TW202342093A - 一種治療阿茲海默症的方法和藥物 - Google Patents

Abstract

本發明涉及一種預防和治療阿茲海默症的方法和藥物，包括給藥受試者治療有效量的纖維蛋白溶酶原激活途徑組分。本發明還涉及用於治療上述病症的包含纖維蛋白溶酶原激活途徑組分的藥物、藥物組合物、製品、試劑盒。

Description

一種治療阿茲海默症的方法和藥物

本發明涉及一種預防或治療阿茲海默症的方法，包括給藥受試者有效量的纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分或其相關化合物，例如纖溶酶原，以改善臨床症狀和體徵。

阿茲海默症（Alzheimer disease，AD）是一種起病隱匿的進行性發展的神經系統退行性疾病。臨床上以記憶障礙、失語、失用、失認、視空間技能損害、執行功能障礙以及人格和行爲改變等全面性痴呆表現爲特徵，病因迄今未明。主要表現爲認知功能下降、精神症狀和行爲障礙、日常生活能力的逐漸下降。根據認知能力和身體機能的惡化程度分成三個時期。第一階段，通常1～3年，爲輕度痴呆期。表現爲記憶減退，對近事遺忘突出；判斷能力下降，病人不能對事件進行分析、思考、判斷，難以處理複雜的問題；工作或家務勞動漫不經心，不能獨立進行購物、經濟事務等，社交困難；儘管仍能做些已熟悉的日常工作，但對新的事物却表現出茫然難解，情感淡漠，偶爾激惹，常有多疑；出現時間定向障礙，對所處的場所和人物能做出定向，對所處地理位置定向困難，複雜結構的視空間能力差；言語詞匯少，命名困難。第二階段，通常2～10年，爲中度痴呆期。表現爲遠近記憶嚴重受損，簡單結構的視空間能力下降，時間、地點定向障礙；在處理問題、辨別事物的相似點和差異點方面有嚴重損害；不能獨立進行室外活動，在穿衣、個人衛生以及保持個人儀錶方面需要幫助；計算不能；出現各種神經症狀，可見失語、失用和失認；情感由淡漠變爲急躁不安，常走動不停，可見尿失禁。第三階段，通常8～12年，爲重度痴呆期。患者已經完全依賴照護者，嚴重記憶力喪失，僅存片段的記憶；日常生活不能自理，大小便失禁，呈現緘默、肢體僵直，查體可見錐體束征陽性，有强握、摸索和吸吮等原始反射。最終昏迷，一般死於感染等併發症。

目前的治療方法主要爲對症治療，控制阿茲海默症伴發的精神病理症狀。例如如有焦慮、激越、失眠症狀施用抗焦慮藥；有抑鬱症狀施用抗抑鬱藥；爲控制病人的行爲紊亂施用抗精神病藥等。另外，爲改善認知功能，延緩疾病進展，施用益智藥或改善認知功能的藥物，例如作用於神經遞質的藥物、腦血管擴張劑、促腦代謝藥等。對於阿茲海默症的治療，需要尋找其他的治療方法和藥物。

本發明研究發現纖溶酶原可以促進阿茲海默症患者的記憶功能恢復，改善認知能力，明顯減輕和緩解阿茲海默症的各項臨床症狀和體徵，預防和治療阿茲海默症。

具體地，本發明涉及如下各項：

1. 一方面，本申請涉及一種預防和治療阿茲海默症的方法，包括給藥阿茲海默症受試者治療有效量的選自如下的一種或多種化合物：纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分、能夠直接激活纖維蛋白溶酶原或通過激活纖維蛋白溶酶原激活途徑上游組分而間接激活纖維蛋白溶酶原的化合物、模擬纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶之活性的化合物、能夠上調纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶原激活劑表達的化合物、纖維蛋白溶酶原類似物、纖維蛋白溶酶類似物、tPA或uPA類似物和纖溶抑制劑的拮抗劑。

一方面，本申請涉及選自如下的一種或多種化合物在製備治療阿茲海默症的藥物中的用途，所述一種或多種化合物選自：纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分、能夠直接激活纖維蛋白溶酶原或通過激活纖維蛋白溶酶原激活途徑上游組分而間接激活纖維蛋白溶酶原的化合物、模擬纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶之活性的化合物、能夠上調纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶原激活劑表達的化合物、纖維蛋白溶酶原類似物、纖維蛋白溶酶類似物、tPA或uPA類似物和纖溶抑制劑的拮抗劑。

一方面，本申請涉及用於治療阿茲海默症的包含選自如下的一種或多種化合物的藥物或藥物組合物，所述一種或多種化合物選自：纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分、能夠直接激活纖維蛋白溶酶原或通過激活纖維蛋白溶酶原激活途徑上游組分而間接激活纖維蛋白溶酶原的化合物、模擬纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶之活性的化合物、能夠上調纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶原激活劑表達的化合物、纖維蛋白溶酶原類似物、纖維蛋白溶酶類似物、tPA或uPA類似物和纖溶抑制劑的拮抗劑。

2. 項1所述的方法、用途、藥物或藥物組合物，其中所述纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分選自纖維蛋白溶酶原、重組人纖維蛋白溶酶、Lys-纖維蛋白溶酶原、Glu-纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、含有纖維蛋白溶酶原和纖維蛋白溶酶的一個或多個kringle結構域和蛋白酶結構域的纖維蛋白溶酶原和纖維蛋白溶酶變體及類似物、小纖維蛋白溶酶原(mini-plasminogen)、小纖維蛋白溶酶(mini-plasmin)、微纖溶酶原（micro-plasminogen）、微纖溶酶（micro-plasmin）、delta-纖溶酶原、delta-纖溶酶（delta-plasmin）、纖維蛋白溶酶原激活劑、tPA和uPA。

3. 項1的方法、用途、藥物或藥物組合物，所述纖溶抑制劑的拮抗劑爲PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白的抑制劑，例如抗體。

4.項1-3任一項的方法、用途、藥物或藥物組合物，其中所述化合物對阿茲海默症受試者具有選自如下的一種或多種作用：促進腦組織中澱粉樣蛋白Aβ40 或Aβ42的降解、改善記憶功能、改善認知能力、改善地理位置辨識能力、緩解焦慮或抑鬱症狀、減少腦組織中Aβ42沉積、促進腦組織中Tau蛋白的降解、促進腦組織中Pro-BDNF裂解形成成熟BDNF、促進腦組織中BDNF的表達、促進腦組織中Pro-NGF裂解形成成熟NGF形成、改善腦組織海馬體損傷。

5. 項1-4任一項的方法、用途、藥物或藥物組合物，其中所述化合物爲纖溶酶原。

6. 項1-5任一項的方法、用途、藥物或藥物組合物，其中所述纖溶酶原爲人全長纖溶酶原或其保守取代變體。

7. 項1-5任一項的方法、用途、藥物或藥物組合物，其中所述纖溶酶原與序列2具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖溶酶原的賴氨酸結合活性或蛋白水解活性。

8. 項1-5任一項的方法、用途、藥物或藥物組合物，所述纖溶酶原包含與序列14具有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列、並且仍然具有纖溶酶原的蛋白水解活性的蛋白質。

9. 項1-5任一項的方法、用途、藥物或藥物組合物，所述纖溶酶原選自Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、小纖溶酶原、微纖溶酶原、delta-纖溶酶原或它們的保留纖溶酶原的蛋白水解活性的變體。

10. 項1-5任一項的方法、用途、藥物或藥物組合物，所述纖溶酶原包含序列2、6、8、10、12所示的氨基酸序列或包含序列2、6、8、10、12所示氨基酸序列的保守取代變體。

11. 項1-10任一項的方法、用途、藥物或藥物組合物，其中所述化合物與一種或多種其他治療方法或藥物聯合使用。

12. 項11的方法、用途、藥物或藥物組合物，其中所述其他治療方法包括細胞治療（包括幹細胞治療）、支持療法和物理治療。

13. 項11的方法、用途、藥物或藥物組合物，其中所述其他藥物爲治療阿茲海默症的其它藥物。

14. 項1-13任一項的方法、用途、藥物或藥物組合物，其中所述化合物通過鼻腔吸入、霧化吸入、滴鼻液、滴眼液、滴耳液、靜脈內、腹膜內、皮下、顱內、鞘內、動脈內(例如經由頸動脈)或肌肉內給藥。

在本發明的上述任一實施方案中，所述纖溶酶原可與序列2、6、8、10或12具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖溶酶原活性，例如賴氨酸結合活性或蛋白水解活性。在一些實施方案中，所述纖溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基礎上，添加、删除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個氨基酸，並且仍然具有纖溶酶原活性，例如賴氨酸結合活性或蛋白水解活性的蛋白質。

在一些實施方案中，所述纖溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、並且仍然具有纖溶酶原活性，例如蛋白水解活性的蛋白質。在一些實施方案中，所述纖溶酶原選自Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、小纖溶酶原、微纖溶酶原、delta-纖溶酶原或它們的保留纖溶酶原活性，例如蛋白水解活性的變體。在一些實施方案中，所述纖溶酶原爲天然或合成的人纖溶酶原、或其仍然保留纖溶酶原活性，例如賴氨酸結合活性或蛋白水解活性的變體或片段。在一些實施方案中，所述纖溶酶原爲來自靈長類動物或嚙齒類動物的人纖溶酶原直向同系物或其仍然保留纖溶酶原活性，例如賴氨酸結合活性或蛋白水解活性的變體或片段。在一些實施方案中，所述纖溶酶原的氨基酸如序列2、6、8、10或12所示。在一些實施方案中，所述纖溶酶原是人天然纖溶酶原。

在一些實施方案中，所述受試者是人。在一些實施方案中，所述受試者缺乏或缺失纖溶酶原。在一些實施方案中，所述缺乏或缺失是先天的、繼發的和/或局部的。

在一些實施方案中，所述藥物組合物包含藥學上可接受的載劑和用於前述方法的纖溶酶原。在一些實施方案中，所述試劑盒可以是預防性或治療性試劑盒，其包含：(i)用於前述方法的纖溶酶原和(ii)用於遞送所述纖溶酶原至所述受試者的構件(means)。在一些實施方案中，所述構件爲注射器或小瓶。在一些實施方案中，所述試劑盒還包含標籤或使用說明書，該標籤或使用說明書指示將所述纖溶酶原投予所述受試者以實施前述任一方法。

在一些實施方案中，所述製品包含：含有標籤的容器；和包含(i)用於前述方法的纖溶酶原或包含纖溶酶原的藥物組合物，其中所述標籤指示將所述纖溶酶原或組合物投予所述受試者以實施前述任一方法。

在一些實施方案中，所述試劑盒或製品還包含另外的一個或多個構件或容器，該構件或容器中含有其他藥物。

在前述方法的一些實施方案中，所述纖溶酶原通過全身或局部給藥，較佳通過以下途徑施用：靜脈內、肌內、皮下給予纖溶酶原來進行治療。在前述方法的一些實施方案中，所述纖溶酶原與適當的多肽載體或穩定劑組合施用。在前述方法的一些實施方案中，所述纖溶酶原以每天0.0001-2000 mg/kg、0.001-800 mg/kg、0.01-600 mg/kg、0.1-400mg/kg、1-200mg/kg、1-100mg/kg、10-100mg/kg（以每公斤體重計算）或0.0001-2000mg/cm2、0.001-800 mg/cm2、0.01-600 mg/cm2、0.1-400 mg/cm2、1-200 mg/cm2、1-100 mg/cm2、 10-100 mg/cm2（以每平方公分體表面積計算）的劑量施用，較佳至少重複一次，較佳至少每天施用。

本發明明確涵蓋了屬於本發明實施方案之間的技術特徵的所有組合，並且這些組合後的技術方案在本申請中已經明確公開，就像上述技術方案  已經單獨且明確公開一樣。另外，本發明還明確涵蓋各個實施方案及其要素的之間的組合，該組合後的技術方案在本文中明確公開。

纖維蛋白溶解系統（Fibrinolytic system）亦稱纖溶系統，爲參與纖維蛋白溶解（纖溶）過程的一系列化學物質組成的系統，主要包括纖維蛋白溶解酶原（纖溶酶原）、纖溶酶、纖溶酶原激活物、纖溶抑制劑。纖溶酶原激活物包括組織型纖溶酶原激活物（t-PA）和尿激酶型纖溶酶原激活物（u-PA）。t-PA是一種絲氨酸蛋白酶，由血管內皮細胞合成。t-PA激活纖溶酶原，此過程主要在纖維蛋白上進行；尿激酶型纖溶酶原激活物（u-PA）由腎小管上皮細胞和血管內皮細胞産生，可以直接激活纖溶酶原而不需要纖維蛋白作爲輔因子。纖溶酶原（PLG）由肝臟合成，當血液凝固時，PLG大量吸附在纖維蛋白網上，在t-PA或u-PA的作用下，被激活爲纖溶酶，促使纖維蛋白溶解。纖溶酶（PL）是一種絲氨酸蛋白酶，作用如下：降解纖維蛋白和纖維蛋白原；水解多種凝血因子Ⅴ、Ⅷ、Ⅹ、Ⅶ、Ⅺ、Ⅱ等；使纖溶酶原轉變爲纖溶酶；水解補體等。纖溶抑制物：包括纖溶酶原激活物抑制劑（PAI）和α2抗纖溶酶（α2-AP）。PAI主要有PAI-1和PAI-2兩種形式，能特異性與t-PA以1：1比例結合，從而使其失活，同時激活PLG。α2-AP由肝臟合成，與PL以1：1比例結合形成複合物，抑制PL活性；FⅩⅢ使α2-AP以共價鍵與纖維蛋白結合，減弱了纖維蛋白對PL作用的敏感性。體內抑制纖溶系統活性的物質：PAI-1，補體C1抑制物；α2抗纖溶酶；α2巨球蛋白。

本發明的術語“纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分”涵蓋：

1. 纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、Glu-纖維蛋白溶酶原、微纖溶酶原（micro-plasminogen）、delta-纖溶酶原；它們的變體或類似物；

2. 纖維蛋白溶酶以及它們的變體或類似物；和

3. 纖維蛋白溶酶原激活劑，例如tPA和uPA以及包含一個或多個tPA或uPA的結構域(如一個或多個kringle結構域和蛋白水解結構域)的tPA或uPA變體和類似物。

上述纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA和uPA的“變體”包括所有天然存在的人類遺傳變體以及這些蛋白質的其他哺乳動物形式，以及通過添加、删除和/或取代例如1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個氨基酸、仍然具有纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA或uPA活性的蛋白質。例如，纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA和uPA的“變體”包括通過例如1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個保守性氨基酸取代獲得的這些蛋白質的突變變體。

本發明的“纖溶酶原變體”涵蓋與序列2、6、8、10或12具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖溶酶原活性，例如賴氨酸結合活性或蛋白水解活性的蛋白質。例如本發明的“纖溶酶原變體”可以是在序列2、6、8、10或12的基礎上，添加、删除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個氨基酸，並且仍然具有纖溶酶原活性，例如賴氨酸結合活性或蛋白水解活性的蛋白質。具體地，本發明纖溶酶原變體包括所有天然存在的人類遺傳變體以及這些蛋白質的其他哺乳動物形式，以及通過保守性氨基酸取代例如1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個氨基酸獲得的這些蛋白質的突變變體。

本發明的纖溶酶原可以爲來自靈長類動物或嚙齒類動物的人纖溶酶原直向同系物或其仍然保留纖溶酶原活性，例如賴氨酸結合活性或蛋白水解活性的變體，例如序列2、6、8、10或12所示的纖溶酶原，例如序列2所示的人天然纖溶酶原。

上述纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA和uPA的“類似物”包括分別提供與纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA或uPA基本相似的作用的化合物。

上述纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA和uPA的“變體”和“類似物”涵蓋包含一個或多個結構域(例如一個或多個kringle結構域和蛋白水解結構域)的纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA和uPA的“變體”和“類似物”。例如，纖維蛋白溶酶原的“變體”和“類似物”涵蓋包含一個或多個纖溶酶原結構域(例如一個或多個kringle結構域和蛋白水解結構域)的纖維蛋白溶酶原變體和類似物，例如小纖維蛋白溶酶原(mini-plasminogen)。纖維蛋白溶酶的“變體”和“類似物”涵蓋包含一個或多個纖維蛋白溶酶結構域(例如一個或多個kringle結構域和蛋白水解結構域)的纖維蛋白溶酶 “變體”和“類似物”，例如小纖維蛋白溶酶(mini-plasmin)和δ-纖維蛋白溶酶(delta-plasmin)。

上述纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA或uPA的“變體”或“類似物”是否分別具有纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA或uPA的活性，或者是否分別提供與纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA或uPA基本相似的作用可以通過本領域習知方法進行檢測，例如，通過基於酶譜法(enzymography)、ELISA(酶聯免疫吸附測定)和FACS(熒光激活細胞分選方法)通過激活的纖維蛋白溶酶活性水平來衡量，例如可以參照選自如下文獻中記載的方法測量：Ny，A.，Leonardsson，G.，Hagglund，A.C，Hagglof，P.，Ploplis，V.A.，Carmeliet，P. and Ny，T. (1999). Ovulation inplasminogen-deficient mice. Endocrinology 140，5030-5035；Silverstein RL, Leung LL, Harpel PC, Nachman RL (November 1984). "Complex formation of platelet thrombospondin with plasminogen. Modulation of activation by tissue activator". J. Clin. Invest. 74 (5): 1625–33；Gravanis I, Tsirka SE (February 2008). "Tissue-type plasminogen activator as a therapeutic target in stroke". Expert Opinion on Therapeutic Targets. 12 (2): 159–70；Geiger M, Huber K, Wojta J, Stingl L, Espana F, Griffin JH, Binder BR (Aug 1989). "Complex formation between urokinase and plasma protein C inhibitor in vitro and in vivo". Blood. 74 (2): 722–8.

在本發明的一些實施方案中，本發明的“纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分”爲纖溶酶原。在一些實施方案中，所述纖溶酶原爲人全長纖溶酶原或其保留纖溶酶原活性（例如其賴氨酸結合活性和蛋白水解活性）的保守取代變體。在一些實施方案中，所述纖溶酶原選自Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、小纖溶酶原、微纖溶酶原、delta-纖溶酶原或它們的保留纖溶酶原活性（例如其賴氨酸結合活性或蛋白水解活性）的變體。在一些實施方案中，所述纖溶酶原爲天然或合成的人纖溶酶原、或其仍然保留纖溶酶原活性（例如其賴氨酸結合活性或蛋白水解活性）的保守取代變體或其片段。在一些實施方案中，所述纖溶酶原爲來自靈長類動物或嚙齒類動物的人纖溶酶原直向同系物或其仍然保留纖溶酶原活性的保守取代變體或其片段。在一些實施方案中，所述纖溶酶原包含如序列2、6、8、10或12所示氨基酸序列。在一些實施方案中，所述纖溶酶原包含序列2、6、8、10或12所示的氨基酸序列的保守取代序列。在一些實施方案中，所述纖溶酶原的氨基酸如序列2、6、8、10或12所示。在一些實施方案中，所述纖溶酶原爲序列2、6、8、10或12所示的纖溶酶原的保守取代變體。在一些實施方案中，所述纖溶酶原是人天然纖溶酶原或其保守突變體。在一些實施方案中，所述纖溶酶原是如序列2所示的人天然纖溶酶原或其保守取代變體。

“能夠直接激活纖維蛋白溶酶原或通過激活纖維蛋白溶酶原激活途徑上游組分而間接激活纖維蛋白溶酶原的化合物”指能夠直接激活纖維蛋白溶酶原或通過激活纖維蛋白溶酶原激活途徑上游組分而間接激活纖維蛋白溶酶原的任何化合物，例如tPA、uPA、鏈激酶、沙蘆普酶、阿替普酶、瑞替普酶、替奈普酶、阿尼普酶、孟替普酶、拉諾替普酶、帕米普酶、葡激酶。

本發明“纖溶抑制劑的拮抗劑”爲拮抗、減弱、封閉、阻止纖溶抑制劑作用的化合物。所述纖溶抑制劑例如PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶和α2巨球蛋白。所述拮抗劑例如PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白的抗體，或阻斷或下調例如PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白表達的反義RNA或小RNA，或占據PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白的結合位點但無PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白功能的化合物”，或 封閉PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白的結合結構域和/或活性結構域的化合物。

纖溶酶是纖溶酶原激活系統（PA系統）的關鍵組分。它是一種廣譜的蛋白酶，能夠水解細胞外基質（ECM）的幾個組分，包括纖維蛋白、明膠、纖連蛋白、層粘連蛋白和蛋白聚糖。此外，纖溶酶能將一些金屬蛋白酶前體(pro-MMPs)激活形成具有活性的金屬蛋白酶（MMPs）。因此纖溶酶被認爲是胞外蛋白水解作用的一個重要的上游調節物。纖溶酶是由纖溶酶原通過兩種生理性的PAs：組織型纖溶酶原激活劑（tPA ）或尿激酶型纖溶酶原激活劑（uPA）蛋白水解形成的。由於纖溶酶原在血漿和其他體液中相對水平較高，傳統上認爲PA系統的調節主要通過PAs的合成和活性水平實現。PA系統組分的合成受不同因素嚴格調節，如激素、生長因子和細胞因子。此外，還存在纖溶酶和PAs的特定生理抑制劑。纖溶酶的主要抑制劑是α2-抗纖溶酶（α2-antiplasmin）。PAs的活性同時被uPA 和tPA 的纖溶酶原激活劑抑制劑-1（PAI-1）抑制以及主要抑制uPA的溶酶原激活劑抑制劑-2（PAI-2）調節。某些細胞表面具有直接水解活性的uPA特異性細胞表面受體(uPAR)。

纖溶酶原是一個單鏈糖蛋白，由791個氨基酸組成，分子量約爲92 kDa。纖溶酶原主要在肝臟合成，大量存在於胞外液中。血漿中纖溶酶原含量約爲2 μM。因此纖溶酶原是組織和體液中蛋白質水解活性的一個巨大的潜在來源。纖溶酶原存在兩種分子形式：谷氨酸-纖溶酶原（Glu-plasminogen）和賴氨酸-纖溶酶原(Lys-plasminogen)。天然分泌和未裂解形式的纖溶酶原具有一個氨基末端（N-末端）谷氨酸，因此被稱爲谷氨酸-纖溶酶原。然而，在纖溶酶存在時，谷氨酸-纖溶酶原在Lys76-Lys77處水解成爲賴氨酸-纖溶酶原。與谷氨酸-纖溶酶原相比，賴氨酸-纖溶酶原與纖維蛋白具有更高的親和力，並可以更高的速率被PAs激活。這兩種形式的纖溶酶原的Arg560-Val561肽鍵可被uPA或tPA切割，導致二硫鍵連接的雙鏈蛋白酶纖溶酶的形成。纖溶酶原的氨基末端部分包含五個同源三環，即所謂的kringles，羧基末端部分包含蛋白酶結構域。一些kringles含有介導纖溶酶原與纖維蛋白及其抑制劑α2-AP特異性相互作用的賴氨酸結合位點。最新發現一個纖溶酶原爲38 kDa的片段，其中包括kringles1-4，是血管生成的有效抑制劑。這個片段被命名爲血管抑素，可通過幾個蛋白酶水解纖溶酶原産生。

纖溶酶的主要底物是纖維蛋白，纖維蛋白的溶解是預防病理性血栓形成的關鍵。纖溶酶還具有對ECM幾個組分的底物特異性，包括層粘連蛋白、纖連蛋白、蛋白聚糖和明膠，表明纖溶酶在ECM重建中亦起著重要作用。間接地，纖溶酶還可以通過轉化某些蛋白酶前體爲活性蛋白酶來降解ECM的其他組分，包括MMP-1，MMP-2，MMP-3和MMP-9。因此，有人提出，纖溶酶可能是細胞外蛋白水解的一個重要的上游調節器。此外，纖溶酶具有激活某些潜在形式的生長因子的能力。在體外，纖溶酶還能水解補體系統的組分並釋放趨化補體片段。

“纖溶酶”是存在於血液中的一種非常重要的酶，能將纖維蛋白凝塊水解爲纖維蛋白降解産物和D-二聚體。

“纖溶酶原”是纖溶酶的酶原形式，根據swiss prot中的序列，按含有信號肽的天然人源纖溶酶原氨基酸序列（序列4）計算由810個氨基酸組成，分子量約爲90kD，主要在肝臟中合成並能夠在血液中循環的糖蛋白，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列3所示。全長的纖溶酶原包含七個結構域：位於C末端的絲氨酸蛋白酶結構域、N末端的Pan Apple(PAp)結構域以及5個Kringle結構域(Kringle1-5)。參照swiss prot中的序列，其信號肽包括殘基Met1-Gly19，PAp包括殘基Glu20-Val98，Kringle1包括殘基Cys103-Cys181，Kringle2包括殘基Glu184-Cys262，Kringle3包括殘基Cys275-Cys352，Kringle4包括殘基Cys377-Cys454，Kringle5包括殘基Cys481-Cys560。根據NCBI數據，絲氨酸蛋白酶域包括殘基Val581-Arg804。

Glu-纖溶酶原是人天然全長的纖溶酶原，由791個氨基酸組成（不含有19個氨基酸的信號肽），編碼該序列的cDNA序列如序列1所示，其氨基酸序列如序列2所示。 在體內，還存在一種是從Glu-纖溶酶原的第76-77位氨基酸處水解從而形成的Lys-纖溶酶原，如序列6所示，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列5所示。Delta-纖溶酶原 (δ-plasminogen)是全長纖溶酶原缺失了Kringle2-Kringle5結構的片段，僅含有Kringle1和絲氨酸蛋白酶域（亦稱蛋白酶結構域（protease domain，PD）），有文獻報導了delta-纖溶酶原的氨基酸序列（序列8），編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列7所示。小纖溶酶原（Mini-plasminogen）由Kringle5和絲氨酸蛋白酶域組成，有文獻報導其包括殘基Val443-Asn791（以不含有信號肽的Glu-纖溶酶原序列的Glu殘基爲起始氨基酸），其氨基酸序列如序列10所示，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列9所示。而微纖溶酶原（Micro-plasminogen）僅含有絲氨酸蛋白酶結構域，有文獻報導其氨基酸序列包括殘基Ala543-Asn791（以不含有信號肽的Glu-纖溶酶原序列的Glu殘基爲起始氨基酸），亦有專利文獻CN102154253A報導其序列包括殘基Lys531-Asn791（以不含有信號肽的Glu-纖溶酶原序列的Glu殘基爲起始氨基酸），在本專利申請中微纖溶酶原序列參考專利文獻CN102154253A，其氨基酸序列如序列12所示，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列11所示。

全長纖溶酶原的結構亦描述在Aisina等(Aisina R B , Mukhametova L I . Structure and function of plasminogen/plasmin system[J]. Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 2014, 40(6):590-605)的文章中。在該文章中，Aisina等描述纖溶酶原包括Kringle1、2、3、4、5結構域和絲氨酸蛋白酶結構域（亦稱蛋白酶結構域（protease domain，PD）），其中，Kringles負責纖溶酶原與低分子量和高分子量的配體結合（即賴氨酸結合活性），導致纖溶酶原轉變成一個更加開放的構型，從而更容易被活化；蛋白酶結構域（PD）爲殘基Val562-Asn791，tPA和UPA特異性切割纖溶酶原的Arg561-Val562位活化鍵，從而使纖溶酶原形成纖溶酶，因此，蛋白酶結構域（PD）是賦予纖溶酶原蛋白水解活性的區域。

本發明的“纖溶酶”與“纖維蛋白溶酶”、“纖維蛋白溶解酶”可互換使用，含義相同；“纖溶酶原”與“纖維蛋白溶酶原”、“纖維蛋白溶解酶原”可互換使用，含義相同。

在本申請中，所述纖溶酶原“缺乏”的含義或活性爲受試者體內纖溶酶原的含量比正常人低，低至足以影響所述受試者的正常生理功能；所述纖溶酶原“缺失”的含義或活性爲受試者體內纖溶酶原的含量顯著低於正常人，甚至活性或表達極微，只有通過外源提供才能維持正常生理功能。

所屬技術領域中具有通常知識者可以理解，本發明纖溶酶原的所有技術方案適用於纖溶酶，因此，本發明描述的技術方案涵蓋了纖溶酶原和纖溶酶。在循環過程中，纖溶酶原採用封閉的非活性構象，但當結合至血栓或細胞表面時，在纖溶酶原激活劑(plasminogen activator，PA)的介導下，其轉變爲呈開放性構象的活性纖溶酶。具有活性的纖溶酶可進一步將纖維蛋白凝塊水解爲纖維蛋白降解産物和D-二聚體，進而溶解血栓。其中纖溶酶原的PAp結構域包含維持纖溶酶原處於非活性封閉構象的重要决定簇，而KR結構域則能夠與存在於受體和底物上的賴氨酸殘基結合。習知多種能夠作爲纖溶酶原激活劑的酶，包括：組織纖溶酶原激活劑(tPA)、尿激酶纖溶酶原激活劑(uPA)、激肽釋放酶和凝血因子XII(哈格曼因子)等。

“纖溶酶原活性片段” 是指具有與底物靶序列中賴氨酸結合的活性（賴氨酸結合活性）、或發揮蛋白水解功能的活性（蛋白水解活性）、或蛋白水解活性和賴氨酸結合活性的片段。本發明涉及纖溶酶原的技術方案涵蓋了用纖溶酶原活性片段代替纖溶酶原的技術方案。在一些實施方案中，本發明所述的纖溶酶原活性片段包含纖溶酶原的絲氨酸蛋白酶結構域或由纖溶酶原的絲氨酸蛋白酶結構域組成。在一些實施方案中，本發明所述的纖溶酶原活性片段包含序列14、或包含與序列14具有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列，或由序列14組成、或由與序列14具有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列組成。在一些實施方案中，本發明所述的纖溶酶原活性片段包含選自Kringle 1、Kringle 2、Kringle 3、Kringle 4、Kringle 5中一個或多個的區域或其保守取代變體，或由選自Kringle 1、Kringle 2、Kringle 3、Kringle 4、Kringle 5中一個或多個的區域或其保守取代變體組成。在一些實施方案中，本發明所述的纖溶酶原包括含有上述纖溶酶原活性片段的蛋白質。

目前，對於血液中纖溶酶原及其活性測定方法包括：對組織纖溶酶原激活劑活性的檢測(t-PAA)、血漿組織纖溶酶原激活劑抗原的檢測(t-PAAg)、對血漿組織纖溶酶原活性的檢測(plgA)、血漿組織纖溶酶原抗原的檢測(plgAg) 、血漿組織纖溶酶原激活劑抑制物活性的檢測、血漿組織纖溶酶原激活劑抑制物抗原的檢測、血漿纖維蛋白溶酶-抗纖維蛋白溶酶複合物檢測(PAP)。其中最常用的檢測方法爲發色底物法：向受檢血漿中加鏈激酶(SK)和發色底物，受檢血漿中的PLG在SK的作用下，轉變成PLM，後者作用於發色底物，隨後用分光光度計測定，吸光度增加與纖溶酶原活性成正比。此外亦可採用免疫化學法、凝膠電泳、免疫比濁法、放射免疫擴散法等對血液中的纖溶酶原活性進行測定。

“直系同源物或直系同系物（ortholog）”指不同物種之間的同源物，既包括蛋白同源物亦包括DNA同源物，亦稱爲直向同源物、垂直同源物。其具體指不同物種中由同一祖先基因進化而來的蛋白或基因。本發明的纖溶酶原包括人的天然纖溶酶原，還包括來源於不同物種的、具有纖溶酶原活性的纖溶酶原直系同源物或直系同系物。

“保守取代變體”是指其中一個給定的氨基酸殘基改變但不改變蛋白質或酶的整體構象和功能，這包括但不限於以相似特性（如酸​​性，鹼性，疏水性，等）的氨基酸取代親本蛋白質中氨基酸序列中的氨基酸。具有類似性質的氨基酸是衆所周知的。例如，精氨酸、組氨酸和賴氨酸是親水性的鹼性氨基酸並可以互換。同樣，異亮氨酸是疏水氨基酸，則可被亮氨酸，蛋氨酸或纈氨酸替換。因此，相似功能的兩個蛋白或氨基酸序列的相似性可能會不同。例如，基於MEGALIGN算法的70%至99%的相似度（同一性）。“保守取代變體”還包括通過BLAST或FASTA算法確定具有60%以上的氨基酸同一性的多肽或酶，若能達 75%以上更好，最好能達85%以上，甚至達90%以上爲最佳，並且與天然或親本蛋白質或酶相比具有相同或基本相似的性質或功能。

“分離的”纖溶酶原是指從其天然環境分離和/或回收的纖溶酶原蛋白。在一些實施方案中，所述纖溶酶原會純化(1)至大於90%、大於95%、或大於98%的純度(按重量計)，如通過Lowry法所確定的，例如超過99% (按重量計)，(2)至足以通過使用旋轉杯序列分析儀獲得N端或內部氨基酸序列的至少15個殘基的程度，或(3)至同質性，該同質性是通過使用考馬斯藍或銀染在還原性或非還原性條件下的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)確定的。分離的纖溶酶原亦包括通過生物工程技術從重組細胞製備，並通過至少一個純化步驟分離的纖溶酶原。

術語“多肽”、“肽”和“蛋白質”在本文中可互換使用，指任何長度的氨基酸的聚合形式，其可以包括遺傳編碼的和非遺傳編碼的氨基酸，化學或生物化學修飾的或衍生化的氨基酸，和具有經修飾的肽主鏈的多肽。該術語包括融合蛋白，包括但不限於具有異源氨基酸序列的融合蛋白，具有異源和同源前導序列(具有或沒有N端甲硫氨酸殘基)的融合物；等等。

關於參照多肽序列的“氨基酸序列同一性百分數（%）”定義爲在必要時引入缺口以實現最大百分比序列同一性後，且不將任何保守替代視爲序列同一性的一部分時，候選序列中與參照多肽序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分率。爲測定百分比氨基酸序列同一性目的的對比可以以本領域技術範圍內的多種方式實現，例如使用公衆可得到的計算機軟件，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign（DNASTAR）軟件。所屬技術領域中具有通常知識者能决定用於比對序列的適宜參數，包括對所比較序列全長實現最大對比需要的任何算法。然而，爲了本發明的目的，氨基酸序列同一性百分數值是使用序列比較計算機程序ALIGN-2産生的。

在採用ALIGN-2來比較氨基酸序列的情况中，給定氨基酸序列A相對於給定氨基酸序列B的%氨基酸序列同一性（或者可表述爲具有或包含相對於、與、或針對給定氨基酸序列B的某一%氨基酸序列同一性的給定氨基酸序列A）如下計算：

分數X/Y 乘 100

其中X是由序列比對程序ALIGN-2在該程序的A和B比對中評分爲相同匹配的氨基酸殘基的數目，且其中Y是B中的氨基酸殘基的總數。應當領會，在氨基酸序列A的長度與氨基酸序列B的長度不相等的情况下，A相對於B的%氨基酸序列同一性會不等於B相對於A的%氨基酸序列同一性。除非另有明確說明，本文中使用的所有%氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2計算機程序獲得的。

如本文中使用的，術語“治療”指獲得期望的藥理和/或生理效果。所述效果可以是完全或部分預防疾病或其症狀的發生、發作，部分或完全減輕疾病和/或其症狀，和/或部分或完全治愈疾病和/或其症狀，包括：(a)預防疾病在受試者體內發生或發作，所述受試者可以具有疾病的素因，但是尚未診斷爲具有疾病；(b)抑制疾病，即阻滯其形成；和(c)減輕疾病和/或其症狀，即引起疾病和/或其症狀消退或消失。

術語“個體”、“受試者”和“患者”在本文中可互換使用，指哺乳動物，包括但不限於鼠(大鼠、小鼠)、非人靈長類、人、犬、猫、有蹄動物(例如馬、牛、綿羊、猪、山羊)等。

“治療有效量”或“有效量”指在對哺乳動物或其它受試者施用以治療疾病時足以實現對疾病的所述預防和/或治療的纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分或其相關化合物（例如纖溶酶原）的量。“治療有效量”會根據所使用的纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分或其相關化合物（例如纖溶酶原）、要治療的受試者的疾病和/或其症狀的嚴重程度以及年齡、體重等而變化。

本發明纖溶酶原的製備

纖溶酶原可以從自然界分離並純化用於進一步的治療用途，亦可以通過標準的化學肽合成技術來合成。當通過化學合成多肽時，可以經液相或固相進行合成。固相多肽合成(SPPS) (其中將序列的C末端氨基酸附接於不溶性支持物，接著序貫添加序列中剩餘的氨基酸)是適合纖溶酶原化學合成的方法。各種形式的SPPS，諸如Fmoc和Boc可用於合成纖溶酶原。用於固相合成的技術描述於Barany和Solid-Phase Peptide Synthesis; 第3-284頁於The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology.第2卷：Special Methods in Peptide Synthesis, Part A., Merrifield,等 J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2156 (1963); Stewart等, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed. Pierce Chem. Co., Rockford, Ill. (1984);和Ganesan A. 2006 Mini Rev. Med Chem. 6:3-10和Camarero JA等 2005 Protein Pept Lett. 12:723-8中。簡言之，用其上構建有肽鏈的功能性單元處理小的不溶性多孔珠。在偶聯/去保護的重複循環後，將附接的固相游離N末端胺與單個受N保護的氨基酸單元偶聯。然後，將此單元去保護，露出可以與別的氨基酸附接的新的N末端胺。肽保持固定在固相上，之後將其切掉。

可以使用標準重組方法來生産本發明的纖溶酶原。例如，將編碼纖溶酶原的核酸插入表達載體中，使其與表達載體中的調控序列可操作連接。表達調控序列包括但不限於啓動子(例如天然關聯的或異源的啓動子)、信號序列、增强子元件、和轉錄終止序列。表達調控可以是載體中的真核啓動子系統，所述載體能夠轉化或轉染真核宿主細胞(例如COS或CHO細胞)。一旦將載體摻入合適的宿主中，在適合於核苷酸序列的高水平表達及纖溶酶原的收集和純化的條件下維持宿主。

合適的表達載體通常在宿主生物體中作爲附加體或作爲宿主染色體DNA的整合部分複製。通常，表達載體含有選擇標誌物(例如氨苄青黴素抗性、潮黴素抗性、四環素抗性、卡那黴素抗性或新黴素抗性)以有助於對外源用期望的DNA序列轉化的那些細胞進行檢測。

大腸桿菌(Escherichia coli)是可以用於複製主題抗體編碼多核苷酸的原核宿主細胞的例子。適合於使用的其它微生物宿主包括桿菌，諸如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和其他腸桿菌科(enterobacteriaceae)，諸如沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、和各種假單胞菌屬(Pseudomonas)物種。在這些原核宿主中，亦可以生成表達載體，其通常會含有與宿主細胞相容的表達控制序列(例如複製起點)。另外，會存在許多公知的啓動子，諸如乳糖啓動子系統，色氨酸(trp)啓動子系統，beta-內醯胺酶啓動子系統，或來自噬菌體λ的啓動子系統。啓動子通常會控制表達，任選在操縱基因序列的情况中，並且具有核糖體結合位點序列等，以啓動並完成轉錄和翻譯。

其他微生物，諸如酵母亦可用於表達。酵母(例如釀酒酵母(S. cerevisiae))和畢赤酵母(Pichia)是合適的酵母宿主細胞的例子，其中合適的載體根據需要具有表達控制序列(例如啓動子)、複製起點、終止序列等。典型的啓動子包含3-磷酸甘油酸激酶和其它糖分解酶。誘導型酵母啓動於特別包括來自醇脫氫酶、異細胞色素C、和負責麥芽糖和半乳糖利用的酶的啓動子。

在微生物外，哺乳動物細胞(例如在體外細胞培養物中培養的哺乳動物細胞) 亦可以用於表達並生成本發明的抗-Tau抗體(例如編碼主題抗-Tau抗體的多核苷酸)。參見Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987)。合適的哺乳動物宿主細胞包括CHO細胞系、各種Cos細胞系、HeLa細胞、骨髓瘤細胞系、和經轉化的B細胞或雜交瘤。用於這些細胞的表達載體可以包含表達控制序列，如複製起點，啓動子和增强子(Queen等, Immunol. Rev. 89:49 (1986))，以及必需的加工信息位點，諸如核糖體結合位點，RNA剪接位點，多聚腺苷酸化位點，和轉錄終止子序列。合適的表達控制序列的例子是白免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳頭瘤病毒、巨細胞病毒等衍生的啓動子。參見Co等, J. Immunol. 148:1149 (1992)。

一旦合成(化學或重組方式)，可以依照本領域的標準規程，包括硫酸銨沉澱，親和柱，柱層析，高效液相層析(HPLC)，凝膠電泳等來純化本發明所述的纖溶酶原。該纖溶酶原是基本上純的，例如至少約80%至85%純的，至少約85%至90%純的，至少約90%至95%純的，或98%至99%純的或更純的，例如不含污染物，所述污染物如細胞碎片，除目標産物以外的大分子，等等。

藥物配製劑

可以通過將具有所需純度的纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分或其相關化合物（例如纖溶酶原）與可選的藥用載體，賦形劑，或穩定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16版，Osol, A. ed.(1980))混合形成凍乾製劑或水溶液製備治療配製劑。可接受的載體、賦形劑、穩定劑在所用劑量及濃度下對受者無毒性，並包括緩衝劑例如磷酸鹽，檸檬酸鹽及其它有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化己烷雙胺；氯化苄烷銨(benzalkonium chloride)，苯索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；烷基對羥基苯甲酸酯如甲基或丙基對羥基苯甲酸酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；間甲酚)；低分子量多肽(少於約10個殘基)；蛋白質如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，穀氨醯胺、天冬醯胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA；糖類如蔗糖、甘露醇、岩藻糖或山梨醇；成鹽反離子如鈉；金屬複合物(例如鋅-蛋白複合物)；和/或非離子表面活性劑，例如 TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。較佳凍乾的抗-VEGF抗體配製劑在WO 97/04801中描述，其包含在本文中作爲參考。

本發明的配製劑亦可含有需治療的具體病症所需的一種以上的活性化合物，較佳活性互補並且相互之間沒有副作用的那些。

本發明的纖溶酶原可包裹在通過諸如凝聚技術或界面聚合而製備的微膠囊中，例如，可置入在膠質藥物傳送系統(例如，脂質體，白蛋白微球，微乳劑，納米顆粒和納米膠囊)中或置入粗滴乳狀液中的羥甲基纖維素或凝膠-微膠囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊中。這些技術公開於Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.(1980)。

用於體內給藥的本發明的纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分或其相關化合物（例如纖溶酶原）必需是無菌的。這可以通過在冷凍乾燥和重新配製之前或之後通過除菌濾膜過濾而輕易實現。

本發明的纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分或其相關化合物（例如纖溶酶原）可製備緩釋製劑。緩釋製劑的適當實例包括具有一定形狀且含有糖蛋白的固體疏水聚合物半通透基質，例如膜或微膠囊。緩釋基質實例包括聚酯、水凝膠(如聚(2-羥基乙基-異丁烯酸酯)(Langer等，J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277(1981)；Langer, Chem. Tech., 12:98-105(1982))或聚(乙烯醇)，聚交酯(美國專利3773919, EP 58,481)，L-谷氨酸與γ乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman，等，Biopolymers 22:547(1983))，不可降解的乙烯－乙烯乙酸酯(ethylene-vinyl acetate)(Langer，等，出處同上)，或可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如Lupron DepotTM(由乳酸-羥基乙酸共聚物和亮氨醯脯氨酸(leuprolide)乙酸酯組成的可注射的微球體)，以及聚D-(-)-3-羥丁酸。聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羥基乙酸能持續釋放分子100天以上，而一些水凝膠釋放蛋白的時間却較短。可以根據相關機理來設計使蛋白穩定的合理策略。例如，如果發現凝聚的機理是通過硫代二硫鍵互換而形成分子間S-S鍵，則可通過修飾巰基殘基、從酸性溶液中凍乾、控制濕度、採用合適的添加劑、和開發特定的聚合物基質組合物來實現穩定。

給藥和劑量

可以通過不同方式，例如通過鼻腔吸入、霧化吸入、滴鼻液或滴眼液，靜脈內，腹膜內、皮下、顱內、鞘內、動脈內(例如經由頸動脈)、肌內、直腸給藥來實現本發明藥物組合物的施用。

用於胃腸外施用的製備物包括無菌水性或非水性溶液、懸浮液和乳劑。非水性溶劑的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油，和可注射有機酯，如油酸乙酯。水性載體包括水、醇性/水性溶液、乳劑或懸浮液，包括鹽水和緩衝介質。胃腸外媒介物包含氯化鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化鈉、或固定油。靜脈內媒介物包含液體和營養補充物、電解質補充物，等等。亦可以存在防腐劑和其他添加劑，諸如例如，抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、和惰性氣體，等等。

醫務人員會基於各種臨床因素確定劑量方案。如醫學領域中公知的，任一患者的劑量取决於多種因素，包括患者的體型、體表面積、年齡、要施用的具體化合物、性別、施用次數和路徑、總體健康、和同時施用的其它藥物。本發明包含纖溶酶原的藥物組合物的劑量範圍可以例如爲每天約0.0001至2000 mg/kg，或約0.001至500 mg/kg (例如0.02 mg/kg，0.25 mg/kg，0.5 mg/kg，0.75 mg/kg，10 mg/kg，50 mg/kg等等)受試者體重。例如，劑量可以是1 mg/kg體重或50 mg/kg體重或在1-50 mg/kg的範圍，或至少1 mg/kg。高於或低於此例示性範圍的劑量亦涵蓋在內，特別是考慮到上述的因素。上述範圍中的中間劑量亦包含在本發明的範圍內。受試者可以每天、隔天、每周或根據通過經驗分析確定的任何其它日程表施用此類劑量。例示性的劑量日程表包括連續幾天0.01-100mg/kg。在本發明的藥物施用過程中需要實時評估治療效果和安全性。

製品或藥盒

本發明的一個實施方案涉及一種製品或藥盒，其包含纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分或其相關化合物（例如纖溶酶原）。所述製品較佳包括一個容器，標籤或包裝插頁。適當的容器有瓶子，小瓶，注射器等。容器可由各種材料如玻璃或塑料製成。所述容器含有組合物，所述組合物可有效治療本發明的疾病或病症並具有無菌入口(例如所述容器可爲靜脈內溶液包或小瓶，其含有可被皮下注射針穿透的塞子的)。所述組合物中至少一種活性劑爲纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分或其相關化合物（例如纖溶酶原）。所述容器上或所附的標籤說明所述組合物用於治療本發明所述病症。所述製品可進一步包含含有可藥用緩衝液的第二容器，諸如磷酸鹽緩衝的鹽水，林格氏溶液以及葡萄糖溶液。其可進一步包含從商業和使用者角度來看所需的其它物質，包括其它緩衝液，稀釋劑，過濾物，針和注射器。此外，所述製品包含帶有使用說明的包裝插頁，包括例如指示所述組合物的使用者將包含纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分或其相關化合物（例如纖溶酶原）的組合物以及治療伴隨的疾病的其它藥物給藥患者。

實施例

以下所有實施例中使用的纖維蛋白溶酶原(簡稱纖溶酶原)來自人捐贈者血漿，基於如下文獻描述的方法：KennethC Robbins,Louis Summaria,David Elwyn et al.Further Studies on the Purification and Characterization of Human Plasminogen and Plasmin. Journal of Biological Chemistry , 1965 , 240 (1) :541-550；Summaria L, Spitz F, Arzadon L et al. Isolation and characterization of the affinity chromatography forms of human Glu- and Lys-plasminogens and plasmins. J Biol Chem. 1976 Jun 25;251(12):3693-9；HAGAN JJ, ABLONDI FB, DE RENZO EC. Purification and biochemical properties of human plasminogen. J Biol Chem. 1960 Apr;235:1005-10，並進行製程優化，從人捐贈者血漿中純化獲得。其中纖溶酶原單體＞98%。

實施例 1 在 PBS 緩衝液體系中，纖溶酶原可促進澱粉樣蛋白（ Aβ ）降解

取Eppendorf (EP) 管分別設爲①空白對照、②溶媒對照、③纖溶酶原組、④纖溶酶原+tPA組，每組4個。空白對照組加入43.3μL生理鹽水、16μL纖溶酶原溶液（0.575mg/mL）、10μL超純水、30.7μL PBS緩衝液（10mM，pH7.4，Thermo Fisher，10010-031）；溶媒對照組加入43.3μL Aβ40（上海强耀生物科技有限公司，04010011521，1.0mg/mL）、16μL溶媒溶液（10mM檸檬酸鈉，2%鹽酸精氨酸，3%甘露醇，PH7.4）、10μL超純水、30.7μL PBS緩衝液；纖溶酶原組加入43.3μL Aβ40（1.0mg/mL）、16μL纖溶酶原溶液（0.575mg/mL）、10μL超純水、30.7μL PBS緩衝液；纖溶酶原+tPA組加入43.3μL Aβ40（1.0mg/mL）、8μL纖溶酶原溶液（1.15mg/mL）、8μL tPA溶液（1.0mg/mL）、10μL賴氨酸溶液（0.1mM）、30.7μL PBS緩衝液。之後，37℃溫育3h，再分別加入100μL 0.1%三氟乙酸溶液終止反應。

根據Tris-Tricine-SDS-PAGE凝膠製備試劑盒（Solarbio，P1320）的說明書的指導製備20%凝膠。各組樣品分別與4×上樣緩衝液（TaKaRa，e2139）以體積比爲3:1混勻後，100℃加熱5min，冷却後離心1min，然後取20μL上樣。電泳條件爲30V 跑1h，然後100V電泳至膠底。電泳結束後剝凝膠置於1‰考馬斯亮藍染色液（1g考馬斯亮藍R250溶於1000ml乙醇：冰醋酸：純化水體積比爲5:2:13的混合液中）中染色30min，再用脫色液（純化水：冰醋酸：無水乙醇=17:2:1體積比混合）脫色至乾淨。凝膠在照膠儀下定量掃描並拍照。

澱粉樣蛋白(Aβ)的聚集是形成阿爾茲海默症的關鍵因素，其中，含40和42個殘基的Aβ40和Aβ42沉積於腦部海馬和紋狀體形成老年斑塊是造成AD主要的致病因素 ^[1]。腦脊液中Aβ40和Aβ42含量檢測亦逐漸成爲臨床阿爾茲海默症的生理指標。

結果顯示，溶媒對照組Aβ40的量沒發生任何改變，定義爲100%；纖溶酶原組在單獨加纖溶酶原時Aβ40發生部分降解；纖溶酶原+tPA組在添加纖溶酶原和tPA時Aβ40體外降解情况明顯，和溶媒對照組比具有顯著性差異（**代表P＜0.01）(圖1)。表明在PBS緩衝液體系中，纖溶酶原可促進Aβ40降解。

實施例 2 在家兔腦脊液中，纖溶酶原可促進澱粉樣蛋白（ Aβ ）降解

取Eppendorf (EP) 管分別設爲①空白對照、②溶媒對照、③纖溶酶原組，每組各4個。空白對照組加入43.3μL生理鹽水、16μL纖溶酶原溶液（0.575mg/mL）、40.7μL 家兔腦脊液；溶媒對照組加入43.3μL Aβ40（上海强耀生物科技有限公司，04010011521，1.0mg/mL）、16μL溶媒溶液（10mM檸檬酸鈉，2%鹽酸精氨酸，3%甘露醇，PH7.4）、40.7μL家兔腦脊液；纖溶酶原組加入43.3μL Aβ40（1.0mg/mL）、16μL纖溶酶原溶液（0.575mg/mL）、40.7μL家兔腦脊液。之後，37℃溫育3h，再分別加入100μL 0.1%三氟乙酸溶液終止反應。

根據Tris-Tricine-SDS-PAGE凝膠製備試劑盒（Solarbio，P1320）的說明書的指導製備20%凝膠。各組樣品分別與4×上樣緩衝液（TaKaRa，e2139）以體積比爲3:1混勻後，100℃加熱5min，冷却後離心1min，然後取20μL上樣。電泳條件爲30V 跑1h，然後100V電泳至膠底。電泳結束後剝凝膠置於1‰考馬斯亮藍染色液（1g考馬斯亮藍R250溶於1000ml乙醇：冰醋酸：純化水體積比爲5:2:13的混合液中）中染色30min，再用脫色液（純化水：冰醋酸：無水乙醇=17:2:1體積比混合）脫色至乾淨。凝膠在照膠儀下定量掃描並拍照。

結果顯示，溶媒對照組Aβ40的量沒發生任何改變，定義爲100%；纖溶酶原組在單獨加纖溶酶原時Aβ40發生部分降解，降解至74.81% (圖2)。表明在家兔腦脊液中，纖溶酶原可促進Aβ40降解。

實施例 3 在阿爾茲海默症模型、正常小鼠腦勻漿液中，纖溶酶原促進人澱粉樣蛋白 Aβ40 降解

選取11周齡B6SJLTg (APPSwFlLon, PSEN1*M146L*L286V) 6799 Vas/ Mmjax（FAD）（Stock Number：034840）（簡稱FAD）、C57BL/6（正常）小鼠各4隻，犧牲後取整個腦組織，稱重後置於 Eppendorf (EP)管中，按150mg組織/mLPBS分別加入1×PBS（Thermo Fisher，pH7.4；10010-031），4℃下勻漿（1min/次，3-4次），勻漿後於4℃離心（12000rpm，15min），取上清腦勻漿液於新的EP管中。

取Eppendorf (EP) 管分別設爲①空白對照組、②溶媒對照組、③纖溶酶原組，各組設置5個平行。空白對照組加入21.5μL生理鹽水、4.6μL纖溶酶原溶液（2mg/mL）、23.9μL小鼠腦勻漿液；溶媒對照組加入21.5μL Aβ40（上海强耀生物科技有限公司，04010011521，1.0mg/mL）、4.6μL溶媒溶液（10mM檸檬酸鈉，2%鹽酸精氨酸，3%甘露醇，PH7.4）、23.9μL小鼠腦勻漿液；纖溶酶原組加入21.5mL Aβ40（1.0mg/mL）、4.6μL纖溶酶原溶液（2mg/mL）、23.9μL小鼠腦勻漿液。各組樣品加好後，37℃溫育6h後分別加入50μL 0.1%三氟乙酸溶液終止反應。

根據Tris-Tricine-SDS-PAGE凝膠製備試劑盒（Solarbio，P1320）配膠說明製備20%凝膠。各組樣品分別與4×上樣緩衝液（TaKaRa，e2139）以體積比爲3:1混勻後，100℃加熱5min，冷却後離心1min，然後取20μL上樣。電泳條件爲30V跑1h，然後100V電泳至膠底。電泳結束後剝凝膠置於1‰考馬斯亮藍染色液（1g考馬斯亮藍R250溶於1000ml乙醇：冰醋酸：純化水體積比爲5:2:13的混合液中）中染色30min，再用脫色液（純化水：冰醋酸：無水乙醇=17:2:1體積比混合）脫色至乾淨。凝膠在生物分子成像儀下拍照並定量掃描。

結果顯示，在阿爾茲海默症模型小鼠腦勻漿液中，纖溶酶原組人澱粉樣蛋白Aβ40的量明顯低於溶媒對照組，且差異極顯著（***表示P＜0.001＝；在正常小鼠腦勻漿液中，纖溶酶原組澱粉樣蛋白Aβ40的量明顯低於溶媒對照組，且差異極顯著（P=0.001）（圖3）。表明在阿爾茲海默症模型、正常小鼠腦勻漿液中，纖溶酶原可有效地促進人澱粉樣蛋白Aβ40降解。

實施例 4 在阿爾茲海默症模型、正常小鼠腦勻漿液中，纖溶酶原促進人澱粉樣蛋白 Aβ42 降解

選取11周齡B6SJLTg (APPSwFlLon, PSEN1*M146L*L286V) 6799 Vas/ Mmjax（FAD）（Stock Number：034840）（簡稱FAD）、C57BL/6（正常）小鼠各4隻，犧牲後取整個腦組織，稱重後置於 Eppendorf (EP)管中，按150mg組織/mLPBS分別加入1×PBS（Thermo Fisher，pH7.4；10010-031），4℃下勻漿（1min/次，3-4次），勻漿後於4℃離心（12000rpm，15min），取上清腦勻漿液於新的EP管中備用。

取Eppendorf (EP) 管分別設爲①空白對照組、②溶媒對照組、③纖溶酶原組，各組設置5個平行。空白對照組加入21.5μL生理鹽水、4.6μL纖溶酶原溶液（2mg/mL）、23.9μL小鼠腦勻漿液；溶媒對照組加入21.5μL Aβ42（上海强耀生物科技有限公司， 04010011526，1.0mg/mL）、4.6μL溶媒溶液（10mM檸檬酸鈉，2%鹽酸精氨酸，3%甘露醇，PH7.4）、23.9μL小鼠腦勻漿液；纖溶酶原組加入21.5mL Aβ42（1.0mg/mL）、4.6μL纖溶酶原溶液（2mg/mL）、23.9μL小鼠腦勻漿液。各組樣品加好後，37℃溫育6h後分別加入50μL 0.1%三氟乙酸溶液終止反應。

根據Tris-Tricine-SDS-PAGE凝膠製備試劑盒（Solarbio，P1320）配膠說明製備20%凝膠。各組樣品分別與4×上樣緩衝液（TaKaRa，e2139）以體積比爲3:1混勻後，100℃加熱5min，冷却後離心1min，然後取20μL上樣。電泳條件爲30V跑1h，然後100V電泳至膠底。電泳結束後剝凝膠置於1‰考馬斯亮藍染色液（1g考馬斯亮藍R250溶於1000ml混合液（乙醇：冰醋酸：純化水體積比爲5:2:13））中染色30min，再用脫色液（純化水：冰醋酸：無水乙醇=17:2:1體積比混合）脫色至乾淨。凝膠在生物分子成像儀下拍照並定量掃描。

結果顯示，在阿爾茲海默症模型小鼠腦勻漿液中，纖溶酶原組澱粉樣蛋白Aβ42的量低於溶媒對照組，且其聚合物a、b、c的量均明顯低於溶媒組，差異極顯著（*代表P＜0.05；***代表P＜0.001＝；在正常小鼠腦勻漿液中，纖溶酶原組澱粉樣蛋白Aβ42的量明顯低於溶媒對照組，且差異極顯著（***代表P＜0.001＝，且其聚合物a、b、c的量均低於溶媒組，差異極顯著（***代表P＜0.001＝（圖4）。表明在FAD、正常小鼠腦勻漿液中，纖溶酶原可有效地促進人澱粉樣蛋白Aβ42及其聚合物降解。

實施例 5 纖溶酶原促進阿爾茲海默模型小鼠記憶功能恢復

B6SJL-Tg (APPSwFlLon, PSEN1*M146L* L286V)6799Vas/Mmjax（簡稱FAD）（購自Jackson lab實驗室，品系號：034840）小鼠爲研究阿爾茲海默常用的轉基因模型小鼠。選取12周齡FAD雌鼠12隻，根據體重結果隨機分爲兩組，溶媒組和給藥組，每組各6隻小鼠，選取SJLB6 （Stock Number：10012）雌鼠6隻做爲正常對照組。給藥組小鼠按照1mg/0.1ml/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原，溶媒組小鼠尾靜脈注射相同體積溶媒（4%精氨酸+2%甘氨酸溶液），正常對照組小鼠不做給藥處理，連續給藥5天。開始給藥定爲第1天，於第6天進行Y迷宮自發性交替反應實驗。Y迷宮由三個完全相同的臂組成。每個臂盡頭有食物提供裝置，根據分析動物取食的策略即進入各臂的次數、時間、正確次數、錯誤次數、路線等參數可以反映出實驗動物的空間記憶能力，現常用於學習記憶功能評價。該實驗完全利用嚙齒類動物對新奇環境探索的天性，動物必須依靠前一次的記憶做出正確的進臂選擇，可有效地評價動物的空間工作記憶能力。實驗時將動物放入一條臂的末端，讓其自由探索幾分鐘，一段時間後將動物再次放入迷宮進行正式檢測。記錄動物進入各臂的順序和總次數，當連續進入不同的臂（例如1,2,3或1,3,2）時，記爲一次正確交替（Alternation）反應。動物放在一個臂的末端，記錄8分鐘內動物進入各臂的順序。

最大的交替爲進入臂次數的總數-2，然後計算百分數=實際Alternation/最大Alternation x 100%，最終要給出的值包括實際Alternation數，最大Alternation數，二者的百分數，動物活動總路程和總進臂次數 ^[2]。

阿茲海默症（AD）是一種起病隱匿的進行性發展的神經系統退行性疾病，以認知障礙、神經變性、β-澱粉樣蛋白沉積、神經纖維纏結形成和神經炎症爲特徵 ^[3]。FAD轉基因小鼠是研發AD治療藥物的常用模型動物。

自發性交替反應百分比

自發交替反應百分比是實際Alternation與最大Alternation x 100%的比值。結果顯示，相對於正常對照組小鼠，溶媒組小鼠自發性交替反應百分比明顯增加；給藥組小鼠自發性交替反應百分比明顯低於溶媒對照組，統計差異顯著（*表示P＜0.05），且接近正常對照小鼠（圖5）。

總進臂次數

總進臂次數是指規定時間內小鼠進入臂次數的總和。結果顯示，相對於正常對照組小鼠，溶媒組小鼠總進臂次數明顯減少；給藥組小鼠總進臂次數明顯多於溶媒對照組，統計差異顯著（*表示P＜0.05），且接近正常對照小鼠（圖6）。

總運動路程

總運動路程是指規定時間內小鼠運動軌迹的總長度。結果顯示，相對於正常對照小鼠，溶媒組小鼠總運動路程明顯減少；給藥組小鼠總運動路程明顯多於溶媒對照組，統計差異顯著（*表示P＜0.05），且更加接近正常對照小鼠（圖7）。

以上結果表明纖溶酶原能夠促進阿爾茲海默模型小鼠自發性交替反應恢復，促進記憶恢復。

實施例 6 纖溶酶原減少阿爾茲海默模型小鼠大腦皮層 Aβ42 沉積

取8周齡的雄性C57小鼠20隻，造模前進行稱重，根據體重排除異常小鼠後所有小鼠隨機分爲兩組，溶媒組和給藥組，每組各10隻。所有小鼠麻醉，根據小鼠立體定位圖譜，定位於海馬的粒細胞層（根據前鹵點的坐標定位：AP-2.0mm，ML ±1.5mm，DV2.0mm），每隻小鼠雙側緩慢微量注射，注射速率爲0.5μL/min，注射體積3μL，模型組小鼠注射Aβ1-42寡聚體溶液，以建立阿爾茲海默模型 ^[3]，模型對照組小鼠注射PBS溶液。Aβ1-42寡聚體溶液製備（10μM）：取β-Amyloid(1-42)（上海强耀生物科技有限公司，04010011521），加入冷的六氟異丙醇，配製濃度爲1mg/ml，室溫放置3天，分裝45μL/管，即10nmol/mL，放置通風橱中過夜，置於25℃乾燥箱中乾燥1小時，-80℃保存。使用時每管加入二甲基亞碸溶液10μl複溶，注射時加入無菌PBS溶液990μL，4℃放置24h後使用。腦定位注射21天後，溶媒組及給藥組小鼠開始給藥，記爲第1天，給藥組小鼠按照1mg/0.1ml/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原，溶媒組小鼠尾靜脈注射0.1ml/隻/天溶媒（4%精氨酸+2%甘氨酸溶液），連續給藥28天。第29天犧牲小鼠取材大腦於10%甲醛固定24-48小時。固定後的腦組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。定位切片黑質，切片厚度爲4μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液（Vector laboratories, Inc., USA）封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液， 滴加兔抗小鼠Aβ42抗體(Abcam, ab201060) 4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔 IgG (HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明幷中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

β-澱粉樣蛋白（amyloid β-protein, Aβ）的神經毒性作用在阿茲海默症的病程進展中發揮著主要作用 ^[4]。

上述實驗結果顯示，溶媒組（圖8A）小鼠大腦皮層Aβ42沉積水平明顯高於給藥組（圖8B），且光密度定量分析結果統計差異顯著（*表示P＜0.05）（圖8C）。提示纖溶酶原能夠明顯減少阿爾茲海默模型小鼠大腦皮層Aβ42沉積。

實施例 7 纖溶酶原降低阿爾茲海默模型小鼠腦組織中 Aβ42 水平

將B6SJL-Tg (APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax小鼠品系號：034840，購自Jackson 實驗室)與C57BL/6J小鼠回交一次繁育的子鼠（簡稱B6-F1-FAD）。取16-17周齡的雌性B6-F1-FAD小鼠18隻和9周齡的C57BL/6J雌性小鼠9隻。B6-F1-FAD根據體重和Y迷宮實驗檢測結果隨機分爲兩組，溶媒組和給藥組，每組9隻。9隻C57BL/6J做爲空白對照組。分組完成後，空白對照組小鼠與溶媒組小鼠尾靜脈注射溶媒（4%精氨酸+2%甘氨酸溶液），每隻小鼠注射量爲5ml/kg。給藥組小鼠尾靜脈注射纖溶酶原，每隻小鼠注射劑量爲50mg/kg，連續注射8天。用藥結束5天後，分別隨機取空白組、溶媒組、給藥組小鼠7、7、6隻犧牲，取材腦組織，4℃勻漿後取上清液即勻漿液，進行BCA法總蛋白濃度檢測和Western blot檢測。

根據Tris-Tricine-SDS-PAGE凝膠製備試劑盒（Solarbio，P1320）配膠說明製備16.5%凝膠。各組樣品分別與4×上樣緩衝液（TaKaRa，e2139）以體積比爲3:1混勻後，100℃加熱5 min，冷却後離心2 min，然後取100ug總蛋白上樣。電泳條件爲30V跑1.5h，然後100V電泳至膠底。電泳結束後剝取凝膠轉移到PVDF膜（GE，A29433753）上，電泳條件爲15V，2.5h。轉移後的PVDF膜浸泡在封閉液（5%脫脂乳液）中於4℃冰箱中封閉過夜，TBST（0.01M Tris-NaCl，pH7.6緩衝液）洗4次後，加入兔抗鼠Aβ42抗體(Abcam, ab201060)室溫孵育2h，TBST洗4次後，加入山羊抗兔 IgG (HRP)抗體(Abcam，ab6721)二抗室溫孵育1h，TBST洗4次後，將PVDF膜放於乾淨成像板上，加入Immobilon Western HRP Substrate（MILLIPORE，WBKLS0100）顯色，在生物分子成像儀下拍照並用Image J定量分析。

結果顯示，空白對照組小鼠腦勻漿中具有一定水平不Aβ42蛋白，溶媒組小鼠腦組織中Aβ42水平明顯高於給藥組小鼠，且統計P值爲0.09（圖9）。提示纖溶酶原能夠降低阿爾茲海默模型小鼠腦組織中Aβ42水平。

實施例 8 在正常小鼠腦勻漿中，纖溶酶原促進 Tau 蛋白降解

取11~12周齡18-25g的C57BL/6J雄性小鼠4隻，犧牲後取整個腦並稱重，按150mg組織/mLPBS分別加入1×PBS（Thermo Fisher，pH7.4；10010-031），4℃下勻漿（1min，3-4次），勻漿後於4℃離心（12000rpm，20min），取上清液即腦勻漿液置於新的EP管中。

取Eppendorf (EP) 管分別設爲①空白組、②空白對照組、③溶媒對照組、④纖溶酶原組，各組分別設置5個平行。空白組加入21.5μL生理鹽水、4.6μL溶媒溶液（10 mM 檸檬酸鈉，2%鹽酸精氨酸，3%甘露醇，pH 7.4）、23.9μL小鼠腦勻漿；空白對照組加入21.5μL生理鹽水、4.6μL纖溶酶原溶液（0.5mg/mL）、23.9μL小鼠腦勻漿；溶媒對照組加入21.5μLTau蛋白溶液（南京金斯瑞生物科技有限公司，定制表達人Tau蛋白，UniProtKB - P10636-8，1.0mg/mL）、4.6μL溶媒溶液、23.9μL小鼠腦勻漿；纖溶酶原組加入21.5μLTau蛋白溶液（1.0mg/mL）、4.6μL纖溶酶原溶液（0.5mg/mL）、23.9μL小鼠腦勻漿。各組樣品加好後，37℃溫育6h後分別加入50μL 0.1%三氟乙酸溶液終止反應。

根據SDS-PAGE配膠說明製備10%凝膠。各組樣品分別與4×上樣緩衝液（TaKaRa，e2139）以體積比爲3:1混勻後，100℃加熱5 min，冷却後離心2 min，然後取20μL上樣。電泳條件爲30V跑45 min，然後100V電泳至膠底。電泳結束後剝取凝膠轉移到活化的PVDF膜（GE，A29433753）上，電泳條件爲15V，2.5h。轉移後的PVDF膜浸泡在封閉液（5%脫脂乳液）中於4℃冰箱中封閉過夜，TBST（0.01M Tris-NaCl，pH7.6緩衝液）洗4次後，加入兔源Tau蛋白抗體（Abcam, ab151559）室溫孵育2h，TBST洗4次後，加入山羊抗兔 IgG (HRP)抗體(Abcam，ab6721)二抗室溫孵育1h，TBST洗4次後，將PVDF膜放於乾淨成像板上，加入Immobilon Western HRP Substrate（MILLIPORE，WBKLS0100）顯色，在生物分子成像儀下拍照並用Image J定量分析。

Tau蛋白是含量最高的微管相關蛋白。Tau蛋白爲含磷酸基蛋白，正常成熟腦中Tau蛋白分子含2～3個磷酸基。而阿爾茨海默症（老年痴呆症）患者腦的Tau蛋白則異常過度磷酸化，每分子Tau蛋白可含5～9個磷酸基，並喪失正常生物功能 ^[5]。

結果顯示，在正常小鼠腦勻漿液中，纖溶酶原組Tau蛋白的量明顯低於溶媒對照組，差異顯著（*代表P＜005，**代表P＜0.01，***代表P＜0.001）（圖10）。表明纖溶酶原能夠促進正常小鼠腦勻漿中Tau蛋白降解。

實施例 9 在阿爾茲海默小鼠腦勻漿中，纖溶酶原促進 Tau 蛋白降解

選取11周齡B6SJLTg (APPSwFlLon, PSEN1*M146L*L286V) 6799 Vas/ Mmjax（FAD）（Stock Number：034840）（簡稱FAD）小鼠各4隻犧牲後取整個腦並稱重，按實施例8所述製備腦勻漿液置於EP管中。

取Eppendorf (EP) 管分別設爲①空白組、②空白對照組、③溶媒對照組、④纖溶酶原組，各組設置5個平行。空白組加入21.5μL生理鹽水、4.6μL溶媒溶液（10 mM 檸檬酸鈉，2%鹽酸精氨酸，3%甘露醇，pH 7.4）、23.9μL小鼠腦勻漿；空白對照組加入21.5μL生理鹽水、4.6μL纖溶酶原溶液（0.5mg/mL）、23.9μL小鼠腦勻漿；溶媒對照組加入21.5μLTau（南京金斯瑞生物科技有限公司，定制表達人Tau蛋白，UniProtKB - P10636-8，1.0mg/mL）、4.6μL溶媒溶液、23.9μL小鼠腦勻漿；纖溶酶原組加入21.5μLTau（1.0mg/mL）、4.6μL纖溶酶原溶液（0.5mg/mL）、23.9μL小鼠腦勻漿。各組樣品加好後，37℃溫育6h後分別加入50μL 0.1%三氟乙酸溶液終止反應。

根據SDS-PAGE配膠說明製備10%凝膠。各組樣品分別與4×上樣緩衝液（TaKaRa，e2139）以體積比爲3:1混勻後，100℃加熱5 min，冷却後離心2 min，然後取20μL上樣。電泳條件爲30V跑45 min，然後100V電泳至膠底。電泳結束後剝取凝膠轉移到活化的PVDF膜（GE，A29433753）上，電泳條件爲15V，2.5h。轉移後的PVDF膜浸泡在封閉液（5%脫脂乳液）中於4℃冰箱中封閉過夜，TBST（0.01M Tris-NaCl，pH7.6緩衝液）洗4次後，加入兔源Tau蛋白抗體（Abcam, ab151559）室溫孵育2h，TBST洗4次後，加入山羊抗兔 IgG (HRP)抗體(Abcam，ab6721)二抗室溫孵育1h，TBST洗4次後，將PVDF膜放於乾淨成像板上，加入Immobilon Western HRP Substrate（MILLIPORE，WBKLS0100）顯色，在生物分子成像儀下拍照並用Image J定量分析。

結果顯示，在阿爾茲海默小鼠腦勻漿液中，纖溶酶原組Tau蛋白的量明顯低於溶媒對照組，且統計差異顯著（*代表P＜005，**代表P＜0.01）（圖11）。表明纖溶酶原能夠促進阿爾茲海默小鼠腦勻漿中Tau蛋白降解。

實施例 10 纖溶酶原降低阿爾茲海默模型小鼠腦組織中 Tau 蛋白水平

將B6SJL-Tg  (APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax小鼠品系號：034840，購自Jackson 實驗室)與C57BL/6J小鼠回交三次繁育的子鼠（簡稱B6-F3-FAD）。取20-25周齡的雌性B6-F3-FAD小鼠18隻和9周齡的C57BL/6J雌性小鼠9隻。B6-F3-FAD根據體重和Y迷宮實驗檢測結果隨機分爲兩組，溶媒組和給藥組，每組9隻。9隻C57BL/6J做爲空白對照組。分組完成後，空白對照組小鼠與溶媒組小鼠尾靜脈注射溶媒（4%精氨酸+2%甘氨酸溶液），每隻小鼠注射量爲5ml/kg。給藥組小鼠尾靜脈注射纖溶酶原，每隻小鼠注射劑量爲50mg/kg，連續注射28天。用藥結束7天後，各組隨機取小鼠犧牲，取材腦組織，4℃勻漿後取上清液即腦勻漿液進行BCA法總蛋白檢測和Western blot檢測。

根據SDS-PAGE凝膠製備試劑盒（Solarbio，P1320）配膠說明製備10%凝膠。各組樣品分別與4×上樣緩衝液（TaKaRa，e2139）以體積比爲3:1混勻後，100℃加熱5 min，冷却後離心2 min，然後取100ug總蛋白上樣。電泳條件爲30V跑1.5h，然後100V電泳至膠底。電泳結束後剝取凝膠轉移到PVDF膜（GE，A29433753）上，電泳條件爲15V，2.5h。轉移後的PVDF膜浸泡在封閉液（5%脫脂乳液）中於4℃冰箱中封閉過夜，TBST（0.01M Tris-NaCl，pH7.6緩衝液）洗4次後，加入兔抗鼠Tau抗體（Abcam, ab151559）室溫孵育2h，TBST洗4次後，加入山羊抗兔 IgG (HRP)抗體(Abcam，ab6721)二抗室溫孵育1h，TBST洗4次後，將PVDF膜放於乾淨成像板上，加入Immobilon Western HRP Substrate（MILLIPORE，WBKLS0100）顯色，在生物分子成像儀下拍照並用Image J定量分析。

結果顯示，空白對照組小鼠腦勻漿中具有一定水平不同分子量的Tau蛋白；給藥組小鼠腦組織中各分子量Tau蛋白和總Tau蛋白水平與溶媒組小鼠相比，明顯低於溶媒組小鼠，且兩組35kd、35-40kd、40 kd、54 kd分子量Tau蛋白水平和總Tau蛋白水平統計分析P值分別爲0.174、0.0406、0.052、0.067和0.055（圖12）。說明纖溶酶原能夠促進阿爾茲海默模型小鼠腦組織中Tau蛋白降解。

實施例 11 在阿爾茲海默症模型小鼠腦勻漿液中，纖溶酶原促進 Pro-BDNF 裂解

選取11周齡B6SJLTg (APPSwFlLon, PSEN1*M146L*L286V) 6799 Vas/ Mmjax（FAD）（Stock Number：034840）（簡稱FAD）小鼠各4隻，犧牲後取整個腦組織，如上所述製備腦勻漿液於EP管中。

取Eppendorf (EP) 管分別設爲①空白組、②空白對照組、③溶媒對照組、④給藥組，各組設置5個平行。空白組加入21.5μL生理鹽水、4.6μL溶媒溶液（10 mM 檸檬酸鈉，2%鹽酸精氨酸，3%甘露醇，pH 7.4）、23.9μL小鼠腦勻漿；空白對照組加入21.5μL生理鹽水、4.6μL纖溶酶原溶液（2mg/mL）、23.9μL小鼠腦勻漿液；溶媒對照組加入21.5μL Pro-BDNF（南京金斯瑞生物科技有限公司，定制表達，UniProtKB - P23560，1.0mg/mL）、4.6μL溶媒溶液（檸檬酸-檸檬酸鈉溶液）、23.9μL小鼠腦勻漿液；纖溶酶原組加入21.5mL Pro-BDNF（1.0mg/mL）、4.6μL纖溶酶原溶液（2mg/mL）、23.9μL小鼠腦勻漿液。各組樣品加好後，37℃溫育6h後分別加入50μL 0.1%三氟乙酸溶液終止反應。

根據SDS-PAGE配膠說明製備12%凝膠。各組樣品分別與4×上樣緩衝液（TaKaRa，e2139）以體積比爲3:1混勻後，100℃加熱5 min，冷却後離心2 min，然後取20μL上樣。電泳條件爲30V跑45min，然後100V電泳至膠底。電泳結束後剝凝膠於1‰考馬斯亮藍染色液（1g考馬斯亮藍R250溶於1000ml乙醇：冰醋酸：純化水體積比爲5:2:13的混合液中）染色30min，再用脫色液（純化水：冰醋酸：無水乙醇=17:2:1體積比混合）脫色至乾淨。凝膠在生物分子成像儀下拍照並定量掃描分析。

腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是一類分子量爲12.3 kD 的鹼性蛋白質，由119 個氨基酸殘基構成，並含有3 對二硫鍵，在體內以二聚體的形式存在，以BDNF前體的形式合成，BDNF前體（Pro-BDNF）可經酶解作用裂解形成成熟的BDNF。文獻報導Pro-BDNF與其裂解形成的成熟的BDNF具有相反的作用。Pro-BDNF促進神經細胞雕亡，降低神經突觸可塑性[6]。成熟的BDNF及其受體廣泛分布於中樞神經系統內，在中樞神經系統發育過程中，對神經元存活、分化、生長發育起重要作用，並能防止神經元受損傷死亡，改善神經元的病理狀態，促進受損傷神經元再生及分化等生物效應，而且亦是成熟的中樞及周圍神經系統的神經元維持生存及正常生理功能所必須的 ^[7]。

結果顯示，在阿爾茲海默症模型小鼠腦勻漿液中，纖溶酶原組Pro-BDNF的量明顯低於溶媒對照組，差異極顯著（*代表P＜0.05，***代表P＜0.001）（圖13）。提示纖溶酶原能夠促進阿爾茲海默症模型小鼠腦勻漿中Pro-BDNF裂解。

實施例 12 在阿爾茲海默症模型小鼠腦勻漿液中，纖溶酶原促進 Pro-BDNF 裂解形成成熟的 BDNF

選取11周齡B6SJLTg (APPSwFlLon, PSEN1*M146L*L286V) 6799 Vas/ Mmjax（FAD）（Stock Number：034840）（簡稱FAD）小鼠各4隻，犧牲後取整個腦組織，如上所述製備腦勻漿液於EP管中。

取Eppendorf (EP) 管分別設爲①空白組、②空白對照組、③溶媒對照組、④給藥組，各組設置5個平行。空白組加入21.5μL生理鹽水、4.6μL溶媒溶液（10 mM 檸檬酸鈉，2%鹽酸精氨酸，3%甘露醇，pH 7.4）、23.9μL小鼠腦勻漿；空白對照組加入21.5μL生理鹽水、4.6μL纖溶酶原溶液（2mg/mL）、23.9μL小鼠腦勻漿液；溶媒對照組加入21.5μL Pro-BDNF（南京金斯瑞生物科技有限公司，定制表達，UniProtKB - P23560，1.0mg/mL）、4.6μL溶媒溶液（檸檬酸-檸檬酸鈉溶液）、23.9μL小鼠腦勻漿液；纖溶酶原組加入21.5mL Pro-BDNF（1.0mg/mL）、4.6μL纖溶酶原溶液（2mg/mL）、23.9μL小鼠腦勻漿液。各組樣品加好後，37℃溫育6h後分別加入50μL 0.1%三氟乙酸溶液終止反應。

根據SDS-PAGE配膠說明製備12%凝膠。各組樣品分別與4×上樣緩衝液（TaKaRa，e2139）以體積比爲3:1混勻後，100℃加熱5 min，冷却後離心2 min，然後取20μL上樣。電泳條件爲30V跑45min，然後100V電泳至膠底。電泳結束後剝取凝膠轉移到PVDF膜（GE，A29433753）上，電泳條件爲15V，2.5h。轉移後的PVDF膜浸泡在封閉液（5%脫脂乳液）中於4℃冰箱中封閉過夜，TBST（0.01M Tris-NaCl，pH7.6緩衝液）洗4次後，加入兔抗人BDNF抗體（Boster Biological Technology, PB9075）室溫孵育3h，TBST洗4次後，加入山羊抗兔 IgG (HRP)抗體(Abcam，ab6721)二抗室溫孵育1h，TBST洗4次後，將PVDF膜放於乾淨成像板上，加入Immobilon Western HRP Substrate（MILLIPORE，WBKLS0100）顯色，在生物分子成像儀下拍照並用Image J定量分析條帶光密度。

結果顯示，在阿爾茲海默症模型小鼠腦勻漿液中，纖溶酶原組Pro-BDNF的量明顯低於溶媒對照組，差異極爲顯著（**代表P＜0.01，***表示P＜0.001）；纖溶酶原組BDNF的量明顯高於溶媒對照組，差異極顯著（圖14）。提示纖溶酶原能夠促進阿爾茲海默症模型小鼠腦勻漿液Pro-BDNF裂解和成熟BDNF形成。

實施例 13 纖溶酶原阿爾茲海默模型小鼠海馬 BDNF 的表達

取24周齡的雄性C57小鼠23隻，造模前進行稱重，根據體重排除異常小鼠後所有小鼠隨機分爲兩組，空白對照組7隻和模型組16隻。所有小鼠麻醉，如實施例6所述建立阿爾茲海默模型 ^[3]。腦定位注射28天後，所有小鼠進行體重及Y迷宮檢測，根據檢測結果排除空白對照組、模型組中的異常小鼠，其中模型組小鼠隨機分爲兩組，溶媒組6隻小鼠，給藥組7隻小鼠，空白對照組6隻小鼠。溶媒組及給藥組小鼠開始給藥，記爲第1天，給藥組小鼠按照1mg/0.1ml/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原，溶媒組小鼠尾靜脈注射0.1ml/隻/天溶媒（4%精氨酸+2%甘氨酸溶液），連續給藥28天，空白對照組小鼠不做給藥處理。第29天犧牲小鼠取材大腦於10%甲醛固定24-48小時。固定後的腦組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。定位切片黑質，切片厚度爲4μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液（Vector laboratories, Inc., USA）封閉30分鐘；時間到後，弃除羊血清液， 滴加兔抗小鼠BDNF抗體（BosterBio, PB9075）4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔 IgG (HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明幷中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

結果顯示，空白對照組（圖15A）小鼠海馬表達一定水平的BDNF（箭頭標識），溶媒組（圖15B）小鼠海馬BDNF的表達明顯少於空白對照組，而給藥組（圖15C）小鼠海馬BDNF的表達明顯高於溶媒組，且統計差異顯著（*表示P＜0.05）（圖15D）。說明纖溶酶原能夠促進阿爾茲海默模型小鼠海馬BDNF的表達。

實施例 14 在阿爾茲海默症模型小鼠腦勻漿液中，纖溶酶原促進 Pro-NGF 裂解形成成熟的 NGF

選取11周齡B6SJLTg (APPSwFlLon, PSEN1*M146L*L286V) 6799 Vas/ Mmjax（FAD）（Stock Number：034840）（簡稱FAD）小鼠各4隻，犧牲後取整個腦組織，如上所述製備腦勻漿液於EP管中。

取Eppendorf (EP) 管分別設爲①空白對照組、②空白組、③溶媒對照組、④纖溶酶原組，各組設置5個平行。空白對照組21.5μL生理鹽水、4.6μL溶媒溶液（10 mM 檸檬酸鈉，2%鹽酸精氨酸，3%甘露醇，pH 7.4）、23.9μL小鼠腦勻漿；空白組加入21.5μL生理鹽水、4.6μL纖溶酶原溶液（2mg/mL）、23.9μL小鼠腦勻漿；溶媒對照組加入21.5μL Pro-NGF溶液（南京金斯瑞生物科技有限公司，定制表達人Pro-NGF，序列來源 UniProtKB - P01138，1.0mg/mL）、4.6μL溶媒溶液、23.9μL小鼠腦勻漿；纖溶酶原組加入21.μL Pro-NGF溶液（1.0mg/mL）、4.6μL纖溶酶原溶液（2mg/mL）、23.9μL小鼠腦勻漿。各組樣品加好後，37℃溫育6h後分別加入50μL 0.1%三氟乙酸溶液終止反應。

根據SDS-PAGE配膠說明製備15%凝膠。各組樣品分別與4×上樣緩衝液（TaKaRa，e2139）以體積比爲3:1混勻後，100℃加熱5 min，冷却後離心2 min，然後取20μL上樣。電泳條件爲30V跑30min，然後100V電泳至膠底。電泳結束後剝取凝膠轉移到活化的PVDF膜（GE，A29433753）上，電泳條件爲15V，2.5h。轉移後的PVDF膜浸泡在封閉液（5%脫脂乳液）中於4℃冰箱中封閉過夜，TBST（0.01M Tris-NaCl，pH7.6緩衝液）洗4次後，加入兔抗人NGF抗體（Abcam, ab52918）室溫孵育2h，TBST洗4次後，加入山羊抗兔 IgG (HRP)抗體(Abcam，ab6721)二抗室溫孵育1h，TBST洗4次後，將PVDF膜放於乾淨成像板上，加入Immobilon Western HRP Substrate（MILLIPORE，WBKLS0100）顯色，在生物分子成像儀下拍照並用Image J定量分析條帶光密度。

神經生長因子（Nerve growth factor, NGF）是神經營養因子家族中的重要成員。在體內以前體形式合成，包括信號肽、前導肽和成熟肽。研究報導神經生長因子NGF前體（Pro-NGF）與其裂解形成NGF發揮相反的作用。Pro-NGF能夠促進神經細胞雕亡。成熟的NGF 參與調節神經細胞的生長、發育、分化、生存和損傷後再修復等過程，對中樞及周圍神經元功能性表達亦有重要調控作用 ^[8]。

結果顯示，在阿爾茲海默症模型小鼠腦勻漿液中，纖溶酶原組Pro-NGF的量明顯低於溶媒對照組，差異極爲顯著（***表示P＜0.001）；纖溶酶原組NGF的量明顯高於溶媒對照組，差異顯著（圖16）。提示纖溶酶原能夠促進阿爾茲海默症模型小鼠腦勻漿液Pro-NGF裂解和成熟NGF形成。

實施例 15 纖溶酶原促進阿爾茲海默模型小鼠焦慮、抑鬱行爲恢復

取雄性C57小鼠28隻，造模前進行稱重，根據體重排除異常小鼠後所有小鼠隨機分爲2組，空白對照組8隻，模型組20隻。分組完成後，如實施例6所述建立阿爾茲海默模型 ^[3]。腦定位注射65天後，所有小鼠進行水迷宮檢測，模型對照組即爲空白對照組小鼠，根據檢測結果排除空白對照組、模型組異常小鼠，其中模型組小鼠隨機分爲兩組，溶媒組10隻小鼠，給藥組10隻小鼠，空白對照組8隻小鼠。分組完成後，溶媒組及給藥組小鼠開始第一階段給藥：給藥組小鼠按照50mg/kg/隻/天尾靜脈注纖溶酶原，溶媒組和空白對照組小鼠尾靜脈注射5ml/kg隻/天溶媒（4%精氨酸+2%甘氨酸溶液），連續給藥28 天。第一階段給藥結束50天後開始第二階段給藥，給藥方式同第一階段，連續給藥7天。第二階段給藥第8天進行曠場實驗。

曠場實驗

實驗時，小鼠放入曠場（40x40x40cm）底面中心，同時進行攝像和計時，觀察持續5分鐘，每隻小鼠進行3次實驗。Smart系統是一個完整且方便使用的視頻跟踪系統，用於評估實驗動物的行爲。 它允許記錄軌跡，活動，特定行爲（如旋轉，拉伸和飼養）和事件，並執行各種分析參數的計算。本實驗使用Smart3.0系統記錄分析小鼠的運動情况，參數包括邊界區總移動路程和中心區運動路程。每次實驗中採用70%酒精擦拭箱體防止嗅覺産生的偏好 ^[1]。

曠場實驗的設計原理是基於小鼠的趨避性，指的是小鼠畏懼開闊、未知、可能存在潜在危險的場所，因而其有“貼牆”活動的天性。總路程和平均速度被視爲反映小鼠自發活動的主要數據，趨避性是以小鼠在曠野周邊區（四個角和四個邊）的活動來評價的。從反映趨避性的周邊區活動時間看，時間減少，說明小鼠更富有“冒險”傾向。在中央區活動時間顯著增多，說明趨避性和焦慮（抑鬱）水平較低。

邊界區運動路程百分比

邊界區運動路程百分比爲規定時間內小鼠在邊界區運動軌迹的長度與總運動軌迹長度的比值。結果顯示，空白對照組具有一定的邊界區運動路程百分比，溶媒組小鼠邊界區運動路程百分比明顯多於空白對照組，給藥組小鼠邊界區運動路程百分比明顯小於溶媒組，且統計差異接近顯著（P-0.08）（圖17）。提示纖溶酶原能夠促進阿爾茲海默模型小鼠焦慮、抑鬱行爲恢復。

中心區運動路程百分比

中心區運動路程百分比爲規定時間內小鼠在中心區運動軌迹的長度與總運動軌迹長度的比值。結果顯示，空白對照組具有一定的中心區運動路程百分比，溶媒組小鼠中心區運動路程百分比明顯小於空白對照組，給藥組小鼠中心區運動路程百分比明顯大於溶媒組，且統計差異接近顯著（P-0.08）（圖18）。提示纖溶酶原能夠促進阿爾茲海默模型小鼠焦慮、抑鬱行爲恢復。

實施例 16 纖溶酶原促進阿爾茲海默模型小鼠焦慮、抑鬱行爲恢復

取雄性C57小鼠28隻，造模前進行稱重，根據體重排除異常小鼠後所有小鼠隨機分爲2組，空白對照組8隻，模型組20隻。分組完成後，如實施例6所述建立阿爾茲海默模型 ^[3]。腦定位注射65天後，所有小鼠進行水迷宮檢測，模型對照組即爲空白對照組小鼠，根據檢測結果排除空白對照組、模型組異常小鼠，其中模型組小鼠隨機分爲兩組，溶媒組10隻小鼠，給藥組10隻小鼠，空白對照組8隻小鼠。分組完成後，溶媒組及給藥組小鼠開始第一階段給藥：給藥組小鼠按照50mg/kg/隻/天尾靜脈注纖溶酶原，溶媒組和空白對照組小鼠尾靜脈注射5ml/kg隻/天溶媒（4%精氨酸+2%甘氨酸溶液），連續給藥28 天。第一階段給藥結束50天後開始第二階段給藥，給藥方式同第一階段，連續給藥9天。第二階段給藥結束兩天後進行高架十字迷宮行爲學檢測。

高架十字迷宮是利用動物對新異環境的探究特性和對高懸敞開臂的恐懼形成矛盾衝突行爲來考察動物的焦慮狀態。高架十字迷宮具有一對開臂和一對閉臂，嚙齒類動物由於嗜暗性會傾向於在閉臂中活動，但出於好奇心和探究性又會在開臂中活動，在面對新奇刺激時，動物同時産生探究的衝動與恐懼，這就造成了探究與回避的衝突行爲，從而産生焦慮心理。而抗焦慮藥物能明顯增加進入開臂的次數與時間，十字迷宮距離地面較高，相當於人站在峭壁上，使實驗對象産生恐懼和不安心理。高架十字迷宮被廣泛應用於新藥開發/篩選/評價、藥理學、毒理學、預防醫學、神經生物學、動物心理學及行爲生物學等多個學科的科學-研究和計算機輔助教學等領域，是醫學院校與科研機構開展行爲學研究尤其是焦慮抑鬱研究的經典實驗。

實驗開始時將小鼠從中央格面向閉合臂放入迷宮，記錄5分鐘內的活動情况。觀察指標包括：開放臂進入次數(必須有兩隻前抓進入臂內)，開放臂停留時間，閉合臂進入次數，閉合臂停留時間。計算開放臂停留時間比例，開放臂進入次數比例，高架十字迷宮中總進入次數。實驗完成後將小鼠取出，將兩臂清理乾淨，噴灑酒精除去氣味。最後用動物行爲學軟件進行數據分析。

總運動路程

總運動路程是指在規定記錄時間內小鼠總運動軌迹長度。結果顯示，空白對照組具有一定的總運動路程；溶媒組運動路程明顯大於空白對照組；給藥組總運動路程明顯小於溶媒組，統計差異極爲顯著（*表示P＜0.05，**表示P＜0.01）（圖19），且更加接近空白對照組小鼠總運動路程。提示纖溶酶原能夠促進阿爾茲海默模型小鼠焦慮、抑鬱行爲恢復。

閉合臂運動路程

閉合臂運動路程是指規定時間內閉合臂運動軌迹長度。結果顯示，空白對照組小鼠具有一定的閉合臂運動路程；溶媒組閉合臂運動路程明顯大於空白對照組小鼠；給藥組小鼠閉合臂運動路程明顯小於溶媒組，兩組比較統計差異顯著（*表示P＜0.05，**表示P＜0.01）（圖20），且給藥組閉合臂運動路程更加接近空白對照組。提示纖溶酶原能夠促進阿爾茲海默模型小鼠焦慮、抑鬱行爲恢復。

閉合臂運動路程百分比

閉合臂運動路程百分比是指規定時間內閉合臂運動軌迹長度與總運動軌迹長度的比值。結果顯示，空白對照組小鼠具有一定的閉合臂運動路程百分比；溶媒組閉合臂運動路程百分比明顯大於空白對照組小鼠；給藥組小鼠閉合臂運動路程百分比明顯小於溶媒組，兩組比較統計差異顯著（*表示P＜0.05）（圖21），且給藥組閉合臂運動路程百分比更加接近空白對照組。提示纖溶酶原能夠促進阿爾茲海默模型小鼠焦慮、抑鬱行爲恢復。

閉合臂進入次數

結果顯示，空白對照組小鼠具有一定的閉合臂進入次數；溶媒組閉合臂進入次數明顯多於空白對照組小鼠；給藥組小鼠閉合臂進入次數明顯少於溶媒組，兩組比較統計差異極爲顯著（*表示P＜0.05，**表示P＜0.01）（圖22），且給藥組閉合臂進入次數更加接近空白對照組。提示纖溶酶原能夠促進阿爾茲海默模型小鼠焦慮、抑鬱行爲恢復。

閉合臂時間

閉合臂時間是指規定時間能小鼠在閉合臂中停留時間。結果顯示，空白對照組小鼠具有一定的閉合臂時間，溶媒組小鼠閉合臂停留時間明顯短於空白對照組，給藥組小鼠閉合臂時間明顯多於溶媒組，兩組比較統計差異顯著（*表示P＜0.05，**表示P＜0.01）（圖23），且給藥組閉合臂時間更加接近空白對照組。提示纖溶酶原能夠促進阿爾茲海默模型小鼠焦慮、抑鬱行爲恢復。

閉合臂時間百分率

閉合臂時間百分率是指小鼠在閉合臂中停留時間與記錄總時間比值。結果顯示，空白對照組小鼠具有一定的閉合臂時間百分率，溶媒組小鼠閉合臂時間百分率明顯低於空白對照組，給藥組小鼠閉合臂時間百分率明顯高於溶媒組，這兩組比較統計差異顯著（*表示P＜0.05，**表示P＜0.01）（圖24），且給藥組閉合臂時間百分率更加接近空白對照組。提示纖溶酶原能夠促進阿爾茲海默模型小鼠焦慮、抑鬱行爲恢復。

閉合臂平均速度

閉合臂平均速度是指閉合臂運動路程與閉合臂時間的比值。結果顯示，空白對照組具有一定的閉合臂平均運動速度，溶媒組閉合臂平均運動速度明顯大於空白對照組，給藥組閉合臂平均運動速度明顯小於溶媒組，這兩組比較統計差異極爲顯著（**表示P＜0.01）（圖25），且給藥組閉合臂平均運動速度更加接近空白對照組。提示纖溶酶原能夠促進阿爾茲海默模型小鼠焦慮抑鬱行爲恢復。

實施例 17 纖溶酶原促進阿爾茲海默模型小鼠記憶能力恢復

取雄性C57小鼠28隻，造模前進行稱重，根據體重排除異常小鼠後所有小鼠隨機分爲2組，空白對照組8隻，模型組20隻。分組完成後，如實施例6所述建立阿爾茲海默模型 ^[3]。腦定位注射65天後，所有小鼠進行水迷宮檢測，模型對照組即爲空白對照組小鼠，根據檢測結果排除空白對照組、模型組異常小鼠，其中模型組小鼠隨機分爲兩組，溶媒組10隻小鼠，給藥組10隻小鼠，空白對照組8隻小鼠。分組完成後，溶媒組及給藥組小鼠開始第一階段給藥：給藥組小鼠按照50mg/kg/隻/天尾靜脈注纖溶酶原，溶媒組和空白對照組小鼠尾靜脈注射5ml/kg隻/天溶媒（4%精氨酸+2%甘氨酸溶液），連續給藥28 天。第一階段給藥結束50天後開始第二階段給藥，給藥方式同第一階段，連續給藥9天。第二階段給藥結束兩天後進行Y迷宮行爲學檢測。

結果顯示，相對於空白對照組小鼠，溶媒組小鼠自發性交替反應百分比明顯降低；給藥組小鼠自發性交替反應百分比明顯高於溶媒組，兩組比較統計差異顯著（*表示P＜0.05），且給藥組接近空白對照小鼠（圖26）。提示纖溶酶原能夠促進阿爾茲海默模型小鼠記憶功能恢復。

實施例 18 纖溶酶原促進阿爾茲海默模型小鼠焦慮、抑鬱行爲恢復

選取20-25周齡的B6SJL-Tg (APPSwFlLon, PSEN1*M146L* L286V)6799Vas/Mmjax（種鼠購自Jackson lab實驗室，品系號：034840）雌鼠18隻，根據體重及Y迷宮檢測結果隨機分爲兩組，溶媒組9隻小鼠，給藥組9隻小鼠，先取同周齡段的C57雌鼠9隻做爲空白對照組。分組完成後，空白對照組小鼠與溶媒組小鼠尾靜脈注射溶媒（4%精氨酸+2%甘氨酸溶液），注射量爲5ml/kg。給藥組小鼠靜脈注射纖溶酶原，注射劑量爲50mg/kg，連續注射18天。第19天進行高架十字迷宮行爲學實驗。

結果顯示，空白對照組小鼠具有一定的閉合臂運動路程；溶媒組閉合臂運動路程明顯小於空白對照組小鼠；給藥組小鼠閉合臂運動路程明顯大於溶媒組，兩組比較統計差異顯著（**表示P＜0.01，***表示P＜0.001）（圖27），且給藥組閉合臂運動路程更加接近空白對照組。提示纖溶酶原能夠促進阿爾茲海默模型小鼠焦慮、抑鬱行爲恢復。

實施例 19 纖溶酶原改善阿爾茲海默模型小鼠海馬體損傷

將B6SJL-Tg (APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax小鼠品系號：034840，購自Jackson 實驗室)與C57BL/6J小鼠回交一次繁育的子鼠（簡稱B6-F1-FAD）。取16-17周齡的雌性B6-F1-FAD小鼠18隻和9周齡的C57BL/6J雌性小鼠9隻。B6-F1-FAD根據體重和Y迷宮實驗檢測結果隨機分爲兩組，溶媒組和給藥組，每組9隻。9隻C57BL/6J做爲空白對照組。分組完成後，空白對照組小鼠與溶媒組小鼠尾靜脈注射溶媒（4%精氨酸+2%甘氨酸溶液），每隻小鼠注射量爲5ml/kg。給藥組小鼠尾靜脈注射纖溶酶原，每隻小鼠注射劑量爲50mg/kg，連續注射8天。用藥結束5天後，犧牲小鼠，取材腦組織於10%中性甲醛溶液固定24-48小時。固定後的腦組織組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。切片厚度爲3μm，切片脫蠟複水並用蘇木素和伊紅染色(HE染色)，1%鹽酸酒精分化後氨水返藍並酒精梯度脫水封片，切片在200倍光學顯微鏡下定位觀察海馬情况。

結果顯示，空白對照組（圖28A）小鼠海馬體組織形態正常；相較於溶媒組（圖28B），給藥組（圖28C）海馬體組織形態明顯改善。提示纖溶酶原能夠改善阿爾茲海默模型小鼠海馬體損傷。

實施例 20 對自願接受纖溶酶原治療的阿爾茲海默症患者的治療效果

以下患者均簽署了知情同意書，自願用藥，並獲得醫院倫理委員會批准。

患者 1 ，男，76歲，半年前出現記憶減退，性格變得執拗記憶能力和學習新事物能力減退，經臨床診斷爲阿爾茲海默症。用藥方案：50毫克起靜脈注射，每天加10毫克，同時從第三天開始霧化吸入10毫克。每天用藥一次，持續13天。

療效：家屬陳述用藥過程中，患者精神狀態逐漸好轉，反應靈敏度逐漸、明顯改善，在用藥後期患者學習新事物能力改善，記憶能力改善。用藥13天後，身體總體感覺好轉約50%，記憶力好轉約50%。

表明纖溶酶原能夠改善阿爾茲海默病人的記憶力、學習能力和精神狀態。

患者 2 ，女，96歲。病史：高血壓20餘年，無心臟病和糖尿病病史，大約半年前病人出現記憶減退，學習能力退化，思維能力和交流能力減退，易激惹，情感淡漠，簡易智力狀態檢查量表（MMSE）測試得分10分。

用藥方案：霧化結合靜脈注射。第一天：霧化吸入3次，每次5毫克，從第二天開始，霧化同前，從30毫克開始，靜脈注射，每天加10毫克，連續用藥7天。

簡易智力狀態檢查量表（MMSE）能全面、準確、迅速地反映被試智力狀態及認知功能缺損程度。該表簡單易行，國內外廣泛應用，是痴呆篩查的首選量表。評分參考：分數在27-30分，正常；分數＜27分，認知功能障礙；分數21-26，輕度；分數10-20,中度；分數0-9，重度。

療效：1.精神好轉；2.老人老年痴呆的症狀好轉，記憶力增加；3.老人焦慮減少；4. MMSE得分14分，主要體現在可以配合別人的指令做動作。給藥前後MMSE評分見表1。

表明纖溶酶原可以提高阿爾茲海默病人的MMSE評分，改善患者的記憶力、思維能力、焦慮和精神狀態。

表1 給藥前後MMSE評分

	MMSE評分
給藥前	10
給藥後	14

患者 3 ，女，87歲，記憶力不好，理解能力差，入院檢查，醫生診斷爲腦梗，記憶力和理解能力受到影響，表現出老年痴呆的現象，意識輕度錯亂，處於亞譫妄狀態，對周圍環境不能正確辨認，時間地點錯亂，與人交流有障礙，總體狀况評分爲10分。（總體狀况評分，第一天以沒有打藥爲10，打藥後以昨天情况爲10爲最嚴重，1爲最輕，0爲正常）。

用藥方案：150-250毫克靜脈注射，加霧化吸入10毫克/次，4小時1次，一天3次，用藥14天。停藥一周後，繼續一周用藥，方法同前，霧化吸入劑量爲15毫克/次，4小時1次，一天3次。停藥一周後，繼續用兩周，隔天給藥，250毫克靜脈注射，霧化15毫克/次，4小時1次，一天3次。後改爲一周2次，用量400毫克靜脈注射，加霧化10毫克/次，一天2次，用藥2周。現爲一周1次用藥，500毫克靜脈注射，加霧化10毫克/次，一天2次，一周2天用藥。

治療過程中以上症狀逐漸好轉，在用藥14天時病人情緒好轉，與人交流基本無障礙，記憶力有所恢復，對時間的概念逐漸清晰，總體狀况評分4分。與人交流70%-80%可以理解並準確應答，雖然在人名上，常常張冠李戴，但是人物具體定向上沒有問題。

表明纖溶酶原可改善阿爾茲海默症，包括改善患者的記憶力、交流能力、認知能力、定向能力。

患者 4 ，女，91歲，診斷爲輕度腦萎病，輕度認知障礙。患者用藥前記憶力評分爲10，計算能力評分爲10，定向力評分爲10（（總體狀况評分，第一天以沒有打藥爲10，打藥後以昨天情况爲10爲最嚴重，1爲最輕，0爲正常）。

給藥方案，50-100mg靜脈注射，一天一次，加霧化吸入10mg/次，一天2-3次。每兩天如上用藥一次，連續用藥13天。

治療第13天後，患者自記憶力評分爲9，計算能力評分爲9，定向力評分爲9。

表明纖溶酶原可改善患者的認知障礙、記憶能力、計算能力、定向能力。

患者 5 ，女，79歲，4年前出現記憶力差，脾氣暴躁等症狀，後逐漸加重。現患者比較安靜，注意力集中不超過2分鐘，語言表達障礙，短期記憶丟失。不能辨別時間、地點，容易悲傷，喪失生活自理能力。MMSE得分3分。

用藥方案：50毫克起靜脈注射，每兩天加50毫克，連續用藥14天，後每周用藥2次，每次400毫克，共治療30天。

用藥第4天開始，注意力、理解力感覺開始稍有改善；用藥第7天時，理解力，注意力進一步好轉，能理解問題，並試圖努力回答；用藥第10天時，能夠認識，記起更多事物和親人；用藥14天時，注意力可集中7～8分鐘；剛發生的事，如果狀態好時，記憶力可持續6～7分鐘；用藥第21天，注意力可以集中30分鐘以上；用藥後24天，剛發生的事情，記憶力可持續約1小時，語言表達亦更爲豐富，MMSE評分爲9分；用藥30天後MMSE評分爲9分；停藥一個月後，算數能力改善，MMSE評分爲8分。給藥前後MMSE評分見表2

表明纖溶酶原能夠提高阿爾茲海默患者的MMSE評分，改善患者的記憶能力、認知能力、注意力、理解能力、語言表達能力、計算能力。

表2 給藥前後MMSE評分

	MMSE評分
給藥前	3
給藥後（24天）	9
給藥後（30天）	9
停藥後（30天）	8

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[8]Aloe L, Rocco M L , Bianchi P , et al. Nerve growth factor: from the early discoveries to the potential clinical use[J]. Journal of Translational Medicine, 2012, 10(1).

無

圖1A-B爲 在PBS緩衝液體系中，纖溶酶原溶解澱粉樣蛋白Aβ40的Tricine-SDS電泳結果。A爲Tricine-SDS-PAGE，B爲Aβ40體外溶解定量掃描分析結果。結果顯示，溶媒對照組Aβ40的量定義爲100%，沒發生任何改變；纖溶酶原組在單獨加纖溶酶原時Aβ40部分發生降解；纖溶酶原+tPA組在添加纖溶酶原和tPA時Aβ40體外降解情况明顯，和溶媒對照組比具有顯著性差異（**代表P＜0.01）。表明纖溶酶原可促進Aβ40降解。

圖2A-B爲在家兔腦脊液中，纖溶酶原溶解澱粉樣蛋白Aβ40的Tricine-SDS電泳結果，泳道1和泳道 4爲空白對照組；泳道 2爲溶媒組；泳道3爲纖溶酶原組。A爲Tricine-SDS-PAGE，B爲Aβ40溶解定量掃描分析結果。結果顯示，溶媒對照組Aβ40的量定義爲100%，沒發生任何改變；纖溶酶原組在單獨加纖溶酶原時Aβ40部分發生降解，降解至74.81%。表明纖溶酶原可促進Aβ40降解。

圖3 A-B在家兔腦脊液中，纖溶酶原對人澱粉樣蛋白Aβ40的作用結果。A爲Tricine-SDS-PAGE電泳圖，B爲Aβ40溶解定量掃描分析結果。結果顯示，將溶媒對照組Aβ40的量定義爲100%，沒發生任何改變；纖溶酶原組在單獨加纖溶酶原時Aβ40部分發生降解，降解至74.81%。表明纖溶酶原可促進人澱粉樣蛋白Aβ40在家兔腦脊液中降解。

圖4 A-B在阿爾茲海默症模型、正常小鼠腦勻漿液中，纖溶酶原對人澱粉樣蛋白Aβ40的作用結果。A爲Tricine-SDS-PAGE電泳圖，B爲Aβ40體外溶解定量掃描分析結果。結果顯示，在FAD小鼠腦勻漿中，給藥組澱粉樣蛋白Aβ40的量明顯低於溶媒對照組，且差異極顯著（***表示P＜0.001）；在正常小鼠腦勻漿中，給藥組人澱粉樣蛋白Aβ40的量明顯低於溶媒對照組，且差異極顯著（P=0.001）。表明在阿爾茲海默症模型、正常小鼠腦勻漿中，纖溶酶原可有效地促進人澱粉樣蛋白Aβ40降解。

圖5 阿爾茲海默模型小鼠給予纖溶酶原5天後自發性交替反應百分比統計結果。結果顯示，相對於正常對照小鼠，溶媒組小鼠自發性交替反應百分比明顯增加；給藥組小鼠自發性交替反應百分比明顯低於溶媒對照組，統計差異顯著（*表示P＜0.05），且更加接近正常對照小鼠。

圖6 阿爾茲海默模型小鼠給予纖溶酶原5天後總進臂次數統計結果。結果顯示，相對於正常對照小鼠，溶媒組小鼠總進臂次數明顯減少；給藥原組小鼠總進臂次數明顯多於溶媒對照組，統計差異顯著（*表示P＜0.05），且更加接近正常對照小鼠。

圖7 阿爾茲海默模型小鼠給予纖溶酶原5天後總運動路程統計結果。結果顯示，相對於正常對照小鼠，溶媒組小鼠總運動路程明顯減少；給纖溶酶原組小鼠總運動路程明顯多於溶媒對照組，統計差異顯著（*表示P＜0.05），且更加接近正常對照小鼠。

圖8A-C 阿爾茲海默模型小鼠給予纖溶酶原28天後大腦皮層Aβ42染色定量分析結果。A爲溶媒組，B爲給藥組，C爲平均光密度定量分析結果。結果顯示，溶媒組小鼠大腦皮層Aβ42沉積水平明顯高於給藥組，且光密度定量分析結果統計差異顯著（*表示P＜0.05）。提示纖溶酶原能夠減少阿爾茲海默模型小鼠大腦皮層Aβ42沉積。

圖9A-B 給予纖溶酶原8天阿爾茲海默模型小鼠後腦組織勻漿Aβ42 Western blot結果。A爲Western blot代表性圖片，B爲光密度定量分析結果。結果顯示，空白對照組小鼠腦勻漿中具有一定水平不Aβ42蛋白，溶媒組小鼠腦組織中Aβ42水平明顯高於給藥組小鼠，且統計P值爲0.09。說明纖溶酶原能夠降低阿爾茲海默模型小鼠腦組織中Aβ42水平。

圖10A-B 在正常小鼠腦勻漿液中，纖溶酶原對Tau蛋白的作用。A爲Western blot圖片，B爲Tau蛋白條帶光密度定量分析結果。結果顯示，在正常小鼠腦勻漿液中，纖溶酶原組Tau蛋白的量明顯低於溶媒對照組，差異顯著（*代表P＜005，**代表P＜0.01，***代表P＜0.001）。提示纖溶酶原能夠促進正常小鼠腦勻漿中Tau蛋白降解。

圖11A-B 在阿爾茲海默小鼠腦勻漿液中，纖溶酶原對Tau蛋白的作用。A爲Western blot圖片，B爲Tau蛋白條帶光密度定量分析結果。結果顯示，在阿爾茲海默小鼠腦勻漿液中，纖溶酶原組Tau蛋白的量明顯低於溶媒對照組，且統計差異顯著（*代表P＜005，**代表P＜0.01）。提示纖溶酶原能夠促進阿爾茲海默小鼠腦勻漿中Tau蛋白降解。

圖12 給予纖溶酶原28天阿爾茲海默小鼠腦組織不同分子量Tau蛋白Western blot檢測結果。結果顯示，空白對照組小鼠腦勻漿中具有一定水平不同分子量的Tau蛋白；給藥組小鼠腦組織中各分子量Tau蛋白和總Tau蛋白水平明顯低於溶媒組小鼠，且兩組35kd、35-40kd、40 kd、54 kd分子量Tau蛋白水平和總Tau蛋白水平統計分析P值分別爲0.174、0.0406、0.052、0.067和0.055。說明纖溶酶原能夠促進阿爾茲海默模型小鼠腦組織中Tau蛋白降解。

圖13A-B在阿爾茲海默模型小鼠腦勻漿液中，纖溶酶原對重組人Pro-BDNF的作用。A爲SDS-PAGE成像圖片，B爲SDS-PAGE中Pro-BDNF條帶定量分析結果。結果顯示，在阿爾茲海默症模型小鼠腦勻漿液中，給藥纖溶酶原組Pro-BDNF的量明顯低於溶媒對照組，差異極顯著（*代表P＜0.05，***代表P＜0.001）。提示纖溶酶原能夠促進阿爾茲海默症模型小鼠腦勻漿中Pro-BDNF裂解。

圖14 A-C在阿爾茲海默模型小鼠腦勻漿液中，纖溶酶原對重組人Pro-BDNF的作用，A爲Western blot成像圖片，B爲Western blot中Pro-BDNF條帶光密度(OD)值分析結果，C爲Western blot中BDNF條帶光密度(OD)值分析結果。結果顯示，在阿爾茲海默症模型小鼠腦勻漿液中，給藥纖溶酶原組Pro-BDNF的量明顯低於溶媒對照組，差異極爲顯著（**代表P＜0.01，***表示P＜0.001）；給藥纖溶酶原組BDNF的量明顯高於溶媒對照組，差異極顯著。提示纖溶酶原能夠促進阿爾茲海默症模型小鼠腦勻漿液Pro-BDNF裂解和成熟BDNF形成。

圖15 A-D給予纖溶酶原28天阿爾茲海默模型小鼠海馬BDNF免疫組化染色結果。A爲空白對照組，B爲溶媒組，C爲給藥組，D爲平均光密度定量分析結果。結果顯示，空白對照組小鼠海馬表達一定水平的BDNF（箭頭標識），溶媒組小鼠海馬BDNF的表達明顯少於空白對照組，而給藥組小鼠海馬BDNF的表達明顯高於溶媒組，且統計差異顯著（*表示P＜0.05）。說明纖溶酶原能夠促進阿爾茲海默模型小鼠海馬BDNF的表達。

圖16 A-C在阿爾茲海默模型小鼠腦勻漿液中，纖溶酶原對重組人Pro-NGF的作用。A爲Western blot成像圖片，B爲Western blot中Pro-NGF條帶光密度(OD)值分析結果， C爲Western blot中NGF條帶光密度(OD)值分析結果。結果顯示，在阿爾茲海默症模型小鼠腦勻漿液中，給藥纖溶酶原組Pro-NGF的量明顯低於溶媒對照組，差異極爲顯著（***表示P＜0.001）；給藥纖溶酶原組NGF的量明顯高於溶媒對照組，差異顯著。提示纖溶酶原能夠促進阿爾茲海默症模型小鼠腦勻漿液中重組人Pro-NGF裂解和成熟NGF形成。

圖17 給予纖溶酶原後28+7天後阿爾茲海默模型小鼠曠場實驗邊界區運動路程百分比統計結果。結果顯示，空白對照組具有一定的邊界區運動路程百分比，溶媒組小鼠邊界區運動路程百分比明顯多於空白對照組，給藥組小鼠邊界區運動路程百分比明顯小於溶媒組，且統計差異接近顯著（P=0.08）。提示纖溶酶原能夠促進阿爾茲海默模型小鼠焦慮、抑鬱行爲恢復。

圖18 給予纖溶酶原後28+7天後阿爾茲海默模型小鼠曠場實驗中心區運動路程百分比統計結果。結果顯示，空白對照組具有一定的中心區運動路程百分比，溶媒組小鼠中心區運動路程百分比明顯小於空白對照組，給藥組小鼠中心區運動路程百分比明顯大於溶媒組，且統計差異接近顯著（P=0.08）。提示纖溶酶原能夠促進阿爾茲海默模型小鼠焦慮、抑鬱行爲恢復。

圖19 給予纖溶酶原後28+9天後阿爾茲海默模型小鼠高架十字迷宮實驗總運動路程統計結果。結果顯示，空白對照組具有一定的總運動路程；溶媒組運動路程明顯大於空白對照組；給藥組總運動路程明顯小於溶媒組，統計差異極爲顯著（*表示P＜0.05，**表示P＜0.01），且更加接近空白對照組小鼠總運動路程。提示纖溶酶原能夠促進阿爾茲海默模型小鼠焦慮、抑鬱行爲恢復。

圖20 給予纖溶酶原後28+9天後阿爾茲海默模型小鼠高架十字迷宮實驗閉合臂運動路程統計結果。結果顯示，空白對照組小鼠具有一定的閉合臂運動路程；溶媒組閉合臂運動路程明顯大於空白對照組小鼠；給藥組小鼠閉合臂運動路程明顯小於溶媒組，兩組比較統計差異顯著（*表示P＜0.05，**表示P＜0.01），且給藥組閉合臂運動路程更加接近空白對照組。提示纖溶酶原能夠促進阿爾茲海默模型小鼠焦慮、抑鬱行爲恢復。

圖21 給予纖溶酶原後28+9天後阿爾茲海默模型小鼠高架十字迷宮實驗閉合臂運動路程百分比統計結果。結果顯示，空白對照組小鼠具有一定的閉合臂運動路程百分比；溶媒組閉合臂運動路程百分比明顯大於空白對照組小鼠；給藥組小鼠閉合臂運動路程百分比明顯小於溶媒組，兩組比較統計差異顯著（*表示P＜0.05），且給藥組閉合臂運動路程百分比更加接近空白對照組。提示纖溶酶原能夠促進阿爾茲海默模型小鼠焦慮、抑鬱行爲恢復。

圖22給予纖溶酶原後28+9天後阿爾茲海默模型小鼠高架十字迷宮實驗閉合臂進入次數統計結果。結果顯示，空白對照組小鼠具有一定的閉合臂進入次數；溶媒組閉合臂進入次數明顯多於空白對照組小鼠；給藥組小鼠閉合臂進入次數明顯少於溶媒組，兩組比較統計差異極爲顯著（*表示P＜0.05，**表示P＜0.01），且給藥組閉合臂進入次數更加接近空白對照組。提示纖溶酶原能夠促進阿爾茲海默模型小鼠焦慮、抑鬱行爲恢復。

圖23 給予纖溶酶原後28+9天後阿爾茲海默模型小鼠高架十字迷宮實驗閉合臂時間統計結果。結果顯示，空白對照組小鼠具有一定的閉合臂時間，溶媒組小鼠閉合臂停留時間明顯短於空白對照組，給藥組小鼠閉合臂時間明顯多於溶媒組，兩組比較統計差異顯著（*表示P＜0.05，**表示P＜0.01），且給藥組閉合臂時間更加接近空白對照組。

圖24 給予纖溶酶原後28+9天後阿爾茲海默模型小鼠高架十字迷宮實驗閉合臂時間百分率統計結果。閉合臂時間百分率是指小鼠在閉合臂中停留時間與記錄總時間比值。結果顯示，空白對照組小鼠具有一定的閉合臂時間百分率，溶媒組小鼠閉合臂時間百分率明顯低於空白對照組，給藥組小鼠閉合臂時間百分率明顯高於溶媒組，這兩組比較統計差異顯著（*表示P＜0.05，**表示P＜0.01），且給藥組閉合臂時間百分率更加接近空白對照組。

圖25 給予纖溶酶原後28+9天後阿爾茲海默模型小鼠高架十字迷宮實驗閉合臂平均運動速度統計結果。結果顯示，空白對照組具有一定的閉合臂平均運動速度，溶媒組閉合臂平均運動速度明顯大於空白對照組，給藥組閉合臂平均運動速度明顯小於溶媒組，這兩組比較統計差異極爲顯著（**表示P＜0.01），且給藥組閉合臂平均運動速度更加接近空白對照組。提示纖溶酶原能夠促進阿爾茲海默模型小鼠焦慮、抑鬱行爲恢復。

圖26 給予纖溶酶原後28+9天後阿爾茲海默模型小鼠Y迷宮自發性交替反應百分比統計結果。結果顯示，相對於空白對照組小鼠，溶媒組小鼠自發性交替反應百分比明顯降低；給藥組小鼠自發性交替反應百分比明顯高於溶媒組，兩組比較統計差異顯著（*表示P＜0.05），且接近空白對照小鼠。提示纖溶酶原能夠促進阿爾茲海默模型小鼠記憶功能恢復。

圖27給予纖溶酶原後18天後阿爾茲海默模型小鼠高架十字迷宮閉合臂運動路程統計結果。結果顯示，空白對照組小鼠具有一定的閉合臂運動路程；溶媒組閉合臂運動路程明顯小於空白對照組小鼠；給藥組小鼠閉合臂運動路程明顯大於溶媒組，兩組比較統計差異顯著（**表示P＜0.01，***表示P＜0.001），且給藥組閉合臂運動路程更加接近空白對照組。提示纖溶酶原能夠促進阿爾茲海默模型小鼠焦慮、抑鬱行爲恢復。

圖28A-C給予纖溶酶原8天阿爾茲海默模型小鼠後腦組織HE染色代表性圖片。A爲空白對照組，B爲溶媒對照組，C爲給藥組。結果顯示，空白對照組小鼠海馬體組織形態正常；相較於溶媒組，給藥組海馬體組織損形態明顯改善。提示纖溶酶原能夠改善阿爾茲海默模型小鼠海馬體損傷。

無

Claims (14)

1. 一種選自如下的一種或多種化合物用於製備預防和治療阿茲海默症的藥物的用途，所述如下的一種或多種化合物選自：纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分、能夠直接激活纖維蛋白溶酶原或通過激活纖維蛋白溶酶原激活途徑上游組分而間接激活纖維蛋白溶酶原的化合物、模擬纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶之活性的化合物、能夠上調纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶原激活劑表達的化合物、纖維蛋白溶酶原類似物、纖維蛋白溶酶類似物、tPA或uPA類似物和纖溶抑制劑的拮抗劑。
2. 如請求項1所述的用途，其中所述纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分選自纖維蛋白溶酶原、重組人纖維蛋白溶酶、Lys-纖維蛋白溶酶原、Glu-纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、含有纖維蛋白溶酶原和纖維蛋白溶酶的一個或多個kringle結構域和蛋白酶結構域的纖維蛋白溶酶原和纖維蛋白溶酶變體及類似物、小纖維蛋白溶酶原(mini-plasminogen)、小纖維蛋白溶酶(mini-plasmin)、微纖溶酶原（micro-plasminogen）、微纖溶酶（micro-plasmin）、delta-纖溶酶原、delta-纖溶酶（delta-plasmin）、纖維蛋白溶酶原激活劑、tPA和uPA。
3. 如請求項1的用途，所述纖溶抑制劑的拮抗劑爲PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白的抑制劑，例如抗體。
4. 如請求項1-3任一項的用途，其中所述化合物對阿茲海默症受試者具有選自如下的一種或多種作用：促進腦組織中澱粉樣蛋白Aβ40 或Aβ42的降解、改善記憶功能、改善認知能力、改善地理位置辨識能力、緩解焦慮或抑鬱症狀、減少腦組織中Aβ42沉積、促進腦組織中Tau蛋白的降解、促進腦組織中Pro-BDNF裂解形成成熟BDNF、促進腦組織中BDNF的表達、促進腦組織中Pro-NGF裂解形成成熟NGF形成、改善腦組織海馬體損傷。
5. 如請求項1-4任一項的用途，其中所述化合物爲纖溶酶原。
6. 如請求項1-5任一項的用途，其中所述纖溶酶原爲人全長纖溶酶原或其保守取代變體。
7. 如請求項1-5任一項的用途，其中所述纖溶酶原與序列2具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖溶酶原的賴氨酸結合活性或蛋白水解活性。
8. 如請求項1-5任一項的用途，所述纖溶酶原包含與序列14具有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列、並且仍然具有纖溶酶原的蛋白水解活性的蛋白質。
9. 如請求項1-5任一項的用途，所述纖溶酶原選自Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、小纖溶酶原、微纖溶酶原、delta-纖溶酶原或它們的保留纖溶酶原的蛋白水解活性的變體。
10. 如請求項1-5任一項的用途，所述纖溶酶原包含序列2、6、8、10、12所示的氨基酸序列或包含序列2、6、8、10、12所示氨基酸序列的保守取代變體。
11. 如請求項1-10任一項的用途，其中所述化合物與一種或多種其他治療方法或藥物聯合使用。
12. 如請求項11的用途，其中所述其他治療方法包括細胞治療（包括幹細胞治療）、支持療法和物理治療。
13. 如請求項11的用途，其中所述其他藥物爲治療阿茲海默症的其它藥物。
14. 如請求項1-13任一項的用途，其中所述化合物通過鼻腔吸入、霧化吸入、滴鼻液、滴眼液、滴耳液、靜脈內、腹膜內、皮下、顱內、鞘內、動脈內(例如經由頸動脈)或肌肉內給藥。