠質細胞增生，具有神經保護作用。

實施例 4 纖溶酶原減少亨廷頓模型小鼠海馬體細胞凋亡

取6周齡雄性C57小鼠，造模前3天所有小鼠稱重並進行的簡單曠場實驗，觀察5min，排除隨機動物中的自發性差異，最終確定實驗動物23隻，按曠場實驗中小鼠總運動路程隨機分爲2組，空白對照組6隻，模型組17隻。空白對照組小鼠腹腔注射PBS溶液125μL，模型組小鼠按照50mg/kg體重腹腔注射硝基丙酸(3-Nitropropionic acid, 3-NP )溶液，每天2次（間隔12小時），連續注射5天，建立亨廷頓模型^[1] 。3-NP溶液配製：將3-NP粉末( sigma,貨號N5636)用PBS溶液溶解至濃度爲10mg/ml。造模完成後的第二天，定爲給藥第0天，所有小鼠稱量體重並進行曠場實驗，模型組小鼠根據曠場實驗中總運動路程隨機分爲2組，溶媒對照組（9隻）和給纖溶酶原組（8隻），溶媒對照組小鼠按照0.1ml/隻每天尾靜脈注射溶媒（10mM檸檬酸_檸檬酸鈉溶液，pH7.4），給纖溶酶原組小鼠按照1mg/0.1ml/隻每天尾靜脈注射人纖溶酶原，連續給藥7天。於給藥第7天犧牲小鼠取材海馬體於10%中性甲醛溶液固定24-48小時。固定後的海馬體組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度爲3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液（Vector laboratories,Inc.,USA）封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔源抗caspase-3抗體(BA2142, Boster Biological Technology) 4°C孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔 IgG (HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明幷中性樹膠封片，切片在400倍光學顯微鏡下觀察。

半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3爲關鍵的執行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發揮功能。3-NP亨廷頓模型中，神經元凋亡增加，caspase-3表達上調。

結果顯示，空白對照組（圖8A）海馬體表達一定量的半胱氨酸蛋白酶-3（箭頭標識），溶媒對照組(圖8B)海馬體半胱氨酸蛋白酶-3表達明顯增多，給纖溶酶原組(圖8C)海馬體半胱氨酸蛋白酶-3的表達明顯少於溶媒對照組，且統計差異接近顯著（P=0.058）(圖8D)。該結果提示纖溶酶原能夠減少半胱氨酸蛋白酶-3的表達，減少亨廷頓模型小鼠海馬體細胞的凋亡。

實施例 5 纖溶酶原促進亨廷頓模型小鼠小腦神經元尼氏體數量恢復

取6周齡雄性C57小鼠，造模前3天所有小鼠稱重並進行的簡單曠場實驗，觀察5min，排除隨機動物中的自發性差異，最終確定實驗動物23隻，按曠場實驗中小鼠總運動路程隨機分爲2組，空白對照組6隻，模型組17隻。空白對照組小鼠腹腔注射PBS溶液125μL，模型組小鼠按照50mg/kg體重腹腔注射硝基丙酸(3-Nitropropionic acid, 3-NP )溶液，每天2次（間隔12小時），連續注射5天，建立亨廷頓模型^[1] 。3-NP溶液配製：將3-NP粉末( sigma,貨號N5636)用PBS溶液溶解至濃度爲10mg/ml。造模完成後的第二天，定爲給藥第0天，所有小鼠稱量體重並進行曠場實驗，模型組小鼠根據曠場實驗中總運動路程隨機分爲2組，溶媒對照組（9隻）和給纖溶酶原組（8隻），溶媒對照組小鼠按照0.1ml/隻每天尾靜脈注射溶媒（10mM檸檬酸_檸檬酸鈉溶液，pH7.4），給纖溶酶原組小鼠按照1mg/0.1ml/隻每天尾靜脈注射人纖溶酶原，連續給藥7天。於給藥第7天犧牲小鼠取材小腦於10%中性甲醛溶液固定24-48小時。固定後的小腦組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度爲3μm，脫蠟至水後，用0.5%甲苯胺藍染液進行染色。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在光學顯微鏡下，觀察拍照。

尼氏體是神經元的特徵性結構之一，爲神經元結構蛋白質和功能蛋白質的合成部位，其數量和分布與神經元的功能狀態密切相關。尼氏體的主要化學成分是核糖核酸和蛋白質，有核外染色質之稱，與鹼性染料如甲苯胺藍、硫堇和焦油紫等具有親和力，其中甲苯胺藍染色是最爲常用的顯示尼氏體的傳統方法^[8] 。當神經系統疾病發生時，尼氏體的狀態會出現異常。

結果顯示，空白對照組（圖9A）小腦神經元存在一定數量的尼氏體（箭頭標識）；溶媒對照組(圖9B)小腦神經元尼氏體數量明顯多於空白對照組；給纖溶酶原組（圖9C）小鼠小腦神經元尼氏體數量與空白對照組並無明顯差別，但明顯少於溶媒對照組，且統計差異顯著（*表示P＜0.05）(圖9D)。該結果表明纖溶酶原能夠促進亨廷頓模型小鼠小腦神經元尼氏體數量恢復。

實施例 6 纖溶酶原促進亨廷頓模型小鼠海馬體神經元尼氏體數量恢復

取6周齡雄性C57小鼠，造模前3天所有小鼠稱重並進行的簡單曠場實驗，觀察5min，排除隨機動物中的自發性差異，最終確定實驗動物23隻，按曠場實驗中小鼠總運動路程隨機分爲2組，空白對照組6隻，模型組17隻。空白對照組小鼠腹腔注射PBS溶液125μL，模型組小鼠按照50mg/kg體重腹腔注射硝基丙酸(3-Nitropropionic acid, 3-NP )溶液，每天2次（間隔12小時），連續注射5天，建立亨廷頓模型^[1] 。3-NP溶液配製：將3-NP粉末( sigma,貨號N5636)用PBS溶液溶解至濃度爲10mg/ml。造模完成後的第二天，定爲給藥第0天，所有小鼠稱量體重並進行曠場實驗，模型組小鼠根據曠場實驗中總運動路程隨機分爲2組，溶媒對照組（9隻）和給纖溶酶原組（8隻），溶媒對照組小鼠按照0.1ml/隻每天尾靜脈注射溶媒（10mM檸檬酸_檸檬酸鈉溶液，pH7.4），給纖溶酶原組小鼠按照1mg/0.1ml/隻每天尾靜脈注射人纖溶酶原，連續給藥7天。於給藥第7天犧牲小鼠取材海馬體於10%中性甲醛溶液固定24-48小時。固定後的海馬體組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度爲3μm，脫蠟至水後，用0.4%焦油紫染液（廠家：國藥集團化學試劑有限公司，批號：20181019）（pH=3）進行染色。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。切片在400倍光學顯微鏡下觀察拍照。

焦油紫染色以焦油紫爲核心染料，焦油紫具有感光作用，能夠很好地顯示尼氏體的變化。

結果顯示，空白對照組（圖10A）小鼠左側海馬體神經元存在一定量的尼氏體（箭頭標識）；溶媒組（圖10B）小鼠左側海馬體神經元尼氏體數量明顯多於空白對照組；給纖溶酶原組（圖10C）小鼠左側海馬體神經元尼氏體數量明顯少於溶媒組，統計差異顯著（*表示P＜0.05）(圖10D)。該結果表明纖溶酶原能夠促進海馬體神經元尼氏體數量恢復。

實施例 7 纖溶酶原促進亨廷頓模型小鼠紋狀體神經元尼氏體數量恢復

取6周齡雄性C57小鼠，造模前3天所有小鼠稱重並進行的簡單曠場實驗，觀察5min，排除隨機動物中的自發性差異，最終確定實驗動物23隻，按曠場實驗中小鼠總運動路程隨機分爲2組，空白對照組6隻，模型組17隻。空白對照組小鼠腹腔注射PBS溶液125μL，模型組小鼠按照50mg/kg體重腹腔注射硝基丙酸(3-Nitropropionic acid, 3-NP )溶液，每天2次（間隔12小時），連續注射5天，建立亨廷頓模型^[1] 。3-NP溶液配製：將3-NP粉末( sigma,貨號N5636)用PBS溶液溶解至濃度爲10mg/ml。造模完成後的第二天，定爲給藥第0天，所有小鼠稱量體重並進行曠場實驗，模型組小鼠根據曠場實驗中總運動路程隨機分爲2組，溶媒對照組（9隻）和給纖溶酶原組（8隻），溶媒對照組小鼠按照0.1ml/隻每天尾靜脈注射溶媒（10mM檸檬酸_檸檬酸鈉溶液，pH7.4），給纖溶酶原組小鼠按照1mg/0.1ml/隻每天尾靜脈注射人纖溶酶原，連續給藥7天。於給藥第7天犧牲小鼠取材紋狀體於10%中性甲醛溶液固定24-48小時。固定後的紋狀體組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度爲3μm，脫蠟至水後，用0.4%焦油紫染液（pH=3）進行染色。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。切片在400倍光學顯微鏡下觀察拍照。

結果顯示，空白對照組（圖11A）小鼠紋狀體神經元存在一定量的尼氏體（箭頭標識）；溶媒組（圖11B）小鼠紋狀體神經元尼氏體數量明顯少於空白對照組；給纖溶酶原組（圖11C）小鼠紋狀體神經元尼氏體數量明顯多於溶媒組，統計差異顯著（*表示P＜0.05）(圖11D)。該結果表明纖溶酶原能夠促進紋狀體神經元尼氏體數量恢復。

實施例 8 纖溶酶原減少亨廷頓模型小鼠海馬體損傷

取6周齡雄性C57小鼠，造模前3天所有小鼠稱重並進行的簡單曠場實驗，觀察5min，排除隨機動物中的自發性差異，最終確定實驗動物23隻，按曠場實驗中小鼠總運動路程隨機分爲2組，空白對照組6隻，模型組17隻。空白對照組小鼠腹腔注射PBS溶液125μL，模型組小鼠按照50mg/kg體重腹腔注射硝基丙酸(3-Nitropropionic acid, 3-NP )溶液，每天2次（間隔12小時），連續注射5天，建立亨廷頓模型^[1] 。3-NP溶液配製：將3-NP粉末( sigma,貨號N5636)用PBS溶液溶解至濃度爲10mg/ml。造模完成後的第二天，定爲給藥第0天，所有小鼠稱量體重並進行曠場實驗，模型組小鼠根據曠場實驗中總運動路程隨機分爲2組，溶媒對照組（9隻）和給纖溶酶原組（8隻），溶媒對照組小鼠按照0.1ml/隻每天尾靜脈注射溶媒（10mM檸檬酸_檸檬酸鈉溶液，pH7.4），給纖溶酶原組小鼠按照1mg/0.1ml/隻每天尾靜脈注射人纖溶酶原，連續給藥7天。於給藥第7天犧牲小鼠取材海馬於10%中性甲醛溶液固定24-48小時。固定後的海馬組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。切片厚度爲4μm，切片脫蠟複水並用蘇木素和伊紅染色(HE染色)，1%鹽酸酒精分化後氨水返藍並酒精梯度脫水封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

結果顯示，空白對照組(圖12A-C)小鼠海馬體整體形態正常，結構完整；溶媒對照組(圖12D-F)小鼠海馬體CA1區出現神經元排列紊亂，神經細胞萎縮（細箭頭標識），細胞變性壞死，周圍腦組織疏鬆水腫（三角形標識），CA3區多處神經元核固縮，濃染（粗箭頭標識）；給纖溶酶原組(圖12G-I)海馬體各區形態有所恢復，CA3及DG區局部有個別神經元核固縮，濃染。該結果表明纖溶酶原能夠修復亨廷頓模型小鼠海馬體損傷。

實施例 9 纖溶酶原減少亨廷頓模型小鼠紋狀體損傷

取6周齡雄性C57小鼠，造模前3天所有小鼠稱重並進行的簡單曠場實驗，觀察5min，排除隨機動物中的自發性差異，最終確定實驗動物23隻，按曠場實驗中小鼠總運動路程隨機分爲2組，空白對照組6隻，模型組17隻。空白對照組小鼠腹腔注射PBS溶液125μL，模型組小鼠按照50mg/kg體重腹腔注射硝基丙酸(3-Nitropropionic acid, 3-NP )溶液，每天2次（間隔12小時），連續注射5天，建立亨廷頓模型^[1] 。3-NP溶液配製：將3-NP粉末( sigma,貨號N5636)用PBS溶液溶解至濃度爲10mg/ml。造模完成後的第二天，定爲給藥第0天，所有小鼠稱量體重並進行曠場實驗，模型組小鼠根據曠場實驗中總運動路程隨機分爲2組，溶媒對照組（9隻）和給纖溶酶原組（8隻），溶媒對照組小鼠按照0.1ml/隻每天尾靜脈注射溶媒（10mM檸檬酸_檸檬酸鈉溶液，pH7.4），給纖溶酶原組小鼠按照1mg/0.1ml/隻每天尾靜脈注射人纖溶酶原，連續給藥7天。於給藥第7天犧牲小鼠取材紋狀體於10%中性甲醛溶液固定24-48小時。固定後的紋狀體組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。切片厚度爲3μm，切片脫蠟複水並用蘇木素和伊紅染色(HE染色)，1%鹽酸酒精分化後氨水返藍並酒精梯度脫水封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

結果顯示，空白對照組（圖13A）小鼠紋狀體形態結構正常；溶媒組(圖13B)小鼠紋狀體神經元變性，部分細胞核呈空泡狀（箭頭標識），腦細胞排列紊亂；給纖溶酶原組(圖13C)小鼠紋狀體整體結構有明顯改善，與空白對照組相似。該結果表明纖溶酶原能修復亨廷頓模型小鼠紋狀體損傷。

實施例 10 纖溶酶原改善亨廷頓模型小鼠嗅結節損傷

取6周齡雄性C57小鼠，造模前3天所有小鼠稱重並進行的簡單曠場實驗，觀察5min，排除隨機動物中的自發性差異，最終確定實驗動物23隻，按曠場實驗中小鼠總運動路程隨機分爲2組，空白對照組6隻，模型組17隻。空白對照組小鼠腹腔注射PBS溶液125μL，模型組小鼠按照50mg/kg體重腹腔注射硝基丙酸(3-Nitropropionic acid, 3-NP )溶液，每天2次（間隔12小時），連續注射5天，建立亨廷頓模型^[1] 。3-NP溶液配製：將3-NP粉末( sigma,貨號N5636)用PBS溶液溶解至濃度爲10mg/ml。造模完成後的第二天，定爲給藥第0天，所有小鼠稱量體重並進行曠場實驗，模型組小鼠根據曠場實驗中總運動路程隨機分爲2組，溶媒對照組（9隻）和給纖溶酶原組（8隻），溶媒對照組小鼠按照0.1ml/隻每天尾靜脈注射溶媒（10mM檸檬酸_檸檬酸鈉溶液，pH7.4），給纖溶酶原組小鼠按照1mg/0.1ml/隻每天尾靜脈注射人纖溶酶原，連續給藥7天。於給藥第7天犧牲小鼠腦組織於10%中性甲醛溶液固定24-48小時。固定後的腦組織組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。切片厚度爲3μm，切片脫蠟複水並用蘇木素和伊紅染色(HE染色)，1%鹽酸酒精分化後氨水返藍並酒精梯度脫水封片，切片在200倍光學顯微鏡下定位觀察嗅結節情况。

有研究報導，亨廷頓模型小鼠嗅覺神經損傷，亨廷頓病人伴有嗅覺缺陷^[9] 。

結果顯示，空白對照組（圖14A）小鼠腦部嗅結節結構形態正常,溶媒組（圖14B）小鼠嗅結節出現嚴重的神經膠質細胞浸潤（箭頭標識），給纖溶酶原組（圖14C）小鼠嗅結節神經膠質細胞浸潤明顯少於溶媒組。該結果表明纖溶酶原能夠改善亨廷頓模型小鼠腦部嗅結節損傷。

實施例 11 纖溶酶原促進亨廷頓模型小鼠海馬體 BDNF 的表達

取6周齡雄性C57小鼠，造模前3天所有小鼠稱重並進行的簡單曠場實驗，觀察5min，排除隨機動物中的自發性差異，最終確定實驗動物23隻，按曠場實驗中小鼠總運動路程隨機分爲2組，空白對照組6隻，模型組17隻。空白對照組小鼠腹腔注射PBS溶液125μL，模型組小鼠按照50mg/kg體重腹腔注射硝基丙酸(3-Nitropropionic acid, 3-NP )溶液，每天2次（間隔12小時），連續注射5天，建立亨廷頓模型^[1] 。3-NP溶液配製：將3-NP粉末( sigma,貨號N5636)用PBS溶液溶解至濃度爲10mg/ml。造模完成後的第二天，定爲給藥第0天，所有小鼠稱量體重並進行曠場實驗，模型組小鼠根據曠場實驗中總運動路程隨機分爲2組，溶媒對照組（9隻）和給纖溶酶原組（8隻），溶媒對照組小鼠按照0.1ml/隻每天尾靜脈注射溶媒（10mM檸檬酸_檸檬酸鈉溶液，pH7.4），給纖溶酶原組小鼠按照1mg/0.1ml/隻每天尾靜脈注射人纖溶酶原，連續給藥7天。於給藥第7天犧牲小鼠取材海馬體於10%中性甲醛溶液固定24-48小時。固定後的海馬體組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度爲3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液（Vector laboratories,Inc.,USA）封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔源抗BNDF抗體（PB9075, Boster Biological Technology）4°C孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔 IgG (HRP)抗體(Vector laboratories, MP-7451)二抗室溫孵育30分鐘，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明幷中性樹膠封片，切片在400倍光學顯微鏡下觀察。

BDNF即腦源性神經營養因子( brain derived neurotrophic factor ) ，是在腦內合成的一種蛋白質，它廣泛分布於中樞神經系統內，在中樞神經系統發育過程中，對神經元的存活、分化、生長發育起重要作用。BDNF能防止神經元受損傷死亡、改善神經元的病理狀態、促進受損傷神經元再生及分化等生物效應^[10] 。

結果顯示，空白對照組(圖15A)小鼠右側海馬體表達一定量的BDNF（箭頭標識），溶媒組（圖15B）小鼠右側海馬體BDNF的表達略高於空白對照組，給纖溶酶原組（圖15C）小鼠右側海馬體BDNF的表達明顯高於溶媒組，且統計差異接近顯著（P=0.07）（圖15D）。該結果提示損傷能夠刺激BDNF的表達，而纖溶酶原能夠進一步促進BDNF的表達，從而促進亨廷頓模型小鼠海馬體損傷修復。

實施例 12 纖溶酶原促進亨廷頓模型小鼠紋狀體 BDNF 的表達

取6周齡雄性C57小鼠，造模前3天所有小鼠稱重並進行的簡單曠場實驗，觀察5min，排除隨機動物中的自發性差異，最終確定實驗動物23隻，按曠場實驗中小鼠總運動路程隨機分爲2組，空白對照組6隻，模型組17隻。空白對照組小鼠腹腔注射PBS溶液125μL，模型組小鼠按照50mg/kg體重腹腔注射硝基丙酸(3-Nitropropionic acid, 3-NP )溶液，每天2次（間隔12小時），連續注射5天，建立亨廷頓模型^[1] 。3-NP溶液配製：將3-NP粉末( sigma,貨號N5636)用PBS溶液溶解至濃度爲10mg/ml。造模完成後的第二天，定爲給藥第0天，所有小鼠稱量體重並進行曠場實驗，模型組小鼠根據曠場實驗中總運動路程隨機分爲2組，溶媒對照組（9隻）和給纖溶酶原組（8隻），溶媒對照組小鼠按照0.1ml/隻每天尾靜脈注射溶媒（10mM檸檬酸_檸檬酸鈉溶液，pH7.4），給纖溶酶原組小鼠按照1mg/0.1ml/隻每天尾靜脈注射人纖溶酶原，連續給藥7天。於給藥第7天犧牲小鼠取材紋狀體於10%中性甲醛溶液固定24-48小時。固定後的紋狀體組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度爲3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液（Vector laboratories,Inc.,USA）封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔源抗BNDF抗體（PB9075, Boster Biological Technology）4°C孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔 IgG (HRP)抗體(Vector laboratories, MP-7451)二抗室溫孵育30分鐘，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明幷中性樹膠封片，切片在400倍光學顯微鏡下觀察。

結果顯示，空白對照組(圖16A)小鼠紋狀體表達一定量的BDNF（箭頭標識），溶媒組（圖16B）小鼠紋狀體BDNF的表達略高於空白對照組，給纖溶酶原組（圖16C）小鼠紋狀體BDNF的表達明顯高於溶媒組，且統計差異接近顯著（P=0.1）（圖16D）。該結果提示損傷能夠刺激BDNF的表達，而纖溶酶原能夠進一步促進BDNF的表達，從而促進亨廷頓模型小鼠紋狀體損傷修復。

實施例 13 纖溶酶原促進亨廷頓模型小鼠紋狀體髓鞘再生

取6周齡雄性C57小鼠，造模前3天所有小鼠稱重並進行的簡單曠場實驗，觀察5min，排除隨機動物中的自發性差異，最終確定實驗動物23隻，按曠場實驗中小鼠總運動路程隨機分爲2組，空白對照組6隻，模型組17隻。空白對照組小鼠腹腔注射PBS溶液125μL，模型組小鼠按照50mg/kg體重腹腔注射硝基丙酸(3-Nitropropionic acid, 3-NP )溶液，每天2次（間隔12小時），連續注射5天，建立亨廷頓模型^[1] 。3-NP溶液配製：將3-NP粉末( sigma,貨號N5636)用PBS溶液溶解至濃度爲10mg/ml。造模完成後的第二天，定爲給藥第0天，所有小鼠稱量體重並進行曠場實驗，模型組小鼠根據曠場實驗中總運動路程隨機分爲2組，溶媒對照組（9隻）和給纖溶酶原組（8隻），溶媒對照組小鼠按照0.1ml/隻每天尾靜脈注射溶媒（10mM檸檬酸_檸檬酸鈉溶液，pH7.4），給纖溶酶原組小鼠按照1mg/0.1ml/隻每天尾靜脈注射人纖溶酶原，連續給藥7天。於給藥第7天犧牲小鼠取材紋狀體於10%中性甲醛溶液固定24-48小時。固定後的紋狀體組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。脊髓組織橫切切片厚度爲4μm，脫蠟至水後，用髓鞘染色液進行LFB染色。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在光學顯微鏡下，觀察拍照。

LFB（luxol fast blue）染色運用固藍染色法染髓鞘，是研究皮質脊髓束定位、髓鞘病變、損傷和再生修復形態學觀察的有效方法^[11-12] 。

結果顯示，空白對照組（圖17）小鼠紋狀體髓鞘結構正常；溶媒組（圖17B）小鼠紋狀體髓鞘蛋白量減少，且可見空洞樣變性（箭頭標識）；給纖溶酶原組（圖17C）小鼠紋狀體髓鞘蛋白量明顯多於溶媒組，統計差異接近顯著（P=0.09）(圖17D)。該結果提示纖溶酶原能夠促進亨廷頓模型小鼠紋狀體髓鞘蛋白形成。

參考文獻

[1] Wang L , Wang J , Yang L , et al. Effect of Praeruptorin C on 3-nitropropionic acid induced Huntington’s disease-like symptoms in mice[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy, 2017, 86:81-87.

[2] Marchei P , Diverio S , Falocci N , et al. Breed differences in behavioural development in kittens[J]. Physiology & Behavior, 2009, 96(4-5):522-531.

[3] Jacob W, Yassouridis A, Marsicano G, et al. Endocannabinoids render exploratory behaviour largely independent of the test aversiveness: role of glutamatergic transmission.[J]. Genes Brain & Behavior, 2010, 8(7):685-698.

[4] Walz K, Spencer C, Kaasik K, et al. Behavioral characterization of mouse models for Smith-Magenis syndrome and dup(17)(p11.2p11.2)[J]. Human Molecular Genetics, 2004, 13(4):367.

[5] Aziz N A , Burg J M M V D , Landwehrmeyer G B , et al. Weight loss in Huntington disease increases with higher CAG repeat number[J]. Neurology, 2009, 73(7):1506.

[6] Hol E M, Pekny M. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and the astrocyte intermediate filament system in diseases of the central nervous system.[J]. Current Opinion in Cell Biology, 2015, 32(1):121-130.

[7] Vagner T, Dvorzhak A, Wójtowicz A M, et al. Systemic application of AAV vectors targeting GFAP-expressing astrocytes in Z-Q175-KI Huntington's disease mice.[J]. Molecular & Cellular Neuroscience, 2016, 77:76-86.

[8] Xie J X, Feng Y, Yuan J M, et al. Positive effects of bFGF modified rat amniotic epithelial cells transplantation on transected rat optic nerve[J]. Plos One, 2014, 10(3):e0119119.

[9] Kohl Z, Regensburger M, Aigner R, et al. Impaired adult olfactory bulb neurogenesis in the R6/2 mouse model of Huntington's disease[J]. BMC Neuroscience,11,1(2010-09-13), 2010, 11(1):114.

[10] Hyman C, Hofer M, Barde Y A, et al. BDNF is a neurotrophic factor for dopaminergic neurons of the substantia nigra[J]. Nature, 1991, 350(6315):230-232.

[11] Sun SW, Liang HF, Trinkaus K et al. Noninvasive detection of cuprizone induced axonal damage and demyelination in the mouse corpus callosum. Magn Reson Med. 2006 Feb;55(2):302-8.

[12] Vallières N1, Berard JL, David S et al. Systemic injections of lipopolysaccharide accelerates myelin phagocytosis during Wallerian degeneration in the injured mouse spinal cord. Glia. 2006 Jan 1;53(1):103-13.

無

圖1給予纖溶酶原7天後亨廷頓模型小鼠曠場實驗總運動路程統計結果。結果顯示，空白對照組小鼠在實驗期間會運動一定路程；溶媒對照組小鼠總運動路程明顯長於空白對照組；給纖溶酶原組小鼠總運動路程明顯短於溶媒對照組，統計差異顯著（*表示P＜0.05），且給纖溶酶原組總運動路程接近於空白對照組。提示纖溶酶原可促進亨廷頓模型小鼠自發活動行爲恢復。

圖2給予纖溶酶原7天後亨廷頓模型小鼠曠場實驗邊界靜息時間率統計結果。結果顯示，空白對照組小鼠具有一定的邊界區靜息時間率；溶媒對照組小鼠邊界區靜息時間率明顯小於空白對照組；給纖溶酶原組小鼠邊界區靜息時間率明顯大於溶媒對照組，統計差異極爲顯著（***表示P＜0.001），且給纖溶酶原組邊界靜息時間率接近於空白對照組。提示纖溶酶原可緩解亨廷頓模型小鼠的焦慮行爲。

圖3給予纖溶酶原7天後亨廷頓模型小鼠曠場實驗中心區平均運動速度統計結果。結果顯示，空白對照組小鼠具有一定的中央區運動速度；溶媒對照組小鼠中央區平均運動速度明顯小於空白對照組；給纖溶酶原組小鼠中央區平均運動速度明顯大於溶媒對照組，統計差異顯著（*表示P＜0.05），且給纖溶酶原組中央區運動速度接近於空白對照組。提示纖溶酶原可促進亨廷頓模型小鼠自發活動及趨避性行爲恢復，緩解焦慮行爲。

圖4給予纖溶酶原7天後亨廷頓模型小鼠曠場實驗邊界區平均運動速度統計結果。結果顯示，空白對照組具有一定的邊界區運動速度；溶媒對照組小鼠邊界區平均運動速度明顯大於空白對照組；給纖溶酶原組小鼠邊界區平均運動速度明顯小於溶媒對照組，統計差異顯著（*表示P＜0.05），且給纖溶酶原組邊界區平均運動速度接近於空白對照組。提示纖溶酶原可促進亨廷頓模型小鼠自發活動及趨避性行爲恢復，緩解焦慮行爲。

圖5A-C給予纖溶酶原7天後亨廷頓模型小鼠曠場實驗運動軌跡圖。A爲空白對照組，B爲溶媒對照組，C爲給纖溶酶原組。結果顯示，空白對照組小鼠中央區運動少，邊界區運動多，運動軌跡有規律；相對於空白對照組，溶媒組小鼠中央區運動和運動總路程明顯增多，運動軌跡混亂無規律；纖溶酶原組小鼠中央區運動和運動總路程明顯少於溶媒組，運動軌跡與空白對照組相似。提示纖溶酶原可促進亨廷頓模型小鼠自發活動及趨避性行爲恢復。

圖6 給予纖溶酶原7天後亨廷頓模型小鼠第7天與第0天體重百分比計算結果。結果顯示，空白對照組體重百分比大於1，體重呈增加趨勢；溶媒對照組小鼠體重百分比小於空白對照組；給纖溶酶原組小鼠體重百分比明顯高於溶媒對照組，且統計差異接近顯著（P=0.07）。該結果提示纖溶酶原可促進亨廷頓模型小鼠體重增加。

圖7A-D 給予纖溶酶原7天後亨廷頓模型小鼠海馬體GFAP免疫組化染色結果。A爲空白對照組，B爲溶媒對照組，C爲給纖溶酶原組，D爲平均光密度定量分析結果。結果顯示，空白對照組小鼠海馬體表達一定量的GFAP；溶媒對照組小鼠海馬體GFAP表達明顯多於空白對照組，統計差異極爲顯著（***表示P＜0.001）；給纖溶酶原組小鼠海馬體GFAP表達明顯少於溶媒對照組，統計差異極爲顯著，並且與空白對照組小鼠海馬體GFAP的表達相比無統計學差異。該結果提示纖溶酶原能夠減少亨廷頓模型小鼠海馬體GFAP的表達，抑制星形膠質細胞增生，促進海馬體損傷恢復。

圖8 A-D給予纖溶酶原7天後亨廷頓模型小鼠海馬體半胱氨酸蛋白酶-3免疫組化染色結果。A爲空白對照組，B爲溶媒對照組，C爲給纖溶酶原組，D爲平均光密度定量分析結果。結果顯示，空白對照組海馬體表達一定量的半胱氨酸蛋白酶-3(capase-3)（箭頭標識），溶媒對照組海馬體半胱氨酸蛋白酶-3表達明顯增多，給纖溶酶原組海馬體半胱氨酸蛋白酶-3的表達明顯少於溶媒對照組，且統計差異接近顯著（P=0.058）。該結果提示纖溶酶原能夠減少半胱氨酸蛋白酶-3的表達，減少亨廷頓模型小鼠海馬體細胞的凋亡。

圖9A-D給予纖溶酶原7天後亨廷頓模型小鼠小腦甲苯胺藍染色結果。A爲空白對照組，B爲溶媒對照組，C爲給纖溶酶原組，D爲小腦尼氏體數量分析結果。結果顯示，空白對照組小腦神經元存在一定數量的尼氏體（箭頭標識）；溶媒對照組小腦神經元尼氏體數量明顯多於空白對照組；給纖溶酶原組小鼠小腦神經元尼氏體數量與空白對照組並無明顯差別，但明顯少於溶媒對照組，且統計差異顯著（*表示P＜0.05）。該結果提示纖溶酶原能夠促進亨廷頓模型小鼠小腦神經元尼氏體數量恢復。

圖10A-D給予纖溶酶原7天後亨廷頓模型小鼠左側海馬體焦油紫染色結果。A爲空白對照組，B爲溶媒對照組，C爲給纖溶酶原組，D爲海馬體尼氏體數量分析結果。結果顯示，空白對照組小鼠左側海馬體神經元存在一定量的尼氏體（箭頭標識）；溶媒組小鼠左側海馬體神經元尼氏體數量明顯多於空白對照組；給纖溶酶原組小鼠左側海馬體神經元尼氏體數量明顯少於溶媒組，統計差異顯著（*表示P＜0.05）。該結果提示纖溶酶原能夠促進海馬體神經元尼氏體數量恢復。

圖11A-D給予纖溶酶原7天後亨廷頓模型小鼠紋狀體焦油紫染色結果。A爲空白對照組，B爲溶媒對照組，C爲給纖溶酶原組，D爲紋狀體尼氏體數量分析結果。結果顯示，空白對照組小鼠紋狀體神經元存在一定量的尼氏體（箭頭標識）；溶媒組小鼠紋狀體神經元尼氏體數量明顯少於空白對照組；給纖溶酶原組小鼠紋狀體神經元尼氏體數量明顯多於溶媒組，統計差異顯著（*表示P＜0.05）。該結果表明纖溶酶原能夠促進紋狀體神經元尼氏體數量恢復。

圖12A-I給予纖溶酶原7天後亨廷頓模型小鼠海馬體H&E染色結果。A、B和C爲空白對照組，D、E和F爲溶媒對照組，G、H、I爲給纖溶酶原組。結果顯示，空白對照組小鼠海馬體整體形態正常，結構完整；溶媒對照組小鼠海馬體CA1區出現神經元排列紊亂，神經細胞萎縮（細箭頭標識），細胞變性壞死，周圍腦組織疏鬆水腫（三角形標識），CA3區多處神經元核固縮，濃染（粗箭頭標識）；給纖溶酶原組海馬體各區形態有所恢復，CA3及DG區局部有個別神經元核固縮，濃染。該結果提示纖溶酶原能夠修復亨廷頓模型小鼠海馬體損傷。

圖13A-C給予纖溶酶原7天後亨廷頓模型小鼠紋狀體H&E染色結果。A爲空白對照組，B爲溶媒對照組，C爲給纖溶酶原組。結果顯示，空白對照組小鼠紋狀體形態結構正常；溶媒組小鼠紋狀體神經元變性，部分細胞核呈空泡狀（箭頭標識），腦細胞排列紊亂；給纖溶酶原組小鼠紋狀體整體結構有明顯改善，與空白對照組相似。該結果提示纖溶酶原能修復亨廷頓模型小鼠紋狀體損傷。

圖14A-C給予纖溶酶原7天後亨廷頓模型小鼠嗅結節H&E染色結果。A爲空白對照組，B爲溶媒對照組，C爲給纖溶酶原組。結果顯示，空白對照組小鼠腦部嗅結節形態結構正常，溶媒組小鼠嗅結節出現嚴重的神經膠質細胞浸潤（箭頭標識），給纖溶酶原組小鼠嗅結節神經膠質細胞浸潤明顯少於溶媒組。該結果表明纖溶酶原能夠改善亨廷頓模型小鼠腦部嗅結節損傷。

圖15A-D給予纖溶酶原7天後亨廷頓模型小鼠海馬體BDNF免疫組化染色結果。A爲空白對照組，B爲溶媒對照組，C爲給纖溶酶原組，D爲平均光密度定量分析結果。結果顯示，空白對照組小鼠右側海馬體表達一定量的BDNF（箭頭標識），溶媒組小鼠右側海馬體BDNF的表達略高於空白對照組，給纖溶酶原組小鼠右側海馬體BDNF的表達明顯高於溶媒組，且統計差異接近顯著（P=0.07）。該結果提示損傷能夠刺激BDNF的表達，而纖溶酶原能夠進一步促進BDNF的表達，從而促進亨廷頓模型小鼠海馬體損傷修復。

圖16A-D給予纖溶酶原7天後亨廷頓模型小鼠紋狀體BDNF免疫組化染色結果。A爲空白對照組，B爲溶媒對照組，C爲給纖溶酶原組，D爲平均光密度定量分析結果。結果顯示，空白對照組小鼠紋狀體表達一定量的BDNF（箭頭標識），溶媒組小鼠紋狀體BDNF的表達略高於空白對照組，給纖溶酶原組小鼠紋狀體BDNF的表達明顯高於溶媒組，且統計差異接近顯著（P=0.1）。該結果提示損傷能夠刺激BDNF的表達，而纖溶酶原能夠進一步促進BDNF的表達，從而促進亨廷頓模型小鼠紋狀體損傷修復。

圖17A-D給予纖溶酶原7天後亨廷頓模型小鼠紋狀體LFB染色結果。A爲空白對照組，B爲溶媒對照組，C爲給纖溶酶原組，D爲平均光密度定量分析結果。結果顯示，空白對照組小鼠紋狀體髓鞘結構正常；溶媒組小鼠紋狀體髓鞘蛋白量減少，且可見空洞樣變性（箭頭標識）；給纖溶酶原組小鼠紋狀體髓鞘蛋白量明顯多於溶媒組，統計差異接近顯著（P=0.09）。該結果提示纖溶酶原能夠促進亨廷頓模型小鼠紋狀體髓鞘蛋白形成。

無

Claims (10)

1. 一種纖溶酶原在製備治療亨廷頓病的藥物的用途。
2. 如請求項1的用途，其中所述纖溶酶原對所述亨廷頓病受試者具有選自如下一項或多項作用：改善或緩解運動障礙、改善認知功能障礙、減緩體重下降、促進已損傷神經元的修復、改善神經精神症狀、緩解焦慮、減少海馬GFAP的表達、減少海馬體細胞凋亡、促進小腦、海馬體或紋狀體神經元尼氏體數量恢復、修復海馬體、紋狀體或嗅結節的損傷、促進海馬體或紋狀體BDNF的表達、和促進紋狀體髓鞘再生。
3. 如請求項1的用途，其中所述纖溶酶原與一種或多種其它藥物或治療方法聯用。
4. 如請求項3的用途，其中所述其它藥物或治療方法選自如下的一種或多種：抗多巴胺能藥物、多巴胺受體抑制劑、抗精神病藥物、γ-氨基丁酸轉移酶抑制劑、細胞移植治療和基因治療。
5. 如請求項1-4任一項的用途，其中所述纖溶酶原為人全長纖溶酶原或其保守取代變體。
6. 如請求項1-4任一項的用途，其中所述纖溶酶原與序列2具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖溶酶原的賴氨酸結合活性或蛋白水解活性。
7. 如請求項1-4任一項的用途，所述纖溶酶原包含與序列14具有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列、並且仍然具有纖溶酶原的蛋白水解活性的蛋白質。
8. 如請求項1-4任一項的用途，所述纖溶酶原選自Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、小纖溶酶原、微纖溶酶原、delta-纖溶酶原或它們的保留纖溶酶原的蛋白水解活性的變體。
9. 如請求項1-4任一項的用途，所述纖溶酶原包含序列2、6、8、10、12所示的氨基酸序列或包含序列2、6、8、10、12所示氨基酸序列的保守取代變體。
10. 如請求項1-4任一項的用途，其中所述纖溶酶原通過鼻腔吸入、霧化吸入、滴鼻液、滴眼液、滴耳液、靜脈內、腹膜內、皮下、顱內、鞘內、動脈內或肌肉內給藥。

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