CN111905103A

CN111905103A - 一种治疗肌萎缩侧索硬化的方法和药物

Info

Publication number: CN111905103A
Application number: CN202010392772.XA
Authority: CN
Inventors: 李季男
Original assignee: Talengen Institute of Life Sciences Co Ltd
Current assignee: Talengen Institute of Life Sciences Co Ltd
Priority date: 2019-05-10
Filing date: 2020-05-11
Publication date: 2020-11-10
Also published as: TW202108166A; TWI741597B

Abstract

本发明涉及一种治疗肌萎缩侧索硬化(ALS)的方法，包括给药受试者治疗有效量的纤溶酶原途径激活剂。本发明还涉及用于治疗肌萎缩侧索硬化的包含纤溶酶原途径激活剂的药物组合物、制品、试剂盒。

Description

一种治疗肌萎缩侧索硬化的方法和药物

技术领域

本发明涉及一种治疗肌萎缩侧索硬化及其相关病症的方法，包括给药患有肌萎缩侧索硬化及其相关病症的受试者有效量的纤维蛋白溶酶原激活途径的组分或其相关化合物，例如纤溶酶原，以修复损伤神经，改善临床症状和体征。

背景技术

肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)，又称渐冻症，为致命性神经系统变性疾病，主要累及锥体束、脑干和脊髓前角细胞，临床表现为呈进行性加重的肌肉萎缩、无力及痉挛，60％以上患者于发病后3～5年后因呼吸肌麻痹死亡(Kiernan MC，Vucis S,Cheah BC,et al.Amyotrophic lateral sclerosis.Lancet,2011,377:942-955.)。

肌萎缩侧索硬化的临床表现以上运动神经元变性(主要特征为腱反射亢进、肌张力增高)和下运动神经元变性(肌萎缩、肌无力、束颤和腱反射丧失)为主要症状与体征。发病症状常不对称，从发病部位逐渐进展至其他部位，但眼外肌和括约肌多不受累。虽然一些患者可能有轻微的感觉症状，但通常感觉系统检查阴性。传统观念认为，肌萎缩侧索硬化患者认知功能保存完好，但随着神经影像学、神经心理学等诊断技术的发展，发现认知功能受损亦是肌萎缩侧索硬化的常见特征。

该病患病率约为4-6/100,000，目前唯一的治疗药物为兴奋性氨基酸拮抗剂力如太(Rilutek)获各国药品监督部门批准，但只能减缓病情进展。

发明概述

本发明研究发现纤溶酶原途径激活剂例如纤溶酶原可以明显改善脊髓前角运动神经元损伤，治疗ALS，改善ALS的症状。

本发明涉及如下各项：

1.一种治疗肌萎缩侧索硬化(ALS)的方法，包括给药患肌萎缩侧索硬化(ALS)的受试者治疗有效量的选自如下的一种或多种纤溶酶原途径激活剂：纤维蛋白溶酶原激活途径的组分、能够直接激活纤维蛋白溶酶原或通过激活纤维蛋白溶酶原激活途径上游组分而间接激活纤维蛋白溶酶原的化合物、模拟纤维蛋白溶酶原或纤维蛋白溶酶之活性的化合物、能够上调纤维蛋白溶酶原或纤维蛋白溶酶原激活剂表达的化合物、纤维蛋白溶酶原类似物、纤维蛋白溶酶类似物、tPA或uPA类似物和纤溶抑制剂的拮抗剂。

2.项1所述的方法，其中所述纤维蛋白溶酶原激活途径的组分选自纤维蛋白溶酶原、重组人纤维蛋白溶酶、Lys-纤维蛋白溶酶原、Glu-纤维蛋白溶酶原、纤维蛋白溶酶、含有纤维蛋白溶酶原和纤维蛋白溶酶的一个或多个kringle结构域和蛋白酶结构域的纤维蛋白溶酶原和纤维蛋白溶酶变体及类似物、小纤维蛋白溶酶原(mini-plasminogen)、小纤维蛋白溶酶(mini-plasmin)、微纤溶酶原(micro-plasminogen)、微纤溶酶(micro-plasmin)、delta-纤溶酶原、delta-纤溶酶(delta-plasmin)、纤维蛋白溶酶原激活剂、tPA和uPA。

3.项1的方法，所述纤溶抑制剂的拮抗剂为PAI-1、补体C1抑制物、α2抗纤溶酶或α2巨球蛋白的拮抗剂，例如PAI-1、补体C1抑制物、α2抗纤溶酶或α2巨球蛋白的抗体。

4.项1-3任一项的方法，其中所述肌萎缩侧索硬化包括包括遗传型和散发型ALS。

5.项1-4任一项的方法，其中所述纤溶酶原途径激活剂对所述患肌萎缩侧索硬化(ALS)的受试者具有选自如下的一种或多种活性：延长寿命和中位生存期、延缓肌肉萎缩和肌力减退、减缓体重下降的速度、减轻脊髓前角细胞损伤、变性和坏死、促进脊髓前角chAT的合成、促进胆碱能神经元功能恢复、促进脊髓前角突触素表达、脊髓前角SMN蛋白表达、促进脊髓前角炎症修复、促进突触损伤修复。

6.项1-5任一项的方法，其中所述纤溶酶原途径激活剂改善受试者的肌肉萎缩、肌力减退、痉挛和/或肌束震颤症状。

7.项1-6任一项的方法，其中所述纤溶酶原途径激活剂减轻受试者的体重下降和/或延长生存期。

8.项1-7任一项的方法，其中所述纤溶酶原途径激活剂改善受试者的肌张力。

9.项1-8任一项的方法，其中所述纤溶酶原途径激活剂促进受试者的肌肉功能恢复。

10.项1-9任一项的方法，其中所述纤溶酶原途径激活剂促进受试者的脊髓前角神经元损伤修复。

11.项1-10任一项的方法，其中所述纤溶酶原途径激活剂与一种或多种其它药物和/或治疗方法联合施用，优选地，所述治疗方法包括细胞疗法(例如干细胞疗法)和基因疗法、反义RNA、小分子剪接修饰剂等。

12.项1-11任一项的方法，其中所述纤溶酶原途径激活剂为纤维蛋白溶酶原激活途径的组分，例如纤溶酶原。

13.项12的方法，其中所述纤溶酶原与序列2、6、8、10或12具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且仍然具有纤溶酶原活性和/或赖氨酸结合活性。

14.项12的方法，所述纤溶酶原为包含纤溶酶原活性和/或赖氨酸结合活性片段、并且仍然具有纤溶酶原活性和/或赖氨酸结合活性的蛋白质。

15.项12的方法，所述纤溶酶原选自Glu-纤溶酶原、Lys-纤溶酶原、小纤溶酶原、微纤溶酶原、delta-纤溶酶原或它们的保留纤溶酶原活性的变体。

16.项12的方法，所述纤溶酶原为天然或合成的人纤溶酶原、或其仍然保留纤溶酶原活性和/或赖氨酸结合活性的变体或片段。

17.项12的方法，其中所述纤溶酶原通过静脉内、肌肉内、鞘内、鼻腔吸入、雾化吸入、滴鼻液或滴眼液形式给药。

在本申请的上述任一实施方案中，所述纤溶酶原可与序列2、6、8、10或12具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且仍然具有纤溶酶原活性和/或赖氨酸结合活性。在一些实施方案中，所述纤溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基础上，添加、删除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1个氨基酸，并且仍然具有纤溶酶原活性和/或赖氨酸结合活性的蛋白质。

在一些实施方案中，所述纤溶酶原是包含纤溶酶原活性和/或赖氨酸结合活性片段、并且仍然具有纤溶酶原活性和/或赖氨酸结合活性的蛋白质。在一些实施方案中，所述纤溶酶原选自Glu-纤溶酶原、Lys-纤溶酶原、小纤溶酶原、微纤溶酶原、delta-纤溶酶原或它们的保留纤溶酶原活性和/或赖氨酸结合活性的变体。在一些实施方案中，所述纤溶酶原为天然或合成的人纤溶酶原、或其仍然保留纤溶酶原活性和/或赖氨酸结合活性的变体或片段。在一些实施方案中，所述纤溶酶原为来自灵长类动物或啮齿类动物的人纤溶酶原直向同系物或其仍然保留纤溶酶原活性和/或赖氨酸结合活性的变体或片段。在一些实施方案中，所述纤溶酶原的氨基酸如序列2、6、8、10或12所示。在一些实施方案中，所述纤溶酶原是人天然纤溶酶原。

在一些实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，所述受试者缺乏或缺失纤溶酶原。在一些实施方案中，所述缺乏或缺失是先天的、继发的和/或局部的。

在前述方法的一些实施方案中，所述纤溶酶原通过全身或局部给药。在一些实施方案中，所述纤溶酶原通过鼻腔吸入、雾化吸入、滴鼻液或滴眼液给药。在一些实施方案中，所述纤溶酶原通过静脉内、肌内、皮下、鞘内注射给予纤溶酶原来进行治疗。在前述方法的一些实施方案中，所述纤溶酶原以每天0.0001-2000mg/kg、0.001-800mg/kg、0.01-600mg/kg、0.1-400mg/kg、1-200mg/kg、1-100mg/kg、10-100mg/kg(以每公斤体重计算)或0.0001-2000mg/cm²、0.001-800mg/cm²、0.01-600mg/cm²、0.1-400mg/cm²、1-200mg/cm²、1-100mg/cm²、10-100mg/cm²(以每平方厘米体表面积计算)的剂量施用，重复一次或多次，优选至少每天、每二天、每三天施用。

在一些实施方案中，本申请涉及以下实施方式

1.治疗有效量的纤溶酶原途径激活剂在制备治疗受试者肌萎缩侧索硬化(ALS)的药物、制剂、制品、试剂盒中的用途。

2.项1的用途，其中所述纤溶酶原途径激活剂对所述患肌萎缩侧索硬化(ALS)的受试者具有选自如下的一种或多种活性：延长寿命和中位生存期、延缓肌肉萎缩和肌力减退、减缓体重下降的速度、减轻脊髓前角细胞损伤、变性和坏死、促进脊髓前角chAT的合成、促进胆碱能神经元功能恢复、促进脊髓前角突触素表达、脊髓前角SMN蛋白表达、促进脊髓前角炎症修复、促进突触损伤修复。

3.项1的用途，其中所述纤溶酶原途径激活剂改善受试者的肌肉萎缩、肌力减退、痉挛和/或肌束震颤症状。

4.项1的用途，其中所述纤溶酶原途径激活剂减轻受试者的体重下降和/或延长生存期。

5.项1的用途，其中所述纤溶酶原途径激活剂改善受试者的肌张力。

6.项1的方法，其中所述纤溶酶原途径激活剂促进受试者的肌肉功能恢复。

7.项1的用途，其中所述纤溶酶原途径激活剂促进受试者的脊髓前角神经元损伤修复。

8.项1-7任一项的用途，其中所述纤溶酶原途径激活剂与一种或多种其它药物和/或治疗方法联合施用。

9.项1-8任一项的用途，其中所述纤溶酶原途径激活剂通过静脉内、皮下、肌肉内、鞘内、鼻腔吸入、雾化吸入、滴鼻液或滴眼液形式给药。

10.项1-9任一项的用途，其中所述纤溶酶原途径激活剂为纤溶酶原激活途径的组分。

11.项10的用途，所述纤溶酶原激活途径的组分为纤溶酶原。

12.项11的方法，其中所述纤溶酶原与序列2、6、8、10或12具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且仍然具有纤溶酶原活性。

13.项11的用途，所述纤溶酶原为纤溶酶原活性片段、并且仍然具有纤溶酶原活性和/或赖氨酸结合活性的蛋白质。

14.项11的用途，所述纤溶酶原选自Glu-纤溶酶原、Lys-纤溶酶原、小纤溶酶原、微纤溶酶原、delta-纤溶酶原或它们的保留纤溶酶原活性的变体。

15.项11的用途，所述纤溶酶原为天然或合成的人纤溶酶原、或其仍然保留纤溶酶原活性和/或赖氨酸结合活性的变体或片段。

本发明还涉及治疗肌萎缩侧索硬化(ALS)的药物组合物、药物、制剂、试剂盒、制品，包含治疗有效量的纤溶酶原途径激活剂。

在一些实施方案中，所述纤溶酶原途径激活剂对所述患肌萎缩侧索硬化(ALS)的受试者具有选自如下的一种或多种活性：延长寿命和中位生存期、延缓肌肉萎缩和肌力减退、减缓体重下降的速度、减轻脊髓前角细胞损伤、变性和坏死、促进脊髓前角chAT的合成、促进胆碱能神经元功能恢复、促进脊髓前角突触素表达、脊髓前角SMN蛋白表达、促进脊髓前角炎症修复、促进突触损伤修复。在一些实施方案中，中所述纤溶酶原途径激活剂改善受试者的肌肉萎缩、肌力减退、痉挛和/或肌束震颤症状。在一些实施方案中，所述纤溶酶原途径激活剂减轻受试者的体重下降和/或延长生存期。在一些实施方案中，所述纤溶酶原途径激活剂改善受试者的肌张力。在一些实施方案中，所述纤溶酶原途径激活剂促进受试者的肌肉功能恢复。在一些实施方案中所述纤溶酶原途径激活剂促进受试者的脊髓前角神经元损伤修复。

在一些实施方案中，所述纤溶酶原途径激活剂为纤溶酶原激活途径的组分。在一些实施方案中，纤溶酶原激活途径的组分为纤溶酶原。在一些实施方案中，所述纤溶酶原与序列2、6、8、10或12具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且仍然具有纤溶酶原活性和/或赖氨酸结合活性。在一些实施方案中，所述纤溶酶原为包含纤溶酶原活性和/或赖氨酸结合活性片段、并且仍然具有纤溶酶原活性和/或赖氨酸结合活性的蛋白质。在一些实施方案中，所述纤溶酶原选自Glu-纤溶酶原、Lys-纤溶酶原、小纤溶酶原、微纤溶酶原、delta-纤溶酶原或它们的保留纤溶酶原活性的变体。在一些实施方案中，所述纤溶酶原为天然或合成的人纤溶酶原、或其仍然保留纤溶酶原活性和/或赖氨酸结合活性的变体或片段。

在一些实施方案中，所述纤溶酶原途径激活剂，例如纤溶酶原激活途径的组分，例如纤溶酶原与一种或多种其它药物和/或治疗方法联合施用。在一些实施方案中，所述纤溶酶原途径激活剂，例如纤溶酶原激活途径的组分，例如纤溶酶原通过静脉内、肌肉内、皮下、鞘内、鼻腔吸入、雾化吸入、滴鼻液或滴眼液形式给药。

在一些实施方案中，所述药物组合物、药物、制剂包含药学上可接受的载体和纤溶酶原途径激活剂，例如纤溶酶原激活途径的组分，例如纤溶酶原。在一些实施方案中，所述试剂盒和制品包含一个或多个容器，所述容器中包含所述药物组合物、药物或制剂。在一些实施方案中，所述试剂盒或制品还包含标签或使用说明书，该标签或使用说明书指示使用纤溶酶原途径激活剂，例如纤溶酶原激活途径的组分，例如纤溶酶原治疗肌萎缩侧索硬化的方法。

在一些实施方案中，所述试剂盒或制品还包含另外的一个或多个容器，该容器中含有其他药物。

本发明还涉及治疗有效量的纤溶酶原途径激活剂在制备治疗肌萎缩侧索硬化(ALS)的药物组合物、药物、制剂、试剂盒、制品中的用途。

在一些实施方案中，所述纤溶酶原途径激活剂为纤溶酶原激活途径的组分。在一些实施方案中，纤溶酶原激活途径的组分为纤溶酶原。在一些实施方案中，所述纤溶酶原与序列2、6、8、10或12具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且仍然具有纤溶酶原活性和/或赖氨酸结合活性。在一些实施方案中，所述纤溶酶原为包含纤溶酶原活性和/或赖氨酸结合活性片段、并且仍然具有纤溶酶原活性和/或赖氨酸结合活性的蛋白质。在一些实施方案中，所述纤溶酶原选自Glu-纤溶酶原、Lys-纤溶酶原、小纤溶酶原、微纤溶酶原、delta-纤溶酶原或它们的保留纤溶酶原活性的变体。在一些实施方案中，所述纤溶酶原为天然或合成的人纤溶酶原、或其仍然保留纤溶酶原活性和/或赖氨酸结合活性的变体或片段。

本发明明确涵盖了属于本发明实施方案之间的技术特征的所有组合，并且这些组合后的技术方案在本申请中已经明确公开，就像上述技术方案已经单独且明确公开一样。另外，本发明还明确涵盖各个实施方案及其要素的之间的组合，该组合后的技术方案在本文中明确公开。

附图简述

图1给予纤溶酶原后ALS模型小鼠寿命和生存时间统计结果。图1A为寿命统计结果，图1B为生存时间统计结果。结果显示，给纤溶酶原组小鼠平均寿命为164±8.6天，溶媒对照组小鼠平均寿命为153±0天，给纤溶酶原组寿命相对于溶媒对照组延长了约11天；给纤溶酶原小鼠中位生存期为53±9天，溶媒对照组中位生存期为40±0天，给纤溶酶原组中位生存期相对于溶媒对照组延长了约13天，约延长了30％。该结果表明纤溶酶原能够延长ALS小鼠寿命和中位生存期。

图2结果显示，给药期间虽然两组小鼠悬挂潜伏时间均在减少，但给纤溶酶原组小鼠悬挂潜伏时间始终长于溶媒对照组小鼠，且给药第6、21、23天，给纤溶酶原组悬挂潜伏时间与溶媒组相比，统计差异显著或极为显著，P值分别为0.03、0.02、0.008。说明纤溶酶原能够延缓ALS小鼠肌力减退。

图3给予纤溶酶原后ALS模型小鼠出现2分神经行为表现的时间。结果显示，给纤溶酶原组小鼠出现2分神经表现的时间点明显晚于溶媒组，且统计差异显著(*表示P<0.05)。

图4给予纤溶酶原后正常小鼠和ALS模型小鼠体重相对于其第1天体重百分比统计结果。结果显示，给药期间，空白对照组小鼠体重波动不大，有逐渐上升趋势；溶媒对照组小鼠体重逐渐下降；给纤溶酶原组小鼠体重前25天虽然波动较大，但均接近或略大于空白对照组体重，25天后体重渐呈降低趋势，但始终大于溶媒对照组小鼠体重，且与溶媒对照组相比，P值小于或接近0.001。说明纤溶酶原可以显著缓解ALS模型小鼠体重下降的速度，延缓ALS病情的恶化。

图5给予纤溶酶原后正常小鼠和ALS模型小鼠脊髓前角H&E染色中空泡面积统计结果。A为空白对照组，B为溶媒组，C为给药组，D为空泡面积统计结果。结果显示，空白对照小鼠脊髓前角呈现出一定水平的空泡面积，溶媒组小鼠脊髓前角空泡面积明显大于空白对照(P<0.001)，给药组小鼠脊髓前角空泡面积明显低于溶媒组，且统计差异极为显著。提示纤溶酶原能够减少ALS模型小鼠脊髓前角空泡面积，减少脊髓前角运动神经元的死亡。

图6给予纤溶酶原后正常小鼠和ALS模型小鼠脊髓前角chAT免疫组化染色结果。A为空白对照组，B为溶媒组，C为给药组，D为平均光密度统计结果。结果显示。空白对照小鼠脊髓前角表达一定量的chAT，溶媒组鼠chAT表达水平明显低于空白对照组小鼠，给药组小鼠脊髓前角chAT的表达明显高于溶媒组小鼠，统计学差异显著(P<0.05)。提示纤溶酶原6能够促进SOD1-G93A小鼠脊髓前角chAT的合成与表达，促进胆碱能神经元功能恢复。

图7给予纤溶酶原后正常小鼠和ALS模型小鼠脊髓前角突触素免疫组化染色结果。A为空白对照组，B为溶媒组，C为给药组，D为平均光密度统计结果。结果显示，空白对照组小鼠脊髓前角表达一定水平的突触素，溶媒组小鼠突触素的表达水平明显低于空白对照小鼠，给药组小鼠脊髓前角突触素的表达明显高于溶媒组小鼠，且统计差异显著(P<0.05)。提示纤溶酶原能够促进模型小鼠脊髓前角突触素的表达，促进突触损伤修复。

图8给予纤溶酶原后正常小鼠和ALS模型小鼠脊髓前角Iba-1免疫组化染色结果。A为空白对照组，B为溶媒组，C为给药组，D为平均光密度统计结果。结果显示，空白对照组小鼠脊髓前角表达一定水平的Iba-1，给药组小鼠脊髓前角Iba-1的表达水平明显高于溶媒组和空白对照组小鼠，且统计差异显著(P<0.05或0.01)。提示纤溶酶原能够促进模型小鼠脊髓前角炎症修复。

图9给予纤溶酶原后正常小鼠和ALS模型小鼠腓肠肌H&E染色代表性图片。A为空白对照组，B为溶媒组，C为给药组。结果显示，空白对照组小鼠腓肠肌肌纤维结构完整，形态大小比较均一，而溶媒组腓肠肌肌纤维出现严重的萎缩现象，并有局部炎症细胞浸润(红色箭头)，肌纤维圆性变，给药组肌纤维萎缩现象相比溶媒组较轻，但也有炎症细胞浸润的现象。提示纤溶酶原能够改善模型小鼠肌肉萎缩。

图10给予纤溶酶原后正常小鼠和ALS模型小鼠臀肌H&E染色代表性图片。A为空白对照组，B为溶媒组，C为给药组。结果显示，空白对照组小鼠肌纤维结构比较完整，形态大小比较均一。溶媒组小鼠臀肌的肌纤维有圆性变，大小不一，萎缩严重，伴有炎性细胞浸润，给药组小鼠臀肌肌纤维结构形态相比溶媒组有一定程度的恢复。提示纤溶酶原能够改善模型小鼠肌肉萎缩。

图11给予纤溶酶原后ALS模型小鼠脊髓前角SMN蛋白免疫组化染色代表性图片。A为溶媒组，B为给药组。结果显示，给药组小鼠脊髓前角SMN蛋白的表达水平明显高于溶媒组。提示纤溶酶原能够促进模型小鼠脊髓前角SMN蛋白的表达。

发明详述

本发明“肌萎缩侧索硬化”是指由运动神经元损伤导致的一系列病理变化的总称。所述病理变化包括运动神经元退化、神经胶质增生、神经纤维异常、皮层脊髓束和脊神经前根中有髓纤维的丧失。延髓运动神经元损伤的表现例如面部肌肉、语言和吞咽功能障碍；脊髓运动神经元损伤的表现包括肌肉痉挛、肌肉衰弱、肌萎缩、瘫痪和呼吸衰竭。

ALS的特征在于下运动神经元和上运动神经元的功能障碍的进行性表现。下运动神经元将脑干和脊髓连接到肌肉纤维，其功能障碍导致肌肉萎缩、痉挛和肌束震颤。上运动神经元源于大脑皮质或脑干的运动区域，运载运动信息至直接响应的运动神经元以刺激目标肌肉。它们的功能障碍导致痉挛(干扰步态、运动和语音的持续的肌肉收缩)和病理反射。ALS根据是否具有家族遗传性可以分为散发性ALS(sALS)和家族性ALS(fALS)。散发性ALS没有ALS家族史，家族性ALS在家族中存在1个以上ALS患者。根据遗传方式的不同，家族性ALS可分为常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传和伴X染色体遗传。

运动神经对肌肉组织有营养作用。切断运动神经后，肌肉内的糖原合成减慢、蛋白质分解加速，肌肉逐渐萎缩。本申请也涉及纤溶酶原对由于运动神经损伤所导致的肌萎缩及其相关病症的治疗。

纤维蛋白溶解系统(Fibrinolytic system)也称纤溶系统，为参与纤维蛋白溶解(纤溶)过程的一系列化学物质组成的系统，主要包括纤维蛋白溶解酶原(纤溶酶原)、纤溶酶、纤溶酶原激活物、纤溶抑制剂。纤溶酶原激活物包括组织型纤溶酶原激活物(t-PA)和尿激酶型纤溶酶原激活物(u-PA)。t-PA是一种丝氨酸蛋白酶，由血管内皮细胞合成。t-PA激活纤溶酶原，此过程主要在纤维蛋白上进行；尿激酶型纤溶酶原激活物(u-PA)由肾小管上皮细胞和血管内皮细胞产生，可以直接激活纤溶酶原而不需要纤维蛋白作为辅因子。纤溶酶原(PLG)由肝脏合成，当血液凝固时，PLG大量吸附在纤维蛋白网上，在t-PA或u-PA的作用下，被激活为纤溶酶，促使纤维蛋白溶解。纤溶酶(PL)是一种丝氨酸蛋白酶，作用如下：降解纤维蛋白和纤维蛋白原；水解多种凝血因子Ⅴ、Ⅷ、Ⅹ、Ⅶ、Ⅺ、Ⅱ等；使纤溶酶原转变为纤溶酶；水解补体等。纤溶抑制物：包括纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)和α2抗纤溶酶(α2-AP)。PAI主要有PAI-1和PAI-2两种形式，能特异性与t-PA以1：1比例结合，从而使其失活，同时激活PLG。α2-AP由肝脏合成，与PL以1：1比例结合形成复合物，抑制PL活性；FⅩⅢ使α2-AP以共价键与纤维蛋白结合，减弱了纤维蛋白对PL作用的敏感性。体内抑制纤溶系统活性的物质：PAI-1，补体C1抑制物；α2抗纤溶酶；α2巨球蛋白。

本发明“纤维蛋白溶酶原途径激活剂”或“纤溶酶原途径激活剂”术语涵盖纤维蛋白溶酶原激活途径的组分、能够直接激活纤维蛋白溶酶原或通过激活纤维蛋白溶酶原激活途径上游组分而间接激活纤维蛋白溶酶原的化合物、模拟纤维蛋白溶酶原或纤维蛋白溶酶之活性的化合物、能够上调纤维蛋白溶酶原或纤维蛋白溶酶原激活剂表达的化合物、纤维蛋白溶酶原类似物、纤维蛋白溶酶类似物、tPA或uPA类似物和纤溶抑制剂的拮抗剂。

本发明的术语“纤维蛋白溶酶原激活途径的组分”或“纤溶酶原激活途径的组分”涵盖：

1.纤维蛋白溶酶原、Lys-纤维蛋白溶酶原、Glu-纤维蛋白溶酶原、微纤溶酶原(micro-plasminogen)、delta-纤溶酶原；它们的变体或类似物；

2.纤维蛋白溶酶以及它们的变体或类似物；和

3.纤维蛋白溶酶原激活剂，例如tPA和uPA以及包含一个或多个tPA或uPA的结构域(如一个或多个kringle结构域和蛋白水解结构域)的tPA或uPA变体和类似物。

所述的“纤溶抑制剂的拮抗剂”术语涵盖PAI-1、补体C1抑制物、α2抗纤溶酶或α2巨球蛋白的拮抗剂，例如PAI-1、补体C1抑制物、α2抗纤溶酶或α2巨球蛋白的抗体。

上述纤维蛋白溶酶原、纤维蛋白溶酶、tPA和uPA的“变体”包括所有天然存在的人类遗传变体以及这些蛋白质的其他哺乳动物形式，以及通过添加、删除和/或取代例如1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1个氨基酸、仍然具有纤维蛋白溶酶原、纤维蛋白溶酶、tPA或uPA活性的蛋白质。例如，纤维蛋白溶酶原、纤维蛋白溶酶、tPA和uPA的“变体”包括通过例如1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1个保守性氨基酸取代获得的这些蛋白质的突变变体。

本发明的“纤溶酶原变体”涵盖与序列2、6、8、10或12具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且仍然具有纤溶酶原活性和/或赖氨酸结合活性的蛋白质。例如本发明的“纤溶酶原变体”可以是在序列2、6、8、10或12的基础上，添加、删除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1个氨基酸，并且仍然具有纤溶酶原活性和/或赖氨酸结合活性的蛋白质。具体地，本发明纤溶酶原变体包括所有天然存在的人类遗传变体以及这些蛋白质的其他哺乳动物形式，以及通过保守性氨基酸取代例如1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1个氨基酸获得的这些蛋白质的突变变体。

本发明的纤溶酶原可以为来自灵长类动物或啮齿类动物的人纤溶酶原直向同系物或其仍然保留纤溶酶原活性和/或赖氨酸结合活性的变体，例如序列2、6、8、10或12所示的纤溶酶原，例如序列2所示的人天然纤溶酶原。

上述纤维蛋白溶酶原、纤维蛋白溶酶、tPA和uPA的“类似物”包括分别提供与纤维蛋白溶酶原、纤维蛋白溶酶、tPA或uPA基本相似的作用的化合物。

上述纤维蛋白溶酶原、纤维蛋白溶酶、tPA和uPA的“变体”和“类似物”涵盖包含一个或多个结构域(例如一个或多个kringle结构域和蛋白水解结构域)的纤维蛋白溶酶原、纤维蛋白溶酶、tPA和uPA的“变体”和“类似物”。例如，纤维蛋白溶酶原的“变体”和“类似物”涵盖包含一个或多个纤溶酶原结构域(例如一个或多个kringle结构域和蛋白水解结构域)的纤维蛋白溶酶原变体和类似物，例如小纤维蛋白溶酶原(mini-plasminogen)。纤维蛋白溶酶的“变体”和“类似物”涵盖包含一个或多个纤维蛋白溶酶结构域(例如一个或多个kringle结构域和蛋白水解结构域)的纤维蛋白溶酶“变体”和“类似物”，例如小纤维蛋白溶酶(mini-plasmin)和δ-纤维蛋白溶酶(delta-plasmin)。

上述纤维蛋白溶酶原、纤维蛋白溶酶、tPA或uPA的“变体”或“类似物”是否分别具有纤维蛋白溶酶原、纤维蛋白溶酶、tPA或uPA的活性，或者是否分别提供与纤维蛋白溶酶原、纤维蛋白溶酶、tPA或uPA基本相似的作用可以通过本领域已知方法进行检测，例如，通过基于酶谱法(enzymography)、ELISA(酶联免疫吸附测定)和FACS(荧光激活细胞分选方法)通过激活的纤维蛋白溶酶活性水平来衡量，例如可以参照选自如下文献中记载的方法测量：Ny，A.，Leonardsson，G.，Hagglund，A.C，Hagglof，P.，Ploplis，V.A.，Carmeliet，P.and Ny，T.(1999).Ovulation inplasminogen-deficient mice.Endocrinology 140，5030-5035；Silverstein RL,Leung LL,Harpel PC,Nachman RL(November 1984)."Complex formation of platelet thrombospondin with plasminogen.Modulation ofactivation by tissue activator".J.Clin.Invest.74(5):1625–33；Gravanis I,TsirkaSE(February2008)."Tissue-type plasminogen activator as a therapeutic targetin stroke".Expert Opinion on Therapeutic Targets.12(2):159–70；Geiger M,HuberK,Wojta J,Stingl L,Espana F,Griffin JH,Binder BR(Aug 1989)."Complex formationbetween urokinase and plasma protein C inhibitor in vitro and in vivo".Blood.74(2):722–8.

在本发明的一些实施方案中，本发明的“纤维蛋白溶酶原激活途径的组分”为纤溶酶原，选自Glu-纤溶酶原、Lys-纤溶酶原、小纤溶酶原、微纤溶酶原、delta-纤溶酶原或它们的保留纤溶酶原活性的变体。在一些实施方案中，所述纤溶酶原为天然或合成的人纤溶酶原、或其仍然保留纤溶酶原活性和/或赖氨酸结合活性的保守突变变体或其片段。在一些实施方案中，所述纤溶酶原为来自灵长类动物或啮齿类动物的人纤溶酶原直向同系物或其仍然保留纤溶酶原活性和/或赖氨酸结合活性的保守突变变体或其片段。在一些实施方案中，所述纤溶酶原的氨基酸如序列2、6、8、10或12所示。在一些实施方案中，所述纤溶酶原是人天然纤溶酶原。在一些实施方案中，所述纤溶酶原是如序列2所示的人天然纤溶酶原。

“能够直接激活纤维蛋白溶酶原或通过激活纤维蛋白溶酶原激活途径上游组分而间接激活纤维蛋白溶酶原的化合物”指能够直接激活纤维蛋白溶酶原或通过激活纤维蛋白溶酶原激活途径上游组分而间接激活纤维蛋白溶酶原的任何化合物，例如tPA、uPA、链激酶、沙芦普酶、阿替普酶、瑞替普酶、替奈普酶、阿尼普酶、孟替普酶、拉诺替普酶、帕米普酶、葡激酶。

本发明“纤溶抑制剂的拮抗剂”为拮抗、减弱、封闭、阻止纤溶抑制剂作用的化合物。所述纤溶抑制剂例如PAI-1、补体C1抑制物、α2抗纤溶酶和α2巨球蛋白。所述拮抗剂例如PAI-1、补体C1抑制物、α2抗纤溶酶或α2巨球蛋白的抗体，或阻断或下调例如PAI-1、补体C1抑制物、α2抗纤溶酶或α2巨球蛋白表达的反义RNA或小RNA，或占据PAI-1、补体C1抑制物、α2抗纤溶酶或α2巨球蛋白的结合位点但无PAI-1、补体C1抑制物、α2抗纤溶酶或α2巨球蛋白功能的化合物”，或封闭PAI-1、补体C1抑制物、α2抗纤溶酶或α2巨球蛋白的结合结构域和/或活性结构域的化合物。

纤溶酶是纤溶酶原激活系统(PA系统)的关键组分。它是一种广谱的蛋白酶，能够水解细胞外基质(ECM)的几个组分，包括纤维蛋白、明胶、纤连蛋白、层粘连蛋白和蛋白聚糖。此外，纤溶酶能将一些金属蛋白酶前体(pro-MMPs)激活形成具有活性的金属蛋白酶(MMPs)。因此纤溶酶被认为是胞外蛋白水解作用的一个重要的上游调节物。纤溶酶是由纤溶酶原通过两种生理性的PAs：组织型纤溶酶原激活剂(tPA)或尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)蛋白水解形成的。由于纤溶酶原在血浆和其他体液中相对水平较高，传统上认为PA系统的调节主要通过PAs的合成和活性水平实现。PA系统组分的合成受不同因素严格调节，如激素、生长因子和细胞因子。此外，还存在纤溶酶和PAs的特定生理抑制剂。纤溶酶的主要抑制剂是α2-抗纤溶酶(α2-antiplasmin)。PAs的活性同时被uPA和tPA的纤溶酶原激活剂抑制剂-1(PAI-1)抑制以及主要抑制uPA的溶酶原激活剂抑制剂-2(PAI-2)调节。某些细胞表面具有直接水解活性的uPA特异性细胞表面受体(uPAR)。

纤溶酶原是一个单链糖蛋白，由791个氨基酸组成，分子量约为92kDa。纤溶酶原主要在肝脏合成，大量存在于胞外液中。血浆中纤溶酶原含量约为2μM。因此纤溶酶原是组织和体液中蛋白质水解活性的一个巨大的潜在来源。纤溶酶原存在两种分子形式：谷氨酸-纤溶酶原(Glu-plasminogen)和赖氨酸-纤溶酶原(Lys-plasminogen)。天然分泌和未裂解形式的纤溶酶原具有一个氨基末端(N-末端)谷氨酸，因此被称为谷氨酸-纤溶酶原。然而，在纤溶酶存在时，谷氨酸-纤溶酶原在Lys76-Lys77处水解成为赖氨酸-纤溶酶原。与谷氨酸-纤溶酶原相比，赖氨酸-纤溶酶原与纤维蛋白具有更高的亲和力，并可以更高的速率被PAs激活。这两种形式的纤溶酶原的Arg560-Val561肽键可被uPA或tPA切割，导致二硫键连接的双链蛋白酶纤溶酶的形成。纤溶酶原的氨基末端部分包含五个同源三环，即所谓的kringles，羧基末端部分包含蛋白酶结构域。一些kringles含有介导纤溶酶原与纤维蛋白及其抑制剂α2-AP特异性相互作用的赖氨酸结合位点。最新发现一个纤溶酶原为38kDa的片段，其中包括kringles1-4，是血管生成的有效抑制剂。这个片段被命名为血管抑素，可通过几个蛋白酶水解纤溶酶原产生。

纤溶酶的主要底物是纤维蛋白，纤维蛋白的溶解是预防病理性血栓形成的关键。纤溶酶还具有对ECM几个组分的底物特异性，包括层粘连蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖和明胶，表明纤溶酶在ECM重建中也起着重要作用。间接地，纤溶酶还可以通过转化某些蛋白酶前体为活性蛋白酶来降解ECM的其他组分，包括MMP-1，MMP-2，MMP-3和MMP-9。因此，有人提出，纤溶酶可能是细胞外蛋白水解的一个重要的上游调节器。此外，纤溶酶具有激活某些潜在形式的生长因子的能力。在体外，纤溶酶还能水解补体系统的组分并释放趋化补体片段。

“纤溶酶”是存在于血液中的一种非常重要的酶，能将纤维蛋白凝块水解为纤维蛋白降解产物和D-二聚体。

“纤溶酶原”是纤溶酶的酶原形式，根据swiss prot中的序列，按含有信号肽的天然人源纤溶酶原氨基酸序列(序列4)计算由810个氨基酸组成，分子量约为90kD，主要在肝脏中合成并能够在血液中循环的糖蛋白，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列3所示。全长的纤溶酶原包含七个结构域：位于C末端的丝氨酸蛋白酶结构域、N末端的Pan Apple(PAp)结构域以及5个Kringle结构域(Kringle1-5)。参照swiss prot中的序列，其信号肽包括残基Met1-Gly19，PAp包括残基Glu20-Val98，Kringle1包括残基Cys103-Cys181，Kringle2包括残基Glu184-Cys262，Kringle3包括残基Cys275-Cys352，Kringle4包括残基Cys377-Cys454，Kringle5包括残基Cys481-Cys560。根据NCBI数据，丝氨酸蛋白酶域包括残基Val581-Arg804。

Glu-纤溶酶原是天然全长的纤溶酶原，由791个氨基酸组成(不含有19个氨基酸的信号肽)，编码该序列的cDNA序列如序列1所示，其氨基酸序列如序列2所示。在体内，还存在一种是从Glu-纤溶酶原的第76-77位氨基酸处水解从而形成的Lys-纤溶酶原，如序列6所示，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列5所示。Delta-纤溶酶原(δ-plasminogen)是全长纤溶酶原缺失了Kringle2-Kringle5结构的片段，仅含有Kringle1和丝氨酸蛋白酶域，有文献报道了delta-纤溶酶原的氨基酸序列(序列8)，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列7。小纤溶酶原(Mini-plasminogen)由Kringle5和丝氨酸蛋白酶域组成，有文献报道其包括残基Val443-Asn791(以不含有信号肽的Glu-纤溶酶原序列的Glu残基为起始氨基酸)，其氨基酸序列如序列10所示，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列9所示。而微纤溶酶原(Micro-plasminogen)仅含有丝氨酸蛋白酶结构域，有文献报道其氨基酸序列包括残基Ala543-Asn791(以不含有信号肽的Glu-纤溶酶原序列的Glu残基为起始氨基酸)，也有专利文献CN102154253A报道其序列包括残基Lys531-Asn791(以不含有信号肽的Glu-纤溶酶原序列的Glu残基为起始氨基酸)，本专利序列参考专利文献CN102154253A，其氨基酸序列如序列12所示，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列11所示。

本发明的“纤溶酶”与“纤维蛋白溶酶”、“纤维蛋白溶解酶”可互换使用，含义相同；“纤溶酶原”与“纤维蛋白溶酶”、“纤维蛋白溶解酶原”可互换使用，含义相同。

在本申请中，所述纤溶酶原“缺乏”的含义或活性为受试者体内纤溶酶原的含量比正常人低，低至足以影响所述受试者的正常生理功能；所述纤溶酶原“缺失”的含义或活性为受试者体内纤溶酶原的含量显著低于正常人，甚至活性或表达极微，只有通过外源提供才能维持正常生理功能。

本领域技术人员可以理解，本发明纤溶酶原的所有技术方案适用于纤溶酶，因此，本发明描述的技术方案涵盖了纤溶酶原和纤溶酶。在循环过程中，纤溶酶原采用封闭的非活性构象，但当结合至血栓或细胞表面时，在纤溶酶原激活剂(plasminogen activator，PA)的介导下，其转变为呈开放性构象的活性纤溶酶。具有活性的纤溶酶可进一步将纤维蛋白凝块水解为纤维蛋白降解产物和D-二聚体，进而溶解血栓。其中纤溶酶原的PAp结构域包含维持纤溶酶原处于非活性封闭构象的重要决定簇，而KR结构域则能够与存在于受体和底物上的赖氨酸残基结合。已知多种能够作为纤溶酶原激活剂的酶，包括：组织纤溶酶原激活剂(tPA)、尿激酶纤溶酶原激活剂(uPA)、激肽释放酶和凝血因子XII(哈格曼因子)等。

“纤溶酶原活性片段”在本申请中包括1)在纤溶酶原蛋白中，能够与底物中的靶序列结合的活性片段，也称为赖氨酸结合片段，例如包含Kringle 1、Kringle 2、Kringle 3、Kringle 4和/或Kringle 5的片段(所述纤溶酶原结构参见Aisina R B,Mukhametova LI.Structure and function of plasminogen/plasmin system[J].Russian Journal ofBioorganic Chemistry,2014,40(6):590-605所述)；2)在纤溶酶原蛋白中发挥蛋白水解功能的活性片段，例如包含序列14所示的纤溶酶原活性(蛋白水解功能)的片段；3)在纤溶酶原蛋白中，既具有与底物中的靶序列结合活性(赖氨酸结合活性)又具有纤溶酶原活性(蛋白水解功能)的片段。在本申请的一些实施方案中，所述纤溶酶原为包含序列14所示的纤溶酶原活性片段的蛋白质。在本申请的一些实施方案中，所述纤溶酶原为包含Kringle 1、Kringle 2、Kringle 3、Kringle 4和/或Kringle 5的赖氨酸结合片段的蛋白质。在一些实施方案中，本申请的纤溶酶原活性片段包含序列14、与序列14具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列的蛋白质。因此，本发明所述的纤溶酶原包括含有该纤溶酶原活性片段、并且仍然保持该纤溶酶原活性的蛋白。在一些实施方案中，本申请的纤溶酶原包含Kringle 1、Kringle 2、Kringle 3、Kringle 4和/或Kringle 5、或与Kringle1、Kringle 2、Kringle 3、Kringle 4或Kringle 5具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同源性并且仍然具有赖氨酸结合活性的蛋白质。

目前，对于血液中纤溶酶原及其活性测定方法包括：对组织纤溶酶原激活剂活性的检测(t-PAA)、血浆组织纤溶酶原激活剂抗原的检测(t-PAAg)、对血浆组织纤溶酶原活性的检测(plgA)、血浆组织纤溶酶原抗原的检测(plgAg)、血浆组织纤溶酶原激活剂抑制物活性的检测、血浆组织纤溶酶原激活剂抑制物抗原的检测、血浆纤维蛋白溶酶-抗纤维蛋白溶酶复合物检测(PAP)。其中最常用的检测方法为发色底物法：向受检血浆中加链激酶(SK)和发色底物，受检血浆中的PLG在SK的作用下，转变成PLM，后者作用于发色底物，随后用分光光度计测定，吸光度增加与纤溶酶原活性成正比。此外也可采用免疫化学法、凝胶电泳、免疫比浊法、放射免疫扩散法等对血液中的纤溶酶原活性进行测定。

“直系同源物或直系同系物(ortholog)”指不同物种之间的同源物，既包括蛋白同源物也包括DNA同源物，也称为直向同源物、垂直同源物。其具体指不同物种中由同一祖先基因进化而来的蛋白或基因。本发明的纤溶酶原包括人的天然纤溶酶原，还包括来源于不同物种的、具有纤溶酶原活性的纤溶酶原直系同源物或直系同系物。

“保守取代变体”是指其中一个给定的氨基酸残基改变但不改变蛋白质或酶的整体构象和功能，这包括但不限于以相似特性(如酸性，碱性，疏水性，等)的氨基酸取代亲本蛋白质中氨基酸序列中的氨基酸。具有类似性质的氨基酸是众所周知的。例如，精氨酸、组氨酸和赖氨酸是亲水性的碱性氨基酸并可以互换。同样，异亮氨酸是疏水氨基酸，则可被亮氨酸，蛋氨酸或缬氨酸替换。因此，相似功能的两个蛋白或氨基酸序列的相似性可能会不同。例如，基于MEGALIGN算法的70％至99％的相似度(同一性)。“保守取代变体”还包括通过BLAST或FASTA算法确定具有60％以上的氨基酸同一性的多肽或酶，若能达75％以上更好，最好能达85％以上，甚至达90％以上为最佳，并且与天然或亲本蛋白质或酶相比具有相同或基本相似的性质或功能。

“分离的”纤溶酶原是指从其天然环境分离和/或回收的纤溶酶原蛋白。在一些实施方案中，所述纤溶酶原会纯化(1)至大于90％、大于95％、或大于98％的纯度(按重量计)，如通过Lowry法所确定的，例如超过99％(按重量计)，(2)至足以通过使用旋转杯序列分析仪获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)至同质性，该同质性是通过使用考马斯蓝或银染在还原性或非还原性条件下的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确定的。分离的纤溶酶原也包括通过生物工程技术从重组细胞制备，并通过至少一个纯化步骤分离的纤溶酶原。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指任何长度的氨基酸的聚合形式，其可以包括遗传编码的和非遗传编码的氨基酸，化学或生物化学修饰的或衍生化的氨基酸，和具有经修饰的肽主链的多肽。该术语包括融合蛋白，包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白，具有异源和同源前导序列(具有或没有N端甲硫氨酸残基)的融合物；等等。

关于参照多肽序列的“氨基酸序列同一性百分数(％)”定义为在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式实现，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能决定用于比对序列的适宜参数，包括对所比较序列全长实现最大对比需要的任何算法。然而，为了本发明的目的，氨基酸序列同一性百分数值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生的。

在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列A相对于给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：

分数X/Y乘100

其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，且其中Y是B中的氨基酸残基的总数。应当领会，在氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等的情况下，A相对于B的％氨基酸序列同一性会不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有明确说明，本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。

如本文中使用的，术语“治疗”指获得期望的药理和/或生理效果。所述效果可以是完全或部分预防疾病或其症状，和/或部分或完全治愈疾病和/或其症状，并且包括：(a)预防疾病在受试者体内发生，所述受试者可以具有疾病的素因，但是尚未诊断为具有疾病；(b)抑制疾病，即阻滞其形成；和(c)减轻疾病和/或其症状，即引起疾病和/或其症状消退。

术语“个体”、“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，指哺乳动物，包括但不限于鼠(大鼠、小鼠)、非人灵长类、人、犬、猫、有蹄动物(例如马、牛、绵羊、猪、山羊)等。

“治疗有效量”或“有效量”指在对哺乳动物或其它受试者施用以治疗疾病时足以实现对疾病的所述预防和/或治疗的纤溶酶原的量。“治疗有效量”会根据所使用的纤溶酶原、要治疗的受试者的疾病和/或其症状的严重程度以及年龄、体重等而变化。

本发明纤溶酶原的制备

纤溶酶原可以从自然界分离并纯化用于进一步的治疗用途，也可以通过标准的化学肽合成技术来合成。当通过化学合成多肽时，可以经液相或固相进行合成。固相多肽合成(SPPS)(其中将序列的C末端氨基酸附接于不溶性支持物，接着序贯添加序列中剩余的氨基酸)是适合纤溶酶原化学合成的方法。各种形式的SPPS，诸如Fmoc和Boc可用于合成纤溶酶原。用于固相合成的技术描述于Barany和Solid-Phase Peptide Synthesis；第3-284页于The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology.第2卷：Special Methods in PeptideSynthesis,Part A.,Merrifield,等J.Am.Chem.Soc.,85:2149-2156(1963)；Stewart等,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd ed.Pierce Chem.Co.,Rockford,Ill.(1984)；和Ganesan A.2006Mini Rev.Med Chem.6:3-10和Camarero JA等2005Protein PeptLett.12:723-8中。简言之，用其上构建有肽链的功能性单元处理小的不溶性多孔珠。在偶联/去保护的重复循环后，将附接的固相游离N末端胺与单个受N保护的氨基酸单元偶联。然后，将此单元去保护，露出可以与别的氨基酸附接的新的N末端胺。肽保持固定在固相上，之后将其切掉。

可以使用标准重组方法来生产本发明的纤溶酶原。例如，将编码纤溶酶原的核酸插入表达载体中，使其与表达载体中的调控序列可操作连接。表达调控序列包括但不限于启动子(例如天然关联的或异源的启动子)、信号序列、增强子元件、和转录终止序列。表达调控可以是载体中的真核启动子系统，所述载体能够转化或转染真核宿主细胞(例如COS或CHO细胞)。一旦将载体掺入合适的宿主中，在适合于核苷酸序列的高水平表达及纤溶酶原的收集和纯化的条件下维持宿主。

合适的表达载体通常在宿主生物体中作为附加体或作为宿主染色体DNA的整合部分复制。通常，表达载体含有选择标志物(例如氨苄青霉素抗性、潮霉素抗性、四环素抗性、卡那霉素抗性或新霉素抗性)以有助于对外源用期望的DNA序列转化的那些细胞进行检测。

大肠杆菌(Escherichia coli)是可以用于克隆纤溶酶原编码多核苷酸的原核宿主细胞的例子。适合于使用的其它微生物宿主包括杆菌，诸如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和其他肠杆菌科(enterobacteriaceae)，诸如沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、和各种假单胞菌属(Pseudomonas)物种。在这些原核宿主中，也可以生成表达载体，其通常会含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如复制起点)。另外，会存在许多公知的启动子，诸如乳糖启动子系统，色氨酸(trp)启动子系统，beta-内酰胺酶启动子系统，或来自噬菌体λ的启动子系统。启动子通常会控制表达，任选在操纵基因序列的情况中，并且具有核糖体结合位点序列等，以启动并完成转录和翻译。

其他微生物，诸如酵母也可用于表达。酵母(例如酿酒酵母(S.cerevisiae))和毕赤酵母(Pichia)是合适的酵母宿主细胞的例子，其中合适的载体根据需要具有表达控制序列(例如启动子)、复制起点、终止序列等。典型的启动子包含3-磷酸甘油酸激酶和其它糖分解酶。诱导型酵母启动于特别包括来自醇脱氢酶、异细胞色素C、和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。

在微生物外，哺乳动物细胞(例如在体外细胞培养物中培养的哺乳动物细胞)也可以用于表达并生成本发明的纤溶酶原(例如编码纤溶酶原的多核苷酸)。参见Winnacker,From Genes to Clones,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.(1987)。合适的哺乳动物宿主细胞包括CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、和经转化的B细胞或杂交瘤。用于这些细胞的表达载体可以包含表达控制序列，如复制起点，启动子和增强子(Queen等,Immunol.Rev.89:49(1986))，以及必需的加工信息位点，诸如核糖体结合位点，RNA剪接位点，多聚腺苷酸化位点，和转录终止子序列。合适的表达控制序列的例子是白免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒、巨细胞病毒等衍生的启动子。参见Co等,J.Immunol.148:1149(1992)。

一旦合成(化学或重组方式)，可以依照本领域的标准规程，包括硫酸铵沉淀，亲和柱，柱层析，高效液相层析(HPLC)，凝胶电泳等来纯化本发明所述的纤溶酶原。该纤溶酶原是基本上纯的，例如至少约80％至85％纯的，至少约85％至90％纯的，至少约90％至95％纯的，或98％至99％纯的或更纯的，例如不含污染物，所述污染物如细胞碎片，除纤溶酶原以外的大分子，等等。

药物配制剂

可以通过将具有所需纯度的纤溶酶原与可选的药用载体，赋形剂，或稳定剂(Remington's Pharmaceutical Sciences,16版，Osol,A.ed.(1980))混合形成冻干制剂或水溶液制备治疗配制剂。可接受的载体、赋形剂、稳定剂在所用剂量及浓度下对受者无毒性，并包括缓冲剂例如磷酸盐，柠檬酸盐及其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化己烷双胺；氯化苄烷铵(benzalkoniumchloride)，苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间甲酚)；低分子量多肽(少于约10个残基)；蛋白质如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA；糖类如蔗糖、甘露醇、岩藻糖或山梨醇；成盐反离子如钠；金属复合物(例如锌-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。

本发明的配制剂也可含有需治疗的具体病症所需的一种以上的活性化合物，优选活性互补并且相互之间没有副作用的那些。例如，抗高血压的药物，抗心律失常的药物，治疗糖尿病的药物等。

本发明的纤溶酶原可包裹在通过诸如凝聚技术或界面聚合而制备的微胶囊中，例如，可置入在胶质药物传送系统(例如，脂质体，白蛋白微球，微乳剂，纳米颗粒和纳米胶囊)中或置入粗滴乳状液中的羟甲基纤维素或凝胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊中。这些技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)。

用于体内给药的本发明的纤溶酶原必需是无菌的。这可以通过在冷冻干燥和重新配制之前或之后通过除菌滤膜过滤而轻易实现。

本发明的纤溶酶原可制备缓释制剂。缓释制剂的适当实例包括具有一定形状且含有糖蛋白的固体疏水聚合物半通透基质，例如膜或微胶囊。缓释基质实例包括聚酯、水凝胶(如聚(2-羟基乙基-异丁烯酸酯)(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.,15:167-277(1981)；Langer,Chem.Tech.,12:98-105(1982))或聚(乙烯醇)，聚交酯(美国专利3773919,EP 58,481)，L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman，等，Biopolymers 22:547(1983))，不可降解的乙烯－乙烯乙酸酯(ethylene-vinyl acetate)(Langer，等，出处同上)，或可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物如Lupron DepotTM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和亮氨酰脯氨酸(leuprolide)乙酸酯组成的可注射的微球体)，以及聚D-(-)-3-羟丁酸。聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羟基乙酸能持续释放分子100天以上，而一些水凝胶释放蛋白的时间却较短。可以根据相关机理来设计使蛋白稳定的合理策略。例如，如果发现凝聚的机理是通过硫代二硫键互换而形成分子间S-S键，则可通过修饰巯基残基、从酸性溶液中冻干、控制湿度、采用合适的添加剂、和开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定。

给药和剂量

可以通过不同方式，例如通过静脉内，腹膜内，皮下，颅内，鞘内，动脉内(例如经由颈动脉)，肌内来实现本发明药物组合物的施用。

用于胃肠外施用的制备物包括无菌水性或非水性溶液、悬浮液和乳剂。非水性溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，和可注射有机酯，如油酸乙酯。水性载体包括水、醇性/水性溶液、乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。胃肠外媒介物包含氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、或固定油。静脉内媒介物包含液体和营养补充物、电解质补充物，等等。也可以存在防腐剂和其他添加剂，诸如例如，抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、和惰性气体，等等。

医务人员会基于各种临床因素确定剂量方案。如医学领域中公知的，任一患者的剂量取决于多种因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、要施用的具体化合物、性别、施用次数和路径、总体健康、和同时施用的其它药物。本发明包含纤溶酶原的药物组合物的剂量范围可以为每天约0.0001至2000mg/kg，或约0.001至500mg/kg(例如0.02mg/kg，0.25mg/kg，0.5mg/kg，0.75mg/kg，10mg/kg，50mg/kg等等)受试者体重。例如，剂量可以是1mg/kg体重或50mg/kg体重或在1-50mg/kg的范围，或至少1mg/kg。高于或低于此例示性范围的剂量也涵盖在内，特别是考虑到上述的因素。上述范围中的中间剂量也包含在本发明的范围内。受试者可以每天、隔天、每周或根据通过经验分析确定的任何其它日程表施用此类剂量。例示性的剂量日程表包括连续几天1-10mg/kg。在本发明的药物施用过程中需要实时评估治疗效果和安全性。

制品或药盒

本发明的一个实施方案涉及一种制品或药盒，其包含可用于治疗由糖尿病引起的心血管病及其相关病症的本发明纤溶酶原或纤溶酶。所述制品优选包括一个容器，标签或包装插页。适当的容器有瓶子，小瓶，注射器等。容器可由各种材料如玻璃或塑料制成。所述容器含有组合物，所述组合物可有效治疗本发明的疾病或病症并具有无菌入口(例如所述容器可为静脉内溶液包或小瓶，其含有可被皮下注射针穿透的塞子的)。所述组合物中至少一种活性剂为纤溶酶原/纤溶酶。所述容器上或所附的标签说明所述组合物用于治疗本发明所述由糖尿病引起的心血管病及其相关病症。所述制品可进一步包含含有可药用缓冲液的第二容器，诸如磷酸盐缓冲的盐水，林格氏溶液以及葡萄糖溶液。其可进一步包含从商业和使用者角度来看所需的其它物质，包括其它缓冲液，稀释剂，过滤物，针和注射器。此外，所述制品包含带有使用说明的包装插页，包括例如指示所述组合物的使用者将纤溶酶原组合物以及治疗伴随的疾病的其它药物给药患者。

实施例

实施例1纤溶酶原延长肌萎缩性侧索硬化症模型小鼠寿命和中位生存期

本实施例中使用的人纤溶酶原来自捐赠者血浆，基于文献^[1-3]所描述的方法并进行工艺优化，纯化获得。人纤溶酶原单体的纯度>95％。以下所有实施例相同。

转基因突变SOD1具有在散发性和家族性肌萎缩性侧索硬化症(AmyotrophicLateral Sclerosis,ALS)临床中观察到的组织病理学特征。本申请ALS模型小鼠为B6.Cg-Tg(SOD1-G93A)1Gur/J转基因小鼠(简称SOD1-G93A)，购自Jackson实验室，在SPF级环境下进行动物相关试验。SOD1-G93A模型小鼠大约在100天左右出现后肢颤抖，之后病情快速恶化，50％存活率为157.1±9.3天^[4]。目前已被广泛应用于ALS的机制研究及新药研发的临床前试验研究当中。

取16周龄SOD1-G93A雄性小鼠9只，根据体重将小鼠随机分为两组，溶媒对照组5只和给纤溶酶原组4只，溶媒对照组小鼠按照0.1ml/天尾静脉注射溶媒(PBS，pH7.4)，给纤溶酶原组小鼠按照1mg/0.1ml/只/天尾静脉注射纤溶酶原，每天观察记录小鼠的生存情况。

结果显示，给纤溶酶原组小鼠平均寿命为164±8.6天，溶媒对照组小鼠平均寿命为153±0天，给纤溶酶原组寿命相对于溶媒对照组延长了约11天(图1A)；给纤溶酶原小鼠中位生存期为53±9天，溶媒对照组中位生存期为40±0天，给纤溶酶原组中位生存期相对于溶媒对照组延长了约13天，约增加了30％(图1B)。该结果表明纤溶酶原能够延长ALS小鼠寿命和中位生存期。

实施例2纤溶酶原改善ALS模型小鼠神经肌肉功能

取16周龄SOD1-G93A雄性小鼠9只，根据体重将小鼠随机分为两组，溶媒对照组5只和给纤溶酶原组4只，溶媒对照组小鼠尾静脉注射0.1ml/天溶媒(PBS，pH7.4)，给纤溶酶原组小鼠尾静脉注射1mg/0.1ml/只/天纤溶酶原，连续给药34天，开始给药定为第0天，于给药第6、8、12、16、21、23、27、30、34天如下进行悬挂抓力测试，考察纤溶酶原对于ALS模型小鼠神经肌肉功能的药效作用，并且如下统计分析ALS小鼠神经行为学表现。

悬挂抓力测试

悬挂实验一般用以评价小鼠运动能力(肌力)。单只小鼠放在鼠笼的金属笼盖上，轻轻晃动笼盖使小鼠抓住笼盖，翻转笼盖，记录小鼠两后肢松开的潜伏时间^[5]。每只小鼠做3次实验，单次实验最长持续时间为90s，每只小鼠最长的潜伏时间进入统计分析。

结果显示，给药期间虽然两组小鼠悬挂潜伏时间均减少，但给纤溶酶原组小鼠悬挂潜伏时间始终长于溶媒对照组小鼠，且给药第6、21、23天，给纤溶酶原组悬挂潜伏时间与溶媒组相比，统计差异显著或极为显著，P值分别为0.03、0.02、0.008(图2)。说明纤溶酶原能够延缓ALS小鼠肌力减退。

ALS运动障碍表征评分，0分：没有运动功能障碍的迹象；1分：在尾悬挂期间，后肢出现明显的震颤；2分：步态异常，步行75cm距离期间脚趾至少2次卷曲，或者腿部沿着笼底拖动；3分：至少1天后肢出现拖曳，僵硬无力(刚性瘫痪)，腿不能用于向前运动；4分：小鼠置为仰卧位，30s内不能翻身为俯卧位(判定为濒死状态)^[5]。

结果显示，给纤溶酶原组小鼠出现评分为2分的神经表现的时间点明显晚于溶媒对照组，且统计差异显著(*表示P<0.05)(图3)。

以上结果表明，纤溶酶原能够显著延缓ALS疾病肌力减退，延缓ALS疾病进展。

实施例3纤溶酶原减缓ALS模型小鼠体重的降低

取周龄相近野生型小鼠20只和雄性SOD1-G93A小鼠29只，雌性SOD1-G93A小鼠31只。野生型小鼠作为空白对照组(不做任何给药处理)，SOD1-G93A小鼠从第14周发病后腿颤抖时开始观察记录，记录每只小鼠发病时间，发病14天后开始给药，所有小鼠根据发病情况随机分成溶媒对照组和给纤溶酶原组，其中溶媒对照组小鼠32只，每天尾静脉注射0.1ml/只溶媒(10mM柠檬酸钠缓冲液,pH7.4)；给纤溶酶原组28只，每天尾静脉注射1mg/0.1ml/只纤溶酶原，SPF环境下连续给药35天。开始给药定为第0天，给药期间每3天测量一次体重，考察纤溶酶原对ALS模型小鼠体重下降的影响。

ALS通常伴有明显的体重减轻，是ALS的主要特征之一^[5]。每次体重测量结果用第0天体重进行标准化处理，即：每次体重测定值/第0天体重*100。

结果显示，给药期间，空白对照组小鼠体重波动不大，有逐渐上升趋势；溶媒对照组小鼠体重逐渐下降；给纤溶酶原组小鼠体重前25天虽然波动较大，但均接近或略大于空白对照组体重，25天后体重渐呈降低趋势，但始终大于溶媒对照组小鼠体重，且与溶媒对照组相比，P值小于或接近0.001(图4)。说明纤溶酶原可以显著缓解ALS模型小鼠体重下降的速度，延缓ALS病情的恶化。

实施例4纤溶酶原减少ALS模型小鼠脊髓前角空泡面积

取周龄相近野生型雄性小鼠5只和雄性SOD1-G93A小鼠9只。野生型小鼠作为空白对照组，SOD1-G93A小鼠从第14周发病后腿颤抖时开始观察记录，记录每只小鼠发病时间，发病14天后开始给药，所有小鼠根据发病情况随机分成溶媒组和给药组，其中溶媒组小鼠5只，每天尾静脉注射0.1ml/只溶媒(10mM柠檬酸钠缓冲液,pH7.4)；给药组4只，每天尾静脉注射1mg/0.1ml/只纤溶酶原，SPF环境下连续给药，濒死时取材，最长给药61天。取材脊髓于福尔马林固定液中固定。固定后的组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次，以苏木素染液染色10min后，流水冲洗5min，1％盐酸乙醇分化10秒，流水冲洗10分钟，0.2％伊红染液10秒，梯度脱水透明并封片。切片在400倍光学显微镜下观察。

脊髓前角运动神经元变性和死亡是ALS主要病理特征之一^[6]。结果显示，空白对照(图5A)小鼠脊髓前角呈现出一定水平的空泡面积，溶媒组(图5B)小鼠脊髓前角空泡面积明显大于空白对照(P<0.001)，给药组(图5C)小鼠脊髓前角空泡面积明显低于溶媒组，且统计差异极为显著(图5D)。提示纤溶酶原能够减少ALS模型小鼠脊髓前角空泡面积，减少脊髓前角运动神经元的死亡。

实施例5纤溶酶原促进ALS模型小鼠脊髓前角乙酰胆碱转移酶的表达

取周龄相近野生型雄性小鼠5只和雄性SOD1-G93A小鼠9只。野生型小鼠作为空白对照组，SOD1-G93A小鼠从第14周发病后腿颤抖时开始观察记录，记录每只小鼠发病时间，发病14天后开始给药，所有小鼠根据发病情况随机分成溶媒组和给药组，其中溶媒组小鼠5只，每天尾静脉注射0.1ml/只溶媒(10mM柠檬酸钠缓冲液,pH7.4)；给药组4只，每天尾静脉注射1mg/0.1ml/只纤溶酶原，SPF环境下连续给药，濒死时取材，最长给药61天。取材脊髓于福尔马林固定液中固定。固定后组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01MPBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔源抗乙酰胆碱转移酶抗体(ab178850,Abcam)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在400倍光学显微镜下观察。

乙酰胆碱转移酶(chAT)是胆碱能神经元的标志酶，在神经细胞内合成。研究显示ALS动物模型动物脊髓运动神经元和患者体内chAT水平降低^[7,8]。

结果显示，空白对照(图6A)小鼠脊髓前角表达一定量的chAT，溶媒组(图6B)小鼠chAT表达水平明显低于空白对照组小鼠，给药组(图6C)小鼠脊髓前角chAT的表达明显高于溶媒组小鼠，统计学差异显著(P<0.05)(图6D)。提示TP01HN106能够促进SOD1-G93A小鼠脊髓前角chAT的合成与表达，促进胆碱能神经元功能恢复。

实施例6纤溶酶原促进ALS模型小鼠脊髓前角突触素的表达

取周龄相近野生型雄性小鼠5只和雄性SOD1-G93A小鼠9只。野生型小鼠作为空白对照组，SOD1-G93A小鼠从第14周发病后腿颤抖时开始观察记录，记录每只小鼠发病时间，发病14天后开始给药，所有小鼠根据发病情况随机分成溶媒组和给药组，其中溶媒组小鼠5只，每天尾静脉注射0.1ml/只溶媒(10mM柠檬酸钠缓冲液,pH7.4)；给药组4只，每天尾静脉注射1mg/0.1ml/只纤溶酶原，SPF环境下连续给药，濒死时取材，最长给药61天。取材脊髓于福尔马林固定液中固定。固定后组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01MPBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔源抗突触素抗体(17785-1-AP,Proteintech)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在400倍光学显微镜下观察。

突触素(synaptophysin)是突触前膜上的磷酸化蛋白，是轴突生长和突触形成的标志，与突触可塑性密切相关。ALS模型小鼠在在临床症状出现前出现明显的突触变性和运动神经元胞体丢失^[9]。

结果显示，空白对照组(图7A)小鼠脊髓前角表达一定水平的突触素，溶媒组(图7B)小鼠突触素的表达水平明显低于空白对照小鼠，给药组(图7C)小鼠脊髓前角突触素的表达明显高于溶媒组小鼠，且统计差异显著(P<0.05)(图7D)。提示纤溶酶原能够促进模型小鼠脊髓前角突触素的表达，促进突触损伤修复。

实施例7纤溶酶原促进ALS模型小鼠脊髓前角炎症修复

取周龄相近野生型雄性小鼠5只和雄性SOD1-G93A小鼠9只。野生型小鼠作为空白对照组，SOD1-G93A小鼠从第14周发病后腿颤抖时开始观察记录，记录每只小鼠发病时间，发病14天后开始给药，所有小鼠根据发病情况随机分成溶媒组和给药组，其中溶媒组小鼠5只，每天尾静脉注射0.1ml/只溶媒(10mM柠檬酸钠缓冲液,pH7.4)；给药组4只，每天尾静脉注射1mg/0.1ml/只纤溶酶原，SPF环境下连续给药，濒死时取材，最长给药61天。取材脊髓于福尔马林固定液中固定。固定后的组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01MPBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔源抗Iba-1(ab178847,Abcam)4℃孵育过夜，0.01MPBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在400倍光学显微镜下观察。

离子钙接头蛋白-1(Ionized calcium binding adaptor molecule-1，Iba-1)是中枢神经系统中的小胶质细胞表面标志物。小胶质细胞做为中枢神经系统中的免疫细胞，在其病变或者损伤时快速感测神经障碍并被活化。活化的小胶质细胞在数量与形态上有显著的变化并迁移到损伤部位，发挥多种功能，例如吞噬死细胞、促炎性细胞因子产量增加等^[10]。

结果显示，空白对照组(图8A)小鼠脊髓前角表达一定水平的Iba-1，给药组(图8C)小鼠脊髓前角Iba-1的表达水平明显高于溶媒组(图8B)和空白对照组小鼠，且统计差异显著(P<0.05或0.01)(图8D)。提示纤溶酶原能够促进模型小鼠脊髓前角炎症修复。

实施例8纤溶酶原改善ALS模型小鼠肌肉萎缩

取周龄相近野生型雄性小鼠5只和雄性SOD1-G93A小鼠9只。野生型小鼠作为空白对照组，SOD1-G93A小鼠从第14周发病后腿颤抖时开始观察记录，记录每只小鼠发病时间，发病14天后开始给药，所有小鼠根据发病情况随机分成溶媒组和给药组，其中溶媒组小鼠5只，每天尾静脉注射0.1ml/只溶媒(10mM柠檬酸钠缓冲液,pH7.4)；给药组4只，每天尾静脉注射1mg/0.1ml/只纤溶酶原，SPF环境下连续给药，濒死时取材，最长给药61天。取材腓肠肌于福尔马林固定液中固定。固定后的组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次，以苏木素染液染色10min后，流水冲洗5min，1％盐酸乙醇分化10秒，流水冲洗10分钟，0.2％伊红染液10秒，梯度脱水透明并封片。切片在200倍光学显微镜下观察。

结果显示，空白对照组(图9A)小鼠腓肠肌肌纤维结构完整，形态大小比较均一，而溶媒组(图9B)腓肠肌肌纤维出现严重的萎缩现象，并有局部炎症细胞浸润(红色箭头)，肌纤维圆性变，给药组(图9C)肌纤维萎缩现象相比溶媒组较轻，但也有炎症细胞浸润的现象。提示纤溶酶原能够改善模型小鼠肌肉萎缩。

实施例9纤溶酶原改善ALS模型小鼠肌肉萎缩

取周龄相近野生型雄性小鼠5只和雄性SOD1-G93A小鼠9只。野生型小鼠作为空白对照组，SOD1-G93A小鼠从第14周发病后腿颤抖时开始观察记录，记录每只小鼠发病时间，发病14天后开始给药，所有小鼠根据发病情况随机分成溶媒组和给药组，其中溶媒组小鼠5只，每天尾静脉注射0.1ml/只溶媒(10mM柠檬酸钠缓冲液,pH7.4))；给药组4只，每天尾静脉注射1mg/0.1ml/只纤溶酶原，SPF环境下连续给药，濒死时取材，最长给药61天。取材臀肌于福尔马林固定液中固定。固定后的组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次，以苏木素染液染色10min后，流水冲洗5min，1％盐酸乙醇分化10秒，流水冲洗10分钟，0.2％伊红染液10秒，梯度脱水透明并封片。切片在200倍光学显微镜下观察。

结果显示，空白对照组(图10A)小鼠肌纤维结构比较完整，形态大小比较均一。溶媒组(图10B)小鼠臀肌的肌纤维有圆性变，大小不一，萎缩严重，伴有炎性细胞浸润，给药组(图10C)小鼠臀肌肌纤维结构形态相比溶媒组有一定程度的恢复。提示纤溶酶原能够改善ALS模型小鼠肌肉萎缩。

实施例10纤溶酶原促进ALS模型小鼠脊髓前角SMN蛋白的表达

取周龄相近野生型雄性小鼠5只和雄性SOD1-G93A小鼠9只。SOD1-G93A小鼠从第14周发病后腿颤抖时开始观察记录，记录每只小鼠发病时间，发病14天后开始给药，所有小鼠根据发病情况随机分成溶媒组和给药组，其中溶媒组小鼠5只，每天尾静脉注射0.1ml/只溶媒(10mM柠檬酸钠缓冲液,pH7.4)；给药组4只，每天尾静脉注射1mg/0.1ml/只纤溶酶原，SPF环境下连续给药，濒死时取材，最长给药61天。取材脊髓于福尔马林固定液中固定。固定后的组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01MPBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔源抗SMN抗体(Abcam)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vectorlaboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在400倍光学显微镜下观察。

运动神经元存活(Survival Motor Neuron，SMN)蛋白研究显示SOD1-ALS模型运动神经元存活(Survival Motor Neuron，SMN)蛋白水平降低，且增加SMN蛋白可改善疾病表型^[11]。

结果显示，给药组(图11B)小鼠脊髓前角SMN蛋白的表达水平明显高于溶媒组(图11A)。提示纤溶酶原能够促进模型小鼠脊髓前角SMN蛋白的表达。

参考文献

[1]KENNETH C.ROBBINS,LOUIS SUMMARIA,DAVID ELWYN et al.Further Studieson the Purification and Characterization of Human Plasminogen andPlasmin.Journal of Biological Chemistry,1965,240(1):541-550.

[2]Summaria L,Spitz F,Arzadon L et al.Isolation and characterizationof the affinity chromatography forms of human Glu-and Lys-plasminogens andplasmins.J Biol Chem.1976Jun 25；251(12):3693-9.

[3]HAGAN JJ,ABLONDI FB,DE RENZO EC.Purification and biochemicalproperties of human plasminogen.J Biol Chem.1960Apr；235:1005-10.

[4]Dobrowolny,G.Muscle expression of a local Igf-1isoform protectsmotor neurons in an ALS mouse model[J].The Journal of Cell Biology,2005,168(2):193-199.

[5]Weydt P,Hong S Y,Kliot M,et al.Assessing disease onset andprogression in the SOD1 mouse model of ALS.[J].Neuroreport,2003,14(7):1051-4.

[6]L.M.Murray,K.Talbot,T.H.Gillingwater.Review:Neuromuscular synapticvulnerability in motor neurone disease:amyotrophic lateral sclerosis andspinal muscular atrophy[J].neuropathology&applied neurobiology,2010,36(2):133-156.

[7]Michael L.Berger,Mario Veitl,Susanne Malessa et al.Cholinergicmarkers in ALS spinal cord[J].Journal of the Neurological Sciences,1992,108(1):114.

[8]Jordan K,Murphy J,Singh A,et al.Astrocyte-Mediated NeuromodulatoryRegulation in Preclinical ALS:A Metadata Analysis[J].Frontiers in CellularNeuroscience,2018,12.

[9]L.M.Murray,K.Talbot,T.H.Gillingwater.Review:Neuromuscular synapticvulnerability in motor neurone disease:amyotrophic lateral sclerosis andspinal muscular atrophy[J].neuropathology&applied neurobiology,2010,36(2):133-156.

[10]Min,Kyoung-Jin,Yang,Myung-Soon,et al.Protein kinase A mediatesmicroglial activation induced by plasminogen and gangliosides[J].Experimental&Molecular Medicine,2004,36(5):461-467.

[11]L.M.Murray,K.Talbot,T.H.Gillingwater.Review:Neuromuscularsynaptic vulnerability in motor neurone disease:amyotrophic lateral sclerosisand spinal muscular atrophy[J].neuropathology&applied neurobiology,2010,36(2):133-156.

序列表

<110> 深圳瑞健生命科学研究院有限公司

<120> 一种治疗肌萎缩侧索硬化的方法和药物

<150> 2019103894691

<151> 2019-5-10

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2376

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸

<220>

<223> 不含有信号肽的天然纤溶酶原(Glu-PLG，Glu-纤维蛋白溶酶原)核酸序列

<400> 1

gagcctctgg atgactatgt gaatacccag ggggcttcac tgttcagtgt cactaagaag 60

cagctgggag caggaagtat agaagaatgt gcagcaaaat gtgaggagga cgaagaattc 120

acctgcaggg cattccaata tcacagtaaa gagcaacaat gtgtgataat ggctgaaaac 180

aggaagtcct ccataatcat taggatgaga gatgtagttt tatttgaaaa gaaagtgtat 240

ctctcagagt gcaagactgg gaatggaaag aactacagag ggacgatgtc caaaacaaaa 300

aatggcatca cctgtcaaaa atggagttcc acttctcccc acagacctag attctcacct 360

gctacacacc cctcagaggg actggaggag aactactgca ggaatccaga caacgatccg 420

caggggccct ggtgctatac tactgatcca gaaaagagat atgactactg cgacattctt 480

gagtgtgaag aggaatgtat gcattgcagt ggagaaaact atgacggcaa aatttccaag 540

accatgtctg gactggaatg ccaggcctgg gactctcaga gcccacacgc tcatggatac 600

attccttcca aatttccaaa caagaacctg aagaagaatt actgtcgtaa ccccgatagg 660

gagctgcggc cttggtgttt caccaccgac cccaacaagc gctgggaact ttgtgacatc 720

ccccgctgca caacacctcc accatcttct ggtcccacct accagtgtct gaagggaaca 780

ggtgaaaact atcgcgggaa tgtggctgtt accgtgtccg ggcacacctg tcagcactgg 840

agtgcacaga cccctcacac acataacagg acaccagaaa acttcccctg caaaaatttg 900

gatgaaaact actgccgcaa tcctgacgga aaaagggccc catggtgcca tacaaccaac 960

agccaagtgc ggtgggagta ctgtaagata ccgtcctgtg actcctcccc agtatccacg 1020

gaacaattgg ctcccacagc accacctgag ctaacccctg tggtccagga ctgctaccat 1080

ggtgatggac agagctaccg aggcacatcc tccaccacca ccacaggaaa gaagtgtcag 1140

tcttggtcat ctatgacacc acaccggcac cagaagaccc cagaaaacta cccaaatgct 1200

ggcctgacaa tgaactactg caggaatcca gatgccgata aaggcccctg gtgttttacc 1260

acagacccca gcgtcaggtg ggagtactgc aacctgaaaa aatgctcagg aacagaagcg 1320

agtgttgtag cacctccgcc tgttgtcctg cttccagatg tagagactcc ttccgaagaa 1380

gactgtatgt ttgggaatgg gaaaggatac cgaggcaaga gggcgaccac tgttactggg 1440

acgccatgcc aggactgggc tgcccaggag ccccatagac acagcatttt cactccagag 1500

acaaatccac gggcgggtct ggaaaaaaat tactgccgta accctgatgg tgatgtaggt 1560

ggtccctggt gctacacgac aaatccaaga aaactttacg actactgtga tgtccctcag 1620

tgtgcggccc cttcatttga ttgtgggaag cctcaagtgg agccgaagaa atgtcctgga 1680

agggttgtag gggggtgtgt ggcccaccca cattcctggc cctggcaagt cagtcttaga 1740

acaaggtttg gaatgcactt ctgtggaggc accttgatat ccccagagtg ggtgttgact 1800

gctgcccact gcttggagaa gtccccaagg ccttcatcct acaaggtcat cctgggtgca 1860

caccaagaag tgaatctcga accgcatgtt caggaaatag aagtgtctag gctgttcttg 1920

gagcccacac gaaaagatat tgccttgcta aagctaagca gtcctgccgt catcactgac 1980

aaagtaatcc cagcttgtct gccatcccca aattatgtgg tcgctgaccg gaccgaatgt 2040

ttcatcactg gctggggaga aacccaaggt acttttggag ctggccttct caaggaagcc 2100

cagctccctg tgattgagaa taaagtgtgc aatcgctatg agtttctgaa tggaagagtc 2160

caatccaccg aactctgtgc tgggcatttg gccggaggca ctgacagttg ccagggtgac 2220

agtggaggtc ctctggtttg cttcgagaag gacaaataca ttttacaagg agtcacttct 2280

tggggtcttg gctgtgcacg ccccaataag cctggtgtct atgttcgtgt ttcaaggttt 2340

gttacttgga ttgagggagt gatgagaaat aattaa 2376

<210> 2

<211> 791

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成的多肽

<220>

<400> 2

Glu Pro Leu Asp Asp Tyr Val Asn Thr Gln Gly Ala Ser Leu Phe Ser

1 5 10 15

Val Thr Lys Lys Gln Leu Gly Ala Gly Ser Ile Glu Glu Cys Ala Ala

20 25 30

Lys Cys Glu Glu Asp Glu Glu Phe Thr Cys Arg Ala Phe Gln Tyr His

35 40 45

Ser Lys Glu Gln Gln Cys Val Ile Met Ala Glu Asn Arg Lys Ser Ser

50 55 60

Ile Ile Ile Arg Met Arg Asp Val Val Leu Phe Glu Lys Lys Val Tyr

65 70 75 80

Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Met

85 90 95

Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ser Thr Ser

100 105 110

Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Glu Gly Leu

115 120 125

Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln Gly Pro Trp

130 135 140

Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp Ile Leu

145 150 155 160

Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn Tyr Asp Gly

165 170 175

Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Glu Cys Gln Ala Trp Asp Ser

180 185 190

Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe Pro Asn Lys

195 200 205

Asn Leu Lys Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Glu Leu Arg Pro

210 215 220

Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Leu Cys Asp Ile

225 230 235 240

Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Pro Thr Tyr Gln Cys

245 250 255

Leu Lys Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Asn Val Ala Val Thr Val

260 265 270

Ser Gly His Thr Cys Gln His Trp Ser Ala Gln Thr Pro His Thr His

275 280 285

Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Asp Glu Asn Tyr

290 295 300

Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Arg Ala Pro Trp Cys His Thr Thr Asn

305 310 315 320

Ser Gln Val Arg Trp Glu Tyr Cys Lys Ile Pro Ser Cys Asp Ser Ser

325 330 335

Pro Val Ser Thr Glu Gln Leu Ala Pro Thr Ala Pro Pro Glu Leu Thr

340 345 350

Pro Val Val Gln Asp Cys Tyr His Gly Asp Gly Gln Ser Tyr Arg Gly

355 360 365

Thr Ser Ser Thr Thr Thr Thr Gly Lys Lys Cys Gln Ser Trp Ser Ser

370 375 380

Met Thr Pro His Arg His Gln Lys Thr Pro Glu Asn Tyr Pro Asn Ala

385 390 395 400

Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Asp Lys Gly Pro

405 410 415

Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu Tyr Cys Asn Leu

420 425 430

Lys Lys Cys Ser Gly Thr Glu Ala Ser Val Val Ala Pro Pro Pro Val

435 440 445

Val Leu Leu Pro Asp Val Glu Thr Pro Ser Glu Glu Asp Cys Met Phe

450 455 460

Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys Arg Ala Thr Thr Val Thr Gly

465 470 475 480

Thr Pro Cys Gln Asp Trp Ala Ala Gln Glu Pro His Arg His Ser Ile

485 490 495

Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg Ala Gly Leu Glu Lys Asn Tyr Cys

500 505 510

Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asn

515 520 525

Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Val Pro Gln Cys Ala Ala Pro

530 535 540

Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys Lys Cys Pro Gly

545 550 555 560

Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp Pro Trp Gln

565 570 575

Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly Gly Thr Leu

580 585 590

Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Glu Lys Ser

595 600 605

Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His Gln Glu Val

610 615 620

Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg Leu Phe Leu

625 630 635 640

Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala

645 650 655

Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr

660 665 670

Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp Gly Glu Thr

675 680 685

Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln Leu Pro Val

690 695 700

Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn Gly Arg Val

705 710 715 720

Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser

725 730 735

Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu Lys Asp Lys

740 745 750

Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro

755 760 765

Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val Thr Trp Ile

770 775 780

Glu Gly Val Met Arg Asn Asn

785 790

<210> 3

<211> 2433

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸

<220>

<223> 含有信号肽的天然纤溶酶原(来源于swiss prot)的核酸序列

<400> 3

atggaacata aggaagtggt tcttctactt cttttatttc tgaaatcagg tcaaggagag 60

cctctggatg actatgtgaa tacccagggg gcttcactgt tcagtgtcac taagaagcag 120

ctgggagcag gaagtataga agaatgtgca gcaaaatgtg aggaggacga agaattcacc 180

tgcagggcat tccaatatca cagtaaagag caacaatgtg tgataatggc tgaaaacagg 240

aagtcctcca taatcattag gatgagagat gtagttttat ttgaaaagaa agtgtatctc 300

tcagagtgca agactgggaa tggaaagaac tacagaggga cgatgtccaa aacaaaaaat 360

ggcatcacct gtcaaaaatg gagttccact tctccccaca gacctagatt ctcacctgct 420

acacacccct cagagggact ggaggagaac tactgcagga atccagacaa cgatccgcag 480

gggccctggt gctatactac tgatccagaa aagagatatg actactgcga cattcttgag 540

tgtgaagagg aatgtatgca ttgcagtgga gaaaactatg acggcaaaat ttccaagacc 600

atgtctggac tggaatgcca ggcctgggac tctcagagcc cacacgctca tggatacatt 660

ccttccaaat ttccaaacaa gaacctgaag aagaattact gtcgtaaccc cgatagggag 720

ctgcggcctt ggtgtttcac caccgacccc aacaagcgct gggaactttg tgacatcccc 780

cgctgcacaa cacctccacc atcttctggt cccacctacc agtgtctgaa gggaacaggt 840

gaaaactatc gcgggaatgt ggctgttacc gtgtccgggc acacctgtca gcactggagt 900

gcacagaccc ctcacacaca taacaggaca ccagaaaact tcccctgcaa aaatttggat 960

gaaaactact gccgcaatcc tgacggaaaa agggccccat ggtgccatac aaccaacagc 1020

caagtgcggt gggagtactg taagataccg tcctgtgact cctccccagt atccacggaa 1080

caattggctc ccacagcacc acctgagcta acccctgtgg tccaggactg ctaccatggt 1140

gatggacaga gctaccgagg cacatcctcc accaccacca caggaaagaa gtgtcagtct 1200

tggtcatcta tgacaccaca ccggcaccag aagaccccag aaaactaccc aaatgctggc 1260

ctgacaatga actactgcag gaatccagat gccgataaag gcccctggtg ttttaccaca 1320

gaccccagcg tcaggtggga gtactgcaac ctgaaaaaat gctcaggaac agaagcgagt 1380

gttgtagcac ctccgcctgt tgtcctgctt ccagatgtag agactccttc cgaagaagac 1440

tgtatgtttg ggaatgggaa aggataccga ggcaagaggg cgaccactgt tactgggacg 1500

ccatgccagg actgggctgc ccaggagccc catagacaca gcattttcac tccagagaca 1560

aatccacggg cgggtctgga aaaaaattac tgccgtaacc ctgatggtga tgtaggtggt 1620

ccctggtgct acacgacaaa tccaagaaaa ctttacgact actgtgatgt ccctcagtgt 1680

gcggcccctt catttgattg tgggaagcct caagtggagc cgaagaaatg tcctggaagg 1740

gttgtagggg ggtgtgtggc ccacccacat tcctggccct ggcaagtcag tcttagaaca 1800

aggtttggaa tgcacttctg tggaggcacc ttgatatccc cagagtgggt gttgactgct 1860

gcccactgct tggagaagtc cccaaggcct tcatcctaca aggtcatcct gggtgcacac 1920

caagaagtga atctcgaacc gcatgttcag gaaatagaag tgtctaggct gttcttggag 1980

cccacacgaa aagatattgc cttgctaaag ctaagcagtc ctgccgtcat cactgacaaa 2040

gtaatcccag cttgtctgcc atccccaaat tatgtggtcg ctgaccggac cgaatgtttc 2100

atcactggct ggggagaaac ccaaggtact tttggagctg gccttctcaa ggaagcccag 2160

ctccctgtga ttgagaataa agtgtgcaat cgctatgagt ttctgaatgg aagagtccaa 2220

tccaccgaac tctgtgctgg gcatttggcc ggaggcactg acagttgcca gggtgacagt 2280

ggaggtcctc tggtttgctt cgagaaggac aaatacattt tacaaggagt cacttcttgg 2340

ggtcttggct gtgcacgccc caataagcct ggtgtctatg ttcgtgtttc aaggtttgtt 2400

acttggattg agggagtgat gagaaataat taa 2433

<210> 4

<211> 810

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成的多肽

<220>

<223> 含有信号肽的天然纤溶酶原(来源于swiss prot)的氨基酸序列

<400> 4

Met Glu His Lys Glu Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Phe Leu Lys Ser

1 5 10 15

Gly Gln Gly Glu Pro Leu Asp Asp Tyr Val Asn Thr Gln Gly Ala Ser

20 25 30

Leu Phe Ser Val Thr Lys Lys Gln Leu Gly Ala Gly Ser Ile Glu Glu

35 40 45

Cys Ala Ala Lys Cys Glu Glu Asp Glu Glu Phe Thr Cys Arg Ala Phe

50 55 60

Gln Tyr His Ser Lys Glu Gln Gln Cys Val Ile Met Ala Glu Asn Arg

65 70 75 80

Lys Ser Ser Ile Ile Ile Arg Met Arg Asp Val Val Leu Phe Glu Lys

85 90 95

Lys Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg

100 105 110

Gly Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser

115 120 125

Ser Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser

130 135 140

Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln

145 150 155 160

Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys

165 170 175

Asp Ile Leu Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn

180 185 190

Tyr Asp Gly Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Glu Cys Gln Ala

195 200 205

Trp Asp Ser Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe

210 215 220

Pro Asn Lys Asn Leu Lys Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Glu

225 230 235 240

Leu Arg Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Leu

245 250 255

Cys Asp Ile Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Pro Thr

260 265 270

Tyr Gln Cys Leu Lys Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Asn Val Ala

275 280 285

Val Thr Val Ser Gly His Thr Cys Gln His Trp Ser Ala Gln Thr Pro

290 295 300

His Thr His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Asp

305 310 315 320

Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Arg Ala Pro Trp Cys His

325 330 335

Thr Thr Asn Ser Gln Val Arg Trp Glu Tyr Cys Lys Ile Pro Ser Cys

340 345 350

Asp Ser Ser Pro Val Ser Thr Glu Gln Leu Ala Pro Thr Ala Pro Pro

355 360 365

Glu Leu Thr Pro Val Val Gln Asp Cys Tyr His Gly Asp Gly Gln Ser

370 375 380

Tyr Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Thr Thr Gly Lys Lys Cys Gln Ser

385 390 395 400

Trp Ser Ser Met Thr Pro His Arg His Gln Lys Thr Pro Glu Asn Tyr

405 410 415

Pro Asn Ala Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Asp

420 425 430

Lys Gly Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu Tyr

435 440 445

Cys Asn Leu Lys Lys Cys Ser Gly Thr Glu Ala Ser Val Val Ala Pro

450 455 460

Pro Pro Val Val Leu Leu Pro Asp Val Glu Thr Pro Ser Glu Glu Asp

465 470 475 480

Cys Met Phe Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys Arg Ala Thr Thr

485 490 495

Val Thr Gly Thr Pro Cys Gln Asp Trp Ala Ala Gln Glu Pro His Arg

500 505 510

His Ser Ile Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg Ala Gly Leu Glu Lys

515 520 525

Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly Gly Pro Trp Cys Tyr

530 535 540

Thr Thr Asn Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Val Pro Gln Cys

545 550 555 560

Ala Ala Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys Lys

565 570 575

Cys Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp

580 585 590

Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly

595 600 605

Gly Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu

610 615 620

Glu Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His

625 630 635 640

Gln Glu Val Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg

645 650 655

Leu Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser

660 665 670

Ser Pro Ala Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser

675 680 685

Pro Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp

690 695 700

Gly Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln

705 710 715 720

Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn

725 730 735

Gly Arg Val Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly

740 745 750

Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu

755 760 765

Lys Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys

770 775 780

Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val

785 790 795 800

Thr Trp Ile Glu Gly Val Met Arg Asn Asn

805 810

<210> 5

<211> 2145

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸

<220>

<223> LYS77-PLG(Lys-纤溶酶原)核酸序列

<400> 5

aaagtgtatc tctcagagtg caagactggg aatggaaaga actacagagg gacgatgtcc 60

aaaacaaaaa atggcatcac ctgtcaaaaa tggagttcca cttctcccca cagacctaga 120

ttctcacctg ctacacaccc ctcagaggga ctggaggaga actactgcag gaatccagac 180

aacgatccgc aggggccctg gtgctatact actgatccag aaaagagata tgactactgc 240

gacattcttg agtgtgaaga ggaatgtatg cattgcagtg gagaaaacta tgacggcaaa 300

atttccaaga ccatgtctgg actggaatgc caggcctggg actctcagag cccacacgct 360

catggataca ttccttccaa atttccaaac aagaacctga agaagaatta ctgtcgtaac 420

cccgataggg agctgcggcc ttggtgtttc accaccgacc ccaacaagcg ctgggaactt 480

tgtgacatcc cccgctgcac aacacctcca ccatcttctg gtcccaccta ccagtgtctg 540

aagggaacag gtgaaaacta tcgcgggaat gtggctgtta ccgtgtccgg gcacacctgt 600

cagcactgga gtgcacagac ccctcacaca cataacagga caccagaaaa cttcccctgc 660

aaaaatttgg atgaaaacta ctgccgcaat cctgacggaa aaagggcccc atggtgccat 720

acaaccaaca gccaagtgcg gtgggagtac tgtaagatac cgtcctgtga ctcctcccca 780

gtatccacgg aacaattggc tcccacagca ccacctgagc taacccctgt ggtccaggac 840

tgctaccatg gtgatggaca gagctaccga ggcacatcct ccaccaccac cacaggaaag 900

aagtgtcagt cttggtcatc tatgacacca caccggcacc agaagacccc agaaaactac 960

ccaaatgctg gcctgacaat gaactactgc aggaatccag atgccgataa aggcccctgg 1020

tgttttacca cagaccccag cgtcaggtgg gagtactgca acctgaaaaa atgctcagga 1080

acagaagcga gtgttgtagc acctccgcct gttgtcctgc ttccagatgt agagactcct 1140

tccgaagaag actgtatgtt tgggaatggg aaaggatacc gaggcaagag ggcgaccact 1200

gttactggga cgccatgcca ggactgggct gcccaggagc cccatagaca cagcattttc 1260

actccagaga caaatccacg ggcgggtctg gaaaaaaatt actgccgtaa ccctgatggt 1320

gatgtaggtg gtccctggtg ctacacgaca aatccaagaa aactttacga ctactgtgat 1380

gtccctcagt gtgcggcccc ttcatttgat tgtgggaagc ctcaagtgga gccgaagaaa 1440

tgtcctggaa gggttgtagg ggggtgtgtg gcccacccac attcctggcc ctggcaagtc 1500

agtcttagaa caaggtttgg aatgcacttc tgtggaggca ccttgatatc cccagagtgg 1560

gtgttgactg ctgcccactg cttggagaag tccccaaggc cttcatccta caaggtcatc 1620

ctgggtgcac accaagaagt gaatctcgaa ccgcatgttc aggaaataga agtgtctagg 1680

ctgttcttgg agcccacacg aaaagatatt gccttgctaa agctaagcag tcctgccgtc 1740

atcactgaca aagtaatccc agcttgtctg ccatccccaa attatgtggt cgctgaccgg 1800

accgaatgtt tcatcactgg ctggggagaa acccaaggta cttttggagc tggccttctc 1860

aaggaagccc agctccctgt gattgagaat aaagtgtgca atcgctatga gtttctgaat 1920

ggaagagtcc aatccaccga actctgtgct gggcatttgg ccggaggcac tgacagttgc 1980

cagggtgaca gtggaggtcc tctggtttgc ttcgagaagg acaaatacat tttacaagga 2040

gtcacttctt ggggtcttgg ctgtgcacgc cccaataagc ctggtgtcta tgttcgtgtt 2100

tcaaggtttg ttacttggat tgagggagtg atgagaaata attaa 2145

<210> 6

<211> 714

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成的多肽

<220>

<223> LYS77-PLG(Lys-纤溶酶原)氨基酸序列

<400> 6

Lys Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg

1 5 10 15

Gly Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser

20 25 30

Ser Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser

35 40 45

Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln

50 55 60

Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys

65 70 75 80

Asp Ile Leu Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn

85 90 95

Tyr Asp Gly Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Glu Cys Gln Ala

100 105 110

Trp Asp Ser Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe

115 120 125

Pro Asn Lys Asn Leu Lys Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Glu

130 135 140

Leu Arg Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Leu

145 150 155 160

Cys Asp Ile Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Pro Thr

165 170 175

Tyr Gln Cys Leu Lys Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Asn Val Ala

180 185 190

Val Thr Val Ser Gly His Thr Cys Gln His Trp Ser Ala Gln Thr Pro

195 200 205

His Thr His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Asp

210 215 220

Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Arg Ala Pro Trp Cys His

225 230 235 240

Thr Thr Asn Ser Gln Val Arg Trp Glu Tyr Cys Lys Ile Pro Ser Cys

245 250 255

Asp Ser Ser Pro Val Ser Thr Glu Gln Leu Ala Pro Thr Ala Pro Pro

260 265 270

Glu Leu Thr Pro Val Val Gln Asp Cys Tyr His Gly Asp Gly Gln Ser

275 280 285

Tyr Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Thr Thr Gly Lys Lys Cys Gln Ser

290 295 300

Trp Ser Ser Met Thr Pro His Arg His Gln Lys Thr Pro Glu Asn Tyr

305 310 315 320

Pro Asn Ala Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Asp

325 330 335

Lys Gly Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu Tyr

340 345 350

Cys Asn Leu Lys Lys Cys Ser Gly Thr Glu Ala Ser Val Val Ala Pro

355 360 365

Pro Pro Val Val Leu Leu Pro Asp Val Glu Thr Pro Ser Glu Glu Asp

370 375 380

Cys Met Phe Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys Arg Ala Thr Thr

385 390 395 400

Val Thr Gly Thr Pro Cys Gln Asp Trp Ala Ala Gln Glu Pro His Arg

405 410 415

His Ser Ile Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg Ala Gly Leu Glu Lys

420 425 430

Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly Gly Pro Trp Cys Tyr

435 440 445

Thr Thr Asn Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Val Pro Gln Cys

450 455 460

Ala Ala Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys Lys

465 470 475 480

Cys Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp

485 490 495

Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly

500 505 510

Gly Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu

515 520 525

Glu Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His

530 535 540

Gln Glu Val Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg

545 550 555 560

Leu Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser

565 570 575

Ser Pro Ala Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser

580 585 590

Pro Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp

595 600 605

Gly Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln

610 615 620

Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn

625 630 635 640

Gly Arg Val Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly

645 650 655

Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu

660 665 670

Lys Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys

675 680 685

Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val

690 695 700

Thr Trp Ile Glu Gly Val Met Arg Asn Asn

705 710

<210> 7

<211> 1245

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸

<220>

<223> delta-plg(delta-纤溶酶原)核酸序列

<400> 7

gagcctctgg atgactatgt gaatacccag ggggcttcac tgttcagtgt cactaagaag 60

cagctgggag caggaagtat agaagaatgt gcagcaaaat gtgaggagga cgaagaattc 120

acctgcaggg cattccaata tcacagtaaa gagcaacaat gtgtgataat ggctgaaaac 180

aggaagtcct ccataatcat taggatgaga gatgtagttt tatttgaaaa gaaagtgtat 240

ctctcagagt gcaagactgg gaatggaaag aactacagag ggacgatgtc caaaacaaaa 300

aatggcatca cctgtcaaaa atggagttcc acttctcccc acagacctag attctcacct 360

gctacacacc cctcagaggg actggaggag aactactgca ggaatccaga caacgatccg 420

caggggccct ggtgctatac tactgatcca gaaaagagat atgactactg cgacattctt 480

gagtgtgaag aggcggcccc ttcatttgat tgtgggaagc ctcaagtgga gccgaagaaa 540

tgtcctggaa gggttgtagg ggggtgtgtg gcccacccac attcctggcc ctggcaagtc 600

agtcttagaa caaggtttgg aatgcacttc tgtggaggca ccttgatatc cccagagtgg 660

gtgttgactg ctgcccactg cttggagaag tccccaaggc cttcatccta caaggtcatc 720

ctgggtgcac accaagaagt gaatctcgaa ccgcatgttc aggaaataga agtgtctagg 780

ctgttcttgg agcccacacg aaaagatatt gccttgctaa agctaagcag tcctgccgtc 840

atcactgaca aagtaatccc agcttgtctg ccatccccaa attatgtggt cgctgaccgg 900

accgaatgtt tcatcactgg ctggggagaa acccaaggta cttttggagc tggccttctc 960

aaggaagccc agctccctgt gattgagaat aaagtgtgca atcgctatga gtttctgaat 1020

ggaagagtcc aatccaccga actctgtgct gggcatttgg ccggaggcac tgacagttgc 1080

cagggtgaca gtggaggtcc tctggtttgc ttcgagaagg acaaatacat tttacaagga 1140

gtcacttctt ggggtcttgg ctgtgcacgc cccaataagc ctggtgtcta tgttcgtgtt 1200

tcaaggtttg ttacttggat tgagggagtg atgagaaata attaa 1245

<210> 8

<211> 414

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成的多肽

<220>

<223> delta-plg(delta-纤溶酶原)氨基酸序列

<400> 8

Glu Pro Leu Asp Asp Tyr Val Asn Thr Gln Gly Ala Ser Leu Phe Ser

1 5 10 15

Val Thr Lys Lys Gln Leu Gly Ala Gly Ser Ile Glu Glu Cys Ala Ala

20 25 30

Lys Cys Glu Glu Asp Glu Glu Phe Thr Cys Arg Ala Phe Gln Tyr His

35 40 45

Ser Lys Glu Gln Gln Cys Val Ile Met Ala Glu Asn Arg Lys Ser Ser

50 55 60

Ile Ile Ile Arg Met Arg Asp Val Val Leu Phe Glu Lys Lys Val Tyr

65 70 75 80

Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Met

85 90 95

Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ser Thr Ser

100 105 110

Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Glu Gly Leu

115 120 125

Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln Gly Pro Trp

130 135 140

Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp Ile Leu

145 150 155 160

Glu Cys Glu Glu Ala Ala Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val

165 170 175

Glu Pro Lys Lys Cys Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His

180 185 190

Pro His Ser Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met

195 200 205

His Phe Cys Gly Gly Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala

210 215 220

Ala His Cys Leu Glu Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile

225 230 235 240

Leu Gly Ala His Gln Glu Val Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile

245 250 255

Glu Val Ser Arg Leu Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu

260 265 270

Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala

275 280 285

Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe

290 295 300

Ile Thr Gly Trp Gly Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu

305 310 315 320

Lys Glu Ala Gln Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr

325 330 335

Glu Phe Leu Asn Gly Arg Val Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His

340 345 350

Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu

355 360 365

Val Cys Phe Glu Lys Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp

370 375 380

Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val

385 390 395 400

Ser Arg Phe Val Thr Trp Ile Glu Gly Val Met Arg Asn Asn

405 410

<210> 9

<211> 1104

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸

<220>

<223> Mini-plg(小纤维蛋白溶酶原)核酸序列

<400> 9

gtcaggtggg agtactgcaa cctgaaaaaa tgctcaggaa cagaagcgag tgttgtagca 60

cctccgcctg ttgtcctgct tccagatgta gagactcctt ccgaagaaga ctgtatgttt 120

gggaatggga aaggataccg aggcaagagg gcgaccactg ttactgggac gccatgccag 180

gactgggctg cccaggagcc ccatagacac agcattttca ctccagagac aaatccacgg 240

gcgggtctgg aaaaaaatta ctgccgtaac cctgatggtg atgtaggtgg tccctggtgc 300

tacacgacaa atccaagaaa actttacgac tactgtgatg tccctcagtg tgcggcccct 360

tcatttgatt gtgggaagcc tcaagtggag ccgaagaaat gtcctggaag ggttgtaggg 420

gggtgtgtgg cccacccaca ttcctggccc tggcaagtca gtcttagaac aaggtttgga 480

atgcacttct gtggaggcac cttgatatcc ccagagtggg tgttgactgc tgcccactgc 540

ttggagaagt ccccaaggcc ttcatcctac aaggtcatcc tgggtgcaca ccaagaagtg 600

aatctcgaac cgcatgttca ggaaatagaa gtgtctaggc tgttcttgga gcccacacga 660

aaagatattg ccttgctaaa gctaagcagt cctgccgtca tcactgacaa agtaatccca 720

gcttgtctgc catccccaaa ttatgtggtc gctgaccgga ccgaatgttt catcactggc 780

tggggagaaa cccaaggtac ttttggagct ggccttctca aggaagccca gctccctgtg 840

attgagaata aagtgtgcaa tcgctatgag tttctgaatg gaagagtcca atccaccgaa 900

ctctgtgctg ggcatttggc cggaggcact gacagttgcc agggtgacag tggaggtcct 960

ctggtttgct tcgagaagga caaatacatt ttacaaggag tcacttcttg gggtcttggc 1020

tgtgcacgcc ccaataagcc tggtgtctat gttcgtgttt caaggtttgt tacttggatt 1080

gagggagtga tgagaaataa ttaa 1104

<210> 10

<211> 367

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成的多肽

<220>

<223> Mini-plg(小纤维蛋白溶酶原)氨基酸序列

<400> 10

Val Arg Trp Glu Tyr Cys Asn Leu Lys Lys Cys Ser Gly Thr Glu Ala

1 5 10 15

Ser Val Val Ala Pro Pro Pro Val Val Leu Leu Pro Asp Val Glu Thr

20 25 30

Pro Ser Glu Glu Asp Cys Met Phe Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly

35 40 45

Lys Arg Ala Thr Thr Val Thr Gly Thr Pro Cys Gln Asp Trp Ala Ala

50 55 60

Gln Glu Pro His Arg His Ser Ile Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg

65 70 75 80

Ala Gly Leu Glu Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly

85 90 95

Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asn Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys

100 105 110

Asp Val Pro Gln Cys Ala Ala Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln

115 120 125

Val Glu Pro Lys Lys Cys Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala

130 135 140

His Pro His Ser Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly

145 150 155 160

Met His Phe Cys Gly Gly Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr

165 170 175

Ala Ala His Cys Leu Glu Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val

180 185 190

Ile Leu Gly Ala His Gln Glu Val Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu

195 200 205

Ile Glu Val Ser Arg Leu Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala

210 215 220

Leu Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro

225 230 235 240

Ala Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys

245 250 255

Phe Ile Thr Gly Trp Gly Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu

260 265 270

Leu Lys Glu Ala Gln Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg

275 280 285

Tyr Glu Phe Leu Asn Gly Arg Val Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly

290 295 300

His Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro

305 310 315 320

Leu Val Cys Phe Glu Lys Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser

325 330 335

Trp Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg

340 345 350

Val Ser Arg Phe Val Thr Trp Ile Glu Gly Val Met Arg Asn Asn

355 360 365

<210> 11

<211> 750

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸

<220>

<223> Micro-plg(微纤维蛋白溶酶原)核酸序列

<400> 11

gccccttcat ttgattgtgg gaagcctcaa gtggagccga agaaatgtcc tggaagggtt 60

gtaggggggt gtgtggccca cccacattcc tggccctggc aagtcagtct tagaacaagg 120

tttggaatgc acttctgtgg aggcaccttg atatccccag agtgggtgtt gactgctgcc 180

cactgcttgg agaagtcccc aaggccttca tcctacaagg tcatcctggg tgcacaccaa 240

gaagtgaatc tcgaaccgca tgttcaggaa atagaagtgt ctaggctgtt cttggagccc 300

acacgaaaag atattgcctt gctaaagcta agcagtcctg ccgtcatcac tgacaaagta 360

atcccagctt gtctgccatc cccaaattat gtggtcgctg accggaccga atgtttcatc 420

actggctggg gagaaaccca aggtactttt ggagctggcc ttctcaagga agcccagctc 480

cctgtgattg agaataaagt gtgcaatcgc tatgagtttc tgaatggaag agtccaatcc 540

accgaactct gtgctgggca tttggccgga ggcactgaca gttgccaggg tgacagtgga 600

ggtcctctgg tttgcttcga gaaggacaaa tacattttac aaggagtcac ttcttggggt 660

cttggctgtg cacgccccaa taagcctggt gtctatgttc gtgtttcaag gtttgttact 720

tggattgagg gagtgatgag aaataattaa 750

<210> 12

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成的多肽

<220>

<223> Micro-plg(微纤维蛋白溶酶原)氨基酸序列

<400> 12

Ala Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys Lys Cys

1 5 10 15

Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp Pro

20 25 30

Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly Gly

35 40 45

Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Glu

50 55 60

Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His Gln

65 70 75 80

Glu Val Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg Leu

85 90 95

Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser Ser

100 105 110

Pro Ala Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser Pro

115 120 125

Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp Gly

130 135 140

Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln Leu

145 150 155 160

Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn Gly

165 170 175

Arg Val Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly Thr

180 185 190

Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu Lys

195 200 205

Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys Ala

210 215 220

Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val Thr

225 230 235 240

Trp Ile Glu Gly Val Met Arg Asn Asn

245

<210> 13

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸

<220>

<223> 丝氨酸蛋白酶(结构)域的核酸序列

<400> 13

gttgtagggg ggtgtgtggc ccacccacat tcctggccct ggcaagtcag tcttagaaca 60

aggtttggaa tgcacttctg tggaggcacc ttgatatccc cagagtgggt gttgactgct 120

gcccactgct tggagaagtc cccaaggcct tcatcctaca aggtcatcct gggtgcacac 180

caagaagtga atctcgaacc gcatgttcag gaaatagaag tgtctaggct gttcttggag 240

cccacacgaa aagatattgc cttgctaaag ctaagcagtc ctgccgtcat cactgacaaa 300

gtaatcccag cttgtctgcc atccccaaat tatgtggtcg ctgaccggac cgaatgtttc 360

atcactggct ggggagaaac ccaaggtact tttggagctg gccttctcaa ggaagcccag 420

ctccctgtga ttgagaataa agtgtgcaat cgctatgagt ttctgaatgg aagagtccaa 480

tccaccgaac tctgtgctgg gcatttggcc ggaggcactg acagttgcca gggtgacagt 540

ggaggtcctc tggtttgctt cgagaaggac aaatacattt tacaaggagt cacttcttgg 600

ggtcttggct gtgcacgccc caataagcct ggtgtctatg ttcgtgtttc aaggtttgtt 660

acttggattg agggagtgat gaga 684

<210> 14

<211> 228

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成的多肽

<220>

<223> 丝氨酸蛋白酶(结构)域的氨基酸序列

<400> 14

Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp Pro Trp Gln Val

1 5 10 15

Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly Gly Thr Leu Ile

20 25 30

Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Glu Lys Ser Pro

35 40 45

Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His Gln Glu Val Asn

50 55 60

Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg Leu Phe Leu Glu

65 70 75 80

Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala Val

85 90 95

Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr Val

100 105 110

Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp Gly Glu Thr Gln

115 120 125

Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln Leu Pro Val Ile

130 135 140

Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn Gly Arg Val Gln

145 150 155 160

Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser Cys

165 170 175

Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu Lys Asp Lys Tyr

180 185 190

Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro Asn

195 200 205

Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val Thr Trp Ile Glu

210 215 220

Gly Val Met Arg

225

Claims

1.一种治疗肌萎缩侧索硬化(ALS)的方法，包括给药患肌萎缩侧索硬化(ALS)的受试者治疗有效量的纤溶酶原途径激活剂。

2.权利要求1的方法，其中所述纤溶酶原途径激活剂对所述患肌萎缩侧索硬化(ALS)的受试者具有选自如下的一种或多种活性：延长寿命和中位生存期、延缓肌肉萎缩和肌力减退、减缓体重下降的速度、减轻脊髓前角细胞损伤、变性和坏死、促进脊髓前角chAT的合成、促进胆碱能神经元功能恢复、促进脊髓前角突触素表达、脊髓前角SMN蛋白表达、促进脊髓前角炎症修复、促进突触损伤修复。

3.权利要求1的方法，其中所述纤溶酶原途径激活剂改善受试者的肌肉萎缩、肌力减退、痉挛和/或肌束震颤症状。

4.权利要求1的方法，其中所述纤溶酶原途径激活剂减轻受试者的体重下降和/或延长生存期。

5.权利要求1的方法，其中所述纤溶酶原途径激活剂改善受试者的肌张力。

6.权利要求1的方法，其中所述纤溶酶原途径激活剂促进受试者的肌肉功能恢复。

7.权利要求1的方法，其中所述纤溶酶原途径激活剂促进受试者的脊髓前角神经元损伤修复。

8.权利要求1-7任一项的方法，其中所述纤溶酶原途径激活剂与一种或多种其它药物和/或治疗方法联合施用。

9.权利要求1-8任一项的方法，其中所述纤溶酶原途径激活剂通过静脉内、皮下、肌肉内、鞘内、鼻腔吸入、雾化吸入、滴鼻液或滴眼液形式给药。

10.权利要求1-9任一项的方法，其中所述纤溶酶原途径激活剂为纤溶酶原激活途径的组分。