CN105504055B - 利用特征十肽制备柞蚕丝素蛋白抗体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种利用特征十肽制备柞蚕丝素蛋白抗体的方法，合成序列为“AAAAAAAAAA”的多肽，将多肽和匙孔血蓝蛋白偶联起来得到完全抗原；用生理盐水稀释完全抗原，将稀释后的完全抗原与Quick Antibody‑Rabbit 5W佐剂均匀混合，然后对兔子进行初次免疫，然后对兔子进行加强免疫，加强免疫使用的试剂与初次免疫一致；当兔子血样中的抗体的效价达到1:10000时，收集免疫后的兔子血液，并使血块充分收缩及抗血清完全析出，然后收集抗血清并离心处理得到上清液，分装备用。本发明方法简单快捷，且制备的抗体具有很强的特异性，能用于检测纺织品中的丝素蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及多克隆抗体的制备方法，尤其涉及一种利用特征多肽制备柞蚕丝素蛋白抗体的方法。
背景技术
蚕丝是一种天然高分子蛋白质纤维，主要分为家蚕丝和野蚕丝两大类。野蚕也叫柞蚕，因喜食柞树叶得名，茧可缫丝，主要用于织造柞丝绸。我国是最早利用柞蚕和放养柞蚕的国家，但其起源一直是研究的热点难点，迫切需要一种更科学的方法来鉴定早期墓葬或遗迹中的丝织品。以往鉴定古代丝织品的方法也比较多，但蚕丝作为一种有机高分子材料长期处于墓葬或遗址环境中，必然会受到多种因素影响，从而出现蚕丝蛋白质发生降解及大分子链的断裂等问题，采用传统的一些方法很难检测到丝素蛋白的存在。因此如何采用自然科学的先进手段，建立丝织品微痕检测技术体系，从印痕，残留物，土壤中提取古代丝绸的信息，对丝绸起源的研究非常迫切。目前蛋白质检测的先进技术是基于抗体-抗原的Western Blotting或ELISA法，柞蚕丝素蛋白抗体的制备是该研究的一个关键环节。
发明内容
本发明是为了克服上述现有技术的不足，目的在于提供一种利用特征多肽制备柞蚕丝素蛋白抗体的方法，它操作简单快捷，且制备的抗体具有很强的特异性。
为实现上述目的，本发明采用的技术解决方案是：一种利用特征十肽制备柞蚕丝素蛋白抗体的方法，其特征在于它包括以下步骤：
步骤一：利用Fmoc法合成序列为“CAAAAAAAAAA”的多肽，并通过所诉多肽的N端的半胱氨酸使该多肽与匙孔血蓝蛋白偶联得到完全抗原；
步骤二：用生理盐水稀释所述完全抗原，将稀释后的完全抗原与Quick Antibody-Rabbit5W佐剂(Quick Antibody系列免疫佐剂，市面上可购)均匀混合，得到初次免疫所用的试剂；
选取2只大白兔进行初次免疫和加强免疫，免疫前抽取兔耳血样做对照；
首先对兔子进行初次免疫，然后对兔子进行加强免疫，加强免疫使用的试剂与初次免疫一致；当兔子血样中的抗体的效价达到1:10000时，收集免疫后的兔子血液，并使血块充分收缩及抗血清完全析出，然后收集抗血清并离心处理得到上清液，分装备用。
步骤三：利用免疫亲和层析技术对抗血清进行纯化；先将合成的半抗原(即多肽“AAAAAAAAAA”)和层析填料交联剂Sulfo-link-gel(美国Pierce公司生产，市面上可购)进行交联，使“AAAAAAAAAA”N端的甘氨酸封闭；
用pH7.4的PBS对十肽柱进行预处理，然后用pH7.4的PBS将抗血清稀释，稀释后上样；然后再重复上样一次；
用pH7.4的PBS对十肽柱进行清洗，然后用glycine-HCL(甘氨酸盐酸)对抗体进行洗脱，洗脱完成后用pH7.4、含0.02％硫柳汞钠的PBS洗涤多肽柱，得到纯化后的抗体调节pH至7.4并于4℃储存；
步骤四：抗原丝素蛋白以1μg/ml的浓度包被，4℃包被过夜；
将抗体分别稀释240000倍、60000倍、20000倍、10000倍、5000倍、1000倍、200倍，50μl/孔的量上样，37℃下温育1h；用TBST缓冲液(由NaCl 8克、KCl 0.2g、Trise base3克，加纯水800ML，用浓盐酸调PH到7.4，然后加水到1000ML，得到TBS溶液；TBS里加0.1％吐温20，即0.1％的洗涤液)以200μl/孔洗涤2遍；酶标二抗以1:5000稀释使用，50μl/孔、37℃下温育1h；用TBST以200μl/孔洗涤3遍，以100μl/孔加入TMB(四甲基联苯胺)于阴暗处显色，显色10min后，以100μl/孔加入2M的H2SO4终止；
步骤五：用酶标仪测定OD450值；
当OD450值＞0.6，则证明所检测的样品呈现阳性，说明样品中含有丝素蛋白；
当OD450值≤0.6，则证明所测得的样品呈现阴性，说明样品中不含有丝素蛋白。
在所述步骤二中，用生理盐水将完全抗原稀释到2倍最终浓度。
在所述步骤二中，在配制初次和加强免疫试剂时，稀释后的完全抗原与佐剂是按体积比1:1进行混合。
在所述步骤二中，对兔子进行初次免疫的方法是：通过后腿小腿肌肉注射免疫兔子，每只兔子注射100μl；对兔子进行加强免疫的方法是：在初次免疫的第21天按同样方式加强免疫一针。
在所述步骤二中，收集抗血清后处理的方法是：在温度为4℃于3000g条件下离心15min，分装上清液，放置于-80℃储存备用。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：
(1)本发明方法通过柞蚕丝素蛋白的特征多肽制备的多克隆抗体具有很强的特异性，经酶联免疫法分析可知，该抗体能够与柞蚕丝素蛋白具有明显的免疫反应，灵敏度很高，可用于检测柞蚕丝素蛋白，特别适合用于不完整丝素蛋白的检测分析。
(2)与传统方法利用天然蛋白质的大分子制备的抗体不同，本发明制备的抗体不仅能够检测完整的丝素蛋白，也能用于检测诸如古代丝织品中已经断裂的丝素蛋白分子，从而为中国早期墓葬和遗迹中的丝织残留品提供一种敏感特异快捷的识别方法，为丝绸考古和起源分析提供新的科学依据。
(3)本发明采用的免疫佐剂，无毒无害，不含蛋白质成分，不破坏抗原天然构型，而且免疫方式简单，无需乳化抗原(只需要简单混合即可免疫)，同时免疫周期短，抗原用量少。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)上查得柞蚕丝素蛋白的氨基酸序列。
通过统计分析，确定“AAAAAAAAAA”多肽片段出现频率最高，是柞蚕丝素的特征多肽，故以此片段制备抗原。
实施例1：
一种利用特征多肽制备柞蚕丝素蛋白抗体的方法，它包括以下步骤：
完全抗原合成：
步骤一：利用Fmoc法合成半抗原(即“CAAAAAAAAAA”多肽序列)，在“CAAAAAAAAAA”多肽序列的N端添加半胱氨酸使该多肽与匙孔血蓝蛋白(KLH)偶联。通过交联剂的作用，“CAAAAAAAAAA”N端的半胱氨酸上的巯基和KLH伯胺形成共价键，从而将多肽和KLH偶联起来，得到完全抗原。
步骤二：用生理盐水将完全抗原稀释到2倍最终浓度，将稀释后的完全抗原与QuickAntibody-Rabbit 5W佐剂按体积比1:1均匀混合，得到初次免疫所用的试剂。加强免疫使用的试剂与初次免疫一致。
抗体制备：
选取2只大白兔(15周龄左右)进行初次免疫和加强免疫。免疫前先抽取兔耳血样做对照。初次免疫是通过后腿小腿肌肉注射免疫兔子，每只兔子注射100μl。然后在初次免疫的第21天用同样的试剂按同样方式加强免疫一针。在第二次免疫后的第10天静脉取血检测抗血清效价。
当兔子血样中的抗血清的效价达到1:10000时，杀死兔子收集血液，收集的大量血液置室温下让其凝固；将凝固血液置于37℃温箱内放置30min，再置于4℃冰箱过夜，使血块充分收缩及抗血清完全析出。收集抗血清，4℃下3000g离心10min，分装上清液，放-80℃储存备用。
抗体纯化：
利用免疫亲和层析技术对抗血清进行纯化。先将合成的半抗原(即多肽“AAAAAAAAAA”)和层析填料Sulfo-link-gel进行交联，使“AAAAAAAAAA”N端的甘氨酸封闭。
用20-25ml、50mM、pH7.4的PBS对柱进行预处理，预处理的流速为60ml/h。用50mM、pH7.4的PBS将15ml的抗血清稀释至20ml，稀释后上样。重复上样一次。
用30-35ml、50mM、pH7.4的PBS对柱进行清洗，清洗的流速为60ml/h。用pH3.0、0.1M的glycine-HCL对抗体进行洗脱。洗脱完成后用含50mM、pH7.4、含0.02％硫柳汞钠的PBS洗涤多肽柱，得到纯化后的抗体调节pH至7.4并于4℃储存。
抗体特异性效果测定：抗原丝素蛋白以1μg/ml的浓度包被，4℃包被过夜。将抗体分别稀释240000倍、60000倍、20000倍、10000倍、5000倍、1000倍、200倍，50μl/孔的量上样，37℃下温育1h。用TBST以200μl/孔洗涤2遍。酶标二抗以1:5000稀释使用，50μl/孔、37℃下温育1h。用TBST以200μl/孔洗涤3遍。以100μl/孔加入TMB于阴暗处显色，显色10min后，以100μl/孔加入2M的H2SO4终止。用酶标仪测定OD450值。根据OD450值，对抗原抗体的结合等情况进行判断。当OD450值达到阳性标准时就可以确定样品中含有丝素；若样品中不含丝素，则OD450值就会低于阳性标准，据此就可以快速判断丝素的存在。
结果分析：结果显示除空白对照呈无色外，样品孔均呈黄色。用酶标仪测定OD450值结果为，对纯化后的抗体进行240000倍、60000倍、20000倍、10000倍、5000倍、1000倍、200倍稀释后得到的OD450值分别为0.730、1.478、1.907、2.290、2.327、2.380、2.479，空白对照的OD450值为0.056.按照平台OD450值达到0.6为阳性的要求，即使将制备的抗体稀释240000倍，仍能够检测到丝素蛋白的阳性信号。从以上结果可以说明，由本发明方法制备的抗体对丝素的反应灵敏度高，且操作简单。
实施例2：
一种利用特征多肽制备柞蚕丝素蛋白抗体的方法，它包括以下步骤：
完全抗原合成：
步骤一：利用Fmoc法合成半抗原(即“CAAAAAAAAAA”多肽序列)，在“CAAAAAAAAAA”多肽序列的N端添加半胱氨酸使该多肽与匙孔血蓝蛋白(KLH)偶联。通过交联剂的作用，“CAAAAAAAAAA”N端的半胱氨酸上的巯基和KLH伯胺形成共价键，从而将多肽和KLH偶联起来，得到完全抗原。
步骤二：用生理盐水将完全抗原稀释到2倍最终浓度，将稀释后的完全抗原与QuickAntibody-Rabbit 5W佐剂按体积比1:1均匀混合，得到初次免疫所用的试剂。加强免疫使用的试剂与初次免疫一致。
抗体制备：
选取2只大白兔(15周龄左右)进行初次免疫和加强免疫。免疫前先抽取兔耳血样做对照。初次免疫是通过后腿小腿肌肉注射免疫兔子，每只兔子注射100μl。然后在初次免疫的第21天用同样的试剂按同样方式加强免疫一针。在第二次免疫后的第10天静脉取血检测抗血清效价。
当兔子血样中的抗血清的效价达到1:10000时，杀死兔子收集血液，收集的大量血液置室温下让其凝固；将凝固血液置于37℃温箱内放置30min，再置于4℃冰箱过夜，使血块充分收缩及抗血清完全析出。收集抗血清，4℃下3000g离心10min，分装上清液，放-80℃储存备用。
抗体纯化：
利用免疫亲和层析技术对抗血清进行纯化。先将合成的半抗原(即多肽“AAAAAAAAAA”)和层析填料Sulfo-link-gel进行交联，使“AAAAAAAAAA”N端的甘氨酸封闭。
用25ml、50mM、pH7.4的PBS对柱进行预处理，预处理的流速为65ml/h。用50mM、pH7.4的PBS将15ml的抗血清稀释至20ml，稀释后上样。重复上样一次。
用35ml、50mM、pH7.4的PBS对柱进行清洗，清洗的流速为65ml/h。用pH3.0、0.1M的glycine-HCL对抗体进行洗脱。洗脱完成后用含50mM、pH7.4、含0.02％硫柳汞钠的PBS洗涤多肽柱，得到纯化后的抗体调节pH至7.4并于4℃储存。
抗体特异性效果测定：抗原丝素蛋白以1μg/ml的浓度包被，4℃包被过夜。将抗体分别稀释240000倍、60000倍、20000倍、10000倍、5000倍、1000倍、200倍，50μl/孔的量上样，37℃下温育1h。用TBST以200μl/孔洗涤2遍。酶标二抗以1:5000稀释使用，50μl/孔、37℃下温育1h。用TBST以200μl/孔洗涤3遍。以100μl/孔加入TMB于阴暗处显色，显色10min后，以100μl/孔加入2M的H2SO4终止。用酶标仪测定OD450值。根据OD450值，对抗原抗体的结合等情况进行判断。当OD450值达到阳性标准时就可以确定样品中含有丝素；若样品中不含丝素，则OD450值就会低于阳性标准，据此就可以快速判断丝素的存在。
结果分析：结果显示除空白对照呈无色外，样品孔均呈黄色。用酶标仪测定OD450值结果为，对纯化后的抗体进行240000倍、60000倍、20000倍、10000倍、5000倍、1000倍、200倍稀释后得到的OD450值分别为0.730、1.478、1.907、2.290、2.327、2.380、2.479，空白对照的OD450值为0.056.按照平台OD450值达到0.6为阳性的要求，即使将制备的抗体稀释240000倍，仍能够检测到丝素蛋白的阳性信号。从以上结果可以说明，由本发明方法制备的抗体对丝素的反应灵敏度高，且操作简单。
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (1)
1.一种利用特征十肽制备柞蚕丝素蛋白抗体的方法，其特征是，它包括以下步骤：
步骤一：利用Fmoc法合成序列为“CAAAAAAAAAA”的多肽，并通过所述多肽的N端的半胱氨酸使该多肽与匙孔血蓝蛋白偶联得到完全抗原；
步骤二：用生理盐水稀释所述完全抗原，将稀释后的完全抗原与Quick Antibody-Rabbit 5W佐剂均匀混合，得到初次免疫所用的试剂；用生理盐水将完全抗原稀释到2倍最终浓度；
选取2只大白兔进行初次免疫和加强免疫，免疫前抽取兔耳血样做对照；
首先对兔子进行初次免疫，然后对兔子进行加强免疫，加强免疫使用的试剂与初次免疫一致；当兔子血样中的抗体的效价达到1:10000时，收集免疫后的兔子血液，并使血块充分收缩及抗血清完全析出，然后收集抗血清并离心处理得到上清液，分装备用；对兔子进行初次免疫的方法是：通过后腿小腿肌肉注射免疫兔子，每只兔子注射100μl；对兔子进行加强免疫的方法是：在初次免疫的第21天按同样方式加强免疫一针；在配制初次和加强免疫试剂时，稀释后的完全抗原与佐剂按体积比1:1进行混合；收集抗血清后处理的方法是：在温度为4℃于3000g条件下离心15min，分装上清液，放置于-80℃储存备用；
步骤三：利用免疫亲和层析技术对抗血清进行纯化；先将合成的半抗原(即多肽“AAAAAAAAAA”)和层析填料Sulfo-link-gel进行交联，使“AAAAAAAAAA”N端的甘氨酸封闭；
用pH7.4的PBS对柱进行预处理，然后用pH7.4的PBS将抗血清稀释，稀释后上样；然后再重复上样一次；
用pH7.4的PBS对柱进行清洗，然后用甘氨酸盐酸glycine-HCL对抗体进行洗脱，洗脱完成后用pH7.4、含0.02％硫柳汞钠的PBS洗涤柱，得到纯化后的抗体调节pH至7.4并于4℃储存；
步骤四：抗原丝素蛋白以1μg/ml的浓度包被，4℃包被过夜；
将抗体分别稀释240000倍、60000倍、20000倍、10000倍、5000倍、1000倍、200倍，50μl/孔的量上样，37℃下温育1h；用TBST缓冲液以200μl/孔洗涤2遍；酶标二抗以1:5000稀释使用，50μl/孔、37℃下温育1h；用TBST以200μl/孔洗涤3遍，以100μl/孔加入TMB于阴暗处显色，显色10min后，以100μl/孔加入2M的H2SO4终止；
步骤五：用酶标仪测定OD 450值；
当OD450值＞0.6，则证明所检测的样品呈现阳性，说明样品中含有丝素蛋白；
当OD450值≤0.6，则证明所测得的样品呈现阴性，说明样品中不含有丝素蛋白。
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