CN105637366B - 胰肿瘤的检测方法、抗体和胰肿瘤检测用试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供对受试体侵袭性低、且检测灵敏度和正确性高的胰肿瘤(胰癌或胰良性肿瘤)的检测方法。本发明提供通过利用抗APOA2抗体测定受试体样品中的APOA2蛋白质变异体的量来检测胰肿瘤的方法、用于该方法的抗APOA2抗体和包含该抗体的胰肿瘤检测用试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及胰肿瘤、即胰癌或胰良性肿瘤的检测方法、用于该方法的 抗APOA2抗体和包含该抗体的胰癌或胰良性肿瘤检测用试剂盒,所述检 测方法包括使用与APOA2蛋白质特异性结合的抗体(抗APOA2抗体)来测 定受试体样品中的APOA2蛋白质变异体的量。
背景技术
根据2012年的统计,在日本主要的死亡原因的第1位是癌。癌的特征 在于,从正常组织产生、由癌细胞的异常增殖引起的肿瘤块的形成,形成 肿瘤块的癌细胞向邻近组织的浸润,以及经由血管、淋巴管向多种脏器的 远处转移。已知在这样的癌发病和发展时,血液、尿等患者的体液中各种 蛋白质的浓度发生变动,这样的蛋白质被称为肿瘤标志物(癌检测用标志 物),被期待在癌的早期发现、治疗后的经过观察等各种诊断用途中应用(例如,专利文献1~3)。然而,可用于临床诊断的以往的肿瘤标志物大多阳性 率为50~70%程度,特别是在早期癌中,存在大部分肿瘤标志物显示假阴 性这样的问题。由于以向邻近组织的浸润、远处转移为特征的晚期癌、末 期癌会预后不良,因此早期发现对于癌的有效治疗是重要的。因此,期待 发现能够检测早期癌、灵敏度优异的肿瘤标志物。
胰肿瘤是指在胰脏形成的全部肿瘤,分为作为恶性肿瘤的胰癌、和作 为良性肿瘤的胰良性肿瘤。
胰癌在众多癌症中作为难治性癌症的一种而为人所知,尚未确立除了 外科手术以外的有效的治疗法,因此早期发现、防止其发病于未然变得特 别重要。作为胰癌的诊断方法,可使用血清肿瘤标志物、螺旋CT、磁共 振装置(MRI)、超声内镜检查法(EUS)等(非专利文献1)。然而,胰癌在早 期阶段缺乏症状,在大多数情况下,已经形成晚期癌才被发现,因此一般 来说治疗困难。因此,期望开发能够准确且简易地发现胰癌的新的诊断技 术。
另一方面,胰良性肿瘤是胰癌前阶段的病态,暗示了与胰癌发病相关。 但是,与胰癌相比,胰良性肿瘤预后良好,期待通过利用外科手术摘出来 防止胰癌的发病。因此,可以认为胰良性肿瘤的早期发现也重要。
APOA2(Apolipoprotein A2(载脂蛋白A2)或Apolipoprotein A-II(载脂 蛋白A-II))蛋白质(GenBank登录号NP_001634.1)是构成血浆脂蛋白的载 脂蛋白家族的一种。载脂蛋白迄今为止已知10种以上,它们的主要功能是 脂蛋白的结构的稳定化、与脂蛋白代谢相关的酶的活化、作为针对细胞表 面存在的脂蛋白受体的配体的作用等。APOA2蛋白质在肝脏组织中作为包 含信号肽的100个氨基酸的前体被合成,血液中存在的成熟型包含77个氨 基酸。成熟型APOA2蛋白质,其氨基末端(N末端)有谷氨酰胺残基(Q)、 从N末端数第76位有苏氨酸残基(T)、第77位的C末端有谷氨酰胺残基 (Q),是构成高密度脂蛋白(HDL)的载脂蛋白之一。此外,报告了APOA2 蛋白质中存在作为完全长度APOA2蛋白质的APOA2-ATQ蛋白质、作为 缺失了C末端的谷氨酰胺残基(Q)的APOA2蛋白质的APOA2-AT蛋白质、 作为缺失了C末端的苏氨酸·谷氨酰胺残基(TQ)的APOA2蛋白质的 APOA2-A蛋白质等质量不同的变异体(非专利文献2)。
根据基于登录在蛋白质结构数据库(PDB;Protein Data Bank;http: //www.rcsb.org/pdb/home.do)的APOA2蛋白质的立体结构数据(PDB ID: 1L6L)的解析,认为APOA2蛋白质通过介由N末端侧的半胱氨酸残基的 二硫键(SS键)而形成二聚体。因此,已知APOA2蛋白质在血液中作为由 前述3种变异体的组合产生的各种分子量的二聚体而存在。具体而言,已 知由完全长度的APOA2-ATQ蛋白质组成的二聚体(APOA2-ATQ/ATQ蛋 白质二聚体)、APOA2-ATQ蛋白质和APOA2-AT蛋白质的二聚体 (APOA2-ATQ/AT蛋白质二聚体)、由APOA2-AT蛋白质组成的二聚体 (APOA2-AT/AT蛋白质二聚体)、APOA2-AT蛋白质和APOA2-A蛋白质 的二聚体(APOA2-AT/A蛋白质二聚体)、由APOA2-A蛋白质组成的二聚 体(APOA2-A/A蛋白质二聚体)等。此外,除此以外,还已知APOA2蛋白 质通过二硫键与APOD蛋白质、APOE蛋白质、APOA1-M蛋白质等其他 蛋白质形成二聚体,或者作为单体而存在(非专利文献3、4)。
已知对于上述各种APOA2蛋白质二聚体,与健常者相比,在胰癌患 者的血中显示量的变动。特别是APOA2-ATQ/AT蛋白质二聚体,质量分 析的结果作为具有分子量17253±9(m/z)的质量值的蛋白质被发现,已经明 确与健常者相比在胰癌患者中显著减少,以及通过利用该蛋白质二聚体作 为胰癌标志物,能够以AUC(area under the curve:曲线下面积)值为0.85 以上的高精度检测出胰癌(专利文献4、5,非专利文献5)。
然而,为了达到前述AUC值的判别精度,需要包括利用质量分析器 进行测定在内的3个繁杂的工序。例如,在最初的工序中,对质量分析中 使用的血液样品使用9M尿素、2%CHAPS进行前处理。然而,尿素容易 分解、不适合长期的保存,因此为了备齐前处理条件,需要在每次测定时 调制包含尿素的溶液。此外,在接下来的工序中,将进行了前处理的样品捕获在蛋白质芯片(サイファージェンバイオシステム社制)的表面。在该 捕获工序中,利用蛋白质芯片表面的带电状态、疏水性等特性进行吸附, 因此可知洗涤条件、试剂的调制条件较大地影响捕获效率。在最后的工序 中,利用质量分析器来进行捕获样品的测定。质量分析器要求对激光强度 的调整等操作熟练,而且在处理受试体上的通量低。进而,在样品中包含 众多不同的蛋白质的情况下,从各蛋白质得到的信号彼此相互干扰,因而 信号的归属变得困难。而且,由于定量性也存在问题,因此不适合需要高 精度测定的诊断用途。因此,存在实用化障碍高这样的问题。
ELISA法作为与质量分析法相比在评价大量的样品上通量高、便宜且 实用的方法而为人所知。此外,ELISA法是通用的方法,因此不需要对操 作熟练,而且,由于使用2种抗体,因此特异性高,使用标准物质能够实 现再现性好的定量。因此,能够全面且定量性高地解析在样品中以各种分 子量存在的APOA2蛋白质变异体。
在先技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开2001-289861号公报
专利文献2:日本特开2002-323499号公报
专利文献3:日本特开2009-034071号公报
专利文献4:国际公开第2006/098087号
专利文献5:日本特开2010-175452号公报
非专利文献
非专利文献1:科学的根拠に基づく膵癌診療ガイドライン(基于科学 的根据的胰癌诊疗指南)2009年版、日本膵臓学会膵癌診療ガイドライン 改訂委員(日本胰脏学会胰癌诊疗指南改订委员),金原出版
非专利文献2:Pankhurst G.等,2003年,J Lipid Res,第44卷, p.349-355
非专利文献3:Blanco-Vaca F.等,2001年,J Lipid Res,第42卷, p.1727-1739
非专利文献4:Rocco AG.等,2006年,Biophys J,第91卷,p.3043-3049
非专利文献5:Honda K.等,2012年,PLoS One,第7卷,p.e46908
发明内容
发明所要解决的课题
通常,肿瘤的检测使用肿瘤标志物,但是已知胰肿瘤难以利用肿瘤标 志物进行检测。胰肿瘤中,特别是早期的胰癌患者与健常者难以辨别,因 此使用肿瘤标志物的胰癌的早期检测非常困难。此外,关于能够检测胰良 性肿瘤的肿瘤标志物,迄今为止基本未知。
本发明的课题是提供利用胰肿瘤标志物APOA2蛋白质变异体,具有 胰肿瘤、即胰癌或胰良性肿瘤的高检测灵敏度,并且比前述专利文献4、5 和非专利文献5中记载的检测方法简便、通量高的胰肿瘤的检测方法和胰 肿瘤检测用试剂盒。
用于解决课题的方法
为了解决上述课题,本发明者们首先旨在开发以APOA2-ATQ/AT蛋 白质二聚体为对象利用了ELISA测定法的胰癌的检测方法。然后,尝试了 基于通常进行的方法,使用针对构成APOA2-ATQ/AT蛋白质二聚体的 APOA2-ATQ蛋白质和APOA2-AT蛋白质各自的C末端区域的抗体(抗 APOA2蛋白质末端抗体),来检测APOA2-ATQ/AT蛋白质二聚体。然而, 可能由于血中存在的妨碍物质、在2种抗体结合于同一抗原时引起的空间 位阻的影响,判明了不能高精度地检测该二聚体。
因此,本发明者们反复进行了深入研究,确立了通过应用夹心ELISA 法,来分别测定APOA2-ATQ蛋白质的总量和APOA2-AT蛋白质的总量 的方法,所述夹心ELISA法组合了与前述C末端区域特异性结合的抗 APOA2蛋白质末端抗体、和与APOA2蛋白质的除了C末端区域以外的 区域特异性结合的抗体(抗APOA2蛋白质非末端抗体)。进而,通过适用分 别测定APOA2-ATQ蛋白质的总量的测定值和APOA2-AT蛋白质的总量 的测定值,将其结果进行组合的解析法,而不是以往进行的测定 APOA2-ATQ/AT蛋白质二聚体的量,能够高精度地判别胰癌患者与健常 者。进而,通过使用该解析法,发现了通过迄今为止报告的肿瘤标志物不 可能实现的胰良性肿瘤的检测这样预料不到的效果。发现了基于该技术, 能够以极高灵敏度检测出包含胰良性肿瘤、早期胰癌在内的胰肿瘤,从而 完成了本发明。
本发明包含以下的发明。
(1)胰肿瘤的检测方法,是测定受试体的体液样品中APOA2蛋白质变 异体的量来检测胰肿瘤的方法,包括:
(A)第1工序,使用与APOA2-ATQ蛋白质的C末端区域特异性结合 的抗APOA2-ATQ末端抗体、和与除了该C末端区域以外的氨基酸序列结 合的抗APOA2-ATQ非末端抗体,来测定样品中的APOA2-ATQ蛋白质 的量,所述APOA2-ATQ蛋白质由序列号1所示的氨基酸序列组成,
(B)第2工序,使用与APOA2-AT蛋白质的C末端区域特异性结合的 抗APOA2-AT末端抗体、和与除了该C末端区域以外的氨基酸序列结合 的抗APOA2-AT非末端抗体,来测定样品中的APOA2-AT蛋白质的量, 所述APOA2-AT蛋白质由序列号2所示的氨基酸序列组成,
(C)第3工序,将由第1工序获得的APOA2-ATQ蛋白质的量的测定 值和由第2工序获得的APOA2-AT蛋白质的量的测定值输入预先设定的判 别式而获得受试体的判别值,在该受试体的判别值与健常体的测定值或判 别值相比在统计学上有显著性差异时,确定受试体罹患胰肿瘤。
(2)根据(1)所述的检测方法,APOA2-ATQ蛋白质和APOA2-AT蛋白 质的所述C末端区域分别由包含6个以上连续氨基酸的序列组成,所述6 个以上连续氨基酸包含C末端在内。
(3)根据(1)或(2)所述的检测方法,前述判别式是选自逻辑回归式、利用 支持向量机的解析制作的判别式、利用神经网络的解析制作的判别式以及 利用判别分析的解析制作的判别式中的任一种。
(4)根据(3)所述的检测方法,前述逻辑回归式包含APOA2-ATQ蛋白 质的前述测定值、和/或APOA2-AT蛋白质的前述测定值、和/或 APOA2-ATQ蛋白质的前述测定值与APOA2-AT蛋白质的前述测定值的 积作为变量。
(5)根据(4)所述的方法,由前述逻辑回归式获得的受试体的判别值是健 常体的判别值的三分之二以下。
(6)根据(1)~(5)中任一项所述的检测方法,前述胰肿瘤是胰癌或胰良性 肿瘤。
(7)根据(6)所述的检测方法,还包括第4工序:对于在前述第3工序中 已确定罹患胰肿瘤的受试体,测定该受试体的体液样品中的胰癌标志物 CA19-9或DU-PAN-2的量,在其测定值超过规定基准值的情况下,确定 受试体罹患胰癌;在其测定值为该基准值以下的情况下,确定受试体罹患 胰良性肿瘤。
(8)根据(1)~(7)中任一项所述的检测方法,前述体液样品是血液、血浆、 或血清。
(9)根据(1)~(8)中任一项所述的检测方法,前述胰癌是早期胰癌。
(10)单克隆抗体或其片段,该单克隆抗体是与APOA2-ATQ蛋白质的 C末端区域特异性结合的抗APOA2-ATQ末端抗体,所述APOA2-ATQ 蛋白质由序列号1所示的氨基酸序列组成,该单克隆抗体的重链的CDR1、 CDR2和CDR3分别由序列号4、5和6所示的氨基酸序列组成,且轻链的 CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号7、8和9所示的氨基酸序列组成。
(11)单克隆抗体或其片段,该单克隆抗体是与APOA2-ATQ蛋白质的 C末端区域特异性结合的抗APOA2-ATQ末端抗体,所述APOA2-ATQ 蛋白质由序列号1所示的氨基酸序列组成,该单克隆抗体的重链的CDR1、 CDR2和CDR3分别由序列号10、11和12所示的氨基酸序列组成,且轻 链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号13、14和15所示的氨基酸序 列组成。
(12)单克隆抗体或其片段,该单克隆抗体是识别APOA2蛋白质的除C 末端区域以外的氨基酸序列的抗APOA2蛋白质非末端抗体,所述APOA2 蛋白质由序列号1~3中任一项所示的氨基酸序列组成,该单克隆抗体的重 链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号16、17和18所示的氨基酸序 列组成,且轻链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号19、20和21所 示的氨基酸序列组成。
(13)单克隆抗体或其片段,该单克隆抗体是识别APOA2蛋白质的除C 末端区域以外的氨基酸序列的抗APOA2蛋白质非末端抗体,所述APOA2 蛋白质由序列号1~3中任一项所示的氨基酸序列组成,该单克隆抗体的重 链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号22、23和24所示的氨基酸序 列组成,且轻链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号25、26和27所 示的氨基酸序列组成。
(14)胰肿瘤的检测用试剂盒,包含1种以上前述(10)~(13)所述的抗体或 其片段。
本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请2013-206682 号、2014-166188号的说明书和/或附图所记载的内容。
发明的效果
根据本发明,能够通过测定血中的胰肿瘤标志物APOA2蛋白质变异 体,来简便、高通量且高灵敏度地检测胰肿瘤。例如,仅通过测定从患者 采集的血液等体液样品中包含的特定的APOA2蛋白质变异体的量,就能 够确定该患者是否罹患胰肿瘤、或者评价罹患的可能性。
附图说明
图1(A)是测定作为抗APOA2-ATQ末端单克隆抗体的克隆7F2对 APOA2蛋白质的各种变异体的结合活性而得的图。图1(B)是测定作为抗 APOA2-ATQ末端单克隆抗体的克隆6G2对APOA2蛋白质的各种变异体 的结合活性而得的图。
图2(A)是测定抗APOA2-ATQ末端单克隆抗体7F2、6G2或抗 APOA2-ATQ末端多克隆抗体(图中标记为多抗)对APOA2-ATQ蛋白质或 APOA2-AT蛋白质的结合活性而得的图。图2(B)是用由(A)获得的前述抗 体对APOA2-ATQ蛋白质的结合活性的测定值除以对APOA2-AT蛋白质 的结合活性的测定值,来评价抗体的结合特异性的图。
图3是测定抗APOA2-AT末端多克隆抗体对APOA2蛋白质的各种变 异体的结合活性而得的图。
图4(A)是测定作为抗APOA2蛋白质非末端单克隆抗体的MAB1对 APOA2蛋白质的各种变异体的结合活性而得的图。图4(B)是测定作为抗 APOA2蛋白质非末端单克隆抗体的MAB2对APOA2蛋白质的各种变异 体的结合活性而得的图。
图5是通过质量分析法测定胰癌患者和健常者各40名的血浆中包含的 APOA2蛋白质二聚体(APOA2-ATQ/AT)而得的图。
图6是通过夹心ELISA法测定胰癌患者和健常者各40名的血浆中包 含的APOA2蛋白质二聚体(APOA2-ATQ/AT)而得的图,所述夹心ELISA 法使用了特异性识别APOA2-ATQ蛋白质的C末端区域的氨基酸序列的单 克隆抗体(抗APOA2-ATQ末端单克隆抗体)和特异性识别APOA2-AT的C 末端区域的氨基酸序列的多克隆抗体(抗APOA2-AT末端多克隆抗体抗体)。
图7是通过夹心ELISA法测定胰癌患者和健常者各40名的血浆中包 含的APOA2-ATQ蛋白质而得的图,所述夹心ELISA法使用了特异性识 别APOA2-ATQ蛋白质的C末端区域的氨基酸序列的单克隆抗体(抗 APOA2-ATQ末端单克隆抗体)和特异性识别除了C末端区域以外的氨基 酸序列的抗体(抗APOA2-ATQ非末端抗体)。
图8是通过夹心ELISA法测定胰癌患者和健常者各40名的血浆中包 含的APOA2-AT蛋白质而得的图,所述夹心ELISA法使用了特异性识别 APOA2-AT蛋白质的C末端区域的氨基酸序列的多克隆抗体(抗 APOA2-AT末端多克隆抗体)和特异性识别除了C末端区域以外的氨基酸 序列的抗体(抗APOA2-AT非末端抗体)。
图9是将胰癌患者和健常者各40名的血浆中包含的2种APOA2蛋白 质变异体(APOA2-ATQ蛋白质和APOA2-AT蛋白质)的量的积作图而得的 图。
图10是将胰癌患者244名和健常者109名的血浆中包含的2种APOA2 蛋白质变异体(APOA2-ATQ蛋白质和APOA2-AT蛋白质)的浓度作图而得 的图。
图11是将胰癌患者(UICC分类中的I期、II期)和健常者的测定值代 入逻辑回归式,制作ROC曲线而得的图。(A)表示对于2种APOA2蛋白 质变异体(APOA2-ATQ蛋白质和APOA2-AT蛋白质)的夹心ELISA法测 定值的积进行解析而得的结果,(B)表示通过质量分析法对于APOA2蛋白 质二聚体(APOA2-ATQ/AT)进行解析而得的结果。
图12是将胰良性肿瘤患者和健常者的测定值代入逻辑回归式,制作 ROC曲线而得的图。(A)表示对于利用夹心ELISA法测定的、2种APOA2 蛋白质变异体(APOA2-ATQ蛋白质和APOA2-AT蛋白质)的测定值的积进 行解析而得的的结果,(B)表示对于CA19-9的测定值进行解析而得的结果。
具体实施方式
成为本发明的测定对象的是胰肿瘤。在本说明书中,“胰肿瘤”是指在 胰脏中形成的全部肿瘤。具体而言,是作为恶性肿瘤的“胰癌”和作为良性 肿瘤的“胰良性肿瘤”。
在本说明书中,所谓“胰癌”,是指在胰脏中形成的全部恶性肿瘤。具 体而言,包含浸润性胰导管癌、胰导管内管状腺癌、胰腺房细胞癌、胰浆 液性囊胞腺癌、胰粘液性囊胞肿瘤(胰粘液性囊胞肿瘤的一种)、胰导管内 乳头粘液性肿瘤(胰导管内乳头粘液性肿瘤的一种)、胰神经内分泌肿瘤(胰 内分泌肿瘤的一种)等(“膵癌取り扱い規約(胰癌处理条约)”,第6版补订版, 2013年,日本胰脏学会,金原出版)。不论作为对象的胰癌的进展度。包含 早期癌、晚期癌和末期癌中的任一种。
在本说明书中,所谓“早期癌”,是指局限于肿瘤发生的局部(粘膜内)、 没有向周围组织的浸润的癌、或者即使有浸润其范围也局限于局部的癌。 具体而言,是指在UICC(Unio Internationalis Contra Cancrum,国际抗癌 联盟)的时期分类中为0、IA、IB、IIA、IIB的癌(“TNM悪性腫瘍の分類 (TNM恶性肿瘤的分类)”,第7版日语版,2012年,UICC日本委员会TNM 委员会,金原出版)。如前所述,胰癌是预后极差的难治性癌,但是如果能 够发现早期胰癌,能够显著提高5年生存率。
此外,“胰良性肿瘤”中包含胰粘液性囊胞腺瘤(胰粘液性囊胞肿瘤的一 种)、胰导管内乳头粘液性腺瘤(胰导管内乳头粘液性肿瘤的一种)、胰神经 内分泌肿瘤(胰内分泌肿瘤的一种)、胰浆液性囊胞腺瘤、发生在胰脏的异 型上皮和上皮内癌(“膵癌取り扱い規約(胰癌处理条约)”,第6版补订版, 2013年,日本胰脏学会,金原出版)。
1.抗APOA2抗体及其片段
本发明的第一实施方式是抗APOA2抗体(包含抗APOA2蛋白质末端 抗体和抗APOA2蛋白质非末端抗体)及其片段。
1-1.抗APOA2抗体
在本说明书中,所谓“APOA2蛋白质”,是指各物种APOA2蛋白质, 但优选来自人的APOA2蛋白质(GenBank登录号No.NP_001634.1)。具体 而言,包含序列号1、2或3所示的来自人的野生型APOA2蛋白质变异体, 进而还包含它们的天然突变体及它们的片段。
在本说明书中,前述“变异体”是指能够存在于人或动物的血浆、血清 或其他体液中的APOA2蛋白质的不同的分子形态。例如,在APOA2蛋 白质中C末端区域的结构不同的APOA2蛋白质或它们的天然突变体。具 体而言,APOA2蛋白质变异体例如,C末端区域的氨基酸序列以ATQ终 止的序列号1所示的APOA2-ATQ蛋白质、C末端区域的氨基酸序列以 AT终止的序列号2所示的APOA2-AT蛋白质、或C末端区域的氨基酸序 列以A终止的序列号3所示的APOA2-A蛋白质。
在本说明书中,所谓“C末端区域(羧基末端区域)”,是指氨基酸序列 中包含C末端的氨基酸及其周围连续的几个氨基酸的、由6~25个氨基酸、 优选为8~20个氨基酸或10~17个氨基酸组成的区域。
在本说明书中,所谓“天然突变体”,是自然界中存在的突变体,例如, 是指在前述序列号1、2或3所示的氨基酸序列中缺失、置换、或添加了1 个或多个的氨基酸的突变体,与前述氨基酸序列具有90%以上、92%以上 或94%以上、优选为95%以上、更优选为97%以上、更优选为98%以上 或99%以上同一性的突变体。所谓“同一性”,是指以两段氨基酸序列获得 最大的一致度的方式导入或不导入间隙而进行排列(比对)时,相对于一段 氨基酸序列的全部氨基酸残基数(也包含间隙数),另一段氨基酸序列的相 同氨基酸残基数的比例(%)。所谓“多个”,是指2~10的整数,例如,2~7、 2~5、2~4、2~3的整数。作为天然突变体的具体例,可举出基于SNP(单核 苷酸多态性,Single Nucleotide Polymorphism)等多态性的突变体、剪接突 变体(剪接变异体)等。此外,前述置换优选为保守的氨基酸置换。这是因 为如果是保守的氨基酸置换,则能够具有与具有前述氨基酸序列的APOA2 蛋白质实质上同等的结构或性质。所谓保守的氨基酸,是指分类在相同的 氨基酸组的氨基酸彼此的关系。对于前述氨基酸组,已知非极性氨基酸组 (甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、脯氨 酸、色氨酸)、极性氨基酸组(非极性氨基酸以外的氨基酸)、带电氨基酸组(酸 性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)和碱性氨基酸组(精氨酸、组氨酸、赖氨酸))、 非带电氨基酸组(除了带电氨基酸以外的氨基酸)、芳香族氨基酸组(苯丙氨 酸、色氨酸、酪氨酸)、支链氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)以及脂 肪族氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)等。
前述“它们的片段”,是指包含APOA2蛋白质的各种变异体及它们的 天然突变体的C末端区域的APOA2蛋白质变异体及其突变体的片段。具 体而言,是指APOA2蛋白质的各种变异体及其突变体的蛋白酶消化物等。
本发明提供包含抗APOA2-ATQ末端抗体和抗APOA2-AT末端抗体 的抗APOA2蛋白质末端抗体。
“抗APOA2-ATQ末端抗体”是指能够特异性识别并且结合 APOA2-ATQ蛋白质的C末端区域中存在的表位的抗体或其片段。所谓“特 异性识别并且结合”,是指与其他APOA2蛋白质变异体没有交差反应性或 者交差反应性极弱,因而对其他APOA2蛋白质变异体不能识别也不能结 合、或者几乎不能识别或结合。具体而言,是指对APOA2-ATQ蛋白质的 C末端区域特异性结合,但是对APOA2-AT蛋白质的C末端区域和 APOA2-A蛋白质等的C末端区域不显示结合的抗体。这样的末端抗体可 以是多克隆抗体和单克隆抗体、或其片段中的任一种。为了能够大量生产、 以及为了获得均质的效果,优选单克隆抗体。
另一方面,“抗APOA2-AT末端抗体”是指能够特异性识别并且结合 APOA2-AT蛋白质的C末端区域中存在的表位的抗体或其片段。具体而 言,是指对APOA2-AT蛋白质的C末端区域特异性结合,但是对 APOA2-ATQ蛋白质的C末端区域和APOA2-A蛋白质等的C末端区域不 显示结合的抗体。这样的末端抗体可以是多克隆抗体和单克隆抗体或其片 段中的任一种。为了能够大量生产、以及为了获得均质的效果,优选单克 隆抗体。
本发明还提供识别除了APOA2蛋白质的C末端区域以外的氨基酸序 列的“抗APOA2蛋白质非末端抗体”。
“抗APOA2蛋白质非末端抗体”,是指识别并结合在APOA2蛋白质 变异体的全长氨基酸序列中,除了前述C末端区域以外的区域中存在的表 位的抗APOA2抗体。即,抗APOA2蛋白质非末端抗体与抗APOA2蛋白 质末端抗体各自识别的表位完全不同。抗APOA2蛋白质非末端抗体称为 “非末端”抗体,这是相对于抗APOA2蛋白质末端抗体的方便的名称。因 此,只要是除了C末端区域以外的区域所存在的表位就无特别限定,也可 以包含识别并结合N末端中存在的表位的抗体。
本发明中使用的抗APOA2蛋白质非末端抗体优选为,在比较对具有 某个特定的C末端序列的APOA2蛋白质的结合活性、和对具有与该 APOA2蛋白质不同的C末端序列的APOA2蛋白质的结合活性的情况下, 两者的结合活性大致相同,且不阻碍对前述抗APOA2蛋白质末端抗体的 C末端区域的结合的抗体。具体而言,可举出例如,与序列号1所示的APOA2-ATQ蛋白质的除了C末端区域以外的氨基酸序列结合的“抗 APOA2-ATQ非末端抗体”、和与序列号2所示的APOA2-AT蛋白质的除 了C末端区域以外的氨基酸序列结合的“抗APOA2-AT非末端抗体”,对 APOA2蛋白质具有同等的结合活性,而且两种非末端抗体均不阻碍抗 APOA2-ATQ末端抗体、抗APOA2-AT末端抗体与APOA2蛋白质的C 末端区域结合。抗APOA2蛋白质非末端抗体可以是多克隆抗体和单克隆 抗体或其片段中的任一种。为了能够大量生产、以及为了获得均质的效果, 优选单克隆抗体。
本说明书中使用的“单克隆抗体”是指由单一的免疫球蛋白组成、或包 含其框架区(Frame work region:以下称为“FR”)和互补决定区 (Complementarity determiningregion:以下称为“CDR”)的、能够特异性 识别并结合特定的抗原(表位)的抗体。
典型的免疫球蛋白分子是作为被称为重链和轻链的2条多肽链一组通 过二硫键2组相互连接而成的四聚体而构成的。重链包含N末端侧的重链 可变区(H链V区:以下称为“VH”)和C末端侧的重链恒定区(H链C区: 以下称为“CH”),轻链包含N末端侧的轻链可变区(L链V区:以下称为 “VL”)和C末端侧的轻链恒定区(L链C区:以下称为“CL”)。其中,VH 和VL在与抗体的结合特异性相关方面特别重要。该VH和VL均包含约 110个的氨基酸残基,其内部具有与抗原的结合特异性直接相关的3个 CDR(CDR1、CDR2、CDR3)、和作为可变区的骨架结构发挥功能的4个 FR(FR1、FR2、FR3、FR4)。已知CDR与抗原分子形成互补的立体结构、 决定抗体的特异性(E.A.Kabat et al,1991,Sequences of proteins of immunologicalinterest,Vol.1,eds.5,NIH publication)。恒定区的氨基酸 序列在种内抗体间几乎恒定,与此相对,CDR的氨基酸序列在各抗体间变 异性高,因此,也称为超可变区(Hypervariable region)。在可变区中,前 述CDR和FR从N末端至C末端方向以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、 CDR3、FR4的顺序排列。在免疫球蛋白分子内,VL和VH通过相对地形 成二聚体而形成抗原结合部位。免疫球蛋白中已知有IgG、IgM、IgA、IgE 和IgD各类,本发明的抗体可以是任一类。优选为IgG。
本发明的抗APOA2-ATQ末端单克隆抗体对序列号1所示的 APOA2-ATQ蛋白质的C末端区域特异性结合,但对序列号2所示的 APOA2-AT蛋白质和序列号3所示的APOA2-A蛋白质不显示结合性。作 为这样的抗体的具体例子,可举出例如,后述实施例1所记载的、由抗体克隆名7F2和6G2表示的抗APOA2-ATQ末端单克隆抗体克隆等。对于 7F2克隆,重链中的CDR1由序列号4所示的序列组成、CDR2由序列号 5所示的序列组成、且CDR3由序列号6所示的序列组成,并且轻链中的 CDR1由序列号7所示的序列组成、CDR2由序列号8所示的序列组成、且CDR3由序列号9所示的序列组成。此外,对于6G2克隆,重链中的 CDR1由序列号10所示的序列组成、CDR2由序列号11所示的序列组成、 且CDR3由序列号12所示的序列组成,并且轻链中的CDR1由序列号13 所示的序列组成、CDR2由序列号14所示的序列组成、且CDR3由序列号 15所示的序列组成。
对于本发明的抗APOA2蛋白质非末端抗体,优选在比较对序列号1~3 中任一项所示的APOA2蛋白质变异体的结合活性的情况下,结合活性同 等的抗APOA2蛋白质非末端抗体。作为具体的例子,可举出例如,后述 实施例5所记载的、由抗体克隆名MAB1和MAB2表示的抗APOA2抗体 克隆等。对于MAB1克隆,重链中的CDR1由序列号16所示的序列组成、 CDR2由序列号17所示的序列组成、且CDR3由序列号18所示的序列组 成,并且轻链中的CDR1由序列号19所示的序列组成、CDR2由序列号 20所示的序列组成、且CDR3由序列号21所示的序列组成。此外,对于 MAB2克隆,重链中的CDR1由序列号22所示的序列组成、CDR2由序 列号23所示的序列组成、且CDR3由序列号24所示的序列组成,并且轻 链中的CDR1由序列号25所示的序列组成、CDR2由序列号26所示的序 列组成、且CDR3由序列号27所示的序列组成。此外,作为抗APOA2 蛋白质非末端抗体,可以使用前述抗APOA2-ATQ非末端抗体、前述抗 APOA2-AT非末端抗体。
前述“多克隆抗体和单克隆抗体或其片段”中的“其片段”,是多克隆抗 体和单克隆抗体的部分片段,是指具有与该抗体所具有的抗原特异性结合 活性实质上同等的活性的多肽链或其复合物。例如,是指包含至少1个前 述抗原结合部位的抗体部分,即,具有至少1组的VL和VH的多肽链或 其复合物。作为具体例,可举出利用各种肽酶切断免疫球蛋白而产生的众 多带有充分特征的抗体片段等。作为更具体的例子,可举出Fab、F(ab’)2、Fab’等。Fab是利用木瓜蛋白酶将IgG分子在铰链部的二硫键的N末端侧 切断而产生的片段,由包含构成VH和CH的3个结构域(CH1,CH2,CH3) 中邻近VH的CH1的多肽、和轻链构成。F(ab’)2是利用胃蛋白酶将IgG 分子在铰链部的二硫键的C末端侧切断而产生的Fab’的二聚体。Fab’比 Fab仅多包含铰链部,H链稍长,但实质上与Fab具有同等的结构 (FundamentalImmunology,Paul ed.,3d ed.,1993)。Fab’可以通过在温 和的条件下将F(ab’)2还原,切断铰链区域的二硫键而获得。这些抗体片段 均包含抗原结合部位,具有与抗原(即在本发明中为APOA2蛋白质的特定 的变异体)特异性结合的能力。
本发明的单克隆抗体的片段可以通过化学合成、或通过利用重组DNA 法来合成。可举出例如,利用重组DNA法新合成的抗体片段。具体而言, 虽不限定,但可以是经由具有适当长度和序列的连接肽等使本发明的单克 隆抗体的一个以上的VL和一个以上的VH人工连接而成的单体多肽分子 或其多聚体多肽。作为这样的多肽的例子,可举出单链Fv(scFv:single chain Fragment of variable region,可变区的单链片段)(参照Pierce catalogand Handbook,1994-1995,Pierce Chemical co.,Rockford,IL)、双价抗体 (diabody),三价抗体(triabody)或四价抗体(tetrabody)等合成抗体等。在免 疫球蛋白分子中,VL和VH通常位于不同的多肽链(L链和H链)上。单链 Fv是将这些可变区通过充分长度的柔软性接头连接,在1条多肽链中具有 包含了VL和VH的结构的合成抗体片段。在单链Fv内,两可变区可以相 互自组装而形成1个功能性的抗原结合部位。单链Fv可以通过将编码它 的重组DNA利用公知技术插入到噬菌体基因组中使其表达而获得。双价 抗体是具有以单链Fv的二聚体结构为基础的结构的分子(Holliger et al, 1993,Proc.Natl.Acad.Sci USA,90:6444-6448)。例如,在前述接头的长 度短于约12个氨基酸残基的情况下,单链Fv内的2个可变部位不能自组 装,但通过形成双价抗体,即,通过使2条单链Fv相互作用,从而一条 Fv链的VL能够与另一条Fv链的VH组装,能够形成2个功能性的抗原 结合部位(Marvin et al,2005,Acta Pharmacol.Sin.,26:649-658)。进而, 通过在单链Fv的C末端添加半胱氨酸残基,从而2条Fv链能够彼此形成 二硫键,也能够形成稳定的双价抗体(Alafsen et al,2004,Prot.Engr.Des.Sel.,17:21-27)。这样,双价抗体是二价的抗体片段,但各 个抗原结合部位不需要与同一表位结合,可以分别识别不同的表位,具有 特异性结合的双特异性。三价抗体和四价抗体与双价抗体同样,具有以单 链Fv结构为基础的其三聚体和四聚体结构。分别是三价和四价的抗体片 段,也可以是多特异性抗体。进而,本发明的抗体片段包含利用噬菌体展 示库鉴定的(例如,参照McCafferty et al.,1990,Nature,Vol.348,522-554)、具有抗原结合能力的抗体片段。另外,还可以参照例如,Kuby,J., Immunology,3rd Ed.,1998,W.H.Freeman&Co.,New York。
在本发明中,抗APOA2抗体或其片段可以修饰。这里所说的修饰包 括在抗APOA2抗体或其片段具有与APOA2蛋白质特异性结合的活性方 面必要的功能上的修饰(例如,糖基化)、和在检测本发明的抗体或其片段 方面必要的标记中的任一种。前述抗体标记可举出例如,荧光色素(FITC、 罗丹明、德州红(Texas Red)、Cy3、Cy5)、荧光蛋白质(例如,PE、APC、GFP)、酶(例如,辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶)、或利用 生物素或(链霉)亲和素的标记。此外,前述抗体的糖基化可以为了调节抗 体对抗原的亲和性而改变。这样的改变可以通过例如,改变抗体序列内的 一个以上糖基化部位而实现。如果更具体地说明,则例如,通过向构成FR 内一个以上糖基化部位的氨基酸序列中导入一个以上的氨基酸置换而除去 该糖基化部位,从而可以使该部位的糖基化丧失。这样的脱糖基化在增加 抗体对抗原的亲和性方面是有效的(美国专利第5714350号和美国专利第 6350861号)。
1-2.免疫原的调制
在本发明中,在制作抗APOA2蛋白质末端抗体的情况下,首先调制 作为免疫原(抗原)的APOA2蛋白质变异体。在本发明中,能够作为免疫原 使用的APOA2蛋白质变异体,可举出例如,具有序列号1~3中任一项所 示的氨基酸序列的APOA2蛋白质或其突变体或它们的多肽片段、或者它 们与其他肽(例如,信号肽、标记肽等)的融合多肽。作为免疫原的APOA2蛋白质变异体,例如,可以利用序列号1~3中任一项的氨基酸序列信息, 通过该技术领域中公知的方法,例如固相肽合成法等来合成。例如,可以 通过以下的方法调制。
作为APOA2蛋白质变异体,可以使用天然型APOA2蛋白质、重组 型APOA2蛋白质中的任一种,其全部或一部分可以是像肽合成那样化学 合成的合成APOA2蛋白质。例如,为了获得与APOA2蛋白质的C末端 结合的抗体(抗APOA2蛋白质末端抗体)而调制的APOA2蛋白质变异体, 只要包含天然型APOA2蛋白质、重组型APOA2蛋白质或至少APOA2 蛋白质的各种变异体的C末端区域的连续6个氨基酸以上的氨基酸序列, 则可以是将其全部或一部分像肽合成那样化学合成而得的合成APOA2蛋 白质中的任一种。
天然型APOA2蛋白质可以从以血液(包含血清和血浆)这样的体液为 代表的样品、或从培养细胞的培养上清中,利用公知的蛋白质分离/纯化技 术,例如,凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析来回收。
重组型APOA2蛋白质可以在导入了编码该蛋白质的DNA的微生物、 昆虫细胞或动物细胞中表达,然后从该细胞中利用公知的蛋白质分离/纯化 技术来回收。
对于合成APOA2蛋白质,例如,可以利用公开的APOA2蛋白质的 氨基酸序列信息,通过该技术领域中公知的方法,例如,固相肽合成法等 来合成。可以将该合成APOA2蛋白质连接于KLH(钥孔血蓝蛋白)、 OVA(卵清白蛋白)、BSA(牛血清白蛋白)等载体蛋白质。
在抗APOA2蛋白质末端抗体的制作中,在以APOA2蛋白质变异体 的片段作为免疫原的情况下,也可以使用天然型APOA2蛋白质片段、重 组型APOA2蛋白质片段或合成APOA2蛋白质片段中的任一种。例如, 作为APOA2蛋白质片段,可以使用在序列号1~3中任一项所示的序列中, 包含包括C末端在内的6个以上、优选为10个氨基酸以上、优选为18个 氨基酸以上、更优选为30个氨基酸以上的连续氨基酸残基的寡肽或多肽作 为抗原。例如,可以使用包含序列号28或29所示的氨基酸序列的肽。
在使用天然型APOA2蛋白质的片段作为免疫原的情况下,例如,可 以在抗APOA2蛋白质末端抗体的制作中,对纯化的APOA2蛋白质用胰 蛋白酶等适当的蛋白酶进行处理,然后用反相柱将峰进行分离分级,利用 质量分析器确定各峰中包含的肽的氨基酸序列,将包含序列号1~3中任一 项所示的APOA2蛋白质的C末端区域的连续6个氨基酸以上的序列作为 部分序列的肽的峰作为免疫原使用。
在使用重组型APOA2蛋白质的氨基酸部分序列作为免疫原的情况下, 例如,在抗APOA2蛋白质末端抗体的制作中,通过将编码前述APOA2 蛋白质的DNA序列中,编码包含序列号1~3中任一项所示的APOA2蛋白 质的C末端氨基酸残基的连续6个氨基酸以上的部分序列的DNA序列部 分插入表达用载体,并导入各种细胞,从而能够获得序列号1~3中任一项 所示的各种APOA2蛋白质变异体的氨基酸部分序列。
此外,在本发明中,在制作抗APOA2蛋白质非末端抗体的情况下, 基本的调制方法也可以与前述抗APOA2蛋白质末端抗体的制作方法相同。 但是,能够作为APOA2蛋白质的免疫原使用的区域,使用与作为在抗 APOA2蛋白质末端抗体的制作中使用的免疫原的区域不同的区域。即,只 要使用APOA2蛋白质的除了C末端区域以外的区域的全部或一部分作为免疫原即可。与制作抗APOA2蛋白质末端抗体的情况同样,在制作抗 APOA2蛋白质非末端抗体的情况下,也可以使用包含APOA2蛋白质的除 了C末端区域以外的区域的氨基酸残基的寡肽或多肽作为抗原。
(重组型APOA2蛋白质的调制)
以下对于序列号1~3中任一项所示的重组型APOA2蛋白质(重组型 APOA2蛋白质变异体)的调制进行详述。
(a)编码重组型APOA2蛋白质变异体的多核苷酸的调制
作为用于APOA2蛋白质的各种变异体的表达的载体,可以使用能够 在宿主微生物中自主增殖的噬菌体或质粒。例如,作为质粒,可举出源自 大肠菌的质粒(pET30a、pGEX6p、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19 等)、源自枯草菌的质粒(pUB110、pTP5等)、源自酵母的质粒(YEp13、 YEp24、YCp50等)。此外,作为噬菌体,可举出λ噬菌体(λgt11、λZAP 等)。进而,可以使用牛痘病毒等动物病毒、杆状病毒等昆虫病毒载体。
为了对上述载体插入编码APOA2蛋白质变异体的多核苷酸,例如, 存在将纯化了的该多核苷酸用适当的限制酶切断,利用DNA连接酶等连 接在已经用适当的限制酶切断的载体内部的方法。
(b)APOA2蛋白质变异体表达载体向宿主内的导入
将所得表达APOA2蛋白质变异体的载体导入能够表达该表达载体的 宿主中,获得表达APOA2蛋白质变异体的转化体。关于使用的宿主,只 要是适合所使用的载体、能够表达APOA2蛋白质变异体的宿主,就不特 别限定。优选使用例如,细菌(大肠菌(例如,:Escherichia coli)、枯草菌(例 如,枯草芽孢杆菌:Bacillus subtilis)等)、酵母、昆虫细胞、动物细胞(COS 细胞、CHO细胞(Journal of immunology,1998,Vol.160,3393-3402))等。 关于对细菌导入前述载体的方法,只要是对细菌导入该载体的公知的方法 就不特别限定。可举出例如,热激法、使用钙离子的方法、电穿孔法等。 这些技术均是在该领域公知的技术,被各种文献所记载。例如,参照Green &Sambrook,2012,Molecular Cloning:ALaboratory Manual Fourth Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,New York。此外,动物细胞的转化优选使用脂质体转染法(PNAS,1989,Vol.86,6077;PNAS,1987,Vol.84,7413)、电穿孔法、磷酸钙法(Virology,1973, Vol.52,456-467)、DEAE-葡聚糖法等。
在以细菌作为宿主的情况下,优选表达APOA2蛋白质变异体的载体 在该细菌中能够自主复制,同时由启动子序列、核糖体结合序列、编码 APOA2蛋白质变异体的DNA序列和转录终止序列构成。此外,可以包含 编码控制启动子的调节因子的基因。启动子只要是在大肠菌等宿主中能够 发挥功能的就可以任意使用。
在以酵母、动物细胞、昆虫细胞等真核细胞作为宿主的情况下,同样 可以按照该技术领域中公知的方法而获得表达APOA2蛋白质变异体的转 化体。在真核细胞中使用的APOA2蛋白质变异体表达载体中,除了启动 子序列、编码APOA2蛋白质变异体的DNA序列以外,还可以根据所需连 接增强子等顺势作用元件、剪接信号(供体部位、接受体部位、分支点等)、 多聚腺苷酸附加信号、选择标志物序列、核糖体结合序列(SD序列)等。
(c)转化体的培养和重组型APOA2蛋白质变异体的表达
接着,培养上述制作的转化体。在培养基中培养转化体的方法按照可 用于宿主的培养的通常的方法进行。例如,在以细菌作为宿主的情况下, 培养基只要含有细菌能够同化的碳源、氮源、无机盐类等,且能够使其生 长、增殖,就不特别限定。可以使用天然培养基、合成培养基中的任一种。 作为更具体的例子,可举出LB培养基,但当然并不限定于此。此外,为 了选择性地进行转化体的培养,可以根据需要在培养基中添加氨苄青霉素、 四环素等抗生素。通常,培养在通气搅拌培养等好氧条件下、在37℃下进 行6~24小时。在培养期间,优选pH值保持在中性附近。pH值的调节利 用无机或有机酸、碱性溶液等进行。在转化体为CHO细胞等动物细胞的 情况下,在Gibco社制DMEM培养基中以1×105细胞/mL接种宿主细胞, 在37℃的5%CO2孵育箱中进行培养即可。培养中可以根据需要在培养基 中添加氨苄青霉素、四环素等抗生素。
在前述表达APOA2蛋白质变异体的载体为包含蛋白质表达控制系统 (例如,在宿主为细菌的情况下是阻遏物基因和操纵基因等)的蛋白质表达 诱导型载体的情况下,需要对前述转化体进行规定的处理、诱导APOA2 蛋白质变异体的表达。表达诱导的方法根据载体中包含的蛋白质表达控制 系统不同而不同,因此只要进行适合该系统的诱导处理即可。例如,在以 细菌作为宿主的蛋白质表达诱导型载体中最常利用的蛋白质表达控制系统 是包含lac阻遏物基因和lac操纵基因的系统。本系统可以通过 IPTG(isopropyl-1-tio-β-D-Galactoside,异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷)处理 来诱导表达。在具有包含该系统的表达APOA2蛋白质的载体的转化体中, 为了使目标APOA2蛋白质变异体表达,在培养基中添加适当量(例如,终 浓度为1mM)的IPTG即可。
(d)重组型APOA2蛋白质变异体的提取和/或回收
培养后,在APOA2蛋白质变异体产生于菌体内或细胞内的情况下, 可以通过回收菌体或细胞并进行破碎来提取蛋白质。此外,在APOA2蛋 白质变异体产生于菌体外或细胞外的情况下,直接使用培养液、或者通过 离心分离等除去菌体或细胞而使用上清即可。然后,通过单独或者适当组 合使用通常的蛋白质纯化方法,例如硫酸铵沉淀、凝胶过滤、离子交换层 析、亲和层析等,可以从前述培养物中分离纯化APOA2蛋白质变异体。 关于是否获得了APOA2蛋白质变异体,通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳等 进行确认即可。
1-3.抗APOA2单克隆抗体的制作
1-3-1.抗APOA2单克隆抗体和杂交瘤制作方法
产生本发明的抗APOA2单克隆抗体的杂交瘤可以通过以下记载的方 法来制作。但是,其制作方法并不受本方法限定,也可以通过该领域公知 的其他所有方法来制作。
(1)抗APOA2单克隆抗体制作方法
为了制作与构成APOA2蛋白质的氨基酸序列中,序列号1、2或3所 示的APOA2蛋白质中任一种的C末端区域特异性结合的抗APOA2蛋白 质末端单克隆抗体,以包含APOA2蛋白质变异体或APOA2蛋白质变异 体的C末端区域的肽作为免疫原来制作单克隆抗体,然后,使用包含序列 号1~3中任一项所示的APOA2蛋白质自身或APOA2蛋白质变异体的C 末端区域的肽来筛选仅与APOA2蛋白质的特定变异体结合的抗体即可。 例如,对于抗APOA2-ATQ末端单克隆抗体,可以以与序列号1所示的 APOA2-ATQ蛋白质的C末端区域特异性结合、与序列号2或3所示的 APOA2蛋白质变异体不结合或者几乎不结合为指标来筛选。此外,对于抗APOA2-AT末端单克隆抗体,可以以与序列号2所示的APOA2-AT蛋白 质的C末端区域特异性结合、与序列号1或3所示的APOA2蛋白质变异 体不结合或者几乎不结合为指标来筛选。
此外,为了制作识别APOA2蛋白质的除了C末端区域以外的氨基酸 的抗APOA2蛋白质非末端抗体,可以以包含APOA2蛋白质变异体或部 分序列的肽作为免疫原来制作单克隆抗体,然后,以在比较对序列号1~3 中任一项所示的APOA2蛋白质变异体或C末端不同的肽的结合活性时结 合活性为同程度为指标,来筛选抗体,从而获得。
(2)产生抗APOA2抗体的细胞的制作
将前述1-2获得的作为免疫原的重组型APOA2蛋白质溶解在缓冲液 中来调制免疫原溶液。此时,为了有效地进行免疫,如果需要,可以添加 佐剂。作为佐剂的例子,可举出市售的弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全 佐剂(FIA)等,可以单独或混合使用这些佐剂。
接着,将前述调制的免疫原溶液给予哺乳动物,例如大鼠、小鼠(例如 近交系小鼠BALB/c)、兔等,进行免疫。作为免疫原的给予方法,可举出 例如,使用FIA或FCA的皮下注射、使用FIA的腹腔内注射或使用0.15mol 氯化钠的静脉注射,但是不限于此。免疫原1次的给予量是根据免疫动物 的种类、给予途径等适当确定的,每只动物约50~200μg。此外,对免疫的 间隔不特别限定,初次免疫后,以数日至数周的间隔、优选为1~4周的间 隔,进行2~6次、优选为3~4次追加免疫。在初次免疫之后,通过 ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,酶联免疫吸附测定)法等 测定免疫动物的血清中的抗体效价,如果观察到抗体效价充分上升,则将 免疫原注射到静脉内或腹腔内,作为最终免疫。然后,最终免疫之日起2~5 天后,优选为3天后,采集抗体产生细胞。
1-3-2.产生抗APOA2单克隆抗体的杂交瘤的制作方法
(1)来自免疫动物的产生抗体的细胞的回收和细胞融合
通过进行从免疫动物获得的产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞的细胞融 合,能够制作生产特异性识别APOA2蛋白质的特定区域的单克隆抗体的 杂交瘤。作为产生抗体的细胞,可举出脾脏细胞、淋巴节细胞、末梢血细 胞等,优选脾脏细胞或局部淋巴节细胞。作为与产生抗体的细胞融合的骨 髓瘤细胞,可以使用通常能够获得的来自小鼠等的株化细胞。作为使用的 细胞株,优选为具有药剂选择性,并具有在未融合的状态下不能在HAT 选择培养基(包含次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶)生存、仅在与产生抗体 的细胞融合的状态下能够生长的性质的细胞株。此外,株化细胞优选为来 自与免疫动物同种系的动物的细胞。作为骨髓瘤细胞的具体例,可举出来 自BALB/c小鼠的次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶(HGPRT)缺损细胞株、 P3X62-Ag.8株(ATCCTIB9)、P3X63-Ag.8.U1株(JCRB9085)、 P3/NSI/1-Ag4-1株(JCRB0009)、P3x63Ag8.653株(JCRB0028)或 SP2/0-Ag14株(JCRB0029)等。
为了使上述骨髓瘤细胞和产生抗体的细胞发生细胞融合,在不含血清 的DMEM、RPMI1640培养基等动物细胞培养用培养基中,将产生抗体的 细胞和骨髓瘤细胞以约1:1~20:1的比例进行混合,在细胞融合促进剂的存 在下进行融合反应。作为细胞融合促进剂,可以以约10~80%的浓度使用 平均分子量1,500~4,000Da的聚乙二醇等。此外,为了提高融合效率,可 以根据情况并用二甲基亚砜等辅助剂。进而,可以使用利用了电刺激(例如电穿孔)的市售细胞融合装置来使产生抗体的细胞和骨髓瘤细胞融合 (Nature,1977,Vol.266,550-552)。
(2)目标杂交瘤的筛选
作为从细胞融合处理后的细胞分选产生抗APOA2单克隆抗体的目标 杂交瘤的方法,将细胞悬浮液利用例如含有胎牛血清的RPMI1640培养基 等进行适当稀释后,以2×106个/孔程度接种在96孔微量酶标板上,向各孔 添加选择培养基,之后适当地交换选择培养基而进行培养。培养温度为 20~40℃,优选为约37℃。在骨髓瘤细胞为HGPRT缺损株或胸苷激酶(TK) 缺损株的情况下,通过使用包含次黄嘌呤·氨基蝶呤·胸腺嘧啶核苷酸的选 择培养基(HAT培养基),可以选择性地仅仅使产生抗体的细胞和骨髓瘤细 胞的杂交瘤生长、增殖,因此可以从在选择培养基中培养开始后约10天前 后选择生长起来的细胞作为杂交瘤。
对用HAT培养基选择出的杂交瘤,首先,以对序列号1~3中任一项 所示的APOA2蛋白质的各种变异体的结合活性为指标进行筛选。接着, 对于产生对APOA2蛋白质变异体具有结合活性的抗体的杂交瘤,进行交 差性试验,选择能够允许的杂交瘤。所谓能够允许的交差性,是指在目标 抗体的用途中能够忽略的程度的交差性。例如,对于用于免疫学测定的单 克隆抗体,如果在最终的测定体系中由交差反应引起的信号强度能够抑制 在小于从背景水平开始由特异性反应引起的信号强度的1%,则可以说事 实上不发生交差反应。
为了确认对APOA2蛋白质的特定变异体的反应特异性,例如,可以 利用ELISA法。在ELISA法中,准备将成为抗原的APOA2蛋白质的各 种变异体或其片段分别固相化在不同孔而得的微孔板,向其中添加将前述 杂交瘤的培养上清进行适当稀释而得的样品,使其反应。在充分反应后, 洗涤孔,添加针对免疫球蛋白的二抗的标记体进一步反应。再次洗涤孔, 如果最终利用已结合于孔的二抗的标记进行测定,则可以定量地知道培养 上清中存在的抗体对抗原的结合活性。例如,为了制作抗APOA2蛋白质 末端单克隆抗体,将仅对特定的APOA2蛋白质变异体的C末端区域显示 结合活性、对APOA2蛋白质的其他变异体不显示交差性为指标,进行特 异性的判断即可。此外,为了制作抗APOA2蛋白质非末端单克隆抗体,以对APOA2蛋白质的C末端不同的任一变异体均显示同程度的结合性、 并且所制作的抗体不阻碍抗APOA2蛋白质末端单克隆抗体与C末端区域 的结合为指标,进行抗体的筛选。
杂交瘤也可以利用重组DNA技术进行筛选。首先,从按照前述方法 获取的杂交瘤组提取mRNA。mRNA的提取使用该技术领域中公知的方法 即可。接着,使用Oligo dT引物、随机引物来获取前述mRNA的cDNA。 以该cDNA为模板,利用包含位于编码可变区的基因的信号序列的碱基序 列、和恒定区侧的碱基序列的引物组来进行PCR。将所得扩增产物插入到 适当的克隆载体而进行克隆化,可以获得由该杂交瘤生产的抗体的可变区 基因的文库。作为更具体的例子,虽不限定,但可以使用Novagen社提供 的Mouse Ig Primer进行PCR,将扩增产物(小鼠免疫球蛋白可变区cDNA) 插入到Invitrogen社提供的ZERO BLUNT PCR TOPO载体的EcoRI位 点而进行克隆化,将所得载体组作为编码可变区氨基酸序列的基因文库。 接着,通过以前述本发明公开的可变区或各CDR的氨基酸序列为基础设 计探针,从前述文库中筛选阳性克隆,可以筛选生产本发明的抗体的杂交 瘤。
(3)利用杂交瘤产生抗体
本发明中的杂交瘤通过使用小鼠进行腹水化,从而可以用于抗体生产。 具体而言,向制作杂交瘤时用作融合伴侣的细胞所来自的小鼠、裸鼠的腹 腔内接种杂交瘤,适当采集腹水,从而可以回收包含抗体的腹水液。更具 体而言,通过以SP2/0细胞作为融合伴侣的杂交瘤接种在接种降植烷后经 过了10天的BALB/c小鼠的腹腔中,可以回收包含抗体的腹水液。
此外,本发明中的杂交瘤通过使用适当的培养基进行培养,从而可以 用于抗体生产。具体而言,通过在Gibco社制的杂交瘤SFM培养基中以 1×105细胞/mL接种杂交瘤,在37℃的5%CO2孵育箱中进行培养直到杂交 瘤死亡为止,可以获得包含抗体的培养液上清,但是不限于此。
(4)通过重组DNA操作制作重组抗APOA2单克隆抗体或其片段的制 作方法
本发明的抗体或其片段也可以利用编码该抗体的氨基酸序列的cDNA 序列,通过重组DNA操作而获得。
可以使用编码来自产生抗APOA2单克隆抗体的杂交瘤、例如来自由 上述“1-3-2(2)”的方法获取的产生抗APOA2蛋白质末端单克隆抗体的杂交 瘤的该抗体的可变区的氨基酸序列的碱基序列,将VH和VL的碱基序列 分别与编码任意的CL和CH的碱基序列连接,将各个多核苷酸插入适当 的表达载体,在导入宿主细胞之后,作为完整的免疫球蛋白分子而使其表 达。此外,也可以利用CDR移植抗体技术,将编码由上述“1-3-2(2)”的方 法获取的可变区的氨基酸序列中的CDR序列的氨基酸序列的多核苷酸插 入适当的表达载体中,在导入宿主细胞之后,作为完整的免疫球蛋白分子 使其表达。此时,使得重链和轻链在同一宿主细胞内表达、能够作为包含 重链/轻链的二聚体而产生,则是便利的。具体而言,例如,可以通过轻链 表达载体和重链表达载体将细胞共转化,从该转化细胞获得本发明的抗体。或者,也可以将编码上述氨基酸序列的多核苷酸直接插入适当的表达载体 中,在导入宿主细胞之后,作为免疫球蛋白分子的片段使其表达。或者, 如上所述,可以将分别编码包含前述氨基酸序列的VL和VH、或轻链和 重链的多核苷酸用适当的接头进行连接并插入噬菌体,制成单链Fv使其 表达,或者制成双价抗体等合成抗体片段使其表达。另外,通过近年开发的、灵活运用基因工程技术而使重组抗体在噬菌体表面表达的噬菌体展示 抗体技术(Brinkmann et al,1995,J Immunol Methods,182,41-50,国 际公开WO97/13844号,同90-02809号),可以人工使将编码重链、轻链 的基因改组(shuffling)而多样化后的单链Fv抗体作为噬菌体融合蛋白表 达,从而获得特异抗体。
关于编码重组抗APOA2抗体或其片段的多核苷酸的调制、插入了该 多核苷酸的载体、该载体的宿主导入法,使用该领域公知的重组DNA技 术来进行即可。目标重组抗APOA2蛋白质抗体或其片段可以从转化细胞 的培养液中或从该细胞内获得。
作为免疫球蛋白的表达载体,可以使用例如,质粒、噬菌粒、粘粒、 病毒载体(例如,基于SV40病毒的载体、基于EB病毒的载体、基于BPV 的载体)等,但不限定于这些。例如,作为基于BPV的载体的1种的BCMGS Neo载体是通过转化COS7细胞等而高效地表达外来基因的理想的载体(乌 山一“牛乳头瘤病毒载体”,村松正实和冈山博人编,实验医学别册:遺伝子工学ハンドブック(基因工程手册),1991,羊土社,297-299)。
除了编码抗体或其片段的多核苷酸以外,前述载体可以包含在表达前 述抗体或其片段方面必要的控制元件(例如,启动子、增强子、终止子、聚 腺苷酸化部位、剪接部位),或者如果需要可以包含选择标志物。
作为转化的宿主,除了“1-2.免疫原的调制”记载的宿主以外,优选使用 SP2/0(小鼠骨髓瘤)细胞(Europian Journal of Cancer Prevention(1996) Vol.5,512-519;Cancer Resarch(1990)Vol.50,1495-1502)。
在本发明中,含有表达抗体或其片段的载体的宿主细胞通过按照常规 方法进行培养,可以在其培养液上清或宿主细胞内产生抗体。具体而言, 在以CHO细胞作为宿主的情况下,通过在Gibco社制DMEM培养基中 以1×105细胞/mL接种宿主细胞,在37℃的5%CO2孵育箱进行培养,从 而可以获得包含抗体的培养液上清。此外,例如,在以大肠杆菌作为宿主细胞的情况下,可以通过接种在LB培养基等可用于大肠杆菌的培养的通 常培养基中进行培养、诱导蛋白质的表达,从而可以在培养液上清或宿主 细胞内产生抗体。
在作为表达产物的抗体或其片段包含恒定区的情况下,可以使用蛋白 A柱、蛋白G柱、抗免疫球蛋白抗体亲和柱等从培养液上清、细胞破碎液 纯化、回收。另一方面,在以仅由可变区构成、不包含恒定区的状态表达 的情况下,不能应用前述纯化方法,因此应用其他适当的纯化方法。例如, 如果作为在C末端融合了组氨酸标签等对纯化有利的标签序列的结构使其 表达,则可以通过利用了对应的配体的亲和层析来纯化。在不是与标签的 融合蛋白质的情况下,可以按照硫酸铵沉淀、离子交换层析、反相层析、 凝胶过滤层析、羟基磷灰石层析等蛋白质纯化的常规方法进行纯化。
另外,为了确认本发明中使用的单克隆抗体或其片段对APOA2蛋白 质的特定的变异体或其片段的特异性,优选如前所述在使用之前预先验证 与其他变异体的交差反应性。例如,对于本发明的抗APOA2-ATQ蛋白质 末端单克隆抗体或其片段,应该确认交差性的抗原是APOA2-AT蛋白质和 APOA2-A蛋白质。
此外,更优选除了前述蛋白质以外,对于部分结构与APOA2蛋白质 变异体相同的其他蛋白质,也确认本发明中使用的抗体或其片段的交差反 应性。对于交差反应的确认,例如,可以使用以APOA2-ATQ蛋白质作为 抗原的ELISA法。在应该试验反应特异性的抗体、即抗APOA2蛋白质末 端抗体及其片段与APOA2蛋白质变异体的反应的情况下,只要使应该确 认交差性的其他抗原蛋白质共存,就能够通过观察两者的竞争状态来确认 交差性。利用了竞争抑制原理的这样的交差性的确认方法,不需要对于所 有的抗原调制反应体系,因此可以迅速地进行筛选。
1-3-3.由所得的抗APOA2蛋白质末端单克隆抗体所识别的APOA2蛋 白质的区域结构的确认
关于由所得的抗APOA2单克隆抗体所特异性识别的APOA2蛋白质 变异体的种类,可以通过以该蛋白质的基因为基础使用PCR反应等制作各 种APOA2蛋白质变异体基因,解析由该基因获得的APOA2蛋白质的各 种变异体与单克隆抗体的结合性来确定。
对于抗APOA2蛋白质末端单克隆抗体的情况,具体而言,通过如下 方法进行。首先,调制APOA2基因全长、或者从APOA2基因的终止密 码子起向5’末端侧缺失了包含终止密码子在内的6个碱基、或9个碱基的 各种长度的片段,制作插入了这些片段的表达载体。这样伴随缺失突变的 基因片段的调制法记载在“续生化学实验讲座,第1卷,遗传子研究法II, 289-305页,日本生化学会编”中。接着,从导入了表达各个APOA2蛋白 质变异体的载体的宿主细胞,利用前述方法来调制APOA2蛋白质的各种 变异体。接着,以这些蛋白质作为抗原、通过ELISA法来评价抗APOA2 蛋白质单克隆抗体对各种APOA2蛋白质变异体的结合性。在仅能观察到 对特定变异体的结合性、不能观察到或者几乎不能观察到对其他变异体的结合性的情况下,可以判断该单克隆抗体是仅与特定的APOA2蛋白质变 异体特异性结合的末端单克隆抗体。
由所得抗APOA2蛋白质末端单克隆抗体识别的APOA2蛋白质变异 体也可以根据如下方法确认。
首先,通过公知的方法,分别固相合成各种APOA2蛋白质变异体的 C末端区域的序列肽。接着,以这些肽作为抗原、通过ELISA法来评价抗 APOA2蛋白质末端单克隆抗体对各种肽的结合性。在抗APOA2蛋白质单 克隆抗体仅对特定的C末端区域的序列肽显示结合性的情况下,可以判断 该单克隆抗体是仅与特定的APOA2蛋白质变异体特异性结合的抗APOA2 蛋白质末端单克隆抗体。
1-4.抗APOA2多克隆抗体的制作
抗APOA2多克隆抗体可以通过该技术领域中公知的方法制作。以下, 作为例子,具体显示仅与APOA2蛋白质的特定变异体特异性结合的抗 APOA2蛋白质末端抗体的获取法。
1-4-1.抗血清的获取
为了制作抗APOA2蛋白质末端多克隆抗体,首先,将特定的APOA2 蛋白质变异体序列上具有至少6个氨基酸以上长度的C末端片段、例如序 列号28或29所示的肽溶解于缓冲液来调制免疫原溶液。如果需要的话, 为了有效地进行免疫,可以添加佐剂。作为佐剂的例子,可举出市售的弗 氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)等,可以单独或混合使用这些佐 剂。
接着,将前述调制的免疫原溶液给予哺乳动物,例如大鼠、小鼠(例如 近交系小鼠Balb/c)、兔等,进行免疫。免疫原溶液1次的给予量是根据免 疫动物的种类、给予途径等适当确定的,每只动物包含约50~200μg的免疫 原即可。作为免疫原溶液的给予方法,可举出例如,使用FIA或FCA的 皮下注射、使用FIA的腹腔内注射或使用150mM的氯化钠的静脉注射, 但不限于此。此外,对免疫的间隔不特别限定,在初次免疫后,以数天至 数周的间隔、优选为以1~4周的间隔,进行2~10次、优选为3~4次追加免 疫。在初次免疫之后,利用ELISA(酶联免疫吸附测定,Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)法等反复测定免疫动物的血清中的抗体效价,在充 分观察到抗体效价的上升时,将免疫原溶液注射到静脉内或腹腔内,作为 最终免疫。免疫后,可以从血液回收包含识别APOA2蛋白质的多克隆抗 体的抗血清。
1-4-2.抗APOA2抗体的纯化
(1)肽固定化柱的制作
制作分别固定化了APOA2蛋白质的C末端区域肽、和在APOA2蛋 白质的C末端区域肽的C末端添加了酰胺基的肽的亲和柱。详细的方法记 载在“抗ペプチド抗体実験プロトコール(抗肽抗体实验方案)”,第2版, 秀润社中。用于亲和柱的担载体可以使用像FormylCellulofine、CNBr琼 脂糖这样,载体上的官能团能够与肽的氨基结合的担载体,或者能够经由 共价键合在担载体上的马来酰亚胺基而与肽序列上的半胱氨酸残基结合的 担载体等。此外,对于固定化的肽的长度,只要包含APOA2蛋白质的C 末端即可,为6个氨基酸以上,优选为10个氨基酸以上,优选为18个氨 基酸以上,更优选为30个氨基酸以上。
(2)抗体纯化
对于抗APOA2蛋白质末端多克隆抗体,可以使用肽固定化亲和柱从 前述抗血清纯化。例如,用适当的缓冲液稀释前述抗血清,使抗血清中包 含的IgG抗体吸附在固定化了APOA2蛋白质的C末端区域肽的亲和柱上, 回收该吸附级分。接着,使用固相化有C末端酰胺化了的APOA2蛋白质 肽的亲和柱,吸附除去对肽的除了C末端区域以外的区域显示结合性的免 疫球蛋白。最终,获取该非吸附级分作为特异性识别特定的APOA2蛋白 质变异体的抗APOA2蛋白质末端多克隆抗体。
2.胰肿瘤的检测方法
本发明的第二方式,涉及在体外检测胰肿瘤、即胰癌或胰良性肿瘤的 方法。本发明的特征在于,基于相对于健常者,胰肿瘤患者中2种APOA2 蛋白质变异体、即APOA2-ATQ蛋白质和APOA2-AT蛋白质两者、或任 一者的血中量显著降低的见解,使用特异性识别各个APOA2蛋白质变异 体的C末端区域的末端抗体(抗APOA2蛋白质末端抗体)或其片段、和识别除了C末端区域以外的区域的氨基酸序列的抗APOA2蛋白质抗体(抗 APOA2蛋白质非末端抗体)或其片段,来测定前述2种APOA2蛋白质变 异体。进而,其特征在于,通过利用所测定的2种APOA2蛋白质变异体 的测定值的多变量解析,来检测胰肿瘤的方法。
本发明的方法包含胰肿瘤检测用标志物测定工序和罹患确定工序。以 下,对于各个工序进行详细说明。
2-1.胰肿瘤检测用标志物测定工序
“胰肿瘤检测用标志物测定工序”,是在体外测定来自受试体的体液中 存在的胰肿瘤检测用标志物、即由APOA2-ATQ蛋白质和APOA2-AT蛋 白质组成的2种APOA2蛋白质变异体的量的工序。
在本说明书中,“受试体”是指成为胰肿瘤的检测对象的个体,优选为 怀疑罹患胰肿瘤的个体。作为这里所说的个体的例子,可举出脊椎动物。 优选为哺乳动物,例如灵长类(人、猴、黑猩猩、红猩猩、大猩猩等)、啮 齿类(小鼠、大鼠、豚鼠等)、有蹄类(牛、马、绵羊、山羊等)等,更优选为 人。在本说明书中,在受试体是人的情况下,以下将受试体特别称为“受试 者”。
在本说明书中,“体液”是供给胰肿瘤检测的样品,是指生物学上的液 体。体液只要是可能包含本发明的胰肿瘤检测用标志物的生物学上的液体 即可,不特别限定。包含例如,血液、尿、淋巴细胞培养上清、脑脊液、 消化液(包含例如,胰液、大肠液、食道腺分泌液、唾液)、汗、腹水、鼻 涕、泪、阴道液、精液等。优选为血液或尿。本说明书中,所谓“血液”包含全血、血浆和血清。全血不论静脉血、动脉血或脐带血等种类。体液也 可以是从同一个体获得的两种以上不同的液体的组合。本发明的胰肿瘤的 检测方法能够从侵袭性低的血液、尿检测,因此作为简便的检测法是非常 有用的。
“来自受试体的体液”是指已经从受试体采集的体液,采集体液的行为 自身不包含在本发明的方式中。对于来自受试体的体液,可以将从受试体 采集的体液立即供给本发明的方法,也可以将采集后直接或进行了适当的 处理后,冷藏或冷冻的体液在供给本发明的方法之前恢复到室温来使用。 作为冷藏或冷冻前的适当的处理,包含例如,在全血中添加肝素等进行抗 凝处理后,或作为血浆或血清进行分离等。这些处理只要基于该领域中公知的技术进行即可。
在本说明书中,“APOA2蛋白质变异体的量”是指来自受试体的体液中 存在的前述2种APOA2蛋白质变异体各自的分量。该分量可以是绝对量 或相对量的任一种。在该分量是绝对量的情况下,是指规定的体液量中包 含的前述2种APOA2蛋白质变异体的质量或体积。在该分量是相对量的 情况下,是指例如,使用标准物质,来自受试体的2种APOA2蛋白质变异体的测定值相对于该标准物质的测定值的相对值。可举出例如,浓度、 荧光强度、吸光度等。
APOA2蛋白质变异体的量可以在体外使用公知的方法进行测定。可举 出例如,使用能够分别与2种APOA2蛋白质变异体特异性结合的物质进 行测定的方法。
在本说明书中,“能够特异性结合”是指某种物质能够仅与作为本发明 的目标的APOA2蛋白质的特定变异体实质性地结合。在该情况下,也可 以存在对特定的APOA2蛋白质变异体的检测不产生影响的程度的非特异 性结合。
作为“能够特异性结合的物质”,可举出例如APOA2结合蛋白质。更 具体而言,例如,以APOA2蛋白质变异体作为抗原、识别C末端区域的 结构的不同而结合的“抗APOA2蛋白质末端抗体”,优选为在以包含序列 号1、2或3的氨基酸序列的人APOA2蛋白质变异体作为抗原时,仅识别 APOA2蛋白质变异体中的任一种而结合的“抗人APOA2蛋白质末端抗体 或其抗体”片段。或者,也可以是它们的化学修饰衍生物。在这里,所谓“化 学修饰衍生物”,包含例如,在前述抗APOA2蛋白质末端抗体或其抗体片 段中,在获得或保持与APOA2蛋白质的特定变异体的特异性结合活性方 面必要的功能上的修饰,或在检测前述抗APOA2蛋白质末端抗体或其抗 体片段方面必要的用于标记的修饰中的任一种。
功能上的修饰可举出例如,糖基化、去糖基化、PEG化。标记上的修 饰可举出例如,利用荧光色素(FITC、罗丹明、德州红、Cy3、Cy5)、荧光 蛋白质(例如,PE、APC、GFP、EGFP)、酶(例如,辣根过氧化物酶、碱 性磷酸酶、葡萄糖氧化酶)、或生物素、亲和素、链霉亲和素的标记。
用于APOA2蛋白质变异体的测定的抗体可以是多克隆抗体和单克隆 抗体中的任一种。为了能够特异性检测,优选为单克隆抗体。例如,与 APOA2蛋白质末端特异性结合的抗APOA2蛋白质末端多克隆抗体等可以 通过前述方法制作。
2种APOA2蛋白质变异体可以通过使用了仅与APOA2蛋白质的特定 变异体结合的抗APOA2抗体的免疫学方法测定。免疫学方法只要使用抗 APOA2抗体,任一方法均可,优选为使用抗APOA2蛋白质末端抗体作为 固相化抗体或标记抗体、组合与APOA2蛋白质的C末端以外的区域结合 的另一抗体(抗APOA2蛋白质非末端抗体)来进行的ELISA法。例如,APOA2-ATQ蛋白质的量可以通过使用抗APOA2-ATQ末端抗体作为标记 抗体、使用抗APOA2-ATQ非末端抗体作为固相化抗体的夹心ELISA法 测定。此外,APOA2-AT蛋白质可以通过使用抗APOA2-AT末端抗体作 为固相化抗体、使用抗APOA2-AT非末端抗体作为标记抗体的夹心ELISA 法测定。抗APOA2蛋白质非末端抗体由Abcam社、FITZGERALD社等 市售,也可以利用这些市售的抗APOA2蛋白质非末端抗体。
2-2.罹患确定工序
“罹患确定工序”是基于在前述胰肿瘤检测用标志物测定工序中所测定 的蛋白质的量,体外确定(或评价)胰癌或胰良性肿瘤的罹患的工序。测定 所测定的胰肿瘤检测用标志物、即受试体的体液样品中的APOA2蛋白质 变异体的量(APOA2-ATQ蛋白质和APOA2-AT蛋白质的量),进行胰肿瘤 的检测,确定是否罹患胰肿瘤,或评价罹患的可能性。本工序进一步由第 1工序~第3工序这3个工序构成。以下,对于各个工序进行详细说明。
在第1工序中,使用与APOA2-ATQ蛋白质的C末端区域特异性结合 的抗APOA2-ATQ末端抗体、和与除了该C末端区域以外的氨基酸序列结 合的抗APOA2-ATQ非末端抗体,来测定受试体的体液样品中的 APOA2-ATQ蛋白质的量,所述APOA2-ATQ蛋白质由序列号1所示的氨 基酸序列组成。
接着,在第2工序中,使用与APOA2-AT蛋白质的C末端区域特异 性结合的抗APOA2-AT末端抗体、和与除了该C末端区域以外的氨基酸 序列结合的抗APOA2-AT非末端抗体,来测定APOA2-AT蛋白质的量, 所述APOA2-AT蛋白质由序列号2所示的氨基酸序列组成。在这里,优选 APOA2-ATQ蛋白质和APOA2-AT蛋白质的前述C末端区域分别是包含 包括C末端在内的6个以上连续的氨基酸序列。APOA2蛋白质变异体的 量例如可以通过ELISA法测定,但不限定于该方法。进而,在第1工序中 与抗APOA2-ATQ末端抗体一起使用的抗APOA2-ATQ非末端抗体、和 在第2工序中与抗APOA2-AT末端抗体一起使用的抗APOA2-AT非末端 抗体,作为抗APOA2蛋白质非末端抗体可以是相同的。即,可以在第1 工序中使用抗APOA2-AT非末端抗体,并且在第2工序中使用抗 APOA2-ATQ非末端抗体。
在第3工序中,将由第1工序获得的APOA2-ATQ蛋白质的量的测定 值和由第2工序获得的APOA2-AT蛋白质的量的测定值输入预先设定的判 别式,求出受试体的判别值,在该受试体的判别值与健常体的判别值相比 在统计学上有显著性差异时,确定受试体罹患胰肿瘤。这里使用的判别式 可以利用后述的方法来设定。
此外,即使不求出判别值,在从受试者采集的样品中的APOA2-ATQ 蛋白质或APOA2-AT蛋白质中的任一者的量与从健常者采集的样本的量 相比有显著性差异的情况下,具体而言,在从受试者采集的样品中所测定 的量显著少的情况下,有时也可以简便地确定受试者罹患胰肿瘤。
本发明的胰肿瘤的检测方法可以对于在上述第3工序中已确定罹患胰 肿瘤的受试体进一步进行第4工序。在第4工序中,通过测定该受试体的 体液样品中的已知的胰癌标志物的量,可以区别地确定受试体是否罹患胰 癌或胰良性肿瘤中的任一种。作为该方法中使用的已知的胰癌标志物,使 用已知能够检测胰癌、但不能检测胰良性肿瘤的标志物。具体而言,可以 使用作为唾液酸化LewisA抗原的“CA19-9”(Carbohydrate Antigen 19-9,糖类抗原19-9)、作为粘蛋白样糖蛋白的“DU-PAN-2”(Pancreatic cancer-associatedantigen-2,胰癌相关抗原-2)(臨床検査データブック(临床 检查数据书)2013-2014,高久史麿监修,医学书院,p.636-638)。关于进行 胰癌判别时的基准值,CA19-9为37(U/mL),DU-PAN-2为150(U/mL)。 CA19-9、DU-PAN-2的量可以通过例如ELISA法来测定,但不限于该方法。
上述第4工序中罹患的确定具体可以如下进行。首先,测定受试者的 体液样品中的CA19-9或DU-PAN-2的量。接着,在该CA19-9或DU-PAN-2 的量的测定值超过用于上述胰癌判别的各基准值的情况下,可以确定受试 体罹患胰癌。此外,在测定值为各基准值以下的情况下,可以确定受试体 罹患胰良性肿瘤。这是因为,测定APOA2蛋白质变异体的量的本发明的 方法能够检测以往不可能检测的胰良性肿瘤。
基于本发明的胰肿瘤的检测方法也可以与APOA2-A蛋白质等、 APOA2蛋白质的其他变异体、或APOA2蛋白质的总量组合来利用,本发 明也包含这样的方式。
“健常体”是指至少不患有胰肿瘤的个体,优选为健康的个体。进而, 健常体要求与受试体是同一物种。例如,在提供给检测的受试体是人(受试 者)的情况下,健常体也必须是人(在本说明书中,以下称为“健常者”)。健 常体的身体条件优选与受试体相同或近似。所谓身体条件,例如在人的情 况下,是人种、性别、年龄、身高、体重等。
关于健常体的体液中的胰肿瘤检测用标志物的浓度,优选利用与前述 胰肿瘤检测用标志物测定工序中说明了的受试体的体液中的胰肿瘤检测用 标志物的浓度的测定方法同样的方法进行测定。关于健常体的体液中的胰 肿瘤检测用标志物的浓度,可以在每次测定受试体的体液中的胰肿瘤检测 用标志物的浓度时进行测定,也可以利用预先测定好的胰肿瘤检测用标志 物的浓度。特别是,如果预先测定好健常体的各种身体条件下的胰肿瘤检 测用标志物质的浓度,将其值输入计算机进行数据库化,则通过将受试体 的身体条件输入该计算机,就可以立即利用与该受试体相比具有最适的身 体条件的健常体的胰肿瘤检测用标志物的浓度,因此是便利的。
在本说明书中,“在统计学上显著”例如所得值的风险率(显著性水平) 小的情况,具体而言,可举出p<0.05、p<0.01或p<0.001的情况。在这里, “p”或“p值”表示在统计学检验中,统计量在假定的分布中,假定偶然正确 的概率。因此,“p”或“p值”越小,表示假定越接近真实。“在统计学上有 显著性差异”是指对分别从受试体和健常体获得的胰肿瘤检测用标志物的 量,或输入到判别式而获得的判别值的差异进行统计学处理时,两者间有 显著性差异。在与健常体的比较中,在统计学上有显著性差异情况下,评 价为该受试体罹患胰肿瘤。对于统计学处理的检验方法,只要适当使用能 够判断显著性有无的公知的检验方法即可,不特别限定。例如,可以使用 学生t检验法(student’s t test)、多重比较检验法。
在本说明书中,“判别式”是多变量解析的最终生成物,通过1个以上 的值集被赋予特征,最终算出判别值。所谓“多变量解析”,在本说明书中, 是为了使用胰肿瘤检测用标志物的测定值来构建判别式而使用的数学方 法。此外,在说明书中,所谓“值集”,是关于胰肿瘤检测用标志物的特征 的值的组合或值域。该值集及其中的值的性质依赖于胰肿瘤检测用标志物 中存在的特征的类型和为了构建指示值集的判别式而使用的多变量解析。
在本说明书中,“判别值”是可以作为预测对象检体是否罹患胰肿瘤的 指标而利用的值。在一个具体例中,根据判别值,可以预测对象检体罹患 胰肿瘤。在另一个例子中,根据判别值,可以预测对象检体没有罹患胰肿 瘤。
判别式可以通过使用数据解析算法的多变量解析来构建。作为可以用 于判别式的构建的数据解析算法,可举出包含逻辑回归分析的广义线性模 型、神经网络、支持向量机(SVM)、判别分析、非参数方法、PLS(Partial Least Squares,偏最小二乘法)、决策树、主成分分析、广义加法模型、模糊逻 辑(Fuzzy logic)、SOM(Self-organizing maps,自组织图)或遗传算法。其中, 可以优选使用逻辑回归分析、神经网络、SVM或判别分析。但是,不限定 于这些数据解析算法。关于这些统计的方法的详细内容,见于以下的参考 文献:Ruczinski,I.等,2003年,Journal of Computational and Graphical Statistics,第12卷,p.475-511;Friedman,J.,Journal of the American Statistical Association,1989年,第84卷,p.165-175;Hastie,T.等著,2001 年,The Elements of StatisticalLearning,Springer Series in Statistics; Breiman,L.著,1984年,Classificationand regression trees,Chapman and Hall:Breiman,L.,2001年,Machine Learning,第45卷,p.5-32;Pepe,M. 著,2003年,The Statistical Evaluation of Medical Tests forClassification and Prediction,Oxford Statistical Science Series;以及Duda,R.等著,2000 年,Pattern Classification,Wiley Interscience,第2版。
在本发明中,使用了判别式的解析通过以下所示的工序进行。首先, 将想要判别的事件设定为目标变量。“目标变量”是在判别式中想要判别的 事件。在本发明中,表示受试者是否罹患胰肿瘤。例如,在逻辑回归分析 的情况下,对于想要判别的事件为受试者是否罹患胰肿瘤的情况,可以如 下设定目标变量:将受试者是胰肿瘤患者的情况设定为“1”,是健常者的情 况设定为“0”。接着,设定用于预测目标变量的说明变量。“说明变量”是在判别式中用于预测前述目标变量而使用的变量。例如,在逻辑回归分析的 情况下,作为说明变量,可以设定胰肿瘤检测用标志物、即APOA2-ATQ 蛋白质和APOA2-AT蛋白质的测定值。接着,使用前述的任一数据解析算 法,构建组合了说明变量的判别式,算出判别值。基于所得的判别值,预 测想要判别的事件。例如,在逻辑回归分析的情况下,根据判别值,可以 预测受试者是胰肿瘤患者(即“1”)、或健常者(即“0”)。最终,比较事件的预 测结果和目标变量的值,评价判别式的判别性能。在这里,“判别性能”是 指能够在何种程度正确地预测想要判别的事件这样的指标。作为判别性能, 可以利用症例数据的判别成绩(灵敏度、特异度)或AUC值。为了确定是否 罹患胰肿瘤或评价罹患的可能性,以从判别式获得的判别值为基准进行即 可。
在本说明书中,“AUC(area under the curve:曲线下面积)值”,是指 受试者工作特征曲线(ROC曲线)下的面积,是测试用于将患者分为阳性组 和阴性组的预测、判定、检测或诊断的方法的精度的指标。在这些曲线中, 关于成为评价对象的方法所显示的结果,将从1减去在阳性患者中出现阳 性结果的概率(灵敏度)、和在阴性患者中出现阴性结果的概率(特异性)而得 的值(假阳性率)进行作图。
在本说明书中,“灵敏度”是指(真阳性的数量)/(真阳性的数量+假阴性 的数量)的值。如果灵敏度高,则胰癌的早期发现、胰良性肿瘤的发现成为 可能,关系到完整的患部切除、再发率降低。
在本说明书中,“特异度”是指(真阴性的数量)/(真阴性的数量+假阳性 的数量)。如果特异度高,则可以防止将健常体误判为早期胰癌患者或胰良 性肿瘤患者而导致的无用的追加检查的实施,关系到患者负担的减轻、医 疗费的削减。
以下,具体表示使用APOA2蛋白质变异体的测定值,通过使用了逻 辑回归分析的判别式,来解析受试者是否罹患胰肿瘤的方法。
2-2-1.使用逻辑回归分析的判别法
作为用于确定是否罹患胰肿瘤或评价罹患的可能性的分析法,可以使 用利用逻辑回归分析而获得判别式的方法。
首先,从临床信息,将全部受试者分为胰肿瘤患者和健常者2组,作 为目标变量将胰肿瘤患者设定为“1”、将健常者设定为“0”。接着,从由这 些具有临床信息的生物体样品获得的APOA2蛋白质的2种变异体的测定 值来设定判别式。对于判别式,可以作为逻辑回归式预先设定,该逻辑回 归式中,作为说明变量,包含APOA2-ATQ蛋白质的测定值和APOA2-AT蛋白质的测定值、和/或APOA2-AT蛋白质的测定值与APOA2-ATQ蛋白 质的测定值的积作为变量。作为逻辑回归式的判别式的妥当性,可以使用 属于最尤法(maximun likelihoodmethod,最大似然法)范畴的AIC值(赤池 信息量准则)或Schwarz的BIC值等指标来评价。
作为逻辑回归式,可以利用如数学式1、数学式2、数学式3那样,包 含APOA2-ATQ蛋白质的测定值、APOA2-AT蛋白质的测定值、 APOA2-AT蛋白质的测定值与APOA2-ATQ蛋白质的测定值的积作为说 明变量的式子。
数学式1:a x(APOA2-ATQ)+b x(APOA2-AT)+d
数学式2:a x(APOA2-ATQ)+b x(APOA2-AT)+c x(APOA2- ATQ)x(APOA2-AT)+d
数学式3:c x(APOA2-ATQ)x(APOA2-AT)+d
(在数学式1~3中,a、b、c、d是不为零的任意的实数,(APOA2-ATQ) 是APOA2-ATQ蛋白质的测定值,(APOA2-AT)是APOA2-AT蛋白质的测 定值。)
在作为逻辑回归式而获得判别式的情况下,将从受试者和健常者获得 的APOA2-ATQ蛋白质或APOA2-AT蛋白质的测定值输入前述逻辑回归 式中,比较所得的判别值,可以确定受试者罹患胰肿瘤。例如,在前述在 统计学上有显著性差异时的受试者的判别值为健常者的判别值的三分之二 以下的情况下、更优选为二分之一以下、进一步优选为四分之一以下的情 况下,可以确定受试者罹患胰肿瘤。
3.胰肿瘤检测用试剂盒
本发明的第三方式,是胰肿瘤检测用试剂盒。
在本说明书中,所谓“胰肿瘤检测用试剂盒”,是指为了评价是否罹患 胰肿瘤、罹患的程度或有无改善、改善的程度,或者为了筛选对预防、改 善或治疗胰肿瘤有用的候选物质,而直接或间接利用的工具。
对于本方式的试剂盒,作为其构成物,包含能够特异性识别且结合与 罹患胰肿瘤相关地在体液样品中、特别是血液、血清、血浆中表达发生变 动的APOA2蛋白质变异体,优选为序列号1和2所示的APOA2蛋白质 的2种变异体的物质。具体而言,例如,包含抗APOA2蛋白质末端抗体 等或其片段或它们的化学修饰衍生物。这些抗体也可以结合在如上所述的固相担载体上,此时,优选为可以结合在如上所述的检查用条上。另外, 可以含有例如,标记二级抗体,以及检测标记所需要的基质、担载体、洗 涤缓冲液、样品稀释液、酶底物、反应停止液、作为纯化的标准物质的 APOA2蛋白质、使用说明书等。
实施例
通过以下的实施例进行更具体地说明本发明。然而,本发明不受该实 施例限制。
(实施例1)特异性识别APOA2-ATQ蛋白质的C末端区域的单克隆抗 体(抗APOA2-ATQ末端单克隆抗体)的制作
(a)产生识别APOA2-ATQ蛋白质的C末端区域的抗体的细胞的制作
由作为APOA2-ATQ蛋白质的C末端区域的序列的序列号29所示的 氨基酸序列组成的肽对水显示难溶性,抗原性也低,因此合成了通过在N 末端侧添加了3个精氨酸残基来赋予亲水性,进一步在其N末端添加了半 胱氨酸残基的肽。接着,使用马来酰亚胺激活卵清蛋白 (Maleimide-Activated Ovalbumin,ピアス社制),使前述肽的半胱氨酸残 基与OVA蛋白质结合。将其作为免疫原,以免疫原为每只100μg的方式, 以2周为间隔对小鼠(BALB/c)进行腹腔内给予。从免疫首次开始至第4次 为止,向前述免疫原溶液中进一步混合Sigma佐剂体系(Sigma Adjuvant System,シグマ社制),进行给予。在第4次给予之后,通过ELISA法测 定小鼠的血清中的抗体效价。
用PBS溶液将前述免疫原调制为0.3μg/mL,然后,向免疫板 Maxisorp(NUNC社制)的孔中各加入100μL,固相化一晚。第二天,废弃 前述溶液,添加封闭缓冲液A溶液(0.5%BSA,0.05%TWEEN20, PBS)400μL,在室温下静置1小时。在废弃孔内的溶液之后,添加 PBS-T(0.05%TWEEN20,PBS)400μL进行洗涤,添加用封闭缓冲液A溶 液稀释的前述小鼠血清100μL,在室温下反应1小时。在废弃孔内的溶液 之后,利用PBS-T进行洗涤,然后,添加用封闭缓冲液A溶液稀释了5000 倍的多克隆兔抗小鼠免疫球蛋白/HRP(ダコ·ジャパン社制)100μL,在室 温下反应1小时。在利用PBS-T进行洗涤之后,添加TMB溶液(ピアス社 制)50μL来进行酶反应。然后,添加0.5N硫酸溶液50μL使反应停止,测 定450nm的吸光度。结果发现充分的抗体效价的上升,因此进一步对前述 小鼠给予前述免疫原溶液,作为最终免疫。然后,在从最终免疫之日起3 天后,从脾脏获取产生抗体的细胞。
(b)来自小鼠的产生抗体的细胞的回收和细胞融合
在RPMI1640培养基中,以1:10的比例将通过前述(a)而从小鼠获得 的产生抗体的细胞和SP2/0(小鼠骨髓瘤)细胞进行混合,在80%聚乙二醇 的存在下进行融合反应。接着,利用HAT培养基培养约1周,分选杂交 瘤。
(c)产生识别APOA2-ATQ蛋白质的C末端区域的抗体的杂交瘤的筛 选
接着,从由HAT培养基选择的杂交瘤中,以对重组型来自人的 APOA2-ATQ蛋白质或APOA2-AT蛋白质的结合活性的不同为指标,筛 选特异性识别APOA2-ATQ蛋白质的C末端区域的抗体。与前述(a)同样, 利用ELISA法进行筛选,结果,获取了克隆7F2和克隆6G2这2种杂交 瘤。编码单克隆抗体的基因的序列解析的结果表明,7F2的CDR序列是序 列号4~9所示的氨基酸序列,6G2的CDR序列是序列号10~15所示的氨 基酸序列。
(实施例2)通过使用了抗APOA2-ATQ末端单克隆抗体的ELISA法来 检测APOA2-ATQ蛋白质
使用由实施例1获取的抗APOA2-ATQ末端单克隆抗体7F2或6G2, 利用ELISA法来检测APOA2-ATQ蛋白质。将重组型来自人的 APOA2-ATQ蛋白质、APOA2-AT蛋白质或APOA2-A蛋白质用PBS溶液 调制成1μg/mL,然后,向免疫板Maxisorp的孔中各加入100μL,固相化 一晚。第二天,废弃前述溶液,添加封闭缓冲液A溶液400μL,在室温下 静置1小时。在废弃孔内的溶液之后,添加PBS-T 400μL进行洗涤,添加 100μL用稀释液(1%NP40,50mM Tris盐酸,150mM NaCl,1mM EDTA, 1%BSA,pH值8.0)稀释至0.2μg/mL的抗体7F2或6G2,在室温下反应2 小时。在废弃孔内的溶液之后,利用PBS-T进行洗涤,然后添加用稀释液 稀释了5000倍的多克隆兔抗小鼠免疫球蛋白/HRP 100μL,在室温下反应 1小时。在利用PBS-T进行洗涤之后,添加TMB溶液100μL进行酶反应。 然后,添加0.5N硫酸溶液100μL使反应停止,测定了450nm的吸光度。
将结果示于图1。确定了在本发明中获取的抗APOA2-ATQ末端单克 隆抗体克隆7F2和克隆6G2均特异性识别APOA2-ATQ蛋白质。
(实施例3)抗APOA2-ATQ末端单克隆抗体和抗APOA2-ATQ末端多 克隆抗体对APOA2-ATQ蛋白质的结合特异性的评价
对于由实施例1获取的抗APOA2-ATQ末端单克隆抗体克隆7F2、克 隆6G2、和使用前述“1-4.抗APOA2多克隆抗体的制作”(方法的细节记载 于“抗ペプチド抗体実験プロトコール(抗肽抗体实验方案)”,第2版,秀 润社)所记载的方法而获取的抗APOA2-ATQ末端多克隆抗体总计3种抗 体,评价对抗原的特异性。在本实验中,使用了克隆7F2、克隆6G2和抗APOA2-ATQ末端多克隆抗体的POD标记体。抗体的POD标记化使用 PEROXIDASE LABELINGKIT-SH(DOJINDO社制)来进行。
将重组型来自人的APOA2-ATQ蛋白质或APOA2-AT蛋白质用PBS 溶液调制为1μg/mL,然后,向免疫板Maxisorp的孔中各加入100μL,进 行2小时固相化。在用PBS-T洗涤后,添加封闭缓冲液B溶液(1%脱脂牛 奶、0.05%TWEEN20、PBS)400μL,在室温下静置1小时,废弃孔内的溶 液。接着,添加用稀释液稀释至0.5μg/mL的单克隆抗体7F2、6G2或抗 APOA2-ATQ末端多克隆抗体的POD标记体100μL,在室温下反应2小 时。进而,利用PBS-T进行洗涤,然后,添加TMB溶液100μL使其显色。 最后,添加0.5N硫酸溶液100μL来使反应停止,测定了450nm的吸光度。
图2(A)显示使各抗体在没有固相化蛋白质的孔(空白)、固相化了 APOA2-AT蛋白质的孔、固相化了APOA2-ATQ蛋白质的孔中反应时的 测定值。图2(B)是将从各抗体在固相化了APOA2-AT蛋白质的孔中的测 定值中减去空白而得的值作为对APOA2-AT蛋白质的结合活性值算出,将 从在固相化了APOA2-ATQ蛋白质的孔中的测定值中减去空白而得的值作为对APOA2-ATQ蛋白质的结合活性值算出,将对APOA2-ATQ蛋白质 的结合活性值乘以对APOA2-AT蛋白质的结合活性值而得的值作为抗 APOA2-ATQ末端抗体的结合特异性而显示的图。确定了与抗 APOA2-ATQ末端多克隆抗体相比,抗APOA2-ATQ末端单克隆抗体7F2、 6G2中的任一种,对APOA2-ATQ蛋白质的结合特异性均强。
(实施例4)通过使用抗APOA2-AT末端抗体的ELISA法来检测 APOA2-AT蛋白质
使用特异性识别APOA2-AT蛋白质的C末端区域的抗APOA2-AT末 端多克隆抗体,通过ELISA法来检测APOA2-AT蛋白质。
(a)抗APOA2-AT末端多克隆抗体的制作
抗APOA2-AT末端多克隆抗体使用前述“1-4.抗APOA2多克隆抗体的 制作”(方法的细节记载于“抗ペプチド抗体実験プロトコール((抗肽抗体 实验方案)”,第2版,秀润社)所记载的方法来获取。免疫原使用在序列号 28所示的表示APOA2-AT蛋白质的C末端区域的肽的N末端添加半胱氨 酸残基,进一步与作为载体蛋白质的KLH结合而得的产物。以1周为间隔对兔给予该免疫原。在第4次给予之后,与前述实施例1同样,利用 ELISA法测定兔血清中的抗体效价。其结果是,观察到充分的抗体效价的 上升,因此在从最终免疫之日起1周后回收抗血清。
将使前述肽结合在Formyl Cellufine担载体上所得的产物作为亲和柱 使用,来进行前述抗血清的纯化。具体而言,使纯化后的抗血清通过将前 述肽的C末端酰胺化而得的产物结合在Cellufine Formyl担载体上而成的 亲和柱,吸附除去对肽的除了C末端区域以外的区域显示结合性的免疫球 蛋白。最终,获取该非吸附级分作为抗APOA2-AT末端多克隆抗体。
(b)使用ELISA法的APOA2-AT蛋白质的检测
将重组型来自人的、APOA2-AT蛋白质、APOA2-ATQ蛋白质或 APOA2-A蛋白质用PBS溶液调制为1μg/mL,然后,向免疫板Maxisorp 的孔中各加入100μL,固相化一晚。第二天,废弃前述溶液,添加封闭缓 冲液A溶液400μL,在室温下静置1小时。在废弃孔内的溶液之后,添加 400μL的PBS-T进行洗涤,添加用稀释液稀释至0.2μg/mL的上述抗 APOA2-AT末端多克隆抗体100μL,在室温下反应2小时。在废弃孔内的 溶液之后,利用PBS-T进行洗涤,然后,添加用稀释液稀释了10000倍的 驴抗兔IgG的HRP标记的F(ab’)2片段(Anti-Rabbit IgG,HRP-Linked F(ab’)2Fragment Donkey,GEヘルスケア社制)100μL,在室温下反应1 小时。在利用PBS-T进行洗涤之后,添加TMB溶液100μL来进行酶反应。 然后,添加0.5N硫酸溶液100μL使反应停止,测定了450nm的吸光度。
将结果示于图3。确定了在本发明中获取的抗体仅特异性识别APOA2 蛋白质变异体中的APOA2-AT蛋白质。
(实施例5)通过使用抗APOA2蛋白质非末端抗体的ELISA法来检测 APOA2蛋白质
使用前述实施例1记载的方法,制作识别APOA2蛋白质的除了C末 端区域以外的氨基酸序列的抗体。
在杂交瘤的筛选中,以对APOA2蛋白质非末端区域具有结合活性为 指标,进行抗体的筛选。筛选的结果获取了产生克隆MAB1和克隆MAB2 的2种抗APOA2蛋白质非末端单克隆抗体的杂交瘤。此外,编码该单克 隆抗体的基因的序列解析的结果表明,MAB1的CDR序列是序列号16~21 所示的氨基酸序列,MAB2的CDR序列是序列号22~27所示的氨基酸序 列。
使用前述抗APOA2蛋白质非末端单克隆抗体MAB1或MAB2,通过 ELISA法检测APOA2蛋白质变异体。将重组型来自人的、APOA2-AT蛋 白质、APOA2-ATQ蛋白质或APOA2-A蛋白质用PBS溶液调制为 1μg/mL,然后,向免疫板Maxisorp的孔中各加入100μL,固相化一晚。 第二天,废弃前述溶液,添加封闭缓冲液A溶液400μL,在室温下静置1 小时。在废弃孔内的溶液之后,添加400μL的PBS-T进行洗涤,添加用封 闭缓冲液A稀释至0.5μg/mL的抗体100μL,在室温下反应1小时。在废 弃孔内的溶液之后,利用PBS-T进行洗涤,然后,添加用封闭缓冲液A稀 释了5000倍的驴抗小鼠IgG的HRP标记的F(ab’)2片段(Anti-Mouse IgG, HRP-Linked F(ab’)2Fragment Donkey,GEヘルスケア社制)100μL,在室 温下反应1小时。在利用PBS-T进行洗涤之后,添加TMB溶液100μL进 行酶反应。然后,添加0.5N硫酸溶液100μL使反应停止,测定了450nm 的吸光度。
图4(A)和(B)显示通过分别使用了MAB1抗体和MAB2抗体的ELISA 法测定APOA2蛋白质变异体的测定结果。从本发明所获取的单克隆抗体 MAB1、MAB2中对APOA2蛋白质变异体的结合活性均为同程度确定了, 它们是识别除了C末端区域以外的氨基酸序列的抗APOA2蛋白质非末端 抗体。
(比较例1)使用了质量分析法的血中APOA2蛋白质二聚体 (APOA2-ATQ/AT)的检测
在国立癌症中心中央医院,获得知情同意书,从由胰癌患者和健常者 各40名采集的血浆,按照日本特许第5200246号公报所记载的与实验1 同样的方法,使用SELDI-QqTOF-MS(surface-enhanced laser desorption/ionization high-resolution performancehybrid quadrupole time of flight mass spectrometry,表面增强激光解吸/离子化高分辨率混合四级 杆飞行时间质谱)法,测定具有17252(m/z)的质量的肽峰的离子强度。
图5显示进行健常者和胰癌患者的判别的结果。本方法显示AUC值 =0.894,确定了具有高的胰癌判别精度。
(比较例2)使用了夹心ELISA法的血中APOA2蛋白质二聚体 (APOA2-ATQ/AT)的检测
以与前述比较例1同样的血浆为对象,尝试通过使用了特异性识别 APOA2-ATQ蛋白质的C末端区域的前述抗APOA2-ATQ末端单克隆抗 体7F2和特异性识别APOA2-AT蛋白质的C末端区域的前述抗 APOA2-AT末端多克隆抗体的POD标记体的夹心ELISA法,检测APOA2蛋白质二聚体(APOA2-ATQ/AT)。
抗APOA2-ATQ末端单克隆抗体的POD标记化使用PEROXIDASE LABELING KIT-SH进行,细节按照附带的方案。将抗APOA2-AT末端 多克隆抗体用PBS溶液调制为5μg/mL,然后向免疫板Maxisorp的孔中各 加入100μL,固相化一晚。第二天,废弃前述溶液,添加400μL的PBS-T 进行洗涤,添加封闭缓冲液C溶液(1%BSA、0.05%TWEEN20、 PBS)400μL,在室温下静置1小时。废弃前述溶液,制成抗体固相化板。 接着,向各孔添加各100μL用稀释液稀释了16倍的血浆,在室温下反应1 小时。在废弃孔内的溶液之后,利用PBS-T进行洗涤,添加用稀释液稀释 至0.4μg/mL的抗APOA2-ATQ末端单克隆抗体的POD标记体100μL,在 室温下反应1小时。利用PBS-T进行洗涤,然后,添加TMB溶液100μL 进行酶反应。然后,添加0.5N硫酸溶液100μL使反应停止,测定了450nm 的吸光度。
图6显示进行健常者和胰癌患者的判别的结果。本方法显示AUC值 =0.529,没有得到与前述比较例1的质量分析法同等的胰癌判别精度。本 结果显示,APOA2-ATQ/AT蛋白质二聚体的2个C末端区域互相接近, 因而由于空间位阻,抗APOA2-AT末端多克隆抗体和抗APOA2-ATQ末 端单克隆抗体不能同时结合的可能性。
(比较例3)使用了夹心ELISA法的血中APOA2-ATQ蛋白质的检测
以与前述比较例1同样的血浆为对象,通过使用了前述抗 APOA2-ATQ末端单克隆抗体7F2的POD标记体、和识别APOA2蛋白 质的除了C末端区域以外的部位的抗APOA2蛋白质非末端多克隆抗体 (FITZGERALD社)的夹心ELISA法,进行了APOA2-ATQ蛋白质的测定。
抗体7F2的POD标记化与前述比较例2同样地进行。将抗APOA2 蛋白质非末端多克隆抗体用PBS溶液调制为2μg/mL,然后,向免疫板 Maxisorp的孔中各加入100μL,固相化一晚。第二天,废弃前述溶液,添 加400μL的PBS-T进行洗涤,添加封闭缓冲液C溶液400μL,在室温下 静置1小时。然后,废弃前述溶液,制成抗体固相化板。接着,向各孔中 添加各100μL的用稀释液稀释了10000倍的血浆,在室温下反应1小时。 废弃孔内的抗原溶液,然后,利用PBS-T进行洗涤,添加用稀释液稀释至 0.2μg/mL的抗体7F2的POD标记体100μL,在室温下反应1小时。利用 PBS-T进行洗涤,然后,添加TMB溶液100μL进行酶反应,添加0.5N硫 酸溶液100μL使反应停止,测定了450nm的吸光度。
图7显示进行健常者和胰癌患者的判别的结果。本方法显示AUC值 =0.515,没有获得优异的胰癌判别精度。
(比较例4)使用了夹心ELISA法的血中APOA2-AT蛋白质的检测
以与前述比较例1同样的血浆为对象,通过使用了前述抗APOA2-AT 末端多克隆抗体和前述抗APOA2蛋白质非末端多克隆抗体的POD标记体 的夹心ELISA法,进行APOA2-AT蛋白质的测定。关于抗APOA2蛋白 质非末端多克隆抗体的POD标记化和夹心ELISA,与前述比较例3同样 地进行。血浆的稀释倍率为6000倍。
图8显示进行健常者和胰癌患者的判别的结果。本方法显示AUC值 =0.814,确定了虽然与前述比较例1的质量分析法相比判别性能差,但是 具有高的胰癌判别精度。
(实施例6)基于2种血中APOA2蛋白质(APOA2-ATQ蛋白质和 APOA2-AT蛋白质)的测定值的组合的胰癌的判别
图9显示将由前述比较例3和比较例4获得的APOA2-ATQ蛋白质与 APOA2-AT蛋白质的测定值的积作图,进行健常者和胰癌患者的判别的结 果。本方法显示AUC值=0.906,确定了与前述比较例1的质量分析法相比 优异,显示高的胰癌判别精度。
(实施例7)使用了夹心ELISA法的胰癌的判别
在国立癌症中心中央医院,获得知情同意书,以从胰癌患者244名和 健常者109名中采集的血浆为对象,按照前述实施例6的方法,测定2种 血中APOA2蛋白质变异体(APOA2-ATQ蛋白质和APOA2-AT蛋白质)。 进而,以重组型来自人的蛋白质APOA2-ATQ蛋白质和APOA2-AT蛋白 质的抗原溶液为标准品,算出血浆中的前述2种蛋白质浓度。
图10表示将各血浆中的2种蛋白质作图而成的散点图。显示使用前述 2种蛋白质,能够以高精度判别胰癌患者和健常者。
(实施例8)通过测定值的数据解析算法处理来判别胰癌
通过由前述实施例7获得的测定值的统计解析处理,能够获得胰癌判 别精度高的判别式。进行以下的统计处理,与使用了与前述比较例1同样 的质量分析法的胰癌判别法进行比较。
(a)使用逻辑回归分析的胰癌的判别
作为目标变量,将胰癌患者定义为“1”、健常者定义为“0”,将由前述 (1)获得的2种APOA2蛋白质变异体(APOA2-ATQ蛋白质和APOA2-AT 蛋白质)的血中浓度作为说明变量,进行逻辑回归分析,算出判别式。表1 显示所得判别式中的AUC值、病例数据的判别成绩(灵敏度、特异度)的计 算结果。其中,在与前述实施例6同样地构建了以2种蛋白质的浓度(APOA2-ATQ蛋白质和APOA2-AT蛋白质)的积作为说明变量的判别式的 情况下,早期的胰癌(I期)的判别性能良好。使用将APOA2-ATQ蛋白质 和APOA2-AT蛋白质的各样本的测定值输入该判别式而获得的判别值,来 判别健常者和胰癌患者(I期和II期),将此时的ROC曲线示于图11(A)。 图11(B)是使用通过前述质量分析法测定的APOA2-ATQ/AT蛋白质二聚 体的量来判别健常者和胰癌患者时的ROC曲线。此外,表2显示在胰癌 的各期中的判别性能的比较结果。在表2中,胰癌的期按照UICC的分期, I期是指UICC分期中的IA、IB,II期是指UICC分期中的IIA、IIB。在 表2中,“ELISA法”显示使用了以通过ELISA法获得的2种蛋白质(APOA2-ATQ蛋白质和APOA2-AT蛋白质)的量的积作为说明变量的判别 式时的解析结果,“质量分析法”显示使用了通过质量分析法获得的APOA2 蛋白质二聚体(APOA2-ATQ/AT)的量时的解析结果。确认了与前述质量分 析法相比,本方法能够以极高的灵敏度检测早期胰癌。
表1
AT、ATQ表示ELISA测定中的APOA2-AT蛋白质、APOA2-ATQ蛋白质的测定值,AT×ATQ表示 前述测定值的积。
表2
(实施例9)通过测定值的数据解析算法处理来判别胰良性肿瘤
通过APOA2来进行健常者和各种胰良性肿瘤患者的判别,与CA19-9 的判别性能进行比较。
在利用APOA2的判别中,使用了与前述实施例8中用于健常者和胰 癌患者的判别时同样的判别式(APOA2-ATQ蛋白质与APOA2-AT蛋白质 的量的积)。关于利用APOA2的判别性能,通过与表1中计算判别成绩(灵 敏度、特异度)时同样的方法来计算。
通过免疫学方法测定了受试者的体液样品中的CA19-9的量。通常, 利用CA19-9来进行健常者和胰癌患者的判别时,判别的基准值为 37(U/mL),将CA19-9的量为基准值以下的情况判别为健常者,将CA19-9 的量超过基准值的情况判别为胰癌患者(臨床検査データブック(临床检查 数据书)2013-2014,高久史麿监修,医学书院,p.636-637)。在本实施例中, 为了验证能否以前述基准值为基础,利用CA19-9来判别胰良性肿瘤患者 和健常者,在CA19-9的量超过前述基准值的情况下,判别为胰良性肿瘤 患者。
将利用APOA2来判别健常者和胰良性肿瘤患者时的ROC曲线示于图 12(A)。将利用CA19-9来判别健常者和胰良性肿瘤患者时的ROC曲线示 于图12(B)。此外,表3显示各胰良性肿瘤的判别性能的比较结果。确认了 本发明的使用APOA2的判别方法能够以极高的灵敏度检测胰良性肿瘤。 另一方面,在使用CA19-9的情况下,灵敏度几乎等于0,判明了检测胰良 性肿瘤是困难的。
表3
(实施例10)组合APOA2和CA19-9的胰癌和胰良性肿瘤的判别
进行了组合APOA2和CA19-9的胰癌和胰良性肿瘤的判别。首先, 使用前述实施例8和9记载的方法,利用APOA2来检测胰良性肿瘤、早 期胰癌(I期、II期)和胰癌(全期),将被检测出任一项的罹患者的人数作为 APOA2的阳性数计算。接着,对于APOA2阳性的患者,使用前述实施例 9所记载的方法通过CA19-9进行判别,作为超过CA19-9的基准值的数量 计算CA19-9的阳性数。进而,计算CA19-9阳性数占APOA2阳性数的比 例。将这些结果示于表4。
根据本方法,确认了能够将APOA2阳性且CA19-9阳性的患者确定 为罹患胰癌,将APOA2阳性且CA19-9阴性的患者确定为罹患胰良性肿 瘤的概率高。即,显示了根据本发明的方法,能够通过组合APOA2和 CA19-9,区别判别胰癌的罹患和胰良性肿瘤的罹患。
表4
*显示CA19-9阳性患者占APOA2阳性患者的数量。
(实施例11)组合APOA2和DU-PAN-2的胰癌和胰良性肿瘤的判别
进行了组合APOA2和DU-PAN-2的胰癌和胰良性肿瘤的判别。使用 DU-PAN-2来代替CA19-9,与前述实施例10记载的方法同样操作来进行 判别。受试体的体液样品中的DU-PAN-2的量通过免疫学方法测定。通常, 利用DU-PAN-2进行健常者和胰癌患者的判别时,判别的基准值为 150(U/mL),将DU-PAN-2的量为基准值以下的情况判别为健常者,将 DU-PAN-2的量超过基准值的情况判别为胰癌患者(臨床検査データブッ ク(临床检查数据书)2013-2014,高久史麿监修,医学书院,p.637-638)。 在本实施例中,对于DU-PAN-2,使用该基准值进行判别。将其结果示于 表5。
表5
*显示DU-PAN-2阳性患者占APOA2阳性患者的数量。
根据本方法,确认了能够将APOA2阳性且DU-PAN-2阳性的患者确 定为罹患胰癌,将APOA2阳性且DU-PAN-2阴性的患者确定为罹患胰良 性肿瘤的概率高。即,显示了根据本发明的方法,能够通过组合APOA2 和DU-PAN-2,区别判别胰癌的罹患和胰良性肿瘤的罹患。
以上,由实施例7~11的结果判明了,本发明通过对于APOA2的变异 体的测定值进行使用判别式的解析,在迄今为止困难的包含早期胰癌(I期、 II期)的胰癌或胰良性肿瘤的高灵敏度检测上是有用的。此外判明了,本发 明通过对于前述检测结果进行组合胰癌标志物(CA19-9或DU-PAN-2)的解 析,在使以往不可能的胰癌和胰良性肿瘤的高精度判别成为可能方面是有 用的。
产业上的可利用性
根据本发明,能够利用简易且非侵袭的方法高通量地检测胰肿瘤,使 得胰肿瘤的早期发现成为可能。
本说明书中引用的所有出版物、专利以及专利申请作为直接参考而纳 入本说明书。
Claims (12)
1.胰癌或胰良性肿瘤的检测用试剂盒,其包含
与APOA2-ATQ蛋白质的C末端区域特异性结合的抗APOA2-ATQ末端抗体、和与除了该C末端区域以外的氨基酸序列结合的抗APOA2-ATQ非末端抗体,所述APOA2-ATQ蛋白质由序列号1所示的氨基酸序列组成,
与APOA2-AT蛋白质的C末端区域特异性结合的抗APOA2-AT末端抗体、和与除了该C末端区域以外的氨基酸序列结合的抗APOA2-AT非末端抗体,所述APOA2-AT蛋白质由序列号2所示的氨基酸序列组成,和
记载了测定受试体的体液样品中APOA2蛋白质变异体的量来检测胰癌或胰良性肿瘤的方法的使用说明书,所述方法包括:
(A)第1工序,使用与APOA2-ATQ蛋白质的C末端区域特异性结合的抗APOA2-ATQ末端抗体、和与除了该C末端区域以外的氨基酸序列结合的抗APOA2-ATQ非末端抗体,来测定样品中的APOA2-ATQ蛋白质的量,所述APOA2-ATQ蛋白质由序列号1所示的氨基酸序列组成,
(B)第2工序,使用与APOA2-AT蛋白质的C末端区域特异性结合的抗APOA2-AT末端抗体、和与除了该C末端区域以外的氨基酸序列结合的抗APOA2-AT非末端抗体,来测定样品中的APOA2-AT蛋白质的量,所述APOA2-AT蛋白质由序列号2所示的氨基酸序列组成,
(C)第3工序,将由第1工序获得的APOA2-ATQ蛋白质的量的测定值和由第2工序获得的APOA2-AT蛋白质的量的测定值输入预先设定的判别式而获得受试体的判别值,在该受试体的判别值与健常体的判别值相比在统计学上有显著性差异时,确定受试体罹患胰癌或胰良性肿瘤。
2.根据权利要求1所述的胰癌或胰良性肿瘤的检测用试剂盒,其中APOA2-ATQ蛋白质和APOA2-AT蛋白质的所述C末端区域分别由包含6个以上连续氨基酸的序列组成,所述6个以上连续氨基酸包含C末端在内。
3.根据权利要求1或2所述的胰癌或胰良性肿瘤的检测用试剂盒,所述判别式是选自逻辑回归式、利用支持向量机的解析制作的判别式、利用神经网络的解析制作的判别式以及利用判别分析的解析制作的判别式中的任一种。
4.根据权利要求3所述的胰癌或胰良性肿瘤的检测用试剂盒,所述逻辑回归式包含APOA2-ATQ蛋白质的所述测定值、和/或APOA2-AT蛋白质的所述测定值、和/或APOA2-ATQ蛋白质的所述测定值与APOA2-AT蛋白质的所述测定值的积作为变量。
5.根据权利要求4所述的胰癌或胰良性肿瘤的检测用试剂盒,由所述逻辑回归式获得的受试体的判别值是健常体的判别值的三分之二以下。
6.根据权利要求1~5中任一项所述的胰癌或胰良性肿瘤的检测用试剂盒,还包括第4工序:对于在所述第3工序中已确定罹患胰癌或胰良性肿瘤的受试体,测定该受试体的体液样品中的胰癌标志物CA19-9或DU-PAN-2的量,在其测定值超过规定基准值的情况下,确定该受试体罹患胰癌;在其测定值为该基准值以下的情况下,确定该受试体罹患胰良性肿瘤。
7.根据权利要求1~6中任一项所述的胰癌或胰良性肿瘤的检测用试剂盒,所述体液样品是血液、血浆或血清。
8.根据权利要求1~7中任一项所述的胰癌或胰良性肿瘤的检测用试剂盒,所述胰癌是早期胰癌。
9.根据权利要求1~8中任一项所述的胰癌或胰良性肿瘤的检测用试剂盒,其中与由序列号1所示的氨基酸序列组成的APOA2-ATQ蛋白质的C末端区域特异性结合的抗APOA2-ATQ末端抗体是单克隆抗体或其片段,该单克隆抗体或其片段的重链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号4、5和6所示的氨基酸序列组成,且轻链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号7、8和9所示的氨基酸序列组成。
10.根据权利要求1~8中任一项所述的胰癌或胰良性肿瘤的检测用试剂盒,其中与由序列号1所示的氨基酸序列组成的APOA2-ATQ蛋白质的C末端区域特异性结合的抗APOA2-ATQ末端抗体是单克隆抗体或其片段,该单克隆抗体或其片段的重链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号10、11和12所示的氨基酸序列组成,且轻链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号13、14和15所示的氨基酸序列组成。
11.根据权利要求1~8中任一项所述的胰癌或胰良性肿瘤的检测用试剂盒,其中权利要求1所述的抗APOA2-ATQ非末端抗体或抗APOA2-AT非末端抗体是识别APOA2蛋白质的除C末端区域以外的氨基酸序列的抗APOA2蛋白质非末端抗体,是单克隆抗体或其片段,所述APOA2蛋白质由序列号1~3中任一项所示的氨基酸序列组成,
该单克隆抗体或其片段的重链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号16、17和18所示的氨基酸序列组成,且
轻链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号19、20和21所示的氨基酸序列组成。
12.根据权利要求1~8中任一项所述的胰癌或胰良性肿瘤的检测用试剂盒,其中权利要求1所述的抗APOA2-ATQ非末端抗体或抗APOA2-AT非末端抗体是识别APOA2蛋白质的除C末端区域以外的氨基酸序列的抗APOA2蛋白质非末端抗体,是单克隆抗体或其片段,所述APOA2蛋白质由序列号1~3中任一项所示的氨基酸序列组成,
该单克隆抗体或其片段的重链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号22、23和24所示的氨基酸序列组成,且
轻链的CDR1、CDR2和CDR3分别由序列号25、26和27所示的氨基酸序列组成。
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