WO2019131552A1 - 膵がん等のがんの判定用バイオマーカー - Google Patents

膵がん等のがんの判定用バイオマーカー Download PDF

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WO2019131552A1
WO2019131552A1 PCT/JP2018/047362 JP2018047362W WO2019131552A1 WO 2019131552 A1 WO2019131552 A1 WO 2019131552A1 JP 2018047362 W JP2018047362 W JP 2018047362W WO 2019131552 A1 WO2019131552 A1 WO 2019131552A1
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cancer
group
substance
subject
concentration
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PCT/JP2018/047362
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English (en)
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Inventor
純男 大槻
伊藤　慎悟
Original Assignee
国立大学法人熊本大学
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention also refers to one or more cancers selected from the group consisting of pancreatic cancer, gastric cancer, colon cancer, duodenal cancer and cholangiocarcinoma (hereinafter also referred to as "cancer in the present invention” Step of measuring the concentration of one or more substances selected from a specific substance group in the blood sample for judgment collected from the subject (a) And a biomarker for the determination of the presence or absence of the aforementioned cancer comprising the aforementioned specific substance group.
  • cancer in the present invention Step of measuring the concentration of one or more substances selected from a specific substance group in the blood sample for judgment collected from the subject (a) And a biomarker for the determination of the presence or absence of the aforementioned cancer comprising the aforementioned specific substance group.
  • Cancer accounts for a high proportion of causes of death, and the situation is long lasting. Although various anticancer agents have been developed so far and more effective anti-cancer agents such as immune checkpoint inhibitors have been put to practical use, the degree of anti-cancer effect to be obtained There are also large differences among individuals and types of cancer, and cancer continues to be a threat to civilization. However, if cancer can be detected early, starting treatment early can greatly reduce the mortality rate from cancer. Therefore, development of more accurate or more various cancer determination / diagnosis methods, in particular, an early cancer determination / diagnosis method is in progress.
  • pancreatic cancer is one of intractable cancers, and no effective treatment other than surgical operation has been established.
  • Pancreas is located at the back of the stomach, that is, deep in the body as one of the main factors that pancreatic cancer is intractable cancer, and symptoms are difficult to appear even if cancer occurs, and early detection Can be said to be very difficult.
  • the 5-year survival rate of pancreatic cancer is extremely poor, about 9%, the 5-year survival rate of early-stage pancreatic cancer (stage I) is relatively good, 41%.
  • stage I early-stage pancreatic cancer
  • early detection and early treatment are particularly important in pancreatic cancer, and if pancreatic cancer can be detected earlier than now, the 5-year survival rate of patients with pancreatic cancer is significantly or dramatically improved. Can be expected to improve.
  • the serum tumor marker CA19-9 can be used as a diagnostic method for pancreatic cancer.
  • helical CT, magnetic resonance imaging (MRI), endoscopic ultrasonography (EUS), etc. are used in the diagnosis of pancreatic cancer.
  • none of these diagnostic methods is sufficient as a diagnostic method for pancreatic cancer, and in particular, it is completely insufficient as a diagnostic method for early pancreatic cancer.
  • Patent Document 1 discloses a step of administering a radionuclide-labeled c (RGDfK) peptide to a mammal, and detecting the radionuclide in the pancreas of a mammal after administration
  • RGDfK radionuclide-labeled c
  • a method of detecting early stage pancreatic cancer comprising the steps of
  • this method requires careful handling of radionuclide-labeled peptides and is not highly practical.
  • the present inventors have previously found that biomarkers present in plasma, insulin-like growth factor-binding protein (IGFBP) 2 and IGFBP 3 are useful for early detection of pancreatic cancer. (Non-Patent Document 1).
  • IGFBP insulin-like growth factor-binding protein
  • one or more substances selected from the specific substance group of the present invention are selected from the group consisting of pancreatic cancer, gastric cancer, colon cancer, duodenal cancer and cholangiocarcinoma. It has not been known until now that it is a biomarker that can determine the presence or absence or risk of developing cancer of a species or more, in particular, a biomarker that can determine the presence or risk of developing pancreatic cancer at an early stage.
  • the subject of the present invention is one or more cancers (preferably pancreatic cancer, preferably early stage) selected from the group consisting of pancreatic cancer, gastric cancer, colon cancer, duodenal cancer and cholangiocarcinoma It is an object of the present invention to provide a determination method capable of accurately determining the presence or absence or risk of onset of pancreatic cancer, a biomarker for determination, and the like.
  • cancers preferably pancreatic cancer, preferably early stage
  • the inventors of the present invention have a patient with early pancreatic cancer (early pancreatic cancer group), a patient with gastric cancer, a patient with colorectal cancer, a patient with duodenal cancer, and bile duct cancer.
  • pancreatic cancer including early pancreatic cancer, gastric cancer, colorectal cancer, duodenal cancer, bile duct It has been found that the present invention is a biomarker that can accurately determine the presence or absence of cancer and the onset risk, and has completed the present invention.
  • the present inventors are partial markers of the APOA4 peptide, which are biomarkers for discriminating pancreatic cancer from other cancers (that is, cholangiocarcinoma, colon cancer, duodenal cancer, and gastric cancer). Above all, they have found that they are biomarkers capable of discriminating between pancreatic cancer, stomach cancer, hepatocellular carcinoma and esophagus cancer with higher accuracy, and have completed the present invention.
  • a method for determining the presence or absence or risk of developing one or more cancers selected from the group consisting of pancreatic cancer, gastric cancer, colon cancer, duodenal cancer and cholangiocarcinoma includes the following steps (a) to (c): (A) measuring the concentration of one or more substances selected from the substance groups described in the following [A group] and [B group] in the blood sample for determination collected from the subject Process; [A group] APOA4 partial peptide, APOA1 partial peptide, TTHY partial peptide, Q5 VY30 partial peptide, H0YAC1 partial peptide, BTD partial peptide, APOA4, APOA1, TTHY, Q5 VY30, H0YAC1, BTD [B group] Partial peptide of ITIH3, ITIH3 (B) comparing the concentration of the substance measured in step (a) with the concentration of the substance in a control healthy blood sample;
  • Determination method described (4) The method according to any one of the above (1) to (3), wherein the partial peptide is a peptide digested with a protease. (5) The determination method according to any one of the above (2) to (4), wherein the multivariate analysis is logistic regression analysis or multiple regression analysis.
  • step (a) further contains the CA19-9 antigen
  • the substance whose concentration is to be measured in step (a) is two or more substances selected from the substance groups described in [group A] and [group B], and containing at least the CA19-9 antigen
  • the determination method according to any one of the above (1) to (6), wherein the concentration of the substance in the step (a) is measured by mass spectrometry.
  • the substance at least contains a partial peptide of APOA4 or a partial peptide of APOA1,
  • the determination method is such that the concentration of the partial peptide of APOA4 or partial peptide of APOA1 measured in step (a) is lower than the concentration of partial peptide of APOA4 or partial peptide of APOA1 in the control healthy blood sample
  • the method further includes the step (d) of evaluating that the subject is likely to have pancreatic cancer or that the subject is at high risk of developing pancreatic cancer.
  • the determination method according to any one of 1) to (7).
  • (9) The method according to any one of the above (1) to (8), wherein the cancer or pancreatic cancer is early-stage pancreatic cancer.
  • (10) It is characterized by being composed of one or more substances selected from the substance groups described in the following [group A] and [group B], It is a biomarker for determining the presence or absence or risk of developing one or more types of cancer selected from the group consisting of pancreatic cancer, gastric cancer, colon cancer, duodenal cancer and bile duct cancer,
  • the substance is a substance of [group A]
  • the concentration of the substance in the blood sample for determination collected from the subject is lower than the concentration of the substance in a control healthy person, the test It is shown that a person is likely to have the one or more cancers or that the subject is at high risk of developing the cancer.
  • the test When the substance is a substance of [group B], when the concentration of the substance in the blood sample for determination collected from the subject is higher than the concentration of the substance in a control healthy person, the test The biomarker for the determination, wherein the person is likely to have the one or more types of cancer or is shown to be at high risk of developing the cancer in the subject.
  • the substance is one or more selected from the group consisting of partial peptides of APOA4, partial peptides of APOA1, partial peptides of ITIH3, APOA4, APOA1 and ITIH3. Biomarker.
  • the substance at least contains a partial peptide of APOA4 or a partial peptide of APOA1,
  • concentration of the partial peptide of APOA4 or partial peptide of APOA1 in the blood sample for determination collected from the subject is lower than the concentration of partial peptide of APOA4 or partial peptide of APOA1 in the control healthy blood sample
  • Biomarker for judgment (13) The biomarker for determination according to any one of the above (10) to (12), wherein the cancer or pancreatic cancer is early-stage pancreatic cancer.
  • It is a diagnostic method for the presence or absence or risk of development of one or more cancers (preferably pancreatic cancer) selected from the group consisting of pancreatic cancer, gastric cancer, colon cancer, duodenal cancer and bile duct cancer.
  • the diagnostic method comprising the steps (a) to (c) (preferably the steps (a) to (d)); It is a diagnostic method for the presence or absence or risk of development of one or more cancers (preferably pancreatic cancer) selected from the group consisting of pancreatic cancer, gastric cancer, colon cancer, duodenal cancer and bile duct cancer.
  • the step (a) to (c) (preferably, the step (a) to (d)) is included, and in the step (c), it is evaluated (diagnosed) that the possibility of having cancer is high.
  • a test evaluated (diagnosed) as having a high possibility of having pancreatic cancer in the step (p) or step (d) of administering a therapeutic agent for cancer to a subject who has The above diagnostic method optionally comprising the step (q) of administering a therapeutic agent for pancreatic cancer to a subject;
  • a method of collecting data comprising the steps (a) to (c) (preferably the steps (a) to (d)); Determination of the presence or absence or risk of developing one or more cancers (preferably pancreatic cancer) selected from the group consisting of pancreatic cancer, gas
  • the substance is a substance of [group B]
  • concentration of the substance in the blood sample for determination collected from the subject is higher than the concentration of the substance in a control healthy person
  • the test It is shown that a person is likely to have the one or more cancers or that the subject is at high risk of developing the cancer.
  • the concentration of the partial peptide of APOA4 or partial peptide of APOA1 in the blood sample for determination collected from the subject is lower than the concentration of partial peptide of APOA4 or partial peptide of APOA1 in the control healthy blood sample
  • Said substance when the degree is greater, said subject is likely to have pancreatic cancer or is shown to be at increased risk of developing pancreatic cancer in said subject; Can be mentioned.
  • At least one cancer selected from the group consisting of pancreatic cancer, gastric cancer, colon cancer, duodenal cancer and cholangiocarcinoma preferably pancreatic cancer, preferably early pancreatic cancer
  • a determination method capable of accurately determining the presence or absence or risk of onset of cancer, a biomarker for determination, and the like can be provided.
  • pancreatic cancer can be detected at an early stage, treatment at an early stage becomes possible, and a five-year survival rate can be expected to be significantly improved as compared to a case where it is detected after progress.
  • ITIH3 peptide EHLVQ ATPENLQEAR [SEQ ID NO: 2]) (FIG. 1A), APOA1 peptide (THLAPYSSDLR [SEQ ID NO: 5]) (FIG. 1 B) in plasma in healthy group (66 cases) and early pancreatic cancer group (59 cases)
  • concentration of and APOA4 peptide LLPHANEVSQK [sequence number 12]
  • FIG. 1C The black circles in the figure indicate the results of individual subjects.
  • the longest horizontal bar in the figure shows the median, and the horizontal bars above and below it show quartiles (25%, 75%).
  • FIG. 2A shows the above three peptides in plasma in three groups (healthy group (66 cases), early pancreatic cancer group (59 cases), and prepancreatic cancer lesion / chronic pancreatitis group (30 cases)). Based on the quantitative results of, using the multiple logistic regression analysis to set the prediction formula (Formula (1)), the probability of occurrence of early pancreatic cancer or prepancreatic cancer lesions and chronic pancreatitis (see the vertical axis in the figure) It is a figure which shows the result of having estimated.
  • FIG. 2B shows the prediction equation (equation (2)) using multiple logistic regression analysis combining the measurement results of CA 19-9 concentration in addition to the quantification results of the above three kinds of peptides in plasma in the above three kinds of groups.
  • FIG. 1 It is a figure which shows the result of having set up and having predicted the occurrence probability (refer to the vertical axis
  • Black circles or gray circles in the figure indicate the results of individual subjects.
  • the longest horizontal bar in the figure shows the median, and the horizontal bars above and below it show quartiles (25%, 75%).
  • FIG. 3A shows five groups (healthy group (44 cases), stage I pancreatic cancer group (4 cases), stage II pancreatic cancer group (19 cases), stage III pancreatic cancer group (26 cases), and Based on the quantitative results of the above three peptides in plasma in the stage IV pancreatic cancer group (51 cases), the pancreas of each stage is obtained using the formula (1) set by multiple logistic regression analysis in FIG. 2A. It is a figure which shows the result of having predicted the occurrence probability (refer the vertical axis
  • FIG. 3B is calculated using the equation (2) in FIG.
  • FIG. 4B shows various cancers, benign tumors, and the like using the formula (2) in which the measured value of the CA19-9 concentration is also combined with the quantified results of the above three types of peptides in plasma in the above 11 types of groups. Or it is a figure which shows the result of having estimated the occurrence probability (refer the vertical axis
  • FIG. 6 shows the formula (1) based on the results of quantification of the above three types of peptides in plasma in two types of groups (45 healthy groups) and in stage III and IV pancreatic cancer (43 cases).
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of predicting the occurrence probability (refer to the vertical axis in the figure) of stage III or IV pancreatic cancer using. The black circles in the figure indicate the results of individual subjects. The longest horizontal bar in the figure indicates the median of the group, and the horizontal bars above and below indicate the quartiles (25%, 75%).
  • FIG. 7 shows an ROC curve created based on the results of FIG. The horizontal axis of the graph in FIG. 7 represents “100% -specificity (%)” (false positive rate (%)), and the vertical axis represents “sensitivity (%)” (true positive rate (%)) .
  • a method for determining the presence or absence or risk of onset of cancer in the present invention A method for determining the presence or absence or risk of developing one or more cancers selected from the group consisting of pancreatic cancer, gastric cancer, colon cancer, duodenal cancer and cholangiocarcinoma,
  • the method is not particularly limited as long as it is a determination method including the following steps (a) to (c) (hereinafter also referred to as “the present determination method”).
  • (A) The concentration of one or more substances selected from the substance groups described in the following [A group] and [B group] in the blood sample for determination collected from the subject (hereinafter referred to as Measuring “the substance concentration in the subject”)); [A group] APOA4 partial peptide, APOA1 partial peptide, TTHY partial peptide, Q5 VY30 partial peptide, H0YAC1 partial peptide, BTD partial peptide, APOA4, APOA1, TTHY, Q5 VY30, H0YAC1, BTD [B group] Partial peptide of ITIH3, ITIH3 (B) comparing the concentration of the substance measured in step (a) with the concentration of the substance in the control healthy blood sample (hereinafter also referred to as "the substance concentration in the control sample”); (C) When the substance measured in step (a) is a substance of [group A], the concentration of the substance measured in step (a) is compared with the concentration of the substance in the control healthy blood sample When
  • the present determination method is a method for assisting a doctor's diagnosis of the presence or absence or risk of onset of cancer in the present invention, and does not include the diagnosis by the doctor.
  • biomarker for the determination of the presence or absence of cancer in the present invention It is characterized by being composed of one or more substances selected from the substance groups described in the following [A group] and [B group]: It is a biomarker for determining the presence or absence or risk of developing one or more types of cancer selected from the group consisting of pancreatic cancer, gastric cancer, colon cancer, duodenal cancer and bile duct cancer,
  • the substance is a substance of [group A]
  • concentration of the substance in the blood sample for determination collected from the subject is lower than the concentration of the substance in a control healthy person, the test It is shown that a person is likely to have the one or more cancers or that the subject is at high risk of developing the cancer.
  • the substance is a substance of [group B]
  • concentration of the substance in the blood sample for determination collected from the subject is higher than the concentration of the substance in a control healthy person, the test It is highly likely that the individual has the one or more cancers, or it is shown that the subject is at high risk of developing the cancer. It is not particularly limited as long as it is the aforementioned determination biomarker (hereinafter, also displayed as "the present determination biomarker").
  • step (a) of the present invention one or more selected from the group of substances described in the following [group A] and [group B] in the blood sample for determination collected from the subject It is not particularly limited as long as it is a process of measuring the concentration of the substance of
  • APOA4 represents apolipoprotein A-4.
  • the amino acid sequence of human APOA4 is shown in SEQ ID NO: 25 (Accession No. P06727 of UniProt).
  • APOA1 represents apolipoprotein A-1.
  • the amino acid sequence of human APOA1 is shown in SEQ ID NO: 26 (Accession No. P02647 of UniProt).
  • TTHY stands for transthyretin.
  • the amino acid sequence of human TTHY is shown in SEQ ID NO: 27 (Accession No. P02766 of UniProt).
  • Q5VY30 represents retinol binding protein 4.
  • the amino acid sequence of human retinol binding protein 4 is shown in SEQ ID NO: 28 (Accession number P02753 of UniProt), as well as in UniProt accession number Q5VY30 (an isoform of human retinol binding protein 4).
  • H0YAC1 represents plasma kallikrein heavy chain 1.
  • the amino acid sequence of human plasma kallikrein heavy chain 1 is shown in SEQ ID NO: 29 (Accession No. P03952 of UniProt) and also in UniProt Accession No. H0YAC1, and also part of human plasma kallikrein heavy chain 1.
  • An amino acid sequence containing the amino acid sequence is also shown in UniProt Accession Nos. E9PBC5, B4DMX2, A8K9A9.
  • BTD stands for biotidase.
  • the amino acid sequence of human biotidase is shown in SEQ ID NO: 30 (Accession No. P43251 of UniProt).
  • ITI H3 stands for inter-alpha trypsin inhibitor heavy chain 3.
  • the amino acid sequence of human inter-alpha trypsin inhibitor heavy chain 3 is shown in SEQ ID NO: 31 (accession number Q06033 of UniProt).
  • the “partial peptide” in the present invention also includes what is generally called “partial protein".
  • the “partial peptide” of a given protein is any of 5 or more (preferably 7 or more, more preferably 9 or more, still more preferably 11 or more) of any consecutive ones in the amino acid sequence of the protein. It means a peptide consisting of amino acids.
  • the "partial peptide” as long as it consists of a part of the amino acid sequence of the full-length amino acid sequence of the corresponding specific protein (hereinafter, also referred to as "corresponding full-length amino acid sequence")
  • the number of amino acids may be one or two or more less than the number of amino acids of the corresponding full-length amino acid sequence, but 90% or less and 70% or less 50% or less, 30% or less, 20% or less, 10% or less of the number of amino acids.
  • the value after the decimal point is discarded.
  • Specific examples of the upper limit of the number of amino acids of the “partial peptide” in the present invention include 100 or less, 50 or less, 30 or less, 20 or less, 18 or less, and 15 or less.
  • As a specific example of the preferable range of the number of amino acids of the "partial peptide” in the present invention 5 to 100, 5 to 50, 7 to 30, 7 to 20, 9 to 18 and 11 to 15 are preferable It can be mentioned.
  • the amino acid sequence of the "partial peptide" in the present invention can be appropriately set based on the corresponding full-length amino acid sequence.
  • the partial peptide of APOA4 is any continuous 5 or more (preferably 7 or more, more preferably 9 or more, more preferably 11 or more) amino acids in the full-length amino acid sequence (SEQ ID NO: 25) of APOA4. It can set suitably by selecting.
  • the "partial peptide” in the present invention is preferably a protease-digested peptide (also referred to herein as "protease-digested peptide”), and such a peptide measures the concentration of a substance by mass spectrometry.
  • protease include trypsin, chymotrypsin, pepsin, bromelain, elastase, clostripain, V8 protease, thermolysin, lysyl endopeptidase, arginine endopeptidase, prolyl endopeptidase, aspartate-N protease and the like, among them trypsin Is particularly preferably mentioned.
  • tryptic peptides listed in Tables 1 to 7 below are particularly preferably mentioned.
  • the substance may be one or more (for example, three or more, four or more, or five or more) substances selected from the present substance group, but from the viewpoint of obtaining higher determination accuracy And one or more selected from the group consisting of partial peptides of APOA4, partial peptides of APOA1, partial peptides of ITIH3, APOA4, APOA1 and ITIH3 (eg, three or more, four or more, or five or more), 1 or 2 or more selected from the group consisting of partial peptides of APOA4, partial peptides of APOA1, partial peptides of TTHY, partial peptides of Q5VY30, partial peptides of H0YAC1, partial peptides of BTD, and partial peptides of ITIH3 (eg 3 Or more, four or more or five) are preferably mentioned, and a partial peptide of APOA4, A One, preferably two, more preferably three, selected from the group consisting of partial peptides of
  • the tryptic peptide of APOA4 includes peptides consisting of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 5-14, and from the viewpoint of obtaining higher determination accuracy, consists of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 6-14
  • Preferred is a peptide, more preferably a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9-14, even more preferably a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10, 12-14, an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 or 14 Is even more preferred, and the peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 is most preferably mentioned.
  • tryptic peptides of ITI H 3 include peptides consisting of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 3, and in view of obtaining higher judgment accuracy, they consist of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2 or 3 A peptide is preferably mentioned, and a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is more preferably mentioned.
  • the tryptic peptide of TTHY includes a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 23 or 24. From the viewpoint of obtaining higher determination accuracy, a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 23 is Preferably mentioned.
  • the cancer according to the present invention to be subjected to the determination or diagnosis according to the present invention is one or more selected from the group consisting of pancreatic cancer, gastric cancer, colon cancer, duodenal cancer and cholangiocarcinoma (for example, The type is not particularly limited as long as it is three or more, four or more, or five) cancers, but among them, pancreatic cancer, or two or more (for example, three or more, four or more, or five) including pancreatic cancer Cancer is preferable, among which pancreatic cancer is more preferable, and early pancreatic cancer is particularly preferable.
  • Early stage pancreatic cancer means stage 0, stage I or stage II pancreatic cancer.
  • the subject is not particularly limited as long as it is a human, but among the cancers in the present invention, it is a human whose presence or absence or risk of developing at least one type of cancer (preferably pancreatic cancer) is unknown.
  • the cancers in the present invention preferably two or more (preferably, two or more cancers including preferably pancreatic cancer), more preferably three or more (preferably three types including pancreatic cancer).
  • the above cancer more preferably four or more (preferably four or more cancers including preferably pancreatic cancer), more preferably a human whose presence or risk of developing five cancers is unknown.
  • Blood samples for determination to be measured in the present invention include serum, plasma, whole blood and the like collected from a subject, among which serum is preferred.
  • the step (b) in the present invention is not particularly limited as long as it is a step of comparing the concentration of the substance measured in the step (a) with the concentration of the substance in the control healthy blood sample.
  • the concentration of the substance group in the blood sample for determination is measured by a known method capable of specifically detecting the substance group in the collected blood sample for determination, for example, using mass spectrometry.
  • a known method capable of specifically detecting the substance group in the collected blood sample for determination for example, using mass spectrometry.
  • the substance group contained in the blood sample for determination is converted to gaseous ions (ionization) using an ion source, and the analysis unit moves in vacuum and uses electromagnetic force, or It refers to a measurement method using a mass spectrometer that can separate and detect a blood sample ionized by the time of flight difference according to the mass-to-charge ratio.
  • Examples of the method of ionizing using the above ion source include electron ionization (EI) method, chemical ionization (CI) method, field desorption ionization (FD) method, fast atom bombardment (FAB) method, matrix assisted laser desorption An ionization ionization (MALDI) method and an electrospray ionization (ESI) method can be mentioned. Further, in the analysis section, the present substance group ionized by various ionization methods is separated according to the mass by the analyzer.
  • EI electron ionization
  • CI chemical ionization
  • FD field desorption ionization
  • FAB fast atom bombardment
  • MALDI matrix assisted laser desorption
  • ESI electrospray ionization
  • a magnetic field type mass separator (Sector MS), a quadrupole mass separator (QMS), a time-of-flight mass separator (TOFMS), a Fourier transform ion cyclotron mass separator (FT-ICRMS) ) May be mentioned, and those combining these may be used.
  • tandem mass spectrometry (MS / MS) combining two or more mass spectrometry methods can be used.
  • the substance group contained in the blood sample for determination is separated from contaminants by gas chromatography (GC), liquid chromatography (LC), high performance liquid chromatography (HPLC), and ultra high performance liquid chromatography (UHPLC). It can be purified and analyzed.
  • LC, HPLC, and UHPLC a cation or anion exchange chromatograph, a normal phase or a reverse phase chromatograph may be mentioned, and a combination thereof may be used.
  • the concentration of the substance group in the blood sample for determination may be an absolute value or a relative value, and when it is a relative value, for example, the substance group with a known concentration (internal standard (internal standard) The relative value on the basis of) can be mentioned.
  • the concentration of the substance in a control healthy blood sample (the substance concentration in the control sample)
  • the concentration in the control sample one corresponding to “the substance concentration in the subject” to be compared is used. Therefore, if “the substance concentration in the subject” is an absolute value, then “the substance concentration in the control sample” also uses the absolute value, and if “the substance concentration in the subject” is a relative value, the “control” The substance concentration in the sample also uses relative values.
  • concentration of the substance in a healthy blood sample as a control can be obtained by using a blood sample (ie, “healthy blood sample”) collected from a healthy person (control person) when carrying out the present determination method or the like. It may be measured each time, but may be measured in advance.
  • the healthy blood sample is preferably a blood sample of the same type as the blood sample for determination derived from the subject.
  • the blood sample for determination derived from the subject is serum, plasma or whole blood
  • a blood sample of the same kind is preferable to use.
  • a healthy blood sample is collected from a healthy person and subjected to the same process as the blood sample for determination derived from a subject.
  • each concentration of two or more substances measured in the step (a) and each concentration of two or more substances in a control healthy blood sample are Preferred is a step of comparing predicted values obtained by substitution into a prediction equation (hereinafter also referred to as "multivariate analysis equation") in multivariate analysis in which each concentration of a species or more substance is a variable.
  • multivariate analysis preferably includes multiple logistic regression analysis or multiple regression analysis. Among them, multiple logistic regression analysis is more preferably mentioned, and multiple logistic regression analysis by the stepwise method is further performed. Preferably mentioned. It is possible to calculate the above-mentioned prediction formula by these multivariate analysis, substitute each concentration of the substance in the prediction formula, and obtain a predicted value, etc. using commercially available data analysis software.
  • a peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12 ie, a tryptic digest of APOA4 in the early pancreatic cancer group and a healthy group
  • a peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 ie, a tryptic digested peptide of APOA1
  • a prediction equation (formula (1)) calculated by multiplex logistic regression analysis of three concentrations (peak intensities) of a peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 ie, ITIH3 tryptic peptide
  • SEQ. 2 indicates the peak intensity of the peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 (ie, ITI H3 tryptic digest peptide)
  • SEQ. 5 indicates SEQ ID NO: 5 Shows the peak intensity of the peptide consisting of the amino acid sequence described in (ie, a tryptic peptide of APOA1)
  • SEQ.12 is the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 (ie, a tryptic peptide of APOA4) Shows the peak intensity of
  • step (c) in the present invention In the case where the substance measured in step (a) is a substance of the above [group A], when the "substance of substance in the subject” measured in step (a) is lower than "the substance concentration in control sample” Evaluate (determine) that the subject is likely to have the cancer of the present invention or that the subject is at high risk of developing the cancer, and / or When the substance measured in step (a) is a substance of the above [group B], the "substance of substance in the subject” measured in step (a) is higher than "the substance concentration in the control sample”; It is evaluated (judged) that the subject is likely to have the cancer of the present invention or the risk of developing the cancer in the subject is high.
  • the threshold value (cutoff value) for determining whether “the substance concentration in the subject” is lower or higher than “the substance concentration in the control sample” can be determined by one skilled in the art. It can be set appropriately according to the type and the like.
  • a threshold value for example, an average value of "substance concentration in control sample” (hereinafter, also simply referred to as “average value”), “average value + standard deviation (SD)", “average value + 2 SD”, “average value Value + 3SD, median value of substance concentration in control sample (hereinafter also referred to simply as median value), median value + SD, median value + 2SD, median value + 3SD, control sample
  • the quartile value (25% value or 75% value) etc. of substance concentration can be mentioned.
  • the threshold is “sensitivity” (the rate at which a person having cancer in the present invention can be correctly determined as positive (possibly likely to have cancer)) and “specificity” (this In the invention, the data of “the substance concentration in the subject” and the data such as “probable proportion that the person who does not have cancer in the invention can be correctly determined negative (less likely to have cancer)” It can also be calculated using a ROC (Recei).
  • the specific method of calculating a threshold value using an ROC curve is, for example, as follows.
  • measurement values measurement values of peptide concentration
  • the measured value can be adopted as a threshold.
  • distance from the upper left end point of the ROC curve graph (1-sensitivity) 2 + (1-specificity) 2
  • a value Youden's index
  • the cancer determination accuracy (diagnosis system) in the present invention at least one of the cancers in the present invention (preferably pancreatic cancer, more preferably early pancreatic cancer)
  • the sensitivity and specificity of both are 0.6 or more, preferably 0.65 or more, more preferably 0.7 or more, still more preferably 0.75 or more, more preferably 0.8 or more, still more preferably 0.85. It is preferably mentioned that the above is more preferably 0.9 or more.
  • the subject when the substance is a substance of the above-mentioned [group A], when the concentration of the substance in the subject is lower than "the substance concentration in the control sample", the subject is said 1 Whether it is likely to have a species or two or more types of cancer or it can be evaluated that the subject is at high risk of developing the cancer depends on the type of cancer in the present invention and the individual of the person. Although it can not be unambiguously specified because it differs depending on the physical characteristics etc., it is preferably 10% or more reduction, more preferably 15% or more reduction, still more preferably 20% or more reduction, still more preferably 30% or more These values can be suitably applied when the cancer in the present invention is pancreatic cancer (preferably, early pancreatic cancer).
  • the degree of reduction is preferably 10% or more, more preferably 15% or more. More preferably, the reduction is 20% or more, still more preferably 30% or more, more preferably 35% or more.
  • pancreatic cancer preferably, early stage. It can apply suitably, when it is pancreatic cancer.
  • the above-mentioned reduction degree is preferably 10% or more, more preferably 15% or more, more preferably The reduction is 20% or more, more preferably 30% or more, more preferably 35% or more, and these figures indicate that the cancer in the present invention is pancreatic cancer (preferably, early pancreatic cancer). Is preferably applicable.
  • the substance when the substance is a substance of the above-mentioned [group B], when the concentration of the substance in the subject is increased to a certain extent than "the substance concentration in the control sample" Whether it is likely to have a species or two or more types of cancer or it can be evaluated that the subject is at high risk of developing the cancer depends on the type of cancer in the present invention and the individual of the person. Although it can not be unambiguously specified because it differs depending on the physical characteristics etc., it is preferably 10% or more, more preferably 15% or more, still more preferably 20% or more, still more preferably 30% or more. And more preferably 35% or more, and these values can be suitably applied when the cancer in the present invention is pancreatic cancer (preferably, early pancreatic cancer).
  • the above-mentioned rising degree is preferably 10% or more, more preferably 15% or more. More preferably 20% or more, still more preferably 30% or more, more preferably 35% or more, and these figures indicate that the cancer in the present invention is pancreatic cancer (preferably, early stage). It can apply suitably, when it is pancreatic cancer.
  • each concentration of two or more types of substances measured in step (a) and each concentration of two or more types of substances in a healthy blood sample as a control are two or more types.
  • the following steps are preferably mentioned as the step (c).
  • the prediction formula in the step (b) the predicted value is high when the subject is highly likely to have the one or more types of cancer or when the risk of developing the cancer is high.
  • the prediction formula in the step (c) when the predicted value obtained for the subject is higher than the predicted value obtained for the healthy blood sample, the subject is the one or two or more types.
  • the predicted value is low when the subject is highly likely to have the one or more cancers or when the risk of developing the cancer is high.
  • the prediction formula in the step (c), when the predicted value obtained for the subject is lower than the predicted value obtained for the healthy blood sample, the subject is the one or two or more species. Evaluating that the subject is likely to have the above cancer or has a high risk of developing the cancer in the subject;
  • [Group B] additionally contains the CA19-9 antigen
  • the substance whose concentration is to be measured in step (a) is two or more substances selected from the substance groups described in [group A] and [group B], and containing at least the CA19-9 antigen Can be mentioned. If the concentration of CA19-9 antigen is further used for determination, the accuracy of determination of pancreatic cancer may be able to be further enhanced.
  • a peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12 ie, a tryptic digest of APOA4 in the early pancreatic cancer group and a healthy group
  • a peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 ie, a tryptic digested peptide of APOA1
  • a peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 ie, ITIH3 tryptic peptide
  • a prediction formula (peak intensity) of CA19-9 antigen calculated by multiple logistic regression analysis
  • SEQ. 2 shows the peak intensity of the peptide (namely, ITIH3 tryptic digest peptide) which consists of an amino acid sequence as shown to sequence number 2, and "SEQ. 5" is sequence number 5 Shows the peak intensity of the peptide consisting of the amino acid sequence described in (ie, a tryptic peptide of APOA1), and “SEQ.12” is the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 (ie, a tryptic peptide of APOA4) “CA 19.9” represents the peak intensity of CA 19-9.
  • the prediction formula of the formula (2) is preferable in that the determination accuracy of the cancer (preferably pancreatic cancer, more preferably early pancreatic cancer) in the present invention is higher than that of the above formula (1). It can be mentioned.
  • the predicted value in the step (b) is high when the subject is highly likely to have the one or more types of cancer or when the risk of developing the cancer is high.
  • the degree to which the predicted value in a person having any one of the cancers of the present invention in the step (c) is higher than the predicted value in the control sample is preferably 10% or more, more preferably 30% or more. More preferably, the increase is 50% or more, more preferably 80% or more, more preferably 100% or more, more preferably 150% or more, even more preferably 200% or more.
  • Ri preferably include raised above 300%, these numbers (preferably, early pancreatic cancer) cancer pancreatic cancer in the present invention can be suitably applied in the case of.
  • the predicted value in the step (b) is low when the subject is highly likely to have the one or more cancers or when the risk of developing the cancer is high.
  • the degree to which the predicted value in a person having any one of the cancers of the present invention in the step (c) is lower than the predicted value in the control sample is: Although it can not be generally specified because it varies depending on the type of cancer, personal characteristics of the person, the contents of the prediction formula, etc., preferably a decrease of 10% or more, more preferably a decrease of 30% or more, More preferably 50% or more reduction, even more preferably 80% or more reduction, more preferably 100% or more reduction, still more preferably 150% or more reduction, even more preferably 200% or more reduction Ri preferably include reduction of more than 300%, these numbers (preferably, early pancreatic cancer) cancer pancreatic cancer in the present invention can be suitably applied in the case of.
  • the substance contains at least a partial peptide of APOA4 or a partial peptide of APOA1
  • the determination method is such that the concentration of the partial peptide of APOA4 or partial peptide of APOA1 measured in step (a) is lower than the concentration of partial peptide of APOA4 or partial peptide of APOA1 in a control healthy blood sample
  • the substance contains at least a partial peptide of APOA4 or a partial peptide of APOA1,
  • the concentration of the partial peptide of APOA4 or partial peptide of APOA1 in the blood sample for determination collected from the subject is lower than the concentration of partial peptide of APOA4 or partial peptide of APOA1 in the control healthy blood sample
  • the degree is larger, it is shown that the subject is likely to have pancreatic cancer or the risk of developing pancreatic cancer in the subject is high (preferably, the subject is gastric cancer, Hepatocellular carcinoma, esophagus cancer, colon cancer, but not likely to have pancreatic cancer or is shown to be at high risk of developing pancreatic cancer in the subject, More preferably, the subject is gastric cancer, Hepatocellular carcinoma, esophagus cancer, colon cancer, but not likely to have pancreatic cancer or is shown to be at high risk of developing pancreatic cancer in the subject, More preferably, the
  • Serum was collected from human and subjected to protein denaturation treatment in urea solution and then digested with peptidase to prepare a peptide sample. More specifically, 15 ⁇ L of an 8 M urea solution is added to 10 ⁇ L of diluted serum obtained by diluting serum collected from human into 1/10, protein modification treatment is performed, then reductive alkylation is performed, and then lysyl is added.
  • the peptide samples were prepared by treatment with endopeptidase and trypsin.
  • ITI H3 peptides Three types of ITI H3 peptides (EVSFDVELPK [SEQ ID NO: 1], EHLVQ ATPENLQEAR [SEQ ID NO: 2], and DYIFGNYIER [SEQ ID NO: 3]); One Q5VY30 peptide (YWGVASFLQK [SEQ ID NO: 4]); One kind of APOA1 peptide (THLAPYSDELR [SEQ ID NO: 5]);
  • APOA4 peptides SELTQQLNALFQDK [SEQ ID NO: 6], LGEVNTYAGDLQK [SEQ ID NO: 7], EAVEHLQK [SEQ ID NO: 8], SLAPYAQDTQEK [SEQ ID NO: 9], SLAELGGHLDQQVEEFR [SEQ ID NO: 10], ISASAEELR [SEQ ID NO: 11], LLPHANEVSQK SEQ ID NO: 12], LAPLAEDVR [SEQ ID NO: 13], and ID
  • an ROC curve is created using OriginPro (manufactured by Light Stone Co., Ltd.), and a peptide having an AUC value of greater than 0.7 between the early pancreatic cancer group and the healthy group is used.
  • OriginPro manufactured by Light Stone Co., Ltd.
  • a peptide having an AUC value of greater than 0.7 between the early pancreatic cancer group and the healthy group is used.
  • the threshold value was set about each of each peptide identified as a biomarker for determination of early stage pancreatic cancer, and the sensitivity and specificity of early stage pancreatic cancer were calculated.
  • ITI H3 peptides Two types of ITI H3 peptides (EHLVQ ATPENLQEAR [SEQ ID NO: 2], and DYIFGNYIER [SEQ ID NO: 3]); One Q5VY30 peptide (YWGVASFLQK [SEQ ID NO: 4]); One kind of APOA1 peptide (THLAPYSDELR [SEQ ID NO: 5]); Nine types of APOA4 peptides (SELTQQLNALFQDK [SEQ ID NO: 6], LGEVNTYAGDLQK [SEQ ID NO: 7], EAVEHLQK [SEQ ID NO: 8], SLAPYAQDTQEK [SEQ ID NO: 9], SLAELGGHLDQQVEEFR [SEQ ID NO: 10], ISASAEELR [SEQ ID NO: 11], LLPHANEVSQK SEQ ID NO: 12], LAPLAEDVR [SEQ ID NO: 13], and IDQTVEELR [SEQ ID NO: 14]
  • ITIH3 is increased in patients with early stage pancreatic cancer as compared to healthy individuals, while the remaining six proteins (Q5VY30, APOA1, APOA4, BTD, H0YAC1, and TTHY) Is a biomarker that decreases in patients with early stage pancreatic cancer compared to healthy individuals (see Table 8).
  • ITIH3 peptide in plasma EHLVQ ATPENLQEAR [SEQ ID NO: 2]
  • APOA1 peptide TNLAPYSDELR [SEQ ID NO: 5]
  • FIG. 1A The results of quantifying the concentration of and APOA4 peptide (LLPHANEVSQK [SEQ ID NO: 12]) (FIG. 1C) by mass spectrometry are shown in FIG. 1A, FIG. 1B and FIG. 1C, respectively.
  • a threshold value is set about each of each peptide identified as a biomarker for determination of early stage pancreatic cancer, and the result of having calculated sensitivity and specificity in determination of early stage pancreatic cancer is also shown in Table 8.
  • Each peptide identified as a biomarker for the determination of early stage pancreatic cancer showed suitable sensitivity and specificity in the determination of early stage pancreatic cancer.
  • the above threshold was calculated as follows.
  • “Rate” in Table 8 indicates the ratio of the quantified value of the early pancreatic cancer group to the healthy group for each peptide.
  • CA19-9 concentration is measured by tumor marker (CA19-9) measurement ELISA kit, both groups
  • the AUC value was 0.8619
  • the sensitivity and specificity when the threshold was set to 24.9 were 77.97% and 81.54%, respectively. That is, none of the 17 peptides (see Table 8) alone identified in the present example exceeded the accuracy of the early pancreatic cancer than the existing cancer markers (CA19-9). Therefore, we tried to search for combinations of peptides that can determine early pancreatic cancer more accurately than CA19-9.
  • CA19-9 has sufficient accuracy as a marker for early pancreatic cancer, but it is not correct.
  • CA19-9 is also used as a marker for cancer of the digestive system in medical checkups such as in the human dock, etc.
  • a subject with a high concentration of CA19-9 in the blood is then subjected to a detailed examination and any of the digestive organs Find out if you have cancer. That is, at present, many of the few early stage pancreatic cancer patients are those who have found early stage pancreatic cancer triggered by the high concentration of CA19-9, so there is a correlation between early pancreatic cancer and CA19-9 concentration. Apparently, it is considered to be higher. However, in fact, pancreatic cancer is largely overlooked at an early stage, and CA19-9 is considered to have low utility as a marker for early stage pancreatic cancer.
  • SEQ. 2 indicates the peak intensity (see FIG. 1A) of the ITIH3 peptide (EHLVQ ATPENLQEAR [SEQ ID NO: 2], and “SEQ. 5” indicates the APOA1 peptide (THLAPYSEDLR [SEQ ID NO: 5].
  • SEQ.12 shows the peak intensity (refer FIG. 1C) of APOA4 peptide (LLPHANEVSQK [sequence number 12]).
  • the AUC value is 0.9343
  • the threshold value is set to 0.4767.
  • the sensitivity and the specificity were 84.75% and 93.85%, respectively, and it was shown that early pancreatic cancer can be determined more accurately than the combination of the above three types of peptides (see FIG. 2B).
  • the occurrence probability of early pancreatic cancer using a combination of the above three types of peptides and CA19-9 was calculated using the multiple logistic regression equation shown in the following formula (2).
  • SEQ. 2 indicates the peak intensity (see FIG. 1A) of ITIH3 peptide (EHLVQ ATPENLQEAR [SEQ ID NO: 2]), and “SEQ. 5” indicates the APOA1 peptide (THLAPYSEDLR [SEQ ID NO: 5].
  • SEQ. 12 shows the peak intensity of APOA4 peptide (LLPHANEVSQK [SEQ ID NO: 12]) (see FIG. 1C)
  • CA 19.9 shows CA 19 ⁇ 9 shows measured values of concentration.
  • pancreatic cancer onset risk by combination of biomarker peptides It is verified whether the biomarkers for determination of early pancreatic cancer identified in this example are also effective for determination of (early) pancreatic cancer onset risk did.
  • the plasma is collected from the pre-pancreatic cancer lesion / chronic pancreatitis group, and a peptide sample is prepared according to the method described in the item “Method” of Example 1, and the above three types of peptides, ie, ITIH3 peptide (EHLVQ ATPENLQEAR [ The concentrations of SEQ ID NO: 2], APOA1 peptide (THLAPYSDELR [SEQ ID NO: 5]), and APOA4 peptide (LLPHANEVSQK [SEQ ID NO: 12]) were quantified.
  • EHLVQ ATPENLQEAR The concentrations of SEQ ID NO: 2]
  • APOA1 peptide TNLAPYSDELR [SEQ ID NO: 5]
  • APOA4 peptide LLPHANEVSQK [SEQ ID NO: 12]
  • the multiple logistic regression analysis described in the item “Method” of Example 4 is performed based on the measured value of the concentration of CA 19-9 in plasma.
  • the probability of developing prepancreatic cancer lesions and chronic pancreatitis was predicted.
  • the incidence probability of anterior pancreatic cancer lesions and chronic pancreatitis using the combination of the above three types of peptides is calculated using the multiple logistic regression equation shown in the above equation (1), and the above three types of peptides and CA 19
  • the occurrence probability of the prepancreatic cancer lesion and chronic pancreatitis using the combination with -9 was calculated using the multiple logistic regression equation shown in the above equation (2).
  • the probability of occurrence of the prepancreatic cancer lesion / chronic pancreatitis in the prepancreatic cancer lesion / chronic pancreatitis group is 0. 6029, which is higher than the probability (0.2338) of prepancreatic cancer lesions and chronic pancreatitis in the healthy group (see FIG. 2A).
  • the AUC value was as high as 0.8116.
  • 0.4481 is set as a cutoff value to distinguish between the prepancreatic cancer lesion / chronic pancreatitis group and the healthy group
  • the sensitivity of the prepancreatic cancer lesion / chronic pancreatitis patient was 0.7667 and 0.8030, respectively.
  • pancreatic cancer lesions and chronic pancreatitis can be determined, that is, the risk of developing pancreatic cancer can be determined. It is possible to determine that the risk of developing pancreatic cancer is high if there is a high possibility of anterior pancreatic cancer lesions or chronic pancreatitis, and if the possibility of pancreatic cancer lesions or chronic pancreatitis is low, pancreatic pancreas It can be determined that the risk of developing cancer is low.
  • Stage I pancreatic cancer group (4 patients with stage I pancreatic cancer [1 male, 3 women]), stage II pancreatic cancer group (19 patients with stage II pancreatic cancer [13 males] Name, 6 women], stage III pancreatic cancer group (26 patients with stage III pancreatic cancer [13 men, 13 women]), and stage IV pancreatic cancer group (stage IV pancreatic cancer patients) Plasma was collected from 51 healthy subjects (32 males, 19 females) and a healthy group (44 healthy subjects [29 males, 15 females]) as a control, and described in the item “Method” in Example 5.
  • quantification of the concentrations of the above three types of peptides (ITIH3 peptide, APOA1 peptide, and APOA4 peptide) and multiple logistic regression analysis based on the obtained quantification results are carried out to generate pancreatic cancer at each stage. Predicted the probability.
  • the numerical values in Table 13 indicate the above three types of peptides ("3 types of peptides” in Table 13), the above 3 types of peptides, and CA 19-9 ("3 types of peptides + CA 19-9” in Table 13). And AUC values when the pancreatic cancer group at each stage and the healthy group were discriminated based on the quantitative results of CA19-9 (“CA19-9” in the table).
  • the numerical values in Table 14 indicate the above three types of peptides ("3 types of peptides” in the table), the above 3 types of peptides, and CA 19-9 ("3 types of peptides + CA 19-9" in Table 14), Also, based on the quantitative results of CA19-9 (“CA19-9” in Table 14), the AUC values are shown when each cancer group and the healthy group are distinguished.
  • pancreatic cancer Discrimination between pancreatic cancer and other cancers
  • stomach cancer hepatocellular carcinoma, esophageal cancer, colon cancer
  • pancreatic cancer 10 specimens used in Example 7
  • pancreatic cancer (10 specimens) used in Example 6 An exhaustive search was performed by quantitative proteome analysis by.
  • APOA4 was identified as a molecule having the highest ability to discriminate between pancreatic cancer and other cancers (gastric cancer, hepatocellular carcinoma, esophageal cancer, colon cancer).
  • SEQ ID NOs: 9, 10 and 12 were used as APOA4 peptides.
  • APOA4 peptide concentration is the lowest in pancreatic cancer, and in other cancers (stomach cancer, hepatocellular carcinoma, esophageal cancer, colon cancer) it is not as low as pancreatic cancer, so pancreatic cancer and other cancers It has been shown that it can be determined. Furthermore, among other cancers, especially in stomach cancer, hepatocellular carcinoma and esophagus cancer, the concentration of APOA4 peptide does not decrease so much, therefore, the concentration of APOA4 peptide causes pancreatic cancer and these three types of cancer, It can be determined more accurately.
  • pancreatic cancer when using APOA4 peptide (preferably, SEQ ID NO: 9, 10, 12), it discriminates pancreatic cancer from other cancers (stomach cancer, hepatocellular carcinoma, esophageal cancer, colon cancer) It has been shown that, among others, it is possible to discriminate pancreatic cancer from gastric cancer, hepatocellular carcinoma and esophageal cancer with higher accuracy.
  • APOA4 peptide preferably, SEQ ID NO: 9, 10, 12
  • the concentration of APOA4 peptide is the lowest in pancreatic cancer, and in other cancers (stomach cancer, hepatocellular carcinoma, esophagus cancer, colon cancer) it is not as low as pancreatic cancer. It has been shown that it can be distinguished from cancer. Furthermore, among other cancers, especially in stomach cancer, hepatocellular carcinoma and esophagus cancer, the concentration of APOA4 peptide does not decrease so much, therefore, the concentration of APOA4 peptide causes pancreatic cancer and these three types of cancer, It has been shown that the determination can be made more accurately.
  • pancreatic cancer group of stage III and IV 43 patients with pancreatic cancer of stage III and IV and healthy group as a comparison control (plasma collected from 45 healthy subjects, Example 5 “Method”
  • quantification of the concentration of the above three kinds of peptides IIH3 peptide, APOA1 peptide and APOA4 peptide
  • multiple logistic regression analysis based on the obtained quantification results are performed, and stage III or IV Predicted the incidence of pancreatic cancer.
  • one or more cancers selected from the group consisting of pancreatic cancer, gastric cancer, colon cancer, duodenal cancer and cholangiocarcinoma (preferably pancreatic cancer, more preferably early stage) It is possible to provide a determination method capable of accurately determining the presence or absence and risk of onset of pancreatic cancer, a biomarker for determination, and the like. According to the present invention, if pancreatic cancer can be detected at an early stage, treatment at an early stage becomes possible, and a five-year survival rate can be expected to be significantly improved as compared to a case where it is detected after progress.

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Abstract

本発明の課題は、膵がん、胃がん、大腸がん、十二指腸がん及び胆管がんからなる群から選択される１種又は２種以上のがん（好ましくは膵がん、より好ましくは早期膵がん）の有無又は発症リスクを精度よく判定できる判定方法や、判定用バイオマーカー等を提供することにある。　本発明は、以下の［Ａグループ］及び［Ｂグループ］に記載される物質群から選択される１又は２種以上の物質を、早期膵がんを含む膵がん、胃がん、大腸がん、十二指腸がん、胆管がんの有無又は発症リスクを精度よく判定できるバイオマーカーとして用いる。 ［Ａグループ］ＡＰＯＡ４の部分ペプチド、ＡＰＯＡ１の部分ペプチド、ＴＴＨＹの部分ペプチド、Ｑ５ＶＹ３０の部分ペプチド、Ｈ０ＹＡＣ１の部分ペプチド、ＢＴＤの部分ペプチド、ＡＰＯＡ４、ＡＰＯＡ１、ＴＴＨＹ、Ｑ５ＶＹ３０、Ｈ０ＹＡＣ１、ＢＴＤ ［Ｂグループ］ＩＴＩＨ３の部分ペプチド、ＩＴＩＨ３

Description

膵がん等のがんの判定用バイオマーカー
　本発明は、膵がん、胃がん、大腸がん、十二指腸がん及び胆管がんからなる群から選択される１種又は２種以上のがん（以下、「本発明におけるがん」とも表示する。）の有無又は発症リスクの判定方法であって、被検者から採取された判定用血液試料中の特定の物質群から選択される１又は２種以上の物質の濃度を測定する工程（ａ）を含む判定方法や、前述の特定の物質群からなる前述のがんの有無の判定用バイオマーカー等に関する。
　がんは死亡原因の高い割合を占めており、その状況は長らく続いている。様々な抗がん剤の開発がこれまでに進められており、免疫チェックポイント阻害剤など、以前より効果の高い抗がん剤も実用化されているものの、得られる抗がん作用の程度には個人差やがんの種類による差も大きく、がんは依然として人類にとっての脅威であり続けている。ただ、がんは早期に発見することができれば、早期に治療を開始することで、がんによる死亡率を大きく低下させることができる。そのため、より精度の高い又はより多様な、がんの判定・診断方法、特に、早期のがんの判定・診断方法の開発が進められている。
　ところで、がんの中でも、膵がんは難治性がんの一つであり、外科的手術以外の有効な治療法は確立されてない。膵がんが難治性がんであることの主な要因の一つとして、膵臓が胃の裏側、すなわち、体の深部に位置しており、がんが発生しても症状が現れにくく、早期発見が非常に難しいこということが挙げられる。実際、膵がんの５年生存率は約９％と極めて予後が悪いものの、早期の膵がん（ステージＩ）の５年生Ｚ存率は４１％と比較的予後がよい。このように、膵がんにおいては早期発見、早期治療が特に重要であり、膵がんを現在よりも早期に発見することができれば、膵がん患者の５年生存率を大幅にあるいは劇的に向上させることが可能になると期待できる。
　膵がんの診断手法としては、血清腫瘍マーカーであるＣＡ１９－９を用いられることが知られている。また、最近では、膵がんの診断において、ヘリカルＣＴ、磁気共鳴装置（ＭＲＩ）、内視鏡的超音波検査法（ＥＵＳ）などが用いられている。しかしながら、これらのいずれの診断手法も、膵がんの診断手法として十分とは言えず、特に、早期の膵がんの診断手法としては全く不十分であった。
　早期の膵がんの診断に関して、特許文献１には、放射性核種で標識されたｃ（ＲＧＤｆＫ）ペプチドを、哺乳動物に投与する工程、及び、投与後の哺乳動物の膵臓における前記放射性核種を検出する工程を含む、早期膵がんの検出方法が開示されている。しかし、この方法は、放射性核種で標識されたペプチドの取り扱いに注意が必要であり、実用性は高くない。一方、本発明者らはこれまでに、血漿中に存在するバイオマーカーであるinsulin-like growth factor-binding protein（ＩＧＦＢＰ）２及びＩＧＦＢＰ３が、膵がんの早期発見に有用であることを見いだしている（非特許文献１）。しかし、本発明の特定の物質群から選択される１又は２種以上の物質が、膵がん、胃がん、大腸がん、十二指腸がん及び胆管がんからなる群から選択される１種又は２種以上のがんの有無又は発症リスクを判定できるバイオマーカーであること、特に、早期の膵がんの有無又は発症リスクを判定できるバイオマーカーであることについては、これまで知られていなかった。
特開２０１２－０４２２１５号公報
PLoS One. 2016 Aug 31;11(8):e0161009
　本発明の課題は、膵がん、胃がん、大腸がん、十二指腸がん及び胆管がんからなる群から選択される１種又は２種以上のがん（好ましくは膵がん、より好ましくは早期膵がん）の有無又は発症リスクを精度よく判定できる判定方法や、判定用バイオマーカー等を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決するため、早期膵がんの患者（早期膵がん群）と、胃がんの患者と、大腸がんの患者と、十二指腸がんの患者と、胆管がんの患者と、健常者（健常群）のそれぞれについて採取した血清をトリプシンで処理し、得られたペプチド試料について質量分析を行ったところ、後述の［Ａグループ］及び［Ｂグループ］に記載される物質群（以下、「本件物質群」とも表示する。）から選択される１又は２種以上の物質が、早期膵がんを含む膵がん、胃がん、大腸がん、十二指腸がん、胆管がんの有無や発症リスクを精度よく判定できるバイオマーカーであることを見いだし、本発明を完成するに至った。また、本発明者らは、早期膵がん群と健常群における本件物質群の各濃度を変数とする多重ロジスティック回帰分析を行ったところ、本発明におけるがんの有無や発症リスクをより高精度で判定できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
［Ａグループ］
　ＡＰＯＡ４の部分ペプチド、ＡＰＯＡ１の部分ペプチド、ＴＴＨＹの部分ペプチド、Ｑ５ＶＹ３０の部分ペプチド、Ｈ０ＹＡＣ１の部分ペプチド、ＢＴＤの部分ペプチド、ＡＰＯＡ４、ＡＰＯＡ１、ＴＴＨＹ、Ｑ５ＶＹ３０、Ｈ０ＹＡＣ１、ＢＴＤ
［Ｂグループ］
ＩＴＩＨ３の部分ペプチド、ＩＴＩＨ３
　また、本発明者らは、ＡＰＯＡ４ペプチドの部分ペプチドが、膵がんと、他のがん（すなわち、胆管がん、結腸がん、十二指腸がん、及び胃がん）を判別するバイオマーカーであり、中でも、膵がんと、胃がん、肝細胞癌、食道がんとをより高精度で判別することができるバイオマーカーであることを見いだし、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下のとおりである。
（１）膵がん、胃がん、大腸がん、十二指腸がん及び胆管がんからなる群から選択される１種又は２種以上のがんの有無又は発症リスクの判定方法であって、
　前記判定方法が以下の工程（ａ）～（ｃ）を含むことを特徴とする、前記判定方法。
（ａ）被検者から採取された判定用血液試料中の、以下の［Ａグループ］及び［Ｂグループ］に記載される物質群から選択される１又は２種以上の物質の濃度を測定する工程；
［Ａグループ］
　ＡＰＯＡ４の部分ペプチド、ＡＰＯＡ１の部分ペプチド、ＴＴＨＹの部分ペプチド、Ｑ５ＶＹ３０の部分ペプチド、Ｈ０ＹＡＣ１の部分ペプチド、ＢＴＤの部分ペプチド、ＡＰＯＡ４、ＡＰＯＡ１、ＴＴＨＹ、Ｑ５ＶＹ３０、Ｈ０ＹＡＣ１、ＢＴＤ
［Ｂグループ］
ＩＴＩＨ３の部分ペプチド、ＩＴＩＨ３
（ｂ）工程（ａ）で測定した物質の濃度を、対照となる健常血液試料中のその物質の濃度と比較する工程；
（ｃ）工程（ａ）で測定した物質が[Ａグループ]の物質である場合、工程（ａ）で測定した物質の濃度が、対照となる健常血液試料中のその物質の濃度と比較して低いとき、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いと評価し、及び／又は、工程（ａ）で測定した物質が［Ｂグループ］の物質である場合、工程（ａ）で測定した物質の濃度が、対照となる健常血液試料中のその物質の濃度と比較して高いとき、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いと評価する工程；
（２）工程（ｂ）が、工程（ａ）で測定した２種以上の物質の各濃度と、対照となる健常血液試料中の２種以上の物質の各濃度とを、２種以上の物質の各濃度を変数とする多変量解析における予測式に代入して得た予測値を比較する工程であり、
　前記予測式が、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い場合に予測値が高くなる予測式である場合には、工程（ｃ）は、被検者について得られた予測値が健常血液試料について得られた予測値よりも高いときに、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いと評価する工程であり、
　前記予測式が、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い場合に予測値が低くなる予測式である場合には、工程（ｃ）は、被検者について得られた予測値が健常血液試料について得られた予測値よりも低いときに、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いと評価する工程であることを特徴とする上記（１）に記載の判定方法や、
（３）物質が、ＡＰＯＡ４の部分ペプチド、ＡＰＯＡ１の部分ペプチド、ＩＴＩＨ３の部分ペプチド、ＡＰＯＡ４、ＡＰＯＡ１及びＩＴＩＨ３からなる群から選択される１種又は２種以上である上記（１）又は（２）に記載の判定方法。
（４）部分ペプチドがプロテアーゼで消化されたペプチドであることを特徴とする上記（１）～（３）のいずれかに記載の判定方法。
（５）多変量解析が、ロジスティック回帰分析又は重回帰分析であることを特徴とする上記（２）～（４）のいずれかに記載の判定方法。
（６）[Ｂグループ]がさらにＣＡ１９－９抗原を含んでおり、
　工程（ａ）で濃度を測定する物質が、［Ａグループ］及び［Ｂグループ］に記載される物質群から選択される２種以上の物質であって、少なくともＣＡ１９－９抗原を含んでいることを特徴とする上記（１）～（５）のいずれかに記載の判定方法。
（７）工程（ａ）における物質の濃度の測定を質量分析法により行うことを特徴とする上記（１）～（６）のいずれかに記載の判定方法。
（８）物質が、ＡＰＯＡ４の部分ペプチド又はＡＰＯＡ１の部分ペプチドを少なくとも含んでおり、
　判定方法が、工程（ａ）で測定したＡＰＯＡ４の部分ペプチド又はＡＰＯＡ１の部分ペプチドの濃度が、対照となる健常血液試料中のＡＰＯＡ４の部分ペプチド又はＡＰＯＡ１の部分ペプチドの濃度と比較して低い程度がより大きいとき、前記被検者が膵がんを有している可能性が高い又は前記被験者における膵がんの発症リスクが高いと評価する工程（ｄ）をさらに含むことを特徴とする上記（１）～（７）のいずれかに記載の判定方法。
（９）がん又は膵がんが、早期膵がんであることを特徴とする上記（１）～（８）のいずれかに記載の判定方法。
（１０）以下の［Ａグループ］及び［Ｂグループ］に記載される物質群から選択される１又は２種以上の物質からなることを特徴とする、
　膵がん、胃がん、大腸がん、十二指腸がん及び胆管がんからなる群から選択される１種又は２種以上のがんの有無又は発症リスクの判定用バイオマーカーであって、
　物質が[Ａグループ]の物質である場合、被検者から採取された判定用血液試料中の前記物質の濃度が、対照となる健常者における前記物質の濃度と比べて低いとき、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いことが示され、
　物質が[Ｂグループ]の物質である場合、被検者から採取された判定用血液試料中の前記物質の濃度が、対照となる健常者における前記物質の濃度と比べて高いとき、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いことが示される、前記判定用バイオマーカー。
［Ａグループ］
　ＡＰＯＡ４の部分ペプチド、ＡＰＯＡ１の部分ペプチド、ＴＴＨＹの部分ペプチド、Ｑ５ＶＹ３０の部分ペプチド、Ｈ０ＹＡＣ１の部分ペプチド、ＢＴＤの部分ペプチド、ＡＰＯＡ４、ＡＰＯＡ１、ＴＴＨＹ、Ｑ５ＶＹ３０、Ｈ０ＹＡＣ１、ＢＴＤ
［Ｂグループ］
ＩＴＩＨ３の部分ペプチド、ＩＴＩＨ３
（１１）物質が、ＡＰＯＡ４の部分ペプチド、ＡＰＯＡ１の部分ペプチド、ＩＴＩＨ３の部分ペプチド、ＡＰＯＡ４、ＡＰＯＡ１及びＩＴＩＨ３からなる群から選択される１種又は２種以上である上記（１０）に記載の判定用バイオマーカー。
（１２）物質が、ＡＰＯＡ４の部分ペプチド又はＡＰＯＡ１の部分ペプチドを少なくとも含んでおり、
　被検者から採取された判定用血液試料中のＡＰＯＡ４の部分ペプチド又はＡＰＯＡ１の部分ペプチドの濃度が、対照となる健常血液試料中のＡＰＯＡ４の部分ペプチド又はＡＰＯＡ１の部分ペプチドの濃度と比較して低い程度がより大きいとき、前記被検者が膵がんを有している可能性が高い又は前記被験者における膵がんの発症リスクが高いことが示される上記（１０）又は（１１）に記載の判定用バイオマーカー。
（１３）
　がん又は膵がんが、早期膵がんであることを特徴とする上記（１０）～（１２）のいずれかに記載の判定用バイオマーカー。
　また本発明の実施の他の形態として、
　膵がん、胃がん、大腸がん、十二指腸がん及び胆管がんからなる群から選択される１種又は２種以上のがん（好ましくは膵がん）の有無又は発症リスクの診断方法であって、
　前記診断方法が上記工程（ａ）～（ｃ）（好ましくは上記工程（ａ）～（ｄ））を含むことを特徴とする、前記診断方法；や、
　膵がん、胃がん、大腸がん、十二指腸がん及び胆管がんからなる群から選択される１種又は２種以上のがん（好ましくは膵がん）の有無又は発症リスクの診断方法であって、
　上記工程（ａ）～（ｃ）（好ましくは上記工程（ａ）～（ｄ））を含み、さらに、工程（ｃ）において、がんを有している可能性が高いと評価（診断）された被検者に対して、がんの治療剤を投与する工程（ｐ）、又は、工程（ｄ）において、膵がんを有している可能性が高いと評価（診断）された被検者に対して、膵がんの治療剤を投与する工程（ｑ）を任意で含む、前記診断方法；や、
　膵がん、胃がん、大腸がん、十二指腸がん及び胆管がんからなる群から選択される１種又は２種以上のがん（好ましくは膵がん）の有無又は発症リスクを診断するためのデータを収集する方法であって、
　前記方法が上記工程（ａ）～（ｃ）（好ましくは上記工程（ａ）～（ｄ））を含むことを特徴とする、前記方法；や、
　膵がん、胃がん、大腸がん、十二指腸がん及び胆管がんからなる群から選択される１種又は２種以上のがん（好ましくは膵がん）の有無又は発症リスクの判定（診断）方法におけるバイオマーカーとして使用するための、本件物質群から選択される１又は２種以上の物質であって、
　物質が[Ａグループ]の物質である場合、被検者から採取された判定用血液試料中の前記物質の濃度が、対照となる健常者における前記物質の濃度と比べて低いとき、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いことが示され、
　物質が[Ｂグループ]の物質である場合、被検者から採取された判定用血液試料中の前記物質の濃度が、対照となる健常者における前記物質の濃度と比べて高いとき、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いことが示され、
　被検者から採取された判定用血液試料中のＡＰＯＡ４の部分ペプチド又はＡＰＯＡ１の部分ペプチドの濃度が、対照となる健常血液試料中のＡＰＯＡ４の部分ペプチド又はＡＰＯＡ１の部分ペプチドの濃度と比較して低い程度がより大きいとき、前記被検者が膵がんを有している可能性が高い又は前記被験者における膵がんの発症リスクが高いことが示される、前記物質；
を挙げることができる。
　本発明によると、膵がん、胃がん、大腸がん、十二指腸がん及び胆管がんからなる群から選択される１種又は２種以上のがん（好ましくは膵がん、より好ましくは早期膵がん）の有無又は発症リスクを精度よく判定できる判定方法や、判定用バイオマーカー等を提供することができる。本発明によって膵がんを早期に発見することができれば、早期の段階での治療が可能となり、進行してから発見する場合に比べて５年生存率の大幅な向上が期待できる。
健常群（６６例）及び早期膵がん群（５９例）における血漿中のＩＴＩＨ３ペプチド（ＥＨＬＶＱＡＴＰＥＮＬＱＥＡＲ［配列番号２］）（図１Ａ）、ＡＰＯＡ１ペプチド（ＴＨＬＡＰＹＳＤＥＬＲ［配列番号５］）（図１Ｂ）、及びＡＰＯＡ４ペプチド（ＬＬＰＨＡＮＥＶＳＱＫ［配列番号１２］）（図１Ｃ）の濃度を、質量分析法により定量した結果を示す図である。図中の黒丸は、個々の測定対象者の結果を示す。図中の一番長い横棒線は、中央値を示し、その上下にある横棒線は四分位値（２５％，７５％）を示す。 図２Ａは、３種類の群（健常群（６６例）、早期膵がん群（５９例）、及び前膵がん病変・慢性膵炎群（３０例））における血漿中の上記３種類のペプチドの定量結果を基に、多重ロジスティック回帰分析を用いて予測式（式（１））を設定し、早期膵がん又は前膵がん病変・慢性膵炎の発生確率（図中の縦軸参照）を予測した結果を示す図である。図２Ｂは、上記３種類の群における血漿中の上記３種類のペプチドの定量結果に加えて、ＣＡ１９－９濃度の測定値も組み合わせた多重ロジスティック回帰分析を用いて予測式（式（２））を設定し、早期膵がん又は前膵がん病変・慢性膵炎の発生確率（図中の縦軸参照）を予測した結果を示す図である。図中の黒丸又は灰色丸は、個々の測定対象者の結果を示す。図中の一番長い横棒線は、中央値を示し、その上下にある横棒線は四分位値（２５％，７５％）を示す。 図３Ａは、５種類の群（健常群（４４例）、ステージＩ膵がん群（４例）、ステージＩＩ膵がん群（１９例）、ステージＩＩＩ膵がん群（２６例）、及びステージＩＶ膵がん群（５１例））における血漿中の上記３種類のペプチドの定量結果を基に、図２Ａにおいて多重ロジスティック回帰分析によって設定した式（１）を用いて、各ステージの膵がんの発生確率（図中の縦軸参照）を予測した結果を示す図である。図３Ｂは、図２Ｂの式（２）を用いて血漿中の上記３種類のペプチドの定量結果に加えて、ＣＡ１９－９濃度の測定値も組み合わせて算出し、各ステージの膵がんの発生確率（図中の縦軸参照）を予測した結果を示す図である。図中の黒丸は、個々の測定対象者の結果を示す。図中の一番長い横棒線は、中央値を示し、その上下にある横棒線は四分位値（２５％，７５％）を示す。 図４Ａは、１１種類の群（健常群［ｎ＝４３］、膵がん群［ｎ＝８０］、前膵がん病変・慢性膵炎群［ｎ＝２９］、良性腫瘍群［ｎ＝４３］、肝外胆管がん群［ｎ＝１６］、結腸がん群［ｎ＝１２６］、十二指腸がん群［ｎ＝８］、食道がん群［ｎ＝１０］、肝細胞がん群［ｎ＝１２］、肝内胆管がん群［ｎ＝９］、及び胃がん群［ｎ＝１１９］）における血漿中の上記３種類のペプチドの定量結果を基に、式（１）を用いて、各種がん、良性腫瘍、又は前膵がん病変・慢性膵炎の発生確率（図中の縦軸参照）を予測した結果を示す図である。図４Ｂは、上記１１種類の群における血漿中の上記３種類のペプチドの定量結果に加えて、ＣＡ１９－９濃度の測定値も組み合わせた式（２）を用いて、各種がん、良性腫瘍、又は前膵がん病変・慢性膵炎の発生確率（図中の縦軸参照）を予測した結果を示す図である。図中の黒丸又は灰色丸は、個々の測定対象者の結果を示す。図中の一番長い横棒線は、中央値を示し、その上下にある横棒線は四分位値（２５％，７５％）を示す。 図５は、健常群ｎ＝１０９、早期膵がん群ｎ＝１３９、前膵がん病変群ｎ＝５６、膵炎群ｎ＝５、良性腫瘍群ｎ＝４１、結腸がん群ｎ＝１２６、食道がん群ｎ＝１０、肝細胞がん群ｎ＝１２、胃がん群ｎ＝１１９における血漿中のＡＰＯＡ４ペプチド（ＬＬＰＨＡＮＥＶＳＱＫ［配列番号１２］）の濃度を、質量分析法により定量した結果を示す図である。図中の黒丸は、個々の測定対象者の結果を示す。図中の一番長い横棒線は、中央値を示し、その上下にある横棒線は四分位値（２５％，７５％）を示す。 図６は、２種類の群（健常群（４５例）、並びにステージIII及びIVの膵がん群（４３例））における血漿中の上記３種類のペプチドの定量結果を基に、式（１）を用いて、ステージIII又はIVの膵がんの発生確率（図中の縦軸参照）を予測した結果を示す図である。図中の黒丸は、個々の測定対象者の結果を示す。図中の一番長い横棒線は、その群の中央値を示し、その上下にある横棒線は四分位値（２５％，７５％）を示す。 図７は、図６の結果を基に作成したＲＯＣ曲線を表す。図７のグラフの横軸は、「１００％－特異度（％）」（偽陽性率（％））を表し、縦軸は、「感度（％）」（真陽性率（％））を表す。
　本発明におけるがんの有無又は発症リスクの判定方法としては、
　膵がん、胃がん、大腸がん、十二指腸がん及び胆管がんからなる群から選択される１種又は２種以上のがんの有無又は発症リスクの判定方法であって、
　以下の工程（ａ）～（ｃ）を含むことを特徴とする判定方法（以下、「本件判定方法」とも表示する。）である限り特に制限されない。
（ａ）被検者から採取された判定用血液試料中の、以下の［Ａグループ］及び［Ｂグループ］に記載される物質群から選択される１又は２種以上の物質の濃度（以下、「被検者における物質濃度」とも表示する。）を測定する工程；
［Ａグループ］
　ＡＰＯＡ４の部分ペプチド、ＡＰＯＡ１の部分ペプチド、ＴＴＨＹの部分ペプチド、Ｑ５ＶＹ３０の部分ペプチド、Ｈ０ＹＡＣ１の部分ペプチド、ＢＴＤの部分ペプチド、ＡＰＯＡ４、ＡＰＯＡ１、ＴＴＨＹ、Ｑ５ＶＹ３０、Ｈ０ＹＡＣ１、ＢＴＤ
［Ｂグループ］
ＩＴＩＨ３の部分ペプチド、ＩＴＩＨ３
（ｂ）工程（ａ）で測定した物質の濃度を、対照となる健常血液試料中のその物質の濃度（以下、「対照試料における物質濃度」とも表示する。）と比較する工程；
（ｃ）工程（ａ）で測定した物質が[Ａグループ]の物質である場合、工程（ａ）で測定した物質の濃度が、対照となる健常血液試料中のその物質の濃度と比較して低いとき、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いと評価し、及び／又は、
工程（ａ）で測定した物質が［Ｂグループ］の物質である場合、工程（ａ）で測定した物質の濃度が、対照となる健常血液試料中のその物質の濃度と比較して高いとき、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いと評価する工程；
　本件判定方法は、本発明におけるがんの有無又は発症リスクの高低の、医師による診断を補助する方法であって、医師による診断行為を含まない。
　また、本発明におけるがんの有無の判定用バイオマーカーとしては、
　以下の［Ａグループ］及び［Ｂグループ］に記載される物質群から選択される１又は２種以上の物質からなることを特徴とする、
　膵がん、胃がん、大腸がん、十二指腸がん及び胆管がんからなる群から選択される１種又は２種以上のがんの有無又は発症リスクの判定用バイオマーカーであって、
　物質が[Ａグループ]の物質である場合、被検者から採取された判定用血液試料中の前記物質の濃度が、対照となる健常者における前記物質の濃度と比べて低いとき、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いことが示され、
　物質が[Ｂグループ]の物質である場合、被検者から採取された判定用血液試料中の前記物質の濃度が、対照となる健常者における前記物質の濃度と比べて高いとき、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いことが示される、
　前記判定用バイオマーカー（以下、「本件判定用バイオマーカー」とも表示する。）である限り特に制限されない。
　本発明における工程（ａ）としては、被検者から採取された判定用血液試料中の、以下の［Ａグループ］及び［Ｂグループ］に記載される物質群から選択される１又は２種以上の物質の濃度を測定する工程である限り特に制限されない。
　ＡＰＯＡ４はアポリポプロテインＡ－４を表す。ヒトのＡＰＯＡ４のアミノ酸配列は配列番号２５（UniProtのアクセッションナンバー P06727）に示される。ＡＰＯＡ１はアポリポプロテインＡ－１を表す。ヒトのＡＰＯＡ１のアミノ酸配列は配列番号２６（UniProtのアクセッションナンバー P02647）に示される。ＴＴＨＹはトランスサイレチンを表す。ヒトのＴＴＨＹのアミノ酸配列は配列番号２７（UniProtのアクセッションナンバー P02766）に示される。Ｑ５ＶＹ３０はレチノール結合タンパク質４を表す。ヒトのレチノール結合タンパク質４のアミノ酸配列は配列番号２８（UniProtのアクセッションナンバー P02753）に示されるほか、UniProtアクセッションナンバー Q5VY30（ヒトのレチノール結合タンパク質４のアイソフォーム）にも示される。Ｈ０ＹＡＣ１は血漿カリクレイン重鎖１を表す。ヒトの血漿カリクレイン重鎖１のアミノ酸配列は配列番号２９（UniProtのアクセッションナンバー P03952）に示されるほか、UniProtアクセッションナンバー H0YAC1にも示され、また、ヒトの血漿カリクレイン重鎖１の一部のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列がUniProtアクセッションナンバーE9PBC5、B4DMX2、A8K9A9にも示される。ＢＴＤはビオチダーゼを表す。ヒトビオチダーゼのアミノ酸配列は配列番号３０（UniProtのアクセッションナンバーP43251）に示される。ＩＴＩＨ３はインターαトリプシンインヒビター重鎖３を表す。ヒトのインターαトリプシンインヒビター重鎖３のアミノ酸配列は配列番号３１（UniProtのアクセッションナンバーQ06033）に示される。
　本発明における「部分ペプチド」とは、一般的に「部分タンパク質」と呼ばれるものをも含む。本発明において、あるタンパク質の「部分ペプチド」とは、そのタンパク質のアミノ酸配列中の任意の連続する５個以上（好ましくは７個以上、より好ましくは９個以上、さらに好ましくは１１個以上）のアミノ酸からなるペプチドを意味する。本発明における「部分ペプチド」としては、対応する特定のタンパク質の全長のアミノ酸配列（以下、「対応する全長アミノ酸配列」とも表示する。）のうち、一部のアミノ酸配列からなる限り、アミノ酸数の上限に特に制限はなく、対応する全長アミノ酸配列のアミノ酸数よりも１個又は２個以上少ないアミノ酸数であればよいが、対応する全長アミノ酸配列のアミノ酸数に対して９０％以下、７０％以下、５０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下のアミノ酸数が挙げられる。なお、対応する全長アミノ酸配列のアミノ酸数に対して特定の割合（％）のアミノ酸数を算出する場合、小数点以下の数値は切り捨てることとする。本発明における「部分ペプチド」のアミノ酸数の上限の具体例としては、１００個以下、５０個以下、３０個以下、２０個以下、１８個以下、１５個以下が挙げられる。本発明における「部分ペプチド」のアミノ酸数の好適な範囲の具体例として、５～１００個、５～５０個、７～３０個、７～２０個、９～１８個、１１～１５個が好ましく挙げられる。
　本発明における「部分ペプチド」のアミノ酸配列は、対応する全長アミノ酸配列に基づいて適宜設定することができる。例えば、ＡＰＯＡ４の部分ペプチドは、ＡＰＯＡ４の全長アミノ酸配列（配列番号２５）中の任意の連続する５個以上（好ましくは７個以上、より好ましくは９個以上、さらに好ましくは１１個以上）のアミノ酸を選択することにより適宜設定することができる。
　本発明における「部分ペプチド」としては、プロテアーゼで消化されたペプチド（本明細書において「プロテアーゼ消化ペプチド」とも表示する。）が好ましく挙げられ、かかるペプチドは、物質の濃度を質量分析法で測定する場合に特に好ましく挙げられる。上記プロテアーゼとしては、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、ブロメライン、エラスターゼ、クロストリパイン、Ｖ８プロテアーゼ、サーモリシン、リシルエンドペプチダーゼ、アルギニンエンドペプチダーゼ、プロリルエンドペプチダーゼ、アスパラギン酸－Ｎプロテアーゼ等が挙げられ、中でも、トリプシンが特に好ましく挙げられる。
　本発明における「部分ペプチド」として、具体的には、以下の表１～７に記載のトリプシン消化ペプチドが特に好ましく挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
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Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　本発明において、物質としては、本件物質群から選択される１又は２種以上（例えば３種以上、４種以上又は５種以上）の物質であればよいが、より高い判定精度を得る観点から、ＡＰＯＡ４の部分ペプチド、ＡＰＯＡ１の部分ペプチド、ＩＴＩＨ３の部分ペプチド、ＡＰＯＡ４、ＡＰＯＡ１及びＩＴＩＨ３からなる群から選択される１種又は２種以上（例えば３種以上、４種以上又は５種以上）や、ＡＰＯＡ４の部分ペプチド、ＡＰＯＡ１の部分ペプチド、ＴＴＨＹの部分ペプチド、Ｑ５ＶＹ３０の部分ペプチド、Ｈ０ＹＡＣ１の部分ペプチド、ＢＴＤの部分ペプチド及びＩＴＩＨ３の部分ペプチドからなる群から選択される１種又は２種以上（例えば３種以上、４種以上又は５種）が好ましく挙げられ、ＡＰＯＡ４の部分ペプチド、ＡＰＯＡ１の部分ペプチド及びＩＴＩＨ３の部分ペプチドからなる群から選択される１種、好ましくは２種、より好ましくは３種がより好ましく挙げられ、ＡＰＯＡ４のプロテアーゼ消化ペプチド、ＡＰＯＡ１のプロテアーゼ消化ペプチド及びＩＴＩＨ３プロテアーゼ消化ペプチドからなる群から選択される１種、好ましくは２種、より好ましくは３種がさらに好ましく挙げられ、ＡＰＯＡ４のトリプシン消化ペプチド、ＡＰＯＡ１のトリプシン消化ペプチド及びＩＴＩＨ３トリプシン消化ペプチドからなる群から選択される１種、好ましくは２種、より好ましくは３種がさらにより好ましく挙げられる。
　ＡＰＯＡ４のトリプシン消化ペプチドとして、具体的には、配列番号５～１４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられ、より高い判定精度を得る観点から、配列番号６～１４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドが好ましく、配列番号９～１４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドがより好ましく、配列番号１０、１２～１４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドがさらに好ましく、配列番号１２又は１４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドがさらにより好ましく、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるペプチドが最も好ましく挙げられる。また、膵がんと、他のがん（胆管がん、結腸がん、十二指腸がん、及び胃がん）を判別する観点からは、配列番号９、１０、１２に示されるアミノ酸配列からなるペプチドが好ましい。ＩＴＩＨ３のトリプシン消化ペプチドとして、具体的には、配列番号１～３に示されるアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられ、より高い判定精度を得る観点から、配列番号２又は３に示されるアミノ酸配列からなるペプチドが好ましく挙げられ、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチドがより好ましく挙げられる。ＴＴＨＹのトリプシン消化ペプチドとして、具体的には、配列番号２３又は２４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられ、より高い判定精度を得る観点から、配列番号２３に示されるアミノ酸配列からなるペプチドが好ましく挙げられる。
　本発明において判定や診断の対象となる本発明におけるがんとしては、膵がん、胃がん、大腸がん、十二指腸がん及び胆管がんからなる群から選択される１種又は２種以上（例えば３種以上、４種以上又は５種）のがんである限り特に制限されないが、中でも、膵がん、又は膵がんを含む２種以上（例えば３種以上、４種以上又は５種）のがんであることが好ましく、中でも、膵がんがより好ましく、中でも、早期膵がんが特に好ましい。早期膵がんとは、ステージ０、ステージＩ又はステージIIの膵がんを意味する。
　上記被検者としては、ヒトである限り特に制限されないが、本発明におけるがんのうち、少なくとも１種のがん（好ましくは膵がん）の有無又は発症リスクが不明であるヒトであることが好ましく、本発明におけるがんのうち、好ましくは２種以上（好ましくは、膵がんを含む２種以上のがん）、より好ましくは３種以上（好ましくは、膵がんを含む３種以上のがん）、さらに好ましくは４種以上（好ましくは、膵がんを含む４種以上のがん）、より好ましくは５種のがんの有無又は発症リスクが不明であるヒトが好ましく挙げられる。
　本発明において測定の対象とする判定用血液試料としては、被検者から採取された血清、血漿、全血などが挙げられ、中でも血清が好ましく挙げられる。
　本発明における工程（ｂ）としては、工程（ａ）で測定した物質の濃度を、対照となる健常血液試料中のその物質の濃度と比較する工程である限り特に制限されない。
　本発明において、判定用血液試料中の本件物質群の濃度は、採取された判定用血液試料中の本件物質群を特異的に検出できる公知の方法、例えば、質量分析法を用いて測定することができる。かかる質量分析法とは、判定用血液試料中に含まれる本件物質群を、イオン源を用いて気体状のイオンとし（イオン化）、分析部において、真空中で運動させ電磁気力を用いて、或いは飛行時間差によりイオン化した血液試料を質量電荷比に応じて分離し、検出できる質量分析計を用いた測定方法のことをいう。上記のイオン源を用いてイオン化する方法としては、例えば、電子イオン化（ＥＩ）法、化学イオン化（ＣＩ）法、電界脱離イオン化（ＦＤ）法、高速原子衝撃（ＦＡＢ）法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法を挙げることができる。また、分析部において、各種イオン化法によりイオン化した本件物質群は、アナライザーで質量に応じて分離される。かかるアナライザーとしては、例えば、磁場型質量分離装置（Ｓｅｃｔｏｒ ＭＳ）、四重極型質量分離装置（ＱＭＳ）、飛行時間型質量分離装置（ＴＯＦＭＳ）、フーリエ変換イオンサイクロトロン型質量分離装置（ＦＴ－ＩＣＲＭＳ）を挙げることができ、さらにこれらを組み合わせたものでもよい。また、２以上の質量分析法を組み合わせたタンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を利用することができる。また、ガスクロマトグラフ（ＧＣ）、液体クロマトグラフ（ＬＣ）、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）、超高速液体クロマトグラフ（ＵＨＰＬＣ）により、判定用血液試料中に含まれる本件物質群を、夾雑物から分離・精製して分析することができる。かかるＬＣ、ＨＰＬＣ、及びＵＨＰＬＣとしては、陽イオン又は陰イオン交換クロマトグラフや、順相又は逆相クロマトグラフを挙げることができ、これらを組み合わせたものであってもよい。
　本発明において、判定用血液試料中の本件物質群の濃度は、絶対値であっても、相対値であってもよく、相対値とする場合、例えば、濃度が既知の本件物質群（内部標準）を基準とした相対値を挙げることができる。
　本発明において、「対照となる健常血液試料中のその物質の濃度」（「対照試料における物質濃度」）は、比較対象である「被検者における物質濃度」に対応するものを用いる。このため、「被検者における物質濃度」が絶対値である場合は、「対照試料における物質濃度」も絶対値を用い、「被検者における物質濃度」が相対値である場合は、「対照試料における物質濃度」も相対値を用いる。上記「対照となる健常血液試料中のその物質の濃度」は、本件判定方法等を実施する際、健常者（対照者）から採取された血液試料（すなわち「健常血液試料」）を用いてその都度測定してもよいが、予め測定したものを用いてもよい。また、上記健常血液試料は、被検者由来の判定用血液試料と同種の血液試料を用いることが好ましく、例えば、被検者由来の判定用血液試料が血清、血漿又は全血である場合は、健常血液試料もそれと同種の血液試料を用いることが好ましい。また、健常血液試料は、健常者から採取された後に、被検者由来の判定用血液試料と同様の処理が施されたものが好ましい。
　本発明における工程（ｂ）の好ましい態様としては、工程（ａ）で測定した２種以上の物質の各濃度と、対照となる健常血液試料中の２種以上の物質の各濃度とを、２種以上の物質の各濃度を変数とする多変量解析における予測式（以下、「多変量解析方程式」とも表示する。）に代入して得た予測値を比較する工程が好ましく挙げられる。
　上記の「多変量解析」としては、多変量解析が、多重ロジスティック回帰分析又は重回帰分析が好ましく挙げられ、中でも、多重ロジスティック回帰分析がより好ましく挙げられ、ステップワイズ法の多重ロジスティック回帰分析がさらに好ましく挙げられる。これらの多変量解析により、上記の予測式を算出することや、その予測式に物質の各濃度を代入して予測値を得ること等は、市販のデータ解析ソフトウェアを用いて行うことができる。早期膵がん群と健常群における、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（すなわち、ＡＰＯＡ４のトリプシン消化ペプチド）、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（すなわち、ＡＰＯＡ１のトリプシン消化ペプチド）、及び、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（すなわち、ＩＴＩＨ３トリプシン消化ペプチド）の３種の濃度（ピーク強度）を、多重ロジスティック回帰分析して算出した予測式（式（１））を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000008
　なお、式（１）中、「ＳＥＱ．２」は、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（すなわち、ＩＴＩＨ３トリプシン消化ペプチド）のピーク強度を示し、「ＳＥＱ．５」は、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（すなわち、ＡＰＯＡ１のトリプシン消化ペプチド）のピーク強度を示し、「ＳＥＱ．１２」は、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（すなわち、ＡＰＯＡ４のトリプシン消化ペプチド）のピーク強度を示す。被検者における上記３種のペプチドのピーク強度をこの予測式に代入した場合、その被検者が本発明におけるがん（好ましくは膵がん、より好ましくは早期膵がん）である確率が高いほど、又は、かかるがんの発症リスクが高いほど、予測式により得られる予測値の値が高くなる。
　本発明における工程（ｃ）において、
　工程（ａ）で測定した物質が上記［Ａグループ］の物質である場合、工程（ａ）で測定した「被検者における物質濃度」が、「対照試料における物質濃度」よりも低いとき、前記被検者が本発明におけるがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いと評価（判定）し、及び／又は、
　工程（ａ）で測定した物質が上記［Ｂグループ］の物質である場合、工程（ａ）で測定した「被検者における物質濃度」が、「対照試料における物質濃度」よりも高いとき、前記被検者が本発明におけるがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いと評価（判定）する。
　「被検者における物質濃度」が、「対照試料における物質濃度」よりも低いか否か、或いは高いか否かを判定するための閾値（カットオフ値）は、当業者であれば、物質の種類等に応じて適宜設定することができる。かかる閾値としては、例えば、「対照試料における物質濃度」の平均値（以下、単に「平均値」とも表示する。）、「平均値＋標準偏差（ＳＤ）」、「平均値＋２ＳＤ」、「平均値＋３ＳＤ」、「対照試料における物質濃度」の中央値（以下、単に「中央値」とも表示する。）、「中央値＋ＳＤ」、「中央値＋２ＳＤ」、「中央値＋３ＳＤ」、「対照試料における物質濃度」の四分位値（２５％値又は７５％値）等を挙げることができる。また、その他の閾値として、対照試料群（例えば１０～２０名の健常者からなる健常者群）における物質の濃度の平均値と、本発明におけるがんのいずれか１種の患者群（例えば１０～２０名の患者からなる患者群）におけるその物質の濃度の平均値とを平均した値；や、対照試料群（例えば１０～２０名の健常者からなる健常者群）における物質の濃度の中央値と、本発明におけるがんのいずれか１種の患者群（例えば１０～２０名の患者からなる患者群）におけるその物質の濃度の中央値とを平均した値；も挙げることができる。また、閾値は、「感度」（本発明におけるがんを有している者を、陽性（がんを有している可能性が高い）と正しく判定できる割合）と、「特異度」（本発明におけるがんを有していない者を、陰性（がんを有している可能性が低い）と正しく判定できる割合）とが高くなるように、「被検者における物質濃度」のデータと、「対照試料における物質濃度」のデータを基に、統計解析ソフトウェアを用いたＲＯＣ（Receiver Operating Characteristic）曲線を用いて算出することもできる。ＲＯＣ曲線を用いて閾値を算出する具体的な方法は例えば以下のとおりである。
統計解析ソフトウェア等を用いてＲＯＣ曲線を描く際に、感度と特異度が変化する全ての測定値（ペプチド濃度の測定値）を提示することができる。その全ての測定値における感度、特異度について、ＲＯＣ曲線のグラフの左上の端の点（感度＝１、１－特異度＝０）からの距離を以下の式で算出し、その距離が最も小さい測定値を閾値として採用することができる。
（ＲＯＣ曲線のグラフの左上の端の点からの距離）２＝（１－感度）２＋（１－特異度）２
また、感度と特異度の和が最大となる値（Youden's index）を閾値として採用することもできる。
　本発明において、本発明におけるがんの判定精度（診断制度）としては、本発明におけるがんのうち、少なくともいずれか１種のがん（好ましくは膵がん、より好ましくは早期膵がん）の感度及び特異度が共に、０．６以上、好ましくは０．６５以上、より好ましくは０．７以上、さらに好ましくは０．７５以上、より好ましくは０．８以上、さらに好ましくは０．８５以上、より好ましくは０．９以上であることが好適に挙げられる
　本発明において、物質が上記［Ａグループ］の物質である場合、被検者におけるその物質の濃度が、「対照試料における物質濃度」よりもどの程度低下したときに、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いと評価することができるかは、本発明におけるがんの種類やその者の個人的な特徴等により異なるため、一概に特定することはできないが、好ましくは１０％以上の減少、より好ましくは１５％以上の減少、さらに好ましくは２０％以上の減少、さらにより好ましくは３０％以上の減少が挙げられ、これらの数値は本発明におけるがんが膵がん（好ましくは、早期膵がん）である場合に好適に適用できる。より具体的には、[Ａグループ]の物質がＡＰＯＡ１の部分ペプチド、又は、ＡＰＯＡ１である場合の、上記の低下する程度としては、好ましくは１０％以上の減少、より好ましくは１５％以上の減少、さらに好ましくは２０％以上の減少、さらにより好ましくは３０％以上の減少、より好ましくは３５％以上の減少が挙げられ、これらの数値は本発明におけるがんが膵がん（好ましくは、早期膵がん）である場合に好適に適用できる。また、[Ａグループ]の物質がＡＰＯＡ４の部分ペプチド、又は、ＡＰＯＡ４である場合の、上記の低下する程度としては、好ましくは１０％以上の減少、より好ましくは１５％以上の減少、さらに好ましくは２０％以上の減少、さらにより好ましくは３０％以上の減少、より好ましくは３５％以上の減少が挙げられ、これらの数値は本発明におけるがんが膵がん（好ましくは、早期膵がん）である場合に好適に適用できる。
　本発明において、物質が上記［Ｂグループ］の物質である場合、被検者におけるその物質の濃度が、「対照試料における物質濃度」よりもどの程度上昇したときに、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いと評価することができるかは、本発明におけるがんの種類やその者の個人的な特徴等により異なるため、一概に特定することはできないが、好ましくは１０％以上の上昇、より好ましくは１５％以上の上昇、さらに好ましくは２０％以上の上昇、さらにより好ましくは３０％以上の上昇、より好ましくは３５％以上の上昇が挙げられ、これらの数値は本発明におけるがんが膵がん（好ましくは、早期膵がん）である場合に好適に適用できる。より具体的には、[Ｂグループ]の物質がＩＴＩＨ３の部分ペプチド、又は、ＩＴＩＨ３である場合の、上記の上昇する程度としては、好ましくは１０％以上の上昇、より好ましくは１５％以上の上昇、さらに好ましくは２０％以上の上昇、さらにより好ましくは３０％以上の上昇、より好ましくは３５％以上の上昇が挙げられ、これらの数値は本発明におけるがんが膵がん（好ましくは、早期膵がん）である場合に好適に適用できる。
　本発明において、工程（ｂ）が、工程（ａ）で測定した２種以上の物質の各濃度と、対照となる健常血液試料中の２種以上の物質の各濃度とを、２種以上の物質の各濃度を変数とする多変量解析における予測式に代入して得た予測値を比較する工程である場合は、工程（ｃ）として以下の工程が好ましく挙げられる。
　工程（ｂ）における予測式が、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い場合又は前記がんの発症リスクが高い場合に予測値が高くなる予測式である場合には、工程（ｃ）は、被検者について得られた予測値が健常血液試料について得られた予測値よりも高いときに、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いと評価する工程であり、
　工程（ｂ）における予測式が、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い場合又は前記がんの発症リスクが高い場合に予測値が低くなる予測式である場合には、工程（ｃ）は、被検者について得られた予測値が健常血液試料について得られた予測値よりも低いときに、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いと評価する工程；
　本発明のより好適な態様として、
　[Ｂグループ]がさらにＣＡ１９－９抗原を含んでおり、
　工程（ａ）で濃度を測定する物質が、［Ａグループ］及び［Ｂグループ］に記載される物質群から選択される２種以上の物質であって、少なくともＣＡ１９－９抗原を含んでいることが挙げられる。判定にさらにＣＡ１９－９抗原の濃度を用いると、膵がんの判定精度をより高めることができる場合がある。
　早期膵がん群と健常群における、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（すなわち、ＡＰＯＡ４のトリプシン消化ペプチド）、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（すなわち、ＡＰＯＡ１のトリプシン消化ペプチド）、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（すなわち、ＩＴＩＨ３トリプシン消化ペプチド）、及び、ＣＡ１９－９抗原の４種の濃度（ピーク強度）を、多重ロジスティック回帰分析して算出した予測式（式（２））を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000009
　なお、式（２）中、「ＳＥＱ．２」は、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（すなわち、ＩＴＩＨ３トリプシン消化ペプチド）のピーク強度を示し、「ＳＥＱ．５」は、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（すなわち、ＡＰＯＡ１のトリプシン消化ペプチド）のピーク強度を示し、「ＳＥＱ．１２」は、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（すなわち、ＡＰＯＡ４のトリプシン消化ペプチド）のピーク強度を示し、「ＣＡ１９．９」は、ＣＡ１９－９のピーク強度を示す。被検者における上記４種のピーク強度をこの予測式に代入した場合、その被検者が本発明におけるがん（好ましくは膵がん、より好ましくは早期膵がん）である確率が高いほど、又は、かかるがんの発症リスクが高いほど、予測式により得られる予測値の値が高くなる。また、式（２）の予測式は、前述の式（１）の予測式よりも本発明におけるがん（好ましくは膵がん、より好ましくは早期膵がん）の判定精度が高い点で好ましく挙げられる。
　工程（ｂ）における予測式が、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い場合又は前記がんの発症リスクが高い場合に予測値が高くなる予測式である場合には、工程（ｃ）において、本発明におけるがんのいずれか１種を有する者におけるその予測値が、対照試料におけるその予測値よりも上昇する程度としては、本発明におけるがんの種類や、その者の個人的な特徴や、予測式の内容等により異なるため、一概に特定することはできないが、好ましくは１０％以上の上昇、より好ましくは３０％以上の上昇、さらに好ましくは５０％以上の上昇、さらにより好ましくは８０％以上の上昇、より好ましくは１００％以上の上昇、さらに好ましくは１５０％以上の上昇、さらにより好ましくは２００％以上の上昇、より好ましくは３００％以上の上昇が挙げられ、これらの数値は本発明におけるがんが膵がん（好ましくは、早期膵がん）である場合に好適に適用できる。
　工程（ｂ）における予測式が、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い場合又は前記がんの発症リスクが高い場合に予測値が低くなる予測式である場合には、工程（ｃ）において、本発明におけるがんのいずれか１種を有する者におけるその予測値が、対照試料におけるその予測値よりも減少する程度としては、本発明におけるがんの種類や、その者の個人的な特徴や、予測式の内容等により異なるため、一概に特定することはできないが、好ましくは１０％以上の減少、より好ましくは３０％以上の減少、さらに好ましくは５０％以上の減少、さらにより好ましくは８０％以上の減少、より好ましくは１００％以上の減少、さらに好ましくは１５０％以上の減少、さらにより好ましくは２００％以上の減少、より好ましくは３００％以上の減少が挙げられ、これらの数値は本発明におけるがんが膵がん（好ましくは、早期膵がん）である場合に好適に適用できる。
　本発明における判定方法等のより好適な態様として、物質が、ＡＰＯＡ４の部分ペプチド又はＡＰＯＡ１の部分ペプチドを少なくとも含んでおり、
　判定方法等が、工程（ａ）で測定したＡＰＯＡ４の部分ペプチド又はＡＰＯＡ１の部分ペプチドの濃度が、対照となる健常血液試料中のＡＰＯＡ４の部分ペプチド又はＡＰＯＡ１の部分ペプチドの濃度と比較して低い程度がより大きいとき、前記被検者が膵がんを有している可能性が高い又は前記被験者における膵がんの発症リスクが高いと評価する（好ましくは、被検者が、胃がん、肝細胞癌、食道がん、結腸がんではなく、膵がんを有している可能性が高い又は前記被験者における膵がんの発症リスクが高いと評価する、より好ましくは、被検者が、胃がん、肝細胞癌、食道がんではなく、膵がんを有している可能性が高い又は前記被験者における膵がんの発症リスクが高いと評価する）工程（ｄ）をさらに含む判定方法等が挙げられる。また、本発明における判定用バイオマーカーのより好適な態様として、物質が、ＡＰＯＡ４の部分ペプチド又はＡＰＯＡ１の部分ペプチドを少なくとも含んでおり、
　被検者から採取された判定用血液試料中のＡＰＯＡ４の部分ペプチド又はＡＰＯＡ１の部分ペプチドの濃度が、対照となる健常血液試料中のＡＰＯＡ４の部分ペプチド又はＡＰＯＡ１の部分ペプチドの濃度と比較して低い程度がより大きいとき、前記被検者が膵がんを有している可能性が高い又は前記被験者における膵がんの発症リスクが高いことが示される（好ましくは、被検者が、胃がん、肝細胞癌、食道がん、結腸がんではなく、膵がんを有している可能性が高い又は前記被験者における膵がんの発症リスクが高いことが示される、より好ましくは、被検者が、胃がん、肝細胞癌、食道がんではなく、膵がんを有している可能性が高い又は前記被験者における膵がんの発症リスクが高いことが示される）判定用バイオマーカーが挙げられる。
　以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
１．ヒト血清からのペプチド試料の調製
　以下の方法で、ヒト血清からペプチド試料を調製した。
１－１　方法
　ヒトから血清を採取し、尿素溶液中でタンパク質変性処理を行った後、ペプチダーゼによる消化処理を行い、ペプチド試料を調製した。より具体的には、ヒトから採取した血清を１０分の１に希釈した希釈血清１０μＬに、８Ｍ尿素溶液１５μＬを添加して、タンパク質変性処理を行った後、還元アルキル化を行い、次いで、リジルエンドペプチダーゼ及びトリプシンで処理して、ペプチド試料を調製した。
２．早期膵がんの判定用バイオマーカーの候補のスクリーニング
　早期膵がんの判定用バイオマーカーの候補をスクリーニングするために、早期膵がん患者由来の血清試料を用いたＳＷＡＴＨ－ＭＳ測定法を行った。
２－１　方法
　早期膵がん群（ステージI［６名］及びステージII［２４名］の早期膵がん患者３０名
［男性１８名、女性１２名］）と、比較対照として健常群（健常者３０名［男性１３名、女性１７名］）から血清を採取し、上記実施例１の「方法」の項目に記載の方法に従ってペプチド試料を調製した。ナノＬＣシステム（Ultimate 3000 RSLCnano；DIONEX社製）を、正イオン化モードで作動させたナノＥＳＩ－質量分析計（TripleTOF 5600； SCIEX社製）に接続し、ＩＤＡ測定法及びＳＷＡＴＨ－ＭＳ測定法を用いて、調製したペプチド試料を分析した。
２－２　結果
　早期膵がん群と、健常群との間で発現が変動するペプチドとして、１１種類のタンパク質（ＩＴＩＨ３、Ｑ５ＶＹ３０、ＡＰＯＡ１、ＡＰＯＡ４、ＢＴＤ、Ｈ０ＹＡＣ１、ＫＮＧ１、ＡＰＯＢ、ＦＥＴＵＡ、ＡＰＯＥ、及びＴＴＨＹ）を構成する、以下の２４種類のペプチドが同定された。
３種類のＩＴＩＨ３ペプチド（ＥＶＳＦＤＶＥＬＰＫ［配列番号１］、ＥＨＬＶＱＡＴＰＥＮＬＱＥＡＲ［配列番号２］、及びＤＹＩＦＧＮＹＩＥＲ［配列番号３］）；
１種類のＱ５ＶＹ３０ペプチド（ＹＷＧＶＡＳＦＬＱＫ［配列番号４］）；
１種類のＡＰＯＡ１ペプチド（ＴＨＬＡＰＹＳＤＥＬＲ［配列番号５］）；
９種類のＡＰＯＡ４ペプチド（ＳＥＬＴＱＱＬＮＡＬＦＱＤＫ［配列番号６］、ＬＧＥＶＮＴＹＡＧＤＬＱＫ［配列番号７］、ＥＡＶＥＨＬＱＫ［配列番号８］、ＳＬＡＰＹＡＱＤＴＱＥＫ［配列番号９］、ＳＬＡＥＬＧＧＨＬＤＱＱＶＥＥＦＲ［配列番号１０］、ＩＳＡＳＡＥＥＬＲ［配列番号１１］、ＬＬＰＨＡＮＥＶＳＱＫ［配列番号１２］、ＬＡＰＬＡＥＤＶＲ［配列番号１３］、及びＩＤＱＴＶＥＥＬＲ［配列番号１４］）；
１種類のＢＴＤペプチド（ＬＳＳＧＬＶＴＡＡＬＹＧＲ［配列番号１５］）；
１種類のＨ０ＹＡＣ１ペプチド（ＩＡＹＧＴＱＧＳＳＧＹＳＬＲ［配列番号１６］）；
１種類のＫＮＧ１ペプチド（ＹＦＩＤＦＶＡＲ［配列番号１７］）；
３種類のＡＰＯＢペプチド（ＡＬＶＤＴＬＫ［配列番号１８］、ＬＳＬＰＤＦＫ［配列番号１９］、及びＩＴＬＰＤＦＲ［配列番号２０］）；
１種類のＦＥＴＵＡペプチド（ＡＨＹＤＬＲ［配列番号２１］）；
１種類のＡＰＯＥペプチド（ＬＡＶＹＱＡＧＡＲ［配列番号２２］）； 
２種類のＴＴＨＹペプチド（ＡＡＤＤＴＷＥＰＦＡＳＧＫ［配列番号２３］、及びＧＳＰＡＩＮＶＡＶＨＶＦＲ［配列番号２４］；
３．早期膵がんの判定用バイオマーカーの同定
　実施例２のスクリーニングにより得られた２４種類のペプチドの中から、早期膵がんの判定用バイオマーカーを同定するために、ＭＲＭ測定法による定量解析を行った。その際、測定対象の早期膵がん患者と、比較対照の健常者の人数も増やして解析を行った。
３－１　方法
　早期膵がん群（ステージI［８名］及びステージII［５１名］の早期膵がん患者５９名
［男性３７名、女性２２名］）と、比較対照として健常群（健常者６６名［男性３１名、女性３５名］）から血漿を採取し、上記実施例１の「方法」の項目に記載の方法に従ってペプチド試料を調製し、マイクロＬＣシステム（microLC200；eksigent社製）を、正イオン化モードで作動させたナノＥＳＩ－三連四重極型質量分析計（QTRAP6500；SCIEX社製）に接続し、ＭＲＭ測定法を用いて、調製したペプチド試料中の上記２４種類のペプチドのピーク強度（すなわちピーク面積）を測定し、既知の濃度のペプチド（測定対象のペプチドと同じアミノ酸配列からなる、安定同位体標識ペプチド）のピーク強度（すなわちピーク面積）に対する相対値（例えば、図１の縦軸の「ピーク強度」に相当）を算出した。また、算出した定量値を基に、OriginPro（Light Stone株式会社製）を用いてＲＯＣ曲線を作成し、早期膵がん群と健常群の間で、ＡＵＣ値が０．７超を示すペプチドを、早期膵がんの判定用バイオマーカーとして同定した。また、早期膵がんの判定用バイオマーカーとして同定した各ペプチドのそれぞれについて閾値を設定し、早期膵がんの感度と特異度を算出した。
３－２　結果
　実施例２のスクリーニングにより得られた２４種類のペプチドのうち、７種類のタンパク質（ＩＴＩＨ３、Ｑ５ＶＹ３０、ＡＰＯＡ１、ＡＰＯＡ４、ＢＴＤ、Ｈ０ＹＡＣ１、及びＴＴＨＹ）を構成する、以下の１７種類のペプチドが、早期膵がんの判定用バイオマーカーとして同定された（表８参照）。
２種類のＩＴＩＨ３ペプチド（ＥＨＬＶＱＡＴＰＥＮＬＱＥＡＲ［配列番号２］、及びＤＹＩＦＧＮＹＩＥＲ［配列番号３］）；
１種類のＱ５ＶＹ３０ペプチド（ＹＷＧＶＡＳＦＬＱＫ［配列番号４］）；
１種類のＡＰＯＡ１ペプチド（ＴＨＬＡＰＹＳＤＥＬＲ［配列番号５］）；
９種類のＡＰＯＡ４ペプチド（ＳＥＬＴＱＱＬＮＡＬＦＱＤＫ［配列番号６］、ＬＧＥＶＮＴＹＡＧＤＬＱＫ［配列番号７］、ＥＡＶＥＨＬＱＫ［配列番号８］、ＳＬＡＰＹＡＱＤＴＱＥＫ［配列番号９］、ＳＬＡＥＬＧＧＨＬＤＱＱＶＥＥＦＲ［配列番号１０］、ＩＳＡＳＡＥＥＬＲ［配列番号１１］、ＬＬＰＨＡＮＥＶＳＱＫ［配列番号１２］、ＬＡＰＬＡＥＤＶＲ［配列番号１３］、及びＩＤＱＴＶＥＥＬＲ［配列番号１４］）；
１種類のＢＴＤペプチド（ＬＳＳＧＬＶＴＡＡＬＹＧＲ［配列番号１５］）；
１種類のＨ０ＹＡＣ１ペプチド（ＩＡＹＧＴＱＧＳＳＧＹＳＬＲ［配列番号１６］）；
２種類のＴＴＨＹペプチド（ＡＡＤＤＴＷＥＰＦＡＳＧＫ［配列番号２３］、及びＧＳＰＡＩＮＶＡＶＨＶＦＲ［配列番号２４］）；
　かかる７種類のバイオマーカータンパク質のうち、ＩＴＩＨ３は、健常者と比べ早期膵がん患者において増加するのに対して、残りの６種類のタンパク質（Ｑ５ＶＹ３０、ＡＰＯＡ１、ＡＰＯＡ４、ＢＴＤ、Ｈ０ＹＡＣ１、及びＴＴＨＹ）は、健常者と比べ早期膵がん患者において減少するバイオマーカーである（表８参照）。早期膵がんの判定用バイオマーカーとして同定した各ペプチドのうち、血漿中のＩＴＩＨ３ペプチド（ＥＨＬＶＱＡＴＰＥＮＬＱＥＡＲ［配列番号２］）（図１Ａ）、ＡＰＯＡ１ペプチド（ＴＨＬＡＰＹＳＤＥＬＲ［配列番号５］）（図１Ｂ）、及びＡＰＯＡ４ペプチド（ＬＬＰＨＡＮＥＶＳＱＫ［配列番号１２］）（図１Ｃ）の濃度を、質量分析法により定量した結果をそれぞれ、図１Ａ、図１Ｂ及び図１Ｃに示す。また、早期膵がんの判定用バイオマーカーとして同定した各ペプチドのそれぞれについて閾値を設定し、早期膵がんの判定における感度と特異度を算出した結果も表８に示す。早期膵がんの判定用バイオマーカーとして同定した各ペプチドは、早期膵がんの判定において、好適な感度と特異度を示した。なお、上記の閾値は以下のように算出した。OriginPro（Light Stone株式会社製）を用いてＲＯＣ曲線を描く際に、感度と特異度が変化する全ての測定値（ペプチド濃度の測定値）が提示される。その全ての測定値における感度、特異度について、ＲＯＣ曲線のグラフの左上の端の点（感度＝１、１－特異度＝０）からの距離を以下の式で算出し、その距離が最も小さい測定値を表８における閾値として採用した。
（ＲＯＣ曲線のグラフの左上の端の点からの距離）２＝（１－感度）２＋（１－特異度）２
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　表８中の「比率」は、各ペプチドについて、健常群に対する早期膵がん群の定量値の比率を示す。
４．バイオマーカーペプチドの組合せによる早期膵がんの判定
　早期膵がん群及び健常群から採取した血漿を用いて、腫瘍マーカー（ＣＡ１９－９）測定ＥＬＩＳＡキットによりＣＡ１９－９濃度を測定し、両群を判別すると、ＡＵＣ値は０．８６１９であり、また、閾値を２４．９に設定した場合の感度及び特異度は、それぞれ７７．９７％及び８１．５４％であった。すなわち、本実施例で同定された１７種類のペプチド（表８参照）単独では、既存のがんマーカー（ＣＡ１９－９）よりも、早期膵がんの精度を上回るものはなかった。そこで、ＣＡ１９－９よりも精度よく早期膵がんを判定できるペプチドの組合せの探索を試みた。なお、感度や特異度の数値から、ＣＡ１９－９が早期膵がんの判定マーカーとして十分な精度を持っているようにも見えるがそれは正しくない。ＣＡ１９－９は消化器系のがんのマーカーとして人間ドック等の検診などでも用いられており、血液中のＣＡ１９－９濃度が高い被検者がその後精密検査を受けて、消化器のいずれかにがんがあるかを調べる。すなわち、現状では、数少ない早期膵がん患者の多くは、ＣＡ１９－９濃度が高いことをきっかけに早期膵がんを発見した者であるため、早期膵がんとＣＡ１９－９濃度の相関関係が見かけ上、高くなっていると考えられる。しかし、実際は、膵がんは早期ではほとんどが見過ごされており、ＣＡ１９－９は早期膵がんのマーカーとしての実用性は低いと考えられる。
４－１　方法
　表８に示す１７種類のペプチドについて、実施例３で得られた早期膵がん群及び健常群における定量結果を基に、或いは、かかる定量結果に加えて、血漿中のＣＡ１９－９濃度の測定値を基に、統計解析ソフト（「EZR on R commander」、Version 1.33）を用いた多重ロジスティック回帰分析を行い、早期膵がんの発生確率（Ｐ）を予測した。
４－２　結果
　ＩＴＩＨ３ペプチド（ＥＨＬＶＱＡＴＰＥＮＬＱＥＡＲ［配列番号２］）、ＡＰＯＡ１ペプチド（ＴＨＬＡＰＹＳＤＥＬＲ［配列番号５］）、及びＡＰＯＡ４ペプチド（ＬＬＰＨＡＮＥＶＳＱＫ［配列番号１２］）の３種類のペプチドを組み合わせて、早期膵がん群及び健常群を判別すると、ＡＵＣ値は０．９００７であり、また、閾値を０．６１２８に設定した場合の感度及び特異度は、それぞれ７４．５８％及び９３．８５％であり、ＣＡ１９－９よりも精度よく早期膵がんを判定できることが示された（図２Ａ参照）。なお、上記３種類のペプチドの組合せを用いた早期膵がんの発生確率は、以下の式（１）に示す多重ロジスティック回帰方程式を用いて算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000011
［式（１）中、「ＳＥＱ．２」は、ＩＴＩＨ３ペプチド（ＥＨＬＶＱＡＴＰＥＮＬＱＥＡＲ［配列番号２］）のピーク強度（図１Ａ参照）を示し、「ＳＥＱ．５」は、ＡＰＯＡ１ペプチド（ＴＨＬＡＰＹＳＤＥＬＲ［配列番号５］）のピーク強度（図１Ｂ参照）を示し、「ＳＥＱ．１２」は、ＡＰＯＡ４ペプチド（ＬＬＰＨＡＮＥＶＳＱＫ［配列番号１２］）のピーク強度（図１Ｃ参照）を示す。］
　また、上記３種類のペプチドと、ＣＡ１９－９とを組み合わせて、早期膵がん群及び健常群を判別すると、ＡＵＣ値は０．９３４３であり、また、閾値を０．４７６７に設定した場合の感度及び特異度は、それぞれ８４．７５％及び９３．８５％であり、上記３種類のペプチドの組合せよりも精度よく早期膵がんを判定できることが示された（図２Ｂ参照）。なお、上記３種類のペプチドと、ＣＡ１９－９との組合せを用いた早期膵がんの発生確率は、以下の式（２）に示す多重ロジスティック回帰方程式を用いて算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000012
［式（２）中、「ＳＥＱ．２」は、ＩＴＩＨ３ペプチド（ＥＨＬＶＱＡＴＰＥＮＬＱＥＡＲ［配列番号２］）のピーク強度（図１Ａ参照）を示し、「ＳＥＱ．５」は、ＡＰＯＡ１ペプチド（ＴＨＬＡＰＹＳＤＥＬＲ［配列番号５］）のピーク強度（図１Ｂ参照）を示し、「ＳＥＱ．１２」は、ＡＰＯＡ４ペプチド（ＬＬＰＨＡＮＥＶＳＱＫ［配列番号１２］）のピーク強度（図１Ｃ参照）を示し、「ＣＡ１９．９」は、ＣＡ１９－９濃度の測定値を示す。］
　なお、同じタンパク質由来のペプチドであれば、別のアミノ酸配列のペプチドであっても、ある程度類似した診断性能を持つかを調べるために、同じタンパク質由来のペプチド間のシグナル強度の相関係数を算出した。その結果を表９～１２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　表９～１２から分かるように、同じタンパク質由来のペプチド間ではシグナル強度の相関性が比較的高いことが示された。したがって、同じタンパク質由来のペプチドであれば、別のアミノ酸配列のペプチドであっても、おおむね類似した診断性能を有する傾向が示された。ただし、表８に示されているように、同じタンパク質由来のペプチドであっても、診断性能が優れている程度には差もあった。
５．バイオマーカーペプチドの組合せによる膵がん発症リスクの判定
　本実施例で同定した早期膵がんの判定用バイオマーカーが、（早期）膵がん発症リスクの判定にも有効であるか否かを検証した。
５－１　方法
　慢性膵炎患者や前膵がん病変患者は、膵がんを発症するリスクが健常人よりも高いと一般的にされている。慢性膵炎患者（３名）及び前膵がん病変患者（２７名）を、前膵がん病変・慢性膵炎群とした。かかる前膵がん病変・慢性膵炎群から血漿を採取し、実施例１の「方法」の項目に記載の方法に従って、ペプチド試料を調製し、上記３種類のペプチド、すなわち、ＩＴＩＨ３ペプチド（ＥＨＬＶＱＡＴＰＥＮＬＱＥＡＲ［配列番号２］）、ＡＰＯＡ１ペプチド（ＴＨＬＡＰＹＳＤＥＬＲ［配列番号５］）、及びＡＰＯＡ４ペプチド（ＬＬＰＨＡＮＥＶＳＱＫ［配列番号１２］）の濃度を定量した。得られた定量結果を基に、あるいは、かかる定量結果に加えて、血漿中のＣＡ１９－９濃度の測定値を基に、実施例４の「方法」の項目に記載の多重ロジスティック回帰分析を行い、前膵がん病変・慢性膵炎の発生確率を予測した。なお、上記３種類のペプチドの組合せを用いた前膵がん病変・慢性膵炎の発生確率は、上記式（１）に示す多重ロジスティック回帰方程式を用いて算出し、上記３種類のペプチドと、ＣＡ１９－９との組合せを用いた前膵がん病変・慢性膵炎の発生確率は、上記式（２）に示す多重ロジスティック回帰方程式を用いて算出した。
　上記３種類のペプチドを組み合わせて、前膵がん病変・慢性膵炎群及び健常群を判別すると、前膵がん病変・慢性膵炎群における前膵がん病変・慢性膵炎の発生確率は、０．６０２９であり、健常群における前膵がん病変・慢性膵炎の発生確率（０．２３３８）と比べ高かった（図２Ａ参照）。また、上記３種類のペプチドと、ＣＡ１９－９とを組み合わせて前膵がん病変・慢性膵炎群及び健常群を判別した場合も同様に、前膵がん病変・慢性膵炎群における前膵がん病変・慢性膵炎の発生確率（０．４９５３）は、健常群における前膵がん病変・慢性膵炎の発生確率（０．１７０４）と比べ高かった（図２Ｂ参照）。
　これらの結果は、膵がんを将来発症するリスクが健常人よりも高い者から採取された血漿中の上記３種類のペプチド濃度は、健常人における上記３種類のペプチド濃度と比べ、変動することを示している。
　また、前膵がん病変・慢性膵炎群及び健常群の血漿中の上記３種類のペプチド濃度を基に、ＲＯＣ曲線を作成したところ、ＡＵＣ値は、０．８１１６と高い値を示した。また、前膵がん病変・慢性膵炎群と、健常群とを区別するためのカットオフ値として、０．４４８１を設定したところ、前膵がん病変・慢性膵炎患者の感度（前膵がん病変・慢性膵炎群の中で検査陽性者の割合）及び特異度（健常群の中で検査陰性の割合）は、それぞれ０．７６６７及び０．８０３０であった。
　これらの結果は、膵がん発症前の対象者から採取された血漿中の上記３種類のペプチド濃度を測定し、適切なカットオフ値を設定すると、上記３種類のペプチド濃度を指標として、前膵がん病変・慢性膵炎を判定できる、すなわち、膵がんを発症するリスクの高低を判定できることを示している。前膵がん病変・慢性膵炎である可能性が高い場合は、膵がんを発症するリスクが高いと判定することができ、膵がん病変・慢性膵炎である可能性が低い場合は、膵がんを発症するリスクが低いと判定することができる。
６．異なるステージの膵がんの判定
　本実施例で同定した早期膵がんの判定用バイオマーカーが、中期～末期（ステージIII～IV）の膵がんの判定にも有効か否かを検討した。
６－１　方法
　ステージI膵がん群（ステージIの膵がん患者４名［男性１名、女性３名］）、ステージII膵がん群（ステージIIの膵がん患者１９名［男性１３名、女性６名］）、ステージIII膵がん群（ステージIIIの膵がん患者２６名［男性１３名、女性１３名］）、及びステージIV膵がん群（ステージIVの膵がん患者５１名［男性３２名、女性１９名］）と、比較対照として健常群（健常者４４名［男性２９名、女性１５名］から血漿を採取し、実施例５の「方法」の項目に記載の方法に従って、上記３種類のペプチド（ＩＴＩＨ３ペプチド、ＡＰＯＡ１ペプチド、及びＡＰＯＡ４ペプチド）の濃度の定量と、得られた定量結果を基にした多重ロジスティック回帰分析を行い、各ステージの膵がんの発生確率を予測した。
６－２　結果
　上記３種類のペプチドを組み合わせて、ステージI～IV膵がん群及び健常群を判別すると、いずれのステージの膵がんについても、ＣＡ１９－９よりも精度よく判定できることが示された（図３及び表１３参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　表１３中の数値は、上記３種類のペプチド（表１３中の「３種類のペプチド」）、上記３種類のペプチド、及びＣＡ１９－９（表１３中の「３種類のペプチド＋ＣＡ１９－９」）、並びにＣＡ１９－９（表中の「ＣＡ１９－９」）の定量結果をもとに、各ステージの膵がん群と健常群とを判別したときのＡＵＣ値を示す。
７．膵がん以外のがんの判定
　本実施例で同定した早期膵がんの判定用バイオマーカーが、膵がん以外のがんの判定にも有効であるか否かを検証した。
７－１　方法
　７種類のがん群、すなわち、肝外胆管がん群（胆管がん患者１６名［男性１０名、女性６名］）、結腸がん群（結腸がん患者１２６名［男性７６名、女性５０名］）、十二指腸がん群（十二指腸がん患者８名［男性３名、女性５名］）、食道がん群（食道がん患者１０名［男性９名、女性１名］）、肝細胞がん群（肝細胞がん患者１２名［男性１０名、女性２名］）、肝内胆管がん群（肝内胆管がん患者９名［男性５名、女性４名］）、及び胃がん群（胃がん患者１１９名［男性８４名、女性３５名］）と、比較対照として健常群（健常者４４名［男性２９名、女性１５名］）、膵がん群（膵がん患者１０１名［男性６０名、女性４１名］）、前膵がん病変・慢性膵炎群（前がん病変の状態の慢性膵炎患者４９名［男性２４名、女性２５名］）、及び良性腫瘍群（良性腫瘍患者４４名［男性２２名、女性２２名］）とから血漿を採取し、実施例５の「方法」の項目に記載の方法に従って、上記３種類のペプチド（ＩＴＩＨ３ペプチド、ＡＰＯＡ１ペプチド、及びＡＰＯＡ４ペプチド）の濃度の定量と、得られた定量結果を基にした多重ロジスティック回帰分析を行い、上記７種類のがんの発生確率を予測した。
７－２　結果
　上記３種類のペプチドを組み合わせて、各種がん群及び健常群を判別すると、７種類のがん群のうち、４種類のがん群（胆管がん群、結腸がん群、十二指腸がん群、及び胃がん群）における各がんの発生確率は、それぞれ、０．７２４８、０．６９３７、０．８５３２及び０．６１０８であり、非がん群である健常群及び良性腫瘍群における各がんの発生確率（０．０９４９及び０．４２４９）と比べ高かった（図４Ａ参照）。また、上記３種類のペプチドと、ＣＡ１９－９とを組み合わせて各種がん群及び健常群を判別した場合も同様に、上記４種類のがん群における各がんの発生確率は、それぞれ、０．６８９１、０．５８４０、０．８２９３、及び０．５１３４であり、非がん群である健常群及び良性腫瘍群における各がんの発生確率（０．０７９１８及び０．３３９３）と比べ高かった（図４Ｂ参照）。
　これらの結果は、胆管がん、結腸がん、十二指腸がん、及び胃がんを発症している者から採取された血漿中の上記３種類のペプチド濃度は、かかるがんを発症しない者における上記３種類のペプチド濃度と比べ、変動することを示している。
　また、各群の血漿中の上記３種類のペプチド濃度を基に、健常群を判別するためのＲＯＣ曲線を作成したところ、上記４種類のがん群におけるＡＵＣ値は、ＣＡ１９－９を用いた場合と比べ、高い値を示した（表１４参照）。
　これらの結果は、上記３種類のペプチドを組み合わせると、膵がんに加えて、４種類のがん（胆管がん、結腸がん、十二指腸がん、及び胃がん）を精度よく判定できることを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　表１４中の数値は、上記３種類のペプチド（表中の「３種類のペプチド」）、上記３種類のペプチド、及びＣＡ１９－９（表１４中の「３種類のペプチド＋ＣＡ１９－９」）、並びにＣＡ１９－９（表１４中の「ＣＡ１９－９」）の定量結果をもとに、各がん群と健常群とを判別したときのＡＵＣ値を示す。
８．膵がんと、他のがんとの判別
　膵がんと、他のがん（胃がん、肝細胞癌、食道がん、結腸がん）とを判別可能なバイオマーカーの候補をスクリーニングするために、実施例７で用いた、膵がん以外の各がんの検体（各がんにつき１０検体）と、実施例６で用いた膵がん（１０検体）について、実施例３と同様の方法による定量プロテオーム解析により網羅的な探索を行った。その結果、膵がんと、他のがん（胃がん、肝細胞癌、食道がん、結腸がん）との判別能が最も高い分子として、ＡＰＯＡ４が同定された。この解析にはＡＰＯＡ４ペプチドとして、配列番号９、１０、１２を用いた。
　各がん群における血漿中の各ＡＰＯＡ４ペプチド（配列番号９、１０又は１２）の濃度を定量した。ＡＰＯＡ４ペプチド濃度は、膵がんで最も低下し、他のがん（胃がん、肝細胞癌、食道がん、結腸がん）では膵がんほどは低下しないため、膵がんと他のがんとを判別することができることが示された。さらに、他のがんの中でも、特に、胃がん、肝細胞癌、食道がんでは、ＡＰＯＡ４ペプチド濃度があまり低下しないため、ＡＰＯＡ４ペプチド濃度により、膵がんとこれらの３種のがんとを、より精度よく判別することができる。
　また、各がん群におけるＡＰＯＡ４ペプチド濃度のデータを基に、膵がんと他のいずれかのがんとを判別するＲＯＣ曲線をそれぞれ作成し、各ＡＵＣを算出した。その結果を表１５に示す。なお、ＡＰＯＡ４配列番号９、ＡＰＯＡ４配列番号１０、ＡＰＯＡ４配列番号１２の上段においては、膵がん群として、実施例６の膵がん群（ｎ＝１００）を用い、ＡＰＯＡ４配列番号１２の下段においては、膵がん群として実施例３の早期膵がん群のうち３８名（ｎ＝３８）と、実施例６の膵がん群（ｎ＝１００）を合わせた膵がん群を用い、胃がん群についてはいずれも実施例７の胃がん群（ｎ＝１１９）を用い、肝細胞がん群についてはいずれも実施例７の肝細胞がん群（ｎ＝１２）を用い、食道がん群についてはいずれも実施例７の食道がん群（ｎ＝１０）を用い、大腸がん群としてはいずれも実施例７の結腸がん群（ｎ＝１２６）を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　表１５の結果から、ＡＰＯＡ４ペプチド（好ましくは配列番号９、１０、１２）を利用すると、膵がんと、他のがん（胃がん、肝細胞癌、食道がん、結腸がん）とを判別することができ、中でも、膵がんと、胃がん、肝細胞癌、食道がんとをより高精度で判別することができることが示された。
　なお、各がん群（健常群ｎ＝１０９、早期膵がん群ｎ＝１３９、前膵がん病変群ｎ＝５６、膵炎群ｎ＝５、良性腫瘍群ｎ＝４１、結腸がん群ｎ＝１２６、食道がん群ｎ＝１０、肝細胞がん群ｎ＝１２、胃がん群ｎ＝１１９）における血漿中のＡＰＯＡ４ペプチド（配列番号１２）の濃度を定量した結果を図５に示す。図５から、ＡＰＯＡ４ペプチド濃度は、膵がんで最も低下し、他のがん（胃がん、肝細胞癌、食道がん、結腸がん）では膵がんほど低下しないため、膵がんと他のがんとを判別することができることが示された。さらに、他のがんの中でも、特に、胃がん、肝細胞癌、食道がんでは、ＡＰＯＡ４ペプチド濃度があまり低下しないため、ＡＰＯＡ４ペプチド濃度により、膵がんとこれらの３種のがんとを、より精度よく判別することができることが示された。
９．単一施設の症例における中期～末期の膵がんの判定
　本実施例で同定した早期膵がんの判定用バイオマーカーが、中期～末期（ステージIII～IV）の膵がんの判定にも有効であることは上記の実施例６においてすでに示した。ただし、この実験では複数の医療施設の患者の検体を使用していた。本実施例で同定した早期膵がんの判定用バイオマーカーが単一の医療施設の症例における中期～末期（ステージIII～IV）の膵がんの判定にも有効であることを念のため確認した。なお、単一の医療施設として、神戸大学医学部附属病院の膵がん患者の検体を使用した。
９－１　方法
　ステージIII及びIVの膵がん群（ステージIII及びIVの膵がん患者４３名と、比較対照として健常群（健常者４５名から血漿を採取し、実施例５の「方法」の項目に記載の方法に従って、上記３種類のペプチド（ＩＴＩＨ３ペプチド、ＡＰＯＡ１ペプチド、及びＡＰＯＡ４ペプチド）の濃度の定量と、得られた定量結果を基にした多重ロジスティック回帰分析を行い、ステージIII又はIVの膵がんの発生確率を予測した。
９－２　結果
　このような方法で予測したステージIII又はIVの膵がんの発生確率を図６に示す。また、図６の結果を基に作成したＲＯＣ曲線を図７に示す。このように、上記３種類のペプチドを組み合わせて、ステージIII及びIVの膵がん群と健常群とを判別すると、ＡＵＣ値は０．８５１と高い値を示した。また、ステージIII又はIVの膵がん群と、健常群とを区別するためのカットオフ値として、Youden's index（感度と特異度の和が最大となる値）である０．４２６を設定した場合の感度及び特異度は、それぞれ６９．８％及び９３．３％であった。これらの結果から、上記３種類のペプチド（ＩＴＩＨ３ペプチド、ＡＰＯＡ１ペプチド、及びＡＰＯＡ４ペプチド）を組み合わせると、ステージIII及びIVの膵がんについても、精度よく判定できることが示された（図６、図７）。
　本発明によれば、膵がん、胃がん、大腸がん、十二指腸がん及び胆管がんからなる群から選択される１種又は２種以上のがん（好ましくは膵がん、より好ましくは早期膵がん）の有無や発症リスクを精度よく判定できる判定方法や、判定用バイオマーカー等を提供することができる。本発明によって膵がんを早期に発見することができれば、早期の段階での治療が可能となり、進行してから発見する場合に比べて５年生存率の大幅な向上が期待できる。

Claims (13)

  1. 　膵がん、胃がん、大腸がん、十二指腸がん及び胆管がんからなる群から選択される１種又は２種以上のがんの有無又は発症リスクの判定方法であって、
    　前記判定方法が以下の工程（ａ）～（ｃ）を含むことを特徴とする、前記判定方法。
    （ａ）被検者から採取された判定用血液試料中の、以下の［Ａグループ］及び［Ｂグループ］に記載される物質群から選択される１又は２種以上の物質の濃度を測定する工程；
    ［Ａグループ］
    　ＡＰＯＡ４の部分ペプチド、ＡＰＯＡ１の部分ペプチド、ＴＴＨＹの部分ペプチド、Ｑ５ＶＹ３０の部分ペプチド、Ｈ０ＹＡＣ１の部分ペプチド、ＢＴＤの部分ペプチド、ＡＰＯＡ４、ＡＰＯＡ１、ＴＴＨＹ、Ｑ５ＶＹ３０、Ｈ０ＹＡＣ１、ＢＴＤ
    ［Ｂグループ］
    ＩＴＩＨ３の部分ペプチド、ＩＴＩＨ３
    （ｂ）工程（ａ）で測定した物質の濃度を、対照となる健常血液試料中のその物質の濃度と比較する工程；
    （ｃ）工程（ａ）で測定した物質が[Ａグループ]の物質である場合、工程（ａ）で測定した物質の濃度が、対照となる健常血液試料中のその物質の濃度と比較して低いとき、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いと評価し、及び／又は、
    工程（ａ）で測定した物質が［Ｂグループ］の物質である場合、工程（ａ）で測定した物質の濃度が、対照となる健常血液試料中のその物質の濃度と比較して高いとき、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いと評価する工程；
  2. 　工程（ｂ）が、工程（ａ）で測定した２種以上の物質の各濃度と、対照となる健常血液試料中の２種以上の物質の各濃度とを、２種以上の物質の各濃度を変数とする多変量解析における予測式に代入して得た予測値を比較する工程であり、
    　前記予測式が、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い場合に予測値が高くなる予測式である場合には、工程（ｃ）は、被検者について得られた予測値が健常血液試料について得られた予測値よりも高いときに、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いと評価する工程であり、
    　前記予測式が、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い場合に予測値が低くなる予測式である場合には、工程（ｃ）は、被検者について得られた予測値が健常血液試料について得られた予測値よりも低いときに、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いと評価する工程であることを特徴とする請求項１に記載の判定方法。
  3. 　物質が、ＡＰＯＡ４の部分ペプチド、ＡＰＯＡ１の部分ペプチド、ＩＴＩＨ３の部分ペプチド、ＡＰＯＡ４、ＡＰＯＡ１及びＩＴＩＨ３からなる群から選択される１種又は２種以上である請求項１又は２に記載の判定方法。
  4. 　部分ペプチドがプロテアーゼで消化されたペプチドであることを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載の判定方法。
  5. 　多変量解析が、ロジスティック回帰分析又は重回帰分析であることを特徴とする請求項２～４のいずれかに記載の判定方法。
  6. [Ｂグループ]がさらにＣＡ１９－９抗原を含んでおり、
    　工程（ａ）で濃度を測定する物質が、［Ａグループ］及び［Ｂグループ］に記載される物質群から選択される２種以上の物質であって、少なくともＣＡ１９－９抗原を含んでいることを特徴とする請求項１～５のいずれかに記載の判定方法。
  7. 　工程（ａ）における物質の濃度の測定を質量分析法により行うことを特徴とする請求項１～６のいずれかに記載の判定方法。
  8. 　物質が、ＡＰＯＡ４の部分ペプチド又はＡＰＯＡ１の部分ペプチドを少なくとも含んでおり、
    　判定方法が、工程（ａ）で測定したＡＰＯＡ４の部分ペプチド又はＡＰＯＡ１の部分ペプチドの濃度が、対照となる健常血液試料中のＡＰＯＡ４の部分ペプチド又はＡＰＯＡ１の部分ペプチドの濃度と比較して低い程度がより大きいとき、前記被検者が膵がんを有している可能性が高い又は前記被験者における膵がんの発症リスクが高いと評価する工程（ｄ）をさらに含むことを特徴とする請求項１～７のいずれかに記載の判定方法。
  9. 　がんが、早期膵がんであることを特徴とする請求項１～８のいずれかに記載の判定方法。
  10. 　以下の［Ａグループ］及び［Ｂグループ］に記載される物質群から選択される１又は２種以上の物質からなることを特徴とする、
    　膵がん、胃がん、大腸がん、十二指腸がん及び胆管がんからなる群から選択される１種又は２種以上のがんの有無又は発症リスクの判定用バイオマーカーであって、
    　物質が[Ａグループ]の物質である場合、被検者から採取された判定用血液試料中の前記物質の濃度が、対照となる健常者における前記物質の濃度と比べて低いとき、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いことが示され、
    　物質が[Ｂグループ]の物質である場合、被検者から採取された判定用血液試料中の前記物質の濃度が、対照となる健常者における前記物質の濃度と比べて高いとき、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いことが示される、
    　前記判定用バイオマーカー。
    ［Ａグループ］
    　ＡＰＯＡ４の部分ペプチド、ＡＰＯＡ１の部分ペプチド、ＴＴＨＹの部分ペプチド、Ｑ５ＶＹ３０の部分ペプチド、Ｈ０ＹＡＣ１の部分ペプチド、ＢＴＤの部分ペプチド、ＡＰＯＡ４、ＡＰＯＡ１、ＴＴＨＹ、Ｑ５ＶＹ３０、Ｈ０ＹＡＣ１、ＢＴＤ
    ［Ｂグループ］
    ＩＴＩＨ３の部分ペプチド、ＩＴＩＨ３
  11. 　物質が、ＡＰＯＡ４の部分ペプチド、ＡＰＯＡ１の部分ペプチド、ＩＴＩＨ３の部分ペプチド、ＡＰＯＡ４、ＡＰＯＡ１及びＩＴＩＨ３からなる群から選択される１種又は２種以上である請求項１０に記載の判定用バイオマーカー。
  12. 　物質が、ＡＰＯＡ４の部分ペプチド又はＡＰＯＡ１の部分ペプチドを少なくとも含んでおり、
    　被検者から採取された判定用血液試料中のＡＰＯＡ４の部分ペプチド又はＡＰＯＡ１の部分ペプチドの濃度が、対照となる健常血液試料中のＡＰＯＡ４の部分ペプチド又はＡＰＯＡ１の部分ペプチドの濃度と比較して低い程度がより大きいとき、前記被検者が膵がんを有している可能性が高い又は前記被験者における膵がんの発症リスクが高いことが示される請求項１０又は１１に記載の判定用バイオマーカー。
  13. 　がんが、早期膵がんであることを特徴とする請求項１０～１２のいずれかに記載の判定用バイオマーカー。
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