JP2023518504A - アルツハイマー病を治療する方法及び薬剤 - Google Patents
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Abstract
Description
1、プラスミノーゲン、Lys-プラスミノーゲン、Glu-プラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン(micro-plasminogen)、delta-プラスミノーゲン、それらの変異体または類縁体;
2、プラスミン及びそれらの変異体または類縁体;及び
3、プラスミノーゲン活性化剤、例えば、tPA及びuPA、ならびにtPAまたはuPAの1つ以上のドメイン(1つ以上のkringleドメイン及びタンパク質加水分解ドメインなど)を含むtPAまたはuPA変異体及び類縁体をカバーする。
分数X/Y×100
プラスミノーゲンは治療の用途に用いられるために、自然界から分離及び精製されるものでもよく、標準的な化学ペプチド合成技術によって合成することでもよい。化学的手法によりポリペプチドを合成する際、液相または固相で合成を行うことができる。固相ポリペプチド合成(SPPS)(配列のC末端アミノ酸を不溶性支持体に附着させ、順番に配列中の残りのアミノ酸を添加する)はプラスミノーゲンの化学的合成に適したものである。各種形式のSPPS、例えばFmoc及びBocは、プラスミノーゲンの合成に用いることができる。固相合成に用いられる技術は以下に記載されている:Barany及びSolid-Phase Peptide Synthesis;3-284ページ、The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology.第二巻:Special Methods in Peptide Synthesis,Part A.,Merrifield,tら J.Am.Chem.Soc.,85:2149-2156(1963);Stewartら,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd ed.Pierce Chem.Co.,Rockford,Ill.(1984);及びGanesan A.2006Mini Rev.Med Chem.6:3-10及びCamarero JAら 2005Protein Pept Lett.12:723-8。簡単に言えば、その上にペプチド鎖が構築されている機能性ユニットにより小さい不溶性の多孔ビーズを処理する。カップリング/脱保護の繰り返し循環後に、附着した固相の遊離N末端アミンとN保護を受けている単一のアミノ酸ユニットをカップリングさせる。それから、該ユニットを脱保護し、他のアミノ酸と連結する新しいN末端アミンを露出させる。ペプチドを固相上に固定したままにし、その後それを切除する。
所望の純度のプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物(例えば、プラスミノーゲン)と必要に応じた薬用担体、賦形剤、または安定化剤(Remington’s Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.ed.(1980))を混合して凍結乾燥製剤または水溶液を形成して治療用の配合剤を得る。許容可能な担体、賦形剤、安定化剤は所要の用量及び濃度下において被験者に対して毒性がなく、さらに例えばリン酸塩、クエン酸塩及びその他の有機酸などの緩衝剤を含む。抗酸化剤はアスコルビン酸和メチオニンを含む;防腐剤(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;塩化ヘキサメチレンジアミン;塩化ベンザルコニウム(benzalkonium chloride)、ベンゼトニウムクロリド;フェノール、ブタノールまたはベンジルアルコール;アルキルパラヒドロキシ安息香酸エステル、例えばメチルまたはプロピルパラヒドロキシ安息香酸エステル;ピロカテコール;レソルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;m-クレゾール);低分子量ポリペプチド(約10個より少ない残基を有するもの);タンパク質例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン;親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン酸、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンである;単糖、二糖及びその他の炭水化物はグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む;キレート剤は例えばEDTAである;糖類は例えばショ糖、マンニトール、フコースまたはソルビトールである;塩形成対イオン、例えばナトリウム;金属複合体(例えば亜鉛-タンパク複合体);及び/または非イオン界面活性剤、例えばTWEENTM、PLURONICSTMまたはポリエチレングリコール(PEG)である。好ましい凍結乾燥された抗VEGF抗体製剤は、WO97/04801に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。
異なる方式、例えば鼻吸入、エアロゾル吸入、点鼻薬や点眼薬、静脈内、腹腔内、皮下、頭蓋内、髄腔内、動脈内(例えば、頸動脈を介して)、筋肉内、及び直腸内投与により本発明の薬物組成物の投与を実現できる。
本発明の一つの実施形態は、プラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物(例えば、プラスミノーゲン)を含む製品または薬物キットに係るものである。前記製品は好ましくひとつの容器、ラベルまたはプロトコールを含む。適切な容器はボトル、バイアル、注射器などである。容器は各種材料例えばガラスまたはプラスチックから作られることができる。前記容器は組成物を含有し、前記組成物は本発明の疾患または症状を有効に治療し且つ無菌の入口を有する(例えば前記容器は静脈輸液用パックまたはバイアルであり、皮下注射針によって貫通される栓を含む)。前記組成物中の少なくとも一種類の活性化剤がプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物(例えば、プラスミノーゲン)である。前記容器上にあるまたは添付されているラベルは前記組成物を本発明の病症の治療に用いられると説明するものである。前記製品はさらに薬用緩衝液を含有する第二容器を含み、前記薬用緩衝液は例えばリン酸塩緩衝の食塩水、リンガー溶液及びグルコース溶液を含む。さらには商業及び使用者の角度から見ると必要とされるその他の物質、即ちその他の緩衝液、希釈剤、濾過物、針及び注射器を含むことができる。また、前記製品は使用説明を有するプロトコルを含み、これには例えば前記組成物の使用者にプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物(例えば、プラスミノーゲン)の組成物及び疾患の治療に伴うその他の薬物を患者に投与することを指示することを含む。
Eppendorf(EP)チューブを取り、(1)ブランク対照群、(2)溶媒対照群、(3)プラスミノーゲン群、(4)プラスミノーゲン+tPA群で、各群に4つのチューブを設定した。ブランク対照群には、43.3μLの生理食塩水、16μLのプラスミノーゲン溶液(0.575mg/mL)、10μLの超純水、30.7μLのPBS緩衝液(10mM、pH7.4、Thermo Fisher、10010-031)を添加した;溶媒対照群に43.3μLAβ40(上海強耀生物科技有限公司(ChinaPeptides Co.,Ltd.,)、04010011521、1.0mg/mL)、16μL溶媒溶液(10mMクエン酸ナトリウム、2%塩酸アルギニン、3%マンニトール、pH7.4)、10μL超純水、30.7μLPBS緩衝液を添加した;プラスミノーゲン群に43.3μL Aβ40(1.0mg/mL)、16μLプラスミノーゲン溶液(0.575mg/mL)、10μL超純水、30.7μL PBS緩衝液を添加した;プラスミノーゲン+tPA群に、43.3μL Aβ40(1.0mg/mL)、8μLプラスミノーゲン溶液(1.15mg/mL)、8μL tPA溶液(1.0mg/mL)、10μLリジン溶液(0.1mM)、30.7μL PBS緩衝液を添加した。その後、37℃で3時間インキュベートした後、100μLの0.1%トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
Tris-Tricine-SDS-PAGEゲル調製キット(Solarbio、P1320)の説明書に従って、20%ゲルを調製した。各群のサンプルを4×ローディング緩衝液(TaKaRa、e2139)と体積比3:1で混合し、100℃で5分間加熱し、冷却して1分間遠心分離した後、20μLのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、30Vで1時間実行した後、100Vでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、1‰のクーマシーブリリアントブルー染色液(1gのクーマシーブリリアントブルーR250を、エタノール:氷酢酸:精製水の体積比が5:2:13の混合液1000mlに溶解したもの)に置いて30分間染色した後、脱色液(精製水:氷酢酸:無水エタノール=17:2:1の体積比で混合)を用いてきれいに脱色した。ゲルをイメージングデンシトメーターで定量的にスキャンし、写真を撮った。
アミロイド(Aβ)の蓄積は、アルツハイマー病の形成における重要な要因であり、そのうち40及び42残基を含むAβ40及びAβ42は、脳の海馬及び線条体に沈着して老人斑を形成し、これがアルツハイマー病の主な原因である[1]。脳脊髄液中のAβ40及びAβ42の含量検出は、徐々に臨床的アルツハイマー病の生理学的指標になりつつある。
その結果、溶媒対照群のAβ40量を100%として定義し、変化がなく、プラスミノーゲン群では、プラスミノーゲンのみを添加した場合にAβ40が部分的に分解され、プラスミノーゲン+tPA群では、プラスミノーゲンとtPAを添加した場合、Aβ40のインビトロ分解は明らかであり、溶媒対照群と比較して有意な差があった(**はP<0.01を表す)(図1)。これは、プラスミノーゲンがPBS緩衝系中でAβ40の分解を促進できることを示している。
Eppendorf(EP)チューブを取り、(1)ブランク対照群、(2)溶媒対照群、(3)プラスミノーゲン群で、各群に4つのチューブを設定した。ブランク対照群には、43.3μLの生理食塩水、16μLのプラスミノーゲン溶液(0.575mg/mL)、40.7μLのウサギ脳脊髄液を添加した;溶媒対照群に43.3μL Aβ40(上海強耀生物科技有限公司(ChinaPeptides Co., Ltd.,)、04010011521、1.0mg/mL)、16μL溶媒溶液(10mMクエン酸ナトリウム、2%塩酸アルギニン、3%マンニトール、pH7.4)、40.7μLのウサギ脳脊髄液を添加した;プラスミノーゲン群に43.3μL Aβ40(1.0mg/mL)、16μLプラスミノーゲン溶液(0.575mg/mL)、40.7μLのウサギ脳脊髄液を添加した。その後、37℃で3時間インキュベートした後、100μLの0.1%トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
Tris-Tricine-SDS-PAGEゲル調製キット(Solarbio、P1320)の説明書に従って、20%ゲルを調製した。各群のサンプルを4×ローディング緩衝液(TaKaRa、e2139)と体積比3:1で混合し、100℃で5分間加熱し、冷却して1分間遠心分離した後、20μLのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、30Vで1時間実行した後、100Vでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、1‰のクーマシーブリリアントブルー染色液(1gのクーマシーブリリアントブルーR250を、エタノール:氷酢酸:精製水の体積比が5:2:13の混合液1000mlに溶解した)に置いて30分間染色した後、脱色液(精製水:氷酢酸:無水エタノール=17:2:1の体積比で混合)を用いてきれいに脱色した。ゲルをイメージングデンシトメーターで定量的にスキャンし、写真を撮った。
その結果、溶媒対照群のAβ40の量を100%と定義し、変化がなく、プラスミノーゲン群では、プラスミノーゲンのみを添加した場合にAβ40が部分的に分解され、74.81%に分解された(図2)。これは、プラスミノーゲンがウサギの脳脊髄液中のAβ40の分解を促進できることを示している。
11週齢のB6SJLTg(APPSwFlLon、PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax(FAD)(ストック番号:034840)(FADと略称)及びC57BL/6(正常)マウス4匹ずつを選択し、殺処分して全脳組織を採取し、重量を測ってからEppendorf(EP)チューブに置いて、1×PBS(Thermo Fisher、pH7.4;10010-031)を150mg組織/mL PBSで加え、4℃でホモジナイズし(1分/回、3~4回)、ホモジナイズ後、4℃(12000rpm、15min)で遠心分離し、上清の脳ホモジネートを新しいEPチューブに移した。
Eppendorf(EP)チューブを取り、(1)ブランク対照群、(2)溶媒対照群、(3)プラスミノーゲン群で、各群に5つの並列を設定した。ブランク対照群には、21.5μLの生理食塩水、4.6μLのプラスミノーゲン溶液(2mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;溶媒対照群に21.5μL Aβ40(上海強耀生物科技有限公司(ChinaPeptides Co., Ltd.,)、04010011521、1.0mg/mL)、4.6μL溶媒溶液(10mMクエン酸ナトリウム、2%塩酸アルギニン、3%マンニトール、pH7.4)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;プラスミノーゲン群に21.5mL Aβ40(1.0mg/mL)、4.6μLプラスミノーゲン溶液(2mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、37℃で6時間インキュベートした後、50μLの0.1%トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
Tris-Tricine-SDS-PAGEゲル調製キット(Solarbio、P1320)の説明書に従って、20%ゲルを調製した。各群のサンプルを4×ローディング緩衝液(TaKaRa、e2139)と体積比3:1で混合し、100℃で5分間加熱し、冷却して1分間遠心分離した後、20μLのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、30Vで1時間実行した後、100Vでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、1‰のクーマシーブリリアントブルー染色液(1gのクーマシーブリリアントブルーR250を、エタノール:氷酢酸:精製水の体積比が5:2:13の混合液1000mlに溶解した)に置いて30分間染色した後、脱色液(精製水:氷酢酸:無水エタノール=17:2:1の体積比で混合)を用いてきれいに脱色した。ゲルを生体分子イメージャーで写真を撮って定量的にスキャンした。
その結果、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン群のヒトアミロイドAβ40量は溶媒対照群に比べて有意に低く、その差は極めて有意であった(***はP<0.001=を表す);正常なマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン群のアミロイドAβ40の量は溶媒対照群よりも有意に低く、その差は極めて有意であった(P=0.001)(図3)。これは、プラスミノーゲンがアルツハイマー病モデル及び正常マウスの脳ホモジネートにおいて、ヒトアミロイドAβ40の分解を効果的に促進できることを示している。
11週齢のB6SJLTg(APPSwFlLon、PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax(FAD)(在庫番号:034840)(FADと略称)及びC57BL/6(正常)マウス4匹ずつを選択し、殺処分して全脳組織を採取し、重量を測ってからEppendorf(EP)チューブに置いて、1×PBS(Thermo Fisher、pH7.4;10010-031)を150mg組織/mL PBSで加え、4℃でホモジナイズし(1分/回、3~4回)、ホモジナイズ後、4℃(12000rpm、15min)で遠心分離し、上清の脳ホモジネートを新しいEPチューブに移した。
Eppendorf(EP)チューブを取り、(1)ブランク対照群、(2)溶媒対照群、(3)プラスミノーゲン群で、各群に5つの並列を設定した。ブランク対照群には、21.5μLの生理食塩水、4.6μLのプラスミノーゲン溶液(2mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;溶媒対照群に21.5μL Aβ42(上海強耀生物科技有限公司(ChinaPeptides Co., Ltd.,)、04010011526、1.0mg/mL)、4.6μL溶媒溶液(10mMクエン酸ナトリウム、2%塩酸アルギニン、3%マンニトール、pH7.4)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;プラスミノーゲン群に21.5mL Aβ42(1.0mg/mL)、4.6μLプラスミノーゲン溶液(2mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、37℃で6時間インキュベートした後、50μLの0.1%トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
Tris-Tricine-SDS-PAGEゲル調製キット(Solarbio、P1320)の説明書に従って、20%ゲルを調製した。各群のサンプルを4×ローディング緩衝液(TaKaRa、e2139)と体積比3:1で混合し、100℃で5分間加熱し、冷却して1分間遠心分離した後、20μLのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、30Vで1時間実行した後、100Vでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、1‰のクーマシーブリリアントブルー染色液(1gのクーマシーブリリアントブルーR250を、エタノール:氷酢酸:精製水の体積比が5:2:13の混合液1000mlに溶解した)に置いて30分間染色した後、脱色液(精製水:氷酢酸:無水エタノール=17:2:1の体積比で混合)を用いてきれいに脱色した。ゲルを生体分子イメージャーで写真を撮って定量的にスキャンした。
その結果、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン群のアミロイドAβ42の量が溶媒対照群よりも低く、重合体a、b、cの量はいずれも溶媒群より有意に低く、その差は極めて有意であった(*はP<0.05を表し、***はP<0.001=を表す);正常なマウスの脳ホモジネートにおいて、プラスミノーゲン群のアミロイドAβ42の量は溶媒対照群より有意に低く、その差は極めて有意であり(***はP<0.001=を表す)、重合体a、b、cの量はいずれも溶媒群より低く、その差は極めて有意であった(***はP<0.001=を表す(図4))。これは、プラスミノーゲンが、FAD及び正常なマウスの脳ホモジネートにおいて、ヒトアミロイドAβ42及びその重合体の分解を効果的に促進できることを示している。
B6SJL-Tg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L* L286V)6799Vas/Mmjax(FADと略称)(Jackson labから購入、カタログ番号:034840)マウスは、アルツハイマー病の研究に一般的に使用されるトランスジェニックモデルマウスである。12週齢のFADメスマウス12匹を取り、体重の結果により溶媒群と投与群の2群にランダムに分け、各群で6匹とし、SJLB6(在庫番号:10012)メスマウス6匹を正常な対照群として選択した。投与群のマウスに1ml/0.1ml/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒群のマウスには同量の溶媒(4%アルギニン+2%グリシン溶液)を静脈注射により投与し、5日間連続投与した。正常対照群のマウスには投与をしなかった。投与開始日を1日目とし、6日目にY迷路自発交替行動実験を行った。Y迷路は、3つの同じのアームで構成されている。各アームの端には餌供給装置があり、動物の餌獲得戦略、すなわち、各アームに入る回数、時間、正しい回数、間違った回数、ルートなどのパラメーターを分析することで、実験動物の空間記憶能力が反映され、これは現在では学習及び記憶機能の評価に一般的に使用されている。この実験は齧歯類の新しい環境の探索特性を利用する。動物は前の記憶に頼って正しいアームエントリを選択しなければならない。これは、動物の空間作業記憶能力を効果的に評価することができる。実験中、動物を片方のアームの末端に置き、数分間自由に探索させ、一定期間後、正式なテストのために動物を再び迷路に入れた。動物が各アームに入った順序及び合計回数を記録し、異なるアーム(例えば、1,2,3または1,3,2)に連続して入った場合、それは1回の正しい交替(Alternation)行動として記録した。動物を一方のアームの端に置き、動物が各アームに入る順序を8分間記録した。
最大交替回数は、アームエントリ回数の合計-2であり、割合=実交替回数/最大交替回数×100%を計算し、最終的に与えられる値には、実交替回数、最大交替回数、両者の割合、動物の移動総距離及び総アーム進入回数が含まれる[2]。
アルツハイマー病(AD)は、認知障害、神経変性、β-アミロイド沈着、神経原線維変化、及び神経炎症を特徴とする、潜行性に発症する進行性の神経変性疾患である[3]。FADトランスジェニックマウスは、AD治療薬の開発に一般的に使用されるモデル動物である。
自発的交替行動率
自発的交替行動率は、実交替と最大交替×100%との比である。その結果、正常な対照マウスと比較して、溶媒群のマウスの自発的交替行動率が有意に増加し、投与群マウスの自発的交替行動率が溶媒対照群よりも有意に低く、統計的差は有意であり(*はP<0.05を示す)、正常な対照マウスに近かった(図5)。
アームエントリの総回数
アームエントリの総回数とは、指定時間内にマウスがアームに進入した回数の合計である。その結果、正常対照群のマウスと比較して、溶媒群のマウスの総アーム進入回数は有意に減少し、投与群のマウスの総アーム進入回数は、溶媒対照群のマウスより有意に多く、統計的差は有意であり(*はP<0.05を表す)、正常対照マウスに近かった(図6)。
総運動距離
総移動距離は、指定された時間内のマウスの移動軌跡の合計の長さを指す。その結果、正常対照マウスと比較して、溶媒群のマウスの総移動距離は有意に減少し、投与群のマウスの総移動距離は溶媒対照群のマウスよりも有意に長く、統計的差異は有意であり(*はP<0.05を表す)、正常対照マウスにより近かった(図7)。
上記の結果は、プラスミノーゲンがアルツハイマー病モデルマウスにおける自発交替行動の回復及び記憶の回復を促進できることを示している。
8週齢のC57オスマウス20匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重によって異常なマウスを除外した後、すべてのマウスを溶媒群と投与群の2つの群にランダムに分け、各群10匹とした。すべてのマウスを麻酔し、マウスの定位アトラスに従って海馬の顆粒球層に位置付けし(前ハロゲンポイントの座標に従って位置付け:AP-2.0mm、ML±1.5mm、DV2.0mm)、各マウスの両側にゆっくりと微量注入し、注入速度は0.5μL/分、注入量は3μLで、アルツハイマーモデル[3]を構築するために、モデル群のマウスにAβ1-42オリゴマー溶液を注入し、モデル対照群のマウスにPBS溶液を注入した。Aβ1-42オリゴマー溶液(10μM)の調製:β-アミロイド(1-42)(上海強耀生物科技有限公司(ChinaPeptides Co., Ltd.,)、04010011521)を取り、冷ヘキサフルオロイソプロパノールを加え、濃度を1mg/mlにし、室温で3日間置いた後、45μL/チューブ、すなわち10nmol/mLに分注し、ドラフト内に一晩置き、25℃の乾燥オーブンに1時間乾燥してから-80℃で保存した。使用時は各チューブにジメチルスルホキシド溶液10μlを加えて溶解し、注入時は滅菌PBS溶液990μLを加え、4℃で24時間静置してから使用した。脳局在注射21日後、溶媒群及び投与群のマウスに投与を開始し、これを1日目とし、投与群のマウスに1mg/0.1ml/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒群のマウスに0.1ml/匹/日で溶媒(4%アルギニン+2%グリシン溶液)を尾静脈注射により投与し、28日間連続して投与した。29日目にマウスを殺処分し、脳を採取して10%ホルムアルデヒドで24~48時間固定した。固定された脳組織をアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。黒質を位置付けし、切片の厚さは4μmであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから1回水で洗った。PAPマーカーで組織を丸で囲み、3%過酸化水素で15分間インキュベートし、0.01M PBSで2回洗浄し、毎回5分間であった。5%正常ヤギ血清(Vector Laboratories,Inc.,USA)で30分間ブロッキングし、時間になったらヤギ血清を捨て、ウサギ抗マウスAβ42抗体(Abcam,ab201060)を滴下して4℃で一晩インキューベートし、0.01M PBSで2回洗浄し、毎回5分間であった。ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam)二次抗体を室温で1時間インキュベートし、0.01M PBSで2回洗浄し、毎回5分間であった。DABキット(Vector laboratories,Inc.,USA)で呈色させ、水で3回洗浄した後にヘマトキシリンで30秒対比染色して、流水で5分間すすいだ。アルコール勾配で脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で200倍にて観察した。
β-アミロイド(アミロイドβタンパク質、Aβ)の神経毒性効果は、アルツハイマー病の進行において主要な役割を果たす[4]。
その結果、溶媒群(図8A)のマウスの大脳皮質におけるAβ42の沈着レベルは、投与群よりも有意に高く(図8B)、光学密度の定量分析結果の統計的差は有意であった(*はP<0.05を表す)(図8C)。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの大脳皮質におけるAβ42の沈着を減少させることができることを示唆している。
B6SJL-Tg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjaxマウス(カタログ番号:034840、Jackson Laboratoryから購入)とC57BL/6Jマウスを一回戻し交配させて子孫(B6-F1-FADと呼ぶ)を繁殖させた。16~17週齢のメスB6-F1-FADマウス18匹及び9週齢のメスC57BL/6Jマウス9匹を取った。B6-F1-FADは、体重及びY迷路試験の結果に応じて、溶媒群と投与群の2つの群にランダムに分け、各群9匹とした。9匹のC57BL/6Jをブランク対照群として使用した。群分けが完了した後、ブランク対照群のマウスと溶媒群のマウスに溶媒(4%アルギニン+2%グリシン溶液)を尾静脈注射により投与し、各マウスの注射量は5ml/kgであった。投与群のマウスにはプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、各マウスに50mg/kgの用量で8日間連続して注射した。投与後の5日後、ブランク群、溶媒群、投与群からそれぞれ7匹、7匹、6匹のマウスをランダムに選んで殺処分し、脳組織を採取し、4℃でホモジナイズし、上清であるホモジネートを取ってBCA法による総タンパク質濃度の検出及びウェスタンブロット検出を行った。
Tris-Tricine-SDS-PAGEゲル調製キット(Solarbio、P1320)の説明書に従って、16.5%ゲルを調製した。各群のサンプルを4×ローディング緩衝液(TaKaRa、e2139)と体積比3:1で均一に混合し、100℃で5分間加熱し、冷却して2分間遠心分離した後、100μgの総タンパク質を採取してローディングした。電気泳動条件は、30Vで1.5時間実行した後、100Vでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、PVDFメンブレン(GE、A29433753)に転写し、電気泳動条件は15Vで2.5時間であった。転写したPVDFメンブレンをブロッキング溶液(5%スキムミルク液)に浸し、4℃の冷蔵庫で一晩ブロッキングし、TBST(0.01M Tris-NaCl、pH7.6緩衝液)で4回洗浄した後、ウサギ抗マウスAβ42抗体(Abcam、ab201060)を加えて室温で2時間インキュベートし、TBSTで4回洗浄し、ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam、ab6721)二次抗体を加え、室温で1時間インキュベートし、TBSTで4回洗浄した後、クリーンなイメージングプレート上にPVDFメンブレンを置き、Immobilon Western HRP Substrate(MILLIPORE、WBKLS0100)を加えて呈色させ、生体分子イメージャーで撮影し、Image Jで定量的に分析した。
その結果、ブランク対照群のマウスの脳ホモジネートには一定レベルのAβ42タンパク質が存在し、溶媒群のマウスの脳組織におけるAβ42のレベルは、投与群のマウスよりも有意に高く、統計P値は0.09であった(図9)。これは、プラスミノーゲンがアルツハイマー病モデルマウスの脳組織におけるAβ42のレベルを低下させることができることを示している。
11~12週齢の18~25gのC57BL/6Jオスマウス4匹を選択し、殺処分して全脳組織を採取し、重量を測ってから1×PBS(Thermo Fisher、pH7.4;10010-031)を150mg組織/mL PBSで加え、4℃でホモジナイズし(1分/回、3~4回)、ホモジナイズ後、4℃(12000rpm、20min)で遠心分離し、上清の脳ホモジネートを新しいEPチューブに移した。
Eppendorf(EP)チューブを取り、(1)ブランク群、(2)ブランク対照群、(3)溶媒対照群、(4)プラスミノーゲン群で、各群に5つの並列を設定した。ブランク群には、21.5μLの生理食塩水、4.6μLの溶媒溶液(10mMクエン酸ナトリウム、2%塩酸アルギニン、3%マンニトール、pH7.4)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;ブランク対照群には、21.5μLの生理食塩水、4.6μLのプラスミノーゲン溶液(0.5mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;溶媒対照群に21.5μL Tauタンパク質溶液(Nanjing GenScript Biotechnology Co., Ltd., custom-expressed human Tau protein,UniProtKB-P10636-8,1.0mg/mL)、4.6μLの溶媒溶液、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;プラスミノーゲン群に21.5μLのTauタンパク質溶液(1.0mg/mL)、4.6μLプラスミノーゲン溶液(0.5mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、37℃で6時間インキュベートした後、50μLの0.1%トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
SDS-PAGEゲル調製キットの説明書に従って、10%ゲルを調製した。各群のサンプルを4×ローディング緩衝液(TaKaRa、e2139)と体積比3:1で混合し、100℃で5分間加熱し、冷却して2分間遠心分離した後、20μLのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、30Vで45分間実行した後、100Vでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、活性化PVDFメンブレン(GE、A29433753)に転写し、電気泳動条件は15Vで2.5時間であった。転写したPVDFメンブレンをブロッキング溶液(5%スキムミルク液)に浸し、4℃の冷蔵庫で一晩ブロッキングし、TBST(0.01M Tris-NaCl、pH7.6緩衝液)で4回洗浄した後、ウサギ由来Tauタンパク質抗体(Abcam、ab151559)を加えて室温で2時間インキュベートし、TBSTで4回洗浄し、ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam、ab6721)二次抗体を加え、室温で1時間インキュベートし、TBSTで4回洗浄した後、クリーンなイメージングプレート上にPVDFメンブレンを置き、Immobilon Western HRP Substrate(MILLIPORE、WBKLS0100)を加えて呈色させ、生体分子イメージャーで撮影し、Image Jで定量的に分析した。
Tauタンパク質は、最も豊富な微小管関連タンパク質である。Tauタンパク質はリン酸基含有タンパク質であり、正常な成熟脳のTauタンパク質分子には2~3個のリン酸基が含まれている。アルツハイマー病(老年性認知症)患者の脳内のTauタンパク質は異常に過剰リン酸化されており、Tauタンパク質の各分子は5~9個のリン酸基を含み得、正常な生物学的機能を失う可能性がある[5]。
その結果、正常なマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン群のTauタンパク質の量が溶媒対照群よりも有意に低く、その差は有意であった(*はP<005を表し、**はP<0.01を表し、***はP<0.001を表す)(図10)。これは、プラスミノーゲンが、正常なマウスの脳ホモジネートにおけるTauタンパク質の分解を促進できることを示唆している。
11週齢のB6SJLTg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax(FAD)(在庫番号:034840)(FADと略称)マウス4匹ずつを選択し、殺処分して全脳組織を採取し、重量を測ってから実施例8のように脳ホモジネートを調製してEPチューブに置いた。
Eppendorf(EP)チューブを取り、(1)ブランク群、(2)ブランク対照群、(3)溶媒対照群、(4)プラスミノーゲン群で、各群に5つの並列を設定した。ブランク群には、21.5μLの生理食塩水、4.6μLの溶媒溶液(10mMクエン酸ナトリウム、2%塩酸アルギニン、3%マンニトール、pH7.4)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;ブランク対照群には、21.5μLの生理食塩水、4.6μLのプラスミノーゲン溶液(0.5mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;溶媒対照群に21.5μL Tau(Nanjing GenScript Biotechnology Co., Ltd., custom-expressed human Tau protein,UniProtKB-P10636-8,1.0mg/mL)、4.6μLの溶媒溶液、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;プラスミノーゲン群に21.5μLのTau(1.0mg/mL)、4.6μLプラスミノーゲン溶液(0.5mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、37℃で6時間インキュベートした後、50μLの0.1%トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
SDS-PAGEゲル調製キットの説明書に従って、10%ゲルを調製した。各群のサンプルを4×ローディング緩衝液(TaKaRa、e2139)と体積比3:1で混合し、100℃で5分間加熱し、冷却して2分間遠心分離した後、20μLのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、30Vで45分間実行した後、100Vでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、活性化PVDFメンブレン(GE、A29433753)に転写し、電気泳動条件は15Vで2.5時間であった。転写したPVDFメンブレンをブロッキング溶液(5%スキムミルク液)に浸し、4℃の冷蔵庫で一晩ブロッキングし、TBST(0.01M Tris-NaCl、pH7.6緩衝液)で4回洗浄した後、ウサギ由来Tauタンパク質抗体(Abcam、ab151559)を加えて室温で2時間インキュベートし、TBSTで4回洗浄し、ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam、ab6721)二次抗体を加え、室温で1時間インキュベートし、TBSTで4回洗浄した後、クリーンなイメージングプレート上にPVDFメンブレンを置き、Immobilon Western HRP Substrate(MILLIPORE、WBKLS0100)を加えて呈色させ、生体分子イメージャーで撮影し、Image Jで定量的に分析した。
その結果、アルツハイマー病マウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン群のTauタンパク質の量が溶媒対照群よりも有意に低く、その差は統計的に有意であった(*はP<005、**はP<0.01を表す)(図11)。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病マウスの脳ホモジネートのTauタンパク質の分解を促進できることを示唆している。
B6SJL-Tg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjaxマウス(カタログ番号:034840、Jackson Laboratoryから購入)とC57BL/6Jマウスを3回戻し交配させて子孫(B6-F3-FADと呼ぶ)を繁殖させた。20~25週齢のメスB6-F3-FADマウス18匹及び9週齢のC57BL/6Jメスマウス9匹を取った。B6-F3-FADは、体重及びY迷路試験の結果に応じて、溶媒群と投与群の2つの群にランダムに分け、各群9匹とした。9匹のC57BL/6Jをブランク対照群として使用した。群分けが完了した後、ブランク対照群のマウスと溶媒群のマウスに溶媒(4%アルギニン+2%グリシン溶液)を尾静脈注射により投与し、各マウスの注射量は5ml/kgであった。投与群のマウスにはプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、各マウスに50mg/kgの用量で28日間連続して注射した。投与後の7日後、各群からマウスをランダムに選んで殺処分し、脳組織を採取し、4℃でホモジナイズし、上清であるホモジネートを取ってBCA法による総タンパク質濃度の検出及びウェスタンブロット検出を行った。
SDS-PAGEゲル調製キット(Solarbio、P1320)の説明書に従って、10%ゲルを調製した。各群のサンプルを4×ローディング緩衝液(TaKaRa、e2139)と体積比3:1で均一に混合し、100℃で5分間加熱し、冷却して2分間遠心分離した後、100μgの総タンパク質を採取してローディングした。電気泳動条件は、30Vで1.5時間実行した後、100Vでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、PVDFメンブレン(GE、A29433753)に転写し、電気泳動条件は15Vで2.5時間であった。転写したPVDFメンブレンをブロッキング溶液(5%スキムミルク液)に浸し、4℃の冷蔵庫で一晩ブロッキングし、TBST(0.01M Tris-NaCl、pH7.6緩衝液)で4回洗浄した後、ウサギ抗マウスTau抗体(Abcam、ab151559)を加えて室温で2時間インキュベートし、TBSTで4回洗浄し、ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam、ab6721)二次抗体を加え、室温で1時間インキュベートし、TBSTで4回洗浄した後、クリーンなイメージングプレート上にPVDFメンブレンを置き、Immobilon Western HRP Substrate(MILLIPORE、WBKLS0100)を加えて呈色させ、生体分子イメージャーで撮影し、Image Jで定量的に分析した。
その結果、ブランク対照群のマウスの脳ホモジネートに一定のレベルの異なる分子量のTauタンパク質があり、投与群のマウスの脳組織における各分子量のTauタンパク質及び総Tauタンパク質のレベルは媒体群のマウスよりも有意に低く、2つの群の35kd、35~40kd、40kd、54kdの分子量Tauタンパク質レベル及び総Tauタンパク質レベルの統計分析P値はそれぞれ、0.174、0.0406、0.052、0.067、及び0.055であった(図12)。これは、プラスミノーゲンがアルツハイマーモデルマウスの脳組織においてTauタンパク質の分解を促進できることを示している。
11週齢のB6SJLTg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax(FAD)(在庫番号:034840)(FADと略称)マウス4匹ずつを選択し、殺処分して全脳組織を採取し、上記のように脳ホモジネートを調製してEPチューブに置いた。
Eppendorf(EP)チューブを取り、(1)ブランク群、(2)ブランク対照群、(3)溶媒対照群、(4)投与群で、各群に5つの並列を設定した。ブランク群には、21.5μLの生理食塩水、4.6μLの溶媒溶液(10mMクエン酸ナトリウム、2%塩酸アルギニン、3%マンニトール、pH7.4)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;ブランク対照群には、21.5μLの生理食塩水、4.6μLのプラスミノーゲン溶液(2mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;溶媒対照群に21.5μL Pro-BDNF(Nanjing GenScript Biotechnology Co., Ltd., custom-expressed,UniProtKB-P23560,1.0mg/mL)、4.6μLの溶媒溶液(クエン酸-クエン酸ナトリウム溶液)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;プラスミノーゲン群に21.5mLのPro-BDNF(1.0mg/mL)、4.6μLプラスミノーゲン溶液(2mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、37℃で6時間インキュベートした後、50μLの0.1%トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
SDS-PAGEゲル調製キットの説明書に従って、12%ゲルを調製した。各群のサンプルを4×ローディング緩衝液(TaKaRa、e2139)と体積比3:1で混合し、100℃で5分間加熱し、冷却して2分間遠心分離した後、20μLのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、30Vで45分間実行した後、100Vでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、1‰のクーマシーブリリアントブルー染色液(1gのクーマシーブリリアントブルーR250を、エタノール:氷酢酸:精製水の体積比が5:2:13の混合液1000mlに溶解した)に置いて30分間染色した後、脱色液(精製水:氷酢酸:無水エタノール=17:2:1の体積比で混合)を用いてきれいに脱色した。ゲルを生体分子イメージャーで写真を撮って定量的にスキャン・分析した。
脳由来神経栄養因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)は、分子量12.3kDの塩基性タンパク質であり、119個のアミノ酸残基からなり、3対のジスルフィド結合を含み、生体内で二量体化した形で存在し、BDNF前駆体の形で合成し、BDNF前駆体(Pro-BDNF)は、酵素加水分解によって切断され、成熟したBDNFを形成することができる。Pro-BDNFは、切断されて形成した成熟BDNFと相反の効果を有することが文献で報告されている。Pro-BDNFはニューロンのアポトーシスを促進し、シナプス可塑性を低下させる[6]。成熟したBDNF及びその受容体は、中枢神経系に広く分布しており、中枢神経系の発達中のニューロンの生存、分化、成長、発達に重要な役割を果たし、ニューロンが損傷を受けて死滅することを防ぎ、ニューロンの病理学的状態を改善し、損傷したニューロンの再生や分化などの生物学的効果を促進することができ、成熟した中枢神経系及び末梢神経系におけるニューロンの生存と正常な生理学的機能に必要である[7]。
その結果、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートにおいて、プラスミノーゲン投与群のPro-BDNF量は溶媒対照群より有意に低く、その差は極めて有意であった(*はP<0.05、***はP<0.001を表す)(図13)。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートにおいてPro-BDNFの切断を促進できることを示唆している。
11週齢のB6SJLTg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax(FAD)(在庫番号:034840)(FADと略称)マウス4匹ずつを選択し、殺処分して全脳組織を採取し、上記のように脳ホモジネートを調製してEPチューブに置いた。
Eppendorf(EP)チューブを取り、(1)ブランク群、(2)ブランク対照群、(3)溶媒対照群、(4)投与群で、各群に5つの並列を設定した。ブランク群には、21.5μLの生理食塩水、4.6μLの溶媒溶液(10mMクエン酸ナトリウム、2%塩酸アルギニン、3%マンニトール、pH7.4)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;ブランク対照群には、21.5μLの生理食塩水、4.6μLのプラスミノーゲン溶液(2mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;溶媒対照群に21.5μL Pro-BDNF(Nanjing GenScript Biotechnology Co., Ltd., custom-expressed,UniProtKB-P23560,1.0mg/mL)、4.6μLの溶媒溶液(クエン酸-クエン酸ナトリウム溶液)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;プラスミノーゲン群に21.5mLのPro-BDNF(1.0mg/mL)、4.6μLプラスミノーゲン溶液(2mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、37℃で6時間インキュベートした後、50μLの0.1%トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
SDS-PAGEゲル調製キットの説明書に従って、12%ゲルを調製した。各群のサンプルを4×ローディング緩衝液(TaKaRa、e2139)と体積比3:1で混合し、100℃で5分間加熱し、冷却して2分間遠心分離した後、20μLのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、30Vで45分間実行した後、100Vでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、PVDFメンブレン(GE、A29433753)に転写し、電気泳動条件は15Vで2.5時間であった。転写したPVDFメンブレンをブロッキング溶液(5%スキムミルク液)に浸し、4℃の冷蔵庫で一晩ブロッキングし、TBST(0.01M Tris-NaCl、pH7.6緩衝液)で4回洗浄した後、ウサギ抗ヒトBDNF抗体(Boster Biological Technology、PB9075)を加えて室温で3時間インキュベートし、TBSTで4回洗浄し、ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam、ab6721)二次抗体を加え、室温で1時間インキュベートし、TBSTで4回洗浄した後、クリーンなイメージングプレート上にPVDFメンブレンを置き、Immobilon Western HRP Substrate(MILLIPORE、WBKLS0100)を加えて呈色させ、生体分子イメージャーで撮影し、バンド光学密度をImage Jで定量的に分析した。
その結果、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートにおいて、プラスミノーゲン投与群のPro-BDNF量は溶媒対照群より有意に低く、その差は極めて有意であった(**はP<0.01、***P<0.001を表す);プラスミノーゲン投与群のBDNF量は溶媒対照群よりも有意に高く、その差は極めて有意であった(図14)。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートにおいて、Pro-BDNFの切断及び成熟BDNFの形成を促進できることを示唆している。
24週齢のC57オスマウス23匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重によって異常なマウスを除外した後、すべてのマウスを2つの群にランダムに分け、ブランク対照群で7匹、モデル群で16匹とした。すべてのマウスを麻酔し、実施例6のようにアルツハイマーモデル[3]を構築した。脳局在注射28日後、すべてのマウスに対して体重及びY迷路試験を行い、試験の結果に応じて、ブランク対照群及びモデル群の異常なマウスを排除し、モデル群マウスを2つの群にランダムに分け、溶媒群で6匹とし、投与群で7匹とし、ブランク対照群で6匹とした。溶媒群及び投与群のマウスに投与を開始し、これを1日目とし、投与群のマウスに1mg/0.1ml/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒群のマウスに0.1ml/匹/日で溶媒(4%アルギニン+2%グリシン溶液)を尾静脈注射により投与し、28日間連続して投与した。ブランク対照群マウスには投与しなかった。29日目にマウスを殺処分し、脳を採取して10%ホルムアルデヒドで24~48時間固定した。固定された脳組織をアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。黒質を位置付けし、切片の厚さは4μmであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから1回水で洗った。PAPマーカーで組織を丸で囲み、3%過酸化水素で15分間インキュベートし、0.01M PBSで2回洗浄し、毎回5分間であった。5%正常ヤギ血清(Vector Laboratories,Inc.,USA)で30分間ブロッキングし、時間になったらヤギ血清を捨て、ウサギ抗マウスBDNF抗体(BosterBio,PB9075)を滴下して4℃で一晩インキューベートし、0.01M PBSで2回洗浄し、毎回5分間であった。ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam)二次抗体を室温で1時間インキュベートし、0.01M PBSで2回洗浄し、毎回5分間であった。DABキット(Vector laboratories,Inc.,USA)で呈色させ、水で3回洗浄した後にヘマトキシリンで30秒対比染色して、流水で5分間すすいだ。アルコール勾配で脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で200倍にて観察した。
その結果、ブランク対照群(図15A)のマウスの海馬が一定レベルのBDNFを発現し(矢印でマーク)、溶媒群(図15B)のマウスの海馬におけるBDNFの発現は、ブランク対照群よりも有意に低く、投与群(図15C)のマウスの海馬におけるBDNFの発現は溶媒群よりも有意に高く、統計的差は有意であった(*はP<0.05を表す)(図15D)。これは、プラスミノーゲンがアルツハイマー病モデルマウスの海馬でBDNFの発現を促進できることを示している。
11週齢のB6SJLTg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax(FAD)(在庫番号:034840)(FADと略称)マウス4匹ずつを選択し、殺処分して全脳組織を採取し、上記のように脳ホモジネートを調製してEPチューブに置いた。
Eppendorf(EP)チューブを取り、(1)ブランク対照群、(2)ブランク群、(3)溶媒対照群、(4)プラスミノーゲン群で、各群に5つの並列を設定した。ブランク対照群には、21.5μLの生理食塩水、4.6μLの溶媒溶液(10mMクエン酸ナトリウム、2%塩酸アルギニン、3%マンニトール、pH7.4)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;ブランク群には、21.5μLの生理食塩水、4.6μLのプラスミノーゲン溶液(2mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;溶媒対照群に21.5μL Pro-NGF(Nanjing GenScript Biotechnology Co., Ltd., custom-expressed Pro-NGF,配列はUniProtKB-P01138に由来,1.0mg/mL)、4.6μLの溶媒溶液、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;プラスミノーゲン群に21.μLのPro-NGF溶液(1.0mg/mL)、4.6μLプラスミノーゲン溶液(2mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、37℃で6時間インキュベートした後、50μLの0.1%トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
SDS-PAGEゲル調製キットの説明書に従って、15%ゲルを調製した。各群のサンプルを4×ローディング緩衝液(TaKaRa、e2139)と体積比3:1で混合し、100℃で5分間加熱し、冷却して2分間遠心分離した後、20μLのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、30Vで30分間実行した後、100Vでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、PVDFメンブレン(GE、A29433753)に転写し、電気泳動条件は15Vで2.5時間であった。転写したPVDFメンブレンをブロッキング溶液(5%スキムミルク液)に浸し、4℃の冷蔵庫で一晩ブロッキングし、TBST(0.01M Tris-NaCl、pH7.6緩衝液)で4回洗浄した後、ウサギ抗ヒトNGF抗体(Abcam,ab52918)を加えて室温で2時間インキュベートし、TBSTで4回洗浄し、ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam、ab6721)二次抗体を加え、室温で1時間インキュベートし、TBSTで4回洗浄した後、クリーンなイメージングプレート上にPVDFメンブレンを置き、Immobilon Western HRP Substrate(MILLIPORE、WBKLS0100)を加えて呈色させ、生体分子イメージャーで撮影し、バンド光学密度をImage Jで定量的に分析した。
神経成長因子(Nerve growth factor,NGF)は、神経栄養因子ファミリーの重要なメンバーである。シグナルペプチド、リーダーペプチド、及び成熟ペプチドを含む前駆体の形でインビボで合成される。研究では、神経成長因子NGFの前駆体(Pro-NGF)が、切断されて形成するNGFと相反の役割を果たしていることが報告されている。Pro-NGFはニューロンのアポトーシスを促進することができる。成熟したNGFは、ニューロンの成長、発達、分化、生存、損傷後の修復などのプロセスの調節に関与しており、中枢及び末梢ニューロンの機能発現の調節にも重要な役割を果たしている[8]。
その結果、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートでは、溶媒対照群に比べてプラスミノーゲン投与群のPro-NGF量が有意に低く、その差は極めて有意であった(***はP<0.001を表す);プラスミノーゲン投与群のNGF量は溶媒対照群よりも有意に高く、その差は有意であった(図16)。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートにおいて、Pro-NGFの切断及び成熟NGFの形成を促進できることを示唆している。
C57オスマウス28匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重によって異常なマウスを除外した後、すべてのマウスを2つの群にランダムに分け、ブランク対照群で8匹、モデル群で20匹とした。群分けが終わった後、実施例6のようにアルツハイマーモデル[3]を構築した。脳局在注射65日後、すべてのマウスに対して水迷路試験を行い、モデル対照群はすなわちブランク対照群マウスであり、試験の結果に応じて、ブランク対照群及びモデル群の異常なマウスを排除し、モデル群マウスを2つの群にランダムに分け、溶媒群で10匹とし、投与群で10匹とし、ブランク対照群で8匹とした。群分けの後、溶媒群及び投与群のマウスに第1期の投与を開始し、投与群のマウスに50mg/kg/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒群及びブランク対照群のマウスに5ml/kg/匹/日で溶媒(4%アルギニン+2%グリシン溶液)を尾静脈注射により投与し、28日間連続して投与した。第1期の投与終了50日後から第2期投与を開始し、投与方法は第1期と同様にして7日間連続して投与した。第2期の投与の8日目にオープンフィールド実験を行った。
オープンフィールド実験
実験時、オープンフィールド(40×40×40cm)の底面中央にマウスを置き、撮影と計時を同時に行い、持続して5分間観察し、各マウスは3回の実験を行った。Smart Systemは、実験動物の行動を評価するための完全な使いやすいビデオ追跡システムである。軌跡、アクティビティ、特定の動作(回転、ストレッチ、摂食など)及びイベントを記録し、さまざまな分析パラメーターの計算を実行できる。この実験では、Smart3.0システムを使用して、マウスの動きを記録及び分析した。パラメーターは、境界ゾーンの総移動距離と中央ゾーンの移動距離を含む。各実験では、匂いの好みを防ぐために70%のアルコールを使用してボックスを拭いた[1]。
オープンフィールド実験の設計原理は、マウスの回避に基づいている。これは、マウスが開けた場所、未知の場所、潜在的に危険な場所を恐れているため、「壁に張り付く」性質を持っていることを指す。総距離と平均速度は、マウスの自発活動を反映する主なデータと見なされ、回避は、フィールドの周辺領域(4つのコーナーと4つの側面)でのマウスの活動によって評価された。回避を反映した周囲での活動時間から判断すると、時間が短縮することは、マウスがより「冒険的」な傾向にあることを示し、中央ゾーンでの活動時間が大幅に長くなることは、回避と不安(うつ病)のレベルが低いことを示す。
境界ゾーンの移動距離の割合
境界ゾーンの移動距離の割合は、指定された時間内に境界ゾーンでのマウスの移動軌跡長さと総移動軌跡の長さとの比率である。その結果、ブランク対照群は境界ゾーンで一定の割合の移動距離を持っており、溶媒群マウスの境界ゾーンの移動距離の割合がブランク対照群より有意に多く、投与群マウスの境界ゾーン移動距離の割合が溶媒群より有意に小さく、しかも統計的差は有意に近かった(P=0.08)(図17)。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの不安及び抑うつ行動の回復を促進できることを示唆している。
中心ゾーンの移動距離の割合
中心ゾーンの移動距離の割合は、指定された時間内に中心ゾーンでのマウスの移動軌跡長さと総移動軌跡の長さとの比率である。その結果、ブランク対照群は中心ゾーンで一定の割合の移動距離を持っており、溶媒群マウスの中心ゾーンの移動距離の割合がブランク対照群より有意に小さく、投与群マウスの中心ゾーン移動距離の割合が溶媒群より有意に大きく、しかも統計的差は有意に近かった(P=0.08)(図18)。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの不安及び抑うつ行動の回復を促進できることを示唆している。
C57オスマウス28匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重によって異常なマウスを除外した後、すべてのマウスを2つの群にランダムに分け、ブランク対照群で8匹、モデル群で20匹とした。群分けが終わった後、実施例6のようにアルツハイマーモデル[3]を構築した。脳局在注射65日後、すべてのマウスに対して水迷路試験を行い、モデル対照群はすなわちブランク対照群マウスであり、試験の結果に応じて、ブランク対照群及びモデル群の異常なマウスを排除し、モデル群マウスを2つの群にランダムに分け、溶媒群で10匹とし、投与群で10匹とし、ブランク対照群で8匹とした。群分けの後、溶媒群及び投与群のマウスに第1期の投与を開始し、投与群のマウスに50mg/kg/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒群及びブランク対照群のマウスに5ml/kg/匹/日で溶媒(4%アルギニン+2%グリシン溶液)を尾静脈注射により投与し、28日間連続して投与した。第1期の投与終了50日後から第2期投与を開始し、投与方法は第1期と同様にして9日間連続して投与した。第2期の投与終了2日後に高架式十字迷路行動実験を行った。
高架式十字迷路は、動物の新しい異なる環境の探索特性及び高くぶら下げるオープンアームへの恐怖を利用して相反する行動を形成し、動物の不安状態を調べる。高架十字迷路には1対のオープンアームと1対のクローズアームがある。齧歯類は暗所嗜好のためクローズアームで移動する傾向があるが、好奇心と探索のためにオープンアームで移動し、新しい刺激に直面すると、動物は探索する衝動と恐怖を同時に感じる。これは、探索と回避の相反する行動を引き起こし、結果として不安が生じる。抗不安薬は、オープンアームに入る回数と時間を大幅に増やすことができる。十字迷路は地面から高く、崖の上に立っているのと同じであるため、被験者に恐怖と不安を感じさせる。高架式十字迷路は、新薬の開発/スクリーニング/評価、薬理学、毒物学、予防医学、神経生物学、動物心理学、行動生物学などの複数の分野における科学研究及びコンピューター支援教育の分野で広く使用されており、医学部や科学研究機関での行動研究、特に不安やうつ病の研究における古典的な実験である。
実験の開始時に、マウスをクローズアームに向かって中央のグリッドから迷路に入れ、5分間の活動を記録した。観察指標は、オープンアームエントリの回数(2つの前足がアームに入る必要がある)、オープンアームの滞留時間、クローズアームエントリの回数、及びクローズアームの滞留時間を含む。オープンアームの滞留時間の割合、オープンアームエントリ回数の割合、及び高架式十字迷路のエントリの総数を計算した。実験が終わった後、マウスを取り出し、両腕をきれいにし、アルコールをスプレーして臭いを取り除いた。最後に、動物行動学ソフトウェアを使用してデータ分析を行った。
総移動距離
総移動距離とは、指定された記録時間内のマウスの総移動軌跡の長さを指す。その結果、ブランク対照群は一定の総移動距離を持っており、溶媒群の移動距離はブランク対照群よりも有意に大きく、投与群の総移動距離は溶媒群よりも有意に小さく、その統計的差は極めて有意であり(*はP<0.05、**はP<0.01を表す)(図19)、しかもブランク対照群のマウスの総移動距離により近かった。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの不安及び抑うつ行動の回復を促進できることを示唆している。
クローズアーム移動距離
クローズアームの移動距離とは、指定された時間内のクローズアームの移動軌跡の長さを指す。その結果、ブランク対照群マウスは一定のクローズアーム移動距離を持っており、溶媒群のクローズアーム移動距離はブランク対照群よりも有意に大きく、投与群のクローズアーム移動距離は溶媒群よりも有意に小さく、2つの群の間の統計的差は有意であり(*はP<0.05、**はP<0.01を表す)(図20)、しかも投与群のクローズアーム移動距離はブランク対照群により近かった。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの不安及び抑うつ行動の回復を促進できることを示唆している。
クローズアームの移動距離の割合
クローズアームの移動距離の割合とは、指定された時間内のクローズアームの移動軌跡の長さと総移動軌跡の長さとの比率を指す。その結果、ブランク対照群マウスは一定のクローズアーム移動距離の割合を持っており、溶媒群のクローズアーム移動距離の割合はブランク対照群よりも有意に大きく、投与群のクローズアーム移動距離の割合は溶媒群よりも有意に小さく、2つの群の間の統計的差は有意であり(*はP<0.05を表す)(図21)、しかも投与群のクローズアーム移動距離の割合はブランク対照群により近かった。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの不安及び抑うつ行動の回復を促進できることを示唆している。
クローズアームエントリ回数
その結果、ブランク対照群マウスは一定のクローズアームエントリ回数を持っており、溶媒群のクローズアームエントリ回数はブランク対照群マウスよりも有意に多く、投与群マウスのクローズアームエントリ回数は溶媒群よりも有意に少なく、2つの群の間の統計的差は極めて有意であり(*はP<0.05、**はP<0.01を表す)(図22)、しかも投与群のクローズアームエントリ回数はブランク対照群により近かった。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの不安及び抑うつ行動の回復を促進できることを示唆している。
クローズアーム時間
クローズアーム時間とは、指定された時間内でマウスがクローズアームに滞在する時間のことである。その結果、ブランク対照群マウスは一定のクローズアーム時間を持っており、溶媒群マウスのクローズアームの滞在時間はブランク対照群マウスよりも有意に短く、投与群マウスのクローズアーム時間は溶媒群よりも有意に長く、2つの群の間の統計的差は有意であり(*はP<0.05、**はP<0.01を表す)(図23)、しかも投与群のクローズアームの滞在時間はブランク対照群により近かった。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの不安及び抑うつ行動の回復を促進できることを示唆している。
クローズアーム時間の割合
クローズアーム時間の割合とは、マウスがクローズアームに滞在した時間と記録された合計時間との比率を指す。その結果、ブランク対照群マウスは一定のクローズアーム時間の割合を持っており、溶媒群マウスのクローズアーム時間の割合はブランク対照群マウスよりも有意に低く、投与群マウスのクローズアーム時間の割合は溶媒群よりも有意に高く、2つの群の間の統計的差は有意であり(*はP<0.05、**はP<0.01を表す)(図24)、しかも投与群のクローズアーム時間の割合はブランク対照群により近かった。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの不安及び抑うつ行動の回復を促進できることを示唆している。
クローズアームでの平均速度
クローズアームでの平均速度とは、クローズアームの移動距離とクローズアーム時間との比率を指す。その結果、ブランク対照群マウスは一定のクローズアームでの平均移動速度を持っており、溶媒群のクローズアームでの平均移動速度はブランク対照群マウスよりも有意に大きく、投与群マウスのクローズアームでの平均移動速度は溶媒群よりも有意に小さく、2つの群の間の統計的差は極めて有意であり(**はP<0.01を表す)(図25)、しかも投与群のクローズアームでの平均移動速度はブランク対照群により近かった。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの不安及び抑うつ行動の回復を促進できることを示唆している。
C57オスマウス28匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重によって異常なマウスを除外した後、すべてのマウスを2つの群にランダムに分け、ブランク対照群で8匹、モデル群で20匹とした。群分けが終わった後、実施例6のようにアルツハイマーモデル[3]を構築した。脳局在注射65日後、すべてのマウスに対して水迷路試験を行い、モデル対照群はすなわちブランク対照群マウスであり、試験の結果に応じて、ブランク対照群及びモデル群の異常なマウスを排除し、モデル群マウスを2つの群にランダムに分け、溶媒群で10匹とし、投与群で10匹とし、ブランク対照群で8匹とした。群分けの後、溶媒群及び投与群のマウスに第1期の投与を開始し、投与群のマウスに50mg/kg/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒群及びブランク対照群のマウスに5ml/kg/匹/日で溶媒(4%アルギニン+2%グリシン溶液)を尾静脈注射により投与し、28日間連続して投与した。第1期の投与終了50日後から第2期投与を開始し、投与方法は第1期と同様にして9日間連続して投与した。第2期の投与終了2日後にY迷路行動実験を行った。
その結果、ブランク対照マウスと比較して、溶媒群のマウスの自発的交替行動率が有意に低下し、投与群のマウスの自発的交替行動率は、溶媒群よりも有意に高く、2つの群の間の統計的差は有意であり(*はP<0.05を表す)、しかもブランク対照群により近かった(図26)。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの記憶機能の回復を促進できることを示唆している。
20~25週齢のB6SJL-Tg(APPSwFlLon、PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax(Jackson labから購入、カタログ番号:034840)のメスマウス18を取り、体重及びY迷路試験の結果に従って2つの群にランダムに分け、媒体群で9匹、投与群で9匹とし、同週齢のC57メスマウス9匹をブランク対照群とした。群分けの後、ブランク対照群及び溶媒群のマウスに5ml/kgで溶媒(4%アルギニン+2%グリシン溶液)を尾静脈注射により投与し、投与群のマウスに50mg/kgでプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、18日間連続して投与した。19日目に架式十字迷路行動実験を行った。
その結果、ブランク対照群マウスは一定のクローズアーム時の移動距離を持っており、溶媒群のクローズアームの移動距離はブランク対照群マウスよりも有意に小さく、投与群マウスのクローズアームの移動距離は溶媒群よりも有意に大きく、2つの群の間の統計的差は有意であり(**はP<0.01、***はP<0.001を表す)(図27)、しかも投与群のクローズアームの移動距離はブランク対照群により近かった。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの不安及び抑うつ行動の回復を促進できることを示唆している。
B6SJL-Tg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjaxマウス(カタログ番号:034840、Jackson Laboratoryから購入)とC57BL/6Jマウスを一回戻し交配させて子孫(B6-F1-FADと呼ぶ)を繁殖させた。16~17週齢のメスB6-F1-FADマウス18匹及び9週齢のメスC57BL/6Jマウス9匹を取った。B6-F1-FADは、体重及びY迷路試験の結果に応じて、溶媒群と投与群の2つの群にランダムに分け、各群9匹とした。9匹のC57BL/6Jをブランク対照群として使用した。群分けが完了した後、ブランク対照群のマウスと溶媒群のマウスに溶媒(4%アルギニン+2%グリシン溶液)を尾静脈注射により投与し、各マウスの注射量は5ml/kgであった。投与群のマウスにはプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、各マウスに50mg/kgの用量で8日間連続して注射した。投与後の5日後、マウスを殺処分し、脳組織を採取して10%中性ホルムアルデヒド溶液で24~48時間固定した。固定された脳組織をアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。切片の厚さは3μmであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから1回水で洗い、ヘマトキシリン及びエオジンで染色し(HE染色)、1%塩酸エタノールで分別させ、アンモニア水でブルーイングさせ、さらにアルコール勾配で脱水させて封入させ、海馬を観察するために、切片を光学顕微鏡下で200倍にて観察した。
その結果、ブランク対照群(図28A)のマウスの海馬の組織形態が正常であり、溶媒群(図28B)と比較して、投与群(図28C)の海馬の組織損傷形態が有意に改善された。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの海馬損傷を改善できることを示している。
以下の患者は自発的に薬を服用するためのインフォームドコンセントフォームに署名し、病院倫理委員会の承認を得た。
治療効果:家族は、投薬プロセス中に患者の精神状態が徐々に改善され、応答感度が徐々に且つ有意に改善され、投薬後の患者の新しいことを学ぶ能力及び記憶能力が改善され、記憶力も改善されたと述べた。13日間の投薬後、体の全体的な感覚は約50%改善し、記憶力は約50%改善したそうである。
これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病患者の記憶力、学習能力、及び精神状態を改善できることを示している。
投薬計画:噴霧と静脈内注射との併用であった。1日目に噴霧吸入3回、毎回5mg、2日目から噴霧は前と同じ、30mgから開始し、静脈内注射は、毎日10mgを追加し、7日間連続投与した。
ミニメンタルステート検査スケール(Mini-Mental State Examination Scale、MMSE)は、被験者の精神状態と認知障害の程度を包括的、正確かつ迅速に反映することができる。このスケールはシンプルで実施が容易であり、国内外で広く使用されており、認知症スクリーニングに好まれるスケールである。採点基準:スコア27~30、正常;スコア<27、認知障害;スコア21~26、軽度;スコア10~20、中程度;スコア0~9、重度。
治療効果:1.精神が向上した;2.老年性認知症の症状が改善され、記憶力が向上した;3.高齢者の不安が軽減された;4.MMSEスコアは14点であり、主に他人の指示に協力して行動する能力に反映された。投与前後のMMSEスコアを表1に示す。
これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病患者のMMSEスコアを改善し、患者の記憶力、思考能力、不安、及び精神状態を改善できることを示している。
表1 投与前後のMMSEスコア
投薬計画:150~250mgの静脈内注射による投与に加えて、1回10mgの噴霧吸入により投与し、4時間ごとに1回、1日3回、14日間投与を続けた。休薬1週間後、1週間投与を継続し、方法は前と同様であり、噴霧吸入量は1回15mg、4時間ごとに1回、1日3回であった。休薬1週間後、また2週間投与を継続し、隔日投与し、250mg静脈内注射により投与し、噴霧は1回15mg、4時間ごとに1回、1日3回投与した。その後、週に2回、400mg静脈内注射による投与に加えて、1回10mgの噴霧により投与し、1日2回、2週間投与に変更した。現在は、週に1回、500mgを静脈内注射による投与に加えて、1回10mg、1日2回、週に2日噴霧している。
治療の過程では、上記の症状は徐々に改善され、14日間の投薬後、患者の気分は改善され、他者とのコミュニケーションは基本的にバリアなく、記憶が回復し、時間の概念が徐々に明確になり、全体的な状態スコアは4点であった。人とのコミュニケーションの70%~80%は正しく理解でき、正確に答えることができる。人の名前を間違えることが多いが、人を特定するには問題はない。
これは、プラスミノーゲンが、患者の記憶力、コミュニケーション能力、認知能力、及び見当識能力の改善など、アルツハイマー病を改善できることを示している。
投薬計画として、50~100mgを静脈内注射により、1日1回、さらに噴霧吸入で10mg/回、1日2~3回投与した。上記のように2日に1回、13日間連続して投与した。
治療の13日後、患者は自己記憶で9点、計算能力で9点、見当識で9点を獲得した。
これは、プラスミノーゲンが、患者の認知障害、記憶能力、計算能力、見当識能力を改善できることを示している。
投薬計画:最初に50mgの静脈内注射により投与し、2日ごとに50mgを追加し、14日間連続して投与し、その後は週に2回、毎回400mgで、合計30日間投与した。
投薬の4日目から、集中力と理解力がわずかに改善し、投薬7日目には理解力と注意力がさらに向上し、質問を理解して一生懸命答えようとするようになり、投薬10日目にはより多くのものや親戚を認識し、思い出すことができた。投薬14日目に、注意力は7~8分間集中することができ、起こったばかりのことについて、状態が良好であれば、記憶は6~7分間持続できた。投薬21日目に、30分間以上集中できた。投薬24日後、たった今起こったことの記憶が約1時間持続し、言語表現も豊かになり、MMSEスコアは9点であった。投薬30日後にMMSEスコアは9点であった。休薬1か月後、計算能力は改善し、MMSEスコアは8点であった。投与前後のMMSEスコアを表2に示す。
これは、プラスミノーゲンがアルツハイマー病患者のMMSEスコアを改善し、患者の記憶能力、認知能力、注意力、理解力、言語表現能力、及び計算能力を改善できることを示している。
表2 投与前後のMMSEスコア
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Claims (14)
- プラスミノーゲン活性化経路の成分、プラスミノーゲンを直接活性化し得るか、またはプラスミノーゲン活性化経路の上流成分を活性化することによって間接的にプラスミノーゲンを活性化し得る化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミンの活性を模倣する化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミノーゲン活性化剤の発現をアップレギュレートすることができる化合物、プラスミノーゲン類縁体、プラスミン類縁体、tPAまたはuPA類縁体及び線維素溶解阻害剤の拮抗剤から選択される1つ以上の治療有効量の化合物をアルツハイマー病の被験者に投与することを含む、アルツハイマー病を予防及び治療する方法。
- 前記プラスミノーゲン活性化経路の成分が、プラスミノーゲン、組換えヒトプラスミノーゲン、Lys-プラスミノーゲン、Glu-プラスミノーゲン、プラスミン、プラスミノーゲンとプラスミンの1つ以上のkringleドメイン及びプロテアーゼドメインを含むプラスミノーゲン及びプラスミン変異体並びに類縁体、ミニプラスミノーゲン(mini-plasminogen)、ミニプラスミン(mini-plasmin)、マイクロプラスミノーゲン(micro-plasminogen)、マイクロプラスミン(micro-plasmin)、delta-プラスミノーゲン、delta-プラスミン(delta-plasmin)、プラスミノーゲン活性化剤、tPA、及びuPAから選択されるものである、請求項1に記載の方法。
- 前記線維素溶解阻害剤の拮抗剤が、PAI-1、補体C1阻害剤、α2抗プラスミンまたはα2マクログロブリンの阻害剤、例えば、抗体である、請求項1に記載の方法。
- 前記化合物が、アルツハイマー病の被験者に対して、脳組織におけるアミロイドAβ40またはAβ42の分解を促進する活性、記憶機能を改善する活性、認知能力を改善する活性、地理的位置認識を改善する活性、不安または抑うつ症状を緩和する活性、脳組織におけるAβ42沈着を減少させる活性、脳組織におけるTauタンパク質の分解を促進する活性、脳組織におけるPro-BDNFの切断による成熟BDNFの形成を促進する活性、脳組織におけるBDNFの発現を促進する活性、脳組織におけるPro-NGFの切断による成熟NGFの形成を促進する活性、及び脳組織の海馬の損傷を改善する活性から選択される1つまたは複数の活性を有する、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記化合物がプラスミノーゲンである、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プラスミノーゲンが、ヒト全長プラスミノーゲンまたはその保存的置換変異体である、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プラスミノーゲンが、配列2と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノーゲンのリジン結合活性またはタンパク質加水分解活性を有する、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プラスミノーゲンが、配列14と少なくとも80%、90%、95%、96%、97%、98%または99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ依然としてプラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性を有するタンパク質を含む、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プラスミノーゲンが、Glu-プラスミノーゲン、Lys-プラスミノーゲン、ミニプラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン、delta-プラスミノーゲン、またはそれらの、プラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性を保持した変異体から選択される、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プラスミノーゲンが、配列2、6、8、10または12に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列2、6、8、10または12に示されるアミノ酸配列の保存的置換変異体を含む、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記化合物が、1つまたは複数の他の治療方法または薬剤と組み合わせて使用される、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記他の治療方法が、細胞療法(幹細胞療法を含む)、支持療法、及び物理的療法を含む、請求項11に記載の方法。
- 前記他の薬剤が、アルツハイマー病の治療のための他の薬剤である、請求項11に記載の方法。
- 前記化合物が、鼻吸入、エアロゾル吸入、点鼻薬、点眼薬、点耳薬、静脈内、腹腔内、皮下、頭蓋内、髄腔内、動脈内(例えば頸動脈を介して)、または筋肉内に投与される、請求項1~13のいずれか一項に記載の方法。
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