BR112021014452A2

BR112021014452A2 - Anticorpos antielastina e métodos de uso

Info

Publication number: BR112021014452A2
Application number: BR112021014452-8A
Authority: BR
Inventors: Narendra R. Vyavahare; Charles D. Rice; Nasim Nosoudi; Vaideesh Parasaram; Saketh Karamched
Original assignee: Clemson University Research Foundation
Priority date: 2019-01-22
Filing date: 2019-01-22
Publication date: 2021-09-21
Also published as: CN113631183A; EA202192033A1; IL285026A; CA3127450A1; JP2022525388A; US20220089706A1; EP3914290A4; KR20210118864A; AU2019424751A1; EP3914290A1; WO2020153940A1; ZA202105152B

Abstract

anticorpos antielastina e métodos de uso. anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que reconhecem e se ligam especificamente a um epítopo de elastina que é exposto e acessível na fibra elástica degradada são descritos. os anticorpos e/ou fragmentos de ligação ao antígeno podem ser ligados de maneira operável a um componente secundário, incluindo agentes biologicamente ativos, tais como agentes terapêuticos e/ou agentes de imagem. opcionalmente, os anticorpos e/ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos podem ser ligados a uma superfície de um portador, tal como uma partícula, para ligação específica e liberação dos agentes transportados à fibra elástica degradada.

Description

“ANTICORPOS ANTIELASTINA E MÉTODOS DE USO” FUNDAMENTOS

[001] A elastina é a proteína constituinte das fibras elásticas encontradas na maioria do tecido conjuntivo e em todo o corpo. As fibras elásticas incluem um núcleo insolúvel de elastina amorfa que é circundada e sustentada por um manto de microfibrilas, que são formadas a partir de uma variedade de diferentes proteínas, glicoproteínas e o complexo receptor de elastina. O núcleo da elastina amorfa das fibras elásticas é formado após a deposição e integração de monômeros de tropoelastina solúveis no andaime das microfibrilas, seguido por reticulação dos monômeros para formar o polímero fibroso insolúvel.

[002] A degradação das fibras elásticas é uma característica comum de muitas patologias, incluindo aneurismas (por exemplo, aneurisma aórtico abdominal, aneurisma cerebral), doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), doença renal crônica, hipertensão, deficiência de antitripsina α-1, síndrome de Marfan, aterosclerose, arteriosclerose, e outras, assim como envelhecimento (isto é, perda de firmeza/suavidade da pele com o passar do tempo). A degradação da fibra elástica é frequentemente causada por enzimas, incluindo enzimas elastase, catepsinas e enzimas metaloproteinase da matriz (MMP), que podem atacar a elastina e os componentes do andaime da fibra elástica. Tais enzimas podem ser secretadas por células nativas, incluindo células vasculares em artérias, fibroblastos dérmicos e pulmonares na pele e no pulmão, respectivamente, assim como por infiltração de células inflamatórias em uma variedade de diferentes estados de doença.

[003] Infelizmente, a liberação sistêmica ainda é o método de liberação mais comum de compostos terapêuticos e de diagnóstico nas patologias mencionadas acima, assim como outras. Agentes introduzidos sistemicamente são tipicamente filtrados pelo corpo por intermédio do efeito de primeira passagem e outros mecanismos. Assim, os métodos de liberação sistêmica frequentemente exigem grandes doses dos compostos que, além de aumentar os custos, também podem causar efeitos colaterais desnecessários e/ou tóxicos ao paciente. Por exemplo, liberação sistêmica e/ou genérica de agentes pode apresentar efeitos inespecíficos - interações com estruturas não alvejadas no corpo - o que pode alterar a função normal do tecido e/ou órgão e levar a efeitos colaterais deletérios.

[004] São necessários na técnica anticorpos antielastina que possam ser usados como agentes alvejantes e que possam ser liberados em combinação com um agente biologicamente ativo para liberação alvejada do agente para propósitos terapêuticos ou de diagnóstico.

SUMÁRIO

[005] De acordo com uma forma de realização, é divulgado um anticorpo antielastina ou porção de ligação ao antígeno do mesmo que reconhece e se liga especificamente a um epítopo de elastina, e, em particular, se liga a um epítopo de uma entre SEQ ID NO.: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO.: 3. Por exemplo, um anticorpo antielastina ou um fragmento de ligação ao antígeno, conforme divulgado, pode incluir um ou mais fragmentos de CDR selecionados a partir da SEQ ID NOs: 9, 11, 13, 27, 29, ou 31.

[006] Também são divulgadas composições que incluem um anticorpo antielastina ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, conforme descrito. Por exemplo, uma composição pode incluir o anticorpo antielastina ou porção de ligação ao antígeno do mesmo (por exemplo, um anticorpo total ou um fragmento do mesmo, incluindo um ou mais fragmentos de CDR selecionados a partir da SEQ ID NOs: 9, 11, 13, 27, 29, ou 31) diretamente ou indiretamente ligado a um agente, por exemplo, um agente biologicamente ativo, tal como um agente terapêutico, ou um agente de diagnóstico, tal como um marcador detectável. As composições podem incluir uma partícula associada a um agente ativo (por exemplo, um agente terapêutico) e um anticorpo antielastina ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ligado a uma superfície externa da partícula, tal que, após a ligação ao seu antígeno, o anticorpo ou fragmento do mesmo pode ancorar a partícula a uma fibra elástica.

[007] Os métodos para usar os anticorpos também são descritos. Por exemplo, um método de uso pode incluir contatar uma fibra elástica degradada com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme descrito, que é, de maneira operável, ligado a um agente, por exemplo um agente terapêutico e/ou de imagem, opcionalmente ligado a uma partícula ou outro mecanismo de liberação. O agente terapêutico pode ser qualquer agente terapêutico para o uso na área geral da fibra elástica degradada. Por exemplo, pode ser para o uso no tratamento direto do tecido conjuntivo que contém a fibra elástica ou pode ser para outro uso, por exemplo, uma condição indiretamente relacionada à existência da fibra elástica degradada ou ainda não relacionada à existência da fibra elástica degradada, mas incluindo componentes alvejados (por exemplo, tecido) na área geral da fibra elástica degradada.

[008] Também são divulgados materiais e métodos para a produção de anticorpos e/ou uma porção de ligação ao antígeno dos mesmos divulgados. Por exemplo, métodos para formar uma célula de hibridoma que produz os anticorpos antielastina monoclonais divulgados e os hibridomas formados são divulgados, assim como células geneticamente modificadas, vetores, etc. que incluem uma ou mais sequências de ácidos nucleicos que codificam um anticorpo antielastina ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, por exemplo, um ou mais segmentos que codificam CDR selecionados a partir da SEQ ID NOs: 8, 10, 12, 26, 28 ou 30.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[009] Uma divulgação completa e habilitante, incluindo o melhor modo da mesma, a um técnico no assunto, é apresentada mais particularmente no restante do relatório descritivo, incluindo referência às Figuras anexas, em que:

[010] A FIG. 1 ilustra as aortas de rato, uma parte de cada uma das quais tendo sido tratada com elastase, após incubação com nanopartículas marcadas com os anticorpos divulgados.

[011] A FIG. 2 ilustra as aortas de camundongo, uma parte de cada uma das quais tendo sido tratada com elastase, após incubação com nanopartículas marcadas com os anticorpos divulgados.

[012] A FIG. 3 ilustra aortas de rato danificadas após alvejamento in vivo por nanopartículas marcadas com um marcador detectável e os anticorpos divulgados.

[013] A FIG. 4 ilustra a pigmentação imuno-histoquímica usando um anticorpo, conforme divulgado neste relatório, como o anticorpo primário do protocolo.

[014] A FIG. 5 ilustra a pigmentação imuno-histoquímica (IHC) usando um anticorpo secundário apenas como controle.

[015] A FIG. 6 ilustra os resultados da pigmentação de Verhoeff-van Gieson de tecido humano marcado com um anticorpo, conforme divulgado neste relatório.

[016] A FIG. 7 ilustra os resultados da pigmentação de Verhoeff-van Gieson de tecido humano mostrando fibras elásticas danificadas.

[017] A FIG. 8 ilustra a pigmentação IHC de tecido a partir de um modelo de enfisema de elastase em pulmões de rato usando um anticorpo, conforme divulgado neste relatório, como o anticorpo primário do protocolo.

[018] A FIG. 9 ilustra a pigmentação IHC de tecido a partir de um modelo de enfisema de elastase em pulmões de camundongo usando um anticorpo, conforme divulgado neste relatório, como o anticorpo primário do protocolo.

[019] A FIG. 10 ilustra a pigmentação IHC de tecido a partir de um modelo de aneurisma AngII na aorta de camundongo usando um anticorpo, conforme divulgado neste relatório, como o anticorpo primário do protocolo.

[020] A FIG. 11 ilustra a pigmentação IHC da pele de camundongo tratada com elastase usando um anticorpo, conforme divulgado neste relatório, como o anticorpo primário do protocolo.

[021] A FIG. 12 ilustra a pigmentação IHC de tecido a partir de um modelo de enfisema de elastase em pulmões de rato usando um anticorpo, conforme divulgado neste relatório, como o anticorpo primário do protocolo.

[022] A FIG. 13 ilustra a pigmentação IHC de tecido a partir de um modelo de enfisema de elastase em pulmões de rato usando um anticorpo secundário como controle.

[023] A FIG. 14 ilustra a pigmentação IHC de tecido a partir de um modelo de enfisema de elastase em pulmões de rato usando um anticorpo secundário como controle.

[024] A FIG. 15 ilustra a pigmentação IHC de tecido a partir de um modelo de aneurisma AngII na aorta de camundongo usando um anticorpo, conforme divulgado neste relatório, como o anticorpo primário do protocolo.

[025] A FIG. 16 ilustra a pigmentação IHC de tecido a partir de um modelo de aneurisma AngII na aorta de camundongo usando um anticorpo, conforme divulgado neste relatório, como o anticorpo primário do protocolo.

[026] A FIG. 17 ilustra a pigmentação IHC de tecido a partir de um modelo de aneurisma AngII na aorta de camundongo usando um anticorpo, conforme divulgado neste relatório, como o anticorpo primário do protocolo.

[027] A FIG. 18 ilustra a pigmentação IHC de tecido a partir de um modelo de aneurisma AngII na aorta de camundongo usando um anticorpo, conforme divulgado neste relatório, como o anticorpo primário do protocolo.

[028] A FIG. 19 ilustra a pigmentação IHC de tecido a partir de um modelo de aneurisma AngII na aorta de camundongo usando um anticorpo secundário como controle.

[029] A FIG. 20 ilustra a pigmentação IHC de tecido a partir de um modelo de aneurisma AngII na aorta de camundongo usando um anticorpo secundário como controle.

[030] A FIG. 21 ilustra a pigmentação IHC da pele de camundongo tratada com elastase usando um anticorpo, conforme divulgado neste relatório, como o anticorpo primário do protocolo.

[031] A FIG. 22 ilustra a pigmentação IHC da pele de camundongo tratada com elastase usando um anticorpo, conforme divulgado neste relatório, como o anticorpo primário do protocolo.

[032] A FIG. 23 ilustra a pigmentação IHC da pele de camundongo tratada com elastase usando um anticorpo secundário como controle.

[033] A FIG. 24 ilustra a pigmentação IHC da pele de camundongo tratada com elastase usando um anticorpo secundário como controle.

[034] A FIG. 25 ilustra pigmentação com prata e resultados de Western blot na detecção da ligação entre os anticorpos divulgados e tropoelastina solúvel.

[035] A FIG. 26 ilustra a IHC da pigmentação H&E da aorta humana com o anticorpo divulgado.

[036] A FIG. 27 mostra a pigmentação de Verhoeff van Gieson (VVG) da aorta humana com degradação leve do aneurisma.

[037] A FIG. 28 mostra a ligação de um anticorpo descrito ao tecido danificado da FIG. 27.

[038] A FIG. 29 mostra uma falta de ligação ao tecido da aorta humana ao usar um anticorpo controle.

[039] A FIG. 30 ilustra a IHC da pigmentação H&E da aorta humana com o anticorpo divulgado.

[040] A FIG. 31 mostra a pigmentação de Verhoeff van Gieson (VVG) da aorta humana com degradação leve do aneurisma.

[041] A FIG. 32 mostra a ligação de um anticorpo descrito ao tecido danificado da FIG. 27.

[042] A FIG. 33 mostra uma falta de ligação ao tecido da aorta humana ao usar um anticorpo controle.

[043] A FIG. 34 ilustra a ligação dos anticorpos divulgados à placa aterosclerótica (CEA) em um protocolo de alvejamento ex vivo.

[044] A FIG. 35 ilustra a IHC, incluindo o exame direto de partículas carregadas com corante, pigmentação H&E e pigmentação VVG mostrando a ligação de anticorpos divulgados à elastina na placa aterosclerótica da aorta humana.

[045] A FIG. 36 ilustra a IHC, incluindo o exame direto de partículas carregadas com corante, pigmentação H&E e pigmentação VVG mostrando a ligação de anticorpos divulgados à elastina na placa aterosclerótica da aorta humana.

[046] A FIG. 37 ilustra esquematicamente um anticorpo monoclonal, conforme descrito neste relatório.

[047] A FIG. 38 apresenta uma imagem de um modelo tridimensional formado com base em uma tomografia computadorizada que visualiza a morfologia de uma aorta aneurismática (esquerda) e ilustra a distribuição de nanopartículas de ouro marcadas com o anticorpo dentro da aorta (direita).

[048] A FIG. 39 fornece duas imagens de microscopia de campo escuro da aorta aneurismática marcada com nanopartículas de ouro pelo uso dos anticorpos descritos neste relatório.

[049] A FIG. 40 ilustra a análise histológica da aorta aneurismática marcada com nanopartículas de ouro pelo uso dos anticorpos descritos neste relatório.

[050] A FIG. 41 fornece o mapeamento hiperespectral do tecido da aorta suprarrenal marcado com nanopartículas de ouro pelo uso dos anticorpos descritos neste relatório.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[051] Agora será feita referência em detalhes às várias formas de realização do assunto presentemente divulgado, um ou mais exemplos das quais são apresentados abaixo. Cada forma de realização é fornecida à título de explicação, não de limitação, do assunto. Na verdade, será evidente para os técnicos no assunto que várias modificações e variações podem ser feitas na presente divulgação sem se afastar do escopo ou espírito da divulgação. Por exemplo, os recursos ilustrados ou descritos como parte de uma forma de realização podem ser usados em outra forma de realização para fornecer ainda uma forma de realização adicional. Assim, pretende-se que a presente divulgação cubra tais modificações e variações que estão no escopo das reivindicações anexas e seus equivalentes.

[052] A presente divulgação está geralmente direcionada a anticorpos antielastina e fragmentos de ligação ao antígenos dos mesmos que podem se ligar especificamente a um epítopo de elastina. Mais especificamente, é divulgado um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno que é específico para ratos, camundongos, porcos, cavalos, cachorros e seres humanoo, bem como outras formas de elastina reticulada amorfa. Em particular, os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos divulgados reconhecem e se ligam especificamente a uma sequência de epítopos de uma ou mais entre GALGPGGKPPKPGAGLL (SEQ ID NO: 1), LGYPIKAPKLPGGYGLPYTTGKLPYGYPGGVAGAAGKAGYPTTGTGV (SEQ ID NO: 2) ou PGGYGLPYTTGKLPYGYP (SEQ ID NO: 3). Também são divulgados agentes de liberação que podem incorporar os anticorpos antielastina e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos como agentes de alvejamento para a liberação de agentes biologicamente ativos a uma área que inclui elastina.

[053] As sequências de epítopos exemplificadas pela SEQ ID NOs: 1 a 3 são componentes de polipeptídeo do componente de elastina reticulada amorfa de uma fibra elástica que pode se tornar exposta e acessível após a degradação da fibra elástica e, em particular, após a degradação das estruturas de andaimes de microfibrilas de fibras elásticas. Como tal, em uma forma de realização, os agentes de alvejamento divulgados podem ser utilizados para se ligar às fibras elásticas danificadas e podem exibir pouca ou nenhuma ligação às fibras elásticas saudáveis ou precursores de elastina solúveis ou componentes de degradação que podem circular no sangue. Por exemplo, um agente de alvejamento que inclui um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que reconhece e se liga especificamente a uma ou mais entre a SEQ ID NOs: 1 a 3 pode exibir pouca ou nenhuma ligação aos produtos de degradação de alfa-elastina. Em uma forma de realização, os agentes de alvejamento podem se ligar à elastina imatura que não é mais solúvel, mas que não é completamente reticulada e formada como fibras elásticas, por exemplo, elastina imatura em capas fibrosas ateroscleróticas.

[054] Os anticorpos/fragmentos divulgados abrangem moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina (isto é, moléculas que contêm um sítio de ligação ao antígeno que se liga imunoespecificamente a um ou mais dos polipeptídeos descritos neste relatório). Um anticorpo completo pode geralmente ser composto por duas cadeias pesadas de imunoglobulina e duas cadeias leves de imunoglobulina. Em uma forma de realização particular, um anticorpo divulgado neste relatório pode incluir uma cadeia pesada SEQ ID NO: 5 e uma cadeia leve SEQ ID NO: 23. Entretanto, deve ser entendido que a invenção abrange os anticorpos completos que incluem as porções variáveis dos anticorpos divulgados (SEQ ID NO: 7 (VH) e SEQ ID NO: 25 (VL)) em combinação com regiões constantes alternativas, bem como porções de ligação ao antígeno isolado dos mesmos (por exemplo, uma ou mais regiões CDR SEQ ID NOs: 9, 11, 13, 27, 29 e 31, opcionalmente, em combinação com suas respectivas regiões FR SEQ ID NOs: 15, 17, 19, 21, 33, 35, 37, 39). Os agentes de alvejamento divulgados neste relatório com base nos anticorpos divulgados podem incluir, sem limitação, uma molécula de imunoglobulina, um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo enxertado com CDR, um anticorpo não humano (por exemplo, de camundongo, rato, cabra ou qualquer outro animal), um anticorpo completamente humano, um anticorpo humanizado, um Fab, um Fab’, um F(ab’)2, um Fv, um Fv ligado por dissulfeto, um scFv, um anticorpo de domínio único com base em um domínio variável de cadeia pesada ou um domínio variável de cadeia leve (um nanocorpo), um diacorpo, um anticorpo multiespecífico, um anticorpo específico duplo, um anticorpo anti-idiotípico, um anticorpo biespecífico, um fragmento de ligação ao epítopo funcionalmente ativo, anticorpos híbridos bifuncionais, uma cadeia única de um anticorpo, etc. Um anticorpo pode ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgA, IgM, IgE ou IgD). Em geral, o anticorpo é uma IgG, por exemplo, um isotipo IgG1, IgG2 ou IgG3. Em uma forma de realização particular, um anticorpo pode ser um isotipo IgG1. Além disso, um anticorpo pode, em geral, incluir cadeia leves capa.

[055] Os compostos de ligação ao antígeno divulgados neste relatório não são limitados aos anticorpos completos. Em uma forma de realização, os compostos e métodos divulgados podem utilizar um ou mais fragmentos de ligação ao antígeno de um anticorpo completo. Por exemplo, os métodos e materiais podem incorporar uma ou mais regiões CDR de um anticorpo completo que pode alvejar e se ligar a um epítopo de elastina. Através de exemplo, um agente de alvejamento pode incluir uma ou mais entre a SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 13 que descrevem os fragmentos CDR de uma região variável de uma cadeia pesada (SEQ ID NO: 7), conforme descrito neste relatório, opcionalmente, em combinação com uma ou mais entre a SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 31 que descrevem os fragmentos CDR de uma região variável de uma cadeia leve (SEQ ID

NO: 25), conforme descrito neste relatório. Um fragmento de CDR pode ser fornecido em uma forma de realização ligada por um ou ambos os fragmentos de FR encontrados em uma região variável completa ou, alternativamente, pode ser utilizado em um formato isolado, independente dos fragmentos de FR naturais. À título de exemplo, em uma forma de realização, um agente de alvejamento, conforme descrito neste relatório, pode incorporar uma sequência de peptídeos, incluindo a SEQ ID NOs: 15, 9 e 17, em ordem sequencial, que inclui um fragmento de CDR (SEQ ID NO: 9) de um anticorpo monoclonal descrito neste relatório, em combinação com os fragmentos de FR encontrados naturalmente em qualquer uma das extremidades do fragmento de CDR (SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 17). Os fragmentos de FR que podem ser utilizados em combinação com os fragmentos CDR podem incluir uma ou mais entre a SEQ ID NOs: 15, 17, 19, 21, 33, 35, 37 e 39 na formação de um agente de alvejamento que reconhece seletivamente um epítopo da elastina degradada.

[056] Conforme utilizado neste relatório, os termos “reconhece seletivamente” e “se liga seletivamente” significam que a ligação da molécula a um epítopo é 2 vezes maior ou mais, por exemplo, de cerca de 2 vezes a cerca de 5 vezes maior do que a ligação da molécula a um epítopo não relacionado ou do que a ligação de uma molécula não relacionada ao epítopo, conforme determinado pelas técnicas conhecidas no ramo, tais como, por exemplo, ELISA, imunoprecipitação, ensaios de dois híbridos, ensaio de deslocamento a frio, etc. Tipicamente, a ligação específica pode ser distinguida da ligação não específica quando a constante de dissociação (KD) é cerca de 1×10−5 M ou menos, ou cerca de 1×10−6 M ou menos, por exemplo, cerca de 1×10−7 M em algumas formas de realização.

[057] Os fragmentos de ligação ao antígeno funcionais dos anticorpos divulgados podem incluir Fab, uma molécula bivalente scFv-Fc, F(ab’)2 e Fv, que são capazes de reconhecer e se ligar especificamente a uma ou mais entre a SEQ

ID NOs: 1 a 3, por exemplo, uma ou mais entre a SEQ ID NOs: 7, 9, 11, 13, 25, 27, 29 ou 31.

[058] Os peptídeos de ligação ao antígeno descritos neste relatório podem incorporar modificações, conforme seria entendido por um técnico no assunto. Por exemplo, existem muitos aminoácidos naturais que ocorrem como isômeros L na maioria dos organismos vivos; entretanto, as formas de realização da divulgação não são limitadas apenas aos aminoácidos L e podem incluir modificações que substituem aminoácidos D ou outros aminoácidos não proteinogênicos que não são naturalmente codificados por humanos ou qualquer outro organismo. Neste relatório, a menos que especificamente referenciado como um aminoácido D (isto é, o identificador de aminoácido, seguido por (d)), a referência a um aminoácido genérico indica o aminoácido L.

[059] Em formas de realização da divulgação, um agente de alvejamento pode incluir uma substituição de ornitina para peptídeos divulgados, por exemplo, para fragmentos de CDR divulgados que podem ser utilizados em um agente de alvejamento. Em algumas formas de realização, um agente de alvejamento pode incluir uma ou mais substituições de aminoácidos de um aminoácido proteinogênico humano selecionado a partir do seguinte grupo: alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina.

[060] Em uma forma de realização, um agente de alvejamento pode incluir peptídeos estrutural e/ou funcionalmente similares aos divulgados neste relatório. Os peptídeos estruturalmente similares podem abranger variações, tais como a substituição de um aminoácido com uma primeira cadeia lateral do aminoácido por um segundo aminoácido com uma segunda cadeia lateral do aminoácido. Tanto a primeira cadeia lateral do aminoácido quanto a segunda cadeia lateral do aminoácido fornecem uma característica similar para manter a similaridade funcional do agente de alvejamento, isto é, a ligação de epítopo de elastina. Uma característica similar pode incluir uma cadeia lateral que tem uma polaridade, carga ou tamanho similar à da primeira cadeia lateral do aminoácido. Como um exemplo, leucina inclui uma cadeia lateral hidrofóbica e, em algumas formas de realização, um agente de alvejamento pode incluir a substituição de uma leucina de uma sequência divulgada (por exemplo, uma sequência CDR) por uma isoleucina, valina ou alanina, como cada um destes aminoácidos incluem uma cadeia lateral hidrofóbica similar. Como outro exemplo, histidina inclui uma cadeia lateral aromática que também pode transportar uma carga positiva e, em algumas formas de realização, uma ou mais histidinas de um anticorpo ou fragmento de ligação de elastina podem ser substituídas por um aminoácido que inclui uma cadeia lateral aromática ou por um aminoácido que pode transportar uma carga positiva, tal como fenilalanina, tirosina, triptofano, arginina ou lisina. Estes são fornecidos como exemplos de possíveis substituições e não se destinam a limitar o escopo das variações consideradas substituindo aminoácidos que têm propriedades de cadeia lateral similares.

[061] Em algumas formas de realização, os fragmentos de ligação ao antígeno compreendem um Fab, em que o fragmento contém um fragmento de ligação ao antígeno monovalente da molécula de anticorpo e que pode ser produzido por digestão do anticorpo inteiro com a enzima papaína para fornecer uma cadeia leve intacta (por exemplo, SEQ ID NO: 23) ou a região variável (por exemplo, SEQ ID NO: 25) e uma porção de uma cadeia pesada (por exemplo, uma ou mais entre a SEQ ID NO: 9, 11, 13, opcionalmente, em combinação com uma ou mais entre a SEQ ID NOs: 15, 17, 19, 21).

[062] Em uma forma de realização, o fragmento de ligação ao antígeno pode compreender um Fab’, que é o fragmento da molécula de anticorpo que pode ser obtida pelo tratamento do anticorpo inteiro com pepsina, seguido por redução, para fornecer uma cadeia leve intacta (por exemplo, SEQ ID NO: 23) ou a região variável

(por exemplo, SEQ ID NO: 25) e uma porção da cadeia pesada (por exemplo, uma ou mais entre a SEQ ID NO: 9, 11, 13, opcionalmente, em combinação com uma ou mais entre a SEQ ID NOs: 15, 17, 19, 21); dois fragmentos Fab’ podem ser obtidos por molécula de anticorpo. Um fragmento (Fab’)2 do anticorpo é englobado, o qual pode ser obtido por tratamento de um anticorpo completo com a enzima pepsina sem redução subsequente. Um fragmento F(ab’)2 é um dímero de dois fragmentos Fab’ mantidos juntos por duas ligações dissulfeto. É também englobado um Fv, que é um fragmento geneticamente modificado contendo a região variável da cadeia leve e a região variável da cadeia pesada expressadas como duas cadeias. Em uma forma de realização, o anticorpo pode abranger um anticorpo de cadeia única (“SCA”), que é uma molécula geneticamente construída contendo a região variável da cadeia leve e a região variável da cadeia pesada, ligado por um ligante de polipeptídeo adequado como uma molécula de cadeia única geneticamente fundida. Um fragmento de anticorpo pode ser um scFv-Fc, que é produzido em uma forma de realização pela fusão de Fv de cadeia única (scFv) com uma região de dobradiça a partir de uma imunoglobulina (Ig), tal como uma IgG e regiões Fc.

[063] Um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode incluir uma modificação conhecida na técnica que não interfere com o reconhecimento e ligação específicos com o epítopo alvo. Por exemplo, uma modificação pode minimizar as mudanças conformacionais durante a mudança das formas exibidas para as formas secretadas do anticorpo ou fragmento. Conforme é entendido por um técnico no assunto, a modificação pode ser uma modificação conhecida na técnica para transmitir uma propriedade funcional que, de outra forma, não estaria presente se não fosse pela presença da modificação. A invenção abrange materiais que são modificados diferencialmente durante ou depois da tradução, por exemplo, por glicosilação, acetilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos de proteção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica,

ligação a uma partícula, outra molécula ou outro ligante celular, etc. Qualquer uma das diversas modificações químicas pode ser realizada por técnicas conhecidas, incluindo, mas não limitadas à clivagem química específica por brometo de cianogênio, tripsina, quimiotripsina, papaína, protease V8, NaBH4, acetilação, formilação, oxidação, redução, síntese metabólica na presença de tunicamicina, etc.

[064] Uma modificação pode incluir uma modificação do terminal N e/ou uma modificação do terminal C. Por exemplo, a modificação pode incluir uma biotinilação do terminal N e/ou uma biotinilação do terminal C. Em uma forma de realização, a forma secretável do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma modificação de terminal N que permite a ligação a uma região de dobradiça da imunoglobulina (Ig). Em outra forma de realização, a região de dobradiça da Ig é, mas não está limitada a uma região de dobradiça da IgA. Em outra forma de realização, a forma secretável do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma modificação do terminal N e/ou uma modificação do terminal C que permite a ligação a um sítio enzimaticamente biotinilável. Em outra forma de realização, a biotinilação do referido sítio pode funcionalizar o sítio para se ligar a qualquer superfície revestida com estreptavidina, avidina, porções derivadas de avidina ou um reagente secundário.

[065] Uma modificação pode incluir, por exemplo, a adição de cadeias de carboidratos ligadas a N ou O, ligação de porções químicas à estrutura dos aminoácidos, modificações químicas de cadeias de carboidratos ligadas a N ou O e adição ou deleção de um resíduo de metionina no terminal N.

[066] Os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno podem ser produzidos por qualquer processo sintético ou recombinante, tal como é bem conhecido na técnica. Os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno podem ser modificados adicionalmente para alterar as propriedades biofísicas ou biológicas por meio de técnicas conhecidas no ramo. Por exemplo, um anticorpo pode ser modificado para aumentar a estabilidade contra proteases ou para modificar a lipofilicidade, solubilidade ou afinidade de ligação a uma ou mais entre a SEQ ID NOs: 1 a 3.

[067] À título de exemplo, os anticorpos podem ser produzidos pela imunização de vários animais, incluindo camundongos, ratos, coelhos, cabras, primatas, galinhas e seres humanos com um antígeno alvo, tal como uma sequência de peptídeos completa descrita, ou um fragmento de peptídeo de elastina contendo uma ou mais das sequências descritas, que incluem pelo menos um epítopo antielastina. Em uma forma de realização, o antígeno ou fragmento de peptídeo contendo o antígeno pode ser purificado antes da imunização do animal. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno obtido pela seguinte imunização pode ser purificado por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, filtração por gel, troca íônica, cromatografia de afinidade, etc. A cromatografia de afinidade ou qualquer uma das várias outras técnicas conhecidas no ramo pode ser usada para isolar anticorpos policlonais ou monoclonais a partir do soro, fluido ascítico ou sobrenadantes de hibridoma.

[068] “Purificado” significa que o anticorpo é separado de pelo menos algumas das proteínas normalmente associadas ao anticorpo e, preferivelmente, separadas de todos os materiais celulares, exceto proteínas.

[069] Os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno podem ser produzidos por meio do uso de técnicas de recombinação genética. Por exemplo, na formação de um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, um fragmento funcional de anticorpo ou semelhantes, tais como um Fv, um SCA, um scFv-Fc ou semelhantes, técnicas de recombinação genética.

[070] Em uma forma de realização, um método para produzir um agente de alvejamento que incorpora todas ou uma porção de uma região variável de uma cadeia pesada (SEQ ID NO: 7) e uma região variável de uma cadeia leve (SEQ ID

NO: 25), por exemplo, incluindo uma ou mais regiões CDR (SEQ ID NOs: 9, 11, 13, 27, 29, 31), por exemplo, na formação de um anticorpo quimérico, pode ser realizado através da utilização de técnicas de recombinação genética.

[071] À título de exemplo, o DNA que codifica uma sequência de aminoácidos (região VH) representada pela SEQ ID NO: 7 é preparado. Do mesmo modo, o DNA que codifica uma sequência de aminoácidos (VL) representada pela SEQ ID NO: 25 é preparado. Os exemplos de tal DNA incluem aqueles representados pela SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 24; entretanto, aqueles com outras sequências de nucleotídeos podem ser usados.

[072] As porções ou mutantes das sequências divulgadas, que ainda retêm a atividade desejada, também são consideradas no escopo desta divulgação. Por exemplo, os mutantes podem incluir alterações na SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 24 que codificam uma ou mais substituições de aminoácidos (por exemplo, mutação de um códon para valina em um códon para alanina). Adicionalmente ou alternativamente, os mutantes de uma sequência de DNA podem incluir uma ou mais mutações pontuais na sequência de cDNA nativa para substituir um códon degenerado pelo códon nativo.

[073] Para as formas de realização da divulgação que incluem um mutante de uma sequência de ácidos nucleicos divulgada (por exemplo, SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 24 ou porções que codificam uma região CDR de um anticorpo), o mutante pode incluir uma ou mais mutações de códon que modificam a proteína expressada para substituir um aminoácido hidrofóbico (por exemplo, valina) por outro aminoácido hidrofóbico (por exemplo, alanina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina ou triptofano) para produzir uma variante de anticorpo.

[074] Devido à redundância de códons, existem muitas variantes de sequência de cDNA teoricamente possíveis que poderiam codificar um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, conforme descrito neste relatório. Adicionalmente,

as variantes que modificam a sequência de proteínas nativa, enquanto retêm a atividade de ligação, aumentam adicionalmente este número. Para estas formas de realização, uma modificação genética pode resultar na expressão de um peptídeo (por exemplo, SEQ ID NO: 7) ou uma variante de peptídeo que retêm a função de ligação do peptídeo nativo.

[075] Um DNA que codifica VH (por exemplo, SEQ ID NO: 7) ou VL (por exemplo, SEQ ID NO: 25) pode ser inserido em um vetor com uma sequência que codifica as respectivas regiões constantes (CH ou CL) do anticorpo humano em uma forma de realização para construir um vetor de expressão de anticorpo quimérico. Os vetores com uma sequência que codifica CH ou CL de um anticorpo humano conforme podem ser utilizados, estão disponíveis comercialmente. Ao introduzir o vetor de expressão construído em uma célula hospedeira, uma célula recombinante que expressa um anticorpo quimérico pode ser obtida. Em seguida, a célula recombinante pode ser cultivada e um anticorpo quimérico desejado pode ser adquirido a partir da cultura.

[076] Uma célula hospedeira não é particularmente limitada, contanto que o vetor de expressão seja capaz de funcionar. À título de exemplo, as células animais (por exemplo, células COS, células CHO, células HEK e semelhantes), de levedura, de bactérias (Escherichia coli e semelhantes), células de planta, células de inseto e semelhantes, podem ser apropriadamente utilizadas.

[077] Em uma forma de realização, uma técnica de recombinação pode ser utilizada para produzir um anticorpo, incluindo CDR específica incluindo uma ou mais entre a SEQ ID NOs: 9, 11, 13, 27, 29 ou 31. Por exemplo, um método pode ser utilizado na formação de um anticorpo humanizado que, conforme utilizado neste relatório, refere-se a um anticorpo com uma CDR derivada de um animal, exceto um ser humano, e outras regiões (região estrutural, região constante e semelhantes) derivadas a partir de seres humanos.

[078] Por exemplo, as sequências de nucleotídeos que codificam as CDRs de cadeia pesada (SEQ ID NOs: 9, 11, 13) e as CDRs de cadeia leve (SEQ ID NOs: 27, 29, 31) de um anticorpo podem ser preparadas. Como o DNA, uma sequência correspondente a cada sequência de nucleotídeos da CDR representada pela SEQ ID NOs: 8, 10, 12, 26, 28, 30 é exemplificada; entretanto, conforme debatido acima, aquelas com outras sequências de nucleotídeo podem ser usadas. O DNA pode ser preparado por métodos conhecidos, tais como PCR. O DNA pode ser preparado por síntese química.

[079] Usando estas sequências, uma sequência que codifica uma região variável em que as regiões que codificam CDR de cadeia pesada (por exemplo, SEQ ID NOs: 8, 10, 12) são enxertadas para as respectivas regiões que codificam regiões estruturais (FR) de VH em um anticorpo humano pode ser preparada. Do mesmo modo, as sequências que codificam uma região variável em que as regiões que codificam CDR de cadeia leve (por exemplo, SEQ ID NOs: 26, 28, 30) são enxertadas para as respectivas regiões que codificam FR de VL em um anticorpo humano podem ser preparadas. A sequência de ácidos nucleicos preparada pode ser, em seguida, inserida em um vetor com uma sequência que codifica a região constante desejada (CH ou CL) de um anticorpo humano, de modo a construir um vetor de expressão de anticorpo humanizado. Ao introduzir o vetor de expressão construído em uma célula hospedeira, uma célula recombinante que expressa um anticorpo humanizado pode ser obtida. A célula recombinante pode ser, em seguida, cultivada e um anticorpo humanizado desejado pode ser adquirido a partir da cultura.

[080] Um agente de alvejamento, incluindo menos do que todas as CDRs de um anticorpo completo, pode ser produzido em um procedimento similar. Por exemplo, um agente de alvejamento que inclui apenas VH ou apenas a região VL de um anticorpo, na ausência da região constante, pode ser produzido em uma forma similar.

[081] Os métodos para purificar um agente de alvejamento formado, de acordo com os métodos descritos neste relatório, não são particularmente limitados e as técnicas conhecidas podem ser utilizadas. Por exemplo, um sobrenadante de cultura de um hibridoma ou uma célula recombinante pode ser coletado e o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode ser purificado por uma combinação de técnicas conhecidas, tais como vários tipos de cromatografia, precipitação de sal, diálise, separação de membrana e semelhantes. Quando o isotipo do anticorpo é IgG, o anticorpo pode ser convenientemente purificado por cromatografia de afinidade usando a proteína A.

[082] Na utilização dos materiais divulgados, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode ser ligado de maneira operável a um material secundário para alvejamento e liberação de um agente para uma fibra elástica degradada ou para uma área perto de uma fibra elástica degradada. Conforme utilizado neste relatório, o termo “ligado de maneira operável” refere-se a uma ligação direta ou indireta que pode ser uma ligação permanente ou temporária (por exemplo, degradável) em que duas ou mais moléculas, sequências, partículas ou combinação das mesmas, são ligadas de tal maneira, para garantir a função apropriada dos componentes e, em particular, de tal maneira que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode se ligar ao seu epítopo. Como tal, os anticorpos ou fragmento de ligação ao antígeno podem liberar qualquer tipo de agente útil para áreas em ou perto de tecidos conjuntivos, tais como artérias, pulmões, pele, etc. Além disso, em algumas formas de realização, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode ser diretamente ligado a um portador (por exemplo, uma partícula adicionalmente descrita neste relatório) que pode transportar e liberar um ou mais agentes ativos. Como tal, uma composição pode ser utilizada para liberar um agente ativo durante um período de tempo por meio da liberação controlada do agente a partir do portador.

[083] Os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno podem ser utilizados para a liberação de agentes biologicamente ativos no tratamento ou diagnóstico de doenças para as quais a degradação da proteína elastina é uma marca, incluindo doenças cardiovasculares, tais como aterosclerose e arteriosclerose, e doenças pulmonares, tais como bronquite crônica, COPD e enfisema. Outras condições que podem incluir a degradação de fibra elástica e para as quais os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno podem ser utilizados na liberação do agente, podem incluir aquelas associadas ao aneurisma, arteriosclerose, aterosclerose, transtornos genéticos, lesão de força bruta, síndrome de Marfan, pseudoxantoma elástico, envelhecimento da pele e assim por diante. Em uma forma de realização, os materiais podem ser utilizados para o tratamento da calcificação vascular que é comum no envelhecimento, bem como em vários transtornos genéticos e metabólicos. A calcificação vascular é agora reconhecida como um forte preditor de eventos cardiovasculares em pessoas que sofrem de outros transtornos, tais como em diabetes e doença renal crônica (CKD), bem como na população geral. Os materiais podem ser utilizados no tratamento da calcificação arterial média (MAC), que pode existir, independentemente de aterosclerose, e está tipicamente associada à degradação de fibra elástica. A calcificação média específica da elastina leva a uma elevação da pressão arterial sistólica (SBP) e da pressão de pulso (PP) e contribui para a hipertensão sistólica isolada (ISH). Em uma forma de realização, os materiais divulgados podem ser utilizados no alvejamento de fibra de elastina imatura e/ou danificada simultaneamente na calcificação íntima e média. Por exemplo, quando as calcificações ateroscleróticas e médias estão presentes em um indivíduo, os materiais divulgados podem ser alvejados por calcificações, simultaneamente.

[084] Em uma forma de realização, os materiais e métodos divulgados podem mostrar benefícios na estabilização da placa aterosclerótica vulnerável. As placas ateroscleróticas foram descobertas para incluir uma capa fibrosa que é produzida sobre a placa. Recentemente, foi descoberto que estas capas fibrosas podem incluir imaturas (isto é, não completamente reticuladas e formadas). Atualmente, a pesquisa mostra que alguns pacientes têm placas estáveis com capa fibrosa espessa e alguns têm uma capa fina vulnerável. A ruptura da placa, devido à presença de uma capa relativamente fina, pode levar à morte. Os anticorpos divulgados podem se ligar à elastina imatura nestas capas fibrosas ateroscleróticas e, desse modo, auxiliar na distribuição de agentes bioativos para a área local, por exemplo, em combinação com nanopartículas transportadoras. Por exemplo, os agentes que podem estabilizar o colágeno/elastina da capa fibrosa ou que podem, de outro modo, aumentar a resistência da capa e evitar a ruptura podem ser liberados pelo uso dos anticorpos de alvejamento.

[085] Os materiais podem ter aplicação no cuidado da pele, tal como para condições, incluindo cicatrizes, flacidez da pele e rugas, que frequentemente ocorrem com a idade, devido à perda/degradação de fibra elástica, incluindo a exposição ao sol ou outros estados da doença. Os pacientes que podem se beneficiar da utilização dos agentes de liberação também podem incluir aqueles que sofrem de doenças arteriais da pele, tais como vasculite cutânea. A vasculite cutânea pode causar danos à lâmina elástica nas pequenas artérias da pele e o uso dos materiais para a liberação de composições de tratamento pode aliviar tais danos.

[086] Os agentes que podem ser liberados pelo uso dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno podem incluir agentes biologicamente ativos, tais como e sem limitação a anticoagulantes, agentes antiplaquetários, agentes anti- inflamatórios, inibidores de proliferação de SMC, inibidores de MMP e catepsina, agentes citostáticos, antioxidantes, agentes quelantes, estabilizadores de elastina e agentes de regeneração, citocinas, enzimas, quimiocinas, radioisótopos, toxinas enzimaticamente ativas ou agentes quimioterápicos.

[087] Em uma forma de realização, os materiais podem ser utilizados na liberação do material genético que pode incluir constructos de ácido nucleico de DNA e/ou RNA. O material genético que pode ser liberado pelo uso dos materiais de alvejamento descritos pode incluir, sem limitação, microRNA, RNA de transferência, RNA ribossomal, RNA silencioso, RNA de regulação, RNA antissentido, interferência de RNA, RNA não codificador e codificador, fragmentos de DNA, plasmídeos, incluindo genes em combinação com sequências regulatórias, precursores de constructos funcionais (por exemplo, precursores de mRNA), sondas de DNA/RNA, etc. e semelhantes.

[088] As cistatinas são um exemplo de um inibidor de catepsina que pode ser liberado pelo uso dos materiais. Os exemplos de inibidores de MMP incluem inibidores de MMP-2, MMP-9 e MMP-12, todos os quais foram implicados na degradação de elastina. Tais inibidores de MMP podem incluir, sem limitação, um ou mais dos quatro inibidores de tecido de metaloproteinases (TIMPs), isto é, TIMP1, TIMP2, TIMP3 ou TIMP4. Os inibidores de MMP sintéticos incluem aqueles contendo um grupo quelante que se liga ao átomo de zinco catalítico no sítio ativo de MMP. Como tal, os agentes quelantes que podem ser úteis para a inibição de MMP e/ou outras razões são englobadas neste relatório. Os grupos quelantes típicos incluem hidroxamatos, carboxilatos, tióis e fosfinilos. Os antibióticos de tetraciclina, tais como doxiciclina, minociclina e assim por diante, podem ser liberados pelo uso dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno divulgados.

[089] Um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode ser utilizado na liberação de um ou mais agentes imunomoduladores que podem aumentar ou diminuir a produção de uma ou mais citocinas, supra ou infrarregular a apresentação do autoantígeno, mascarar os antígenos MHC ou promover a proliferação,

diferenciação, migração ou estado de ativação de um ou mais tipos de células imunes. Os agentes imunomoduladores incluem, mas não são limitados a anti- inflamatórios não esteroides (NSAIDs); esteroides tópicos; citocina, quimiocina ou antagonistas do receptor; globulina antilinfócitos heteróloga; etc.

[090] Em uma forma de realização, um composto biologicamente ativo para a liberação alvejada pode incluir um composto utilizado para tratar diretamente a elastina degradada. Tais compostos podem incluir aqueles que podem encorajar a reticulação de elastina, de modo a fornecer suporte estrutural adicional para o tecido conjuntivo e os compostos que podem regular positivamente a formação de elastina, particularmente através do aumento da formação e/ou reticulação de tropoelastina. Por exemplo, um agente de reticulação de elastina, tal como pentagaloilglucose (PGG), pode ser liberado pelo uso dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos. Os compostos biologicamente ativos que podem encorajar a formação e/ou reticulação de tropoelastina, de modo a encorajar a formação de novas fibras elásticas, incluem a enzima lisil oxidase e/ou agentes que aumentam a atividade de lisil oxidase, tais como íons cobre, ou forscolina, que é um indutor de AMP (cAMP) cíclico. Outro composto que pode ser utilizado para encorajar a reticulação de tropoelastina é TGF-β, que mostrou o aumento da atividade de lisil oxidase. Os íons cobre (Cu2+) podem aumentar o transporte extracelular da lisil oxidase endógena e atividade funcional da lisil oxidase endógena e exógena, permitindo a transferência de elétrons a partir do oxigênio para facilitar a desaminação oxidativa e a formação de aldeído nos resíduos de lisina em elastina. Consequentemente, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser direta ou indiretamente ligado aos íons cobre para a liberação a uma fibra elástica degradada.

[091] Em uma forma de realização, um agente que pode dissolver minerais, tal como, por exemplo, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), que mostrou ser um agente quelante versátil; ácido etilenoglicol-bis(éter β-aminoetílico)-N,N,N’,N’- tetracético (EGTA), um quelante específico de cálcio; ácido etilenoglicol tetracético; ácido nitrilotriacético, ácido etilenodiaminetriacético de hidroxietila; ácido 8-Hidróxi-7- iodo-5-quinolinossulfônico; poli(ácido gama-glutâmico; tiossulfato de sódio; ácido alfa-lipoico; bisfosfonatos; ácido dietilenotriaminopentacético (DTPA); e/ou outros quelantes conhecidos na técnica podem ser liberados.

[092] Um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser direta ou indiretamente ligado a um agente de imagem. Ao ligar a fibra elástica degradada através do anticorpo, um agente de imagem pode ser usado na determinação da localização e extensão da degradação de fibra elástica e diagnóstico de uma condição de doença relacionada ou não relacionada. Os agentes de imagem podem incluir aqueles para varreduras de CT ou MRI, ou imagem SPECT, conforme é conhecido na técnica. Os marcadores detectáveis que podem ser direta ou indiretamente ligados aos materiais podem incluir agentes fotoativáveis, fluoróforos, radioisótopos, proteínas bioluminescentes ou peptídeos, marcadores fluorescentes (por exemplo, fluoresceína, isotiocianato (FITC), um corante de cianina, etc.), proteínas fluorescentes ou peptídeos, etiquetas de afinidade (por exemplo, biotina, avidina, proteína A, etc.), etiquetas enzimáticas (por exemplo, peroxidase de raiz forte ou fosfatase alcalina) ou etiquetas isotópicas (por exemplo, 125I), partículas de ouro, bastonetes, substâncias opacas de raios X e microbolhas (por exemplo, para imagens de ultrassom), ou qualquer outra porção detectável para permitir a detecção do anticorpo e, opcionalmente, a imagem da área.

[093] Conforme mencionado, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode ser diretamente ligado a um material a granel (geralmente, mas não necessariamente, na forma de uma partícula) que pode transportar um agente para a liberação à área de uma fibra elástica degradada. Em geral, qualquer material sintético ou natural biocompatível a granel capaz de ser formado em um tamanho e formas úteis pode ser utilizado na formação do portador. Em uma forma de realização, uma partícula polimérica pode ser utilizada. Por exemplo, as partículas formadas a partir de polímeros naturais ou sintéticos incluindo, sem limitação, poliestireno, poli(ácido láctico), policetal, butadieno estireno, terpolímero estireno- acrílico-vinil, poli(metacrilato de metila), poli(metacrilato de etila), poli(cianoacrilato de alquila), copolímero de anidrido estireno-maleico, poli(acetato de vinila), poli(piridina de vinila), poli(divinilbenzeno), poli(tereftalato de butileno), acrilonitrila, acrilatos de cloreto de vinila, poli(etilenoglicol) e semelhantes, ou um aldeído, carboxila, amino, hidroxila ou derivado de hidrazida pode ser utilizado. As partículas formadas de polímeros biológicos, tais como proteínas, podem ser usadas. Por exemplo, as partículas formadas de albumina (por exemplo, albumina de soro bovino), dextrano, gelatina, quitosano, dendrímeros, lipossomas, etc. podem ser utilizadas. Tais partículas podem ser preferidas em certas formas de realização, pois podem ser formadas sem o uso de solventes orgânicos, de acordo com os métodos conhecidos. Outros materiais biocompatíveis que podem ser utilizados na formação de partículas de portador podem incluir, sem limitação, óxidos, tais como sílica, titânia, zircônia e semelhantes, e metais nobres, tais como ouro, prata, platina, paládio e semelhantes. Em geral, os materiais serão biocompatíveis e não imunogênicos. Os materiais biodegradáveis adequados podem incluir, sem limitação, homopolímeros e copolímeros de polissacarídeo e/ou poli(ácido láctico). Por exemplo, as partículas formadas de copolímeros de poli(ácido láctico-co- glicólico) (PLGA), copolímeros de poli(etilenoglicol) (PEG)/poli(ácido láctico) (PLA) em bloco e derivados podem ser utilizados.

[094] A seleção do material de transporte a granel pode ser utilizada para fornecer controle de taxa de liberação de um agente biologicamente ativo da partícula carregada. Por exemplo, a seleção de um material biodegradável pode ser utilizada para controlar a taxa de liberação de agente e fornecer um mecanismo de liberação que pode ser controlado em grande medida pela taxa de degradação de partícula e em menor extensão pela difusão do agente ativo através e fora da partícula a granel. Os materiais podem ser utilizados, tal que a taxa de liberação de agente ativo seja limitada por uma entre difusão (por exemplo, uma partícula não degradável) ou taxa de degradação de nanopartícula (por exemplo, essencialmente nenhuma difusão do agente ativo através da partícula, devido ao pequeno tamanho da malha da matriz), ou a alguma combinação das mesmas que pode ser projetada para uma taxa de liberação desejada.

[095] As partículas podem ser micropartículas ou nanopartículas. Conforme utilizado neste relatório, o termo nanopartícula geralmente se refere a uma partícula cujo tamanho, isto é, o diâmetro médio, pode ser cerca de 1000 nanômetros (nm) ou menos, geralmente, cerca de 500 nm ou menos, por exemplo, cerca de 200 nm ou menos ou cerca de 100 nm ou menos. Em uma forma de realização particular, as nanopartículas podem ser cerca de 50 nm ou menos em tamanho, por exemplo, cerca de 20 nm de diâmetro médio. Em uma forma de realização, as nanopartículas podem ter um diâmetro médio de cerca de 50 nm a cerca de 400 nm, ou de cerca de 100 nm a cerca de 300 nm.

[096] As partículas maiores podem ser alternativamente utilizadas. Por exemplo, em outras formas de realização, as micropartículas com um tamanho médio de até cerca de 50 micrômetros (μm) podem ser utilizadas como um portador.

[097] Em geral, o tamanho preferido de partículas pode depender da aplicação específica, por exemplo, o método específico de liberação dos agentes, tal como através de aplicação de superfície (como em um creme ou loção), através de injeção parenteral usando o sistema circulatório ou trato digestivo, através de inalação, etc., bem como a taxa de liberação desejada de um agente a partir das partículas. Por exemplo, as partículas podem ser de um tamanho para evitar a captação celular, de modo que permaneçam na matriz extracelular e estejam disponíveis para a interação com as fibras elásticas danificadas. Assim, as partículas podem ter cerca de 100 nm ou mais em uma forma de realização, como partículas menores foram mostradas para exibir maior absorção celular. As partículas também podem ser suficientemente pequenas, de modo a penetrar o endotélio e penetrar a membrana basal, de modo a contatar as fibras elásticas do tecido conjuntivo. Por exemplo, as partículas podem ter cerca de 400 nm ou menos de diâmetro médio em uma forma de realização, de modo a penetrar o endotélio e a membrana basal. Quando destinada para o uso em uma formulação administrada intravenosamente, as partículas grandes (por exemplo, maiores do que cerca de 1 μm) são tipicamente desfavorecidas pelo fato de que podem se alojar na microvasculatura. Além disso, as partículas maiores podem se acumular ou agregar in vivo. Como tal, para a administração intravenosa, as partículas abaixo de 1 μm são tipicamente usadas.

[098] Geralmente, os transportadores particulados podem apresentar forma substancialmente esférica, embora outras formas, incluindo, mas não limitadas às placas, bastões, barras, formas irregulares, etc., sejam adequadas para o uso. Conforme será avaliado pelos técnicos no assunto, a composição, forma, tamanho e/ou densidade das partículas podem variar amplamente.

[099] As partículas podem ser projetadas com uma carga de superfície desejável, de modo a melhor alvejar as fibras elásticas danificadas. Por exemplo, as nanopartículas carregadas positivamente mostraram absorção celular superior em comparação às partículas carregadas negativamente. Assim, em uma forma de realização, as partículas podem ser desenvolvidas com uma carga de superfície negativa para manter as partículas na matriz extracelular e evitar a absorção celular.

[0100] As partículas podem ser carregadas com um ou mais agentes, de acordo com qualquer método adequado. Por exemplo, um método de precipitação pode ser utilizado para formar as partículas carregadas em um processo de formação de uma etapa. De acordo com este método, um material a granel de partícula (por exemplo, um polímero biocompatível, tal como poli-(D,L-lactídeo-co- glicolídeo ou um copolímero PGA/PLA) pode ser dissolvido em um solvente. Os solventes adequados podem depender dos materiais específicos envolvidos. Por exemplo, os solventes orgânicos, incluindo acetona, tetraidrofurano, dimetilssulfoxida, dimetilformamida ou acetonitrila e semelhantes, podem ser utilizados. A solução pode ser submetida ao processamento padrão, tal como sonicação, etc., de modo a solubilizar adequadamente o polímero. A solução pode ser, em seguida, adicionada, geralmente, às gotas, a uma segunda solução. Espontaneamente ou depois de um método de emulsificação, por exemplo, depois da sonicação, as partículas do material a granel podem se formar na segunda solução.

[0101] Ao utilizar um processo de formação de etapa única, um agente para a liberação (por exemplo, um agente terapêutico) também pode ser incluído em qualquer uma entre a primeira solução ou a segunda solução. Após a formação das partículas, o agente pode ser incorporado nas partículas com o material a granel.

[0102] A concentração inicial de um agente dentro ou em uma partícula obviamente variará dependendo da natureza do agente, taxa de liberação, etc. Por exemplo, em uma forma de realização, a concentração de carga de um agente biologicamente ativo de/em uma partícula pode variar de cerca de 4 % em peso para mais do que cerca de 40 % em peso, em peso da partícula, com concentrações possíveis superiores e inferiores dependendo do agente específico, da partícula no material a granel e semelhantes. Por exemplo, em uma forma de realização em que um agente para a liberação exibe alta solubilidade no material de partícula a granel, um nível de carga muito alto pode ser alcançado, particularmente, quando ambos os materiais são altamente hidrofóbicos.

[0103] Os processos de formação podem incluir processos de duas etapas nos quais as partículas são formadas primeiro, seguido por uma segunda etapa de carregamento em que um ou mais agentes ativos são carregados nas partículas formadas ou na superfície das partículas formadas. Por exemplo, um método pode incluir intumescimento de uma partícula polimérica pré-formada, opcionalmente reticulada, em uma solução que inclui o agente para a liberação, de modo a carregar a partícula através de um processo de difusão. Em outra forma de realização, o método de carregamento pode incluir polimerização de emulsão dupla, que permite o carregamento de compostos hidrofílicos em partículas hidrofóbicas. O método de formação para nanopartículas não é particularmente limitado e outros métodos de formação conhecidos na técnica, por exemplo, métodos de sonicação, métodos de precipitação de solvente, etc., podem ser utilizados.

[0104] As partículas carregadas podem ser formadas, de modo a controlar a taxa de liberação do composto ativo a partir de uma partícula. Os mecanismos de controle adequados são conhecidos pelos técnicos no assunto. Por exemplo, as taxas de liberação podem depender da concentração relativa de um agente para liberação para o material de partícula a granel, do peso molecular e características de degradação do material de nanopartícula a granel, do tamanho da malha de uma matriz de partícula de polímero, do mecanismo de ligação entre a superfície de uma partícula e de um agente e, assim por diante, como é conhecido. Em qualquer um destes casos, um técnico no assunto é capaz de projetar um sistema, de modo a obter a taxa de liberação desejável. Por exemplo, no caso de liberação puramente limitada por difusão, tal controle pode ser obtido pela variação da concentração de agente dentro de partículas e/ou tamanho de partícula, tamanho de malha de polímero de partícula e assim por diante. No caso de liberação puramente limitada por degradação, unidades de monômero de polímero, por exemplo, teor de ácido glicólico de um polímero PLGA e/ou peso molecular de material de partícula a granel, bem como tamanho de partícula, podem ser ajustadas para “sintonia fina” da taxa de liberação do composto ativo. Por exemplo, o uso de polímeros PLGA com alto teor de ácido glicólico e peso molecular menor pode levar a um aumento da taxa de degradação de uma partícula formada com o polímero. A taxa de liberação de um agente das partículas pode ser ajustada utilizando os parâmetros acima, de modo a produzir transportadores capazes de suportar a liberação por períodos que variam de alguns dias a alguns meses, com as taxas de liberação máximas variando geralmente de algumas horas a algumas semanas.

[0105] Os agentes para a liberação não precisam necessariamente ser incorporados dentro do material a granel. Por exemplo, em uma forma de realização, um agente pode ser ligado à superfície de uma partícula. Por exemplo, um agente pode ser ligado à superfície de uma partícula utilizando a química similar àquela descrita em mais detalhes abaixo em relação à ligação dos anticorpos ou fragmentos de ligação de epítopo às partículas.

[0106] Um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode ser conjugado a um portador, de acordo com qualquer processo adequado. Por exemplo, uma partícula pode incluir grupos reativos de superfície para facilitar a conjugação da partícula a um anticorpo. Os grupos reativos de superfície podem incluir, sem limitação, aldeído, carboxila, amino, hidroxila e semelhantes. Os grupos reativos de superfície podem existir na superfície da partícula como formados ou podem ser adicionados à superfície após a formação, por exemplo, através de oxidação, aminação, etc., da partícula formada, como é geralmente conhecido na técnica. Um anticorpo ou fragmento pode ser, em seguida, conjugado à partícula, por exemplo, através de reação com maleimida na qual o anticorpo é um anticorpo tiolado.

[0107] Um anticorpo ou fragmento pode ser ligado a um portador (por exemplo, uma partícula) através da adsorção não específica ou uma ligação covalente. Os métodos de fixação preferidos podem geralmente depender da aplicação desejada dos conjugados formados. Por exemplo, nestas formas de realização em que um sistema é projetado para funcionar in vivo, partículas de portador podem encontrar colisões múltiplas com vários agentes biológicos e tecidos. Consequentemente, a ligação covalente pode ser preferida em tal forma de realização para melhor garantir que os anticorpos/fragmentos não sejam desalojados através da colisão das partículas com outros materiais.

[0108] A química específica utilizada para ligar os anticorpos/fragmentos (e, opcionalmente, outro agente, tal como um agente de tratamento ativo) a uma superfície de portador não é particularmente limitada. Por exemplo, em uma forma de realização, um anticorpo ou fragmento pode ser ligado a uma partícula clorometilada, de acordo com uma reação de substituição nucleofílica entre um grupo amina do polipeptídeo e um cloreto de alquila da partícula. Em outra forma de realização, a química de carbodiimida solúvel (EDC) e glutaraldeído pode ser usada para obter a ligação covalente de grupos amina do polipeptídeo para partículas carboxiladas e aminadas, respectivamente. Ainda de acordo com outra forma de realização, um peptídeo pode ser ligado a uma partícula através de ligação covalente inicial de uma monocamada de estreptavidina a uma partícula, seguido pela ligação controlável de quantidades desejadas de anticorpo biotinilado. Ainda de acordo com outra forma de realização, um anticorpo/fragmento pode ser covalentemente ligado a uma partícula usando um agente de reticulação, por exemplo, um agente de reticulação fenilazida, tal como Pierce™ sulfo-HSAB (N- Hidroxisulfosuccinimidil-4-azidobenoato) um reagente fotorreativo que pode reticular grupos amina do peptídeo e ligações C-H ou C-C de uma partícula polimérica.

[0109] Em uma forma de realização, um espaçador molecular, por exemplo, um espaçador hidrofílico, pode ser utilizado para amarrar um anticorpo/fragmento de uma partícula. A utilização de um espaçador pode evitar a interação de peptídeos ligados covalentemente com a superfície de partícula e, assim, evitar alterações estruturais dos anticorpos/fragmentos que podem levar à perda parcial ou completa da funcionalidade. Os espaçadores podem incluir polímeros hidrofílicos longos (por exemplo, peso molecular médio ponderado entre cerca de 2.000 e cerca de 20.000 Da), tais como, sem limitação, poli(etilenoglicol), álcool polivinílico, polissacarídeos e assim por diante.

[0110] O espaçador e a partícula podem incluir ou ser processados para incluir a funcionalidade, de modo a facilitar a ligação de um com o outro. Por exemplo, um espaçador de PEG pode incluir funcionalidade de aldeído e pode se ligar a uma partícula aminada através da reação covalente entre o grupo aldeído do espaçador e o grupo amina da partícula. Um anticorpo/fragmento tiolado pode ser, em seguida, ligado ao espaçador, de acordo com um processo simples, incluindo a mistura de uma solução incluindo o anticorpo tiolado com uma suspensão aquosa de partículas na presença de maleimida.

[0111] No estágio final de conjugação, uma partícula de portador pode ser bloqueada, por exemplo, com um tensoativo, tal como Tween® 20, Pluronic® ou dextrano, que pode ser adsorvido na partícula para bloquear qualquer superfície hidrofóbica exposta à solução, bem como substituir quaisquer agentes não ligados. As baixas concentrações de tais materiais geralmente não interferem com a atividade de agentes. A presença de um tensoativo pode reduzir as interações de proteína-partícula indesejáveis e evitar a agregação de partículas. Também pode evitar “incrustação” não seletiva da superfície de uma partícula com outras proteínas no ambiente em que o material é utilizado, o que poderia potencialmente desativar um sistema.

[0112] Em uma forma de realização, um portador pode ser projetado para exibir propriedades de ancoragem para uma aplicação desejada. Por exemplo, a capacidade de ligação e período de tempo que uma partícula de portador pode permanecer ligada à fibra elástica degradada e pode ser construída por alteração de tamanho e/ou concentração de partícula dos anticorpos/fragmentos de alvejamento sobre a superfície da partícula.

[0113] Os compostos conjugados podem ser liberados à fibra elástica degradada, de acordo com qualquer método adequado, geralmente, dependendo de onde a fibra alvejada está. Por exemplo, ao considerar um método de liberação sistêmico, tal como uma via de liberação intravenosa, os conjugados podem circular até que a fibra elástica danificada seja contatada, apenas para propósitos de ilustração e não pretendem ser limitante, como no caso de elastose. Uma vez ligado a uma fibra elástica através do anticorpo/fragmento, um agente pode facilitar a detecção ou pode ser liberado a partir da partícula por meio, por exemplo, da degradação de partícula, difusão, etc., para fornecer a atividade desejada. Os compostos podem ser liberados ou administrados intensa ou cronicamente, de acordo com vários métodos de liberação, incluindo métodos de liberação suportados que incorporam adesivos perivasculares ou endovasculares, aplicação tópica, administração intravenosa, bombas osmóticas, inalação e assim por diante.

[0114] A presente divulgação pode ser melhor entendida com referência aos Exemplos abaixo.

MÉTODOS DE FORMAÇÃO FORMAÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS

[0115] Hemocianina de lapa buraco de fechadura (KLH) foi conjugada ao fragmento de peptídeo de aminoácido selecionado de elastina de rato (isto é, uma de SEQ ID NOs: 1 a 3). Usando os protocolos padrão, os camundongos RBF/dnj ou balb/c foram sensibilizados por via subcutânea (s.c.) com uma dose inicial de 100 μg de proteína total de peptídeo KLH em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e adjuvante TiterMax® em um volume total de 200 μL. Um reforço subsequente foi determinado 14 dias mais tarde em adjuvante de Freund incompleto. Os reforços livres de adjuvante foram, em seguida, determinados em intervalos de 21 dias, para um total de 4 imunizações. A última imunização foi determinada por uma injeção intraperitoneal (i.p.). Cinco dias depois da última imunização, os camundongos foram sacrificados em câmaras de CO2 e os baços foram coletados para células que foram, em seguida, fundidas com mielomas FOX-NY ou Sp2/0-Ag14 na presença de polietilenoglicol (PEG) para fazer hibridomas serem cultivados em placas de microtitulação de 96 poços usando procedimentos de crescimento celular padrão. Quatorze dias depois da fusão, os sobrenadantes destas misturas de hibridoma brutas foram rastreados para a reatividade imunológica contra fragmentos de peptídeo livres não conjugados por etapas de ELISA. Os hibridomas positivos foram cultivados e clonados adicionalmente por diluição limitante para fornecer uma linha de células secretoras de anticorpo monoclonal (hibridoma). Os sobrenadantes da cultura de hibridoma foram, em seguida, novamente verificados quanto à especificidade e caracterizados completamente quanto ao isotipo e aplicações técnicas.

FORMAÇÃO DE ANTICORPOS POLICLONAIS

[0116] Hemocianina de lapa buraco de fechadura (KLH) foi conjugada ao fragmento de peptídeo de aminoácido selecionado de elastina de rato (isto é, uma de SEQ ID NOs: 1 a 3). Os coelhos brancos da Nova Zelândia foram sensibilizados subcutaneamente (s.c.) com uma dose inicial de 100 μg de proteína total de peptídeo KLH em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e adjuvante TiterMax® em um volume total de 200 μL, determinada em cada uma das duas regiões de ombro, e em cada uma das duas regiões de anca posteriores. Um reforço subsequente foi determinado 14 dias mais tarde no adjuvante de Freund incompleto. Os reforços livres de adjuvante foram, em seguida, determinados em intervalos de 21 dias, para um total de 5 imunizações. Dez dias mais tarde, os coelhos foram sacrificados e sangrados, o sangue coagulou e o soro foi coletado depois da centrifugação. O soro depois foi caracterizado quanto ao título de anticorpos.

FORMAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS Nanopartículas carregadas com corante DiR (útil para marcação fluorescente e imagem in vivo)

[0117] As partículas carregadas com corante DiR foram preparadas por meio de coacervação. Brevemente, as nanopartículas carregadas de iodeto de infravermelho fluorescente (DIR-NPs) 1,1-dioctadecil-3,3,3,3- tetrametilindotricarbocianina (DIR) foram obtidas dissolvendo 250 mg de albumina de soro bovino (BSA) (SeraCare™, MA) em 4 mL de água desionizada. Em seguida, 2,5 mg de DIR foram dissolvidos em 100 μL de acetona e adicionados à solução de BSA. Depois de uma hora de agitação, a mistura foi adicionada, às gotas, a 24 mL de etanol sob sonicação contínua (Omni Ruptor 400 Ultrasonic Homogenizer, Omni International Inc, Kennesaw, GA) durante meia-hora. Para a reticulação, glutaraldeído (grau EM de 70 %, EMS, PA) foi adicionado durante a agitação (42 μg por mg de BSA). Em seguida, 10 mg de DIR-NPs foram incubados com 2,5 mg de reticulador heterobifuntional de éster poli(etilenoglicol)α-maleimida-ω-N- hidroxissuccinimida (éster maleimida-PEG-NHS, MW 2000 Da, Nanocs Inc., NY) para obter um sistema de partículas reativas à sulfirila. Os reagentes de Traut (34 μg, G-Biosciences, Saint Louis, MO) foram usados para tiolação de 10 μg de anticorpo de elastina anti-rato de coelho (United States Biological, Swampscott, MA) como controle ou um anticorpo formado contra as sequências descritas neste relatório, e a mistura foi incubada em tampão HEPES (20 mM, pH = 9,0) durante uma hora na temperatura ambiente. Os anticorpos tiolados foram lavados com tampão HEPES e foram adicionados às nanopartículas (4 μg de anticorpo por 1 mg de NPs) e incubados durante a noite para conjugação. Nanopartículas carregadas com EDTA (um agente quelante)

[0118] As nanopartículas carregadas com EDTA (EDTA-NPs) foram obtidas dissolvendo 200 mg de BSA (SeraCare™, MA) e 100 mg de sal dissódico de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (Fisher Scientific™, NJ) em 4 mL de água desionizada e o pH foi ajustado a 8,5. A solução aquosa foi adicionada, às gotas, a 16 mL de etanol sob sonicação de sonda durante 1 hora. Para a reticulação, glutaraldeído foi adicionado durante a sonicação (10 µg por mg de BSA). O procedimento de conjugação de anticorpo de elastina foi similar àquele de DIR-NPs. Nanopartículas carregadas com PGG (útil para estabilizar a elastina)

[0119] As nanopartículas carregadas com PGG (PGG-NPs) foram obtidas dissolvendo 250 mg de BSA (SeraCare™, MA) em 4 mL de água desionizada (DI). PGG (125 mg) foi dissolvido em 400 µL de sulfóxido de dimetila e adicionado lentamente à solução de BSA. Depois de uma hora de agitação, a mistura foi adicionada, às gotas, a 24 mL de etanol sob sonicação contínua durante meia-hora. Glutaraldeído foi adicionado durante a agitação em uma concentração de 12 μg/mg de proteína (BSA). O procedimento de conjugação de anticorpo de elastina foi similar àquele de DIR- NPs. Nanopartículas carregadas com um inibidor de MMP BB-94

[0120] As nanopartículas de poli(D,L-lactídeo) (PLA) foram preparadas usando um método de nano-precipitação com base na difusão de solvente. PLA (MW médio 75k a 120k) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) foi dissolvido em acetona (VWR International, Radnor, PA). 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N- [metóxi(polietilenoglicol)-2000] (DSPE-PEG (2000) Maleimida) (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL) e BB-94 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) foram dissolvidos em sulfóxido de dimetila (DMSO) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO), a solução acima depois foi adicionada à solução de PLA. A solução de polímero foi adicionada, às gotas, (16 µL/s) à água mantida sob sonicação (Omni Ruptor 4000) durante 20 minutos a 4 °C. Após a sonicação, as partículas foram lavadas duas vezes com água destilada por centrifugação a 14000x g durante 30 minutos a 4 °C e, em seguida, recolocadas em suspensão em água destilada. A razão de não solvente (água) para solvente

(acetona) foi de 1:15 para todos os experimentos. Três lotes diferentes contendo razão polímero para BB-94 5:1, 10:1 e 15:1 foram preparados em que a razão entre os dois polímeros (PLA: DSPE-PEG(2000) Maleimida) foi de 4:1. O procedimento de conjugação de anticorpo de elastina foi similar àquele de DIR- NPs. Nanopartículas carregadas com um hiclato de doxiciclina

[0121] As nanopartículas de BSA carregadas com hiclato de doxiciclina (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) foram preparadas usando um procedimento similar. Brevemente, 25 mg de hiclato de doxiciclina (DOXTot) foram dissolvidos juntamente com 100 mg de BSA (BSATot) em 2 mL de água e foram agitados em 500 rpm durante 30 minutos. Em seguida, 4 mL de etanol foram adicionados, às gotas, em uma taxa de 1 mL/min usando um dispensador automatizado, que torna a solução turva. Para isso, 8 % de glutaraldeído (40 μg/mg BSA) foi adicionado para reticular a albumina e a mistura foi agitada durante 2 horas na temperatura ambiente. A solução resultante foi centrifugada em 14.000 rpm durante 10 minutos para separar as nanopartículas formadas. As nanopartículas foram lavadas três vezes com água DI antes de prosseguir com a conjugação de anticorpo antielastina. O sobrenadante obtido a partir da lavagem foi usado para estimar a quantidade de doxiciclina livre (DOXF) medindo a absorvância a 273 nm usando um espectrofotômetro de UV (BioTek Instruments Inc., Winooski, VT). A diferença entre DOXTot e DOXF forneceu a quantidade de doxiciclina encapsulada (DOXNP) que foi de cerca de 17 %. EXEMPLO 1

[0122] Os anticorpos monoclonais e policlonais foram formados contra a SEQ ID NO: 1 (GALGPGGKPPKPGAGLL), conforme descrito.

[0123] Aortas de rato e camundongos (n = 8) foram adquiridas a partir da BioChemed Inc. A solução de elastase foi preparada dissolvendo a elastase pancreática porcina (10 U/mL) em água DI. As aortas foram amarradas a uma sutura e as metades inferiores da aorta foram colocadas em suspensão na solução de elastase durante 1 hora a 37 °C. As aortas foram, em seguida, lavadas completamente em solução salina e todas as aortas foram incubadas durante a noite em 10 mg/mL de solução de DiR- NPs que foram etiquetadas com anticorpos monoclonais para SEQ ID NO: 1. Em seguida, as aortas foram lavadas em solução salina durante 90 minutos em um agitador e representadas visualmente usando sistema de imagem IVIS. A FIG. 1 ilustra os resultados para as aortas de rato e a FIG. 2 ilustra os resultados para as aortas de camundongo. Conforme mostrado, os anticorpos antielastina foram preferencialmente ligados às porções das aortas que incluíram as fibras elásticas degradadas.

[0124] Oito ratos machos Sprague Dawley de 6 semanas de idade foram submetidos à lesão da aorta abdominal através de aplicação periadventicial de 0,5 M CaCl2 três vezes durante 5 minutos cada. Depois de 10 dias de lesão, os ratos foram injetados com BSA-DiR NPs, a uma concentração de 10 mg/kg, marcados com anticorpo monoclonal antielastina para a SEQ ID NO: 1. Vinte e quatro horas depois da injeção, os animais foram sacrificados e suas aortas foram representadas visualmente usando sistema de imagem IVIS para alvejamento de nanopartículas. Conforme indicado na FIG. 3, o anticorpo alvejou com sucesso a elastina danificada (área quadrada) na aorta, enquanto poupou a elastina saudável nas outras partes da aorta. EXEMPLO 2

[0125] Uma porção de uma artéria da perna humana calcificada foi processada e embebida em parafina. Seções de 5 µm foram cortadas e montadas em lâminas de vidro carregadas positivamente e a análise histológica foi realizada. A imunohistoquímica (IHC) para detectar elastina com anticorpo monoclonal para SEQ ID NO: 1 como o anticorpo primário (10 µg/mL) foi realizada usando um kit IHC comercialmente disponível (Enzo Life Sciences, Inc.). Além disso, as pigmentações de Verhoeff van Gieson (VVG) foram usadas para identificar fibra de elastina quebrada (ou danificada). IHC revelou que o anticorpo para SEQ ID NO: 1 foi capaz de marcar com sucesso a elastina danificada presente na artéria indicada pelas áreas mais escuras da FIG. 4. A pigmentação VVG mostrou que a elastina estava quebrada e danificada (FIG. 6, FIG. 7). Mesmo que a fibra de elastina danificada fosse visível com VVG, IHC para elastina não mostrou qualquer pigmentação escura quando incubada com apenas o anticorpo controle (FIG. 5), confirmando eficazmente que o anticorpo para SEQ ID NO: 1 foi capaz de reconhecer e se ligar à elastina humana das fibras elásticas danificadas, enquanto o anticorpo controle não o fez. EXEMPLO 3

[0126] Um modelo de enfisema foi desenvolvido em ratos Sprague-Dawley machos de seis semanas de idade (n = 6) que receberam uma injeção intratraqueal de 50 U de elastase pancreática porcina (PPE) (Elastin Products Company Inc., Owensville, MO) dissolvida em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e esterilizada por filtração. Os ratos tratados com elastase desenvolveram danos à elastina ao longo de quatro semanas. Os animais foram sacrificados e as aortas foram cuidadosamente explantadas depois da lavagem de todo o corpo com solução salina. Uma parte dos pulmões foi processada e embebida em parafina. Seções com cinco mícrons de espessura foram feitas e imunohistoquímica foi realizada usando anticorpo monoclonal, conforme descrito neste relatório, como anticorpo primário com vários tecidos usando kit IHC (Enzo Life Sciences, Inc.). IHC para seções embebidas em parafina foi realizado, de acordo com o protocolo do fabricante. A concentração do anticorpo foi mantida a 10μg/mL para todos os experimentos.

[0127] Um protocolo similar foi usado para desenvolver um modelo de enfisema em camundongo e um modelo de aneurisma AngII em camundongo. A FIG. 8 a FIG. 11 ilustram pigmentação de IHC dos vários tecidos depois da incubação com um anticorpo monoclonal para SEQ ID NO: 1 nos modelos animais,

incluindo o modelo de enfisema de elastase em pulmões de ratos (FIG. 8), o modelo de enfisema de elastase em pulmões de camundongo (FIG. 9), o modelo de aneurisma AngII em aorta de camundongo (FIG. 10), pele de camundongo tratada com elastase (FIG. 11). Conforme mostrado, o anticorpo criado contra a SEQ ID NO: 1 foi capaz de marcar a elastina danificada em múltiplos tipos de tecidos diferentes.

[0128] A FIG. 8 e a FIG. 12 ilustram tecidos pulmonares do modelo de enfisema em tecido de rato após a incubação com o anticorpo criado contra a SEQ ID NO: 1. A FIG. 13 e a FIG. 14 mostram os tecidos pulmonares a partir do modelo de rato com enfisema após a incubação com o anticorpo controle. Conforme pode ser observado, o anticorpo para a SEQ ID NO: 1 mostrou excelente ligação ao tecido danificado. EXEMPLO 4

[0129] Os camundongos foram anestesiados e bombas enchidas com angiotensina foram colocadas em bolsos subcutâneos feitos perpendiculares à espinha dos animais. Duas semanas depois, os animais desenvolveram espontaneamente aneurisma na aorta. Uma parte da aorta contendo dano de elastina foi processada e embebida em parafina. Seções de cinco mícrons de espessura foram feitas e a imunohistoquímica foi realizada usando um anticorpo monoclonal (mAb) RE2 criado contra a SEQ ID NO: 1 como anticorpo primário usando kit IHC (Enzo Life Sciences, Inc.). IHC para seções embebidas em parafina foi realizada, de acordo com o protocolo do fabricante. A concentração do anticorpo foi mantida a 10 μg/mL para todos os experimentos. Os exemplos das aortas de camundongos são ilustrados na FIG. 15 e FIG. 16. Conforme pode ser observado pelas áreas escuras nas imagens, o anticorpo está ligado à elastina degradada. EXEMPLO 5

[0130] Os tecidos pulmonares mostrados nas FIGs. 17 a 20 foram obtidos a partir de camundongos C57BL/6 machos de oito semanas de idade que receberam uma injeção intratraqueal de 0,50 U de elastase pancreática porcina (PPE) (Elastin Products Company Inc., Owensville, MO) dissolvida em solução salina tamponada por fosfato (PBS) e esterilizada por filtração. Os camundongos tratados com elastase desenvolveram danos à elastina ao longo de quatro semanas. Os animais foram sacrificados e as aortas foram explantadas depois da lavagem de todo o corpo com solução salina. Uma parte dos pulmões foi processada e embebida em parafina. Seções de cinco mícrons de espessura foram feitas e a imunohistoquímica foi realizada usando mAb RE2, um anticorpo monoclonal criado contra SEQ ID NO: 1 como anticorpo primário com vários tecidos usando kit IHC (Enzo Life Sciences, Inc.). IHC para seções embebidas em parafina foi realizada, de acordo com o protocolo do fabricante. A concentração de mAb RE2 foi mantida a 10 ug/mL para todos os experimentos.

[0131] A FIG. 17 e FIG. 18 ilustram as seções com IHC realizada com o anticorpo criado contra SEQ ID NO: 1, e a FIG. 19 e a FIG. 20 ilustram seções com IHC realizada com o anticorpo controle. Conforme pode ser observado, o anticorpo contra a SEQ ID NO: 1 está fortemente ligado ao tecido danificado. EXEMPLO 6

[0132] Os tecidos da pele foram obtidos a partir de camundongos sem pelo de 8 semanas de idade. A pele dos animais foi dividida em quadrantes e a elastase pancreática porcina (30 U) dissolvida em solução salina tamponada com fosfato e esterilizada por filtração foi injetada de forma intradérmica. Isto foi repetido depois de duas semanas e depois de quatro semanas. A elastina na pele foi danificada devido à atividade de elastase. Os animais foram sacrificados e a pele foi cuidadosamente coletada e congelada. As amostras de pele foram posteriormente processadas e embebidas em parafina. Seção de cinco mícrons de espessura foram feitas e a imunohistoquímica foi feita usando anticorpo mAb RE2 como anticorpo primário (FIG. 21 e 22) usando kit IHC (Enzo Life Sciences, Inc.). A FIG. 23 e a FIG. 24 ilustram os resultados usando o anticorpo controle. IHC para seções embebidas em parafina foi realizada, de acordo com o protocolo do fabricante. A concentração do anticorpo foi mantida a 10 μg/mL para todos os experimentos. EXEMPLO 7

[0133] Western blot e pigmentação com prata foram usados para detectar as ligações de anticorpos divulgados com tropoelastina. O meio de cultura celular, alfa- elastina padrão e solução de sobrenadante da aorta do rato digerida com elastase foram usados para testar a detecção de elastina por anticorpo monoclonal criado contra a SEQ ID NO: 1 e o anticorpo de elastina de camundongo monoclonal criado como controle (um anticorpo monoclonal produzido a partir do camundongo antes dos hibridomas). A pigmentação com prata (FIG. 25) mostrou elastina solúvel em marcadores de proteína entre 75 kDa e 50 kDa, mas nenhum dos anticorpos conseguiu detectar a elastina solúvel. Quando a amostra de aorta digerida com elastase foi usada, o anticorpo policlonal de coelho mostrou uma banda em torno de 50 kDa de marcador proteína. O camundongo monoclonal tinha uma única banda muito específica acima de 150 kDa de marcador com amostra de aorta digerida com elastase, mas não no meio de cultura celular. EXEMPLO 8

[0134] Um anticorpo monoclonal de isotipo IgG1 foi formado contra a sequência de elastina humana SEQ ID NO: 3 (PGGYGLPYTTGKLPYGYP).

[0135] IHC usando pigmentação H&E (FIG. 26) mostrou especificidade para a elastina degradada na aorta humana com aneurisma leve. A porção circulada na pigmentação VVG para elastina (FIG. 27) mostrou degradação de elastina e a mesma área mostrou a ligação de anticorpo à seção (FIG. 28). O anticorpo controle secundário apenas não mostrou o sinal (FIG. 29).

[0136] IHC usando pigmentação H&E (FIG. 30) mostrou especificidade para a elastina degradada na aorta humana com aneurisma suave. A porção circulada na pigmentação VVG para elastina (FIG. 31) mostrou degradação de elastina e a mesma área mostrou ligação de anticorpo à seção (FIG. 32). O anticorpo controle secundário apenas não mostrou o sinal (FIG. 33). EXEMPLO 9

[0137] As amostras frescas de artéria de endarterectomia da carótida humana (CEA) foram separadas em duas partes: Uma parte foi usada para o alvejamento com DIR-NPs carregados com o anticorpo criado contra a SEQ ID NO: 3 (grupo ELN) e a outra parte foi usada para o alvejamento com DiR-NPs sem anticorpo de elastina (grupo controle). As amostras foram incubadas a 4 °C durante 12 horas. As amostras foram, em seguida, lavadas com PBS e a ligação de nanopartículas foi testada com IVIS. Os resultados de IVIS (FIG. 34) mostraram que DiR- NPs conjugados com ELN foram ligados à elastina degradada e imatura na artéria, enquanto os NPs controle sem anticorpo não foram ligados.

[0138] As amostras, em seguida, foram submetidas à descalcificação para a preparação da histologia e foram embebidas em OCT® para obter seções congeladas para a pigmentação. Conforme demonstrado na FIG. 35 e na FIG. 36, o alvejamento de nanopartículas para a elastina em aterosclerose foi observado por exame direto (painéis da esquerda), pigmentação H&E (painéis do meio) e pigmentação VVG (painéis da direita). NPs controle sem o anticorpo (painéis inferiores) não foram direcionados. EXEMPLO 10

[0139] Os hibridomas que expressam um anticorpo monoclonal de isotipo IgG1 formado contra a sequência de elastina humana SEQ ID NO: 3 foram caracterizados. O RNA total foi isolado das células de hibridoma seguindo o manual técnico do Reagente TRIzol®. O RNA total depois foi transcrito reversamente em cDNA usando primers antissentido específicos de isotipo ou primers universais seguindo o manual técnico do kit PrimeScript™ 1st Strand cDNA Synthesis. Os fragmentos de anticorpo de VH, VL, CH e CL foram amplificados, de acordo com o procedimento de operação padrão de amplificação rápida de extremidades de cDNA (RACE) de GenScript®. Os fragmentos de anticorpo amplificados foram clonados em um vetor de clonagem padrão separadamente. PCR de colônia foi realizada para rastrear clones com inserções de tamanhos corretos. Não menos do que cinco colônias com inserções de tamanhos corretos foram sequenciadas para cada fragmento. As sequências de diferentes clones foram alinhadas e uma sequência de consenso foi obtida.

[0140] A FIG. 37 ilustra esquematicamente o anticorpo monoclonal. O isotipo foi camundongo IgG/capa, conforme analisado pelas sequências da região constante. Para a sequência de consenso, cinco clones foram sequenciados para as sequências VH, CH, VL, e CL, todos com mais do que 99 % de identidade de sequência. A análise IMGT das junções V(D)J é fornecida na Tabela 1 abaixo. Todas as sequências variáveis foram produtivas e nenhum segmento D foi detectado. Tabela 1 Região V (% Quadro GENE V e de Gene J e Sequência Junção AA de Alelo identidade Alelo junção (nt) Musmus 96,53 % Musmus No VH IGHV9 - 3 - (278/288 nt) CAREDYW IGHJ2*01F quadro 1*01F Musmus IGKV1- 98,64 % Musmus No

VL CWQGTHFPWTF 135*01F (290/294 nt) IGKJ1*01F quadro

[0141] A SEQ ID NO: 4 fornece a sequência de DNA completa e a SEQ ID NO: 5 fornece a sequência de aminoácidos completa para a cadeia pesada do anticorpo monoclonal. A SEQ ID NO: 6 (nt) e a SEQ ID NO: 7 (aa) fornecem as sequências para a região variável da cadeia pesada, com as regiões CDR e FR descritas na SEQ ID NOs: 8 a 21. A SEQ ID NO: 22 fornece a sequência de DNA completa e a SEQ ID NO: 23 fornece a sequência de aminoácidos completa para a cadeia leve do anticorpo monoclonal. A SEQ ID NO: 24 (nt) e a SEQ ID NO: 25 (aa) fornecem as sequências para a região variável da cadeia leve com as regiões CDR e FR descritas na SEQ ID NOs: 26 a 39. EXEMPLO 11

[0142] As nanopartículas de ouro cobertas com citrato (GNPs) foram adquiridas a partir de Meliorum Technologies, Rochester, NY) com um tamanho médio de 150±25 nm. Um ácido tiol-PEG-heterobifuncional (SH-PEG-COOH) (2000 MW, Nanocs, Nova Iorque, NY) foi adicionado às GNPs em uma razão ponderada de 4:1 e a mistura foi incubada a 4 °C durante 48 horas com balanço suave para obter PEGuilação. GNPs PEGuiladas foram coletadas depois da centrifugação em

10.000 rpm durante 20 minutos na temperatura ambiente e recolocadas em suspensão em 0,1 M MES (pH: 5,5). A química EDC/NHS foi utilizada para conjugar as GNPs PEGuiladas com anticorpo antielastina, conforme descrito neste relatório. Brevemente, EDC (cloridreto de N-(3-Dimetilaminopropil)-N-etilcarbodi-imida) (Oakwood Chemical, Estill, SC) e Sulfo-NHS (N-hidroxisulfossuccinimida) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) foram adicionados em uma razão ponderada de 2:1 e 4:1 separadamente das GNPs PEGuiladas. Esta mistura foi incubada na temperatura ambiente durante 6 horas com agitação suave em vórtex. GNPs resultantes foram coletadas depois da centrifugação em 10.000 rpm durante 20 minutos na temperatura ambiente e recolocadas em suspensão em 1 mL de PBS (pH 7,8). 4 µg de anticorpo antielastina por mg de GNPs foram adicionados e a mistura foi incubada durante a noite a 4 °C sob agitação lenta. O anticorpo excessivo foi removido centrifugando a solução resultante em 10.000 rpm durante 20 minutos. Os conjugados de anticorpo/nanopartícula resultantes (EL-GNPs) foram recolocados em suspensão em solução salina a uma concentração de 3 mg/mL para a injeção.

[0143] Quinze camundongos machos deficientes em receptor de lipoproteína de baixa densidade (LDLr) (-/-) (2 meses de idade, em fundo de C57BL/6) foram obtidos a partir do Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Onze camundongos foram usados para estudo de aneurisma, enquanto outros quatro camundongos foram usados como controles saudáveis de idade. Os aneurismas foram induzidos por infusão sistêmica de angiotensina II (AngII, Bachem Americas Inc., Torrance, CA) em combinação com uma dieta com gordura saturada (21 % p/p) e colesterol (0,2 % p/p; catálogo no. TD88137; Harlan Teklad). Brevemente, os camundongos foram alimentados com dieta rica em gordura durante 1 semana antes e 6 semanas durante a infusão de AngII. As bombas osmóticas (Modelo 2004; Alzet®, Cupertino, CA) preenchidas com AngII foram implantadas subcutaneamente através de uma incisão no ombro direito posterior dos camundongos sob anestesia com isoflurano. 2 % a 3 % de isoflurano foram inalados pelos camundongos como anestesia durante todo o processo cirúrgico. A taxa de bombeamento para AngII foi definida para 1000 ng/kg/min. As bombas foram explantadas 4 semanas depois da implantação e os camundongos puderam se recuperar durante 2 semanas. A progressão da doença foi monitorada com uma máquina de ultrassom de alta frequência, FUJIFILM VisualSonics® Vevo® 2100 (FUJIFILM, Toronto, ON, Canadá), utilizando uma sonda de matriz linear (MS-550D, frequência de banda larga 22 MHz a 55 MHz).

[0144] EL-GNPs foram dadas aos camundongos (n = 15) como um agente de contraste através de uma injeção retro-orbital a uma dosagem de 10 mg/kg de peso do animal sob 2 % a 3 % de inalação de isoflurano. Os camundongos foram sacrificados 24 horas depois das injeções e as aortas integrais (a partir da aorta ascendente para bifurcação ilíaca) foram explantadas. O tecido conjuntivo circundante nas aortas foi limpo antes da varredura por micro-CT. As aortas foram imersas em óleo de milho e fotografadas (90 kV, 250 mAs, 300 ms, filtro de 0,2 mm

Al) com um sistema de micro-CT com alto desempenho in vivo (SKYSCAN 1176, Bruker, Billerica, MA). A reconstrução foi realizada usando o software SKYSCAN Nrecon com base no algoritmo Feldkamp. As imagens reconstruídas das aortas foram visualizadas, e as dimensões dos aneurismas foram medidas usando software DataViewer e CTVox. As imagens 3D de projeção de intensidade máxima (MIP) (FIG. 38, esquerda) foram obtidas para determinar a distribuição de EL-GNPs dentro das aortas, enquanto as imagens de atenuação (FIG. 38, direita) foram adquiridas para estudar a intensidade dos sinais dados tanto por EL-GNPs quanto pelo tecido. A intensidade de sinal foi quantificada adicionalmente usando software CTAn.

[0145] Amostras histológicas criosseccionadas (5 µm) foram examinadas com um sistema óptico de campo escuro aprimorado CytoViva (CytoViva, Inc., Auburn, AL). O sistema (Olympus BX51) emprega um condensador de campo ultraescuro de óleo de imersão (Tipo A, nd> 1,515, Cargille Brand) e uma objetiva de 40× Air Plan-FL com uma abertura numérica ajustável de 1,2 a 1,4. A iluminação foi fornecida por um laminador regulamentado Fiber-Lite® DC-950. As imagens de microscopia de campo escuro aprimoradas (FIG. 39) foram obtidas usando o software Exponent 7 com um ganho de 2,8 e exposição de 53 ms para visualizar as EL-GNPs. O gerador de imagens hiperespectral (montado em um microscópio e controlado pelo software Environment for Visualization for Rich Data Interpretation (VERDI) de Exelis Visual Information Solutions, Inc.) foi usado para extrair informações espectrais para mapear as EL-GNPs nas amostras (FIG. 41) com um tempo de exposição de 0,25 ms com um campo de visão completo (643 linhas). As amostras controle negativo foram representadas visualmente e analisadas para criar uma biblioteca espectral como referência. O mapeamento foi obtido pela aplicação de uma biblioteca espectral filtrada pela subtração da biblioteca espectral de controle negativo do controle positivo.

[0146] As criosseções tanto dos aneurismas quanto das aortas saudáveis foram usadas para análise histológica (FIG. 40). As aortas foram fixadas em formalina tamponada, embebidas em composto de temperatura de corte ideal (OCT) (Sakura Finetek USA, Torrance, CA) depois de serem lavadas em água DI e seccionadas por procedimentos padrão. Seções de cinco micrômetros foram montadas em lâminas de vidro carregadas positivamente. As lâminas foram colocadas em 100 % de acetona pré-fria (Fisher Science Education, Nazaré, PA) durante 10 minutos para aderir os tecidos às lâminas. Subsequentemente, as lâminas foram enxaguadas com água da torneira durante 3 minutos para remover o composto de OCT para pigmentação adicional. As lâminas foram coradas com VVG para determinar os danos de elastina em diferentes amostras.

[0147] A FIG. 39 e a FIG. 40 apresentam as imagens de campo escuro (FIG. 39) e as imagens coloridas VVG (FIG. 40) de duas seções (esquerda e direita nas imagens) da aorta. Conforme pode ser observado, um sinal de imagem de campo escuro forte é observado na imagem esquerda da FIG. 39, que mostrou mais dano à elastina (esquerda, FIG. 40) em comparação à seção de tecido mostrada na direita de cada figura, que continha principalmente fibras de elastina intactas (direita, FIG. 40). Os sinais dados pelas nanopartículas de ouro foram encontrados em posições onde a elastina degradada foi exposta, indicada pelas setas mais escuras nas imagens, enquanto as fibras de elastina saudáveis e intactas estavam desprovidas de sinal de GNP, conforme indicado pelas setas mais claras nas imagens.

[0148] A FIG. 41 fornece os resultados do mapeamento hiperespectral do tecido da aorta suprarrenal marcado com nanopartículas de ouro pelo uso de EL- GNPs marcadas com anticorpo. As setas na FIG. 41, da parte superior até a parte inferior, correspondem às aortas suprarrenais com diferentes níveis de dano à elastina dentro das paredes aórticas, de cima para baixo, respectivamente. A primeira coluna (A) apresenta imagens de microscopia de campo claro (40X) depois da pigmentação VVG e demonstrou nível de degradação de elastina diferente. A segunda coluna (B) apresenta imagens de microscopia em campo escuro aprimoradas (40X) que mostram a presença de EL-GNPs de alto contraste nos tecidos, conforme indicado pelas setas. A terceira coluna (C) inclui imagens hiperespectrais (40X), a quarta coluna (D) inclui as imagens hiperespectrais mapeadas contra a respectiva biblioteca de espectro de referência gerada com controles negativos. Isto identificou uma distribuição mais ampla de EL-GNPs em comparação à microscopia em campo escuro (FIG. 39). Além disso, a quantidade de EL-GNPs mapeada aumentou à medida que o tecido mostrou mais dano à elastina.

[0149] Embora o presente assunto tenha sido descrito em detalhes em relação às formas de realização específicas, será avaliado pelos técnicos no assunto, ao atingir uma compreensão do anterior, que podem prontamente produzir alterações, variações e equivalentes para tais formas de realização. Consequentemente, o escopo da presente divulgação é a título de exemplo em vez de limitação, e a divulgação do assunto não impede a inclusão de tais modificações, variações e/ou adições ao presente assunto, conforme seria prontamente evidente para um técnico no assunto.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de que reconhece especificamente um epítopo de uma ou mais entre a SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3.

2. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

3. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo policlonal.

4. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma ou mais entre a SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 31, ou em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende a SEQ ID NO: 7 e/ou SEQ ID NO: 25.

5. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo que é um anticorpo completamente humano, um anticorpo não humano, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado ou um nanocorpo.

6. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um fragmento de ligação ao antígeno que compreende um Fab, um Fab’, um F(ab’)2, um Fv, um Fv ligado a dissulfeto ou um scFv.

7. Composição, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, ligado de maneira operável direta ou indiretamente a um material secundário.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADA pelo fato de que o material secundário compreende um agente biologicamente ativo, tal como um anticoagulante, um antiplaquetário, um anti-inflamatório, um inibidor da proliferação de SMC, um inibidor da metaloproteinase da matriz, um inibidor de catepsina, um agente citostático, um antioxidante, um agente estabilizante de colágeno, um agente estabilizante de elastina e um agente de regeneração de elastina, uma citocina, uma enzima, uma quimiocina, um radioisótopo, uma toxina, um agente imunomodulatório, um quelante, um constructo de ácido nucleico, um agente quimioterápico, um agente de reticulação de elastina ou um agente de reticulação de tropoelastina.

9. Composição, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADA pelo fato de que o material secundário compreende um agente de imagem, tal como um agente fotoativável, um fluoróforo, um radioisótopo, uma proteína ou peptídeo bioluminescente, uma etiqueta fluorescente, proteína ou peptídeo fluorescente s, um marcador de afinidade, um marcador enzimático, um agente de MRI, uma partícula de ouro, uma substância opaca de raios X ou um marcador isotópico.

10. Composição, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADA pelo fato de que o material secundário compreende um portador, tal como um portador na forma de uma partícula, por exemplo, uma nanopartícula que compreende opcionalmente uma partícula degradável compreendendo um polímero.

11. Hibridoma ou célula geneticamente modificada, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6.

12. Hbridoma ou célula geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência de ácidos nucleicos compreende uma ou mais entre a SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, e SEQ ID NO: 30, ou em que a sequência de ácidos nucleicos compreende a SEQ ID NO: 6 e/ou SEQ ID NO: 24.

13. Método, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende contatar uma fibra elástica degradada com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é ligado de maneira operável a um material secundário.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o material secundário compreende um portador e um agente biologicamente ativo incorporado no portador, o agente biologicamente ativo sendo liberado a partir do portador após a ligação do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo à fibra elástica degradada.

15. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o material secundário compreende um agente de imagem.