KR20220156927A - 알츠하이머병의 치료 방법 및 약물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 피험자에게 치료 유효량의 플라스미노겐 활성화 경로의 성분을 투여하는 단계를 포함하는 알츠하이머병의 예방 및 치료 방법과 약물을 제공한다. 본 발명은 또한 플라스미노겐 활성화 경로의 성분을 포함하는 약물, 약학적 조성물, 제품, 키트를 제공한다.

Description

알츠하이머병의 치료 방법 및 약물

본 발명은 피험자에게 유효량의 플라스미노겐 활성화 경로의 성분 또는 이의 관련 화합물, 예를 들어 플라스미노겐을 투여하여 임상 증상 및 징후를 개선하는 단계를 포함하는 알츠하이머병의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.

알츠하이머병(Alzheimer disease, AD)은 서서히 발병하는 진행성 신경퇴행성 질환이다. 임상적으로는 기억 장애, 실어증, 실행증, 실인증, 시공간 기능 손상, 실행 기능 장애, 성격 및 행동의 변화 등 전신성 치매를 특징으로 하며, 원인은 아직까지 밝혀지지 않았다. 주요 증상은 인지 기능 저하, 정신 증상 및 행동 장애, 일상 생활 능력의 점진적 저하이다. 인지 능력과 신체 기능의 저하 정도에 따라 3기로 구분한다. 첫 번째 단계는 통상적으로 1 ~ 3년으로 경증 치매이다. 증상은 기억이 감퇴되고, 최근 사건에 대한 현저한 망각이 보이며; 판단 능력이 저하되고, 환자는 사건을 분석, 사고, 판단할 수 없으며, 복잡한 문제를 대처하기 어려워하고; 업무나 가사노동에 부주의하며, 쇼핑, 경제업무 등을 독립적으로 수행할 수 없고, 사교적 활동이 어려우며; 익숙한 일상 업무를 여전히 수행할 수 있지만, 새로운 사물에 대해 막연하고 난해해 하며, 무관심하고 때때로 성급하며 종종 의심하고; 시간 지향 장애가 나타나며, 장소와 사람에 대한 지향력이 있고, 지리적 위치에 대한 지남력이 없으며, 복잡한 구조의 시공간 능력이 좋지 않고; 어휘가 적으며 명명이 어렵다. 두 번째 단계는 통상적으로 2 ~ 10년으로 중증도 치매이다. 증상은 원거리 및 근거리 기억이 심각하게 손상되고, 간단한 구조의 시공간 능력이 감소되며, 시간 및 지점 지향 장애가 나타나며; 문제의 처리 및 사물의 유사점과 차이점 식별 측면에서 심각한 손상이 있고, 야외 활동을 독립적으로 수행할 수 없으며, 옷 입기, 개인 위생 및 외모 유지에 있어 도움이 필요하고; 계산이 불가능하며; 실어증, 실행증, 실인증을 비롯한 다양한 신경 증상이 나타나고; 무관심에서 과민성으로 바뀌며, 종종 쉬지 않고 걸으며, 요실금을 볼 수 있다. 세 번째 단계는 통상적으로 8 ~ 12년으로 중증 치매이다. 환자는 전적으로 간병인에게 의존하고, 심각한 기억력 상실과 단편적인 기억만 있으며; 일상 생활에서 자신을 돌볼 수 없고, 대소변이 무의식으로 배출되며, 함구증 및 사지 경직이 나타나고, 신체 검사에서 추체로 징후룰 볼 수 있으며, 움켜잡기, 더듬기 및 빨기와 같은 원시 반사가 있다. 결국 의식을 잃고 일반적으로 감염 등 합병증으로 사망한다.

현재의 치료 방법은 주로 대증적 치료로, 알츠하이머병과 동반하는 정신병리학적 증상을 제어하는 것이다. 예를 들어 불안, 초조, 불면과 같은 증상이 있으면 항불안제를 투여하고; 우울 증상이 있으면 항우울제를 투여하며; 환자의 행동 장애를 제어하기 위해 항정신병제를 투여한다. 또한, 인지 기능의 개선, 질환 진행의 지연을 위해, 신경 전달 물질에 작용하는 약물, 뇌 혈관 확장제 및 뇌 대사 촉진제와 같은 항정신제 또는 인지 기능 개선을 위한 약물을 투여한다. 알츠하이머병의 치료를 위해서는 다른 치료 방법 및 약물을 찾아야 한다.

본 발명의 연구는 플라스미노겐이 알츠하이머병 환자의 기억 기능 회복을 촉진하고, 인지 능력을 개선하며, 알츠하이머병의 다양한 임상 증상 및 징후를 유의하게 경감 및 완화하고, 알츠하이머병을 예방 및 치료할 수 있음을 발견하였다.

구체적으로, 본 발명은 하기와 같은 각 항에 관한 것이다.

1. 일 양태에서, 본 발명은 치료 유효량의 플라스미노겐 활성화 경로의 성분, 플라스미노겐을 직접적으로 활성화하거나 또는 플라스미노겐 활성화 경로의 업스트림 성분을 활성화하여 플라스미노겐을 간접적으로 활성화할 수 있는 화합물, 플라스미노겐 또는 플라스민의 활성을 모방하는 화합물, 플라스미노겐 또는 플라스미노겐 활성제의 발현을 상향 조절할 수 있는 화합물, 플라스미노겐 유사체, 플라스민 유사체, tPA 또는 uPA 유사체 및 피브린 용해 억제제의 길항제로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 알츠하이머병 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는 알츠하이머병의 예방 및 치료 방법에 관한 것이다.

일 양태에서, 본 발명은 플라스미노겐 활성화 경로의 성분, 플라스미노겐을 직접적으로 활성화하거나 또는 플라스미노겐 활성화 경로의 업스트림 성분을 활성화하여 플라스미노겐을 간접적으로 활성화할 수 있는 화합물, 플라스미노겐 또는 플라스민의 활성을 모방하는 화합물, 플라스미노겐 또는 플라스미노겐 활성제의 발현을 상향 조절할 수 있는 화합물, 플라스미노겐 유사체, 플라스민 유사체, tPA 또는 uPA 유사체 및 피브린 용해 억제제의 길항제로부터 선택되는 하나 이상의 화합물의 알츠하이머병의 치료를 위한 약물의 제조에서의 용도에 관한 것이다.

일 양태에서, 본 발명은 플라스미노겐 활성화 경로의 성분, 플라스미노겐을 직접적으로 활성화하거나 또는 플라스미노겐 활성화 경로의 업스트림 성분을 활성화하여 플라스미노겐을 간접적으로 활성화할 수 있는 화합물, 플라스미노겐 또는 플라스민의 활성을 모방하는 화합물, 플라스미노겐 또는 플라스미노겐 활성제의 발현을 상향 조절할 수 있는 화합물, 플라스미노겐 유사체, 플라스민 유사체, tPA 또는 uPA 유사체 및 피브린 용해 억제제의 길항제로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하는 알츠하이머병의 치료를 위한 약물 또는 약학적 조성물에 관한 것이다.

2. 1항에 따른 방법, 용도, 약물 또는 약학적 조성물에 있어서, 상기 플라스미노겐 활성화 경로의 성분은 플라스미노겐, 재조합 인간 플라스민, Lys-플라스미노겐, Glu-플라스미노겐, 플라스민, 플라스미노겐 및 플라스민의 하나 이상의 kringle 도메인 및 프로테아제 도메인을 포함하는 플라스미노겐 및 플라스민의 변이체 및 유사체, 미니플라스미노겐(mini-plasminogen), 미니플라스민(mini-plasmin), 마이크로플라스미노겐(micro-plasminogen), 마이크로플라스민(micro-plasmin), 델타-플라스미노겐, 델타-플라스민(delta-plasmin), 플라스미노겐 활성제, tPA 및 uPA로부터 선택된다.

3. 1항에 따른 방법, 용도, 약물 또는 약학적 조성물에 있어서, 상기 피브린 용해 억제제의 길항제는 PAI-1, 보체 C1 억제제, α2 항플라스민 또는 α2 마크로글로불린의 억제제, 예를 들어 항체이다.

4. 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 따른 방법, 용도, 약물 또는 약학적 조성물에 있어서, 상기 화합물은 알츠하이머병 피험자에 대해 뇌 조직 내 아밀로이드 단백질 Aβ40 또는 Aβ42의 분해 촉진, 기억 기능 개선, 인지 능력 개선, 지리적 위치 인식 능력 개선, 불안 또는 우울증 완화, 뇌 조직 내 Aβ42 침착 감소, 뇌 조직 내 Tau 단백질의 분해 촉진, 성숙한 BDNF의 형성을 위한 뇌 조직 내 Pro-BDNF의 절단 촉진, 뇌 조직 내 BDNF의 발현 촉진, 성숙한 NGF의 형성을 위한 뇌 조직 내 Pro-NGF의 절단 촉진, 뇌 조직 해마 손상 개선으로부터 선택되는 하나 이상의 작용을 갖는다.

5. 1항 내지 4항 중 어느 한 항에 따른 방법, 용도, 약물 또는 약학적 조성물에 있어서, 상기 화합물은 플라스미노겐이다.

6. 1항 내지 5항 중 어느 한 항에 따른 방법, 용도, 약물 또는 약학적 조성물에 있어서, 상기 플라스미노겐은 인간 전장 플라스미노겐 또는 이의 보존적 치환 변이체이다.

7. 1항 내지 5항 중 어느 한 항에 따른 방법, 용도, 약물 또는 약학적 조성물에 있어서, 상기 플라스미노겐은 서열번호 2와 적어도 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％의 서열 상동성을 갖고, 플라스미노겐의 라이신 결합 활성 또는 단백질 분해 활성을 여전히 갖는다.

8. 1항 내지 5항 중 어느 한 항에 따른 방법, 용도, 약물 또는 약학적 조성물에 있어서, 상기 플라스미노겐은 서열번호 14와 적어도 80％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％의 아미노산 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열, 및 플라스미노겐의 단백질 분해 활성을 여전히 갖는 단백질을 포함한다.

9. 1항 내지 5항 중 어느 한 항에 따른 방법, 용도, 약물 또는 약학적 조성물에 있어서, 상기 플라스미노겐은 Glu-플라스미노겐, Lys-플라스미노겐, 미니플라스미노겐, 마이크로플라스미노겐, 델타-플라스미노겐 또는 플라스미노겐의 단백질 분해 활성을 유지하는 이들의 변이체로부터 선택된다.

10. 1항 내지 5항 중 어느 한 항에 따른 방법, 용도, 약물 또는 약학적 조성물에 있어서, 상기 플라스미노겐은 서열번호 2, 6, 8, 10, 12로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 서열번호 2, 6, 8, 10, 12로 표시되는 아미노산 서열의 보존적 치환 변이체를 포함한다.

11. 1항 내지 10항 중 어느 한 항에 따른 방법, 용도, 약물 또는 약학적 조성물에 있어서, 상기 화합물은 하나 이상의 다른 치료 방법 또는 다른 약물과 병용된다.

12. 11항에 따른 방법, 용도, 약물 또는 약학적 조성물에 있어서, 상기 다른 치료 방법은 세포 치료(줄기 세포 치료 포함), 지지 치료 및 물리 치료를 포함한다.

13. 11항에 따른 방법, 용도, 약물 또는 약학적 조성물에 있어서, 상기 다른 약물은 알츠하이머병의 치료를 위한 다른 약물이다.

14. 1항 내지 13항 중 어느 한 항에 따른 방법, 용도, 약물 또는 약학적 조성물에 있어서, 상기 화합물은 비강 흡입, 에어로졸 흡입, 점비액, 점안액, 점이액, 정맥내, 복막내, 피하, 두개내, 척추강내, 동맥내(예를 들어, 경동맥을 통해) 또는 근육내에 의해 투여된다.

본 발명의 상기 어느 하나의 실시형태에서, 상기 플라스미노겐은 서열번호 2, 6, 8, 10 또는 12와 적어도 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％의 서열 상동성을 갖고, 라이신 결합 활성 또는 단백질 분해 활성과 같은 플라스미노겐 활성을 여전히 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐은 서열번호 2, 6, 8, 10 또는 12의 기초상에서 1 ~ 100, 1 ~ 90, 1 ~ 80, 1 ~ 70, 1 ~ 60, 1 ~ 50, 1 ~ 45, 1 ~ 40, 1 ~ 35, 1 ~ 30, 1 ~ 25, 1 ~ 20, 1 ~ 15, 1 ~ 10, 1 ~ 5, 1 ~ 4, 1 ~ 3, 1 ~ 2, 1개의 아미노산을 첨가, 삭제 및/또는 치환하고, 라이신 결합 활성 또는 단백질 분해 활성과 같은 플라스미노겐 활성을 여전히 갖는 단백질이다.

일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐은 플라스미노겐 활성 단편을 포함하고, 단백질 분해 활성과 같은 플라스미노겐 활성을 여전히 갖는 단백질이다. 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐은 Glu-플라스미노겐, Lys-플라스미노겐, 미니플라스미노겐, 마이크로플라스미노겐, 델타-플라스미노겐 또는 단백질 분해 활성과 같은 플라스미노겐 활성을 유지하는 이들의 변이체로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐은 천연 또는 합성 인간 플라스미노겐, 또는 라이신 결합 활성 또는 단백질 분해 활성과 같은 플라스미노겐 활성을 여전히 유지하는 이들의 변이체 또는 단편이다. 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐은 영장류 동물 또는 설치류 동물로부터 유래되는 인간 플라스미노겐 동원체 또는 라이신 결합 활성 또는 단백질 분해 활성과 같은 플라스미노겐 활성을 여전히 유지하는 이들의 변이체 또는 단편이다. 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐의 아미노산은 서열번호 2, 6, 8, 10 또는 12로 표시된 바와 같다. 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐은 인간 천연 플라스미노겐이다.

일부 실시형태에서, 상기 피험자는 인간이다. 일부 실시형태에서, 상기 피험자는 플라스미노겐이 결핍하거나 결실되어 있다. 일부 실시형태에서, 상기 결핍 또는 결실은 선천적, 이차적 및/또는 국소적이다.

일부 실시형태에서, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 벡터 및 전술한 방법에 사용되는 플라스미노겐을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 키트는 예방 또는 치료 키트일 수 있는 바, (i) 전술한 방법에 사용되는 플라스미노겐 및 (ii) 상기 피험자에게 상기 플라스미노겐을 전달하기 위한 수단(means)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 수단은 주사기 또는 바이알이다. 일부 실시형태에서, 상기 키트는 라벨 또는 사용설명서를 더 포함하고, 상기 라벨 또는 사용설명서는 전술한 어느 하나의 방법을 구현하기 위해 상기 플라스미노겐을 상기 피험자에게 투여하도록 지시한다.

일부 실시형태에서, 상기 제품은 라벨을 포함하는 용기; 및 (i) 전술한 방법에 사용되는 플라스미노겐 또는 플라스미노겐을 포함하는 약학적 조성물을 포함하고, 여기서 상기 라벨은 전술한 어느 하나의 방법을 구현하기 위해 상기 플라스미노겐 또는 조성물을 상기 피험자에게 투여하도록 지시한다.

일부 실시형태에서, 상기 키트 또는 제품은 하나 이상의 다른 수단 또는 용기를 더 포함하고, 상기 수단 또는 용기에는 다른 약물이 포함된다.

전술한 방법의 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐은 전신 또는 국소 투여되고, 바람직하게는 정맥내, 근육내, 피하에 의해 플라스미노겐을 투여하여 치료한다. 전술한 방법의 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐은 적절한 폴리펩티드 벡터 또는 안정화제와 병용된다. 전술한 방법의 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐은 매일 0.0001 ~ 2000 mg/kg, 0.001 ~ 800 mg/kg, 0.01 ~ 600 mg/kg, 0.1 ~ 400 mg/kg, 1 ~ 200 mg/kg, 1 ~ 100 mg/kg, 10 ~ 100 mg/kg(체중 킬로그램당 계산) 또는 0.0001 ~ 2000mg/cm², 0.001 ~ 800 mg/cm², 0.01 ~ 600 mg/cm², 0.1 ~ 400 mg/cm², 1 ~ 200 mg/cm², 1 ~ 100 mg/cm², 10 ~ 100 mg/cm²(체표면적의 제곱센티미터당 계산)의 용량으로 투여되고, 바람직하게는 적어도 1회 반복되며, 바람직하게는 적어도 매일 투여된다.

본 발명은 본 발명의 실시형태에 속하는 기술특징의 모든 조합을 명시적으로 포함하고, 이러한 조합된 기술적 해결수단은 상기 기술적 해결수단이 단독으로 명시적으로 공개된 것처럼 본 발명에서 명시적으로 공개되었다. 또한, 본 발명은 각 실시형태 및 이들의 구성요소 간의 조합을 명시적으로 포함하고, 상기 조합된 기술적 해결수단은 본문에서 명시적으로 공개된다.

도 1의 A ~ B는 PBS 완충액 시스템에서 플라스미노겐이 아밀로이드 단백질 Aβ40을 용해시키는 Tricine-SDS 전기영동 결과를 도시한다. A는 Tricine-SDS-PAGE이고, B는 Aβ40 시험관 내 용해의 정량적 스캐닝 분석 결과이다. 결과에 따르면, 비히클 대조군의 Aβ40의 양을 100％로 정의하는 경우, 아무런 변화도 발생하지 않았고; 플라스미노겐군은 플라스미노겐 단독 첨가 시 Aβ40가 부분적으로 분해되며; 플라스미노겐+tPA군은 플라스미노겐 및 tPA 첨가 시 시험관 내에서 Aβ40가 유의하게 분해되고, 비히클 대조군과 현저한 차이가 있다(**는 P<0.01을 나타냄). 이는 플라스미노겐이 Aβ40 분해를 촉진할 수 있음을 나타낸다.
도 2의 A ~ B는 토끼 뇌 척수액에서 플라스미노겐이 아밀로이드 단백질 Aβ40을 용해시키는 Tricine-SDS 전기영동 결과를 도시하고, 레인 1 및 레인 4는 블랭크 대조군이며; 레인 2는 비히클군이고; 레인 3은 플라스미노겐군이다. A는 Tricine-SDS-PAGE이고, B는 Aβ40 용해의 정량적 스캐닝 분석 결과이다. 결과에 따르면, 비히클 대조군의 Aβ40의 양을 100％로 정의하는 경우, 아무런 변화도 발생하지 않았고; 플라스미노겐군은 플라스미노겐 단독 첨가 시 Aβ40가 74.81％로 부분적으로 분해되었다. 이는 플라스미노겐이 Aβ40 분해를 촉진할 수 있음을 나타낸다.
도 3의 A ~ B는 토끼 뇌 척수액에서 인간 아밀로이드 단백질 Aβ40에 대한 플라스미노겐의 작용 결과를 도시한다. A는 Tricine-SDS-PAGE 전기영동도이고, B는 Aβ40 용해의 정량적 스캐닝 분석 결과이다. 결과에 따르면, 비히클 대조군의 Aβ40의 양을 100％로 정의하는 경우, 아무런 변화도 발생하지 않았고; 플라스미노겐군은 플라스미노겐 단독 첨가 시 Aβ40가 74.81％로 부분적으로 분해되었다. 이는 플라스미노겐이 토끼 뇌 척수액에서 인간 아밀로이드 단백질 Aβ40의 분해를 촉진할 수 있음을 나타낸다.
도 4의 A ~ B는 알츠하이머병 모델 및 정상 마우스 뇌 균질액에서 인간 아밀로이드 단백질 Aβ40에 대한 플라스미노겐의 작용 결과를 도시한다. A는 Tricine-SDS-PAGE 전기영동도이고, B는 Aβ40 시험관 내 용해의 정량적 스캐닝 분석 결과이다. 결과에 따르면, FAD 마우스의 뇌 균질액에서 투여군의 아밀로이드 단백질 Aβ40의 양은 비히클 대조군보다 유의하게 낮고, 차이가 매우 현저하며(***는 P<0.001을 나타냄); 정상 마우스의 뇌 균질액에서 투여군의 인간 아밀로이드 단백질 Aβ40의 양은 비히클 대조군보다 유의하게 낮고, 차이가 매우 현저하다(P＝0.001). 이는 알츠하이머병 모델 및 정상 마우스의 뇌 균질액에서 플라스미노겐이 인간 아밀로이드 단백질 Aβ40의 분해를 효과적으로 촉진할 수 있음을 나타낸다.
도 5는 알츠하이머병 모델 마우스에 플라스미노겐을 5일 동안 투여한 후 자발적 교대 반응 백분율의 통계적 결과를 도시한다. 결과에 따르면, 정상 대조군 마우스에 비해 비히클군 마우스의 자발적 교대 반응 백분율은 유의하게 증가하고; 투여군 마우스의 자발적 교대 반응 백분율은 비히클 대조군보다 유의하게 낮으며, 통계학적 차이가 현저하고(*는 P<0.05를 나타냄), 정상 대조군 마우스에 더 근접한다.
도 6은 알츠하이머병 모델 마우스에 플라스미노겐을 5일 동안 투여한 후 총 팔 진입 횟수의 통계적 결과를 도시한다. 결과에 따르면, 정상 대조군 마우스에 비해 비히클군 마우스의 총 팔 진입 횟수는 유의하게 감소하고; 투여군 마우스의 총 팔 진입 횟수는 비히클 대조군보다 유의하게 많으며, 통계학적 차이가 현저하고(*는 P<0.05를 나타냄), 정상 대조군 마우스에 더 근접한다.
도 7은 알츠하이머병 모델 마우스에 플라스미노겐을 5일 동안 투여한 후 총 운동 거리의 통계적 결과를 도시한다. 결과에 따르면, 정상 대조군 마우스에 비해 비히클군 마우스의 총 운동 거리는 유의하게 감소하고; 플라스미노겐 투여군 마우스의 총 운동 거리는 비히클 대조군보다 유의하게 많으며, 통계학적 차이가 현저하고(*는 P<0.05를 나타냄), 정상 대조군 마우스에 더 근접한다.
도 8의 A ~ C는 알츠하이머병 모델 마우스에 플라스미노겐을 28일 동안 투여한 후 대뇌피질 Aβ42 염색의 정량적 분석 결과를 도시한다. A는 비히클군이고, B는 투여군이며, C는 평균 광학 밀도의 정량적 분석 결과이다. 결과에 따르면, 비히클군 마우스의 대뇌피질 Aβ42 침착 수준은 투여군보다 유의하게 높고, 광학 밀도의 정량적 분석 결과는 통계학적 차이가 현저하다(*는 P<0.05를 나타냄). 이는 플라스미노겐이 알츠하이머병 모델 마우스의 대뇌피질 Aβ42 침착을 감소시킬 수 있음을 나타낸다.
도 9의 A ~ B는 알츠하이머병 모델 마우스에 플라스미노겐을 8일 동안 투여한 후 뇌 조직 균질액 Aβ42의 Western blot 결과를 도시한다. A는 Western blot의 대표적인 사진이고, B는 광학 밀도의 정량적 분석 결과이다. 결과에 따르면, 블랭크 대조군 마우스의 뇌 균질액에는 일정한 수준의 Aβ42 단백질이 있고, 비히클군 마우스의 뇌 조직 내 Aβ42 수준은 투여군 마우스보다 유의하게 높으며, 통계적 P 값은 0.09이다. 이는 플라스미노겐이 알츠하이머병 모델 마우스의 뇌 조직 내 Aβ42 수준을 감소시킬 수 있음을 나타낸다.
도 10의 A ~ B는 정상 마우스의 뇌 균질액에서 Tau 단백질에 대한 플라스미노겐의 작용을 도시한다. A는 Western blot 사진이고, B는 Tau 단백질 밴드 광학 밀도의 정량적 분석 결과이다. 결과에 따르면, 정상 마우스의 뇌 균질액에서 플라스미노겐군의 Tau 단백질의 양은 비히클 대조군보다 유의하게 낮고, 차이가 현저하다(*는 P<0.05를 나타내고, **는 P<0.01을 나타내며, ***는 P<0.001을 나타냄). 이는 플라스미노겐이 정상 마우스의 뇌 균질액에서 Tau 단백질의 분해를 촉진할 수 있음을 나타낸다.
도 11의 A ~ B는 알츠하이머병 마우스의 뇌 균질액에서 Tau 단백질에 대한 플라스미노겐의 작용을 도시한다. A는 Western blot 사진이고, B는 Tau 단백질 밴드 광학 밀도의 정량적 분석 결과이다. 결과에 따르면, 알츠하이머병 마우스의 뇌 균질액에서 플라스미노겐군의 Tau 단백질의 양이 비히클 대조군보다 유의하게 낮고, 통계학적 차이가 현저하다(*는 P<0.05를 나타내고, **는 P<0.01을 나타냄). 이는 플라스미노겐이 알츠하이머병 마우스의 뇌 균질액 내 Tau 단백질의 분해를 촉진할 수 있음을 나타낸다.
도 12는 플라스미노겐을 28일 동안 투여한 후 알츠하이머병 마우스의 뇌 조직에서 상이한 분자량의 Tau 단백질의 Western blot 검출 결과를 도시한다. 결과에 따르면, 블랭크 대조군 마우스의 뇌 균질액에는 일정한 수준의 상이한 분자량의 Tau 단백질이 있고; 투여군 마우스의 뇌 조직 내 각 분자량의 Tau 단백질 및 총 Tau 단백질 수준은 비히클군 마우스보다 유의하게 낮으며, 두 그룹의 35 kd, 35 ~ 40 kd, 40 kd, 54 kd의 분자량의 Tau 단백질 수준 및 총 Tau 단백질 수준의 통계적 분석 P 값은 각각 0.174, 0.0406, 0.052, 0.067 및 0.055이다. 이는 플라스미노겐이 알츠하이머병 모델 마우스의 뇌 조직 내 Tau 단백질의 분해를 촉진할 수 있음을 나타낸다.
도 13의 A ~ B는 알츠하이머병 모델 마우스의 뇌 균질액에서 재조합 인간 Pro-BDNF에 대한 플라스미노겐의 작용을 도시한다. A는 SDS-PAGE 이미징 사진이고, B는 SDS-PAGE의 Pro-BDNF 밴드의 정량적 분석 결과이다. 결과에 따르면, 알츠하이머병 모델 마우스의 뇌 균질액에서 플라스미노겐 투여군의 Pro-BDNF의 양은 비히클 대조군보다 유의하게 낮고, 차이가 매우 현저하다(*는 P<0.05를 나타내고, ***는 P<0.001을 나타냄). 이는 플라스미노겐이 알츠하이머병 모델 마우스의 뇌 균질액 내 Pro-BDNF의 절단을 촉진할 수 있음을 나타낸다.
도 14의 A ~ C는 알츠하이머병 모델 마우스의 뇌 균질액에서 재조합 인간 Pro-BDNF에 대한 플라스미노겐의 작용을 도시하고, A는 Western blot 이미징 사진이며, B는 Western blot의 Pro-BDNF 밴드 광학 밀도(OD) 값의 분석 결과이고, C는 Western blot의 BDNF 밴드 광학 밀도(OD) 값의 분석 결과이다. 결과에 따르면, 알츠하이머병 모델 마우스의 뇌 균질액에서 플라스미노겐 투여군의 Pro-BDNF의 양은 비히클 대조군보다 유의하게 낮고, 차이가 매우 현저하며(**는 P<0.01을 나타내고, ***는 P<0.001을 나타냄); 플라스미노겐 투여군의 BDNF의 양은 비히클 대조군보다 유의하게 높고, 차이가 매우 현저하다. 이는 플라스미노겐이 알츠하이머병 모델 마우스의 뇌 균질액 Pro-BDNF의 절단 및 성숙한 BDNF의 형성을 촉진할 수 있음을 나타낸다.
도 15의 A ~ D는 플라스미노겐을 28일 동안 투여한 후 알츠하이머병 모델 마우스의 해마 BDNF 면역조직화학적 염색 결과를 도시한다. A는 블랭크 대조군이고, B는 비히클군이며, C는 투여군이고, D는 평균 광학 밀도의 정량적 분석 결과이다. 결과에 따르면, 블랭크 대조군 마우스의 해마는 일정한 수준의 BDNF(화살표로 표시)를 발현하고, 비히클군 마우스의 해마 BDNF의 발현은 블랭크 대조군보다 유의하게 적으며, 투여군 마우스의 해마 BDNF의 발현은 비히클군보다 유의하게 높고, 통계학적 차이가 현저하다(*는 P<0.05를 나타냄). 이는 플라스미노겐이 알츠하이머병 모델 마우스의 해마 BDNF의 발현을 촉진할 수 있음을 나타낸다.
도 16의 A ~ C는 알츠하이머병 모델 마우스의 뇌 균질액에서 재조합 인간 Pro-NGF에 대한 플라스미노겐의 작용을 도시한다. A는 Western blot 이미징 사진이고, B는 Western blot의 Pro-NGF 밴드 광학 밀도(OD) 값의 분석 결과이며, C는 Western blot의 NGF 밴드 광학 밀도(OD) 값의 분석 결과이다. 결과에 따르면, 알츠하이머병 모델 마우스의 뇌 균질액에서 플라스미노겐 투여군의 Pro-NGF의 양은 비히클 대조군보다 유의하게 낮고, 차이가 매우 현저하며(***는 P<0.001을 나타냄); 플라스미노겐 투여군의 NGF의 양은 비히클 대조군보다 유의하게 높고, 차이가 현저하다. 이는 플라스미노겐이 알츠하이머병 모델 마우스의 뇌 균질액 내 재조합 인간 Pro-NGF의 절단 및 성숙한 NGF의 형성을 촉진할 있음을 나타낸다.
도 17은 플라스미노겐을 28+7일 동안 투여한 후 알츠하이머병 모델 마우스의 오픈 필드 실험에서 경계 영역 운동 거리 백분율의 통계적 결과를 도시한다. 결과에 따르면, 블랭크 대조군은 일정한 경계 영역 운동 거리 백분율을 갖고, 비히클군 마우스의 경계 영역 운동 거리 백분율은 블랭크 대조군보다 유의하게 많으며, 투여군 마우스의 경계 영역 운동 거리 백분율은 비히클군보다 유의하게 작고, 통계학적 차이가 유의에 근접한다(P＝0.08). 이는 플라스미노겐이 알츠하이머병 모델 마우스의 불안, 우울 행동 회복을 촉진할 수 있음을 나타낸다.
도 18은 플라스미노겐을 28+7일 동안 투여한 후 알츠하이머병 모델 마우스의 오픈 필드 실험에서 중앙 영역 운동 거리 백분율의 통계적 결과를 도시한다. 결과에 따르면, 블랭크 대조군은 일정한 중앙 영역 운동 거리 백분율을 갖고, 비히클군 마우스의 중앙 영역 운동 거리 백분율은 블랭크 대조군보다 유의하게 작으며, 투여군 마우스의 중앙 영역 운동 거리 백분율은 비히클군보다 유의하게 크고, 통계학적 차이가 유의에 근접한다(P＝0.08). 이는 플라스미노겐이 알츠하이머병 모델 마우스의 불안, 우울 행동 회복을 촉진할 수 있음을 나타낸다.
도 19는 플라스미노겐을 28+9일 동안 투여한 후 알츠하이머병 모델 마우스의 높은 십자 미로 실험에서 총 운동 거리의 통계적 결과를 도시한다. 결과에 따르면, 블랭크 대조군은 일정한 총 운동 거리를 갖고; 비히클군의 운동 거리는 블랭크 대조군보다 유의하게 크며; 투여군의 총 운동 거리는 비히클군보다 유의하게 작고, 통계학적 차이가 매우 현저하며(*는 P<0.05를 나타내고, **는 P<0.01을 나타냄), 블랭크 대조군 마우스의 운동 거리에 더 근접한다. 이는 플라스미노겐이 알츠하이머병 모델 마우스의 불안, 우울 행동 회복을 촉진할 수 있음을 나타낸다.
도 20은 플라스미노겐을 28+9일 동안 투여한 후 알츠하이머병 모델 마우스의 높은 십자 미로 실험에서 닫힌 팔 운동 거리의 통계적 결과를 도시한다. 결과에 따르면, 블랭크 대조군 마우스는 일정한 닫힌 팔 운동 거리를 갖고; 비히클군의 닫힌 팔 운동 거리는 블랭크 대조군 마우스보다 유의하게 크며; 투여군 마우스의 닫힌 팔 운동 거리는 비히클군보다 유의하게 작고, 두 그룹의 비교 시 통계학적 차이가 현저하며(*는 P<0.05를 나타내고, **는 P<0.01을 나타냄), 투여군의 닫힌 팔 운동 거리는 블랭크 대조군에 더 근접한다. 이는 플라스미노겐이 알츠하이머병 모델 마우스의 불안, 우울 행동 회복을 촉진할 수 있음을 나타낸다.
도 21은 플라스미노겐을 28+9일 동안 투여한 후 알츠하이머병 모델 마우스의 높은 십자 미로 실험에서 닫힌 팔 운동 거리 백분율의 통계적 결과를 도시한다. 결과에 따르면, 블랭크 대조군 마우스는 일정한 닫힌 팔 운동 거리 백분율을 갖고; 비히클군의 닫힌 팔 운동 거리 백분율은 블랭크 대조군 마우스보다 유의하게 크며; 투여군 마우스의 닫힌 팔 운동 거리 백분율은 비히클군보다 유의하게 작고, 두 그룹의 비교 시 통계학적 차이가 현저하며(*는 P<0.05를 나타냄), 투여군의 닫힌 팔 운동 거리 백분율은 블랭크 대조군에 더 근접한다. 이는 플라스미노겐이 알츠하이머병 모델 마우스의 불안, 우울 행동 회복을 촉진할 수 있음을 나타낸다.
도 22는 플라스미노겐을 28+9일 동안 투여한 후 알츠하이머병 모델 마우스의 높은 십자 미로 실험에서 닫힌 팔 진입 횟수의 통계적 결과를 도시한다. 결과에 따르면, 블랭크 대조군 마우스는 일정한 닫힌 팔 진입 횟수를 갖고; 비히클군의 닫힌 팔 진입 횟수는 블랭크 대조군 마우스보다 유의하게 많으며; 투여군 마우스의 닫힌 팔 진입 횟수는 비히클군보다 유의하게 적고, 두 그룹의 비교 시 통계학적 차이가 매우 현저하며(*는 P<0.05를 나타내고, **는 P<0.01을 나타냄), 투여군의 닫힌 팔 진입 횟수는 블랭크 대조군에 더 근접한다. 이는 플라스미노겐이 알츠하이머병 모델 마우스의 불안, 우울 행동 회복을 촉진할 수 있음을 나타낸다.
도 23은 플라스미노겐을 28+9일 동안 투여한 후 알츠하이머병 모델 마우스의 높은 십자 미로 실험에서 닫힌 팔 시간의 통계적 결과를 도시한다. 결과에 따르면, 블랭크 대조군 마우스는 일정한 닫힌 팔 시간을 갖고, 비히클군 마우스의 닫힌 팔 체류 시간은 블랭크 대조군보다 유의하게 짧으며, 투여군 마우스의 닫힌 팔 시간은 비히클군보다 유의하게 많고, 두 그룹의 비교 시 통계학적 차이가 현저하며(*는 P<0.05를 나타내고, **는 P<0.01을 나타냄), 투여군의 닫힌 팔 시간은 블랭크 대조군에 더 근접한다.
도 24는 플라스미노겐을 28+9일 동안 투여한 후 알츠하이머병 모델 마우스의 높은 십자 미로 실험에서 닫힌 팔 시간 백분율의 통계적 결과를 도시한다. 닫힌 팔 시간 백분율은 닫힌 팔에서 마우스의 체류 시간과 총 기록 시간의 비율을 의미한다. 결과에 따르면, 블랭크 대조군 마우스는 일정한 닫힌 팔 시간 백분율을 갖고, 비히클군 마우스의 닫힌 팔 시간 백분율은 블랭크 대조군보다 유의하게 낮으며, 투여군 마우스의 닫힌 팔 시간 백분율은 비히클군보다 유의하게 높고, 이 두 그룹의 비교 시 통계학적 차이가 현저하며(*는 P<0.05를 나타내고, **는 P<0.01을 나타냄), 투여군의 닫힌 팔 시간 백분율은 블랭크 대조군에 더 근접한다.
도 25는 플라스미노겐을 28+9일 동안 투여한 후 알츠하이머병 모델 마우스의 높은 십자 미로 실험에서 닫힌 팔 평균 운동 속도의 통계적 결과를 도시한다. 결과에 따르면, 블랭크 대조군은 일정한 닫힌 팔 평균 운동 속도를 갖고, 비히클군의 닫힌 팔 평균 운동 속도는 블랭크 대조군보다 유의하게 크며, 투여군의 닫힌 팔 평균 운동 속도는 비히클군보다 유의하게 작고, 이 두 그룹의 비교 시 통계학적 차이가 매우 현저하며(**는 P<0.01을 나타냄), 투여군의 닫힌 팔 평균 운동 속도는 블랭크 대조군에 더 근접한다. 이는 플라스미노겐이 알츠하이머병 모델 마우스의 불안, 우울 행동 회복을 촉진할 수 있음을 나타낸다.
도 26은 플라스미노겐을 28+9일 동안 투여한 후 알츠하이머병 모델 마우스의 Y 미로에서 자발적 교대 반응 백분율의 통계적 결과를 도시한다. 결과에 따르면, 블랭크 대조군 마우스에 비해 비히클군 마우스의 자발적 교대 반응 백분율은 유의하게 감소하고; 투여군 마우스의 자발적 교대 반응 백분율은 비히클군보다 유의하게 높으며, 두 그룹의 비교 시 통계학적 차이가 현저하고(*는 P<0.05를 나타냄), 블랭크 대조군 마우스에 근접한다. 이는 플라스미노겐이 알츠하이머병 모델 마우스의 기억 기능 회복을 촉진할 수 있음을 나타낸다.
도 27은 플라스미노겐을 18일 동안 투여한 후 알츠하이머병 모델 마우스의 높은 십자 미로에서 닫힌 팔 운동 거리의 통계적 결과를 도시한다. 결과에 따르면, 블랭크 대조군 마우스는 일정한 닫힌 팔 운동 거리를 갖고; 비히클군의 닫힌 팔 운동 거리는 블랭크 대조군 마우스보다 유의하게 작으며; 투여군 마우스의 닫힌 팔 운동 거리는 비히클군보다 유의하게 크고, 두 그룹의 비교 시 통계학적 차이가 현저하며(**는 P<0.01을 나타내고, ***는 P<0.001을 나타냄), 투여군의 닫힌 팔 운동 거리는 블랭크 대조군에 더 근접한다. 이는 플라스미노겐이 알츠하이머병 모델 마우스의 불안, 우울 행동 회복을 촉진할 수 있음을 나타낸다.
도 28의 A ~ C는 알츠하이머병 모델 마우스에 플라스미노겐을 8일 동안 투여한 후 뇌 조직 HE 염색의 대표적인 사진이다. A는 블랭크 대조군이고, B는 비히클 대조군이며, C는 투여군이다. 결과에 따르면, 블랭크 대조군 마우스의 해마 조직 형태는 정상적이고; 비히클군에 비해 투여군의 해마 조직 손상 형태는 유의하게 개선되었다. 이는 플라스미노겐이 알츠하이머병 모델 마우스의 해마 손상을 개선할 수 있음을 나타낸다.

피브린 용해 시스템(Fibrinolytic system)은 섬유소 용해 시스템이라고도 하며, 피브린 용해(섬유소 용해) 과정에 관여하는 일련의 화학 물질로 구성된 시스템으로, 주로 플라스미노겐, 플라스민, 플라스미노겐 활성제, 피브린 용해 억제제를 포함한다. 플라스미노겐 활성제는 조직형 플라스미노겐 활성제(t-PA) 및 유로키나아제형 플라스미노겐 활성제(u-PA)를 포함한다. t-PA는 혈관 내피 세포로 합성된 세린 프로테아제이다. t-PA는 플라스미노겐을 활성화하고, 이 과정은 주로 피브린에서 수행되며; 유로키나아제형 플라스미노겐 활성제(u-PA)는 신세뇨관 상피 세포 및 혈관 내피 세포에서 생성되고, 보조 인자로 피브린을 사용하지 않고도 플라스미노겐을 직접적으로 활성화할 수 있다. 플라스미노겐(PLG)은 간에서 합성되고, 혈액이 응고되는 경우 PLG는 피브린 네트워크에 대량으로 흡착되며, t-PA 또는 u-PA의 작용하에 플라스민으로 활성화되어 피브린 용해를 촉진한다. 플라스민(PL)은 세린 프로테아제로, 이의 작용은 피브린 및 피브리노겐을 분해하고; 다양한 혈액 응고 인자 Ⅴ, Ⅷ, Ⅹ, Ⅶ, XI, Ⅱ 등을 가수분해하며; 플라스미노겐을 플라스민으로 전환시키고; 보체를 가수분해하는 등이다. 피브린 용해 억제제는 플라스미노겐 활성제 억제제(PAI) 및 α2 항플라스민(α2-AP)을 포함한다. PAI는 주로 PAI-1 및 PAI-2의 두 가지 형태가 있는데, 이는 t-PA에 1:1의 비율로 특이적으로 결합되어 이를 불활성화시키는 동시에 PLG를 활성화시킬 수 있다. α2-AP는 간에서 합성되고, PL과 1:1의 비율로 결합하여 착물을 형성하여 PL 활성을 억제하며; FⅩⅢ는 α2-AP를 피브린과 공유 결합시켜 PL 작용에 대한 피브린의 민감도를 감소시킨다. 체내에서 피브린 용해 시스템 활성을 억제하는 물질은 PAI-1, 보체 C1 억제제; α2 항플라스민; α2 마크로글로불린이다.

본 발명의 용어 “플라스미노겐 활성화 경로의 성분”은,

1. 플라스미노겐, Lys-플라스미노겐, Glu-플라스미노겐, 마이크로플라스미노겐(micro-plasminogen), 델타-플라스미노겐; 이들의 변이체 또는 유사체;

2. 플라스민 및 이들의 변이체 또는 유사체; 및

3. 플라스미노겐 활성제, 예를 들어 tPA, uPA 및 하나 이상의 tPA 또는 uPA의 도메인(예를 들어, 하나 이상의 kringle 도메인 및 단백질 분해 도메인)을 포함하는 tPA 또는 uPA의 변이체 및 유사체를 포함한다.

상기 플라스미노겐, 플라스민, tPA 및 uPA의 “변이체”는 천연적으로 존재하는 모든 인간 유전 변이체 및 이러한 단백질의 다른 포유동물 형태, 및 예를 들어 1 ~ 100, 1 ~ 90, 1 ~ 80, 1 ~ 70, 1 ~ 60, 1 ~ 50, 1 ~ 45, 1 ~ 40, 1 ~ 35, 1 ~ 30, 1 ~ 25, 1 ~ 20, 1 ~ 15, 1 ~ 10, 1 ~ 5, 1 ~ 4, 1 ~ 3, 1 ~ 2, 1개의 아미노산의 첨가, 삭제 및/또는 치환을 통해 플라스미노겐, 플라스민, tPA 또는 uPA 활성을 여전히 갖는 단백질을 포함한다. 예를 들어, 플라스미노겐, 플라스민, tPA 및 uPA의 “변이체”는 예를 들어 1 ~ 100, 1 ~ 90, 1 ~ 80, 1 ~ 70, 1 ~ 60, 1 ~ 50, 1 ~ 45, 1 ~ 40, 1 ~ 35, 1 ~ 30, 1 ~ 25, 1 ~ 20, 1 ~ 15, 1 ~ 10, 1 ~ 5, 1 ~ 4, 1 ~ 3, 1 ~ 2, 1개의 보존적 아미노산 치환을 통해 획득된 이러한 단백질의 돌연변이체를 포함한다.

본 발명의 “플라스미노겐 변이체”는 서열번호 2, 6, 8, 10 또는 12와 적어도 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％의 서열 상동성을 갖고, 라이신 결합 활성 또는 단백질 분해 활성과 같은 플라스미노겐 활성을 여전히 갖는 단백질을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 “플라스미노겐 변이체”는 서열번호 2, 6, 8, 10 또는 12의 기초상에서 1 ~ 100, 1 ~ 90, 1 ~ 80, 1 ~ 70, 1 ~ 60, 1 ~ 50, 1 ~ 45, 1 ~ 40, 1 ~ 35, 1 ~ 30, 1 ~ 25, 1 ~ 20, 1 ~ 15, 1 ~ 10, 1 ~ 5, 1 ~ 4, 1 ~ 3, 1 ~ 2, 1개의 아미노산을 첨가, 삭제 및/또는 치환하고, 라이신 결합 활성 또는 단백질 분해 활성과 같은 플라스미노겐 활성을 여전히 갖는 단백질일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 플라스미노겐 변이체는 천연적으로 존재하는 모든 인간 유전 변이체 및 이러한 단백질의 다른 포유동물 형태, 및 1 ~ 100, 1 ~ 90, 1 ~ 80, 1 ~ 70, 1 ~ 60, 1 ~ 50, 1 ~ 45, 1 ~ 40, 1 ~ 35, 1 ~ 30, 1 ~ 25, 1 ~ 20, 1 ~ 15, 1 ~ 10, 1 ~ 5, 1 ~ 4, 1 ~ 3, 1 ~ 2, 1개의 보존적 아미노산 치환을 통해 획득된 이러한 단백질의 돌연변이체를 포함한다.

본 발명의 플라스미노겐은 영장류 동물 또는 설치류 동물로부터 유래되는 인간 플라스미노겐 동원체 또는 라이신 결합 활성 또는 단백질 분해 활성과 같은 플라스미노겐 활성을 유지하는 이들의 변이체, 예를 들어 서열번호 2, 6, 8, 10 또는 12로 표시되는 플라스미노겐, 예를 들어 서열번호 2로 표시되는 인간 천연 플라스미노겐일 수 있다.

상기 플라스미노겐, 플라스민, tPA 및 uPA의 “유사체”는 각각 플라스미노겐, 플라스민, tPA 또는 uPA와 기본적으로 유사한 작용을 제공하는 화합물을 포함한다.

상기 플라스미노겐, 플라스민, tPA 및 uPA의 “변이체” 및 “유사체”는 하나 이상의 도메인(예를 들어, 하나 이상의 kringle 도메인 및 단백질 분해 도메인)을 포함하는 플라스미노겐, 플라스민, tPA 및 uPA의 “변이체” 및 “유사체”를 포함한다. 예를 들어, 플라스미노겐의 “변이체” 및 “유사체”는 하나 이상의 플라스미노겐 도메인(예를 들어, 하나 이상의 kringle 도메인 및 단백질 분해 도메인)을 포함하는 플라스미노겐 변이체 및 유사체, 예를 들어 미니플라스미노겐(mini-plasminogen)을 포함한다. 플라스민의 “변이체” 및 “유사체”는 하나 이상의 플라스민 도메인(예를 들어, 하나 이상의 kringle 도메인 및 단백질 분해 도메인)을 포함하는 플라스민 “변이체” 및 “유사체”, 예를 들어 미니플라스민(mini-plasmin) 및 δ-플라스민(delta-plasmin)을 포함한다.

상기 플라스미노겐, 플라스민, tPA 또는 uPA의 “변이체” 또는 “유사체”가 각각 플라스미노겐, 플라스민, tPA 또는 uPA의 활성을 갖는지 여부, 또는 각각 플라스미노겐, 플라스민, tPA 또는 uPA와 기본적으로 유사한 작용을 제공하는지 여부는 본 기술분야에 공지된 방법에 의해 검출될 수 있고, 예를 들어 효소측정법(enzymography), ELISA(효소 결합 면역 흡착 측정) 및 FACS(형광 활성 세포 분류 방법)에 기반하여 활성화된 플라스민 활성 수준을 통해 측정되며, 예를 들어 하기 문헌에 기재된 방법을 참조하여 측정할 수 있다. Ny, A., Leonardsson, G., Hagglund, A.C, Hagglof, P., Ploplis, V.A., Carmeliet, P. and Ny, T.(1999). Ovulation inplasminogen-deficient mice. Endocrinology 140, 5030-5035; Silverstein RL, Leung LL, Harpel PC, Nachman RL(November 1984). "Complex formation of platelet thrombospondin with plasminogen. Modulation of activation by tissue activator". J.Clin.Invest.74(5):1625-33; Gravanis I, Tsirka SE(February 2008). "Tissue-type plasminogen activator as a therapeutic target in stroke". Expert Opinion on Therapeutic Targets.12(2):159-70; Geiger M, Huber K, Wojta J, Stingl L, Espana F, Griffin JH, Binder BR(Aug 1989). "Complex formation between urokinase and plasma protein C inhibitor in vitro and in vivo". Blood.74(2):722-8.

본 발명의 일부 실시형태에서, 본 발명의 “플라스미노겐 활성화 경로의 성분”은 플라스미노겐이다. 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐은 인간 전장 플라스미노겐 또는 플라스미노겐 활성(예를 들어, 이들의 라이신 결합 활성 및 단백질 분해 활성)을 유지하는 이들의 보존적 치환 변이체이다. 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐은 Glu-플라스미노겐, Lys-플라스미노겐, 미니플라스미노겐, 마이크로플라스미노겐, 델타-플라스미노겐 또는 플라스미노겐 활성(예를 들어, 이들의 라이신 결합 활성 또는 단백질 분해 활성)을 유지하는 이들의 변이체로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐은 천연 또는 합성 인간 플라스미노겐, 또는 플라스미노겐 활성(예를 들어, 이들의 라이신 결합 활성 또는 단백질 분해 활성)을 여전히 유지하는 이들의 보존적 치환 변이체 또는 이들의 단편이다. 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐은 영장류 동물 또는 설치류 동물로부터 유래되는 인간 플라스미노겐 동원체 또는 플라스미노겐 활성을 여전히 유지하는 이들의 보존적 돌연변이체 또는 이들의 단편이다. 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐은 서열번호 2, 6, 8, 10 또는 12로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐은 서열번호 2, 6, 8, 10 또는 12로 표시되는 아미노산 서열의 보존적 치환 서열은 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐의 아미노산은 서열번호 2, 6, 8, 10 또는 12로 표시된 바와 같다. 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐은 서열번호 2, 6, 8, 10 또는 12로 표시되는 플라스미노겐의 보존적 치환 변이체이다. 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐은 인간 천연 플라스미노겐 또는 이의 보존적 돌연변이체이다. 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐은 서열번호 2로 표시되는 인간 천연 플라스미노겐 또는 이의 보존적 치환 변이체이다.

“플라스미노겐을 직접적으로 활성화하거나 또는 플라스미노겐 활성화 경로의 업스트림 성분을 활성화하여 플라스미노겐을 간접적으로 활성화할 수 있는 화합물”은 플라스미노겐을 직접적으로 활성화하거나 또는 플라스미노겐 활성화 경로의 업스트림 성분을 활성화하여 플라스미노겐을 간접적으로 활성화할 수 있는 임의의 화합물을 의미하며, 예를 들어, tPA, uPA, 스트렙토키나아제(streptokinase), 사루플라제(saruplase), 알테플라제(alteplase), 레테플라제(reteplase), 테넥테플라제(tenecteplase), 아니스트레플라제(anistreplase), 몬테플라제(monteplase), 라노테플라제(lanoteplase), 파미테플라제(pamiteplase), 스타필로키나아제(staphylokinase)이다.

본 발명의 “피브린 용해 억제제의 길항제”는 피브린 용해 억제제의 작용을 길항, 약화, 차단 및 방지하는 화합물이다. 상기 피브린 용해 억제제는 예를 들어 PAI-1, 보체 C1 억제제, α2 항플라스민 및 α2 마크로글로불린이다. 상기 길항제는 예를 들어 PAI-1, 보체 C1 억제제, α2 항플라스민 또는 α2 마크로글로불린의 항체, 또는 예를 들어 PAI-1, 보체 C1 억제제, α2 항플라스민 또는 α2 마크로글로불린 발현을 차단 또는 하향 조절하는 안티센스 RNA 또는 작은 RNA, 또는 PAI-1, 보체 C1 억제제, α2 항플라스민 또는 α2 마크로글로불린의 결합 부위를 점유하지만 PAI-1, 보체 C1 억제제, α2 항플라스민 또는 α2 마크로글로불린의 기능이 없는 화합물, 또는 PAI-1, 보체 C1 억제제, α2 항플라스민 또는 α2 마크로글로불린의 결합 도메인 및/또는 활성 도메인을 차단하는 화합물이다.

플라스민은 플라스미노겐 활성화 시스템(PA 시스템)의 핵심 성분이다. 이는 피브린, 젤라틴(gelatin), 피브로넥틴(fibronectin), 라미닌(laminin) 및 프로테오글리칸(proteoglycan)을 포함하여 세포외 매트릭스(ECM)의 여러 성분을 가수분해할 수 있는 광범위 스펙트럼의 프로테아제이다. 또한, 플라스민은 일부 메탈프로테이나제 전구체(pro-MMPs)를 활성화하여 활성을 갖는 메탈로프로테이나제(MMPs)를 형성할 수 있다. 따라서 플라스민은 세포외 단백질 분해 작용의 하나의 중요한 업스트림 조절자로 간주된다. 플라스민은 플라스미노겐이 조직형 플라스미노겐 활성제(tPA) 또는 유로키나아제형 플라스미노겐 활성제(uPA)의 두 가지 생리학적 PAs를 통해 단백질 분해되어 형성된 것이다. 혈장 및 다른 체액에서 플라스미노겐의 상대적 수준이 비교적 높기 때문에 전통적으로 PA 시스템의 조절은 주로 PAs의 합성 및 활성 수준을 통해 구현되는 것으로 간주된다. PA 시스템 성분의 합성은 호르몬, 성장 인자 및 사이토카인과 같은 상이한 요인에 의해 엄격하게 조절된다. 또한, 플라스민과 PAs의 특정 생리학적 억제제도 있다. 플라스민의 주요 억제제는 α2-항플라스민(α2-antiplasmin)이다. PAs의 활성은 동시에 uPA 및 tPA의 플라스미노겐 활성제 억제제-1(PAI-1)에 의해 억제되고, 주로 uPA를 억제하는 플라스미노겐 활성제 억제제-2(PAI-2)에 의해 조절된다. 일부 세포 표면에는 직접적인 가수분해 활성을 갖는 uPA 특이적 세포 표면 수용체(uPAR)가 있다.

플라스미노겐은 하나의 단일 사슬 당단백질로 791개의 아미노산으로 구성되고 분자량은 약 92 kDa이다. 플라스미노겐은 주로 간에서 합성되고 세포외액에 대량으로 존재한다. 혈장 내 플라스미노겐 함량은 약 2 μM이다. 따라서 플라스미노겐은 조직 및 체액에서 단백질 분해 활성의 큰 잠재적 유래이다. 플라스미노겐은 글루타메이트-플라스미노겐(Glu-plasminogen) 및 라이신-플라스미노겐(Lys-plasminogen)의 두 가지 분자 형태로 존재한다. 자연적으로 분비되고 절단되지 않은 형태의 플라스미노겐은 하나의 아미노 말단(N-말단) 글루타메이트를 갖기 때문에 글루타메이트-플라스미노겐이라고 한다. 그러나, 플라스민의 존재하에 글루타메이트-플라스미노겐은 Lys76-Lys77에서 라이신-플라스미노겐으로 가수분해된다. 글루타메이트-플라스미노겐에 비해 라이신-플라스미노겐은 피브린과 더 높은 친화력을 갖고 더 높은 속도로 PAs에 의해 활성화될 수 있다. 이 두 가지 형태의 플라스미노겐의 Arg560-Val561 펩티드 결합은 uPA 또는 tPA에 의해 절단되어 이황화 결합으로 연결된 이중 사슬 프로테아제 플라스민이 형성될 수 있다. 플라스미노겐의 아미노 말단 부분은 5개의 상동 삼중 고리, 즉 소위 kringles를 포함하고, 카르복시 말단 부분은 프로테아제 도메인을 포함한다. 일부 kringles은 플라스미노겐과 피브린 및 이의 억제제 α2-AP의 특이적 상호작용을 매개하는 라이신 결합 부위를 포함한다. 최근에 발견된 하나의 플라스미노겐은 kringles1-4를 포함하는 38 kDa의 단편으로, 강력한 혈관신생 억제제이다. 이 단편은 앤지오스타틴(angiostatin)으로 명명되며, 여러 프로테아제에 의한 플라스미노겐의 가수분해에 의해 생성될 수 있다.

플라스민의 주요 기질은 피브린이고, 피브린의 용해는 병리학적 혈전증을 예방하는 관건이다. 플라스민은 또한 라미닌, 피브로넥틴, 프로테오글리칸 및 젤라틴을 비롯한 ECM의 여러 성분에 대한 기질 특이성을 갖고, 이는 플라스민이 ECM 리모델링에서도 중요한 작용을 일으킨다는 것을 나타낸다. 간접적으로, 플라스민은 또한 일부 프로테아제 전구체를 활성 프로테아제로 전환함으로써 MMP-1, MMP-2, MMP-3 및 MMP-9를 비롯한 ECM의 다른 성분을 분해할 수 있다. 따라서, 플라스민이 세포외 단백질 분해의 하나의 중요한 업스트림 조절자일 수 있다고 제시하였다. 또한, 플라스민은 일부 잠재적 형태의 성장 인자를 활성화하는 능력을 갖는다. 시험관 내에서 플라스민은 또한 보체 시스템의 성분을 가수분해하고 주화성 보체 단편을 방출할 수 있다.

“플라스민”은 피브린 응괴를 피브린 분해 산물 및 D-이량체로 가수분해할 수 있는 혈액에 존재하는 매우 중요한 효소이다.

“플라스미노겐”은 플라스민의 자이모겐(zymogen) 형태로, swiss prot 중의 서열에 따르면 신호 펩티드를 포함하는 천연 인간 플라스미노겐 아미노산 서열(서열번호 4)에 따라 계산되는 810개의 아미노산으로 구성되고 분자량은 약 90 kD이며, 주로 간에서 합성되고 혈액에서 순환될 수 있는 당단백질이며, 상기 아미노산 서열을 코딩하는 cDNA 서열은 서열번호 3으로 표시된 바와 같다. 전장 플라스미노겐은 C 말단의 세린 프로테아제 도메인, N 말단의 Pan Apple(PAp) 도메인 및 5개의 kringle 도메인(Kringle1-5) 등 7개의 도메인을 포함한다. swiss prot 중의 서열을 참조하면, 이의 신호 펩티드는 잔기 Met1-Gly19를 포함하고, PAp는 잔기 Glu20-Val98을 포함하며, Kringle1은 잔기 Cys103-Cys181을 포함하고, Kringle2는 잔기 Glu184-Cys262를 포함하며, Kringle3은 잔기 Cys275-Cys352를 포함하고, Kringle4는 잔기 Cys377-Cys454를 포함하며, Kringle5는 잔기 Cys481-Cys560을 포함한다. NCBI 데이터에 따르면, 세린 프로테아제 도메인은 잔기 Val581-Arg804를 포함한다.

Glu-플라스미노겐은 인간 천연 전장 플라스미노겐으로, 791개의 아미노산으로 구성(19개의 아미노산의 신호 펩티드를 포함하지 않음)되고, 상기 서열을 코딩하는 cDNA 서열은 서열번호 1로 표시된 바와 같으며, 이의 아미노산 서열은 서열번호 2로 표시된 바와 같다. 체내에는 또한 Glu-플라스미노겐의 76 ~ 77번 아미노산에서 가수분해되어 형성된 Lys-플라스미노겐이 존재하고, 서열번호 6으로 표시된 바와 같으며, 상기 아미노산 서열을 코딩하는 cDNA 서열은 서열번호 5로 표시된 바와 같다. 델타-플라스미노겐(δ-plasminogen)은 Kringle2-Kringle5 구조가 결실된 전장 플라스미노겐의 단편으로, Kringle1 및 세린 프로테아제 도메인(프로테아제 도메인(protease domain, PD)이라고도 함)만 포함하고, 문헌에 델타-플라스미노겐의 아미노산 서열(서열번호 8)이 보고되어 있으며, 상기 아미노산 서열을 코딩하는 cDNA 서열은 서열번호 7로 표시된 바와 같다. 미니플라스미노겐(Mini-plasminogen)은 Kringle5 및 세린 프로테아제 도메인으로 구성되고, 문헌에 잔기 Val443-Asn791(신호 펩티드를 포함하지 않는 Glu-플라스미노겐 서열의 Glu 잔기를 시작 아미노산으로 함)을 포함하는 것으로 보고되어 있으며, 이의 아미노산 서열은 서열번호 10으로 표시된 바와 같고, 상기 아미노산 서열을 코딩하는 cDNA 서열은 서열번호 9로 표시된 바와 같다. 마이크로플라스미노겐(Micro-plasminogen)은 세린 프로테아제 도메인만 포함하고, 문헌에 이의 아미노산 서열이 잔기 Ala543-Asn791(신호 펩티드를 포함하지 않는 Glu-플라스미노겐 서열의 Glu 잔기를 시작 아미노산으로 함)을 포함하는 것으로 보고되어 있으며, 특허 문헌 CN102154253A에도 이의 서열이 잔기 Lys531-Asn791(신호 펩티드를 포함하지 않는 Glu-플라스미노겐 서열의 Glu 잔기를 시작 아미노산으로 함)을 포함하는 것으로 보고되어 있으며, 본 특허 출원에서 마이크로플라스미노겐 서열은 특허 문헌 CN102154253A를 참조하고, 이의 아미노산 서열은 서열번호 12로 표시된 바와 같으며, 상기 아미노산 서열을 코딩하는 cDNA 서열은 서열번호 11로 표시된 바와 같다.

전장 플라스미노겐의 구조도 Aisina 등(Aisina R B, Mukhametova L I. Structure and function of plasminogen/plasmin system[J]. Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 2014, 40(6):590-605)의 문장에 기재되어 있다. 상기 문장에서 Aisina 등은 플라스미노겐이 Kringle1, 2, 3, 4, 5 도메인 및 세린 프로테아제 도메인(프로테아제 도메인(protease domain, PD)이라고도 함)을 포함하고, 여기서 Kringles이 플라스미노겐과 저분자량 및 고분자량의 리간드의 결합(즉, 라이신 결합 활성)을 담당하여 플라스미노겐이 보다 개방된 배열로 전환되도록 함으로써 더 쉽게 활성화되며; 프로테아제 도메인(PD)은 잔기 Val562- Asn791이고, tPA 및 UPA가 플라스미노겐의 Arg561-Val562 활성화 결합을 특이적으로 절단하여 플라스미노겐이 플라스민으로 형성되도록 함으로써, 프로테아제 도메인(PD)은 플라스미노겐 단백질 분해 활성을 부여하는 영역이라는 것을 설명하였다.

본 발명의 “플라스민”과 “섬유소 용해 효소”, “피브린 용해 효소”는 상호교환하여 사용될 수 있고 의미는 동일하며; “플라스미노겐”과 “섬유소 용해 자이모겐”, “피브린 용해 자이모겐”은 상호교환하여 사용될 수 있고 의미는 동일하다.

본 발명에서, 상기 플라스미노겐 또는 플라스미노겐 활성의 “결핍”은 피험자 체내의 플라스미노겐 함량이 상기 피험자의 정상적인 생리학적 기능에 영향을 미칠만큼 정상인보다 낮다는 것을 의미하고; 상기 플라스미노겐 또는 플라스미노겐 활성의 “결실”은 피험자 체내의 플라스미노겐 함량이 정상인보다 현저히 낮고, 심지어는 활성 또는 발현이 극히 낮으며, 외부 공급에 의해서만 정상적인 생리학적 기능을 유지할 수 있다는 것을 의미한다.

당업자는 본 발명의 플라스미노겐의 모든 기술적 해결수단이 플라스민에 적용되기 때문에 본 발명에 기재된 기술적 해결수단이 플라스미노겐 및 플라스민을 포함하는 것을 이해할 수 있다. 순환 과정에서, 플라스미노겐은 폐쇄된 비활성 형태를 사용하지만, 혈전 또는 세포 표면에 결합되는 경우 플라스미노겐 활성제(plasminogen activator, PA)의 매개하에 개방형 형태를 갖는 활성 플라스민으로 전환된다. 활성을 갖는 플라스민은 피브린 응괴를 피브린 분해 산물 및 D-이량체로 추가 가수분해하여 혈전을 용해할 수 있다. 여기서 플라스미노겐의 PAp 도메인은 플라스미노겐이 비활성 폐쇄 형태로 유지하도록 하는 중요한 결정 인자를 포함하고, KR 도메인은 수용체 및 기질에 존재하는 라이신 잔기에 결합될 수 있다. 조직 플라스미노겐 활성제(tPA), 유로키나아제 플라스미노겐 활성제(uPA), 칼리크레인(kallikrein) 및 혈액 응고 인자 XII(하게만 인자) 등을 비롯한 다양한 효소가 플라스미노겐 활성제로 사용될 수 있다는 것이 알려져 있다.

“플라스미노겐 활성 단편”은 기질 표적 서열 중 라이신에 결합되는 활성(라이신 결합 활성), 또는 단백질 분해 기능을 발휘하는 활성(단백질 분해 활성), 또는 단백질 분해 활성 및 라이신 결합 활성을 갖는 단편을 의미한다. 본 발명에 따른 플라스미노겐의 기술적 해결수단은 플라스미노겐 활성 단편으로 플라스미노겐을 대체하는 기술적 해결수단을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 플라스미노겐 활성 단편은 플라스미노겐의 세린 프로테아제 도메인을 포함하거나 또는 플라스미노겐의 세린 프로테아제 도메인으로 구성된다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 플라스미노겐 활성 단편은 서열번호 14를 포함하거나, 또는 서열번호 14와 적어도 80％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호 14로 구성되거나, 또는 서열번호 14와 적어도 80％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 플라스미노겐 활성 단편은 Kringle 1, Kringle 2, Kringle 3, Kringle 4, Kringle 5로부터 선택되는 하나 이상의 도메인 또는 이들의 보존적 치환 변이체를 포함하거나, 또는 Kringle 1, Kringle 2, Kringle 3, Kringle 4, Kringle 5로부터 선택되는 하나 이상의 도메인 또는 이들의 보존적 치환 변이체로 구성된다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 플라스미노겐은 상기 플라스미노겐 활성 단편을 포함하는 단백질을 포함한다.

현재, 혈액 내 플라스미노겐 및 이의 활성 측정 방법은 조직 플라스미노겐 활성제 활성의 검출(t-PAA), 혈장 조직 플라스미노겐 활성제 항원의 검출(t-PAAg), 혈장 조직 플라스미노겐 활성의 검출(plgA), 혈장 조직 플라스미노겐 항원의 검출(plgAg), 혈장 조직 플라스미노겐 활성제 억제제 활성의 검출, 혈장 조직 플라스미노겐 활성제 억제제 항원의 검출, 혈장 플라스민-항플라스민 착물 검출(PAP)을 포함한다. 여기서 가장 일반적으로 사용되는 검출 방법은 발색 기질 방법으로, 검출할 혈장에 스트렙토키나아제(SK) 및 발색 기질을 첨가하고, 검출할 혈장 내의 PLG를 SK의 작용하에 PLM으로 전환하며, 후자를 발색 기질에 작용시키고, 그 다음 분광 광도계로 측정하며, 흡광도의 증가는 플라스미노겐 활성에 정비례한다. 또한, 면역화학적 방법, 겔 전기영동, 면역비탁법, 방사면역측정법 등을 사용하여 측정할 수도 있다.

“동원체 또는 병렬상동체(ortholog)”는 단백질 동원체 뿐만 아니라 DNA 동원체도 포함하는 상이한 종 사이의 동원체를 의미하고, 이종상동체 및 수직 동원체라고도 한다. 구체적으로 상이한 종의 동일한 조상 유전자에서 진화한 단백질 또는 유전자를 의미한다. 본 발명의 플라스미노겐은 인간 천연 플라스미노겐을 포함하고, 상이한 종으로부터 유래되고 플라스미노겐 활성을 갖는 플라스미노겐 동원체 또는 병렬상동체를 더 포함한다.

“보존적 치환 변이체”는 그 중 하나의 주어진 아미노산 잔기가 변경되나 단백질 또는 효소의 전체 형태 및 기능이 변경되지 않는 것을 의미하며, 이는 유사한 특성(예를 들어 산성, 염기성, 소수성 등)의 아미노산으로 모 단백질의 아미노산 서열 중의 아미노산을 치환하는 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 유사한 특성을 갖는 아미노산은 잘 알려져 있다. 예를 들어 아르기닌, 히스티딘 및 라이신은 친수성 염기성 아미노산이고 상호교환할 수 있다. 이와 같이, 이소류신이 소수성 아미노산이면, 류신, 메티오닌 또는 발린으로 대체될 수 있다. 따라서, 유사한 기능의 두 단백질 또는 아미노산 서열의 유사성은 상이할 수 있다. 예를 들어, MEGALIGN 알고리즘 기반의 70％ 내지 99%의 유사성(동일성)이다. “보존적 치환 변이체”는 BLAST 또는 FASTA 알고리즘을 통해 결정된 60％ 이상, 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상, 또는 가장 바람직하게는 90% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩티드 또는 효소를 더 포함하고, 천연 또는 모 단백질 또는 효소에 비해 동일하거나 기본적으로 유사한 특성 또는 기능을 갖는다.

“분리된” 플라스미노겐은 자연 환경에서 분리 및/또는 회수된 플라스미노겐 단백질을 의미한다. 일부 실시형태에서, 상기 플라스미노겐은 (1) 90%, 95% 또는 98%보다 큰 순도(중량 기준), 예를 들어 Lowry 방법에 의해 결정된 99％(중량 기준)를 초과한 순도, (2) 스피닝 컵 서열 분석기를 사용하여 N 말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 획득하기에 충분한 정도, 또는 (3) 환원 또는 비환원 조건에서 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 통해 쿠마시 블루 또는 은 염색을 사용하여 결정된 균질성으로 정제된다. 분리된 플라스미노겐은 또한 생물공학 기술을 통해 재조합 세포로부터 제조되고 적어도 하나의 정제 단계를 통해 분리된 플라스미노겐을 포함한다.

용어 “폴리펩티드”, “펩티드” 및 “단백질”은 본문에서 상호교환하여 사용될 수 있고, 유전적으로 코딩된 아미노산 및 비유전적으로 코딩된 아미노산, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형되거나 유도체화된 아미노산, 및 변형된 펩티드 골격을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있는 임의의 길이의 아미노산의 중합 형태를 의미한다. 상기 용어는 이종 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질, 이종 및 상동 리더 서열(N 말단 메티오닌 잔기가 있거나 없음)을 갖는 융합체 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 융합 단백질을 포함한다.

참조 폴리펩티드 서열에 대한 “아미노산 서열 상동성 백분율(%)”은 최대 백분율 서열 상동성을 달성하기 위해 필요시 갭을 도입한 후 임의의 보존적 치환을 서열 상동성의 일부로 고려하지 않는 경우, 참조 폴리펩티드 서열 중의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로 정의한다. 백분율 아미노산 서열 상동성을 측정하기 위한 정렬은 본 기술분야의 기술적 범위 내에서 다양한 방식으로 구현될 수 있고, 예를 들어 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어를 사용할 수 있다. 당업자는 비교될 서열의 전장에 대해 최대 정렬을 구현하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본 발명의 목적을 위해 아미노산 서열 상동성의 백분율 값은 서열 비교를 위한 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다.

ALIGN-2를 사용하여 아미노산 서열을 비교하는 경우, 주어진 아미노산 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 ％ 아미노산 서열 상동성(또는 주어진 아미노산 서열 B에 대하여, 주어진 아미노산 서열 B와 또는 이와 관련하여 ％ 아미노산 서열 상동성을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 표현될 수 있음)은 하기와 같이 계산된다.

분수 X/Y 곱하기 100

여기서 X는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의한 A 및 B 정렬에서 동일한 매치로 스코어링된 아미노산 잔기의 수이고, 여기서 Y는 B 중의 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 ％ 아미노산 서열 상동성은 A에 대한 B의 ％ 아미노산 서열 상동성과 같지 않다는 것을 이해해야 한다. 달리 명시적으로 설명되지 않는 한, 본문에 사용된 모든 ％ 아미노산 서열 상동성 값은 상술한 바와 같이 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 획득된다.

본문에 사용된 바와 같이, 용어 “치료”는 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 획득함을 의미한다. 상기 효과는 질환 또는 이의 증상의 발생, 발작을 완전히 또는 부분적으로 예방하거나, 질환 및/또는 이의 증상을 부분적으로 또는 완전히 경감하거나, 및/또는 질환 및/또는 이의 증상을 부분적으로 또는 완전히 치유할 수 있는 것이며, (a) 질환의 소인을 가질 수 있지만 질환이 있는 것으로 진단되지 않은 피험자 체내에서 질환의 발생 또는 발작을 예방하는 것; (b) 질환을 억제하는 것, 즉 질환의 발달을 막는 것; 및 (c) 질환 및/또는 이의 증상을 완화시키는 것, 즉 질환 및/또는 이의 증상을 퇴행 또는 소실시키는 것을 포함한다.

용어 “개체”, “피험자” 및 “환자”는 본문에서 상호교환하여 사용될 수 있고, 쥐(래트, 마우스), 비인간 영장류, 인간, 개, 고양이, 발굽이 있는 동물(예를 들어 말, 소, 양, 돼지, 염소) 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 포유동물을 의미한다.

“치료 유효량” 또는 “유효량”은 질환을 치료하기 위해 포유동물 또는 다른 피험자에게 투여될 때 질환을 예방 및/또는 치료하기에 충분한 플라스미노겐 활성화 경로의 성분 또는 이의 관련 화합물(예를 들어, 플라스미노겐)의 양을 의미한다. “치료 유효량”은 사용된 플라스미노겐 활성화 경로의 성분 또는 이의 관련 화합물(예를 들어, 플라스미노겐), 치료할 피험자의 질환 및/또는 이의 증상의 중증도, 연령, 체중 등에 따라 변화된다.

본 발명의 플라스미노겐의 제조

플라스미노겐은 자연계에서 분리되고 정제되어 추가적인 치료 용도에 사용되거나, 표준 화학 펩티드 합성 기술을 통해 합성될 수 있다. 폴리펩티드가 화학적으로 합성되는 경우, 액상 또는 고상을 통해 합성될 수 있다. 고상 폴리펩티드 합성(SPPS)(여기서 서열의 C 말단 아미노산을 불용성 지지체 부착한 다음, 서열의 나머지 아미노산을 순차적으로 첨가함)은 플라스미노겐의 화학적 합성에 적합한 방법이다. Fmoc 및 Boc와 같은 다양한 형태의 SPPS는 플라스미노겐의 합성에 사용할 수 있다. 고상 합성 기술은 Barany 및 Solid-Phase Peptide Synthesis; 제3-284페이지 The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. 제2권: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A., Merrifield, 등. J.Am.Chem.Soc., 85:2149-2156(1963); Stewart 등, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed. Pierce Chem.Co., Rockford, Ill.(1984); 및 Ganesan A.2006Mini Rev.Med Chem.6:3-10 및 Camarero JA 등 2005 Protein Pept Lett.12:723-8에 기재되어 있다. 간단히 말해서, 펩티드 사슬이 구축되어 있는 기능성 단위로 작은 불용성 다공성 비드를 처리한다. 커플링/탈보호의 반복된 주기 후에, 부착된 고상이 없는 N 말단 아민과 단일 N 보호 아미노산 단위를 커플링한다. 그 다음 이 단위를 탈보호하여 다른 아미노산에 부착될 수 있는 새로운 N 말단 아민을 나타낸다. 펩티드는 고상에 고정된 상태로 유지되며, 그 후에 이를 절단한다.

표준 재조합 방법을 사용하여 본 발명의 플라스미노겐을 생산할 수 있다. 예를 들어, 플라스미노겐을 코딩하는 핵산을 발현 벡터에 삽입하여 발현 벡터 중의 조절 서열에 작동 가능하게 연결되도록 한다. 발현 조절 서열은 프로모터(예를 들어, 천연적으로 연관된 또는 이종 프로모터), 신호 서열, 인핸서 요소 및 전사 종결 서열을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 발현 조절은 진핵 숙주 세포(예를 들어, COS 또는 CHO 세포)를 형질전환 또는 형질감염시킬 수 있는 벡터 중의 진핵 프로모터 시스템일 수 있다. 벡터가 적합한 숙주에 통합되면, 뉴클레오티드 서열의 고수준 발현 및 플라스미노겐의 수집 및 정제에 적합한 조건하에 숙주가 유지된다.

적합한 발현 벡터는 통상적으로 숙주 유기체에서 에피솜 또는 숙주 염색체 DNA의 통합 부분으로서 복제된다. 통상적으로, 발현 벡터는 선택 가능한 마커(예를 들어, 암피실린(ampicillin) 내성, 하이그로마이신(hygromycin) 내성, 테트라사이클린(tetracycline) 내성, 카나마이신(kanamycin) 내성 또는 네오마이신(neomycin) 내성)을 포함하여 원하는 외인성 DNA 서열로 형질전환된 세포를 검출하는 데 도움이 된다.

대장균(Escherichia coli)은 주제 항체를 클로닝하여 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 원핵 숙주 세포의 예일 수 있다. 사용하기에 적합한 다른 미생물 숙주는 간균, 예를 들어 고초균(Bacillus subtilis) 및 다른 장내세균과(enterobacteriaceae), 예를 들어 살모넬라속(Salmonella), 셀라티아속(Serratia), 및 다양한 슈도모나스속(Pseudomonas) 종을 포함한다. 이러한 원핵 숙주에서 또한 발현 벡터를 생성할 수 있고, 이는 통상적으로 숙주 세포와 양립할 수 있는 발현 조절 서열(예를 들어, 복제 기점)을 포함할 수 있다. 또한, 락토오스 프로모터 시스템, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, beta-락타마제 프로모터 시스템, 또는 박테리오파지 λ로부터의 프로모터 시스템과 같은 공지된 다양한 프로모터가 있다. 프로모터는 선택적으로 작동 유전자 서열의 경우에 통상적으로 발현을 제어하고, 전사 및 번역을 개시 및 완료하기 위해 리보솜 결합 부위 서열 등을 갖는다.

효모와 같은 다른 미생물도 발현에 사용될 수 있다. 효모(예를 들어, 출아형 효모(S.cerevisiae)) 및 피키아(Pichia)는 적절한 효모 숙주 세포의 예로, 여기서 적절한 벡터는 필요에 따라 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터), 복제 기점, 종결 서열 등을 갖는다. 전형적인 프로모터는 3-포스포글리세르산 키나아제 및 기타 당분해 효소를 포함한다. 특히 유도성 효모 프로모터는 에탄올 탈수소 효소, 이소시토크롬 C, 및 말토스 및 갈락토스 이용을 담당한 효소로부터의 프로모터를 포함한다.

미생물 외에, 포유동물 세포(예를 들어, 시험관내 세포 배양물에서 배양된 포유동물 세포)는 또한 본 발명의 항-Tau 항체(예를 들어, 주제 항-Tau 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드)를 발현 및 생성하는 데 사용될 수 있다. Winnacker,From Genes to Clones,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.(1987)를 참조한다. 적합한 포유동물 숙주 세포는 CHO 세포주, 다양한 Cos 세포주, HeLa 세포, 골수종 세포주, 및 형질전환된 B 세포 또는 하이브리도마를 포함한다. 이러한 세포에 사용되는 발현 벡터는 복제 기점, 프로모터 및 인핸서(Queen 등, Immunol.Rev.89:49(1986))와 같은 발현 조절 서열, 및 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이싱 부위, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종결자 서열과 같은 필수적인 가공 정보 부위를 포함할 수 있다. 적합한 발현 조절 서열의 예는 면역글로불린 유전자, SV40, 아데노바이러스, 소유두종바이러스, 거대세포바이러스 등으로부터 유래된 프로모터이다. Co 등, J.Immunol.148:1149(1992)를 참조한다.

일단 합성(화학적 또는 재조합적 방식)되면, 황산암모늄 침전, 친화성 컬럼, 컬럼 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 겔 전기영동 등을 포함하는 본 기술분야의 표준 절차에 따라 본 발명에 따른 플라스미노겐을 정제할 수 있다. 상기 플라스미노겐은 기본적으로 순수하고, 예를 들어 적어도 약 80% 내지 85%, 적어도 약 85% 내지 90%, 적어도 약 90% 내지 95% 순수하거나, 또는 98% 내지 99% 순수하거나 더 순수하며, 예를 들어 세포 파편, 주제 항체 이외의 거대 분자 등과 같은 오염 물질을 포함하지 않는다.

약물 제제

원하는 순도의 플라스미노겐 활성화 경로의 성분 또는 이의 관련 화합물(예를 들어, 플라스미노겐)을 선택 가능한 약학적으로 허용 가능한 벡터, 부형제 또는 안정화제(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16판, Osol, A.ed.(1980))와 혼합하여 동결건조제 또는 수용액을 형성함으로써 치료 제제를 제조할 수 있다. 허용 가능한 벡터, 부형제, 안정화제는 사용된 용량 및 농도하에 피험자에게 무독성이고, 인산염, 시트르산염 및 다른 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 방부제(예를 들어 옥타데실디메틸벤질암모늄 클로라이드; 헥산디아민 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드(benzalkonium chloride), 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부탄올 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라히드록시벤조에이트; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; m-크레졸); 저분자량 폴리펩티드(약 10개 미만의 잔기); 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류 및 포도당, 만노오스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 푸코스 또는 소르비톨과 같은 당류; 나트륨과 같은 염 형성 반대 이온; 금속 착물(예를 들어, 아연-단백질 착물); 및/또는 TWEENTM, PLURONICSTM 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다. 바람직한 동결 건조된 항-VEGF 항체 제제는 WO 97/04801에 기재되어 있고, 이는 본문에서 참조로 포함된다.

본 발명의 제제는 또한 치료해야 할 구체적인 병증에 필요한 하나 이상의 활성 화합물을 포함할 수 있고, 바람직하게는 활성이 상보적이며 서로 부작용이 없는 것이다.

본 발명의 플라스미노겐은 코아세르베이션(coacervation) 또는 계면 중합과 같은 기술을 통해 제조된 마이크로캡슐에 캡슐화될 수 있으며, 예를 들어 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 매크로에멀젼의 히드록시메틸셀룰로스 또는 겔-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸 메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 배치할 수 있다. 이러한 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)에 공개되어 있다.

체내 투여를 위한 본 발명의 플라스미노겐 활성화 경로의 성분 또는 이의 관련 화합물(예를 들어, 플라스미노겐)은 무조건 멸균된 것이다. 이는 동결 건조 및 재조제 전후에 멸균 필터를 통한 여과에 의해 쉽게 구현될 수 있다.

본 발명의 플라스미노겐 활성화 경로의 성분 또는 이의 관련 화합물(예를 들어, 플라스미노겐)은 서방형 제제로 제조될 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예는 멤브레인 또는 마이크로캡슐과 같이 일정한 형태를 갖고 당단백질을 포함하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함한다. 서방형 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 하이드로겔(예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트)(Langer 등, J.Biomed.Mater.Res.,15:167-277(1981); Langer,Chem.Tech.,12:98-105(1982)) 또는 폴리(비닐 알코올), 폴리락티드(미국 특허 3773919,EP 58,481), L-글루탐산과 γ에틸-L-글루탐산의 공중합체(Sidman, 등, Biopolymers 22:547(1983)), 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트(ethylene-vinyl acetate)(Langer, 등, 출처는 상기와 같음), 또는 Lupron DepotTM(젖산-글리콜산 공중합체 및 류프롤라이드(leuprolide) 아세테이트로 구성된 주사 가능한 마이크로스피어)과 같은 분해성 젖산-글리콜산 공중합체, 및 폴리D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 젖산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 이상 동안 연속적으로 분자를 방출할 수 있지만 일부 하이드로겔은 단백질을 방출하는 시간이 비교적 짧다. 관련 메커니즘에 따라 단백질의 안정화를 위한 합리적인 전략을 설계할 수 있다. 예를 들어, 축합 메커니즘이 티오디설피드 교환을 통해 분자간 S-S 결합을 형성하는 것으로 발견되면, 설프히드릴 잔기를 변형시키고 산성 용액에서 동결 건조하며 습도를 조절하고 적절한 첨가제를 사용하며 특정된 중합체 매트릭스 조성물을 개발하여 안정화를 구현할 수 있다.

투여 및 용량

비강 흡입, 에어로졸 흡입, 점비액 또는 점안액, 정맥내, 복막내, 피하, 두개내, 척추강내, 동맥내(예를 들어, 경동맥을 통해), 근육내, 직장내 투여와 같이 상이한 방식을 통해 본 발명의 약학적 조성물의 투여를 구현할 수 있다.

비경구 투여를 위한 제조물은 멸균된 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다. 비수성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 및 에틸 올레이트와 같은 주사 가능한 유기 에스테르이다. 수성 벡터는 물, 알코올성/수성 용액, 염수 및 완충 매질을 포함한 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨 또는 고정유를 포함한다. 정맥내 비히클은 액체 및 영양 보충제, 전해질 보충제 등을 포함한다. 또한 방부제 및 다른 첨가제, 예를 들어 항미생물제, 항산화제, 킬레이트제 및 불활성 가스 등이 존재할 수 있다.

의료진은 다양한 임상 요인에 기반하여 용량 방법을 결정한다. 의료 분야에 공지된 바와 같이, 임의의 환자의 용량은 환자의 체격, 체표면적, 연령, 투여할 구체적인 화합물, 성별, 투여 횟수 및 경로, 일반적인 건강 및 동시에 투여되는 다른 약물을 비롯한 다양한 요인에 따라 결정된다. 본 발명의 플라스미노겐을 포함하는 약학적 조성물의 용량 범위는 예를 들어 매일 약 0.0001 내지 2000 mg/kg, 또는 약 0.001 내지 500 mg/kg(예를 들어 0.02 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.75 mg/kg, 10 mg/kg, 50 mg/kg 등) 피험자 체중일 수 있다. 예를 들어, 용량은 1 mg/kg 체중 또는 50 mg/kg 체중 또는 1 ~ 50 mg/kg 범위, 또는 적어도 1 mg/kg일 수 있다. 이 예시적인 범위보다 높거나 낮은 용량도 특히 상기 요인을 고려하여 포함된다. 상기 범위 중의 중간 용량도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 피험자는 매일, 격일, 매주 또는 경험적 분석에 의해 결정된 임의의 다른 일정에 따라 이러한 용량을 투여할 수 있다. 예시적인 용량 일정은 연속적으로 몇일 0.01 ~ 100 mg/kg을 포함한다. 본 발명의 약물 투여 과정에서 치료 효과 및 안전성을 실시간으로 평가해야 한다.

제품 또는 키트

본 발명의 일 실시형태는 플라스미노겐 활성화 경로의 성분 또는 이의 관련 화합물(예를 들어, 플라스미노겐)을 포함하는 제품 또는 키트에 관한 것이다. 상기 제품은 바람직하게는 하나의 용기, 라벨 또는 패키지 인서트를 포함한다. 적합한 용기는 병, 바이알, 주사기 등이 있다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 제조될 수 있다. 상기 용기는 조성물을 포함하고, 상기 조성물은 본 발명의 질환 또는 병증을 효과적으로 치료하고 멸균 접근 포트(예를 들어, 상기 용기는 피하 주사바늘이 관통할 수 있는 마개를 포함하는 정맥내 용액 팩 또는 바이알일 수 있음)를 갖는다. 상기 조성물 중 적어도 하나의 활성제는 플라스미노겐 활성화 경로의 성분 또는 이의 관련 화합물(예를 들어, 플라스미노겐)이다. 상기 용기 상의 또는 부착된 라벨은 상기 조성물이 본 발명에 따른 병증의 치료에 사용됨을 나타낸다. 상기 제품은 약학적으로 허용 가능한 완충액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있는 바, 예를 들어 인산완충식염수, 링거 용액 및 포도당 용액이다. 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하여 상업적 및 사용자 관점에서 요구되는 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 제품은 사용 지침이 있는 패키지 인서트를 포함하고, 예를 들어 상기 조성물의 사용자가 플라스미노겐 활성화 경로의 성분 또는 이의 관련 화합물(예를 들어, 플라스미노겐)의 조성물 및 수반되는 질환의 치료를 위한 다른 약물을 환자에게 투여하도록 지시하는 것을 포함한다.

실시예

하기 모든 실시예에서 사용되는 플라스미노겐은 인간 공여자 혈장에서 유래되고, KennethC Robbins,Louis Summaria,David Elwyn et al.Further Studies on the Purification and Characterization of Human Plasminogen and Plasmin.Journal of Biological Chemistry,1965,240(1):541-550; Summaria L,Spitz F,Arzadon L et al.Isolation and characterization of the affinity chromatography forms of human Glu-and Lys-plasminogens and plasmins.J Biol Chem.1976 Jun 25; 251(12):3693-9; HAGAN JJ,ABLONDI FB,DE RENZO EC.Purification and biochemical properties of human plasminogen.J Biol Chem.1960 Apr; 235:1005-10에 기재된 방법에 기반하여, 공정 최적화를 수행하고, 인간 공여자 혈장으로부터 정제하여 획득한다. 여기서, 플라스미노겐 단량체는 >98％이다.

실시예 1 PBS 완충액 시스템에서 아밀로이드 단백질(Aβ)의 분해를 촉진할 수 있는 플라스미노겐

Eppendorf(EP) 튜브를 취하여 각각 ① 블랭크 대조군, ② 비히클 대조군, ③ 플라스미노겐군, ④ 플라스미노겐+tPA군으로 설정하고, 각 그룹은 4개이다. 블랭크 대조군에 43.3 μL의 생리식염수, 16 μL의 플라스미노겐 용액(0.575 mg/mL), 10 μL의 초순수, 30.7 μL의 PBS 완충액(10 mM, pH 7.4, Thermo Fisher, 10010-031)을 첨가하고; 비히클 대조군에 43.3 μL의 Aβ40(Shanghai Qiangyao Biotechnology Co., Ltd, 04010011521, 1.0 mg/mL), 16 μL의 비히클 용액(10 mM의 시트르산나트륨, 2％ 아르기닌염산염, 3％ 만니톨, PH 7.4), 10 μL의 초순수, 30.7 μL의 PBS 완충액을 첨가하며; 플라스미노겐군에 43.3 μL의 Aβ40(1.0 mg/mL), 16 μL의 플라스미노겐 용액(0.575 mg/mL), 10 μL의 초순수, 30.7 μL의 PBS 완충액을 첨가하고; 플라스미노겐+tPA군에 43.3 μL의 Aβ40(1.0 mg/mL), 8 μL의 플라스미노겐 용액(1.15 mg/mL), 8 μL의 tPA 용액(1.0 mg/mL), 10 μL의 라이신 용액(0.1 mM), 30.7 μL의 PBS 완충액을 첨가하였다. 그 후, 37℃에서 3 h 동안 배양한 다음, 각각 100 μL의 0.1％ 트리플루오로아세트산 용액을 첨가하여 반응을 종결시켰다.

Tris-Tricine-SDS-PAGE 겔 제조 키트(Solarbio, P1320)의 설명서 지침에 따라 20％ 겔을 제조하였다. 각 그룹의 샘플은 각각 4×로딩 완충(TaKaRa, e2139)과 3:1의 부피비로 골고루 혼합한 다음, 100℃에서 5 min 동안 가열하고, 냉각 후 1 min 동안 원심분리하며, 그 다음 20 μL의 샘플을 로딩하였다. 전기영동 조건은 30 V에서 1시간 동안 실행한 다음, 100 V에서 겔 바닥까지 전기영동하는 것이다. 전기영동 후 겔을 벗겨내고 1‰ 쿠마시 브릴리언트 블루 염색액(1 g의 쿠마시 브릴리언트 블루 R250을 부피비가 5:2:13인 1000 ml의 에탄올:빙초산:정제수의 혼합액에 용해시킴)에서 30 min 동안 염색한 다음, 탈색액(정제수:빙초산:무수 에탄올＝17:2:1 부피비 혼합)으로 깨끗해질 때까지 탈색하였다. 겔을 투과조명기로 정량적 스캐닝 및 촬영하였다.

아밀로이드 단백질(Aβ)의 축적은 알츠하이머병의 형성에 중요한 요인이며, 여기서 40개 및 42개의 잔기를 포함하는 Aβ40 및 Aβ42는 뇌의 해마 및 선조체에 침착되어 AD의 주요 발병 요인인 노인반을 형성한다^[1]. 뇌 척수액에서 Aβ40 및 Aβ42의 함량 검출도 임상 알츠하이머병의 생리학적 지표로 된다.

결과에 따르면, 비히클 대조군의 Aβ40의 양은 아무런 변화도 발생하지 않았고, 100％로 정의하였으며; 플라스미노겐군은 플라스미노겐 단독 첨가 시 Aβ40가 부분적으로 분해되며; 플라스미노겐+tPA군은 플라스미노겐 및 tPA 첨가 시 시험관 내에서 Aβ40가 유의하게 분해되고, 비히클 대조군과 현저한 차이가 있다(**는 P<0.01을 나타냄)(도 1). 이는 PBS 완충액 시스템에서 플라스미노겐이 Aβ40 분해를 촉진할 수 있음을 나타낸다.

실시예 2 토끼 뇌 척수액에서 아밀로이드 단백질(Aβ)의 분해를 촉진할 수 있는 플라스미노겐

Eppendorf(EP) 튜브를 취하여 각각 ① 블랭크 대조군, ② 비히클 대조군, ③ 플라스미노겐군으로 설정하고, 각 그룹은 4개이다. 블랭크 대조군에 43.3 μL의 생리식염수, 16 μL의 플라스미노겐 용액(0.575 mg/mL), 40.7 μL의 토끼 뇌 척수액을 첨가하고; 비히클 대조군에 43.3 μL의 Aβ40(Shanghai Qiangyao Biotechnology Co., Ltd, 04010011521, 1.0 mg/mL), 16 μL의 비히클 용액(10 mM의 시트르산나트륨, 2％ 아르기닌염산염, 3％ 만니톨, PH 7.4), 40.7 μL의 토끼 뇌 척수액을 첨가하며; 플라스미노겐군에 43.3 μL의 Aβ40(1.0 mg/mL), 16 μL의 플라스미노겐 용액(0.575 mg/mL), 40.7 μL의 토끼 뇌 척수액을 첨가하였다. 그 후, 37℃에서 3 h 동안 배양한 다음, 각각 100 μL의 0.1％ 트리플루오로아세트산 용액을 첨가하여 반응을 종결시켰다.

Tris-Tricine-SDS-PAGE 겔 제조 키트(Solarbio, P1320)의 설명서 지침에 따라 20％ 겔을 제조하였다. 각 그룹의 샘플은 각각 4×로딩 완충(TaKaRa, e2139)과 3:1의 부피비로 골고루 혼합한 다음, 100℃에서 5 min 동안 가열하고, 냉각 후 1 min 동안 원심분리하며, 그 다음 20 μL의 샘플을 로딩하였다. 전기영동 조건은 30 V에서 1시간 동안 실행한 다음, 100 V에서 겔 바닥까지 전기영동하는 것이다. 전기영동 후 겔을 벗겨내고 1‰ 쿠마시 브릴리언트 블루 염색액(1 g의 쿠마시 브릴리언트 블루 R250을 부피비가 5:2:13인 1000 ml의 에탄올:빙초산:정제수의 혼합액에 용해시킴)에서 30 min 동안 염색한 다음, 탈색액(정제수:빙초산:무수 에탄올＝17:2:1 부피비 혼합)으로 깨끗해질 때까지 탈색하였다. 겔을 투과조명기로 정량적 스캐닝 및 촬영하였다.

결과에 따르면, 비히클 대조군의 Aβ40의 양은 아무런 변화도 발생하지 않았고, 100％로 정의하였으며; 플라스미노겐군은 플라스미노겐 단독 첨가 시 Aβ40가 74.81％로 부분적으로 분해되었다(도 2). 이는 토끼 뇌 척수액에서 플라스미노겐이 Aβ40 분해를 촉진할 수 있음을 나타낸다.

실시예 3 알츠하이머병 모델 및 정상 마우스의 뇌 균질액에서 인간 아밀로이드 단백질 Aβ40의 분해를 촉진하는 플라스미노겐

11주령 B6SJLTg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799 Vas/Mmjax(FAD)(Stock Number: 034840)(FAD라고 약칭함), C57BL/6(정상) 마우스를 각각 4마리 선택하고, 희생시킨 후 전체 뇌 조직을 취하며, 무게를 측정한 다음 Eppendorf(EP) 튜브에 넣고, 150 mg 조직/mL의 PBS에 따라 각각 1×PBS(Thermo Fisher, pH 7.4; 10010-031)를 첨가한 다음, 4℃에서 균질화(1 min/회, 3 ~ 4회)하며, 균질화한 후 4℃에서 원심분리(12000 rpm, 15 min)하고, 상층 뇌 균질액을 취하여 새로운 EP 튜브에 넣었다.

Eppendorf(EP) 튜브를 취하여 각각 ① 블랭크 대조군, ② 비히클 대조군, ③ 플라스미노겐군으로 설정하고, 각 그룹에 5개의 평행 그룹을 설정하였다. 블랭크 대조군에 21.5 μL의 생리식염수, 4.6 μL의 플라스미노겐 용액(2 mg/mL), 23.9 μL의 마우스 뇌 균질액을 첨가하고; 비히클 대조군에 21.5 μL의 Aβ40(Shanghai Qiangyao Biotechnology Co., Ltd, 04010011521, 1.0 mg/mL), 4.6 μL의 비히클 용액(10 mM의 시트르산나트륨, 2％ 아르기닌염산염, 3％ 만니톨, pH 7.4), 23.9 μL의 마우스 뇌 균질액을 첨가하며; 플라스미노겐군에 21.5 mL의 Aβ40(1.0 mg/mL), 4.6 μL의 플라스미노겐 용액(2 mg/mL), 23.9 μL의 마우스 뇌 균질액을 첨가하였다. 각 그룹의 샘플을 첨가한 후, 37℃에서 6 h 동안 배양하고 50 μL의 0.1％ 트리플루오로아세트산 용액을 첨가하여 반응을 종결시켰다.

Tris-Tricine-SDS-PAGE 겔 제조 키트(Solarbio, P1320)의 겔 조제 지침에 따라 20％ 겔을 제조하였다. 각 그룹의 샘플은 각각 4×로딩 완충(TaKaRa, e2139)과 3:1의 부피비로 골고루 혼합한 다음, 100℃에서 5 min 동안 가열하고, 냉각 후 1 min 동안 원심분리하며, 그 다음 20 μL의 샘플을 로딩하였다. 전기영동 조건은 30 V에서 1시간 동안 실행한 다음, 100 V에서 겔 바닥까지 전기영동하는 것이다. 전기영동 후 겔을 벗겨내고 1‰ 쿠마시 브릴리언트 블루 염색액(1 g의 쿠마시 브릴리언트 블루 R250을 부피비가 5:2:13인 1000 ml의 에탄올:빙초산:정제수의 혼합액에 용해시킴)에서 30 min 동안 염색한 다음, 탈색액(정제수:빙초산:무수 에탄올＝17:2:1 부피비 혼합)으로 깨끗해질 때까지 탈색하였다. 겔은 바이오 분자 이미지 분석기로 촬영 및 정량적 스캐닝하였다.

결과에 따르면, 알츠하이머병 모델 마우스의 뇌 균질액에서 플라스미노겐군의 인간 아밀로이드 단백질 Aβ40의 양은 비히클 대조군보다 유의하게 낮고, 차이가 매우 현저하며(***는 P<0.001을 나타냄); 정상 마우스의 뇌 균질액에서 플라스미노겐군의 아밀로이드 단백질 Aβ40의 양은 비히클 대조군보다 유의하게 낮고, 차이가 매우 현저하다(P＝0.001)(도 3). 이는 알츠하이머병 모델 및 정상 마우스의 뇌 균질액에서 플라스미노겐이 인간 아밀로이드 단백질 Aβ40의 분해를 효과적으로 촉진할 수 있음을 나타낸다.

실시예 4 알츠하이머병 모델 및 정상 마우스의 뇌 균질액에서 인간 아밀로이드 단백질 Aβ42의 분해를 촉진하는 플라스미노겐

11주령 B6SJLTg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799 Vas/Mmjax(FAD)(Stock Number: 034840)(FAD라고 약칭함), C57BL/6(정상) 마우스를 각각 4마리 선택하고, 희생시킨 후 전체 뇌 조직을 취하며, 무게를 측정한 다음 Eppendorf(EP) 튜브에 넣고, 150 mg 조직/mL의 PBS에 따라 각각 1×PBS(Thermo Fisher, pH 7.4; 10010-031)를 첨가한 다음, 4℃에서 균질화(1 min/회, 3 ~ 4회)하며, 균질화한 후 4℃에서 원심분리(12000 rpm, 15 min)하고, 상층 뇌 균질액을 취하여 새로운 EP 튜브에 넣어 비축하였다.

Eppendorf(EP) 튜브를 취하여 각각 ① 블랭크 대조군, ② 비히클 대조군, ③ 플라스미노겐군으로 설정하고, 각 그룹에 5개의 평행 그룹을 설정하였다. 블랭크 대조군에 21.5 μL의 생리식염수, 4.6 μL의 플라스미노겐 용액(2 mg/mL), 23.9 μL의 마우스 뇌 균질액을 첨가하고; 비히클 대조군에 21.5 μL의 Aβ42(Shanghai Qiangyao Biotechnology Co., Ltd, 04010011526, 1.0 mg/mL), 4.6 μL의 비히클 용액(10 mM의 시트르산나트륨, 2％ 아르기닌염산염, 3％ 만니톨, pH 7.4), 23.9 μL의 마우스 뇌 균질액을 첨가하며; 플라스미노겐군에 21.5 mL의 Aβ42(1.0 mg/mL), 4.6 μL의 플라스미노겐 용액(2 mg/mL), 23.9 μL의 마우스 뇌 균질액을 첨가하였다. 각 그룹의 샘플을 첨가한 후, 37℃에서 6 h 동안 배양하고 50 μL의 0.1％ 트리플루오로아세트산 용액을 첨가하여 반응을 종결시켰다.

Tris-Tricine-SDS-PAGE 겔 제조 키트(Solarbio, P1320)의 겔 조제 지침에 따라 20％ 겔을 제조하였다. 각 그룹의 샘플은 각각 4×로딩 완충(TaKaRa, e2139)과 3:1의 부피비로 골고루 혼합한 다음, 100℃에서 5 min 동안 가열하고, 냉각 후 1 min 동안 원심분리하며, 그 다음 20 μL의 샘플을 로딩하였다. 전기영동 조건은 30 V에서 1시간 동안 실행한 다음, 100 V에서 겔 바닥까지 전기영동하는 것이다. 전기영동 후 겔을 벗겨내고 1‰ 쿠마시 브릴리언트 블루 염색액(1 g의 쿠마시 브릴리언트 블루 R250을 1000 ml의 혼합액(에탄올:빙초산:정제수의 부피비는 5:2:13임)에 용해시킴)에서 30 min 동안 염색한 다음, 탈색액(정제수:빙초산:무수 에탄올＝17:2:1 부피비 혼합)으로 깨끗해질 때까지 탈색하였다. 겔은 바이오 분자 이미지 분석기로 촬영 및 정량적 스캐닝하였다.

결과에 따르면, 알츠하이머병 모델 마우스의 뇌 균질액에서 플라스미노겐군의 아밀로이드 단백질 Aβ42의 양은 비히클 대조군보다 낮고, 이의 중합체 a, b, c의 양은 모두 비히클보다 유의하게 낮으며, 차이가 매우 현저하고(*는 P<0.05를 나타내고; ***는 P<0.001을 나타냄); 정상 마우스의 뇌 균질액에서 플라스미노겐군의 아밀로이드 단백질 Aβ42의 양은 비히클군보다 유의하게 낮으며, 차이가 매우 현저하고(***는 P<0.001을 나타냄), 이의 중합체 a, b, c의 양은 모두 비히클군보다 낮으며, 차이가 매우 현저하다(***는 P<0.001을 나타냄)(도 4). 이는 FAD 및 정상 마우스의 뇌 균질액에서 플라스미노겐이 인간 아밀로이드 단백질 Aβ42 및 이의 중합체의 분해를 효과적으로 촉진할 수 있음을 나타낸다.

실시예 5 알츠하이머병 모델 마우스의 기억 기능 회복을 촉진하는 플라스미노겐

B6SJL-Tg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax(FAD라고 약칭함)(Jackson lab 실험실에서 구입, 품종 번호: 034840) 마우스는 알츠하이머를 연구하기 위해 일반적으로 사용되는 유전자 변형 모델 마우스이다. 12주령 FAD 암컷 마우스를 12마리 선택하고, 체중 결과에 따라 랜덤으로 두 그룹으로 나누었는 바, 비히클군 및 투여군으로 각 그룹은 6마리의 마우스이며, SJLB6(Stock Number: 10012) 암컷 마우스를 6마리 선택하여 정상 대조군으로 사용하였다. 투여군 마우스는 1 mg/0.1 ml/마리/일에 따라 플라스미노겐을 꼬리 정맥 주사하고, 비히클군 마우스는 동일한 부피의 비히클(4％ 아르기닌+2％ 글리신 용액)을 꼬리 정맥 주사하며, 정상 대조군 마우스는 투여 처리하지 않고, 5일 동안 연속 투여하였다. 투여 시작을 1일차로 하고, 6일차에 Y 미로 자발적 교대 반응 실험을 수행하였다. Y 미로는 3개의 완전히 동일한 팔로 구성된다. 각각의 팔 끝에는 음식 제공 장치가 있고, 동물 먹이기 전략 분석, 즉 각각의 팔 진입 횟수, 시간, 올바른 횟수, 잘못된 횟수, 경로 등 파라미터에 따라 실험 동물의 공간 기억 능력을 반영할 수 있으며, 현재 학습 기억 기능의 평가에 자주 사용된다. 상기 실험은 새로운 환경을 탐색하는 설치류 동물의 본성을 완전히 이용하고, 동물은 바로 전의 기억에 의존하여 올바른 팔 진입 선택을 해야 하며, 이는 동물의 공간 작업 기능 능력을 효과적으로 평가할 수 있다. 실험 시 동물을 한 팔의 말단에 놓고 몇 분 동안 자유롭게 탐색하도록 하며, 일정 시간이 지난 후 동물을 다시 미로에 놓고 정식 테스트를 한다. 동물의 각각의 팔에 진입한 순서 및 총 횟수를 기록하고, 상이한 팔(예를 들어 1, 2, 3 또는 1, 3, 2)에 연속 진입하는 경우, 올바른 교대(Alternation) 반응으로 기록하였다. 한 팔의 말단에 동물을 놓고, 8분 이내에 동물이 각각의 팔에 진입한 순서를 기록하였다.

최대 교대는 팔 진입 횟수의 총 수-2이고, 그 다음 백분율=실제 Alternation/최대 Alternation×100%를 계산하며, 최종적으로 부여되는 값은 실제 Alternation 수, 최대 Alternation 수, 양자의 백분율, 동물 활동의 총 거리 및 총 팔 진입 횟수를 포함한다^[2].

알츠하이머병(AD)은 서서히 발병하는 진행성 신경퇴행성 질환으로, 인지 장애, 신경변성, β-아밀로이드 단백질 침착, 신경섬유 엉킴 및 신경염을 특징으로 한다^[3]. FAD 유전자 변형 마우스는 AD 치료 약물의 연구 및 개발을 위해 일반적으로 사용되는 모델 동물이다.

자발적 교대 반응 백분율

자발적 교대 반응 백분율은 실제 Alternation과 최대 Alternation×100%의 비율이다. 결과에 따르면, 정상 대조군 마우스에 비해 비히클군 마우스의 자발적 교대 반응 백분율은 유의하게 증가하고; 투여군 마우스의 자발적 교대 반응 백분율은 비히클 대조군보다 유의하게 낮으며, 통계학적 차이가 현저하고(*는 P<0.05를 나타냄), 정상 대조군 마우스에 더 근접한다(도 5).

총 팔 진입 횟수

총 팔 진입 횟수는 지정된 시간 내 마우스의 팔 진입 횟수의 합을 의미한다. 결과에 따르면, 정상 대조군 마우스에 비해 비히클군 마우스의 총 팔 진입 횟수는 유의하게 감소하고; 투여군 마우스의 총 팔 진입 횟수는 비히클 대조군보다 유의하게 많으며, 통계학적 차이가 현저하고(*는 P<0.05를 나타냄), 정상 대조군 마우스에 더 근접한다(도 6).

총 운동 거리

총 운동 거리는 지정된 시간 내 마우스의 운동 궤적의 총 길이를 의미한다. 결과에 따르면, 정상 대조군 마우스에 비해 비히클군 마우스의 총 운동 거리는 유의하게 감소하고; 투여군 마우스의 총 운동 거리는 비히클 대조군보다 유의하게 많으며, 통계학적 차이가 현저하고(*는 P<0.05를 나타냄), 정상 대조군 마우스에 더 근접한다(도 7).

상기 결과는 플라스미노겐이 알츠하이머병 모델 마우스의 자발적 교대 반응 회복을 촉진하고 기억 회복을 촉진할 수 있음을 나타낸다.

실시예 6 알츠하이머병 모델 마우스의 대뇌피질 Aβ42 침착을 감소시키는 플라스미노겐

20마리의 8주령 수컷 C57 마우스를 취하고, 모델링 전에 무게를 측정하며, 체중이 비정상인 마우스를 제거한 후 모든 마우스를 랜덤으로 두 그룹으로 나누었는 바, 비히클군 및 투여군으로 각 그룹은 10마리이다. 모든 마우스를 마취시키고, 마우스의 뇌 입체 해부도에 따라 해마의 과립층(브레그마에 따른 좌표 정위: AP-2.0 mm, ML±1.5 mm, DV 2.0 mm)에 정위시키며, 각 마우스의 양측에 천천히 미량으로 주사하고, 주사 속도는 0.5 μL/min이며, 주사 부피는 3 μL이고, 모델군 마우스에 Aβ1-42 올리고머 용액을 주사하여, 알츠하이머 모델을 구축하며^[3], 모델 대조군 마우스에 PBS 용액을 주사하였다. Aβ1-42 올리고머 용액의 제조(10 μM): β-Amyloid(1-42)(Shanghai Qiangyao Biotechnology Co., Ltd, 04010011521)를 취하고, 냉각된 헥사플루오로이소프로판올을 첨가하며, 제조 농도는 1 mg/mL이고, 실온에서 3일 동안 배치하며, 45 μL/튜브, 즉 10 nmol/mL로 나누어 포장하고, 흄후드에서 밤새 배치하며, 25℃의 건조기에서 1시간 동안 건조시키고, -80℃에서 보관하였다. 사용 시 각 튜브에 10 μl의 디메틸술폭시드 용액을 첨가하여 재용해시키고, 주사 시 990 μL의 멸균 PBS 용액을 첨가하며, 4℃에서 24 h 동안 배치한 후 사용하였다. 뇌 정위 주사 21일 후, 비히클군 및 투여군 마우스는 투여하기 시작하고, 1일차로 기록하며, 투여군 마우스는 1 mg/0.1 ml/마리/일에 따라 플라스미노겐을 꼬리 정맥 주사하고, 비히클군 마우스는 0.1 ml/마리/일에 따라 비히클(4％ 아르기닌+2％ 글리신 용액)을 꼬리 정맥 주사하며, 28일 동안 연속 투여하였다. 29일차에 마우스를 희생시키고 뇌를 취하여 10％ 포름알데히드에 24 ~ 48시간 동안 고정시켰다. 고정된 뇌 조직을 알코올 구배로 탈수하고 자일렌으로 투명하게 한 다음 파라핀 포매를 수행하였다. 절편 흑질을 정위하고, 절편의 두께는 4 μm이며, 절편을 탈납 및 재수화하고 물로 1회 세척하였다. PAP 펜으로 조직에 동그라미를 치고, 3％ 과산화수소로 15분 동안 배양하며, 0.01 M의 PBS로 매회 5분씩 2회 세척하였다. 5％ 정상 염소 혈청액(Vector laboratories,Inc.,USA)으로 30분 동안 차단하고; 시간이 다 되면 염소 혈청을 버리고, 토끼 항 마우스 Aβ42 항체(Abcam,ab201060)를 적가하여 4℃에서 밤새 배양하며, 0.01 M의 PBS로 매회 5분씩 2회 세척하였다. 염소 항 토끼 IgG(HRP) 항체(Abcam) 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 배양하고, 0.01 M의 PBS로 매회 5분씩 2회 세척하였다. DAB 키트(Vector laboratories,Inc.,USA)에 따라 발색하고, 물로 3회 세척한 다음 헤마톡실린으로 30초 동안 대조염색하며, 흐르는 물로 5분 동안 세척하였다. 구배 알코올로 탈수하고 자일렌으로 투명하게 한 다음 중성 검으로 절편을 밀봉하며, 절편은 200배 광학 현미경으로 관찰하였다.

β-아밀로이드 단백질(amyloid β-protein,Aβ)의 신경 독성 작용은 알츠하이머병의 진행에 주요한 작용을 발휘한다^[4].

상기 실험 결과에 따르면, 비히클군(도 8의 A) 마우스의 대뇌피질 Aβ42 침착 수준은 투여군(도 8의 B)보다 유의하게 높고, 광학 밀도의 정량적 분석 결과는 통계학적 차이가 현저하다(*는 P<0.05를 나타냄)(도 8의 C). 이는 플라스미노겐이 알츠하이머병 모델 마우스의 대뇌피질 Aβ42 침착을 감소시킬 수 있음을 나타낸다.

실시예 7 알츠하이머병 모델 마우스의 뇌 조직 내 Aβ42 수준을 감소시키는 플라스미노겐

B6SJL-Tg(APPSwFlLon, PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax 마우스 품종 번호: 034840, Jackson 실험실에서 구입)와 C57BL/6J 마우스를 1회 역교배시켜 래트(B6-F1-FAD라고 약칭함)를 번식시켰다. 18마리의 16 ~ 17주령 암컷 B6-F1-FAD 마우스 및 9마리의 9주령 C57BL/6J 암컷 마우스를 취하였다. B6-F1-FAD를 체중 및 Y 미로 실험 검출 결과에 따라 두 그룹으로 나누었는 바, 비히클군 및 투여군으로 각 그룹은 9마리이다. 9마리의 C57BL/6J를 블랭크 대조군으로 사용하였다. 그룹을 나눈 후, 블랭크 대조군 마우스와 비히클군 마우스에 비히클(4％ 아르기닌+2％ 글리신 용액)을 꼬리 정맥 주사하고, 각 마우스의 주사량은 5 ml/kg이다. 투여군 마우스에 플라스미노겐을 꼬리 정맥 주사하고, 각 마우스의 주사 용량은 50 mg/kg이며, 8일 동안 연속 주사하였다. 투여 종료 5일 후, 블랭크군, 비히클군, 투여군의 마우스를 각각 랜덤으로 7, 7, 6마리 취하여 희생시키고, 뇌 조직을 취한 다음, 4℃에서 균질화하고 상층액, 즉 균질액을 취하여 BCA 방법으로 총 단백질 농도 검출 및 Western blot 검출을 수행하였다.

Tris-Tricine-SDS-PAGE 겔 제조 키트(Solarbio, P1320)의 겔 조제 지침에 따라 16.5％ 겔을 제조하였다. 각 그룹의 샘플은 각각 4×로딩 완충(TaKaRa, e2139)과 3:1의 부피비로 골고루 혼합한 다음, 100℃에서 5 min 동안 가열하고, 냉각 후 2 min 동안 원심분리하며, 그 다음 100 ug의 총 단백질을 로딩하였다. 전기영동 조건은 30 V에서 1.5 h 동안 실행한 다음, 100 V에서 겔 바닥까지 전기영동하는 것이다. 전기영동 후 겔을 벗겨내고 PVDF 필름(GE, A29433753)에 전이하며, 전기영동 조건은 15 V, 2.5 h이다. 전이된 PVDF 필름을 차단 용액(5％ 탈지 에멀션)에 담그고 4℃의 냉장고에서 밤새 차단하며, TBST(0.01 M의 Tris-NaCl, pH 7.6 완충액)로 4회 세척한 다음, 토끼 항 마우스 Aβ42 항체(Abcam, ab201060)를 첨가하고 실온에서 2 h 동안 배양하며, TBST로 4회 세척한 다음, 염소 항 토끼 IgG(HRP) 항체(Abcam, ab6721) 2차 항체를 첨가하고 실온에서 1 h 동안 배양하며, TBST로 4회 세척한 다음, PVDF 필름을 깨끗한 이미징 플레이트에 놓고, Immobilon Western HRP Substrate(MILLIPORE, WBKLS0100)를 첨가하여 발색하며, 바이오 분자 이미지 분석기로 촬영하고 Image J로 정량적 분석하였다.

결과에 따르면, 블랭크 대조군 마우스의 뇌 균질액에는 일정한 수준의 Aβ42 단백질이 있고, 비히클군 마우스의 뇌 조직 내 Aβ42 수준은 투여군 마우스보다 유의하게 높으며, 통계적 P 값은 0.09이다(도 9). 이는 플라스미노겐이 알츠하이머병 모델 마우스의 뇌 조직 내 Aβ42 수준을 감소시킬 수 있음을 나타낸다.

실시예 8 정상 마우스의 뇌 균질액에서 Tau 단백질의 분해를 촉진하는 플라스미노겐

18 ~ 25 g의 11 ~ 12 주령 C57BL/6J 수컷 마우스를 4마리 취하여 희생시킨 다음 전체 뇌를 취하여 무게를 측정하고, 150 mg 조직/mL의 PBS에 따라 각각 1×PBS(Thermo Fisher, pH 7.4; 10010-031)를 첨가한 다음, 4℃에서 균질화(1 min/회, 3 ~ 4회)하며, 균질화한 후 4℃에서 원심분리(12000 rpm, 20min)하고, 상층액, 즉 뇌 균질액을 취하여 새로운 EP 튜브에 넣었다.

Eppendorf(EP) 튜브를 취하여 각각 ① 블랭크군, ② 블랭크 대조군, ③ 비히클 대조군, ④ 플라스미노겐군으로 설정하고, 각 그룹에 5개의 평행 그룹을 설정하였다. 블랭크군에 21.5 μL의 생리식염수, 4.6 μL의 비히클 용액(10 mM의 시트르산나트륨, 2％ 아르기닌염산염, 3％ 만니톨, pH 7.4), 23.9 μL의 마우스 뇌 균질액을 첨가하고; 블랭크 대조군에 21.5 μL의 생리식염수, 4.6 μL의 플라스미노겐 용액(0.5 mg/mL), 23.9 μL의 마우스 뇌 균질액을 첨가하며; 비히클 대조군에 21.5 μL의 Tau 단백질 용액(Nanjing Jinsirui Biotechnology Co., Ltd, 인간 Tau 단백질의 맞춤 제작 및 발현, UniProtKB-P10636-8, 1.0 mg/mL), 4.6 μL의 비히클 용액, 23.9 μL의 마우스 뇌 균질액을 첨가하고; 플라스미노겐군에 21.5 μL의 Tau 단백질 용액(1.0 mg/mL), 4.6 μL의 플라스미노겐 용액(0.5 mg/mL), 23.9 μL의 마우스 뇌 균질액을 첨가하였다. 각 그룹의 샘플을 첨가한 후, 37℃에서 6 h 동안 배양하고 50 μL의 0.1％ 트리플루오로아세트산 용액을 첨가하여 반응을 종결시켰다.

SDS-PAGE 겔 조제 지침에 따라 10％ 겔을 제조하였다. 각 그룹의 샘플은 각각 4×로딩 완충(TaKaRa, e2139)과 3:1의 부피비로 골고루 혼합한 다음, 100℃에서 5 min 동안 가열하고, 냉각 후 2 min 동안 원심분리하며, 그 다음 20 μL의 샘플을 로딩하였다. 전기영동 조건은 30 V에서 45 min 동안 실행한 다음, 100 V에서 겔 바닥까지 전기영동하는 것이다. 전기영동 후 겔을 벗겨내고 활성화된 PVDF 필름(GE, A29433753)에 전이하며, 전기영동 조건은 15 V, 2.5 h이다. 전이된 PVDF 필름을 차단 용액(5％ 탈지 에멀션)에 담그고 4℃의 냉장고에서 밤새 차단하며, TBST(0.01 M의 Tris-NaCl, pH 7.6 완충액)로 4회 세척한 다음, 토끼 유래 Tau 단백질 항체(Abcam, ab151559)를 첨가하고 실온에서 2 h 동안 배양하며, TBST로 4회 세척한 다음, 염소 항 토끼 IgG(HRP) 항체(Abcam, ab6721) 2차 항체를 첨가하고 실온에서 1 h 동안 배양하며, TBST로 4회 세척한 다음, PVDF 필름을 깨끗한 이미징 플레이트에 놓고, Immobilon Western HRP Substrate(MILLIPORE, WBKLS0100)를 첨가하여 발색하며, 바이오 분자 이미지 분석기로 촬영하고 Image J로 정량적 분석하였다.

Tau 단백질은 함량이 가장 높은 미세소관 관련 단백질이다. Tau 단백질은 인산기 함유 단백질로, 정상적인 성숙 뇌에서 Tau 단백질 분자는 2 ~ 3개의 인산기를 포하한다. 알츠하이머병(노인성 치매) 환자의 뇌에서 Tau 단백질은 비정상적으로 과도하게 인산화되어, 분자당 Tau 단백질은 5 ~ 9개의 인산기를 포함할 수 있고, 정상적인 생리학적 기능을 상실한다^[5].

결과에 따르면, 정상 마우스의 뇌 균질액에서 플라스미노겐군의 Tau 단백질의 양은 비히클 대조군보다 유의하게 낮고, 차이가 현저하다(*는 P<0.05를 나타내고, **는 P<0.01을 나타내며, ***는 P<0.001을 나타냄)(도 10). 이는 플라스미노겐이 정상 마우스의 뇌 균질액에서 Tau 단백질의 분해를 촉진할 수 있음을 나타낸다.

실시예 9 알츠하이머병 마우스의 뇌 균질액에서 Tau 단백질의 분해를 촉진하는 플라스미노겐

11주령 B6SJLTg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799 Vas/Mmjax(FAD)(Stock Number: 034840)(FAD라고 약칭함) 마우스를 각각 4마리 선택하고 희생시킨 다음 전체 뇌를 취하여 무게를 측정하며, 실시예 8에 따라 뇌 균질액을 제조하여 EP 튜브에 넣었다.

Eppendorf(EP) 튜브를 취하여 각각 ① 블랭크군, ② 블랭크 대조군, ③ 비히클 대조군, ④ 플라스미노겐군으로 설정하고, 각 그룹에 5개의 평행 그룹을 설정하였다. 블랭크군에 21.5 μL의 생리식염수, 4.6 μL의 비히클 용액(10 mM의 시트르산나트륨, 2％ 아르기닌염산염, 3％ 만니톨, pH 7.4), 23.9 μL의 마우스 뇌 균질액을 첨가하고; 블랭크 대조군에 21.5 μL의 생리식염수, 4.6 μL의 플라스미노겐 용액(0.5 mg/mL), 23.9 μL의 마우스 뇌 균질액을 첨가하며; 비히클 대조군에 21.5 μL의 Tau(Nanjing Jinsirui Biotechnology Co., Ltd, 인간 Tau 단백질의 맞춤 제작 및 발현, UniProtKB-P10636-8, 1.0 mg/mL), 4.6 μL의 비히클 용액, 23.9 μL의 마우스 뇌 균질액을 첨가하고; 플라스미노겐군에 21.5 μL의 Tau(1.0 mg/mL), 4.6 μL의 플라스미노겐 용액(0.5 mg/mL), 23.9 μL의 마우스 뇌 균질액을 첨가하였다. 각 그룹의 샘플을 첨가한 후, 37℃에서 6 h 동안 배양하고 50 μL의 0.1％ 트리플루오로아세트산 용액을 첨가하여 반응을 종결시켰다.

SDS-PAGE 겔 조제 지침에 따라 10％ 겔을 제조하였다. 각 그룹의 샘플은 각각 4×로딩 완충(TaKaRa, e2139)과 3:1의 부피비로 골고루 혼합한 다음, 100℃에서 5 min 동안 가열하고, 냉각 후 2 min 동안 원심분리하며, 그 다음 20 μL의 샘플을 로딩하였다. 전기영동 조건은 30 V에서 45 min 동안 실행한 다음, 100 V에서 겔 바닥까지 전기영동하는 것이다. 전기영동 후 겔을 벗겨내고 활성화된 PVDF 필름(GE, A29433753)에 전이하고, 전기영동 조건은 15 V, 2.5 h이다. 전이된 PVDF 필름을 차단 용액(5％ 탈지 에멀션)에 담그고 4℃의 냉장고에서 밤새 차단하며, TBST(0.01 M의 Tris-NaCl, pH 7.6 완충액)로 4회 세척한 다음, 토끼 유래 Tau 단백질 항체(Abcam, ab151559)를 첨가하고 실온에서 2 h 동안 배양하며, TBST로 4회 세척한 다음, 염소 항 토끼 IgG(HRP) 항체(Abcam, ab6721) 2차 항체를 첨가하고 실온에서 1 h 동안 배양하며, TBST로 4회 세척한 다음, PVDF 필름을 깨끗한 이미징 플레이트에 놓고, Immobilon Western HRP Substrate(MILLIPORE, WBKLS0100)를 첨가하여 발색하며, 바이오 분자 이미지 분석기로 촬영하고 Image J로 정량적 분석하였다.

결과에 따르면, 알츠하이머병 마우스의 뇌 균질액에서 플라스미노겐군의 Tau 단백질의 양이 비히클 대조군보다 유의하게 낮고, 통계학적 차이가 현저하다(*는 P<0.05를 나타내고, **는 P<0.01을 나타냄)(도 11). 이는 플라스미노겐이 알츠하이머병 마우스의 뇌 균질액 내 Tau 단백질의 분해를 촉진할 수 있음을 나타낸다.

실시예 10 알츠하이머병 모델 마우스의 뇌 조직 내 Tau 단백질 수준을 감소시키는 플라스미노겐

B6SJL-Tg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax 마우스 품종 번호: 034840, Jackson 실험실에서 구입)와 C57BL/6J 마우스를 3회 역교배시켜 래트(B6-F3-FAD라고 약칭함)를 번식시켰다. 18마리의 20 ~ 25주령 암컷 B6-F3-FAD 마우스 및 9마리의 9주령 C57BL/6J 암컷 마우스를 취하였다. B6-F3-FAD를 체중 및 Y 미로 실험 검출 결과에 따라 두 그룹으로 나누었는 바, 비히클군 및 투여군으로 각 그룹은 9마리이다. 9마리의 C57BL/6J를 블랭크 대조군으로 사용하였다. 그룹을 나눈 후, 블랭크 대조군 마우스와 비히클군 마우스에 비히클(4％ 아르기닌+2％ 글리신 용액)을 꼬리 정맥 주사하고, 각 마우스의 주사량은 5 ml/kg이다. 투여군 마우스에 플라스미노겐을 꼬리 정맥 주사하고, 각 마우스의 주사 용량은 50 mg/kg이며, 28일 동안 연속 주사하였다. 투여 종료 7일 후, 각 그룹에서 마우스를 랜덤으로 취하여 희생시키고, 뇌 조직을 취한 다음, 4℃에서 균질화하고 상층액, 즉 균질액을 취하여 BCA 방법으로 총 단백질 검출 및 Western blot 검출을 수행하였다.

SDS-PAGE 겔 제조 키트(Solarbio, P1320)의 겔 조제 지침에 따라 10％ 겔을 제조하였다. 각 그룹의 샘플은 각각 4×로딩 완충(TaKaRa, e2139)과 3:1의 부피비로 골고루 혼합한 다음, 100℃에서 5 min 동안 가열하고, 냉각 후 2 min 동안 원심분리하며, 그 다음 100 ug의 총 단백질을 로딩하였다. 전기영동 조건은 30 V에서 1.5 h 동안 실행한 다음, 100 V에서 겔 바닥까지 전기영동하는 것이다. 전기영동 후 겔을 벗겨내고 PVDF 필름(GE, A29433753)으로 전이하며, 전기영동 조건은 15 V, 2.5 h이다. 전이된 PVDF 필름을 차단 용액(5％ 탈지 에멀션)에 담그고 4℃의 냉장고에서 밤새 차단하며, TBST(0.01 M의 Tris-NaCl, pH 7.6 완충액)로 4회 세척한 다음, 토끼 항 마우스 Tau 항체(Abcam, ab151559)를 첨가하고 실온에서 2 h 동안 배양하며, TBST로 4회 세척한 다음, 염소 항 토끼 IgG(HRP) 항체(Abcam, ab6721) 2차 항체를 첨가하고 실온에서 1 h 동안 배양하며, TBST로 4회 세척한 다음, PVDF 필름을 깨끗한 이미징 플레이트에 놓고, Immobilon Western HRP Substrate(MILLIPORE, WBKLS0100)를 첨가하여 발색하며, 바이오 분자 이미지 분석기로 촬영하고 Image J로 정량적 분석하였다.

결과에 따르면, 블랭크 대조군 마우스의 뇌 균질액에는 일정한 수준의 상이한 분자량의 Tau 단백질이 있고; 투여군 마우스의 뇌 조직 내 각 분자량의 Tau 단백질 및 총 Tau 단백질 수준은 비히클군 마우스보다 유의하게 낮으며, 두 그룹의 35 kd, 35 ~ 40 kd, 40 kd, 54 kd의 분자량의 Tau 단백질 수준 및 총 Tau 단백질 수준의 통계적 분석 P 값은 각각 0.174, 0.0406, 0.052, 0.067 및 0.055이다(도 12). 이는 플라스미노겐이 알츠하이머병 모델 마우스의 뇌 조직 내 Tau 단백질의 분해를 촉진할 수 있음을 나타낸다.

실시예 11 알츠하이머병 모델 마우스의 뇌 균질액에서 Pro-BDNF 절단을 촉진하는 플라스미노겐

11주령 B6SJLTg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799 Vas/Mmjax(FAD)(Stock Number: 034840)(FAD라고 약칭함) 마우스를 각각 4마리 선택하고, 희생시킨 후 전체 뇌 조직을 취하며, 상기와 같이 뇌 균질액을 제조하여 EP 튜브에 넣었다.

Eppendorf(EP) 튜브를 취하여 각각 ① 블랭크군, ② 블랭크 대조군, ③ 비히클 대조군, ④ 투여군으로 설정하고, 각 그룹에 5개의 평행 그룹을 설정하였다. 블랭크군에 21.5 μL의 생리식염수, 4.6 μL의 비히클 용액(10 mM의 시트르산나트륨, 2％ 아르기닌염산염, 3％ 만니톨, pH 7.4), 23.9 μL의 마우스 뇌 균질액을 첨가하고; 블랭크 대조군에 21.5 μL의 생리식염수, 4.6 μL의 플라스미노겐 용액(2 mg/mL), 23.9 μL의 마우스 뇌 균질액을 첨가하며; 비히클 대조군에 21.5 μL의 Pro-BDNF(Nanjing Jinsirui Biotechnology Co., Ltd, 맞춤 제작 및 발현, UniProtKB-P23560, 1.0 mg/mL), 4.6 μL의 비히클 용액(시트르산-시트르산나트륨 용액), 23.9 μL의 마우스 뇌 균질액을 첨가하고; 플라스미노겐군에 21.5 mL의 Pro-BDNF(1.0 mg/mL), 4.6 μL의 플라스미노겐 용액(2 mg/mL), 23.9 μL의 마우스 뇌 균질액을 첨가하였다. 각 그룹의 샘플을 첨가한 후, 37℃에서 6 h 동안 배양하고 50 μL의 0.1％ 트리플루오로아세트산 용액을 첨가하여 반응을 종결시켰다.

SDS-PAGE의 겔 조제 지침에 따라 12％ 겔을 제조하였다. 각 그룹의 샘플은 각각 4×로딩 완충(TaKaRa, e2139)과 3:1의 부피비로 골고루 혼합한 다음, 100℃에서 5 min 동안 가열하고, 냉각 후 2 min 동안 원심분리하며, 그 다음 20 μL의 샘플을 로딩하였다. 전기영동 조건은 30 V에서 45 min 동안 실행한 다음, 100 V에서 겔 바닥까지 전기영동하는 것이다. 전기영동 후 겔을 벗겨내고 1‰ 쿠마시 브릴리언트 블루 염색액(1 g의 쿠마시 브릴리언트 블루 R250을 부피비가 5:2:13인 1000 ml의 에탄올:빙초산:정제수의 혼합액에 용해시킴)에서 30 min 동안 염색한 다음, 탈색액(정제수:빙초산:무수 에탄올＝17:2:1 부피비 혼합)으로 깨끗해질 때까지 탈색하였다. 겔은 바이오 분자 이미지 분석기로 촬영하고 정량적으로 스캐닝 및 분석하였다.

뇌 유래 신경 영양 인자(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)는 분자량이 12.3 kD인 알칼리성 단백질의 일종으로, 119개의 아미노산 잔기로 구성되고, 3쌍의 이황화 결합을 포함하며, 체내에서 이량체의 형태로 존자하고, BDNF 전구체의 형태로 합성되며, BDNF 전구체(Pro-BDNF)는 효소 분해 작용을 통해 절단되어 성숙한 BDNF를 형성할 수 있다. 문헌에는 Pro-BDNF가 절단되어 형성된 성숙한 BDNF와 반대 작용을 갖는다는 것이 보고되어 있다. Pro-BDNF는 신경 세포 사멸을 촉진하고, 시냅스의 가소성을 감소시킨다^[6]. 성숙한 BDNF 및 이의 수용체는 중추신경계 내에 널리 분포되고, 중추신경계 발육 과정에서 뉴런의 생존, 분화, 성장 및 발육에 중요한 작용을 하며, 뉴런이 손상되어 사멸되는 것을 방지하고 뉴런의 병리학적 상태를 개선하며 손상된 뉴런의 재생 및 분화 등 생물학적 효과를 촉진할 수 있고, 성숙한 중추 및 말초 신경계의 생존 및 정상적인 생리학적 기능을 유지하는 데 필수적인 것이다^[7].

결과에 따르면, 알츠하이머병 모델 마우스의 뇌 균질액에서 플라스미노겐군의 Pro-BDNF의 양은 비히클 대조군보다 유의하게 낮고, 차이가 매우 현저하다(*는 P<0.05를 나타내고, ***는 P<0.001을 나타냄)(도 13). 이는 플라스미노겐이 알츠하이머병 모델 마우스의 뇌 균질액 내 Pro-BDNF의 절단을 촉진할 수 있음을 나타낸다.

실시예 12 알츠하이머병 모델 마우스의 뇌 균질액에서 Pro-BDNF의 절단을 촉진하여 성숙한 BDNF를 형성하는 플라스미노겐

11주령 B6SJLTg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799 Vas/Mmjax(FAD)(Stock Number: 034840)(FAD라고 약칭함) 마우스를 각각 4마리 선택하고, 희생시킨 후 전체 뇌 조직을 취하며, 상기와 같이 뇌 균질액을 제조하여 EP 튜브에 넣었다.

Eppendorf(EP) 튜브를 취하여 각각 ① 블랭크군, ② 블랭크 대조군, ③ 비히클 대조군, ④ 투여군으로 설정하고, 각 그룹에 5개의 평행 그룹을 설정하였다. 블랭크군에 21.5 μL의 생리식염수, 4.6 μL의 비히클 용액(10 mM의 시트르산나트륨, 2％ 아르기닌염산염, 3％ 만니톨, pH 7.4), 23.9 μL의 마우스 뇌 균질액을 첨가하고; 블랭크 대조군에 21.5 μL의 생리식염수, 4.6 μL의 플라스미노겐 용액(2 mg/mL), 23.9 μL의 마우스 뇌 균질액을 첨가하며; 비히클 대조군에 21.5 μL의 Pro-BDNF(Nanjing Jinsirui Biotechnology Co., Ltd, 맞춤 제작 및 발현, UniProtKB-P23560, 1.0 mg/mL), 4.6 μL의 비히클 용액(시트르산-시트르산나트륨 용액), 23.9 μL의 마우스 뇌 균질액을 첨가하고; 플라스미노겐군에 21.5 mL의 Pro-BDNF(1.0 mg/mL), 4.6 μL의 플라스미노겐 용액(2 mg/mL), 23.9 μL의 마우스 뇌 균질액을 첨가하였다. 각 그룹의 샘플을 첨가한 후, 37℃에서 6 h 동안 배양하고 50 μL의 0.1％ 트리플루오로아세트산 용액을 첨가하여 반응을 종결시켰다.

SDS-PAGE의 겔 조제 지침에 따라 12％ 겔을 제조하였다. 각 그룹의 샘플은 각각 4×로딩 완충(TaKaRa, e2139)과 3:1의 부피비로 골고루 혼합한 다음, 100℃에서 5 min 동안 가열하고, 냉각 후 2 min 동안 원심분리하며, 그 다음 20 μL의 샘플을 로딩하였다. 전기영동 조건은 30 V에서 45 min 동안 실행한 다음, 100 V에서 겔 바닥까지 전기영동하는 것이다. 전기영동 후 겔을 벗겨내고 PVDF 필름(GE, A29433753)으로 전이하며, 전기영동 조건은 15 V, 2.5 h이다. 전이된 PVDF 필름을 차단 용액(5％ 탈지 에멀션)에 담그고 4℃의 냉장고에서 밤새 차단하며, TBST(0.01 M의 Tris-NaCl, pH 7.6 완충액)로 4회 세척한 다음, 토끼 항 인간 BDNF 항체(Boster Biological Technology, PB9075)를 첨가하고 실온에서 3 h 동안 배양하며, TBST로 4회 세척한 다음, 염소 항 토끼 IgG(HRP) 항체(Abcam, ab6721) 2차 항체를 첨가하고 실온에서 1 h 동안 배양하며, TBST로 4회 세척한 다음, PVDF 필름을 깨끗한 이미징 플레이트에 놓고, Immobilon Western HRP Substrate(MILLIPORE, WBKLS0100)를 첨가하여 발색하며, 바이오 분자 이미지 분석기로 촬영하고 Image J로 밴드 광학 밀도를 정량적 분석하였다.

결과에 따르면, 알츠하이머병 모델 마우스의 뇌 균질액에서 플라스미노겐군의 Pro-BDNF의 양은 비히클 대조군보다 유의하게 낮고, 차이가 매우 현저하며(**는 P<0.01을 나타내고, ***는 P<0.001을 나타냄); 플라스미노겐군의 BDNF의 양은 비히클 대조군보다 유의하게 높고, 차이가 매우 현저하다(도 14). 이는 플라스미노겐이 알츠하이머병 모델 마우스의 뇌 균질액 Pro-BDNF의 절단 및 성숙한 BDNF의 형성을 촉진할 수 있음을 나타낸다.

실시예 13 알츠하이머병 모델 마우스의 해마 BDNF의 발현을 촉진하는 플라스미노겐

23마리의 24주령 수컷 C57 마우스를 취하고, 모델링 전에 무게를 측정하며, 체중이 비정상인 마우스를 제거한 후 모든 마우스를 랜덤으로 두 그룹으로 나누었는 바, 블랭크 대조군 7마리와 모델군 16마리이다.

모든 마우스를 마취시키고, 실시예 6과 같이 알츠하이머 모델을 구축하였다^[3]. 뇌 정위 주사 28일 후, 모든 마우스에 대해 체중 및 Y 미로 검출을 수행하고, 검출 결과에 따라 블랭크 대조군, 모델군의 비정상 마우스를 제거하며, 여기서 모델군 마우스를 랜덤으로 두 그룹으로 나누었는 바, 비히클군 6마리와 투여군 7마리이고, 블랭크 대조군은 6마리이다. 비히클군 및 투여군 마우스는 투여하기 시작하고, 1일차로 기록하며, 투여군 마우스는 1 mg/0.1 ml/마리/일에 따라 플라스미노겐을 꼬리 정맥 주사하고, 비히클군 마우스는 0.1 ml/마리/일에 따라 비히클(4％ 아르기닌+2％ 글리신 용액)을 꼬리 정맥 주사하며, 28일 동안 연속 투여하고, 블랭크 대조군 마우스는 투여 처리를 하지 않았다. 29일차에 마우스를 희생시키고 뇌를 취하여 10％ 포름알데히드에 24 ~ 48시간 동안 고정시켰다. 고정된 뇌 조직을 알코올 구배로 탈수하고 자일렌으로 투명하게 한 다음 파라핀 포매를 수행하였다. 절편 흑질을 정위하고, 절편의 두께는 4 μm이며, 절편을 탈납 및 재수화하고 물로 1회 세척하였다. PAP 펜으로 조직에 동그라미를 치고, 3％ 과산화수소로 15분 동안 배양하며, 0.01 M의 PBS로 매회 5분씩 2회 세척하였다. 5％ 정상 염소 혈청액(Vector laboratories,Inc.,USA)으로 30분 동안 차단하고; 시간이 다 되면 염소 혈청을 버리고, 토끼 항 마우스 BDNF 항체(BosterBio, PB9075)를 적가하여 4℃에서 밤새 배양하며, 0.01 M의 PBS로 매회 5분씩 2회 세척하였다. 염소 항 토끼 IgG(HRP) 항체(Abcam) 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 배양하고, 0.01 M의 PBS로 매회 5분씩 2회 세척하였다. DAB 키트(Vector laboratories,Inc.,USA)에 따라 발색하고, 물로 3회 세척한 다음 헤마톡실린으로 30초 동안 대조염색하며, 흐르는 물로 5분 동안 세척하였다. 구배 알코올로 탈수하고 자일렌으로 투명하게 한 다음 중성 검으로 절편을 밀봉하며, 절편은 200배 광학 현미경으로 관찰하였다.

결과에 따르면, 블랭크 대조군(도 15의 A) 마우스의 해마는 일정한 수준의 BDNF(화살표로 표시)를 발현하고, 비히클군(도 15의 B) 마우스의 해마 BDNF의 발현은 블랭크 대조군보다 유의하게 적으며, 투여군(도 15의 C) 마우스의 해마 BDNF의 발현은 비히클군보다 유의하게 높고, 통계학적 차이가 현저하다(*는 P<0.05를 나타냄)(도 15의 D). 이는 플라스미노겐이 알츠하이머병 모델 마우스의 해마 BDNF의 발현을 촉진할 수 있음을 나타낸다.

실시예 14 알츠하이머병 모델 마우스의 뇌 균질액에서 Pro-NGF의 절단을 촉진하여 성숙한 NGF를 형성하는 플라스미노겐

11주령 B6SJLTg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799 Vas/Mmjax(FAD)(Stock Number: 034840)(FAD라고 약칭함) 마우스를 각각 4마리 선택하고, 희생시킨 후 전체 뇌 조직을 취하며, 상기와 같이 뇌 균질액을 제조하여 EP 튜브에 넣었다.

Eppendorf(EP) 튜브를 취하여 각각 ① 블랭크 대조군, ② 블랭크군, ③ 비히클 대조군, ④ 플라스미노겐군으로 설정하고, 각 그룹에 5개의 평행 그룹을 설정하였다. 블랭크 대조군에 21.5 μL의 생리식염수, 4.6 μL의 비히클 용액(10 mM의 시트르산나트륨, 2％ 아르기닌염산염, 3％ 만니톨, pH 7.4), 23.9 μL의 마우스 뇌 균질액을 첨가하고; 블랭크군에 21.5 μL의 생리식염수, 4.6 μL의 플라스미노겐 용액(2 mg/mL), 23.9 μL의 마우스 뇌 균질액을 첨가하며; 비히클 대조군에 21.5 μL의 Pro-NGF 용액(Nanjing Jinsirui Biotechnology Co., Ltd, 인간 Pro-NGF의 맞춤 제작 및 발현, 서열 유래 UniProtKB-P01138, 1.0 mg/mL), 4.6 μL의 비히클 용액, 23.9 μL의 마우스 뇌 균질액을 첨가하고; 플라스미노겐군에 21. μL의 Pro-NGF 용액(1.0 mg/mL), 4.6 μL의 플라스미노겐 용액(2 mg/mL), 23.9 μL의 마우스 뇌 균질액을 첨가하였다. 각 그룹의 샘플을 첨가한 후, 37℃에서 6 h 동안 배양하고 50 μL의 0.1％ 트리플루오로아세트산 용액을 첨가하여 반응을 종결시켰다.

SDS-PAGE의 겔 조제 지침에 따라 15％ 겔을 제조하였다. 각 그룹의 샘플은 각각 4×로딩 완충(TaKaRa, e2139)과 3:1의 부피비로 골고루 혼합한 다음, 100℃에서 5 min 동안 가열하고, 냉각 후 2 min 동안 원심분리하며, 그 다음 20 μL의 샘플을 로딩하였다. 전기영동 조건은 30 V에서 30 min 동안 실행한 다음, 100 V에서 겔 바닥까지 전기영동하는 것이다. 전기영동 후 겔을 벗겨내고 활성화된 PVDF 필름(GE, A29433753)에 전이하며, 전기영동 조건은 15 V, 2.5 h이다. 전이된 PVDF 필름을 차단 용액(5％ 탈지 에멀션)에 담그고 4℃의 냉장고에서 밤새 차단하며, TBST(0.01 M의 Tris-NaCl, pH 7.6 완충액)로 4회 세척한 다음, 토끼 항 인간 NGF 항체(Abcam, ab52918)를 첨가하고 실온에서 2 h 동안 배양하며, TBST로 4회 세척한 다음, 염소 항 토끼 IgG(HRP) 항체(Abcam, ab6721) 2차 항체를 첨가하고 실온에서 1 h 동안 배양하며, TBST로 4회 세척한 다음, PVDF 필름을 깨끗한 이미징 플레이트에 놓고, Immobilon Western HRP Substrate(MILLIPORE, WBKLS0100)를 첨가하여 발색하며, 바이오 분자 이미지 분석기로 촬영하고 Image J로 밴드 광학 밀도를 정량적 분석하였다.

신경 성장 인자(Nerve growth factor, NGF)는 신경 영양 인자 패밀리의 중요한 구성원이다. 체내에서 전구체 형태로 합성되고, 신호 펩티드, 선도 펩티드 및 성숙 펩티드를 포함한다. 연구에서는 신경 성장 인자의 NGF 전구체(Pro-NGF)가 절단되어 형성된 NGF와 반대 작용을 한다는 것을 보고하였다. Pro-NGF는 신경 세포 사멸을 촉진할 수 있다. 성숙한 NGF는 신경 세포의 성장, 발육, 분화, 생존 및 손상 후 재복구 등 과정에 관여하고, 중추 및 말초 뉴런의 기능적 발현에 대해서도 중요한 조절 작용을 한다^[8].

결과에 따르면, 알츠하이머병 모델 마우스의 뇌 균질액에서 플라스미노겐 투여군의 Pro-NGF의 양은 비히클 대조군보다 유의하게 낮고, 차이가 매우 현저하며(***는 P<0.001을 나타냄); 플라스미노겐군의 NGF의 양은 비히클 대조군보다 유의하게 높고, 차이가 현저하다(도 16). 이는 플라스미노겐이 알츠하이머병 모델 마우스의 뇌 균질액 내 Pro-NGF의 절단 및 성숙한 NGF의 형성을 촉진할 있음을 나타낸다.

실시예 15 알츠하이머병 모델 마우스의 불안, 우울 행동 회복을 촉진하는 플라스미노겐

28마리의 수컷 C57 마우스를 취하고, 모델링 전에 무게를 측정하며, 체중이 비정상인 마우스를 제거한 후 모든 마우스를 랜덤으로 두 그룹으로 나누었는 바, 블랭크 대조군 8마리와 모델군 20마리이다. 그룹을 나눈 후, 실시예 6과 같이 알츠하이머 모델을 구축하였다^[3]. 뇌 정위 주사 65일 후, 모든 마우스에 대해 물 미로 검출을 수행하고, 모델 대조군은 블랭크 대조군 마우스이며, 검출 결과에 따라 블랭크 대조군, 모델군의 비정상 마우스를 제거하고, 여기서 모델군 마우스를 랜덤으로 두 그룹으로 나누었는 바, 비히클군 10마리와 투여군 10마리이고, 블랭크 대조군은 8마리이다. 그룹을 나눈 후, 비히클군 및 투여군 마우스는 제1 단계 투여를 시작하였는 바, 투여군 마우스는 50 mg/kg/마리/일에 따라 플라스미노겐을 꼬리 정맥 주사하고, 비히클군 및 블랭크 대조군 마우스는 5 ml/kg 마리/일에 따라 비히클(4％ 아르기닌+2％ 글리신 용액)을 꼬리 정맥 주사하며, 28일 동안 연속 투여하였다. 제1 단계 투여 종료 50일 후 제2 단계 투여를 시작하고, 투여 방식은 제1 단계와 동일하며, 7일 동안 연속 투여하였다. 제2 단계 투여 8일차에 오픈 필드 실험을 수행하였다.

오픈 필드 실험

실험 시, 마우스를 오픈 필드(40×40×40×cm) 바닥면 중앙에 놓는 동시에 촬영 및 시간 측정을 수행하고, 5분 동안 지속적으로 관찰하며, 각 마우스는 3번의 실험을 수행하였다. Smart 시스템은 실험 동물의 행동을 평가하기 위한 완전하고 사용하기 쉬운 비디오 추적 시스템이다. 이는 궤적, 활동, 특정 행동(예를 들어, 회전, 스트레칭 및 먹이 주기) 및 이벤트를 기록하고 다양한 분석 파라미터의 계산을 수행하도록 허용한다. 본 실험은 Smart3.0 시스템을 이용하여 마우스의 운동 상태를 기록하고 분석하며, 파라미터는 경계 영역 총 운동 거리 및 중심 영역 운동 거리를 포함한다. 각 실험에서 후각으로 인한 선호도를 방지하기 위해 70% 알코올을 사용하여 박스를 닦았다^[1].

오픈 필드 실험의 설계 원리는 마우스의 회피성을 기반으로 하는데, 마우스가 개방된 곳, 미지의 곳, 잠재적으로 위험한 곳을 두려워하여, “벽에 붙어” 활동하는 성질을 갖는다는 것을 의미한다. 총 거리 및 평균 속도는 마우스의 자발적 활동을 반영하는 주요 데이터로 간주되고, 회피성은 오픈 필드 주변 영역(4개의 모서리 및 4개의 변두리)에서 마우스의 활동으로 평가되었다. 회피성을 반영하는 주변 영역의 활동 시간으로부터 보다시피 시간이 단축되었으며, 이는 마우스가 “모험적”인 경향이 더 풍부함을 나타낸다. 중앙 영역의 활동 시간이 현저히 증가하였는데, 이는 회피성 및 불안(우울) 수준이 낮음을 나타낸다.

경계 영역 운동 거리 백분율

경계 영역 운동 거리 백분율은 지정된 시간 내 경계 영역에서 마우스의 운동 궤적의 길이와 총 운동 궤적 길이의 비율이다. 결과에 따르면, 블랭크 대조군은 일정한 경계 영역 운동 거리 백분율을 갖고, 비히클군 마우스의 경계 영역 운동 거리 백분율은 블랭크 대조군보다 유의하게 많으며, 투여군 마우스의 경계 영역 운동 거리 백분율은 비히클군보다 유의하게 작고, 통계학적 차이가 유의에 근접한다(P＝0.08)(도 17). 이는 플라스미노겐이 알츠하이머병 모델 마우스의 불안, 우울 행동 회복을 촉진할 수 있음을 나타낸다.

중앙 영역 운동 거리 백분율

중앙 영역 운동 거리 백분율은 지정된 시간 내 중앙 영역에서 마우스의 운동 궤적의 길이와 총 운동 궤적 길이의 비율이다. 결과에 따르면, 블랭크 대조군은 일정한 중앙 영역 운동 거리 백분율을 갖고, 비히클군 마우스의 중앙 영역 운동 거리 백분율은 블랭크 대조군보다 유의하게 작으며, 투여군 마우스의 중앙 영역 운동 거리 백분율은 비히클군보다 유의하게 크고, 통계학적 차이가 유의에 근접한다(P＝0.08)(도 18). 이는 플라스미노겐이 알츠하이머병 모델 마우스의 불안, 우울 행동 회복을 촉진할 수 있음을 나타낸다.

실시예 16 알츠하이머병 모델 마우스의 불안, 우울 행동 회복을 촉진하는 플라스미노겐

28마리의 수컷 C57 마우스를 취하고, 모델링 전에 무게를 측정하며, 체중이 비정상인 마우스를 제거한 후 모든 마우스를 랜덤으로 두 그룹으로 나누었는 바, 블랭크 대조군 8마리와 모델군 20마리이다. 그룹을 나눈 후, 실시예 6과 같이 알츠하이머 모델을 구축하였다^[3]. 뇌 정위 주사 65일 후, 모든 마우스에 대해 물 미로 검출을 수행하고, 모델 대조군은 블랭크 대조군 마우스이며, 검출 결과에 따라 블랭크 대조군, 모델군의 비정상 마우스를 제거하고, 여기서 모델군 마우스를 랜덤으로 두 그룹으로 나누었는 바, 비히클군 10마리와 투여군 10마리이고, 블랭크 대조군은 8마리이다. 그룹을 나눈 후, 비히클군 및 투여군 마우스는 제1 단계 투여를 시작하였는 바, 투여군 마우스는 50 mg/kg/마리/일에 따라 플라스미노겐을 꼬리 정맥 주사하고, 비히클군 및 블랭크 대조군 마우스는 5 ml/kg 마리/일에 따라 비히클(4％ 아르기닌+2％ 글리신 용액)을 꼬리 정맥 주사하며, 28일 동안 연속 투여하였다. 제1 단계 투여 종료 50일 후 제2 단계 투여를 시작하고, 투여 방식은 제1 단계와 동일하며, 9일 동안 연속 투여하였다. 제2 단계 투여 종료 2일 후 높은 십자 미로 행동학 검출을 수행하였다.

높은 십자 미로는 새로운 환경에 대한 동물의 탐색 특성 및 높은 곳에서 팔을 벌리고 있는 것에 대한 두려움으로 인한 모순적인 행동을 이용하여 동물의 불안 상태를 조사하는 것이다. 높은 십자 미로는 한 쌍의 열린 팔과 한 쌍의 닫힌 팔을 갖고, 설치류 동물은 암소기호증으로 인해 닫힌 팔에서 활동하는 경향이 있지만, 호기심과 탐구성으로 인해 열린 팔에서도 활동하며, 새로운 자극에 직면하는 경우 동물은 탐색의 충동과 두려움을 동시에 가지므로, 탐색과 회피의 모순적인 행동을 초래하여, 불안 심리를 일으킨다. 항불안제는 닫힌 팔에 진입하는 횟수 및 시간을 유의하게 증가시킬 수 있고, 지면과 멀리 떨어진 십자 미로는 인간이 절벽 위에 서있는 것과 같기 때문에, 실험 객체는 두려움과 불안 심리를 갖게 된다. 높은 십자 미로는 신약 개발/스크리닝/평가, 약리학, 독성학, 예방의학, 신경생물학, 동물심리학 및 행동생물학 등 다양한 분야의 과학 연구 및 컴퓨터 지원 교육 분야에서 널리 응용되고 있으며, 의과대학 및 과학연구원에서 진행하는 행동학 연구, 특히 불안 및 우울 연구의 고전적 실험이다.

실험 시작 시 마우스를 중앙 그리드에서 닫힌 팔로 향하는 미로에 넣고, 5분 이내의 활동 상태를 기록하였다. 관찰 지표는 열린 팔 진입 횟수(두 앞발이 팔에 진입해야 함), 열린 팔 체류 시간, 닫힌 팔 진입 횟수, 닫힌 팔 체류 시간을 포함한다. 열린 팔 체류 시간 비율, 열린 팔 진입 횟수 비율, 높은 십자 미로의 총 진입 횟수를 계산하였다. 실험이 완료된 후 마우스를 꺼내고, 두 팔을 깨끗이 씻으며, 알코올을 뿌려 냄새를 제거하였다. 마지막으로 동물 행동학 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행하였다.

총 운동 거리

총 운동 거리는 지정된 기록 시간 내 마우스의 총 운동 궤적 길이를 의미한다. 결과에 따르면, 블랭크 대조군은 일정한 총 운동 거리를 갖고; 비히클군의 운동 거리는 블랭크 대조군보다 유의하게 크며; 투여군의 총 운동 거리는 비히클군보다 유의하게 작고, 통계학적 차이가 매우 현저하며(*는 P<0.05를 나타내고, **는 P<0.01을 나타냄))(도 19), 블랭크 대조군 마우스의 운동 거리에 더 근접한다. 이는 플라스미노겐이 알츠하이머병 모델 마우스의 불안, 우울 행동 회복을 촉진할 수 있음을 나타낸다.

닫힌 팔 운동 거리

닫힌 팔 운동 거리는 기정된 시간 내 닫힌 팔 운동 궤적 길이를 의미한다. 결과에 따르면, 블랭크 대조군 마우스는 일정한 닫힌 팔 운동 거리를 갖고; 비히클군의 닫힌 팔 운동 거리는 블랭크 대조군 마우스보다 유의하게 크며; 투여군 마우스의 닫힌 팔 운동 거리는 비히클군보다 유의하게 작고, 두 그룹의 비교 시 통계학적 차이가 현저하며(*는 P<0.05를 나타내고, **는 P<0.01을 나타냄)(도 20), 투여군의 닫힌 팔 운동 거리는 블랭크 대조군에 더 근접한다. 이는 플라스미노겐이 알츠하이머병 모델 마우스의 불안, 우울 행동 회복을 촉진할 수 있음을 나타낸다.

닫힌 팔 운동 거리 백분율

닫힌 팔 운동 거리 백분율은 지정된 시간 내 닫힌 팔 운동 궤적 길이와 총 운동 궤적 길이의 비율을 의미한다. 결과에 따르면, 블랭크 대조군 마우스는 일정한 닫힌 팔 운동 거리 백분율을 갖고; 비히클군의 닫힌 팔 운동 거리 백분율은 블랭크 대조군 마우스보다 유의하게 크며; 투여군 마우스의 닫힌 팔 운동 거리 백분율은 비히클군보다 유의하게 작고, 두 그룹의 비교 시 통계학적 차이가 현저하며(*는 P<0.05를 나타냄)(도 21), 투여군의 닫힌 팔 운동 거리 백분율은 블랭크 대조군에 더 근접한다. 이는 플라스미노겐이 알츠하이머병 모델 마우스의 불안, 우울 행동 회복을 촉진할 수 있음을 나타낸다.

닫힌 팔 진입 횟수

결과에 따르면, 블랭크 대조군 마우스는 일정한 닫힌 팔 진입 횟수를 갖고; 비히클군의 닫힌 팔 진입 횟수는 블랭크 대조군 마우스보다 유의하게 많으며; 투여군 마우스의 닫힌 팔 진입 횟수는 비히클군보다 유의하게 적고, 두 그룹의 비교 시 통계학적 차이가 매우 현저하며(*는 P<0.05를 나타내고, **는 P<0.01을 나타냄)(도 22), 투여군의 닫힌 팔 진입 횟수는 블랭크 대조군에 더 근접한다. 이는 플라스미노겐이 알츠하이머병 모델 마우스의 불안, 우울 행동 회복을 촉진할 수 있음을 나타낸다.

닫힌 팔 시간

닫힌 팔 시간은 지정된 시간 내 닫힌 팔에서 마우스의 체류 시간을 의미한다. 결과에 따르면, 블랭크 대조군 마우스는 일정한 닫힌 팔 시간을 갖고, 비히클군 마우스의 닫힌 팔 체류 시간은 블랭크 대조군보다 유의하게 짧으며, 투여군 마우스의 닫힌 팔 시간은 비히클군보다 유의하게 많고, 두 그룹의 비교 시 통계학적 차이가 현저하며(*는 P<0.05를 나타내고, **는 P<0.01을 나타냄)(도 23), 투여군의 닫힌 팔 시간은 블랭크 대조군에 더 근접한다. 이는 플라스미노겐이 알츠하이머병 모델 마우스의 불안, 우울 행동 회복을 촉진할 수 있음을 나타낸다.

닫힌 팔 시간 백분율

닫힌 팔 시간 백분율은 닫힌 팔에서 마우스의 체류 시간과 총 기록 시간의 비율을 의미한다. 결과에 따르면, 블랭크 대조군 마우스는 일정한 닫힌 팔 시간 백분율을 갖고, 비히클군 마우스의 닫힌 팔 시간 백분율은 블랭크 대조군보다 유의하게 낮으며, 투여군 마우스의 닫힌 팔 시간 백분율은 비히클군보다 유의하게 높고, 이 두 그룹의 비교 시 통계학적 차이가 현저하며(*는 P<0.05를 나타내고, **는 P<0.01을 나타냄)(도 24), 투여군의 닫힌 팔 시간 백분율은 블랭크 대조군에 더 근접한다. 이는 플라스미노겐이 알츠하이머병 모델 마우스의 불안, 우울 행동 회복을 촉진할 수 있음을 나타낸다.

닫힌 팔 평균 속도

닫힌 팔 평균 속도는 닫힌 팔 운동 거리와 닫힌 팔 시간의 비율을 의미한다. 결과에 따르면, 블랭크 대조군은 일정한 닫힌 팔 평균 운동 속도를 갖고, 비히클군의 닫힌 팔 평균 운동 속도는 블랭크 대조군보다 유의하게 크며, 투여군의 닫힌 팔 평균 운동 속도는 비히클군보다 유의하게 작고, 이 두 그룹의 비교 시 통계학적 차이가 매우 현저하며(**는 P<0.01을 나타냄)(도 25), 투여군의 닫힌 팔 평균 운동 속도는 블랭크 대조군에 더 근접한다. 이는 플라스미노겐이 알츠하이머병 모델 마우스의 불안, 우울 행동 회복을 촉진할 수 있음을 나타낸다.

실시예 17 알츠하이머병 모델 마우스의 기억 능력 회복을 촉진하는 플라스미노겐

28마리의 수컷 C57 마우스를 취하고, 모델링 전에 무게를 측정하며, 체중이 비정상인 마우스를 제거한 후 모든 마우스를 랜덤으로 두 그룹으로 나누었는 바, 블랭크 대조군 8마리와 모델군 20마리이다. 그룹을 나눈 후, 실시예 6과 같이 알츠하이머 모델을 구축하였다^[3]. 뇌 정위 주사 65일 후, 모든 마우스에 대해 물 미로 검출을 수행하고, 모델 대조군은 블랭크 대조군 마우스이며, 검출 결과에 따라 블랭크 대조군, 모델군의 비정상 마우스를 제거하고, 여기서 모델군 마우스를 랜덤으로 두 그룹으로 나누었는 바, 비히클군 10마리와 투여군 10마리이고, 블랭크 대조군은 8마리이다. 그룹을 나눈 후, 비히클군 및 투여군 마우스는 제1 단계 투여를 시작하였는 바, 투여군 마우스는 50 mg/kg/마리/일에 따라 플라스미노겐을 꼬리 정맥 주사하고, 비히클군 및 블랭크 대조군 마우스는 5 ml/kg 마리/일에 따라 비히클(4％ 아르기닌+2％ 글리신 용액)을 꼬리 정맥 주사하며, 28일 동안 연속 투여하였다. 제1 단계 투여 종료 50일 후 제2 단계 투여를 시작하고, 투여 방식은 제1 단계와 동일하며, 9일 동안 연속 투여하였다. 제2 단계 투여 종료 2일 후 Y 미로 행동학 검출을 수행하였다.

결과에 따르면, 블랭크 대조군 마우스에 비해 비히클군 마우스의 자발적 교대 반응 백분율은 유의하게 감소하고; 투여군 마우스의 자발적 교대 반응 백분율은 비히클군보다 유의하게 높으며, 두 그룹의 비교 시 통계학적 차이가 현저하고(*는 P<0.05를 나타냄), 투여군은 블랭크 대조군 마우스에 근접한다(도 26). 이는 플라스미노겐이 알츠하이머병 모델 마우스의 기억 기능 회복을 촉진할 수 있음을 나타낸다.

실시예 18 알츠하이머병 모델 마우스의 불안, 우울 행동 회복을 촉진하는 플라스미노겐

18마리의 20 ~ 25 주령 B6SJL-Tg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax(Jackson lab 실험실에서 구입, 품종 번호: 034840) 암컷 마우스를 선택하고, 체중 및 Y 미로 실험 검출 결과에 따라 두 그룹으로 나누었는 바, 비히클군 9마리와 투여군 9마리이며, 먼저 동일한 주령의 C57 암컷 마우스 9마리를 취하여 블랭크 대조군으로 사용하였다. 그룹을 나눈 후, 블랭크 대조군 마우스와 비히클군 마우스에 비히클(4％ 아르기닌+2％ 글리신 용액)을 꼬리 정맥 주사하고, 주사량은 5 ml/kg이다. 투여군 마우스에 플라스미노겐을 정맥 주사하고, 주사 용량은 50 mg/kg이며, 18일 동안 연속 주사하였다. 19일차에 높은 십자 미로 행동학 실험을 수행하였다.

결과에 따르면, 블랭크 대조군 마우스는 일정한 닫힌 팔 운동 거리를 갖고; 비히클군의 닫힌 팔 운동 거리는 블랭크 대조군 마우스보다 유의하게 작으며; 투여군 마우스의 닫힌 팔 운동 거리는 비히클군보다 유의하게 크고, 두 그룹의 비교 시 통계학적 차이가 현저하며(**는 P<0.01을 나타내고, ***는 P<0.001을 나타냄)(도 27), 투여군의 닫힌 팔 운동 거리는 블랭크 대조군에 더 근접한다. 이는 플라스미노겐이 알츠하이머병 모델 마우스의 불안, 우울 행동 회복을 촉진할 수 있음을 나타낸다.

실시예 19 알츠하이머병 모델 마우스의 해마 손상을 개선하는 플라스미노겐

B6SJL-Tg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax 마우스 품종 번호: 034840, Jackson 실험실에서 구입)와 C57BL/6J 마우스를 1회 역교배시켜 래트(B6-F1-FAD라고 약칭함)를 번식시켰다. 18마리의 16 ~ 17 주령 암컷 B6-F1-FAD 마우스 및 9마리의 9주령 C57BL/6J 암컷 마우스를 취하였다. B6-F1-FAD를 체중 및 Y 미로 실험 검출 결과에 따라 두 그룹으로 나누었는 바, 비히클군 및 투여군으로 각 그룹은 9마리이다. 9마리의 C57BL/6J를 블랭크 대조군으로 사용하였다. 그룹을 나눈 후, 블랭크 대조군 마우스와 비히클군 마우스에 비히클(4％ 아르기닌+2％ 글리신 용액)을 꼬리 정맥 주사하고, 각 마우스의 주사량은 5 ml/kg이다. 투여군 마우스에 플라스미노겐을 꼬리 정맥 주사하고, 각 마우스의 주사 용량은 50 mg/kg이며, 8일 동안 연속 주사하였다. 투여 종료 5일 후, 마우스를 희생시키고, 뇌 조직을 취한 다음 10％ 중성 포름알데히드 용액에 24 ~ 48시간 동안 고정시켰다. 고정된 뇌 조직을 알코올 구배로 탈수하고 자일렌으로 투명하게 한 다음 파라핀 포매를 수행하였다. 절편의 두께는 3 μm이고, 절편을 탈납 및 재수화하고 헤마톡실린 및 에오신으로 염색(HE 염색)하며, 1％ 염산 알코올로 분화한 후 암모니아수로 파란색으로 되돌리고 알코올 구배로 탈수한 다음 절편을 밀봉하며, 절편은 200배 광학 현미경으로 해마 상태를 정위 및 관찰하였다.

결과에 따르면, 블랭크 대조군(도 28의 A) 마우스의 해마 조직 형태는 정상적이고; 비히클군(도 28의 B)에 비해 투여군(도 28의 C)의 해마 조직 손상 형태는 유의하게 개선되었다. 이는 플라스미노겐이 알츠하이머병 모델 마우스의 해마 손상을 개선할 수 있음을 나타낸다.

실시예 20 플라스미노겐 치료를 자청하는 알츠하이머병 환자에 대한 치료 효과

하기 환자는 모두 동의서에 서명하여 자발적으로 사용을 사용하며, 병원윤리위원회의 승인을 받앗다.

환자 1, 남, 76세, 반년 전부터 기억력이 감퇴되고 고집스러워지며 기억 능력 및 새로운 사물에 대한 학습 능력이 감퇴되고, 임상을 통해 알츠하이머병으로 진단을 받았다. 투여 방법: 50 mg으로부터 시작하여 매일 10 mg씩 추가하여 정맥 주사하는 동시에, 3일차부터 10 mg을 에어로졸 흡입하기 시작하였다. 1일 1회 연속 13일 동안 투여하였다.

치료 효과: 가족들은 투여 과정에서 환자의 정신 상태가 점차 호전되고 반응 감도가 점차 뚜렷하게 개선되며, 투여 후기에 환자가 새로운 사물에 대한 학습 능력이 개선되고 기억 능력이 개선되었다고 진술하였다. 투여 13일 후, 신체는 전체적으로 약 50% 호전되고 기억력은 약 50％ 호전되었다.

이는 플라스미노겐이 알츠하이머병 환자의 기억력, 학습 능력 및 정신 상태를 개선할 수 있음을 나타낸다.

환자 2, 여, 96세. 병력: 고혈압을 20여년 동안 앓고, 심장병 및 당뇨병 병력이 없으며, 약 반년 전부터 기억력이 감퇴되고, 학습 능력이 저하되며, 사고 능력 및 의사소통 능력이 감퇴되고, 화를 잘 내며, 무관심하고, 간이정신상태검사(MMSE) 테스트에서 10점을 받았다.

투여 방법: 에어로졸과 정맥 주사를 결합하였다. 1일차에 1회 5 mg씩 3회 에어로졸 흡입하고, 2일차부터 에어로졸은 전과 동일하고, 정맥 주사는 매일 10 mg씩 추가하여 7일 동안 연속 투여하였다.

간이정신상태검사(MMSE)는 피험자의 지적 상태 및 인지 기능 결핍 정도를 종합적이고 정확하며 신속하게 반영할 수 있다. 이 표는 간단하고 구현하기 쉬우며, 국내외에서 널리 적용되고, 치매 검진을 위한 첫 번째 선택 척도이다. 평점 참고: 점수 27 ~ 30점, 정상; 점수<27점, 인지 기능 장애; 점수 21 ~ 26점, 경증; 점수 10 ~ 20점, 중증도; 점수 0 ~ 9점, 중증.

치료 효과: 1. 정신이 호전되고; 2. 노인성 치매 증상이 호전되며, 기억력이 증가되고; 3. 노인 불안이 감소되며; 4. MMSE에서 14점을 받고, 주로 타인의 지시에 따라 동작할 수 있는 것으로 나타났다. 투여 전후 MMSE 평점은 표 1과 같다.

이는 플라스미노겐이 알츠하이머병 환자의 MMSE 평점을 향상시키고 환자의 기억력, 사고 능력, 불안 및 정신 상태를 개선할 수 있음을 나타낸다.

환자 3, 여, 87세, 기억력이 좋지 않고 이해 능력이 좋지 않으며, 내원 검사 시 의사는 뇌경색으로 진단하였고, 기억력 및 이해 능력이 영향을 받아 노인성 치매의 현상이 나타나며, 경미한 의식 착란이 있고, 아섬망 상태에 있으며, 주변 환경을 정확히 식별할 수 없고, 시간 및 장소 착란이 있으며, 사람들과의 의사소통에 장애가 있고, 전반적인 상태의 평점은 10점이다. (전반적인 상태의 평점을 보면, 1일차에 투여하지 않은 상태를 10으로 하고, 투여 후 어제 상태에서 10으로 가장 심각, 1은 가장 경미, 0은 정상으로 함)

투여 방법: 150 ~ 250 mg 정맥 주사, 추가로 에어로졸 흡입 10 mg/회, 4시간 1회, 1일 3회, 14일 투여. 약물 중단 일주일 후, 계속하여 일주일 동안 투여하고, 방법은 전과 동일하며, 에어로졸 흡입 용량은 15 mg/회, 4시간 1회, 1일 3회이다. 약물 중단 일주일 후, 계속하여 두주일 동안 투여하고, 격일로 투여하며, 250 mg을 정맥 주사하고, 에어로졸은 15 mg/회, 4시간 1회, 1일 3회이다. 그 후, 주 2회 용량 400 mg을 정맥 주사하고, 추가로 에어로졸 10 mg/회, 1일 2회, 2주 투여로 변경하였다. 현재 주 1회 투여, 500 mg 정맥 주사, 추가로 에어로졸 흡입 10 mg/회, 1일 2회, 주 2일 투여이다.

치료 과정에서 상기 증상이 점차 호전되고, 투여 14일차에 환자의 기분은 좋아지며, 사람들과의 의사소통에 기본적으로 장애가 없고, 기억력이 회복되며, 시간에 대한 개념이 점차 명확해지고, 전반적인 상태의 평점은 4점이다. 사람들과의 의사소통에서 70％ ~ 80％는 이해하고 정확하게 응답할 수 있으며, 사람의 이름을 종종 헷갈려 하지만, 인물의 구체적인 지향에는 문제가 없다.

이는 플라스미노겐이 환자의 기억력, 의사소통 능력, 인지 능력, 지향 능력의 개선을 포함하여 알츠하이머병을 개선할 수 있음을 나타낸다.

환자 4, 여, 91세, 경미한 뇌위축증으로 진단을 받았고, 경미한 인지 장애가 있다. 환자는 투여 전 기억력 평점이 10이고, 계산 능력 평점이 10이며, 지향력 평점이 10이었다(전반적인 상태의 평점을 보면, 1일차에 투여하지 않은 상태를 10으로 하고, 투여 후 어제 상태에서 10을 가장 심각, 1은 가장 경미, 0은 정상으로 함).

투여 방법, 50 ~ 100 mg 정맥 주사, 1일 1회, 추가로 에어로졸 흡입 10 mg/회, 1일 2 ~ 3회. 이틀에 한 번씩 전과 같이 투여하고, 13일 동안 연속 투여하였다.

치료 13일 후, 환자의 기억력 평점은 9이고, 계산 능력 평점은 9이며, 지향력 평점은 9였다.

이는 플라스미노겐이 환자의 인지 장애, 기억 능력, 계산 능력, 지향 능력을 개선할 수 있음을 나타낸다.

환자 5, 여, 79세, 4년 전부터 기억력이 저하되고, 성질이 급한 등 증상이 나타났다. 현재 환자는 비교적 조용하고, 집중력이 2분을 넘지 않으며, 언어 표현 장애 및 단기 기억 상실이 있다. 시간 및 장소를 식별할 수 없고, 쉽게 슬퍼하며, 스스로 생활하는 능력을 상실하였다. MMSE 점수는 3점이다.

투여 방법: 50 mg부터 정맥 주사하고, 이틀에 한 번 씩 50 mg을 추가하며, 14일 동안 연속 투여하고, 그 후 주 2회 투여하고, 매회 400 mg씩 총 30일 동안 치료하였다.

투여 4일차부터 집중력 및 이해력 감각이 약간 개선되기 시작하고; 투여 7일차에 이해력 및 집중력이 더 호전되며, 문제를 이해할 수 있고, 응답하려고 노력하며; 투여 10일차에 더 많은 사물과 가족을 알아보고 기억할 수 있으며; 투여 14일차에 집중력이 7 ~ 8분에 달할 수 있고; 금방 발생한 일의 경우, 상태가 좋을 때 기억력이 6 ~ 7분 동안 지속될 수 있으며; 투여 21일차에 집중력이 30분 이상에 달할 수 있고;투여 24일차에 금방 발생한 일에 있어 기억력이 약 1시간 동안 지속될 수 있으며, 언어 표현도 더 풍부해지고, MMSE 평점이 9점이며; 투여 30일 후 MMSE 평점은 9점이고; 약물 중단 1개월 후, 계산 능력이 개선되고 MMSE 평점은 8점이다. 투여 전후 MMSE 평점은 표 2와 같다.

이는 플라스미노겐이 알츠하이머 환자의 MMSE 평점을 향상시키고 환자의 기억 능력, 인지 능력, 집중력, 이해 능력, 언어 표현 능력, 계산 능력을 개선할 수 있음을 나타낸다.

(참고 문헌)

[1]Selkoe D J.Alzheimer's disease:genes,proteins,and therapy[J].Physiol.Rev,2001,81(2):741-766.

[2]Oakley H,Cole S L,Logan S,et al.Intraneuronalβ-Amyloid Aggregates,Neurodegeneration,and Neuron Loss in Transgenic Mice with Five Familial Alzheimer's Disease Mutations:Potential Factors in Amyloid Plaque Formation[J].Journal of Neuroscience,2006,26(40):10129-10140.

[3]Moon M,Choi J G,Kim S Y,et al.Bombycis Excrementum Reduces Amyloid-β Oligomer-Induced Memory Impairments,Neurodegeneration,and Neuroinflammation in Mice[J].Journal of Alzheimer's disease:JAD,2014,41(2).

[4]Park S W,Kim J H,Mook-Jung I,et al.Intracellular amyloid beta alters he tight junction of retinal pigment epithelium in 5XFAD mice[J].Neurobiology of Aging,2014,35(9):2013-2020.

[5]Naseri NN,Wang H,Guo J,Sharma M,Luo W.The complexity of tau in Alzheimer's disease.Neurosci Lett.2019 Jul 13; 705:183-194.

[6]Gray K,Ellis V.Activation of pro-BDNF by the pericellular serine protease plasmin[J].Febs Letters,2008,582(6):907-910.

[7]Kowiaρski,Przemys？aw,Lietzau G,Czuba E,et al.BDNF:A Key Factor with Multipotent Impact on Brain Signaling and Synaptic Plasticity[J].Cellular&Molecular Neurobiology,2017

[8]Aloe L,Rocco M L,Bianchi P,et al.Nerve growth factor:from the early discoveries to the potential clinical use[J].Journal of Translational Medicine,2012,10(1)

SEQUENCE LISTING <110> TALENGEN INTERNATIONAL LIMITED <120> METHOD AND DRUG FOR TREATING ALZHEIMER'S DISEASE <130> FE00366PCT <150> 2020102134627 <151> 2020-03-24 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2376 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> nucleotide sequence of the natural plasminogen(Glu-PLG,Glu-plasminogen)without the signal peptide <400> 1 gagcctctgg atgactatgt gaatacccag ggggcttcac tgttcagtgt cactaagaag 60 cagctgggag caggaagtat agaagaatgt gcagcaaaat gtgaggagga cgaagaattc 120 acctgcaggg cattccaata tcacagtaaa gagcaacaat gtgtgataat ggctgaaaac 180 aggaagtcct ccataatcat taggatgaga gatgtagttt tatttgaaaa gaaagtgtat 240 ctctcagagt gcaagactgg gaatggaaag aactacagag ggacgatgtc caaaacaaaa 300 aatggcatca cctgtcaaaa atggagttcc acttctcccc acagacctag attctcacct 360 gctacacacc cctcagaggg actggaggag aactactgca ggaatccaga caacgatccg 420 caggggccct ggtgctatac tactgatcca gaaaagagat atgactactg cgacattctt 480 gagtgtgaag aggaatgtat gcattgcagt ggagaaaact atgacggcaa aatttccaag 540 accatgtctg gactggaatg ccaggcctgg gactctcaga gcccacacgc tcatggatac 600 attccttcca aatttccaaa caagaacctg aagaagaatt actgtcgtaa ccccgatagg 660 gagctgcggc cttggtgttt caccaccgac cccaacaagc gctgggaact ttgtgacatc 720 ccccgctgca caacacctcc accatcttct ggtcccacct accagtgtct gaagggaaca 780 ggtgaaaact atcgcgggaa tgtggctgtt accgtgtccg ggcacacctg tcagcactgg 840 agtgcacaga cccctcacac acataacagg acaccagaaa acttcccctg caaaaatttg 900 gatgaaaact actgccgcaa tcctgacgga aaaagggccc catggtgcca tacaaccaac 960 agccaagtgc ggtgggagta ctgtaagata ccgtcctgtg actcctcccc agtatccacg 1020 gaacaattgg ctcccacagc accacctgag ctaacccctg tggtccagga ctgctaccat 1080 ggtgatggac agagctaccg aggcacatcc tccaccacca ccacaggaaa gaagtgtcag 1140 tcttggtcat ctatgacacc acaccggcac cagaagaccc cagaaaacta cccaaatgct 1200 ggcctgacaa tgaactactg caggaatcca gatgccgata aaggcccctg gtgttttacc 1260 acagacccca gcgtcaggtg ggagtactgc aacctgaaaa aatgctcagg aacagaagcg 1320 agtgttgtag cacctccgcc tgttgtcctg cttccagatg tagagactcc ttccgaagaa 1380 gactgtatgt ttgggaatgg gaaaggatac cgaggcaaga gggcgaccac tgttactggg 1440 acgccatgcc aggactgggc tgcccaggag ccccatagac acagcatttt cactccagag 1500 acaaatccac gggcgggtct ggaaaaaaat tactgccgta accctgatgg tgatgtaggt 1560 ggtccctggt gctacacgac aaatccaaga aaactttacg actactgtga tgtccctcag 1620 tgtgcggccc cttcatttga ttgtgggaag cctcaagtgg agccgaagaa atgtcctgga 1680 agggttgtag gggggtgtgt ggcccaccca cattcctggc cctggcaagt cagtcttaga 1740 acaaggtttg gaatgcactt ctgtggaggc accttgatat ccccagagtg ggtgttgact 1800 gctgcccact gcttggagaa gtccccaagg ccttcatcct acaaggtcat cctgggtgca 1860 caccaagaag tgaatctcga accgcatgtt caggaaatag aagtgtctag gctgttcttg 1920 gagcccacac gaaaagatat tgccttgcta aagctaagca gtcctgccgt catcactgac 1980 aaagtaatcc cagcttgtct gccatcccca aattatgtgg tcgctgaccg gaccgaatgt 2040 ttcatcactg gctggggaga aacccaaggt acttttggag ctggccttct caaggaagcc 2100 cagctccctg tgattgagaa taaagtgtgc aatcgctatg agtttctgaa tggaagagtc 2160 caatccaccg aactctgtgc tgggcatttg gccggaggca ctgacagttg ccagggtgac 2220 agtggaggtc ctctggtttg cttcgagaag gacaaataca ttttacaagg agtcacttct 2280 tggggtcttg gctgtgcacg ccccaataag cctggtgtct atgttcgtgt ttcaaggttt 2340 gttacttgga ttgagggagt gatgagaaat aattaa 2376 <210> 2 <211> 791 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of the natural plasminogen (Glu-PLG,Glu-plasminogen) without the signal peptide <400> 2 Glu Pro Leu Asp Asp Tyr Val Asn Thr Gln Gly Ala Ser Leu Phe Ser 1 5 10 15 Val Thr Lys Lys Gln Leu Gly Ala Gly Ser Ile Glu Glu Cys Ala Ala 20 25 30 Lys Cys Glu Glu Asp Glu Glu Phe Thr Cys Arg Ala Phe Gln Tyr His 35 40 45 Ser Lys Glu Gln Gln Cys Val Ile Met Ala Glu Asn Arg Lys Ser Ser 50 55 60 Ile Ile Ile Arg Met Arg Asp Val Val Leu Phe Glu Lys Lys Val Tyr 65 70 75 80 Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Met 85 90 95 Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ser Thr Ser 100 105 110 Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Glu Gly Leu 115 120 125 Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln Gly Pro Trp 130 135 140 Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp Ile Leu 145 150 155 160 Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn Tyr Asp Gly 165 170 175 Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Glu Cys Gln Ala Trp Asp Ser 180 185 190 Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe Pro Asn Lys 195 200 205 Asn Leu Lys Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Glu Leu Arg Pro 210 215 220 Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Leu Cys Asp Ile 225 230 235 240 Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Pro Thr Tyr Gln Cys 245 250 255 Leu Lys Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Asn Val Ala Val Thr Val 260 265 270 Ser Gly His Thr Cys Gln His Trp Ser Ala Gln Thr Pro His Thr His 275 280 285 Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Asp Glu Asn Tyr 290 295 300 Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Arg Ala Pro Trp Cys His Thr Thr Asn 305 310 315 320 Ser Gln Val Arg Trp Glu Tyr Cys Lys Ile Pro Ser Cys Asp Ser Ser 325 330 335 Pro Val Ser Thr Glu Gln Leu Ala Pro Thr Ala Pro Pro Glu Leu Thr 340 345 350 Pro Val Val Gln Asp Cys Tyr His Gly Asp Gly Gln Ser Tyr Arg Gly 355 360 365 Thr Ser Ser Thr Thr Thr Thr Gly Lys Lys Cys Gln Ser Trp Ser Ser 370 375 380 Met Thr Pro His Arg His Gln Lys Thr Pro Glu Asn Tyr Pro Asn Ala 385 390 395 400 Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Asp Lys Gly Pro 405 410 415 Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu Tyr Cys Asn Leu 420 425 430 Lys Lys Cys Ser Gly Thr Glu Ala Ser Val Val Ala Pro Pro Pro Val 435 440 445 Val Leu Leu Pro Asp Val Glu Thr Pro Ser Glu Glu Asp Cys Met Phe 450 455 460 Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys Arg Ala Thr Thr Val Thr Gly 465 470 475 480 Thr Pro Cys Gln Asp Trp Ala Ala Gln Glu Pro His Arg His Ser Ile 485 490 495 Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg Ala Gly Leu Glu Lys Asn Tyr Cys 500 505 510 Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asn 515 520 525 Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Val Pro Gln Cys Ala Ala Pro 530 535 540 Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys Lys Cys Pro Gly 545 550 555 560 Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp Pro Trp Gln 565 570 575 Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly Gly Thr Leu 580 585 590 Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Glu Lys Ser 595 600 605 Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His Gln Glu Val 610 615 620 Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg Leu Phe Leu 625 630 635 640 Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala 645 650 655 Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr 660 665 670 Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp Gly Glu Thr 675 680 685 Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln Leu Pro Val 690 695 700 Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn Gly Arg Val 705 710 715 720 Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser 725 730 735 Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu Lys Asp Lys 740 745 750 Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro 755 760 765 Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val Thr Trp Ile 770 775 780 Glu Gly Val Met Arg Asn Asn 785 790 <210> 3 <211> 2433 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> nucleotide sequence of the natural plasminogen(from swiss prot)with the signal peptide <400> 3 atggaacata aggaagtggt tcttctactt cttttatttc tgaaatcagg tcaaggagag 60 cctctggatg actatgtgaa tacccagggg gcttcactgt tcagtgtcac taagaagcag 120 ctgggagcag gaagtataga agaatgtgca gcaaaatgtg aggaggacga agaattcacc 180 tgcagggcat tccaatatca cagtaaagag caacaatgtg tgataatggc tgaaaacagg 240 aagtcctcca taatcattag gatgagagat gtagttttat ttgaaaagaa agtgtatctc 300 tcagagtgca agactgggaa tggaaagaac tacagaggga cgatgtccaa aacaaaaaat 360 ggcatcacct gtcaaaaatg gagttccact tctccccaca gacctagatt ctcacctgct 420 acacacccct cagagggact ggaggagaac tactgcagga atccagacaa cgatccgcag 480 gggccctggt gctatactac tgatccagaa aagagatatg actactgcga cattcttgag 540 tgtgaagagg aatgtatgca ttgcagtgga gaaaactatg acggcaaaat ttccaagacc 600 atgtctggac tggaatgcca ggcctgggac tctcagagcc cacacgctca tggatacatt 660 ccttccaaat ttccaaacaa gaacctgaag aagaattact gtcgtaaccc cgatagggag 720 ctgcggcctt ggtgtttcac caccgacccc aacaagcgct gggaactttg tgacatcccc 780 cgctgcacaa cacctccacc atcttctggt cccacctacc agtgtctgaa gggaacaggt 840 gaaaactatc gcgggaatgt ggctgttacc gtgtccgggc acacctgtca gcactggagt 900 gcacagaccc ctcacacaca taacaggaca ccagaaaact tcccctgcaa aaatttggat 960 gaaaactact gccgcaatcc tgacggaaaa agggccccat ggtgccatac aaccaacagc 1020 caagtgcggt gggagtactg taagataccg tcctgtgact cctccccagt atccacggaa 1080 caattggctc ccacagcacc acctgagcta acccctgtgg tccaggactg ctaccatggt 1140 gatggacaga gctaccgagg cacatcctcc accaccacca caggaaagaa gtgtcagtct 1200 tggtcatcta tgacaccaca ccggcaccag aagaccccag aaaactaccc aaatgctggc 1260 ctgacaatga actactgcag gaatccagat gccgataaag gcccctggtg ttttaccaca 1320 gaccccagcg tcaggtggga gtactgcaac ctgaaaaaat gctcaggaac agaagcgagt 1380 gttgtagcac ctccgcctgt tgtcctgctt ccagatgtag agactccttc cgaagaagac 1440 tgtatgtttg ggaatgggaa aggataccga ggcaagaggg cgaccactgt tactgggacg 1500 ccatgccagg actgggctgc ccaggagccc catagacaca gcattttcac tccagagaca 1560 aatccacggg cgggtctgga aaaaaattac tgccgtaacc ctgatggtga tgtaggtggt 1620 ccctggtgct acacgacaaa tccaagaaaa ctttacgact actgtgatgt ccctcagtgt 1680 gcggcccctt catttgattg tgggaagcct caagtggagc cgaagaaatg tcctggaagg 1740 gttgtagggg ggtgtgtggc ccacccacat tcctggccct ggcaagtcag tcttagaaca 1800 aggtttggaa tgcacttctg tggaggcacc ttgatatccc cagagtgggt gttgactgct 1860 gcccactgct tggagaagtc cccaaggcct tcatcctaca aggtcatcct gggtgcacac 1920 caagaagtga atctcgaacc gcatgttcag gaaatagaag tgtctaggct gttcttggag 1980 cccacacgaa aagatattgc cttgctaaag ctaagcagtc ctgccgtcat cactgacaaa 2040 gtaatcccag cttgtctgcc atccccaaat tatgtggtcg ctgaccggac cgaatgtttc 2100 atcactggct ggggagaaac ccaaggtact tttggagctg gccttctcaa ggaagcccag 2160 ctccctgtga ttgagaataa agtgtgcaat cgctatgagt ttctgaatgg aagagtccaa 2220 tccaccgaac tctgtgctgg gcatttggcc ggaggcactg acagttgcca gggtgacagt 2280 ggaggtcctc tggtttgctt cgagaaggac aaatacattt tacaaggagt cacttcttgg 2340 ggtcttggct gtgcacgccc caataagcct ggtgtctatg ttcgtgtttc aaggtttgtt 2400 acttggattg agggagtgat gagaaataat taa 2433 <210> 4 <211> 810 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of the natural plasminogen(from swiss prot)with the signal peptide <400> 4 Met Glu His Lys Glu Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Phe Leu Lys Ser 1 5 10 15 Gly Gln Gly Glu Pro Leu Asp Asp Tyr Val Asn Thr Gln Gly Ala Ser 20 25 30 Leu Phe Ser Val Thr Lys Lys Gln Leu Gly Ala Gly Ser Ile Glu Glu 35 40 45 Cys Ala Ala Lys Cys Glu Glu Asp Glu Glu Phe Thr Cys Arg Ala Phe 50 55 60 Gln Tyr His Ser Lys Glu Gln Gln Cys Val Ile Met Ala Glu Asn Arg 65 70 75 80 Lys Ser Ser Ile Ile Ile Arg Met Arg Asp Val Val Leu Phe Glu Lys 85 90 95 Lys Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg 100 105 110 Gly Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser 115 120 125 Ser Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser 130 135 140 Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln 145 150 155 160 Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys 165 170 175 Asp Ile Leu Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn 180 185 190 Tyr Asp Gly Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Glu Cys Gln Ala 195 200 205 Trp Asp Ser Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe 210 215 220 Pro Asn Lys Asn Leu Lys Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Glu 225 230 235 240 Leu Arg Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Leu 245 250 255 Cys Asp Ile Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Pro Thr 260 265 270 Tyr Gln Cys Leu Lys Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Asn Val Ala 275 280 285 Val Thr Val Ser Gly His Thr Cys Gln His Trp Ser Ala Gln Thr Pro 290 295 300 His Thr His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Asp 305 310 315 320 Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Arg Ala Pro Trp Cys His 325 330 335 Thr Thr Asn Ser Gln Val Arg Trp Glu Tyr Cys Lys Ile Pro Ser Cys 340 345 350 Asp Ser Ser Pro Val Ser Thr Glu Gln Leu Ala Pro Thr Ala Pro Pro 355 360 365 Glu Leu Thr Pro Val Val Gln Asp Cys Tyr His Gly Asp Gly Gln Ser 370 375 380 Tyr Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Thr Thr Gly Lys Lys Cys Gln Ser 385 390 395 400 Trp Ser Ser Met Thr Pro His Arg His Gln Lys Thr Pro Glu Asn Tyr 405 410 415 Pro Asn Ala Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Asp 420 425 430 Lys Gly Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu Tyr 435 440 445 Cys Asn Leu Lys Lys Cys Ser Gly Thr Glu Ala Ser Val Val Ala Pro 450 455 460 Pro Pro Val Val Leu Leu Pro Asp Val Glu Thr Pro Ser Glu Glu Asp 465 470 475 480 Cys Met Phe Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys Arg Ala Thr Thr 485 490 495 Val Thr Gly Thr Pro Cys Gln Asp Trp Ala Ala Gln Glu Pro His Arg 500 505 510 His Ser Ile Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg Ala Gly Leu Glu Lys 515 520 525 Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly Gly Pro Trp Cys Tyr 530 535 540 Thr Thr Asn Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Val Pro Gln Cys 545 550 555 560 Ala Ala Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys Lys 565 570 575 Cys Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp 580 585 590 Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly 595 600 605 Gly Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu 610 615 620 Glu Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His 625 630 635 640 Gln Glu Val Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg 645 650 655 Leu Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser 660 665 670 Ser Pro Ala Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser 675 680 685 Pro Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp 690 695 700 Gly Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln 705 710 715 720 Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn 725 730 735 Gly Arg Val Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly 740 745 750 Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu 755 760 765 Lys Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys 770 775 780 Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val 785 790 795 800 Thr Trp Ile Glu Gly Val Met Arg Asn Asn 805 810 <210> 5 <211> 2145 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> nucleotide sequence of LYS77-PLG(Lys-plasminogen) <400> 5 aaagtgtatc tctcagagtg caagactggg aatggaaaga actacagagg gacgatgtcc 60 aaaacaaaaa atggcatcac ctgtcaaaaa tggagttcca cttctcccca cagacctaga 120 ttctcacctg ctacacaccc ctcagaggga ctggaggaga actactgcag gaatccagac 180 aacgatccgc aggggccctg gtgctatact actgatccag aaaagagata tgactactgc 240 gacattcttg agtgtgaaga ggaatgtatg cattgcagtg gagaaaacta tgacggcaaa 300 atttccaaga ccatgtctgg actggaatgc caggcctggg actctcagag cccacacgct 360 catggataca ttccttccaa atttccaaac aagaacctga agaagaatta ctgtcgtaac 420 cccgataggg agctgcggcc ttggtgtttc accaccgacc ccaacaagcg ctgggaactt 480 tgtgacatcc cccgctgcac aacacctcca ccatcttctg gtcccaccta ccagtgtctg 540 aagggaacag gtgaaaacta tcgcgggaat gtggctgtta ccgtgtccgg gcacacctgt 600 cagcactgga gtgcacagac ccctcacaca cataacagga caccagaaaa cttcccctgc 660 aaaaatttgg atgaaaacta ctgccgcaat cctgacggaa aaagggcccc atggtgccat 720 acaaccaaca gccaagtgcg gtgggagtac tgtaagatac cgtcctgtga ctcctcccca 780 gtatccacgg aacaattggc tcccacagca ccacctgagc taacccctgt ggtccaggac 840 tgctaccatg gtgatggaca gagctaccga ggcacatcct ccaccaccac cacaggaaag 900 aagtgtcagt cttggtcatc tatgacacca caccggcacc agaagacccc agaaaactac 960 ccaaatgctg gcctgacaat gaactactgc aggaatccag atgccgataa aggcccctgg 1020 tgttttacca cagaccccag cgtcaggtgg gagtactgca acctgaaaaa atgctcagga 1080 acagaagcga gtgttgtagc acctccgcct gttgtcctgc ttccagatgt agagactcct 1140 tccgaagaag actgtatgtt tgggaatggg aaaggatacc gaggcaagag ggcgaccact 1200 gttactggga cgccatgcca ggactgggct gcccaggagc cccatagaca cagcattttc 1260 actccagaga caaatccacg ggcgggtctg gaaaaaaatt actgccgtaa ccctgatggt 1320 gatgtaggtg gtccctggtg ctacacgaca aatccaagaa aactttacga ctactgtgat 1380 gtccctcagt gtgcggcccc ttcatttgat tgtgggaagc ctcaagtgga gccgaagaaa 1440 tgtcctggaa gggttgtagg ggggtgtgtg gcccacccac attcctggcc ctggcaagtc 1500 agtcttagaa caaggtttgg aatgcacttc tgtggaggca ccttgatatc cccagagtgg 1560 gtgttgactg ctgcccactg cttggagaag tccccaaggc cttcatccta caaggtcatc 1620 ctgggtgcac accaagaagt gaatctcgaa ccgcatgttc aggaaataga agtgtctagg 1680 ctgttcttgg agcccacacg aaaagatatt gccttgctaa agctaagcag tcctgccgtc 1740 atcactgaca aagtaatccc agcttgtctg ccatccccaa attatgtggt cgctgaccgg 1800 accgaatgtt tcatcactgg ctggggagaa acccaaggta cttttggagc tggccttctc 1860 aaggaagccc agctccctgt gattgagaat aaagtgtgca atcgctatga gtttctgaat 1920 ggaagagtcc aatccaccga actctgtgct gggcatttgg ccggaggcac tgacagttgc 1980 cagggtgaca gtggaggtcc tctggtttgc ttcgagaagg acaaatacat tttacaagga 2040 gtcacttctt ggggtcttgg ctgtgcacgc cccaataagc ctggtgtcta tgttcgtgtt 2100 tcaaggtttg ttacttggat tgagggagtg atgagaaata attaa 2145 <210> 6 <211> 714 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of LYS77-PLG(Lys-plasminogen) <400> 6 Lys Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg 1 5 10 15 Gly Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser 20 25 30 Ser Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser 35 40 45 Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln 50 55 60 Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys 65 70 75 80 Asp Ile Leu Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn 85 90 95 Tyr Asp Gly Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Glu Cys Gln Ala 100 105 110 Trp Asp Ser Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe 115 120 125 Pro Asn Lys Asn Leu Lys Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Glu 130 135 140 Leu Arg Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Leu 145 150 155 160 Cys Asp Ile Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Pro Thr 165 170 175 Tyr Gln Cys Leu Lys Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Asn Val Ala 180 185 190 Val Thr Val Ser Gly His Thr Cys Gln His Trp Ser Ala Gln Thr Pro 195 200 205 His Thr His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Asp 210 215 220 Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Arg Ala Pro Trp Cys His 225 230 235 240 Thr Thr Asn Ser Gln Val Arg Trp Glu Tyr Cys Lys Ile Pro Ser Cys 245 250 255 Asp Ser Ser Pro Val Ser Thr Glu Gln Leu Ala Pro Thr Ala Pro Pro 260 265 270 Glu Leu Thr Pro Val Val Gln Asp Cys Tyr His Gly Asp Gly Gln Ser 275 280 285 Tyr Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Thr Thr Gly Lys Lys Cys Gln Ser 290 295 300 Trp Ser Ser Met Thr Pro His Arg His Gln Lys Thr Pro Glu Asn Tyr 305 310 315 320 Pro Asn Ala Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Asp 325 330 335 Lys Gly Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu Tyr 340 345 350 Cys Asn Leu Lys Lys Cys Ser Gly Thr Glu Ala Ser Val Val Ala Pro 355 360 365 Pro Pro Val Val Leu Leu Pro Asp Val Glu Thr Pro Ser Glu Glu Asp 370 375 380 Cys Met Phe Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys Arg Ala Thr Thr 385 390 395 400 Val Thr Gly Thr Pro Cys Gln Asp Trp Ala Ala Gln Glu Pro His Arg 405 410 415 His Ser Ile Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg Ala Gly Leu Glu Lys 420 425 430 Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly Gly Pro Trp Cys Tyr 435 440 445 Thr Thr Asn Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Val Pro Gln Cys 450 455 460 Ala Ala Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys Lys 465 470 475 480 Cys Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp 485 490 495 Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly 500 505 510 Gly Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu 515 520 525 Glu Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His 530 535 540 Gln Glu Val Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg 545 550 555 560 Leu Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser 565 570 575 Ser Pro Ala Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser 580 585 590 Pro Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp 595 600 605 Gly Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln 610 615 620 Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn 625 630 635 640 Gly Arg Val Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly 645 650 655 Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu 660 665 670 Lys Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys 675 680 685 Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val 690 695 700 Thr Trp Ile Glu Gly Val Met Arg Asn Asn 705 710 <210> 7 <211> 1245 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> nucleotide sequence of delta-plg(delta-plasminogen) <400> 7 gagcctctgg atgactatgt gaatacccag ggggcttcac tgttcagtgt cactaagaag 60 cagctgggag caggaagtat agaagaatgt gcagcaaaat gtgaggagga cgaagaattc 120 acctgcaggg cattccaata tcacagtaaa gagcaacaat gtgtgataat ggctgaaaac 180 aggaagtcct ccataatcat taggatgaga gatgtagttt tatttgaaaa gaaagtgtat 240 ctctcagagt gcaagactgg gaatggaaag aactacagag ggacgatgtc caaaacaaaa 300 aatggcatca cctgtcaaaa atggagttcc acttctcccc acagacctag attctcacct 360 gctacacacc cctcagaggg actggaggag aactactgca ggaatccaga caacgatccg 420 caggggccct ggtgctatac tactgatcca gaaaagagat atgactactg cgacattctt 480 gagtgtgaag aggcggcccc ttcatttgat tgtgggaagc ctcaagtgga gccgaagaaa 540 tgtcctggaa gggttgtagg ggggtgtgtg gcccacccac attcctggcc ctggcaagtc 600 agtcttagaa caaggtttgg aatgcacttc tgtggaggca ccttgatatc cccagagtgg 660 gtgttgactg ctgcccactg cttggagaag tccccaaggc cttcatccta caaggtcatc 720 ctgggtgcac accaagaagt gaatctcgaa ccgcatgttc aggaaataga agtgtctagg 780 ctgttcttgg agcccacacg aaaagatatt gccttgctaa agctaagcag tcctgccgtc 840 atcactgaca aagtaatccc agcttgtctg ccatccccaa attatgtggt cgctgaccgg 900 accgaatgtt tcatcactgg ctggggagaa acccaaggta cttttggagc tggccttctc 960 aaggaagccc agctccctgt gattgagaat aaagtgtgca atcgctatga gtttctgaat 1020 ggaagagtcc aatccaccga actctgtgct gggcatttgg ccggaggcac tgacagttgc 1080 cagggtgaca gtggaggtcc tctggtttgc ttcgagaagg acaaatacat tttacaagga 1140 gtcacttctt ggggtcttgg ctgtgcacgc cccaataagc ctggtgtcta tgttcgtgtt 1200 tcaaggtttg ttacttggat tgagggagtg atgagaaata attaa 1245 <210> 8 <211> 414 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of delta-plg(delta-plasminogen) <400> 8 Glu Pro Leu Asp Asp Tyr Val Asn Thr Gln Gly Ala Ser Leu Phe Ser 1 5 10 15 Val Thr Lys Lys Gln Leu Gly Ala Gly Ser Ile Glu Glu Cys Ala Ala 20 25 30 Lys Cys Glu Glu Asp Glu Glu Phe Thr Cys Arg Ala Phe Gln Tyr His 35 40 45 Ser Lys Glu Gln Gln Cys Val Ile Met Ala Glu Asn Arg Lys Ser Ser 50 55 60 Ile Ile Ile Arg Met Arg Asp Val Val Leu Phe Glu Lys Lys Val Tyr 65 70 75 80 Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Met 85 90 95 Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ser Thr Ser 100 105 110 Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Glu Gly Leu 115 120 125 Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln Gly Pro Trp 130 135 140 Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp Ile Leu 145 150 155 160 Glu Cys Glu Glu Ala Ala Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val 165 170 175 Glu Pro Lys Lys Cys Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His 180 185 190 Pro His Ser Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met 195 200 205 His Phe Cys Gly Gly Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala 210 215 220 Ala His Cys Leu Glu Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile 225 230 235 240 Leu Gly Ala His Gln Glu Val Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile 245 250 255 Glu Val Ser Arg Leu Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu 260 265 270 Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala 275 280 285 Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe 290 295 300 Ile Thr Gly Trp Gly Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu 305 310 315 320 Lys Glu Ala Gln Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr 325 330 335 Glu Phe Leu Asn Gly Arg Val Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His 340 345 350 Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu 355 360 365 Val Cys Phe Glu Lys Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp 370 375 380 Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val 385 390 395 400 Ser Arg Phe Val Thr Trp Ile Glu Gly Val Met Arg Asn Asn 405 410 <210> 9 <211> 1104 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> nucleotide sequence of Mini-plg(mini-plasminogen) <400> 9 gtcaggtggg agtactgcaa cctgaaaaaa tgctcaggaa cagaagcgag tgttgtagca 60 cctccgcctg ttgtcctgct tccagatgta gagactcctt ccgaagaaga ctgtatgttt 120 gggaatggga aaggataccg aggcaagagg gcgaccactg ttactgggac gccatgccag 180 gactgggctg cccaggagcc ccatagacac agcattttca ctccagagac aaatccacgg 240 gcgggtctgg aaaaaaatta ctgccgtaac cctgatggtg atgtaggtgg tccctggtgc 300 tacacgacaa atccaagaaa actttacgac tactgtgatg tccctcagtg tgcggcccct 360 tcatttgatt gtgggaagcc tcaagtggag ccgaagaaat gtcctggaag ggttgtaggg 420 gggtgtgtgg cccacccaca ttcctggccc tggcaagtca gtcttagaac aaggtttgga 480 atgcacttct gtggaggcac cttgatatcc ccagagtggg tgttgactgc tgcccactgc 540 ttggagaagt ccccaaggcc ttcatcctac aaggtcatcc tgggtgcaca ccaagaagtg 600 aatctcgaac cgcatgttca ggaaatagaa gtgtctaggc tgttcttgga gcccacacga 660 aaagatattg ccttgctaaa gctaagcagt cctgccgtca tcactgacaa agtaatccca 720 gcttgtctgc catccccaaa ttatgtggtc gctgaccgga ccgaatgttt catcactggc 780 tggggagaaa cccaaggtac ttttggagct ggccttctca aggaagccca gctccctgtg 840 attgagaata aagtgtgcaa tcgctatgag tttctgaatg gaagagtcca atccaccgaa 900 ctctgtgctg ggcatttggc cggaggcact gacagttgcc agggtgacag tggaggtcct 960 ctggtttgct tcgagaagga caaatacatt ttacaaggag tcacttcttg gggtcttggc 1020 tgtgcacgcc ccaataagcc tggtgtctat gttcgtgttt caaggtttgt tacttggatt 1080 gagggagtga tgagaaataa ttaa 1104 <210> 10 <211> 367 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of Mini-plg(mini-plasminogen) <400> 10 Val Arg Trp Glu Tyr Cys Asn Leu Lys Lys Cys Ser Gly Thr Glu Ala 1 5 10 15 Ser Val Val Ala Pro Pro Pro Val Val Leu Leu Pro Asp Val Glu Thr 20 25 30 Pro Ser Glu Glu Asp Cys Met Phe Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly 35 40 45 Lys Arg Ala Thr Thr Val Thr Gly Thr Pro Cys Gln Asp Trp Ala Ala 50 55 60 Gln Glu Pro His Arg His Ser Ile Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg 65 70 75 80 Ala Gly Leu Glu Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly 85 90 95 Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asn Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys 100 105 110 Asp Val Pro Gln Cys Ala Ala Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln 115 120 125 Val Glu Pro Lys Lys Cys Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala 130 135 140 His Pro His Ser Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly 145 150 155 160 Met His Phe Cys Gly Gly Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr 165 170 175 Ala Ala His Cys Leu Glu Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val 180 185 190 Ile Leu Gly Ala His Gln Glu Val Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu 195 200 205 Ile Glu Val Ser Arg Leu Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala 210 215 220 Leu Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro 225 230 235 240 Ala Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys 245 250 255 Phe Ile Thr Gly Trp Gly Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu 260 265 270 Leu Lys Glu Ala Gln Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg 275 280 285 Tyr Glu Phe Leu Asn Gly Arg Val Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly 290 295 300 His Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro 305 310 315 320 Leu Val Cys Phe Glu Lys Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser 325 330 335 Trp Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg 340 345 350 Val Ser Arg Phe Val Thr Trp Ile Glu Gly Val Met Arg Asn Asn 355 360 365 <210> 11 <211> 750 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> nucleotide sequence of Micro-plg(micro-plasminogen) <400> 11 gccccttcat ttgattgtgg gaagcctcaa gtggagccga agaaatgtcc tggaagggtt 60 gtaggggggt gtgtggccca cccacattcc tggccctggc aagtcagtct tagaacaagg 120 tttggaatgc acttctgtgg aggcaccttg atatccccag agtgggtgtt gactgctgcc 180 cactgcttgg agaagtcccc aaggccttca tcctacaagg tcatcctggg tgcacaccaa 240 gaagtgaatc tcgaaccgca tgttcaggaa atagaagtgt ctaggctgtt cttggagccc 300 acacgaaaag atattgcctt gctaaagcta agcagtcctg ccgtcatcac tgacaaagta 360 atcccagctt gtctgccatc cccaaattat gtggtcgctg accggaccga atgtttcatc 420 actggctggg gagaaaccca aggtactttt ggagctggcc ttctcaagga agcccagctc 480 cctgtgattg agaataaagt gtgcaatcgc tatgagtttc tgaatggaag agtccaatcc 540 accgaactct gtgctgggca tttggccgga ggcactgaca gttgccaggg tgacagtgga 600 ggtcctctgg tttgcttcga gaaggacaaa tacattttac aaggagtcac ttcttggggt 660 cttggctgtg cacgccccaa taagcctggt gtctatgttc gtgtttcaag gtttgttact 720 tggattgagg gagtgatgag aaataattaa 750 <210> 12 <211> 249 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of Micro-plg(micro-plasminogen) <400> 12 Ala Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys Lys Cys 1 5 10 15 Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp Pro 20 25 30 Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly Gly 35 40 45 Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Glu 50 55 60 Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His Gln 65 70 75 80 Glu Val Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg Leu 85 90 95 Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser Ser 100 105 110 Pro Ala Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser Pro 115 120 125 Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp Gly 130 135 140 Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln Leu 145 150 155 160 Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn Gly 165 170 175 Arg Val Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly Thr 180 185 190 Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu Lys 195 200 205 Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys Ala 210 215 220 Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val Thr 225 230 235 240 Trp Ile Glu Gly Val Met Arg Asn Asn 245 <210> 13 <211> 684 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> nucleotide sequence of the serine protease domain <400> 13 gttgtagggg ggtgtgtggc ccacccacat tcctggccct ggcaagtcag tcttagaaca 60 aggtttggaa tgcacttctg tggaggcacc ttgatatccc cagagtgggt gttgactgct 120 gcccactgct tggagaagtc cccaaggcct tcatcctaca aggtcatcct gggtgcacac 180 caagaagtga atctcgaacc gcatgttcag gaaatagaag tgtctaggct gttcttggag 240 cccacacgaa aagatattgc cttgctaaag ctaagcagtc ctgccgtcat cactgacaaa 300 gtaatcccag cttgtctgcc atccccaaat tatgtggtcg ctgaccggac cgaatgtttc 360 atcactggct ggggagaaac ccaaggtact tttggagctg gccttctcaa ggaagcccag 420 ctccctgtga ttgagaataa agtgtgcaat cgctatgagt ttctgaatgg aagagtccaa 480 tccaccgaac tctgtgctgg gcatttggcc ggaggcactg acagttgcca gggtgacagt 540 ggaggtcctc tggtttgctt cgagaaggac aaatacattt tacaaggagt cacttcttgg 600 ggtcttggct gtgcacgccc caataagcct ggtgtctatg ttcgtgtttc aaggtttgtt 660 acttggattg agggagtgat gaga 684 <210> 14 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of the serine protease domain <400> 14 Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp Pro Trp Gln Val 1 5 10 15 Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly Gly Thr Leu Ile 20 25 30 Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Glu Lys Ser Pro 35 40 45 Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His Gln Glu Val Asn 50 55 60 Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg Leu Phe Leu Glu 65 70 75 80 Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala Val 85 90 95 Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr Val 100 105 110 Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp Gly Glu Thr Gln 115 120 125 Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln Leu Pro Val Ile 130 135 140 Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn Gly Arg Val Gln 145 150 155 160 Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser Cys 165 170 175 Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu Lys Asp Lys Tyr 180 185 190 Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro Asn 195 200 205 Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val Thr Trp Ile Glu 210 215 220 Gly Val Met Arg 225

Claims (14)

1. 알츠하이머병의 예방 및 치료 방법으로서,
   치료 유효량의 플라스미노겐 활성화 경로의 성분, 플라스미노겐을 직접적으로 활성화하거나 또는 플라스미노겐 활성화 경로의 업스트림 성분을 활성화하여 플라스미노겐을 간접적으로 활성화할 수 있는 화합물, 플라스미노겐 또는 플라스민의 활성을 모방하는 화합물, 플라스미노겐 또는 플라스미노겐 활성제의 발현을 상향 조절할 수 있는 화합물, 플라스미노겐 유사체, 플라스민 유사체, tPA 또는 uPA 유사체 및 피브린 용해 억제제의 길항제로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 알츠하이머병 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 플라스미노겐 활성화 경로의 성분은 플라스미노겐, 재조합 인간 플라스민, Lys-플라스미노겐, Glu-플라스미노겐, 플라스민, 플라스미노겐 및 플라스민의 하나 이상의 kringle 도메인 및 프로테아제 도메인을 포함하는 플라스미노겐 및 플라스민의 변이체 및 유사체, 미니플라스미노겐(mini-plasminogen), 미니플라스민(mini-plasmin), 마이크로플라스미노겐(micro-plasminogen), 마이크로플라스민(micro-plasmin), 델타-플라스미노겐, 델타-플라스민(delta-plasmin), 플라스미노겐 활성제, tPA 및 uPA로부터 선택되는 방법.
3. 제1항에 있어서,
   상기 피브린 용해 억제제의 길항제는 PAI-1, 보체 C1 억제제, α2 항플라스민 또는 α2 마크로글로불린의 억제제, 예를 들어 항체인 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 화합물은 알츠하이머병 피험자에 대해 뇌 조직 내 아밀로이드 단백질 Aβ40 또는 Aβ42의 분해 촉진, 기억 기능 개선, 인지 능력 개선, 지리적 위치 인식 능력 개선, 불안 또는 우울증 완화, 뇌 조직 내 Aβ42 침착 감소, 뇌 조직 내 Tau 단백질의 분해 촉진, 성숙한 BDNF의 형성을 위한 뇌 조직 내 Pro-BDNF의 절단 촉진, 뇌 조직 내 BDNF의 발현 촉진, 성숙한 NGF의 형성을 위한 뇌 조직 내 Pro-NGF의 절단 촉진, 뇌 조직 해마 손상 개선으로부터 선택되는 하나 이상의 작용을 갖는 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 화합물은 플라스미노겐인 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 플라스미노겐은 인간 전장 플라스미노겐 또는 이의 보존적 치환 변이체인 방법.
7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 플라스미노겐은 서열번호 2와 적어도 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％의 서열 상동성을 갖고, 플라스미노겐의 라이신 결합 활성 또는 단백질 분해 활성을 여전히 갖는 방법.
8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 플라스미노겐은 서열번호 14와 적어도 80％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％의 아미노산 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열, 및 플라스미노겐의 단백질 분해 활성을 여전히 갖는 단백질을 포함하는 방법.
9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 플라스미노겐은 Glu-플라스미노겐, Lys-플라스미노겐, 미니플라스미노겐, 마이크로플라스미노겐, 델타-플라스미노겐 또는 플라스미노겐의 단백질 분해 활성을 유지하는 이들의 변이체로부터 선택되는 방법.
10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 플라스미노겐은 서열번호 2, 6, 8, 10, 12로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 서열번호 2, 6, 8, 10, 12로 표시되는 아미노산 서열의 보존적 치환 변이체를 포함하는 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 화합물은 하나 이상의 다른 치료 방법 또는 다른 약물과 병용되는 방법.
12. 제11항에 있어서,
    상기 다른 치료 방법은 세포 치료(줄기 세포 치료 포함), 지지 치료 및 물리 치료를 포함하는 방법.
13. 제11항에 있어서,
    상기 다른 약물은 알츠하이머병의 치료를 위한 다른 약물인 방법.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 화합물은 비강 흡입, 에어로졸 흡입, 점비액, 점안액, 점이액, 정맥내, 복막내, 피하, 두개내, 척추강내, 동맥내(예를 들어, 경동맥을 통해) 또는 근육내에 의해 투여되는 방법.

Images