CN116669757A - 一种提高bdnf水平的方法和药物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种促进成熟BDNF形成和提高BDNF水平的方法，包括给药受试者治疗有效量的纤溶酶原途径激活剂。本发明还涉及用于促进成熟BDNF形成和提高BDNF水平的包含纤溶酶原途径激活剂的药物组合物、制品和试剂盒。

Description

一种提高BDNF水平的方法和药物 技术领域
本发明涉及一种促进成熟BDNF形成和提高BDNF水平的方法，包括给药有需要的受试者有效量的纤维蛋白溶酶原激活途径的组分或其相关化合物，例如纤溶酶原，以修复损伤神经。
背景技术
脑源性神经营养因子(BDNF)是神经营养因子(NTF)家族的一员。BDNF主要在中枢神经系统内表达，主要分布在海马、杏仁核和皮质，在外周系统心脏、脂肪和骨骼肌也有表达。酪氨酸激酶受体B(tyrosine kinase receptor B,Trk B)是BDNF的特异性高亲和力受体，BDNF可通过与Trk B结合，激发各种信号传导通路而发挥其特殊的生物学功能。
脑源性神经营养因子(BDNF)及其受体酪氨酸激酶受体B(Trk B)基因突变或功能缺失均会导致机体能量代谢失衡。BDNF可通过调节神经元的生存、生长并维持其功能在学习和记忆中发挥着重要的作用。
发明概述
本发明研究发现纤溶酶原途径激活剂例如纤溶酶原可以明显促进成熟BDNF形成和提高BDNF水平，从而对神经元存活、分化、生长发育起作用。
一方面，本发明涉及以下各项：
1.一种促进成熟BDNF形成和提高BDNF水平的方法，包括给药受试者治疗有效量的纤溶酶原途径激活剂。
2.项1的方法，其中所述纤溶酶原途径激活剂促进受试者神经组织Pro-BDNF裂解形成成熟BDNF和BDNF基因的转录或表达。
3.项1的方法，其中所述纤溶酶原途径激活剂促进患神经组织损伤受试者神经组织Pro-BDNF裂解形成成熟BDNF和BDNF基因的转录或表达，其中所述神经组织损伤由选自如下的一种或多种疾病或状况所致：
1)感染，选自如下的一种或多种：脑膜炎、脑炎、脊髓灰质炎和硬膜外脓肿；
2)血管疾病，选自如下的一种或多种：中风、短暂性脑缺血发作(TIA)、蛛网膜下腔出血、硬膜下出血和血肿、和硬膜外出血；
3)神经结构损伤疾病，选自如下的一种或多种：脑或脊髓损伤、贝尔麻痹、颈椎病、腕管综合征、脑或脊髓肿瘤、周围神经病和格林-巴利综合征；
4)功能障碍，选自如下的一种或多种：头痛、癫痫、失眠、神经痛、焦虑和抑郁症；
5)神经退行性疾病，选自如下的一种或多种：阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病(Huntington's disease，HD)、肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophiclateral sclerosis，ALS)、多发性硬化症(Multiple sclerosis，MS)、脊髓小脑共济失调和Pick病；
6)运动神经元疾病，选自如下的一种或多种：脊髓性肌萎缩症(SpinalMuscularAtrophy，SMA)、进行性延髓麻痹、进行性肌肉萎缩、和原发性侧索硬化；
7)肿瘤，选自如下的一种或多种：脑部肿瘤和脑癌。
4.项1的方法，其中所纤溶酶原途径激活剂促进脊髓性肌萎缩症(SpinalMuscularAtrophy，SMA)受试者神经组织Pro-BDNF裂解形成成熟BDNF和BDNF基因的转录或表达。
在一些实施方案中，所述纤溶酶原途径激活剂提高受试者损伤神经组织中其它神经营养因子的基因转录、蛋白表达和水平。在一些实施方案中，所述神经营养因子包括神经生长因子(NGF)、神经营养因子3(NT-3)、神经营养因子4/5(NT-4/5)、睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)、胶质细胞源神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)、胰岛素样生长因子I(insulin like-growth factor-1，IGF-1)、转化生长因子(transforming growth factor，TGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)或血小板源生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)。
在一些实施方案中，本申请涉及一种预防或治疗BDNF相关疾病或病症的方法，包括给药受试者治疗有效量的纤溶酶原途径激活剂。
在一些实施方案中，所述BDNF相关疾病或病症包括选自如下的任一 种：
1)感染，选自如下的任一种：脑膜炎、脑炎、脊髓灰质炎和硬膜外脓肿；
2)血管疾病，选自如下的任一种：中风、短暂性脑缺血发作(TIA)、蛛网膜下腔出血、硬膜下出血和血肿、和硬膜外出血；
3)神经结构损伤疾病，选自如下的任一种：脑或脊髓损伤、贝尔麻痹、颈椎病、腕管综合征、脑或脊髓肿瘤、周围神经病和格林-巴利综合征；
4)功能障碍，选自如下的任一种：头痛、癫痫、失眠、神经痛、焦虑和抑郁症；
5)神经退行性疾病，选自如下的任一种：阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病(Huntington's disease，HD)、肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophiclateral sclerosis，ALS)、多发性硬化症(Multiple sclerosis，MS)、脊髓小脑共济失调和Pick病；
6)运动神经元疾病，选自如下的任一种：脊髓性肌萎缩症(SpinalMuscularAtrophy，SMA)、进行性延髓麻痹、进行性肌肉萎缩、和原发性侧索硬化；
7)肿瘤，选自如下的任一种：脑部肿瘤和脑癌；
8)周围神经病、外伤引起的神经损伤，视神经病变、多发性神经炎、带状疱疹、面神经麻痹、烧伤、褥疮、角膜溃疡、放疗或化疗引起的副作用；
9)神经精神障碍、强迫性神经失调、创伤后应激障碍、神经性厌食、中枢神经系统的自身免疫性疾病、长期或短期记忆障碍、儿童学习障碍、闭合性颅脑损伤、注意力缺陷障碍、发作性睡病、睡眠障碍、脑或神经细胞损伤、与AIDS有关的神经功能缺损、以运动和/或发声性抽搐为特征的运动和抽搐障碍(例如，图雷特精神障碍、慢性运动或发声性抽搐障碍、短时抽搐性障碍和刻板型活动障碍)、物质滥用病症(例如，物质依赖、物质滥用以及物质滥用/依赖的后遗症，例如物质诱发的心理障碍、物质戒断和物质诱发的痴呆或遗忘症)、外伤性脑损伤、耳鸣、共济失调、肌肉强直(痉挛状态)、由酒精或物质滥用(例如，摇头丸、去氧麻黄碱等)引发的神经毒 性、精神发育迟缓或认知缺损(例如，非综合征性X连锁精神发育迟缓、脆性X综合征、唐氏综合征、孤独症)、失语症、贝尔氏麻痹、克-雅病、脑炎、年龄相关性黄斑变性、ondine综合征、WAGR综合征、听力损失、雷特综合征、视神经损伤、糖尿病神经病变、神经移植并发症、周围神经损伤、肥胖症、代谢综合征、哮喘、特应性疾病、过敏性炎症、湿疹、神经免疫学疾病或病症和神经耳科疾病或病症、以及与老化和衰老有关的疾病或病症；
10)神经痛，选自如下的任一项：三叉神经痛、慢性疼痛、慢性炎性痛、与关节炎有关的疼痛、纤维肌痛、癌症相关的疼痛、与消化性疾病有关的疼痛、与克罗恩氏病有关的疼痛、与自身免疫性疾病有关的疼痛、与内分泌疾病有关的疼痛、与糖尿病神经病变有关的疼痛、幻肢痛、自发性疼痛、慢性术后疼痛、慢性颞下颌疼痛、灼痛、疱疹后神经痛、AIDS相关的疼痛、I和II型复杂性区域疼痛综合征、慢性背痛、与脊髓损伤有关的疼痛、与药物摄入有关的疼痛和复发性急性疼痛、神经性疼痛。
5.项1-4任一项的方法，其中所述纤溶酶原途径激活剂提高受试者患病神经组织中纤溶酶原水平。
6.项1-5任一项的方法，其中所述纤溶酶原途径激活剂与一种或多种其它药物或治疗方法联合施用。
7.项1-6任一项的方法，其中所述纤溶酶原途径激活剂通过静脉内、肌肉内、鞘内、鼻腔吸入、雾化吸入、滴鼻液或滴眼液形式给药。
8.项1-7任一项的方法，其中所述纤溶酶原途径激活剂为纤溶酶原激活途径的组分，优选纤溶酶原。
9.项1-8任一项的方法，其中所述纤溶酶原途径激活剂具有选自如下的一项或多项中的用途或活性：促进神经元存活、分化、生长发育；防止神经元受损伤死亡；促进受损伤神经元再生及分化；和维持神经元生存及正常生理功能。
10.项1-9任一项的方法，其中所述纤溶酶原包含与序列2、6、8、10或12所示氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列，并且具有纤溶酶原活性。
11.项1-9任一项的方法，所述纤溶酶原为纤溶酶原活性片段、并且具有纤溶酶原的蛋白水解活性或赖氨酸结合活性的蛋白质。
12.项1-9任一项的方法，所述纤溶酶原选自Glu-纤溶酶原、Lys-纤溶酶原、小纤溶酶原、微纤溶酶原、delta-纤溶酶原或它们的保留纤溶酶原活性的变体。
13.项1-9任一项的方法，所述纤溶酶原包含序列2、6、8、10或12所示氨基酸序列。
在上述技术方案中，所述纤溶酶原途径激活剂选自如下一种或多种：纤维蛋白溶酶原激活途径的组分、能够直接激活纤维蛋白溶酶原或通过激活纤维蛋白溶酶原激活途径上游组分而间接激活纤维蛋白溶酶原的化合物、模拟纤维蛋白溶酶原或纤维蛋白溶酶之活性的化合物、能够上调纤维蛋白溶酶原或纤维蛋白溶酶原激活剂表达的化合物、纤维蛋白溶酶原类似物、纤维蛋白溶酶类似物、tPA或uPA类似物和纤溶抑制剂的拮抗剂。
在一些具体实施方案中，所述纤维蛋白溶酶原激活途径的组分选自天然或重组的纤维蛋白溶酶原、人纤维蛋白溶酶、Lys-纤维蛋白溶酶原、Glu-纤维蛋白溶酶原、纤维蛋白溶酶、含有纤维蛋白溶酶原和纤维蛋白溶酶的一个或多个kringle结构域和蛋白酶结构域的纤维蛋白溶酶原和纤维蛋白溶酶变体及类似物、小纤维蛋白溶酶原(mini-plasminogen)、小纤维蛋白溶酶(mini-plasmin)、微纤溶酶原(micro-plasminogen)、微纤溶酶(micro-plasmin)、delta-纤溶酶原、delta-纤溶酶(delta-plasmin)、纤维蛋白溶酶原激活剂、tPA和uPA。在一些具体实施方案中，所述纤溶抑制剂的拮抗剂为天然或重组的PAI-1、补体C1抑制物、α2抗纤溶酶或α2巨球蛋白的拮抗剂，例如PAI-1、补体C1抑制物、α2抗纤溶酶或α2巨球蛋白的抗体。
在一些具体实施方案中，所述纤溶酶原途径激活剂与一种或多种其它药物和/或治疗方法联合施用，优选地，所述治疗方法包括细胞疗法(例如干细胞疗法)和基因疗法，例如反义RNA、小分子剪接修饰剂。
在一些具体实施方案中，所述纤溶酶原途径激活剂为纤维蛋白溶酶原激活途径的组分，例如纤溶酶原。在一些具体实施方案中，所述纤溶酶原包含或具有与序列2、6、8、10或12所示氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列，并且具有纤溶酶原活性和/或赖氨酸结合活性。在一些实施方案中，所述纤溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基础上，添加、删除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1个氨基酸，并且具有纤溶酶原活性 和/或赖氨酸结合活性的蛋白质。在一些具体实施方案中，所述纤溶酶原活性为纤溶酶原的蛋白水解活性。在一些具体实施方案中，所述纤溶酶原为包含纤溶酶原活性片段、并且具有纤溶酶原活性和/或赖氨酸结合活性的蛋白质。在一些具体实施方案中，所述纤溶酶原活性为纤溶酶原的蛋白水解活性。在一些具体实施方案中，所述纤溶酶原活性片段包含或具有纤溶酶原丝氨酸蛋白酶结构域或称纤溶酶原蛋白酶结构域。在一些具体实施方案中，所述纤溶酶原活性片段的氨基酸序列如序列14所示。在一些具体实施方案中，所述纤溶酶原选自Glu-纤溶酶原(人全长纤溶酶原)、Lys-纤溶酶原(在第76-77位氨基酸之间切割后的人全长纤溶酶原)、小纤溶酶原(包含Kringle 5(K5)和丝氨酸蛋白酶结构域)、微纤溶酶原(包含丝氨酸蛋白酶结构域)、delta-纤溶酶原(包含Kringle 1和丝氨酸蛋白酶结构域)或它们的保留纤溶酶原活性的变体。在一些具体实施方案中，所述纤溶酶原为人全长纤溶酶原、或其仍然保留纤溶酶原活性和/或赖氨酸结合活性的变体或片段。在一些实施方案中，所述纤溶酶原为来自灵长类动物或啮齿类动物的人纤溶酶原直向同系物或其仍然保留纤溶酶原活性和/或赖氨酸结合活性的变体或片段。在一些实施方案中，所述纤溶酶原包含如序列2、6、8、10或12所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述纤溶酶原是人天然纤溶酶原。
在一些实施方案中，本申请还涉及如下各项的技术方案：
1.一方面，本申请涉及用于促进受试者神经组织中成熟BDNF形成和/或提高BDNF水平的纤溶酶原途径激活剂、或包含纤溶酶原途径激活剂的药物组合物。一方面，本申请还涉及纤溶酶原途径激活剂在制备用于促进受试者神经组织中成熟BDNF形成和/或提高BDNF水平的药物中的用途。
2.项1的纤溶酶原途径激活剂、或包含纤溶酶原途径激活剂的药物组合物、或用途，其中所述纤溶酶原途径激活剂促进受试者神经组织中Pro-BDNF裂解形成成熟BDNF和BDNF基因的转录或表达。
3.项1或2的纤溶酶原途径激活剂、或包含纤溶酶原途径激活剂的药物组合物、或用途，其中所述纤溶酶原途径激活剂提高受试者神经组织中其它神经营养因子的基因转录、蛋白表达和水平。
4.项3的纤溶酶原途径激活剂、或包含纤溶酶原途径激活剂的药物组合物、或用途，其中所述神经营养因子包括神经生长因子(NGF)、神经营养因子3(NT-3)、神经营养因子4/5(NT-4/5)、睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)、胶质细胞源神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)、胰岛素样生长因子I(insulin like-growth factor-1，IGF-1)、转化生长因子(transforming growth factor，TGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)或血小板源生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)。
5.项1-4任一项的纤溶酶原途径激活剂、或包含纤溶酶原途径激活剂的药物组合物、或用途，其中所述纤溶酶原途径激活剂具有选自如下的一项或多项中的用途或活性：促进神经元存活、分化、生长发育；防止神经元受损伤死亡；促进受损伤神经元再生及分化；和维持神经元生存及正常生理功能。
6.项1-5中任一项的纤溶酶原途径激活剂、或包含纤溶酶原途径激活剂的药物组合物、或用途，其中所述受试者为神经或脑组织损伤受试者，其中所述神经或脑组织损伤由选自如下的一种或多种疾病或状况所致：
1)感染，选自如下的一种或多种：脑膜炎、脑炎、脊髓灰质炎和硬膜外脓肿；
2)血管疾病，选自如下的一种或多种：中风、短暂性脑缺血发作(TIA)、蛛网膜下腔出血、硬膜下出血和血肿、和硬膜外出血；
3)神经结构损伤疾病，选自如下的一种或多种：脑或脊髓损伤、贝尔麻痹、颈椎病、腕管综合征、脑或脊髓肿瘤、周围神经病和格林-巴利综合征；
4)功能障碍，选自如下的一种或多种：头痛、癫痫、失眠、神经痛、焦虑和抑郁症；
5)神经退行性疾病，选自如下的一种或多种：阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病(Huntington's disease，HD)、肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophiclateral sclerosis，ALS)、多发性硬化症(Multiple sclerosis，MS)、脊髓小脑共济失调和Pick病；
6)运动神经元疾病，选自如下的一种或多种：脊髓性肌萎缩症(SpinalMuscularAtrophy，SMA)、进行性延髓麻痹、进行性肌肉萎缩、和原发性侧索硬化；
7)肿瘤，选自如下的一种或多种：脑部肿瘤和脑癌。
7.用于预防或治疗BDNF相关疾病或病症的纤溶酶原途径激活剂、包 含该纤溶酶原途径激活剂的药物组合、或纤溶酶原途径激活剂在制备预防或治疗BDNF相关疾病或病症的药物中的用途。
8.项7的纤溶酶原途径激活剂、药物组合物或用途，其中所述BDNF相关疾病或病症包括选自如下的任一种：
1)感染，选自如下的任一种：脑膜炎、脑炎、脊髓灰质炎和硬膜外脓肿；
2)血管疾病，选自如下的任一种：中风、短暂性脑缺血发作(TIA)、蛛网膜下腔出血、硬膜下出血和血肿、和硬膜外出血；
3)神经结构损伤疾病，选自如下的任一种：脑或脊髓损伤、贝尔麻痹、颈椎病、腕管综合征、脑或脊髓肿瘤、周围神经病和格林-巴利综合征；
4)功能障碍，选自如下的任一种：头痛、癫痫、失眠、神经痛、焦虑和抑郁症；
5)神经退行性疾病，选自如下的任一种：阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病(Huntington's disease，HD)、肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophiclateral sclerosis，ALS)、多发性硬化症(Multiple sclerosis，MS)、脊髓小脑共济失调和Pick病；
6)运动神经元疾病，选自如下的任一种：脊髓性肌萎缩症(SpinalMuscularAtrophy，SMA)、进行性延髓麻痹、进行性肌肉萎缩、和原发性侧索硬化；
7)肿瘤，选自如下的任一种：脑部肿瘤和脑癌；
8)周围神经病、外伤引起的神经损伤，视神经病变、多发性神经炎、带状疱疹、面神经麻痹、烧伤、褥疮、角膜溃疡、放疗或化疗引起的副作用；
9)神经精神障碍、强迫性神经失调、创伤后应激障碍、神经性厌食、中枢神经系统的自身免疫性疾病、长期或短期记忆障碍、儿童学习障碍、闭合性颅脑损伤、注意力缺陷障碍、发作性睡病、睡眠障碍、脑或神经细胞损伤、与AIDS有关的神经功能缺损、以运动和/或发声性抽搐为特征的运动和抽搐障碍(例如，图雷特精神障碍、慢性运动或发声性抽搐障碍、短时抽搐性障碍和刻板型活动障碍)、物质滥用病症(例如，物质依赖、物质滥 用以及物质滥用/依赖的后遗症，例如物质诱发的心理障碍、物质戒断和物质诱发的痴呆或遗忘症)、外伤性脑损伤、耳鸣、共济失调、肌肉强直(痉挛状态)、由酒精或物质滥用(例如，摇头丸、去氧麻黄碱等)引发的神经毒性、精神发育迟缓或认知缺损(例如，非综合征性X连锁精神发育迟缓、脆性X综合征、唐氏综合征、孤独症)、失语症、贝尔氏麻痹、克-雅病、脑炎、年龄相关性黄斑变性、ondine综合征、WAGR综合征、听力损失、雷特综合征、视神经损伤、糖尿病神经病变、神经移植并发症、周围神经损伤、肥胖症、代谢综合征、哮喘、特应性疾病、过敏性炎症、湿疹、神经免疫学疾病或病症和神经耳科疾病或病症、以及与老化和衰老有关的疾病或病症；
10)神经痛，选自如下的任一项：三叉神经痛、慢性疼痛、慢性炎性痛、与关节炎有关的疼痛、纤维肌痛、癌症相关的疼痛、与消化性疾病有关的疼痛、与克罗恩氏病有关的疼痛、与自身免疫性疾病有关的疼痛、与内分泌疾病有关的疼痛、与糖尿病神经病变有关的疼痛、幻肢痛、自发性疼痛、慢性术后疼痛、慢性颞下颌疼痛、灼痛、疱疹后神经痛、AIDS相关的疼痛、I和II型复杂性区域疼痛综合征、慢性背痛、与脊髓损伤有关的疼痛、与药物摄入有关的疼痛和复发性急性疼痛、神经性疼痛。9.项1-8任一项的纤溶酶原途径激活剂、或包含纤溶酶原途径激活剂的药物组合物、或用途，其中所述纤溶酶原途径激活剂提高受试者损伤神经组织中纤溶酶原水平。
10.项1-9任一项的纤溶酶原途径激活剂、或包含纤溶酶原途径激活剂的药物组合物、或用途，其中所述纤溶酶原途径激活剂与一种或多种其它药物或治疗方法联合施用。
11.项1-10任一项的纤溶酶原途径激活剂、或包含纤溶酶原途径激活剂的药物组合物、或用途，其中所述纤溶酶原途径激活剂通过静脉内、肌肉内、鞘内、鼻腔吸入、雾化吸入、滴鼻液或滴眼液形式给药。
12.项1-11任一项的纤溶酶原途径激活剂、或包含纤溶酶原途径激活剂的药物组合物、或用途，其中所述纤溶酶原途径激活剂选自如下一种或多种：纤维蛋白溶酶原激活途径的组分、能够直接激活纤维蛋白溶酶原或通过激活纤维蛋白溶酶原激活途径上游组分而间接激活纤维蛋白溶酶原的化合物、模拟纤维蛋白溶酶原或纤维蛋白溶酶之活性的化合物、能够上调纤 维蛋白溶酶原或纤维蛋白溶酶原激活剂表达的化合物、纤维蛋白溶酶原类似物、纤维蛋白溶酶类似物、tPA或uPA类似物和纤溶抑制剂的拮抗剂。
13.项12的纤溶酶原途径激活剂、或包含纤溶酶原途径激活剂的药物组合物、或用途，其中所述纤维蛋白溶酶原激活途径的组分选自天然或重组的纤溶酶原、人纤维蛋白溶酶、Lys-纤维蛋白溶酶原、Glu-纤维蛋白溶酶原、纤维蛋白溶酶、含有纤维蛋白溶酶原和纤维蛋白溶酶的一个或多个kringle结构域和/或蛋白酶结构域的纤维蛋白溶酶原和纤维蛋白溶酶变体及类似物、小纤维蛋白溶酶原(mini-plasminogen)、小纤维蛋白溶酶(mini-plasmin)、微纤溶酶原(micro-plasminogen)、微纤溶酶(micro-plasmin)、delta-纤溶酶原、delta-纤溶酶(delta-plasmin)、纤维蛋白溶酶原激活剂、tPA和uPA。
14.项12的纤溶酶原途径激活剂、或包含纤溶酶原途径激活剂的药物组合物、或用途，其中所述纤溶抑制剂的拮抗剂为天然或重组的PAI-1、补体C1抑制物、α2抗纤溶酶或α2巨球蛋白的拮抗剂，例如PAI-1、补体C1抑制物、α2抗纤溶酶或α2巨球蛋白的抗体。
15.项1-13任一项的纤溶酶原途径激活剂、或包含纤溶酶原途径激活剂的药物组合物、或用途，其中所述纤溶酶原途径激活剂为纤溶酶原。
16.项15的纤溶酶原途径激活剂、或包含纤溶酶原途径激活剂的药物组合物、或用途，其中所述纤溶酶原包含序列2、6、8、10或12所示的氨基酸序列，或包含与序列2、6、8、10或12所示氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列，并且具有纤溶酶原的蛋白水解活性和/或赖氨酸结合活性。
17.项15的纤溶酶原途径激活剂、或包含纤溶酶原途径激活剂的药物组合物、或用途，所述纤溶酶原包含选自如下的一项或多项：
1)具有序列14所示的丝氨酸蛋白酶结构域；
2)与序列14具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性并保留蛋白水解活性的丝氨酸蛋白酶结构域；
3)选自Kringle 1、Kringle 2、Kringle 3、Kringle 4和Kringle 5中一个或多个的Kringle结构域；和
4)与选自Kringle 1、Kringle 2、Kringle 3、Kringle 4和Kringle 5中一个或多个具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性并保留赖氨酸结合活性的Kringle结构域。
18.项15的纤溶酶原途径激活剂、或包含纤溶酶原途径激活剂的药物组合物、或用途，所述纤溶酶原选自Glu-纤溶酶原、Lys-纤溶酶原、小纤溶酶原、微纤溶酶原、delta-纤溶酶原或它们的保留纤溶酶原的蛋白水解活性的变体。
在一些具体实施方案中，所述纤溶酶原途径激活剂以全身或局部方式给药，例如通过静脉内、肌肉内、鞘内、鼻腔吸入、雾化吸入、滴鼻液或滴眼液形式给药。在一些实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，所述受试者缺乏或缺失纤溶酶原。在一些实施方案中，所述缺乏或缺失是先天的、继发的和/或局部的。在一些实施方案中，所述纤溶酶原以每天0.0001-2000mg/kg、0.001-800mg/kg、0.01-600mg/kg、0.1-400mg/kg、1-200mg/kg、1-100mg/kg、10-100mg/kg(以每公斤体重计算)或0.0001-2000mg/cm 2、0.001-800mg/cm 2、0.01-600mg/cm 2、0.1-400mg/cm 2、1-200mg/cm 2、1-100mg/cm 2、10-100mg/cm 2(以每平方厘米体表面积计算)的剂量，每天、每二天或每三天连续施用。
一方面，本申请还涉及用于上述方法的药物组合物、药物、制剂、试剂盒、制品，包含以上所述的纤溶酶原途径激活剂，例如以上所述的纤溶酶原。
在一些实施方案中，所述药物组合物、药物、制剂包含药学上可接受的载体和纤溶酶原途径激活剂，例如纤溶酶原激活途径的组分，例如纤溶酶原。在一些实施方案中，所述试剂盒和制品包含一个或多个容器，所述容器中包含所述药物组合物、药物或制剂。在一些实施方案中，所述试剂盒或制品还包含标签或使用说明书，该标签或使用说明书指示使用纤溶酶原途径激活剂，例如纤溶酶原激活途径的组分，例如纤溶酶原用于上述方法。在一些实施方案中，所述试剂盒或制品还包含另外的一个或多个容器，该容器中含有一种或多种其他药物。
一方面本申请还涉及用于以上所述用途的纤溶酶原途径激活剂，例如以上所述的纤溶酶原。
一方面，本申请还涉及治疗有效量的上述纤溶酶原途径激活剂在制备用于上述方法的药物组合物、药物、制剂、试剂盒、制品中的用途。
在一些实施方案中，所述纤溶酶原途径激活剂选自如下的一种或多种：纤维蛋白溶酶原激活途径的组分、能够直接激活纤维蛋白溶酶原或通过激活纤维蛋白溶酶原激活途径上游组分而间接激活纤维蛋白溶酶原的化 合物、模拟纤维蛋白溶酶原或纤维蛋白溶酶之活性的化合物、能够上调纤维蛋白溶酶原或纤维蛋白溶酶原激活剂表达的化合物、纤维蛋白溶酶原类似物、纤维蛋白溶酶类似物、tPA或uPA类似物和纤溶抑制剂的拮抗剂。
在一些具体实施方案中，所述纤维蛋白溶酶原激活途径的组分选自纤维蛋白溶酶原、重组人纤维蛋白溶酶、Lys-纤维蛋白溶酶原、Glu-纤维蛋白溶酶原、纤维蛋白溶酶、含有纤维蛋白溶酶原和纤维蛋白溶酶的一个或多个kringle结构域和蛋白酶结构域的纤维蛋白溶酶原和纤维蛋白溶酶变体及类似物、小纤维蛋白溶酶原(mini-plasminogen)、小纤维蛋白溶酶(mini-plasmin)、微纤溶酶原(micro-plasminogen)、微纤溶酶(micro-plasmin)、delta-纤溶酶原、delta-纤溶酶(delta-plasmin)、纤维蛋白溶酶原激活剂、tPA和uPA。在一些具体实施方案中，所述纤溶抑制剂的拮抗剂为PAI-1、补体C1抑制物、α2抗纤溶酶或α2巨球蛋白的拮抗剂，例如PAI-1、补体C1抑制物、α2抗纤溶酶或α2巨球蛋白的抗体。
在一些具体实施方案中，所述纤溶酶原途径激活剂与一种或多种其它药物和/或治疗方法联合施用，优选地，所述治疗方法包括细胞疗法(例如干细胞疗法)和基因疗法，例如反义RNA、小分子剪接修饰剂。
在一些具体实施方案中，所述纤溶酶原途径激活剂为纤维蛋白溶酶原激活途径的组分，例如纤溶酶原。在一些具体实施方案中，所述纤溶酶原包含或具有与序列2、6、8、10或12所示氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列，并且具有纤溶酶原活性和/或赖氨酸结合活性。在一些实施方案中，所述纤溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基础上，添加、删除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1个氨基酸，并且具有纤溶酶原活性和/或赖氨酸结合活性的蛋白质。在一些具体实施方案中，所述纤溶酶原活性为纤溶酶原的蛋白水解活性。在一些具体实施方案中，所述纤溶酶原为包含纤溶酶原活性片段、并且具有纤溶酶原活性和/或赖氨酸结合活性的蛋白质。在一些具体实施方案中，所述纤溶酶原活性为纤溶酶原的蛋白水解活性。在一些具体实施方案中，所述纤溶酶原活性片段包含或具有纤溶酶原丝氨酸蛋白酶结构域或称纤溶酶原蛋白酶结构域。在一些具体实施方案中，所述纤溶酶原活性片段的氨基酸序列如序列14所示。在一些具体实施方案中，所述纤溶酶原选自Glu-纤溶酶原(人全长纤溶酶原)、Lys-纤溶 酶原(在第76-77位氨基酸之间切割后的人全长纤溶酶原)、小纤溶酶原(包含Kringle 5(K5)和丝氨酸蛋白酶结构域)、微纤溶酶原(包含丝氨酸蛋白酶结构域)、delta-纤溶酶原(包含Kringle 1和丝氨酸蛋白酶结构域)或它们的保留纤溶酶原活性的变体。在一些具体实施方案中，所述纤溶酶原为人全长纤溶酶原、或其仍然保留纤溶酶原活性和/或赖氨酸结合活性的变体或片段。在一些实施方案中，所述纤溶酶原为来自灵长类动物或啮齿类动物的人纤溶酶原直向同系物或其仍然保留纤溶酶原活性和/或赖氨酸结合活性的变体或片段。在一些实施方案中，所述纤溶酶原包含如序列2、6、8、10或12所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述纤溶酶原是人天然纤溶酶原。
在一些实施方案中，所述纤溶酶原途径激活剂，例如纤溶酶原激活途径的组分，例如纤溶酶原与一种或多种其它药物和/或治疗方法联合施用。在一些实施方案中，所述纤溶酶原途径激活剂，例如纤溶酶原激活途径的组分，例如纤溶酶原通过静脉内、肌肉内、鞘内、鼻腔吸入、雾化吸入、滴鼻液或滴眼液形式给药。
在一些实施方案中，所述药物组合物、药物、制剂包含药学上可接受的载体和纤溶酶原途径激活剂，例如纤溶酶原激活途径的组分，例如纤溶酶原。在一些实施方案中，所述试剂盒和制品包含一个或多个容器，所述容器中包含所述药物组合物、药物或制剂。在一些实施方案中，所述试剂盒或制品还包含标签或使用说明书，该标签或使用说明书指示使用纤溶酶原途径激活剂，例如纤溶酶原激活途径的组分，例如纤溶酶原用于上述用途。
在一些实施方案中，所述试剂盒或制品还包含另外的一个或多个容器，该容器中含有一种或多种其他药物。
本发明明确涵盖了属于本发明实施方案之间的技术特征的所有组合，并且这些组合后的技术方案在本申请中已经明确公开，就像上述技术方案已经单独且明确公开一样。另外，本发明还明确涵盖各个实施方案及其要素的之间的组合，该组合后的技术方案在本文中明确公开。
附图简述
图1A-B在正常小鼠脑匀浆液中，纤溶酶原对重组人Pro-BDNF的作用。A为SDS-PAGE成像图片，B为SDS-PAGE条带定量分析结果。结果 显示，在正常小鼠脑匀浆液中，给药纤溶酶原组Pro-BDNF的量明显低于溶媒对照组，差异极显著(***代表P＜0.001)。提示纤溶酶原能够促进正常小鼠脑匀浆中重组人Pro-BDNF裂解。
图2A-B在正常小鼠脑匀浆液中，纤溶酶原对重组人Pro-BDNF的作用。A为Western blot成像图片，B为Western blot中Pro-BDNF条带光密度(OD)值分析结果。结果显示，在正常小鼠脑匀浆液中，给药纤溶酶原组Pro-BDNF的量明显低于溶媒对照组，差异极显著(**代表P＜0.01)。提示纤溶酶原能够促进正常小鼠脑匀浆中重组人Pro-BDNF裂解。
图3A-B在帕金森病模型小鼠脑匀浆液中，纤溶酶原对重组人Pro-BDNF的作用，A为SDS-PAGE成像图片，B为SDS-PAGE条带定量分析结果。结果显示，在帕金森病模型小鼠脑匀浆液中，给药纤溶酶原组Pro-BDNF的量明显低于溶媒对照组，差异极显著(***代表P＜0.001)。提示纤溶酶原能够促进帕金森病模型小鼠脑匀浆中重组人Pro-BDNF裂解。
图4A-C在帕金森病模型小鼠脑匀浆液中，纤溶酶原对重组人Pro-BDNF的作用。A为Western blot成像图片，B为Western blot中Pro-BDNF条带光密度(OD)值分析结果，C为Western blot中BDNF条带光密度(OD)值分析结果。结果显示，在帕金森病模型小鼠脑匀浆液中，给药纤溶酶原组Pro-BDNF的量明显低于溶媒对照组，差异显著(*代表P＜0.05，***表示P＜0.001)；给药纤溶酶原组BDNF的量明显高于溶媒对照组，差异极为显著。提示纤溶酶原能够促进帕金森病模型小鼠脑匀浆液重组人Pro-BDNF裂解和成熟BDNF形成。
图5A-B在阿尔兹海默模型小鼠脑匀浆液中，纤溶酶原对重组人Pro-BDNF的作用。A为SDS-PAGE成像图片，B为SDS-PAGE中Pro-BDNF条带定量分析结果。结果显示，在阿尔兹海默症模型小鼠脑匀浆液中，给药纤溶酶原组Pro-BDNF的量明显低于溶媒对照组，差异极显著(***代表P＜0.001)。提示纤溶酶原能够促进阿尔兹海默症模型小鼠脑匀浆中Pro-BDNF裂解。
图6A-C在阿尔兹海默模型小鼠脑匀浆液中，纤溶酶原对重组人Pro-BDNF的作用，A为Western blot成像图片，B为Western blot中Pro-BDNF条带光密度(OD)值分析结果，C为Western blot中BDNF条带光密度(OD)值分析结果。结果显示，在阿尔兹海默症模型小鼠脑匀浆液中，给药纤溶酶原组Pro-BDNF的量明显低于溶媒对照组，差异极为显著(**代表P＜ 0.01，***表示P＜0.001)；给药纤溶酶原组BDNF的量明显高于溶媒对照组，差异极显著。提示纤溶酶原能够促进阿尔兹海默症模型小鼠脑匀浆液Pro-BDNF裂解和成熟BDNF形成。
图7连续给药纤溶酶原后，ELISA法检测SMNΔ7SMA小鼠脑组织中纤溶酶原含量结果。结果显示，空白对照组野生型小鼠脑组织纤溶酶原水平为1.18±1.54ng/mg；溶媒组小鼠脑组织纤溶酶原水平为1.49±1.59ng/mg，与空白对照组相比，溶媒组小鼠脑组织纤溶酶原水平未见明显变化；给药组SMA转基因小鼠纤溶酶原水平为12.09±5.32ng/mg，约为溶媒组的8倍。提示补充纤溶酶原可以促进SMA疾病条件下血-脑屏障对纤酶原通透性增加，纤溶酶原可通过血-脑屏障，达到脑部。
图8连续给药纤溶酶原后，ELISA法检测SMNΔ7SMA脊髓组织中纤溶酶原含量结果。结果显示，空白对照组野生型小鼠脊髓纤溶酶原水平为8.51±9.51ng/mg。溶媒组SMA转基因小鼠脊髓纤溶酶原水平为19.95±4.06ng/mg，相比于空白对照组稍有增加。正常给药对照组纤溶酶原水平为13.03±7.51ng/mg。给药组SMA转基因小鼠脊髓纤溶酶原水平为62.33±17.37ng/mg，约为溶媒组小鼠的3倍，且给药组和溶媒组两组比较统计分析P值为0.029；约为正常给药对照组的4.8倍，且给药组和正常给药对照组比较统计分析P值为0.026。说明给药纤溶酶原可促进SMA条件下血-脊髓屏障对纤溶酶原通透性增加，纤溶酶原可通过血-脊髓屏障，达到脊髓部位。
图9单次尾静脉注射给予纤溶酶原于LPS诱导的肺炎SMA杂合子小鼠2小时后，脊髓匀浆纤溶酶原水平ELISA检测结果。结果显示，空白对照组小鼠脊髓组织匀浆纤溶酶原水平为2.70±0.74ng/mg；气管滴注LPS后，溶媒组小鼠脊髓组织匀浆纤溶酶原水平为3.17±1.51ng/mg，与空白对照组相比未见明显变化；给药组小鼠补充2.5倍生理剂量水平的纤溶酶原后，纤溶酶原水平为121.16±44.68ng/mg，约为溶媒组小鼠的38.2倍。提示补充纤溶酶原能够促进LPS诱导的肺炎SMA杂合子小鼠血-脊髓屏障对纤溶酶原的通透性增加，该条件下纤溶酶原可通过血-脊髓屏障，进入中枢神经系统。
图10单次尾静脉注射给予纤溶酶原于LPS诱导的肺炎SMA杂合子小鼠2小时后，脊髓匀浆纤溶酶原水平酶底物动力学法检测结果。结果显示，空白对照组小鼠脊髓组织纤溶酶原水平为0.00011±4.51x10 -5U/mg；气 管滴注LPS后，溶媒组小鼠脊髓纤溶酶原水平为0.00010±9.72x10 -6U/mg，与空白对照组相比，未见明显变化；给药组小鼠补充2.5倍生理剂量水平的纤溶酶原后，纤溶酶原水平增加至0.00034±1.04x10 -4U/mg，与溶媒相比，统计分析P值为0.058。提示补充纤溶酶原能够促进LPS诱导的肺炎SMA杂合子小鼠血-脊髓屏障对纤溶酶原的通透性增加，纤溶酶原可通过血-脊髓屏障，在脊髓处聚集。
图11单次尾静脉注射给予纤溶酶原于LPS诱导的肺炎小鼠2小时后，脊髓匀浆纤溶酶原水平ELISA检测结果。脊髓组织匀浆液中纤溶酶原水平ELISA检测结果显示，空白对照组的脊髓组织Plg含量为7.71±0.51ng/mg，溶媒组小鼠脊髓组织Plg含量14.04±3.25ng/mg，气管滴注LPS后，小鼠脊髓纤溶酶原水平有所增加；给药A组小鼠补充50mg/kg(每只小鼠约1mg)的纤溶酶原后，脊髓组织纤溶酶原水平为85.10±11.59ng/mg，约为溶媒组小鼠的6.1倍；给药B组小鼠补充17mg/kg(每只小鼠约0.34mg)的纤溶酶原后，脊髓组织纤溶酶原水平为77.90±21.39ng/mg，约为溶媒组小鼠的5.5倍；给药C组小鼠补充6mg/kg(每只小鼠约0.1mg)的纤溶酶原后，脊髓组织纤溶酶原水平为64.00±19.63ng/mg，约为溶媒组小鼠的4.6倍。提示1)补充纤溶酶原能够促进LPS诱导的肺炎小鼠血脑屏障对纤溶酶原的通透性增加，纤溶酶原可穿过血脑屏障，在脊髓组织富集；2)纤溶酶原在脊髓中的富集具有剂量依赖效应，在6mg/kg至50mg/kg给药剂量范围内，脊髓中纤溶酶原富集水平随纤溶酶原施予剂量增加而增加。
图12尾静脉注射纤溶酶原于C57肺炎模型小鼠后，不同时间点脊髓组织匀浆液中人纤溶酶原水平ELISA法检测结果。结果显示，假手术+溶媒组小鼠和LPS+溶媒组小鼠未接受纤溶酶原注射，在0、2、6、12和24小时，脊髓组织匀浆液中均未检测到人纤溶酶原。假手术+50mg/kg纤溶酶原组和LPS+50mg/kg纤溶酶原组小鼠接受50mg/kg体重的纤溶酶原注射，注射2小时后脊髓组织匀浆中人纤溶酶原均有显著升高，注射6-12小时后纤溶酶原水平明显降低，24小时基本检测不到人纤溶酶原。LPS+6mg/kg纤溶酶原组小鼠接受6mg/kg体重的纤溶酶原注射，注射2小时后脊髓组织匀浆中检测到纤溶酶原水平显著高于LPS+溶媒组小鼠，显著低于LPS+50mg/kg纤溶酶原组小鼠。该结果表明1)在生理和病理情况下施予纤溶酶原后，可促进纤溶酶原穿过血脑屏障，在脊髓组织中富集；2)静脉注射纤溶酶原于正常小鼠体内，脊髓组织纤溶酶原水平显著增加；3)纤溶酶原在脊髓富集 具有时间依赖效应，先升高，2至12小时逐渐降低，在12至24小时几乎全部完全代谢；4)纤溶酶原在脊髓富集具有剂量依赖效应，施予剂量越高，脊髓组织中纤溶酶原水平越高。
图13尾静脉注射纤溶酶原于C57肺炎模型小鼠后，不同时间点脑组织匀浆液中纤溶酶原水平ELISA法检测结果。结果显示，空白+溶媒组小鼠和LPS+溶媒组小鼠未接受纤溶酶原注射，在0、2、6、12和24小时，脑组织匀浆液中均未检测到人纤溶酶原。空白+50mg/kg纤溶酶原组和LPS+50mg/kg纤溶酶原组小鼠接受50mg/kg体重的纤溶酶原注射，注射2小时后脑组织匀浆中检测到人纤溶酶原均有显著升高，注射6-12小时后纤溶酶原水平明显降低，24小时基本检测不到人纤溶酶原。LPS+6mg/kg纤溶酶原组小鼠接受6mg/kg体重的纤溶酶原注射，注射2小时后脑组织匀浆中检测到纤溶酶原水平显著高于LPS+溶媒组小鼠，显著低于LPS+50mg/kg纤溶酶原组小鼠。该结果表明1)在生理和病理情况下施予纤溶酶原后，可促进纤溶酶原穿过血脑屏障，在脑组织富集；2)静脉注射纤溶酶原于正常小鼠体内，脑组织纤溶酶原水平显著增加；3)纤溶酶原在脑组织富集具有时间依赖效应，先升高，2至12小时逐渐降低，在12至24小时几乎全部完全代谢；4)纤溶酶原在脑组织富集具有剂量依赖效应，施予剂量越高，脑组织中纤溶酶原水平越高。
图14尾静脉注射纤溶酶原于SOD1-G93A小鼠后，不同时间点脊髓组织匀浆液中人纤溶酶原水平ELISA法检测结果。SOD1-G93A小鼠脊髓ELISA水平检测结果显示，尾静脉注射给予50mg/kg和6mg/kg纤溶酶原，SOD1-G93A小鼠脊髓纤溶酶原水平明显增加，且50mg/kg给药组纤溶酶原水平明显高于6mg/kg组。纤溶酶原水平在给药后2小时后逐渐降低，在12至24小时基本代谢完全。
该结果表明1)施予生理剂量水平的纤溶酶原能够穿过SOD1-G93A小鼠血脑屏障，在脊髓组织富集；2)纤溶酶原在脊髓的富集具有剂量依赖效应，纤溶酶原施予剂量越高，富集的越多；3)纤溶酶原在脊髓的富集具有时间依赖效应，先升高，在2至12小时逐渐降低，在12至24小时基本完全代谢。
图15尾静脉注射纤溶酶原于SOD1-G93A小鼠后，不同时间点脑组织匀浆液中纤溶酶原水平ELISA法检测结果。SOD1-G93A小鼠脑ELISA水平检测结果显示，尾静脉注射给予50mg/kg和6mg/kg纤溶酶原，SOD1- G93A小鼠脑组织纤溶酶原水平明显增加，且50mg/kg给药组纤溶酶原水平明显高于6mg/kg给药组。纤溶酶原水平在给药后2小时后逐渐降低，在12至24小时基本代谢完全。该结果表明1)施予生理剂量水平的纤溶酶原能够穿过SOD1-G93A小鼠血脑屏障，在脑组织富集；2)纤溶酶原在脑组织的富集具有剂量依赖效应，纤溶酶原施予剂量越高，富集的越多；3)纤溶酶原在脑组织的富集具有时间依赖效应，先升高，在2至12小时逐渐降低，在12至24小时基本完全代谢。
图16尾静脉注射纤溶酶原于FAD小鼠后，不同时间点脊髓组织匀浆液中纤溶酶原水平ELISA法检测结果。脊髓组织匀浆ELISA水平检测结果显示，尾静脉注射给予50mg/kg和6mg/kg纤溶酶原，FAD小鼠脊髓组织纤溶酶原水平明显增加，且50mg/kg给药组纤溶酶原水平明显高于6mg/kg给药组。纤溶酶原水平在给药后2小时后逐渐降低，在12至24小时基本代谢完全。该结果表明1)施予生理剂量水平的纤溶酶原能够穿过FAD小鼠血脑屏障，在脊髓组织富集；2)纤溶酶原在脊髓组织的富集具有剂量依赖效应，纤溶酶原施予剂量越高，富集的越多；3)纤溶酶原在脊髓组织的富集具有时间依赖效应，先升高，在2至12小时逐渐降低，在12至24小时基本完全代谢。
图17尾静脉注射纤溶酶原于FAD小鼠后，不同时间点脑组织匀浆液中纤溶酶原水平ELISA法检测结果。脑组织匀浆ELISA水平检测结果显示，尾静脉注射给予50mg/kg和6mg/kg纤溶酶原，FAD小鼠脑组织纤溶酶原水平明显增加，且50mg/kg给药组纤溶酶原水平明显高于6mg/kg给药组。纤溶酶原水平在给药后2小时后逐渐降低，在12至24小时基本代谢完全。该结果表明1)施予生理剂量水平的纤溶酶原能够穿过FAD小鼠血脑屏障，在脑组织富集；2)纤溶酶原在脑组织的富集具有剂量依赖效应，纤溶酶原施予剂量越高，富集的越多；3)纤溶酶原在脑组织的富集具有时间依赖效应，先升高，在2至12小时逐渐降低，在12至24小时基本完全代谢。
图18尾静脉注射纤溶酶原于SOD1-G93A小鼠后，脊髓組織BDNF基因mRNA PCR检测。结果显示，给药组小鼠脊髓组织BDNF基因转录水平明显高于溶媒组，且统计差异P值为0.05。表明纤溶酶原能够促进SOD1-G93A小鼠脊髓组织中BDNF基因转录。
发明详述
纤维蛋白溶解系统(Fibrinolytic system)也称纤溶系统，为参与纤维蛋白溶解(纤溶)过程的一系列化学物质组成的系统，主要包括纤维蛋白溶解酶原(纤溶酶原)、纤溶酶、纤溶酶原激活物、纤溶抑制剂。纤溶酶原激活物包括组织型纤溶酶原激活物(t-PA)和尿激酶型纤溶酶原激活物(u-PA)。t-PA是一种丝氨酸蛋白酶，由血管内皮细胞合成。t-PA激活纤溶酶原，此过程主要在纤维蛋白上进行；尿激酶型纤溶酶原激活物(u-PA)由肾小管上皮细胞和血管内皮细胞产生，可以直接激活纤溶酶原而不需要纤维蛋白作为辅因子。纤溶酶原(PLG)由肝脏合成，当血液凝固时，PLG大量吸附在纤维蛋白网上，在t-PA或u-PA的作用下，被激活为纤溶酶，促使纤维蛋白溶解。纤溶酶(PL)是一种丝氨酸蛋白酶，作用如下：降解纤维蛋白和纤维蛋白原；水解多种凝血因子Ⅴ、Ⅷ、Ⅹ、Ⅶ、Ⅺ、Ⅱ等；使纤溶酶原转变为纤溶酶；水解补体等。纤溶抑制物：包括纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)和α2抗纤溶酶(α2-AP)。PAI主要有PAI-1和PAI-2两种形式，能特异性与t-PA以1：1比例结合，从而使其失活，同时激活PLG。α2-AP由肝脏合成，与PL以1：1比例结合形成复合物，抑制PL活性；FⅩⅢ使α2-AP以共价键与纤维蛋白结合，减弱了纤维蛋白对PL作用的敏感性。体内抑制纤溶系统活性的物质：PAI-1，补体C1抑制物；α2抗纤溶酶；α2巨球蛋白。
本发明“纤维蛋白溶酶原途径激活剂”或“纤溶酶原途径激活剂”术语涵盖纤维蛋白溶酶原激活途径的组分、能够直接激活纤维蛋白溶酶原或通过激活纤维蛋白溶酶原激活途径上游组分而间接激活纤维蛋白溶酶原的化合物、模拟纤维蛋白溶酶原或纤维蛋白溶酶之活性的化合物、能够上调纤维蛋白溶酶原或纤维蛋白溶酶原激活剂表达的化合物、纤维蛋白溶酶原类似物、纤维蛋白溶酶类似物、tPA或uPA类似物和纤溶抑制剂的拮抗剂。
本发明的术语“纤维蛋白溶酶原激活途径的组分”或“纤溶酶原激活途径的组分”涵盖：
1.纤维蛋白溶酶原、Lys-纤维蛋白溶酶原、Glu-纤维蛋白溶酶原、微纤溶酶原(micro-plasminogen)、delta-纤溶酶原；它们的变体或类似物；
2.纤维蛋白溶酶以及它们的变体或类似物；和
3.纤维蛋白溶酶原激活剂，例如tPA和uPA以及包含一个或多个tPA或uPA的结构域(如一个或多个kringle结构域和蛋白水解结构域)的tPA或uPA变体和类似物。
所述的“纤溶抑制剂的拮抗剂”术语涵盖PAI-1、补体C1抑制物、α2抗纤溶酶或α2巨球蛋白的拮抗剂，例如PAI-1、补体C1抑制物、α2抗纤溶酶或α2巨球蛋白的抗体。
上述纤维蛋白溶酶原、纤维蛋白溶酶、tPA和uPA的“变体”包括所有天然存在的人类遗传变体以及这些蛋白质的其他哺乳动物形式，以及通过添加、删除和/或取代例如1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1个氨基酸、仍然具有纤维蛋白溶酶原、纤维蛋白溶酶、tPA或uPA活性的蛋白质。例如，纤维蛋白溶酶原、纤维蛋白溶酶、tPA和uPA的“变体”包括通过例如1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1个保守性氨基酸取代获得的这些蛋白质的突变变体。
本发明的“纤溶酶原变体”涵盖包含或具有与序列2、6、8、10或12所示氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且具有纤溶酶原活性和/或赖氨酸结合活性的蛋白质。例如本发明的“纤溶酶原变体”可以是在序列2、6、8、10或12的基础上，添加、删除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1个氨基酸，并且仍然具有纤溶酶原活性和/或赖氨酸结合活性的蛋白质。具体地，本发明纤溶酶原变体包括所有天然存在的人类遗传变体以及这些蛋白质的其他哺乳动物形式，以及通过保守性氨基酸取代例如1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1个氨基酸获得的这些蛋白质的突变变体。
本发明的纤溶酶原可以为来自灵长类动物或啮齿类动物的人纤溶酶原直向同系物或其仍然保留纤溶酶原活性和/或赖氨酸结合活性的变体，例如序列2、6、8、10或12所示的纤溶酶原，例如序列2所示的人天然纤溶酶原。
上述纤维蛋白溶酶原、纤维蛋白溶酶、tPA和uPA的“类似物”包括分别提供与纤维蛋白溶酶原、纤维蛋白溶酶、tPA或uPA基本相似的作用的化合物。
上述纤维蛋白溶酶原、纤维蛋白溶酶、tPA和uPA的“变体”和“类似物”涵盖包含一个或多个结构域(例如一个或多个kringle结构域和蛋白水解结构域)的纤维蛋白溶酶原、纤维蛋白溶酶、tPA和uPA的“变体”和“类似物”。例如，纤维蛋白溶酶原的“变体”和“类似物”涵盖包含一个或多个纤溶酶原结构域(例如一个或多个kringle(k)结构域和蛋白水解结构域(或称丝氨酸蛋白酶结构域，或称纤溶酶原蛋白酶结构域)的纤维蛋白溶酶原变体和类似物，例如小纤维蛋白溶酶原(mini-plasminogen)。纤维蛋白溶酶的“变体”和“类似物”涵盖包含一个或多个纤维蛋白溶酶结构域(例如一个或多个kringle结构域和蛋白水解结构域)的纤维蛋白溶酶“变体”和“类似物”，例如小纤维蛋白溶酶(mini-plasmin)和δ-纤维蛋白溶酶(delta-plasmin)。
上述纤维蛋白溶酶原、纤维蛋白溶酶、tPA或uPA的“变体”或“类似物”是否分别具有纤维蛋白溶酶原、纤维蛋白溶酶、tPA或uPA的活性，或者是否分别提供与纤维蛋白溶酶原、纤维蛋白溶酶、tPA或uPA基本相似的作用可以通过本领域已知方法进行检测，例如，通过基于酶谱法(enzymography)、ELISA(酶联免疫吸附测定)和FACS(荧光激活细胞分选方法)通过激活的纤维蛋白溶酶活性水平来衡量，例如可以参照选自如下文献中记载的方法测量：Ny，A.，Leonardsson，G.，Hagglund，A.C，Hagglof，P.，Ploplis，V.A.，Carmeliet，P.and Ny，T.(1999).Ovulation inplasminogen-deficient mice.Endocrinology 140，5030-5035；Silverstein RL,Leung LL,Harpel PC,Nachman RL(November 1984)."Complex formation of platelet thrombospondin with plasminogen.Modulation of activation by tissue activator".J.Clin.Invest.74(5):1625–33；Gravanis I,Tsirka SE(February 2008)."Tissue-type plasminogen activator as a therapeutic target in stroke".Expert Opinion on Therapeutic Targets.12(2):159–70；Geiger M,Huber K,Wojta J,Stingl L,Espana F,Griffin JH,Binder BR(Aug 1989)."Complex formation between urokinase and plasma protein C inhibitor in vitro and in vivo".Blood.74(2):722–8.
在本发明的一些实施方案中，本发明的“纤维蛋白溶酶原激活途径的组分”为纤溶酶原，选自Glu-纤溶酶原、Lys-纤溶酶原、小纤溶酶原、微纤溶 酶原、delta-纤溶酶原或它们的保留纤溶酶原活性的变体。在一些实施方案中，所述纤溶酶原为天然或合成的人纤溶酶原、或其仍然保留纤溶酶原活性和/或赖氨酸结合活性的保守突变变体或其片段。在一些实施方案中，所述纤溶酶原为来自灵长类动物或啮齿类动物的人纤溶酶原直向同系物或其仍然保留纤溶酶原活性和/或赖氨酸结合活性的保守突变变体或其片段。在一些实施方案中，所述纤溶酶原的氨基酸序列包含或具有如序列2、6、8、10或12所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述纤溶酶原是人全长纤溶酶原。在一些实施方案中，所述纤溶酶原是如序列2所示的人全长纤溶酶原。
“能够直接激活纤维蛋白溶酶原或通过激活纤维蛋白溶酶原激活途径上游组分而间接激活纤维蛋白溶酶原的化合物”指能够直接激活纤维蛋白溶酶原或通过激活纤维蛋白溶酶原激活途径上游组分而间接激活纤维蛋白溶酶原的任何化合物，例如tPA、uPA、链激酶、沙芦普酶、阿替普酶、瑞替普酶、替奈普酶、阿尼普酶、孟替普酶、拉诺替普酶、帕米普酶、葡激酶。
本发明“纤溶抑制剂的拮抗剂”为拮抗、减弱、封闭、阻止纤溶抑制剂作用的化合物。所述纤溶抑制剂例如PAI-1、补体C1抑制物、α2抗纤溶酶和α2巨球蛋白。所述拮抗剂例如PAI-1、补体C1抑制物、α2抗纤溶酶或α2巨球蛋白的抗体，或阻断或下调例如PAI-1、补体C1抑制物、α2抗纤溶酶或α2巨球蛋白表达的反义RNA或小RNA，或占据PAI-1、补体C1抑制物、α2抗纤溶酶或α2巨球蛋白的结合位点但无PAI-1、补体C1抑制物、α2抗纤溶酶或α2巨球蛋白功能的化合物”，或封闭PAI-1、补体C1抑制物、α2抗纤溶酶或α2巨球蛋白的结合结构域和/或活性结构域的化合物。
纤溶酶是纤溶酶原激活系统(PA系统)的关键组分。它是一种广谱的蛋白酶，能够水解细胞外基质(ECM)的几个组分，包括纤维蛋白、明胶、纤连蛋白、层粘连蛋白和蛋白聚糖。此外，纤溶酶能将一些金属蛋白酶前体(pro-MMPs)激活形成具有活性的金属蛋白酶(MMPs)。因此纤溶酶被认为是胞外蛋白水解作用的一个重要的上游调节物。纤溶酶是由纤溶酶原通过两种生理性的PAs：组织型纤溶酶原激活剂(tPA)或尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)蛋白水解形成的。由于纤溶酶原在血浆和其他体液中相对水平较高，传统上认为PA系统的调节主要通过PAs的合成和活性水平实现。PA系统组分的合成受不同因素严格调节，如激素、生长因子和细胞因子。此外，还存在纤溶酶和PAs的特定生理抑制剂。纤溶酶的主要抑制 剂是α2-抗纤溶酶(α2-antiplasmin)。PAs的活性同时被uPA和tPA的纤溶酶原激活剂抑制剂-1(PAI-1)抑制以及主要抑制uPA的溶酶原激活剂抑制剂-2(PAI-2)调节。某些细胞表面具有直接水解活性的uPA特异性细胞表面受体(uPAR)。
纤溶酶原是一个单链糖蛋白，由791个氨基酸组成，分子量约为92kDa。纤溶酶原主要在肝脏合成，大量存在于胞外液中。血浆中纤溶酶原含量约为2μM。因此纤溶酶原是组织和体液中蛋白质水解活性的一个巨大的潜在来源。纤溶酶原存在两种分子形式：谷氨酸-纤溶酶原(Glu-plasminogen)和赖氨酸-纤溶酶原(Lys-plasminogen)。天然分泌和未裂解形式的纤溶酶原具有一个氨基末端(N-末端)谷氨酸，因此被称为谷氨酸-纤溶酶原。然而，在纤溶酶存在时，谷氨酸-纤溶酶原在Lys76-Lys77处水解成为赖氨酸-纤溶酶原。与谷氨酸-纤溶酶原相比，赖氨酸-纤溶酶原与纤维蛋白具有更高的亲和力，并可以更高的速率被PAs激活。这两种形式的纤溶酶原的Arg560-Val561肽键可被uPA或tPA切割，导致二硫键连接的双链蛋白酶纤溶酶的形成。纤溶酶原的氨基末端部分包含五个同源三环，即所谓的kringles，羧基末端部分包含蛋白酶结构域。一些kringles含有介导纤溶酶原与纤维蛋白及其抑制剂α2-AP特异性相互作用的赖氨酸结合位点。最新发现一个纤溶酶原为38kDa的片段，其中包括kringles1-4，是血管生成的有效抑制剂。这个片段被命名为血管抑素，可通过几个蛋白酶水解纤溶酶原产生。
纤溶酶的主要底物是纤维蛋白，纤维蛋白的溶解是预防病理性血栓形成的关键。纤溶酶还具有对ECM几个组分的底物特异性，包括层粘连蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖和明胶，表明纤溶酶在ECM重建中也起着重要作用。间接地，纤溶酶还可以通过转化某些蛋白酶前体为活性蛋白酶来降解ECM的其他组分，包括MMP-1，MMP-2，MMP-3和MMP-9。因此，有人提出，纤溶酶可能是细胞外蛋白水解的一个重要的上游调节器。此外，纤溶酶具有激活某些潜在形式的生长因子的能力。在体外，纤溶酶还能水解补体系统的组分并释放趋化补体片段。
“纤溶酶”是存在于血液中的一种非常重要的酶，能将纤维蛋白凝块水解为纤维蛋白降解产物和D-二聚体。
“纤溶酶原”是纤溶酶的酶原形式，根据swiss prot中的序列，按含有信号肽的天然人源纤溶酶原氨基酸序列(序列4)计算由810个氨基酸组成， 分子量约为90kD，主要在肝脏中合成并能够在血液中循环的糖蛋白，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列3所示。全长的纤溶酶原包含七个结构域：位于C末端的丝氨酸蛋白酶结构域、N末端的Pan Apple(PAp)结构域以及5个Kringle结构域(Kringle1-5)。参照swiss prot中的序列，其信号肽包括残基Met1-Gly19，PAp包括残基Glu20-Val98，Kringle1包括残基Cys103-Cys181，Kringle2包括残基Glu184-Cys262，Kringle3包括残基Cys275-Cys352，Kringle4包括残基Cys377-Cys454，Kringle5包括残基Cys481-Cys560。根据NCBI数据，丝氨酸蛋白酶域包括残基Val581-Arg804。
Glu-纤溶酶原是天然全长的纤溶酶原，由791个氨基酸组成(不含有19个氨基酸的信号肽)，编码该序列的cDNA序列如序列1所示，其氨基酸序列如序列2所示。在体内，还存在一种是从Glu-纤溶酶原的第76-77位氨基酸处水解从而形成的Lys-纤溶酶原，如序列6所示，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列5所示。Delta-纤溶酶原(δ-plasminogen)是全长纤溶酶原缺失了Kringle2-Kringle5结构的片段，仅含有Kringle1和丝氨酸蛋白酶(结构)域(也可称为蛋白水解结构域，或称纤溶酶原蛋白酶结构域)，有文献报道了delta-纤溶酶原的氨基酸序列(序列8)，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列7。小纤溶酶原(Mini-plasminogen)由Kringle5和丝氨酸蛋白酶域组成，有文献报道其包括残基Val443-Asn791(以不含有信号肽的Glu-纤溶酶原序列的Glu残基为起始氨基酸)，其氨基酸序列如序列10所示，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列9所示。而微纤溶酶原(Micro-plasminogen)仅含有丝氨酸蛋白酶结构域，有文献报道其氨基酸序列包括残基Ala543-Asn791(以不含有信号肽的Glu-纤溶酶原序列的Glu残基为起始氨基酸)，也有专利文献CN102154253A报道其序列包括残基Lys531-Asn791(以不含有信号肽的Glu-纤溶酶原序列的Glu残基为起始氨基酸)，本专利序列参考专利文献CN102154253A，其氨基酸序列如序列12所示，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列11所示。
本发明的“纤溶酶”与“纤维蛋白溶酶”、“纤维蛋白溶解酶”可互换使用，含义相同；“纤溶酶原”与“纤维蛋白溶酶”、“纤维蛋白溶解酶原”可互换使用，含义相同。
在本申请中，所述纤溶酶原“缺乏”的含义或活性为受试者体内纤溶酶原的含量比正常人低，低至足以影响所述受试者的正常生理功能；所述纤 溶酶原“缺失”的含义或活性为受试者体内纤溶酶原的含量显著低于正常人，甚至活性或表达极微，只有通过外源提供才能维持正常生理功能。
本领域技术人员可以理解，本发明纤溶酶原的所有技术方案适用于纤溶酶，因此，本发明描述的技术方案涵盖了纤溶酶原和纤溶酶。在循环过程中，纤溶酶原采用封闭的非活性构象，但当结合至血栓或细胞表面时，在纤溶酶原激活剂(plasminogen activator，PA)的介导下，其转变为呈开放性构象的活性纤溶酶。具有活性的纤溶酶可进一步将纤维蛋白凝块水解为纤维蛋白降解产物和D-二聚体，进而溶解血栓。其中纤溶酶原的PAp结构域包含维持纤溶酶原处于非活性封闭构象的重要决定簇，而KR结构域则能够与存在于受体和底物上的赖氨酸残基结合。已知多种能够作为纤溶酶原激活剂的酶，包括：组织纤溶酶原激活剂(tPA)、尿激酶纤溶酶原激活剂(uPA)、激肽释放酶和凝血因子XII(哈格曼因子)等。
“纤溶酶原活性片段”在本申请中包括1)在纤溶酶原蛋白中，能够与底物中的靶序列结合的活性片段，也称为赖氨酸结合片段，例如包含Kringle 1、Kringle 2、Kringle 3、Kringle 4和/或Kringle 5的片段(所述纤溶酶原结构参见Aisina R B,Mukhametova L I.Structure and function of plasminogen/plasmin system[J].Russian Journal of Bioorganic Chemistry,2014,40(6):590-605所述)；2)在纤溶酶原蛋白中发挥蛋白水解功能的活性片段，例如包含序列14所示的纤溶酶原活性(蛋白水解功能)的片段；3)在纤溶酶原蛋白中，既具有与底物中的靶序列结合活性(赖氨酸结合活性)又具有纤溶酶原活性(蛋白水解功能)的片段。在本申请的一些实施方案中，所述纤溶酶原为包含序列14所示的纤溶酶原活性片段的蛋白质。在本申请的一些实施方案中，所述纤溶酶原为包含Kringle 1、Kringle 2、Kringle 3、Kringle 4和/或Kringle 5的赖氨酸结合片段的蛋白质。在一些实施方案中，本申请的纤溶酶原活性片段包含序列14、与序列14具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列的蛋白质。因此，本发明所述的纤溶酶原包括含有该纤溶酶原活性片段、并且仍然保持该纤溶酶原活性的蛋白。在一些实施方案中，本申请的纤溶酶原包含Kringle 1、Kringle 2、Kringle 3、Kringle 4和/或Kringle 5、或与Kringle 1、Kringle 2、Kringle 3、Kringle 4或Kringle 5具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同源性并且仍然具有赖氨酸结合活性的蛋白质。
目前，对于血液中纤溶酶原及其活性测定方法包括：对组织纤溶酶原激活剂活性的检测(t-PAA)、血浆组织纤溶酶原激活剂抗原的检测(t-PAAg)、对血浆组织纤溶酶原活性的检测(plgA)、血浆组织纤溶酶原抗原的检测(plgAg)、血浆组织纤溶酶原激活剂抑制物活性的检测、血浆组织纤溶酶原激活剂抑制物抗原的检测、血浆纤维蛋白溶酶-抗纤维蛋白溶酶复合物检测(PAP)。其中最常用的检测方法为发色底物法：向受检血浆中加链激酶(SK)和发色底物，受检血浆中的PLG在SK的作用下，转变成PLM，后者作用于发色底物，随后用分光光度计测定，吸光度增加与纤溶酶原活性成正比。此外也可采用免疫化学法、凝胶电泳、免疫比浊法、放射免疫扩散法等对血液中的纤溶酶原活性进行测定。
“直系同源物或直系同系物(ortholog)”指不同物种之间的同源物，既包括蛋白同源物也包括DNA同源物，也称为直向同源物、垂直同源物。其具体指不同物种中由同一祖先基因进化而来的蛋白或基因。本发明的纤溶酶原包括人的天然纤溶酶原，还包括来源于不同物种的、具有纤溶酶原活性的纤溶酶原直系同源物或直系同系物。
“保守取代变体”是指其中一个给定的氨基酸残基改变但不改变蛋白质或酶的整体构象和功能，这包括但不限于以相似特性(如酸性，碱性，疏水性，等)的氨基酸取代亲本蛋白质中氨基酸序列中的氨基酸。具有类似性质的氨基酸是众所周知的。例如，精氨酸、组氨酸和赖氨酸是亲水性的碱性氨基酸并可以互换。同样，异亮氨酸是疏水氨基酸，则可被亮氨酸，蛋氨酸或缬氨酸替换。因此，相似功能的两个蛋白或氨基酸序列的相似性可能会不同。例如，基于MEGALIGN算法的70％至99％的相似度(同一性)。“保守取代变体”还包括通过BLAST或FASTA算法确定具有60％以上的氨基酸同一性的多肽或酶，若能达75％以上更好，最好能达85％以上，甚至达90％以上为最佳，并且与天然或亲本蛋白质或酶相比具有相同或基本相似的性质或功能。
“分离的”纤溶酶原是指从其天然环境分离和/或回收的纤溶酶原蛋白。在一些实施方案中，所述纤溶酶原会纯化(1)至大于90％、大于95％、或大于98％的纯度(按重量计)，如通过Lowry法所确定的，例如超过99％(按重量计)，(2)至足以通过使用旋转杯序列分析仪获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)至同质性，该同质性是通过使用考马斯蓝或银染在还原性或非还原性条件下的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)确定的。分离的纤溶酶原也包括通过生物工程技术从重组细胞制备，并通过至少一个纯化步骤分离的纤溶酶原。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指任何长度的氨基酸的聚合形式，其可以包括遗传编码的和非遗传编码的氨基酸，化学或生物化学修饰的或衍生化的氨基酸，和具有经修饰的肽主链的多肽。该术语包括融合蛋白，包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白，具有异源和同源前导序列(具有或没有N端甲硫氨酸残基)的融合物；等等。
关于参照多肽序列的“氨基酸序列同一性百分数(％)”定义为在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式实现，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能决定用于比对序列的适宜参数，包括对所比较序列全长实现最大对比需要的任何算法。然而，为了本发明的目的，氨基酸序列同一性百分数值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生的。
在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列A相对于给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：
分数X/Y乘100
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，且其中Y是B中的氨基酸残基的总数。应当领会，在氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等的情况下，A相对于B的％氨基酸序列同一性会不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有明确说明，本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。
术语“个体”、“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，指哺乳动物，包括但不限于鼠(大鼠、小鼠)、非人灵长类、人、犬、猫、有蹄动物(例如马、牛、绵羊、猪、山羊)等。
“治疗有效量”或“有效量”指在对哺乳动物或其它受试者施用以治疗疾病时足以实现对疾病的所述预防和/或治疗的纤溶酶原的量。“治疗有效量”会 根据所使用的纤溶酶原、要治疗的受试者的疾病和/或其症状的严重程度以及年龄、体重等而变化。
术语疾病状态的“治疗”包括抑制或阻止所述疾病状态或其临床症状的发展，或减轻所述疾病状态或症状，使得所述疾病状态或其临床症状暂时或永久性的退去。
本发明纤溶酶原的制备
纤溶酶原可以从自然界分离并纯化用于进一步的治疗用途，也可以通过标准的化学肽合成技术来合成。当通过化学合成多肽时，可以经液相或固相进行合成。固相多肽合成(SPPS)(其中将序列的C末端氨基酸附接于不溶性支持物，接着序贯添加序列中剩余的氨基酸)是适合纤溶酶原化学合成的方法。各种形式的SPPS，诸如Fmoc和Boc可用于合成纤溶酶原。用于固相合成的技术描述于Barany和Solid-Phase Peptide Synthesis；第3-284页于The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology.第2卷：Special Methods in Peptide Synthesis,Part A.,Merrifield,等J.Am.Chem.Soc.,85:2149-2156(1963)；Stewart等,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd ed.Pierce Chem.Co.,Rockford,Ill.(1984)；和Ganesan A.2006Mini Rev.Med Chem.6:3-10和Camarero JA等2005Protein Pept Lett.12:723-8中。简言之，用其上构建有肽链的功能性单元处理小的不溶性多孔珠。在偶联/去保护的重复循环后，将附接的固相游离N末端胺与单个受N保护的氨基酸单元偶联。然后，将此单元去保护，露出可以与别的氨基酸附接的新的N末端胺。肽保持固定在固相上，之后将其切掉。
可以使用标准重组方法来生产本发明的纤溶酶原。例如，将编码纤溶酶原的核酸插入表达载体中，使其与表达载体中的调控序列可操作连接。表达调控序列包括但不限于启动子(例如天然关联的或异源的启动子)、信号序列、增强子元件、和转录终止序列。表达调控可以是载体中的真核启动子系统，所述载体能够转化或转染真核宿主细胞(例如COS或CHO细胞)。一旦将载体掺入合适的宿主中，在适合于核苷酸序列的高水平表达及纤溶酶原的收集和纯化的条件下维持宿主。
合适的表达载体通常在宿主生物体中作为附加体或作为宿主染色体DNA的整合部分复制。通常，表达载体含有选择标志物(例如氨苄青霉素抗 性、潮霉素抗性、四环素抗性、卡那霉素抗性或新霉素抗性)以有助于对外源用期望的DNA序列转化的那些细胞进行检测。
大肠杆菌(Escherichia coli)是可以用于克隆纤溶酶原编码多核苷酸的原核宿主细胞的例子。适合于使用的其它微生物宿主包括杆菌，诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和其他肠杆菌科(enterobacteriaceae)，诸如沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、和各种假单胞菌属(Pseudomonas)物种。在这些原核宿主中，也可以生成表达载体，其通常会含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如复制起点)。另外，会存在许多公知的启动子，诸如乳糖启动子系统，色氨酸(trp)启动子系统，beta-内酰胺酶启动子系统，或来自噬菌体λ的启动子系统。启动子通常会控制表达，任选在操纵基因序列的情况中，并且具有核糖体结合位点序列等，以启动并完成转录和翻译。
其他微生物，诸如酵母也可用于表达。酵母(例如酿酒酵母(S.cerevisiae))和毕赤酵母(Pichia)是合适的酵母宿主细胞的例子，其中合适的载体根据需要具有表达控制序列(例如启动子)、复制起点、终止序列等。典型的启动子包含3-磷酸甘油酸激酶和其它糖分解酶。诱导型酵母启动于特别包括来自醇脱氢酶、异细胞色素C、和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。
在微生物外，哺乳动物细胞(例如在体外细胞培养物中培养的哺乳动物细胞)也可以用于表达并生成本发明的纤溶酶原(例如编码纤溶酶原的多核苷酸)。参见Winnacker,From Genes to Clones,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.(1987)。合适的哺乳动物宿主细胞包括CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、和经转化的B细胞或杂交瘤。用于这些细胞的表达载体可以包含表达控制序列，如复制起点，启动子和增强子(Queen等,Immunol.Rev.89:49(1986))，以及必需的加工信息位点，诸如核糖体结合位点，RNA剪接位点，多聚腺苷酸化位点，和转录终止子序列。合适的表达控制序列的例子是白免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒、巨细胞病毒等衍生的启动子。参见Co等,J.Immunol.148:1149(1992)。
一旦合成(化学或重组方式)，可以依照本领域的标准规程，包括硫酸铵沉淀，亲和柱，柱层析，高效液相层析(HPLC)，凝胶电泳等来纯化本发明所述的纤溶酶原。该纤溶酶原是基本上纯的，例如至少约80％至85％纯的，至少约85％至90％纯的，至少约90％至95％纯的，或98％至99％纯的 或更纯的，例如不含污染物，所述污染物如细胞碎片，除纤溶酶原以外的大分子，等等。
药物配制剂
可以通过将具有所需纯度的纤溶酶原与可选的药用载体，赋形剂，或稳定剂(Remington's Pharmaceutical Sciences,16版，Osol,A.ed.(1980))混合形成冻干制剂或水溶液制备治疗配制剂。可接受的载体、赋形剂、稳定剂在所用剂量及浓度下对受者无毒性，并包括缓冲剂例如磷酸盐，柠檬酸盐及其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化己烷双胺；氯化苄烷铵(benzalkonium chloride)，苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间甲酚)；低分子量多肽(少于约10个残基)；蛋白质如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA；糖类如蔗糖、甘露醇、岩藻糖或山梨醇；成盐反离子如钠；金属复合物(例如锌-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
本发明的配制剂也可含有需治疗的具体病症所需的一种以上的活性化合物，优选活性互补并且相互之间没有副作用的那些。例如，抗高血压的药物，抗心律失常的药物，治疗糖尿病的药物等。
本发明的纤溶酶原可包裹在通过诸如凝聚技术或界面聚合而制备的微胶囊中，例如，可置入在胶质药物传送系统(例如，脂质体，白蛋白微球，微乳剂，纳米颗粒和纳米胶囊)中或置入粗滴乳状液中的羟甲基纤维素或凝胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊中。这些技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)。
用于体内给药的本发明的纤溶酶原必需是无菌的。这可以通过在冷冻干燥和重新配制之前或之后通过除菌滤膜过滤而轻易实现。
本发明的纤溶酶原可制备缓释制剂。缓释制剂的适当实例包括具有一定形状且含有糖蛋白的固体疏水聚合物半通透基质，例如膜或微胶囊。缓释基质实例包括聚酯、水凝胶(如聚(2-羟基乙基-异丁烯酸酯)(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.,15:167-277(1981)；Langer,Chem.Tech.,12:98- 105(1982))或聚(乙烯醇)，聚交酯(美国专利3773919,EP 58,481)，L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman，等，Biopolymers 22:547(1983))，不可降解的乙烯－乙烯乙酸酯(ethylene-vinyl acetate)(Langer，等，出处同上)，或可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物如Lupron DepotTM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和亮氨酰脯氨酸(leuprolide)乙酸酯组成的可注射的微球体)，以及聚D-(-)-3-羟丁酸。聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羟基乙酸能持续释放分子100天以上，而一些水凝胶释放蛋白的时间却较短。可以根据相关机理来设计使蛋白稳定的合理策略。例如，如果发现凝聚的机理是通过硫代二硫键互换而形成分子间S-S键，则可通过修饰巯基残基、从酸性溶液中冻干、控制湿度、采用合适的添加剂、和开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定。
给药和剂量
可以通过不同方式，例如通过静脉内，腹膜内，皮下，颅内，鞘内，动脉内(例如经由颈动脉)，肌内来实现本发明药物组合物的施用。
用于胃肠外施用的制备物包括无菌水性或非水性溶液、悬浮液和乳剂。非水性溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，和可注射有机酯，如油酸乙酯。水性载体包括水、醇性/水性溶液、乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。胃肠外媒介物包含氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、或固定油。静脉内媒介物包含液体和营养补充物、电解质补充物，等等。也可以存在防腐剂和其他添加剂，诸如例如，抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、和惰性气体，等等。
医务人员会基于各种临床因素确定剂量方案。如医学领域中公知的，任一患者的剂量取决于多种因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、要施用的具体化合物、性别、施用次数和路径、总体健康、和同时施用的其它药物。本发明包含纤溶酶原的药物组合物的剂量范围可以为每天约0.0001至2000mg/kg，或约0.001至500mg/kg(例如0.02mg/kg，0.25mg/kg，0.5mg/kg，0.75mg/kg，10mg/kg，50mg/kg等等)受试者体重。例如，剂量可以是1mg/kg体重或50mg/kg体重或在1-50mg/kg的范围，或至少1mg/kg。高于或低于此例示性范围的剂量也涵盖在内，特别是考虑到上述的因素。上述范围中的中间剂量也包含在本发明的范围内。受试者可以每天、隔天、每周或根据通过经验分析确定的任何其它日程表施用此类 剂量。例示性的剂量日程表包括连续几天1-10mg/kg。在本发明的药物施用过程中需要实时评估治疗效果和安全性。
制品或药盒
本发明的一个实施方案涉及一种制品或药盒，其包含可用于治疗由糖尿病引起的心血管病及其相关病症的本发明纤溶酶原或纤溶酶。所述制品优选包括一个容器，标签或包装插页。适当的容器有瓶子，小瓶，注射器等。容器可由各种材料如玻璃或塑料制成。所述容器含有组合物，所述组合物可有效治疗本发明的疾病或病症并具有无菌入口(例如所述容器可为静脉内溶液包或小瓶，其含有可被皮下注射针穿透的塞子的)。所述组合物中至少一种活性剂为纤溶酶原/纤溶酶。所述容器上或所附的标签说明所述组合物用于治疗本发明所述由糖尿病引起的心血管病及其相关病症。所述制品可进一步包含含有可药用缓冲液的第二容器，诸如磷酸盐缓冲的盐水，林格氏溶液以及葡萄糖溶液。其可进一步包含从商业和使用者角度来看所需的其它物质，包括其它缓冲液，稀释剂，过滤物，针和注射器。此外，所述制品包含带有使用说明的包装插页，包括例如指示所述组合物的使用者将纤溶酶原组合物以及治疗伴随的疾病的其它药物给药患者。
实施例
以下所有实施例中使用的人纤溶酶原来自捐赠者血浆，基于文献[1-3]所描述的方法并进行工艺优化，从人捐赠者血浆纯化获得，其中人Lys-纤维蛋白溶酶原(Lys-纤溶酶原)和Glu-纤维蛋白溶酶原(Glu-纤溶酶原)>98％。
实施例1纤溶酶原促进Pro-BDNF在正常小鼠脑匀浆中裂解
取11～12周龄、18-25g的C57BL/6J雄性小鼠4只，处死后取整个脑并称重，按150mg组织/mLPBS分别加入1×PBS(Thermo Fisher，pH7.4；10010-031，4℃下匀浆(1min，3-4次)，匀浆后于4℃离心(12000rpm，20min)，取上清液即脑匀浆液置于新的EP管中。
取Eppendorf(EP)管分别设为①空白组、②空白对照组、③溶媒对照组、④纤溶酶原组，各组设置5个平行。空白对照组加入21.5μL生理盐水、4.6μL纤溶酶原溶液(2mg/mL)、23.9μL小鼠脑匀浆；溶媒对照组加入21.5μL Pro-BDNF(上海强耀，定制表达人Pro-BDNF，1.0mg/mL)、4.6μL溶媒溶液(柠檬酸-柠檬酸钠溶液)、23.9μL小鼠脑匀浆；纤溶酶原组加入21.μL Pro-BDNF(1.0mg/mL)、4.6μL纤溶酶原溶液(2mg/mL)、 23.9μL小鼠脑匀浆。各组样品加好后，37℃温育6h后分别加入100μL0.1％三氟乙酸溶液终止反应。
根据SDS-PAGE配胶说明制备12％凝胶。各组样品分别与4×上样缓冲液(TaKaRa，e2139)以体积比为3:1混匀后，100℃加热5min，冷却后离心2min，然后取20μL上样。电泳条件为30V跑30min，然后100V电泳至胶底。电泳结束后剥凝胶于1‰考马斯亮蓝染色液(1g考马斯亮蓝R250溶于1000ml乙醇：冰醋酸：纯化水体积比为5:2:13的混合液中)染色30min，再用脱色液(纯化水：冰醋酸：无水乙醇＝17:2:1体积比混合)脱色至干净。凝胶在生物分子成像仪下拍照并定量扫描分析。
BDNF是一类分子量为12.3kD的碱性蛋白质，由119个氨基酸残基构成，并含有3对二硫键，在体内以二聚体的形式存在，以BDNF前体的形式合成，BDNF前体(Pro-BDNF)可经酶解作用裂解形成成熟的BDNF。文献报道Pro-BDNF与其裂解形成的成熟的BDNF具有相反的作用。Pro-BDNF促进神经细胞凋亡，降低神经突触可塑性[1]。成熟的BDNF及其受体广泛分布于中枢神经系统内，在中枢神经系统发育过程中，对神经元存活、分化、生长发育起重要作用，并能防止神经元受损伤死亡，改善神经元的病理状态，促进受损伤神经元再生及分化等生物效应，而且也是成熟的中枢及周围神经系统的神经元维持生存及正常生理功能所必须的[2]。
结果显示，在正常小鼠脑匀浆液中，纤溶酶原组Pro-BDNF的量明显低于溶媒对照组，差异极显著(***代表P＜0.001)(图1)。提示纤溶酶原能够促进正常小鼠脑匀浆中Pro-BDNF裂解。
实施例2纤溶酶原促进Pro-BDNF在正常小鼠脑匀浆中裂解形成成熟的BDNF
取11～12周龄、18-25g的C57BL/6J雄性小鼠4只，处死后取整个脑部并称重，按150mg组织/mLPBS分别加入1×PBS(Thermo Fisher，pH7.4；10010-031，4℃下匀浆(1min，3-4次)，匀浆后于4℃离心(12000rpm，20min)，取上清液即脑匀浆液置于新的EP管中。
取Eppendorf(EP)管分别设为①空白组、②空白对照组、③溶媒对照组、④纤溶酶原组，各组设置5个平行。空白对照组加入21.5μL生理盐水、4.6μL纤溶酶原溶液(2mg/mL)、23.9μL小鼠脑匀浆；溶媒对照组加入21.5μL Pro-BDNF(上海强耀，定制表达人Pro-BDNF，1.0mg/mL)、4.6μL溶媒溶液(柠檬酸-柠檬酸钠溶液)、23.9μL小鼠脑匀浆；纤溶酶原 组加入21.μL Pro-BDNF(1.0mg/mL)、4.6μL纤溶酶原溶液(2mg/mL)、23.9μL小鼠脑匀浆。各组样品加好后，37℃温育6h后分别加入100μL0.01％三氟乙酸溶液终止反应。
根据SDS-PAGE配胶说明制备10％凝胶。各组样品分别与4×上样缓冲液(TaKaRa，e2139)以体积比为3:1混匀后，100℃加热5min，冷却后离心2min，然后取20μL上样。电泳条件为30V跑45min，然后100V电泳至胶底。电泳结束后剥取凝胶转移到活化的PVDF膜(GE，A29433753)上，电泳条件为15V，2.5h。转移后的PVDF膜浸泡在封闭液(5％脱脂乳液)中于4℃冰箱中封闭过夜，TBST(0.01M Tris-NaCl，pH7.6缓冲液)洗4次后，加入兔抗人BDNF抗体(Boster Biological Technology,PB9075)室温孵育3h，TBST洗4次后，加入山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam，ab6721)二抗室温孵育1h，TBST洗4次后，将PVDF膜放于干净成像板上，加入Immobilon Western HRP Substrate(MILLIPORE，WBKLS0100)显色，在生物分子成像仪下拍照并用Image J定量分析。
结果显示，在正常小鼠脑匀浆液中，纤溶酶原组Pro-BDNF的量明显低于溶媒对照组，差异极显著(**代表P＜0.01)(图2)。提示纤溶酶原能够促进正常小鼠脑匀浆中Pro-BDNF裂解。
实施例3纤溶酶原促进Pro-BDNF在帕金森病模型小鼠脑匀浆中裂解
取11～12周龄、18-25g的C57BL/6J雄性小鼠4只。造模时间定在每日早上9点，空白对照组腹腔注射200μL生理盐水；模型组腹腔注射35mg/kg/只5mg/mL MPTP溶液，连续注射5天，建立帕金森病模型 [5]。MPTP溶液配制：取45mg MPTP(sigma，M0896)溶解在9mL生理盐水溶液中，配制最终浓度为5mg/mL。造模完成后即造模第6天，所有小鼠进行旷场实验，鉴定造模成功。所有小鼠处死后取整个脑部并称重，按150mg组织/mLPBS分别加入1×PBS(Thermo Fisher，pH7.4；10010-031，4℃下匀浆(1min，3-4次)，匀浆后于4℃离心(12000rpm，20min)，取上清液即脑匀浆液置于新的EP管中。
取Eppendorf(EP)管分别设为①空白组、②空白对照组、③溶媒对照组、④纤溶酶原组，各组设置5个平行。空白对照组加入21.5μL生理盐水、4.6μL纤溶酶原溶液(2mg/mL)、23.9μL小鼠脑匀浆；溶媒对照组加入21.5μL Pro-BDNF(上海强耀，定制表达人Pro-BDNF，1.0mg/mL)、4.6μL溶媒溶液(柠檬酸-柠檬酸钠溶液)、23.9μL小鼠脑匀浆；纤溶酶原 组加入21.μL Pro-BDNF(1.0mg/mL)、4.6μL纤溶酶原溶液(2mg/mL)、23.9μL小鼠脑匀浆。各组样品加好后，37℃温育6h后分别加入100μL0.1％三氟乙酸溶液终止反应。
根据SDS-PAGE配胶说明制备12％凝胶。各组样品分别与4×上样缓冲液(TaKaRa，e2139)以体积比为3:1混匀后，100℃加热5min，冷却后离心2min，然后取20μL上样。电泳条件为30V跑45min，然后100V电泳至胶底。电泳结束后剥凝胶于1‰考马斯亮蓝染色液(1g考马斯亮蓝R250溶于1000ml乙醇：冰醋酸：纯化水体积比为5:2:13的混合液中)染色30min，再用脱色液(纯化水：冰醋酸：无水乙醇＝17:2:1体积比混合)脱色至干净。凝胶在生物分子成像仪下拍照并定量扫描分析。
结果显示，在帕金森病模型小鼠脑匀浆液中，纤溶酶原组Pro-BDNF的量明显低于溶媒对照组，差异极显著(***代表P＜0.001)(图3)。提示纤溶酶原能够促进帕金森病模型小鼠脑匀浆中Pro-BDNF裂解。
实施例4纤溶酶原促进Pro-BDNF在帕金森病模型小鼠脑匀浆中裂解形成成熟的BDNF
取11～12周龄、18-25g的C57BL/6J雄性小鼠8只，造模前1天称重，根据体重随机分为2组，空白对照组4只，模型组4只。造模时间定在每日早上9点，空白对照组腹腔注射200μL生理盐水；模型组腹腔注射35mg/kg/只5mg/mL MPTP溶液，连续注射5天，建立帕金森病模型 [5]。MPTP溶液配制：取45mg MPTP(sigma，M0896)溶解在9mL生理盐水溶液中，配制最终浓度为5mg/mL。造模完成后即造模第6天，所有小鼠进行旷场实验，鉴定造模成功。所有小鼠处死后取整个脑部并称重，按150mg组织/mLPBS分别加入1×PBS(Thermo Fisher，pH7.4；10010-031，4℃下匀浆(1min，3-4次)，匀浆后于4℃离心(12000rpm，20min)，取上清液即脑匀浆液置于新的EP管中。
取Eppendorf(EP)管分别设为①空白组、②空白对照组、③溶媒对照组、④纤溶酶原组，各组设置5个平行。空白对照组加入21.5μL生理盐水、4.6μL纤溶酶原溶液(2mg/mL)、23.9μL小鼠脑匀浆；溶媒对照组加入21.5μL Pro-BDNF(上海强耀，定制表达人Pro-BDNF，1.0mg/mL)、4.6μL溶媒溶液(柠檬酸-柠檬酸钠溶液)、23.9μL小鼠脑匀浆；纤溶酶原组加入21.μL Pro-BDNF(1.0mg/mL)、4.6μL纤溶酶原溶液(2mg/mL)、 23.9μL小鼠脑匀浆。各组样品加好后，37℃温育6h后分别加入100μL0.1％三氟乙酸溶液终止反应。
根据SDS-PAGE配胶说明制备10％凝胶。各组样品分别与4×上样缓冲液(TaKaRa，e2139)以体积比为3:1混匀后，100℃加热5min，冷却后离心2min，然后取20μL上样。电泳条件为30V跑45min，然后100V电泳至胶底。电泳结束后剥取凝胶转移到活化的PVDF膜(GE，A29433753)上，电泳条件为15V，2.5h。转移后的PVDF膜浸泡在封闭液(5％脱脂乳液)中于4℃冰箱中封闭过夜，TBST(0.01M Tris-NaCl，pH7.6缓冲液)洗4次后，加入兔抗人BDNF抗体(Boster Biological Technology,PB9075)室温孵育3h，TBST洗4次后，加入山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam，ab6721)二抗室温孵育1h，TBST洗4次后，将PVDF膜放于干净成像板上，加入Immobilon Western HRP Substrate(MILLIPORE，WBKLS0100)显色，在生物分子成像仪下拍照并用Image J定量分析。
结果显示，在帕金森病模型小鼠脑匀浆液中，纤溶酶原组Pro-BDNF的量明显低于溶媒对照组，差异显著(*代表P＜0.05，***表示P＜0.001)；纤溶酶原组BDNF的量明显高于溶媒对照组，差异极为显著(图4)。提示纤溶酶原能够促进帕金森病模型小鼠脑匀浆液Pro-BDNF裂解和成熟BDNF形成。
实施例5在阿尔兹海默症模型小鼠脑匀浆液中，纤溶酶原促进Pro-BDNF裂解
选取11周龄B6SJLTg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax(FAD)(Stock Number：034840)(简称FAD)小鼠各4只，处死后取整个脑组织，称重后置于Eppendorf(EP)管中，按150mg组织/mLPBS分别加入1×PBS(Thermo Fisher，pH7.4；10010-031)，4℃下匀浆(1min/次，3-4次)，匀浆后于4℃离心(12000rpm，15min)，取上清脑匀浆液于新的EP管中。
取Eppendorf(EP)管分别设为①空白对照组、②溶媒对照组、③纤溶酶原组，各组设置5个平行。空白对照组加入21.5μL生理盐水、4.6μL纤溶酶原溶液(2mg/mL)、23.9μL小鼠脑匀浆液；溶媒对照组加入21.5μL Aβ40(上海强耀，04010011521，1.0mg/mL)、4.6μL溶媒溶液(柠檬酸-柠檬酸钠溶液)、23.9μL小鼠脑匀浆液；纤溶酶原组加入21.5mL Aβ40(1.0mg/mL)、4.6μL纤溶酶原溶液(2mg/mL)、23.9μL小鼠脑匀浆液。 各组样品加好后，37℃温育6h后分别加入50μL 0.1％三氟乙酸溶液终止反应。
根据SDS-PAGE配胶说明制备12％凝胶。各组样品分别与4×上样缓冲液(TaKaRa，e2139)以体积比为3:1混匀后，100℃加热5min，冷却后离心2min，然后取20μL上样。电泳条件为30V跑45min，然后100V电泳至胶底。电泳结束后剥凝胶于1‰考马斯亮蓝染色液(1g考马斯亮蓝R250溶于1000ml乙醇：冰醋酸：纯化水体积比为5:2:13的混合液中)染色30min，再用脱色液(纯化水：冰醋酸：无水乙醇＝17:2:1体积比混合)脱色至干净。凝胶在生物分子成像仪下拍照并定量扫描分析。
结果显示，在阿尔兹海默症模型小鼠脑匀浆液中，纤溶酶原组Pro-BDNF的量明显低于溶媒对照组，差异极显著(***代表P＜0.001)(图5)。提示纤溶酶原能够促进阿尔兹海默症模型小鼠脑匀浆中Pro-BDNF裂解。
实施例6在阿尔兹海默症模型小鼠脑匀浆液中，纤溶酶原促进Pro-BDNF裂解形成成熟的BDNF
选取11周龄B6SJLTg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax(FAD)(Stock Number：034840)(简称FAD)小鼠各4只，处死后取整个脑组织，称重后置于Eppendorf(EP)管中，按150mg组织/mLPBS分别加入1×PBS(Thermo Fisher，pH7.4；10010-031)，4℃下匀浆(1min/次，3-4次)，匀浆后于4℃离心(12000rpm，15min)，取上清脑匀浆液于新的EP管中。
取Eppendorf(EP)管分别设为①空白对照组、②溶媒对照组、③纤溶酶原组，各组设置5个平行。空白对照组加入21.5μL生理盐水、4.6μL纤溶酶原溶液(2mg/mL)、23.9μL小鼠脑匀浆液；溶媒对照组加入21.5μL Aβ40(上海强耀，04010011521，1.0mg/mL)、4.6μL溶媒溶液(柠檬酸-柠檬酸钠溶液)、23.9μL小鼠脑匀浆液；纤溶酶原组加入21.5mL Aβ40(1.0mg/mL)、4.6μL纤溶酶原溶液(2mg/mL)、23.9μL小鼠脑匀浆液。各组样品加好后，37℃温育6h后分别加入50μL 0.01％三氟乙酸溶液终止反应。
根据SDS-PAGE配胶说明制备12％凝胶。各组样品分别与4×上样缓冲液(TaKaRa，e2139)以体积比为3:1混匀后，100℃加热5min，冷却后离心2min，然后取20μL上样。电泳条件为30V跑45min，然后100V电泳 至胶底。电泳结束后剥取凝胶转移到PVDF膜(GE，A29433753)上，电泳条件为15V，2.5h。转移后的PVDF膜浸泡在封闭液(5％脱脂乳液)中于4℃冰箱中封闭过夜，TBST(0.01M Tris-NaCl，pH7.6缓冲液)洗4次后，加入兔抗人BDNF抗体(Boster Biological Technology,PB9075)室温孵育3h，TBST洗4次后，加入山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam，ab6721)二抗室温孵育1h，TBST洗4次后，将PVDF膜放于干净成像板上，加入Immobilon Western HRP Substrate(MILLIPORE，WBKLS0100)显色，在生物分子成像仪下拍照并用Image J定量分析条带光密度。
结果显示，在阿尔兹海默症模型小鼠脑匀浆液中，纤溶酶原组Pro-BDNF的量明显低于溶媒对照组，差异极为显著(**代表P＜0.01，***表示P＜0.001)；纤溶酶原组BDNF的量明显高于溶媒对照组，差异极显著(图6)。提示纤溶酶原能够促进阿尔兹海默症模型小鼠脑匀浆液Pro-BDNF裂解和成熟BDNF形成。
实施例7给予纤溶酶原促进SMA小鼠脑组织中纤溶酶原水平增加
取出生3或7天的FVB.Cg-Grm7Tg(SMN2)89Ahmb Smn1tm1MsdTg(SMN2*delta7)4299Ahmb/J基因突变小鼠(简称SMNΔ7SMA小鼠)(购自Jackson Laboratory实验室，谱系号：005025)8只和同龄的野生型小鼠4只，SMNΔ7SMA小鼠随机分为溶媒组和给药组，每组各4只，4只野生型小鼠作为空白对照组。给药组小鼠按照60mg/kg/天腹腔注射纤溶酶原，浓度为10mg/ml，溶媒组和空白对照组小鼠按照6ml/kg/天腹腔注射溶媒，均给药到出生后11天。在小鼠出生后11天给药2小时后处死解剖所有小鼠，取材部分脑组织，匀浆后按照Human Plasminogen ELISA Kit(厂家：AssayMax，货号：EP1200-1)说明书操作进行检测。以人纤溶酶原工作标准品作为内标，对每个样本的浓度进行浓度标定，标定后的浓度除以总蛋白浓度计算出每个样本单位总蛋白量中纤溶酶原的量并进行统计分析。
SMNΔ7SMA小鼠的SMN1基因纯合突变并且表达人的SMN2基因，该小鼠临床及病理表现类似于人类脊髓性肌萎缩(SMA)。
结果显示，空白对照组野生型小鼠脑组织纤溶酶原水平为1.18±1.54ng/mg；溶媒组小鼠脑组织纤溶酶原水平为1.49±1.59ng/mg，与空白对照组相比，溶媒组小鼠脑组织纤溶酶原水平未见明显变化；给药组SMA转基因小鼠纤溶酶原水平为12.09±5.32ng/mg，约为溶媒组的8倍(图7)。 提示补充纤溶酶原可以促进SMA疾病条件下血-脑屏障对纤酶原通透性增加，纤溶酶原可通过血-脑屏障，达到脑部。
实施例8给予纤溶酶原促进SMA小鼠脊髓组织中纤溶酶原水平增加
取出生3或7天的SMNΔ7SMA小鼠8只和同龄的野生型小鼠4只和同龄的SMA杂合小鼠3只，SMNΔ7SMA小鼠随机分为溶媒组和给药组，每组各4只，4只野生型小鼠作为空白对照组，3只SMA杂合小鼠作为正常给药对照组。给药组和正常给药对照组小鼠按照60mg/kg/天腹腔注射纤溶酶原，浓度为10mg/ml，溶媒组和空白对照组小鼠按照6ml/kg/天腹腔注射溶媒，均给药到出生后11天。在小鼠出生后11天给药2小时后处死解剖所有小鼠，取材部分脊髓组织，匀浆后行纤溶酶原ELISA检测。
结果显示，空白对照组野生型小鼠脊髓纤溶酶原水平为8.51±9.51ng/mg。溶媒组SMA转基因小鼠脊髓纤溶酶原水平为19.95±4.06ng/mg，相比于空白对照组稍有增加。正常给药对照组纤溶酶原水平为13.03±7.51ng/mg。给药组SMA转基因小鼠脊髓纤溶酶原水平为62.33±17.37ng/mg，约为溶媒组小鼠的3倍，且给药组和溶媒组两组比较统计分析P值为0.029；约为正常给药对照组的4.8倍，且给药组和正常给药对照组比较统计分析P值为0.026(图8)。说明给药纤溶酶原可促进SMA条件下血-脊髓屏障对纤溶酶原通透性增加，纤溶酶原可通过血-脊髓屏障，达到脊髓部位。
实施例9给予纤溶酶原促进LPS诱导的肺炎SMA杂合小鼠脊髓组织中纤溶酶原水平增加
取SMA杂合性小鼠(购自Jackson Laboratory，谱系号：005025)9只，根据体重随机分为2组，空白对照组3只和模型组6只。所有小鼠使用舒泰50麻醉后，模型组小鼠气管滴注2.5mg/ml的细菌脂多糖(LPS)溶液进行造模，造模剂量5mg/kg，空白对照组小鼠管滴注2ml/kg生理盐水。造模2小时后，模型组所有小鼠根据体重随机分为两组，溶媒组3只，给药组3只；分组完成后开始给药，给药组小鼠按照50mg/kg/只尾静脉注射纤溶酶原，溶媒组小鼠及空白对照组小鼠按照5ml/kg/只尾静脉注射溶媒。给药2小时后处死所有小鼠解剖取材脊髓组织，匀浆后按照Human Plasminogen ELISA Kit(厂家：AssayMax，货号：EP1200-1)说明书操作进行检测。以人纤溶酶原工作标准品作为内标，对每个样本的浓度进行浓 度标定，标定后的浓度除以总蛋白浓度计算出每个样本单位总蛋白量中纤溶酶原的量并进行统计分析。
结果显示，空白对照组小鼠脊髓组织匀浆纤溶酶原水平为2.70±0.74ng/mg；气管滴注LPS后，溶媒组小鼠脊髓组织匀浆纤溶酶原水平为3.17±1.51ng/mg，与空白对照组相比未见明显变化；给药组小鼠补充2.5倍生理剂量水平的纤溶酶原后，纤溶酶原水平为121.16±44.68ng/mg，约为溶媒组小鼠的38.2倍(图9)。提示补充纤溶酶原能够促进LPS诱导的肺炎SMA杂合子小鼠血-脊髓屏障对纤溶酶原的通透性增加，该条件下纤溶酶原可通过血-脊髓屏障，进入中枢神经系统。
实施例10给予纤溶酶原促进LPS诱导的肺炎SMA杂合小鼠脊髓组织中纤溶酶原水平增加
取SMA杂合性小鼠(购自Jackson Laboratory，谱系号：005025)9只，根据体重随机分为2组，空白对照组3只和模型组6只。所有小鼠使用舒泰50麻醉后，模型组小鼠气管滴注2.5mg/ml的细菌脂多糖(LPS)溶液进行造模，造模剂量5mg/kg，空白对照组小鼠管滴注2ml/kg生理盐水。造模2小时后，模型组所有小鼠根据体重随机分为两组，溶媒组3只，给药组3只；分组完成后开始给药，给药组小鼠按照50mg/kg/只尾静脉注射纤溶酶原，溶媒组小鼠及空白对照组小鼠按照5ml/kg/只尾静脉注射溶媒。给药2小时后处死所有小鼠解剖取材脊髓组织，匀浆后进行纤溶酶原的酶底物动力学法检测。依次向酶标板(厂家：NUNC，货号：446469)中加入85μL/孔七个不同浓度点的标准品溶液、空白、样本，然后每孔加入15μL 20mM S-2251溶液(厂家：Chromogenix，货号：82033239)和100ng/μL uPA溶液的混合物(临用前按体积比2：1混合)，于37℃温育。从反应0min开始，每隔5min在多功能酶标仪中读取A405吸光值，至反应90min止。所有的反应以时间为和吸光值进行直线拟合，得出直线的斜率为标准品/样本的反应速率(△A405/min)。最后以标准品的效价值和△A405/min作标准曲线进行计算所测样本效价。计算出每个样本单位总蛋白量中纤溶酶原的活性。
结果显示，空白对照组小鼠脊髓组织纤溶酶原水平为0.00011±4.51x10 - 5U/mg；气管滴注LPS后，溶媒组小鼠脊髓纤溶酶原水平为0.00010±9.72x10 -6U/mg，与空白对照组相比，未见明显变化；给药组小鼠补充2.5倍生理剂量水平的纤溶酶原后，纤溶酶原水平增加至0.00034±1.04x10 -4U/mg， 与溶媒相比，统计分析P值为0.058(图10)。提示补充纤溶酶原能够促进LPS诱导的肺炎SMA杂合子小鼠血-脊髓屏障对纤溶酶原的通透性增加，纤溶酶原可通过血-脊髓屏障，在脊髓处聚集。
实施例11给予纤溶酶原促进LPS诱导的肺炎小鼠脊髓组织中纤溶酶原水平增加
取C57雄性小鼠15只，称重后随机分为2组，空白对照组小鼠3只，模型组小鼠12只。所有模型组小鼠使用舒泰50麻醉后，气管滴注2.5mg/ml的LPS溶液进行造模，造模剂量5mg/kg。造模2小时后，模型组所有小鼠根据体重分为四组，溶媒组3只，给药A组3只、给药B组3只、给药C组3只。分组完成后开始给药，给药A组小鼠按照50mg/kg/只尾静脉注射纤溶酶原，给药B组小鼠按照17mg/kg/只尾静脉注射纤溶酶原，给药C组小鼠按照6mg/kg/只尾静脉注射纤溶酶原。溶媒组小鼠及空白对照组小鼠按照5ml/kg/只尾静脉注射溶媒。给药2小时后解剖取材脊髓组织，行特异性人纤溶酶原ELISA检测。
脊髓组织匀浆液中纤溶酶原水平ELISA检测结果显示，空白对照组的脊髓组织Plg含量为7.71±0.51ng/mg，溶媒组小鼠脊髓组织Plg含量14.04±3.25ng/mg，气管滴注LPS后，小鼠脊髓纤溶酶原水平有所增加；给药A组小鼠补充50mg/kg(每只小鼠约1mg)的纤溶酶原后，脊髓组织纤溶酶原水平为85.10±11.59ng/mg，约为溶媒组小鼠的6.1倍；给药B组小鼠补充17mg/kg(每只小鼠约0.34mg)的纤溶酶原后，脊髓组织纤溶酶原水平为77.90±21.39ng/mg，约为溶媒组小鼠的5.5倍；给药C组小鼠补充6mg/kg(每只小鼠约0.1mg)的纤溶酶原后，脊髓组织纤溶酶原水平为64.00±19.63ng/mg，约为溶媒组小鼠的4.6倍(图11)。提示1)补充纤溶酶原能够促进LPS诱导的肺炎小鼠血脑屏障对纤溶酶原的通透性增加，纤溶酶原可穿过血脑屏障，在脊髓组织富集；2)纤溶酶原在脊髓中的富集具有剂量依赖效应，在6mg/kg至50mg/kg给药剂量范围内，脊髓中纤溶酶原富集水平随纤溶酶原施予剂量增加而增加。
实施例12给予纤溶酶原促进LPS诱导的肺炎小鼠脊髓组织中纤溶酶原水平增加
取6-9周C57雄性小鼠54只，称重后随机分为2组，空白对照组小鼠15只，模型组小鼠39只。所有小鼠使用舒泰50麻醉后，模型组小鼠气管滴注2.5mg/ml的LPS溶液进行造模，造模剂量5mg/kg，空白组小鼠气管滴 注生理盐水2ml/kg。所有模型组小鼠LPS造模2小时后，根据体重分为三组，LPS+溶媒组15只，LPS+50mg/kg纤溶酶原组12只、LPS+6mg/kg纤溶酶原组12只。空白组小鼠根据体重随机分为2组，空白+溶媒组3只，空白+50mg/kg纤溶酶原组12只，并开始给药操作。LPS+50mg/kg纤溶酶原组和空白+50mg/kg纤溶酶原组按照50mg/kg体重尾静脉注射给予纤溶酶原，LPS+溶媒组和空白+溶媒组按照5ml/kg/只尾静脉注射给予溶媒，LPS+6mg/kg纤溶酶原组按照6mg/kg体重尾静脉注射给予纤溶酶原。3只空白+溶媒组和3只LPS+溶媒组给药后0小时处死，在2、6、12和24小时每个时间点每组小鼠随机处死3只。处死后取材脊髓，匀浆后行特异性人纤溶酶原ELISA法检测
结果显示，假手术+溶媒组小鼠和LPS+溶媒组小鼠未接受纤溶酶原注射，在0、2、6、12和24小时，脊髓组织匀浆液中均未检测到人纤溶酶原。假手术+50mg/kg纤溶酶原组和LPS+50mg/kg纤溶酶原组小鼠接受50mg/kg体重的纤溶酶原注射，注射2小时后脊髓组织匀浆中人纤溶酶原均有显著升高，注射6-12小时后纤溶酶原水平明显降低，24小时基本检测不到人纤溶酶原。LPS+6mg/kg纤溶酶原组小鼠接受6mg/kg体重的纤溶酶原注射，注射2小时后脊髓组织匀浆中检测到纤溶酶原水平显著高于LPS+溶媒组小鼠，显著低于LPS+50mg/kg纤溶酶原组小鼠(图12)。
该结果表明1)在生理和病理情况下施予纤溶酶原后，可促进纤溶酶原穿过血脑屏障，在脊髓组织中富集；2)静脉注射纤溶酶原于正常小鼠体内，脊髓组织纤溶酶原水平显著增加；3)纤溶酶原在脊髓富集具有时间依赖效应，先升高，2至12小时逐渐降低，在12至24小时几乎全部完全代谢；4)纤溶酶原在脊髓富集具有剂量依赖效应，施予剂量越高，脊髓组织中纤溶酶原水平越高。
实施例13给予纤溶酶原促进LPS诱导的肺炎小鼠脑组织中纤溶酶原水平增加
取6-9周C57雄性小鼠54只，称重后随机分为2组，空白对照组小鼠15只，模型组小鼠39只。所有小鼠使用舒泰50麻醉后，模型组小鼠气管滴注2.5mg/ml的LPS溶液进行造模，造模剂量5mg/kg，空白组小鼠气管滴注生理盐水2ml/kg。所有模型组小鼠LPS造模2小时后，根据体重分为三组，LPS+溶媒组15只，LPS+50mg/kg纤溶酶原组12只、LPS+6mg/kg纤溶酶原组12只。空白组小鼠根据体重随机分为2组，空白+溶媒组3只，空 白+50mg/kg纤溶酶原组12只，并开始给药操作。LPS+50mg/kg纤溶酶原组和空白+50mg/kg纤溶酶原组按照50mg/kg体重尾静脉注射给予纤溶酶原，LPS+溶媒组和空白+溶媒组按照5ml/kg/只尾静脉注射给予溶媒，LPS+6mg/kg纤溶酶原组按照6mg/kg体重尾静脉注射给予纤溶酶原。3只空白+溶媒组和3只LPS+溶媒组给药后0小时处死，在2、6、12和24小时每个时间点每组小鼠随机处死3只。处死后取材脑，匀浆后行特异性人纤溶酶原ELISA法检测。
结果显示，空白+溶媒组小鼠和LPS+溶媒组小鼠未接受纤溶酶原注射，在0、2、6、12和24小时，脑组织匀浆液中均未检测到人纤溶酶原。空白+50mg/kg纤溶酶原组和LPS+50mg/kg纤溶酶原组小鼠接受50mg/kg体重的纤溶酶原注射，注射2小时后脑组织匀浆中检测到人纤溶酶原均有显著升高，注射6-12小时后纤溶酶原水平明显降低，24小时基本检测不到人纤溶酶原。LPS+6mg/kg纤溶酶原组小鼠接受6mg/kg体重的纤溶酶原注射，注射2小时后脑组织匀浆中检测到纤溶酶原水平显著高于LPS+溶媒组小鼠，显著低于LPS+50mg/kg纤溶酶原组小鼠(图13)。
该结果表明1)在生理和病理情况下施予纤溶酶原后，可促进纤溶酶原穿过血脑屏障，在脑组织富集；2)静脉注射纤溶酶原于正常小鼠体内，脑组织纤溶酶原水平显著增加；3)纤溶酶原在脑组织富集具有时间依赖效应，先升高，2至12小时逐渐降低，在12至24小时几乎全部完全代谢；4)纤溶酶原在脑组织富集具有剂量依赖效应，施予剂量越高，脑组组织中纤溶酶原水平越高。
实施例14给予纤溶酶原促进SOD1-G93A小鼠脊髓组织中纤溶酶原水平增加
取15周龄B6.Cg-Tg(SOD1-G93A)1Gur/J转基因小鼠(以下简称SOD1-G93A小鼠)(购自Jackson Laboratory，谱系号：004435)27只随机为分三组，溶媒组3只，50mg/kg给药组12只，6mg/kg给药组12只。溶媒组小鼠尾静脉注射给予溶媒，50mg/kg纤溶酶原组按照50mg/kg体重尾静脉注射给予纤溶酶原，6mg/kg纤溶酶原组按照6mg/kg体重尾静脉注射给予纤溶酶原。溶媒组小鼠在给药后2小时处死，剩余小鼠在给药后2、6、12、24小时每组小鼠取3只处死。处死后取材脊髓，匀浆后行特异性人纤溶酶原ELISA法检测。
SOD1-G93A小鼠过表达人突变SOD1基因，该小鼠临床及病理表现与 人肌萎缩侧索硬化症相似。
SOD1-G93A小鼠脊髓ELISA水平检测结果显示，尾静脉注射给予50mg/kg和6mg/kg纤溶酶原，SOD1-G93A小鼠脊髓纤溶酶原水平明显增加，且50mg/kg给药组纤溶酶原水平明显高于6mg/kg组。纤溶酶原水平在给药后2小时后逐渐降低，在12至24小时基本代谢完全(图14)。
该结果表明1)施予生理剂量水平的纤溶酶原能够穿过SOD1-G93A小鼠血脑屏障，在脊髓组织富集；2)纤溶酶原在脊髓的富集具有剂量依赖效应，纤溶酶原施予剂量越高，富集的越多；3)纤溶酶原在脊髓的富集具有时间依赖效应，先升高，在2至12小时逐渐降低，在12至24小时基本完全代谢。
实施例15给予纤溶酶原促进SOD1-G93A小鼠脑组织中纤溶酶原水平增加
取15周龄SOD1-G93A小鼠27只随机为分三组，溶媒组3只，50mg/kg给药组12只，6mg/kg给药组12只。溶媒组小鼠尾静脉注射给予溶媒，50mg/kg纤溶酶原组按照50mg/kg体重尾静脉注射给予纤溶酶原，6mg/kg纤溶酶原组按照6mg/kg体重尾静脉注射给予纤溶酶原。溶媒组小鼠在给药后2小时处死，剩余小鼠在给药后2、6、12、24小时每组小鼠取3只处死。处死后取材脑，匀浆后行特异性人纤溶酶原ELISA法检测。
SOD1-G93A小鼠脑ELISA水平检测结果显示，尾静脉注射给予50mg/kg和6mg/kg纤溶酶原，SOD1-G93A小鼠脑组织纤溶酶原水平明显增加，且50mg/kg给药组纤溶酶原水平明显高于6mg/kg给药组。纤溶酶原水平在给药后2小时后逐渐降低，在12至24小时基本代谢完全(图15)。
该结果表明1)施予生理剂量水平的纤溶酶原能够穿过SOD1-G93A小鼠血脑屏障，在脑组织富集；2)纤溶酶原在脑组织的富集具有剂量依赖效应，纤溶酶原施予剂量越高，富集的越多；3)纤溶酶原在脑组织的富集具有时间依赖效应，先升高，在2至12小时逐渐降低，在12至24小时基本完全代谢。
实施例16给予纤溶酶原促进FAD小鼠脊髓组织中纤溶酶原水平增加
取15周龄B6-Tg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax(以下简称FAD小鼠)(购自Jackson Laboratory，谱系号：034840)27只随机为分三组，溶媒组3只，50mg/kg给药组12只，6mg/kg给药组12只。溶媒组小鼠尾静脉注射给予溶媒，50mg/kg纤溶酶原组按照50mg/kg 体重尾静脉注射给予纤溶酶原，6mg/kg纤溶酶原组按照6mg/kg体重尾静脉注射给予纤溶酶原。溶媒组小鼠在给药后2小时处死，剩余小鼠在给药后2、6、12、24小时每组小鼠取3只处死。处死后取材脊髓，匀浆后行特异性人纤溶酶原ELISA法检测。
FAD小鼠为阿尔兹海默病研究中常用的动物模型。
脊髓组织匀浆ELISA水平检测结果显示，尾静脉注射给予50mg/kg和6mg/kg纤溶酶原，FAD小鼠脊髓组织纤溶酶原水平明显增加，且50mg/kg给药组纤溶酶原水平明显高于6mg/kg给药组。纤溶酶原水平在给药后2小时后逐渐降低，在12至24小时基本代谢完全(图16)。
该结果表明1)施予生理剂量水平的纤溶酶原能够穿过FAD小鼠血脑屏障，在脊髓组织富集；2)纤溶酶原在脊髓组织的富集具有剂量依赖效应，纤溶酶原施予剂量越高，富集的越多；3)纤溶酶原在脊髓组织的富集具有时间依赖效应，先升高，在2至12小时逐渐降低，在12至24小时基本完全代谢。
实施例17给予纤溶酶原促进FAD小鼠脑组织中纤溶酶原水平增加
取15周龄FAD小鼠27只随机为分三组，溶媒组3只，50mg/kg给药组12只，6mg/kg给药组12只。溶媒组小鼠尾静脉注射给予溶媒，50mg/kg纤溶酶原组按照50mg/kg体重尾静脉注射给予纤溶酶原，6mg/kg纤溶酶原组按照6mg/kg体重尾静脉注射给予纤溶酶原。溶媒组小鼠在给药后2小时处死，剩余小鼠在给药后2、6、12、24小时每组小鼠取3只处死。处死后取材脑，匀浆后行特异性人纤溶酶原ELISA法检测。
脑组织匀浆ELISA水平检测结果显示，尾静脉注射给予50mg/kg和6mg/kg纤溶酶原，FAD小鼠脑组织纤溶酶原水平明显增加，且50mg/kg给药组纤溶酶原水平明显高于6mg/kg给药组。纤溶酶原水平在给药后2小时后逐渐降低，在12至24小时基本代谢完全(图17)。
该结果表明1)施予生理剂量水平的纤溶酶原能够穿过FAD小鼠血脑屏障，在脑组织富集；2)纤溶酶原在脑组织的富集具有剂量依赖效应，纤溶酶原施予剂量越高，富集的越多；3)纤溶酶原在脑组织的富集具有时间依赖效应，先升高，在2至12小时逐渐降低，在12至24小时基本完全代谢。
实施例18给予纤溶酶原促进SOD1-G93A小鼠脊髓组织中BDNF基因转录
取12周龄的雌性SOD1-G93A小鼠，开始详细观察发病情况，发病后腿颤抖时开始观察记录，记录每只小鼠发病时间。发病14天后的SOD1-G93A小鼠根据体重及行为学检测，随机进行分為兩組，一组为给药组9只，另一组为溶媒组9只。另取同周龄的野生型(C57)小鼠5只作为正常对照组。给药组小鼠按照50mg/kg/天尾静脉注射纤溶酶原，溶媒组和正常对照组小鼠按照5mL/kg/天尾静脉注射溶媒。连续给药29天进行解剖取材脊髓组织。进行所有BDNF基因转录产物qPCR检测。
结果显示，给药组小鼠脊髓组织BDNF基因转录水平明显高于溶媒组，且统计差异P值为0.05(图18)。表明纤溶酶原能够促进SOD1-G93A小鼠脊髓组织中BDNF基因转录。
参考文献
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[4]Komoly S.Experimental demyelination caused by primary oligodendrocyte dystrophy.Regional distribution of the lesions in the nervous system of mice[corrected].[J].ideggyógyászati szemle,2005.

Claims (18)

  1. 一种促进成熟BDNF形成和/或提高BDNF水平的方法，包括给药受试者治疗有效量的纤溶酶原途径激活剂。
  2. 权利要求1的方法，其中所述纤溶酶原途径激活剂促进受试者神经组织中Pro-BDNF裂解形成成熟BDNF和BDNF基因的转录或表达。
  3. 权利要求1或2的方法，其中所述纤溶酶原途径激活剂提高受试者神经组织中其它神经营养因子的基因转录、蛋白表达和水平。
  4. 权利要求3的方法，其中所述其它神经营养因子包括神经生长因子(NGF)、神经营养因子3(NT-3)、神经营养因子4/5(NT-4/5)、睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)、胶质细胞源神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)、胰岛素样生长因子I(insulin like-growth factor-1，IGF-1)、转化生长因子(transforming growth factor，TGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)或血小板源生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)。
  5. 权利要求1-4任一项的方法，其中所述纤溶酶原途径激活剂具有选自如下的一项或多项中的用途或活性：促进神经元存活、分化、生长发育；防止神经元受损伤死亡；促进受损伤神经元再生及分化；和维持神经元生存及正常生理功能。
  6. 权利要求1-5中任一项的方法，其中所述受试者为患神经或脑组织损伤的受试者，该神经或脑组织损伤由选自如下的一种或多种疾病或状况所致：
    1)感染，选自如下的一种或多种：脑膜炎、脑炎、脊髓灰质炎和硬膜外脓肿；
    2)血管疾病，选自如下的一种或多种：中风、短暂性脑缺血发作(TIA)、蛛网膜下腔出血、硬膜下出血和血肿、和硬膜外出血；
    3)神经结构损伤疾病，选自如下的一种或多种：脑或脊髓损伤、贝尔麻痹、颈椎病、腕管综合征、脑或脊髓肿瘤、周围神经病和格林-巴利综合征；
    4)功能障碍，选自如下的一种或多种：头痛、癫痫、失眠、神经痛、焦虑和抑郁症；
    5)神经退行性疾病，选自如下的一种或多种：阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病(Huntington's disease，HD)、肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophiclateral sclerosis，ALS)、多发性硬化症(Multiple sclerosis，MS)、脊髓小脑共济失调和Pick病；
    6)运动神经元疾病，选自如下的一种或多种：脊髓性肌萎缩症(SpinalMuscularAtrophy，SMA)、进行性延髓麻痹、进行性肌肉萎缩、和原发性侧索硬化；
    7)肿瘤，选自如下的一种或多种：脑部肿瘤和脑癌。
  7. 一种预防或治疗BDNF相关疾病或病症的方法，包括给药受试者治疗有效量的纤溶酶原途径激活剂。
  8. 权利要求7的方法，其中所述BDNF相关疾病或病症包括选自如下的任一种：
    1)感染，选自如下的任一种：脑膜炎、脑炎、脊髓灰质炎和硬膜外脓肿；
    2)血管疾病，选自如下的任一种：中风、短暂性脑缺血发作(TIA)、蛛网膜下腔出血、硬膜下出血和血肿、和硬膜外出血；
    3)神经结构损伤疾病，选自如下的任一种：脑或脊髓损伤、贝尔麻痹、颈椎病、腕管综合征、脑或脊髓肿瘤、周围神经病和格林-巴利综合征；
    4)功能障碍，选自如下的任一种：头痛、癫痫、失眠、神经痛、焦虑和抑郁症；
    5)神经退行性疾病，选自如下的任一种：阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病(Huntington's disease，HD)、肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophiclateral sclerosis，ALS)、多发性硬化症(Multiple sclerosis，MS)、脊髓小脑共济失调和Pick病；
    6)运动神经元疾病，选自如下的任一种：脊髓性肌萎缩症(SpinalMuscularAtrophy，SMA)、进行性延髓麻痹、进行性肌肉萎缩、和原发性侧索硬化；
    7)肿瘤，选自如下的任一种：脑部肿瘤和脑癌；
    8)周围神经病、外伤引起的神经损伤，视神经病变、多发性神经炎、带状疱疹、面神经麻痹、烧伤、褥疮、角膜溃疡、放疗或化疗引起的副作 用；
    9)神经精神障碍、强迫性神经失调、创伤后应激障碍、神经性厌食、中枢神经系统的自身免疫性疾病、长期或短期记忆障碍、儿童学习障碍、闭合性颅脑损伤、注意力缺陷障碍、发作性睡病、睡眠障碍、脑或神经细胞损伤、与AIDS有关的神经功能缺损、以运动和/或发声性抽搐为特征的运动和抽搐障碍(例如，图雷特精神障碍、慢性运动或发声性抽搐障碍、短时抽搐性障碍和刻板型活动障碍)、物质滥用病症(例如，物质依赖、物质滥用以及物质滥用/依赖的后遗症，例如物质诱发的心理障碍、物质戒断和物质诱发的痴呆或遗忘症)、外伤性脑损伤、耳鸣、共济失调、肌肉强直(痉挛状态)、由酒精或物质滥用(例如，摇头丸、去氧麻黄碱等)引发的神经毒性、精神发育迟缓或认知缺损(例如，非综合征性X连锁精神发育迟缓、脆性X综合征、唐氏综合征、孤独症)、失语症、贝尔氏麻痹、克-雅病、脑炎、年龄相关性黄斑变性、ondine综合征、WAGR综合征、听力损失、雷特综合征、视神经损伤、糖尿病神经病变、神经移植并发症、周围神经损伤、肥胖症、代谢综合征、哮喘、特应性疾病、过敏性炎症、湿疹、神经免疫学疾病或病症和神经耳科疾病或病症、以及与老化和衰老有关的疾病或病症；
    10)神经痛，选自如下的任一项：三叉神经痛、慢性疼痛、慢性炎性痛、与关节炎有关的疼痛、纤维肌痛、癌症相关的疼痛、与消化性疾病有关的疼痛、与克罗恩氏病有关的疼痛、与自身免疫性疾病有关的疼痛、与内分泌疾病有关的疼痛、与糖尿病神经病变有关的疼痛、幻肢痛、自发性疼痛、慢性术后疼痛、慢性颞下颌疼痛、灼痛、疱疹后神经痛、AIDS相关的疼痛、I和II型复杂性区域疼痛综合征、慢性背痛、与脊髓损伤有关的疼痛、与药物摄入有关的疼痛和复发性急性疼痛、神经性疼痛。
  9. 权利要求1-8任一项的方法，其中所述纤溶酶原途径激活剂提高受试者神经组织中纤溶酶原水平。
  10. 权利要求1-9任一项的方法，其中所述纤溶酶原途径激活剂与一种或多种其它药物或治疗方法联合施用。
  11. 权利要求1-10任一项的方法，其中所述纤溶酶原途径激活剂通过静脉内、肌肉内、鞘内、鼻腔吸入、雾化吸入、滴鼻液或滴眼液形式给药。
  12. 权利要求1-11任一项的方法，其中所述纤溶酶原途径激活剂选自如 下一种或多种：纤维蛋白溶酶原激活途径的组分、能够直接激活纤维蛋白溶酶原或通过激活纤维蛋白溶酶原激活途径上游组分而间接激活纤维蛋白溶酶原的化合物、模拟纤维蛋白溶酶原或纤维蛋白溶酶之活性的化合物、能够上调纤维蛋白溶酶原或纤维蛋白溶酶原激活剂表达的化合物、纤维蛋白溶酶原类似物、纤维蛋白溶酶类似物、tPA或uPA类似物和纤溶抑制剂的拮抗剂。
  13. 权利要求12的方法，其中所述纤维蛋白溶酶原激活途径的组分选自天然或重组的纤溶酶原、人纤维蛋白溶酶、Lys-纤维蛋白溶酶原、Glu-纤维蛋白溶酶原、纤维蛋白溶酶、含有纤维蛋白溶酶原和纤维蛋白溶酶的一个或多个kringle结构域和/或蛋白酶结构域的纤维蛋白溶酶原和纤维蛋白溶酶变体及类似物、小纤维蛋白溶酶原(mini-plasminogen)、小纤维蛋白溶酶(mini-plasmin)、微纤溶酶原(micro-plasminogen)、微纤溶酶(micro-plasmin)、delta-纤溶酶原、delta-纤溶酶(delta-plasmin)、纤维蛋白溶酶原激活剂、tPA和uPA。
  14. 权利要求12的方法，其中所述纤溶抑制剂的拮抗剂为天然或重组的PAI-1、补体C1抑制物、α2抗纤溶酶或α2巨球蛋白的拮抗剂，例如PAI-1、补体C1抑制物、α2抗纤溶酶或α2巨球蛋白的抗体。
  15. 权利要求1-13任一项的方法，其中所述纤溶酶原途径激活剂为纤溶酶原。
  16. 权利要求15的方法，其中所述纤溶酶原包含序列2、6、8、10或12所示的氨基酸序列，或包含与序列2、6、8、10或12所示氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列，并且具有纤溶酶原的蛋白水解活性和/或赖氨酸结合活性。
  17. 权利要求15的方法，所述纤溶酶原包含选自如下的一项或多项：
    1)具有序列14所示的丝氨酸蛋白酶结构域；
    2)与序列14具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性并保留蛋白水解活性的丝氨酸蛋白酶结构域；
    3)选自Kringle 1、Kringle 2、Kringle 3、Kringle 4和Kringle 5中一个或多个的Kringle结构域；和
    4)与选自Kringle 1、Kringle 2、Kringle 3、Kringle 4和Kringle 5中一个或多个具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性并保留赖氨酸结合活性的Kringle结构域。
  18. 权利要求15的方法，所述纤溶酶原选自Glu-纤溶酶原、Lys-纤溶酶原、小纤溶酶原、微纤溶酶原、delta-纤溶酶原或它们的保留纤溶酶原的蛋白水解活性的变体。
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