JPWO2019131552A1 - 膵がん等のがんの判定用バイオマーカー - Google Patents

Abstract

本発明の課題は、膵がん、胃がん、大腸がん、十二指腸がん及び胆管がんからなる群から選択される１種又は２種以上のがん（好ましくは膵がん、より好ましくは早期膵がん）の有無又は発症リスクを精度よく判定できる判定方法や、判定用バイオマーカー等を提供することにある。本発明は、以下の［Ａグループ］及び［Ｂグループ］に記載される物質群から選択される１又は２種以上の物質を、早期膵がんを含む膵がん、胃がん、大腸がん、十二指腸がん、胆管がんの有無又は発症リスクを精度よく判定できるバイオマーカーとして用いる。［Ａグループ］ＡＰＯＡ４の部分ペプチド、ＡＰＯＡ１の部分ペプチド、ＴＴＨＹの部分ペプチド、Ｑ５ＶＹ３０の部分ペプチド、Ｈ０ＹＡＣ１の部分ペプチド、ＢＴＤの部分ペプチド、ＡＰＯＡ４、ＡＰＯＡ１、ＴＴＨＹ、Ｑ５ＶＹ３０、Ｈ０ＹＡＣ１、ＢＴＤ［Ｂグループ］ＩＴＩＨ３の部分ペプチド、ＩＴＩＨ３

Description

本発明は、膵がん、胃がん、大腸がん、十二指腸がん及び胆管がんからなる群から選択される１種又は２種以上のがん（以下、「本発明におけるがん」とも表示する。）の有無又は発症リスクの判定方法であって、被検者から採取された判定用血液試料中の特定の物質群から選択される１又は２種以上の物質の濃度を測定する工程（ａ）を含む判定方法や、前述の特定の物質群からなる前述のがんの有無の判定用バイオマーカー等に関する。

がんは死亡原因の高い割合を占めており、その状況は長らく続いている。様々な抗がん剤の開発がこれまでに進められており、免疫チェックポイント阻害剤など、以前より効果の高い抗がん剤も実用化されているものの、得られる抗がん作用の程度には個人差やがんの種類による差も大きく、がんは依然として人類にとっての脅威であり続けている。ただ、がんは早期に発見することができれば、早期に治療を開始することで、がんによる死亡率を大きく低下させることができる。そのため、より精度の高い又はより多様な、がんの判定・診断方法、特に、早期のがんの判定・診断方法の開発が進められている。

ところで、がんの中でも、膵がんは難治性がんの一つであり、外科的手術以外の有効な治療法は確立されてない。膵がんが難治性がんであることの主な要因の一つとして、膵臓が胃の裏側、すなわち、体の深部に位置しており、がんが発生しても症状が現れにくく、早期発見が非常に難しいこということが挙げられる。実際、膵がんの５年生存率は約９％と極めて予後が悪いものの、早期の膵がん（ステージＩ）の５年生Ｚ存率は４１％と比較的予後がよい。このように、膵がんにおいては早期発見、早期治療が特に重要であり、膵がんを現在よりも早期に発見することができれば、膵がん患者の５年生存率を大幅にあるいは劇的に向上させることが可能になると期待できる。

膵がんの診断手法としては、血清腫瘍マーカーであるＣＡ１９−９を用いられることが知られている。また、最近では、膵がんの診断において、ヘリカルＣＴ、磁気共鳴装置（ＭＲＩ）、内視鏡的超音波検査法（ＥＵＳ）などが用いられている。しかしながら、これらのいずれの診断手法も、膵がんの診断手法として十分とは言えず、特に、早期の膵がんの診断手法としては全く不十分であった。

早期の膵がんの診断に関して、特許文献１には、放射性核種で標識されたｃ（ＲＧＤｆＫ）ペプチドを、哺乳動物に投与する工程、及び、投与後の哺乳動物の膵臓における前記放射性核種を検出する工程を含む、早期膵がんの検出方法が開示されている。しかし、この方法は、放射性核種で標識されたペプチドの取り扱いに注意が必要であり、実用性は高くない。一方、本発明者らはこれまでに、血漿中に存在するバイオマーカーであるinsulin-like growth factor-binding protein（ＩＧＦＢＰ）２及びＩＧＦＢＰ３が、膵がんの早期発見に有用であることを見いだしている（非特許文献１）。しかし、本発明の特定の物質群から選択される１又は２種以上の物質が、膵がん、胃がん、大腸がん、十二指腸がん及び胆管がんからなる群から選択される１種又は２種以上のがんの有無又は発症リスクを判定できるバイオマーカーであること、特に、早期の膵がんの有無又は発症リスクを判定できるバイオマーカーであることについては、これまで知られていなかった。

特開２０１２−０４２２１５号公報

PLoS One. 2016 Aug 31;11(8):e0161009

本発明の課題は、膵がん、胃がん、大腸がん、十二指腸がん及び胆管がんからなる群から選択される１種又は２種以上のがん（好ましくは膵がん、より好ましくは早期膵がん）の有無又は発症リスクを精度よく判定できる判定方法や、判定用バイオマーカー等を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決するため、早期膵がんの患者（早期膵がん群）と、胃がんの患者と、大腸がんの患者と、十二指腸がんの患者と、胆管がんの患者と、健常者（健常群）のそれぞれについて採取した血清をトリプシンで処理し、得られたペプチド試料について質量分析を行ったところ、後述の［Ａグループ］及び［Ｂグループ］に記載される物質群（以下、「本件物質群」とも表示する。）から選択される１又は２種以上の物質が、早期膵がんを含む膵がん、胃がん、大腸がん、十二指腸がん、胆管がんの有無や発症リスクを精度よく判定できるバイオマーカーであることを見いだし、本発明を完成するに至った。また、本発明者らは、早期膵がん群と健常群における本件物質群の各濃度を変数とする多重ロジスティック回帰分析を行ったところ、本発明におけるがんの有無や発症リスクをより高精度で判定できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
［Ａグループ］
ＡＰＯＡ４の部分ペプチド、ＡＰＯＡ１の部分ペプチド、ＴＴＨＹの部分ペプチド、Ｑ５ＶＹ３０の部分ペプチド、Ｈ０ＹＡＣ１の部分ペプチド、ＢＴＤの部分ペプチド、ＡＰＯＡ４、ＡＰＯＡ１、ＴＴＨＹ、Ｑ５ＶＹ３０、Ｈ０ＹＡＣ１、ＢＴＤ
［Ｂグループ］
ＩＴＩＨ３の部分ペプチド、ＩＴＩＨ３

また、本発明者らは、ＡＰＯＡ４ペプチドの部分ペプチドが、膵がんと、他のがん（すなわち、胆管がん、結腸がん、十二指腸がん、及び胃がん）を判別するバイオマーカーであり、中でも、膵がんと、胃がん、肝細胞癌、食道がんとをより高精度で判別することができるバイオマーカーであることを見いだし、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下のとおりである。
（１）膵がん、胃がん、大腸がん、十二指腸がん及び胆管がんからなる群から選択される１種又は２種以上のがんの有無又は発症リスクの判定方法であって、
前記判定方法が以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含むことを特徴とする、前記判定方法。
（ａ）被検者から採取された判定用血液試料中の、以下の［Ａグループ］及び［Ｂグループ］に記載される物質群から選択される１又は２種以上の物質の濃度を測定する工程；
［Ａグループ］
ＡＰＯＡ４の部分ペプチド、ＡＰＯＡ１の部分ペプチド、ＴＴＨＹの部分ペプチド、Ｑ５ＶＹ３０の部分ペプチド、Ｈ０ＹＡＣ１の部分ペプチド、ＢＴＤの部分ペプチド、ＡＰＯＡ４、ＡＰＯＡ１、ＴＴＨＹ、Ｑ５ＶＹ３０、Ｈ０ＹＡＣ１、ＢＴＤ
［Ｂグループ］
ＩＴＩＨ３の部分ペプチド、ＩＴＩＨ３
（ｂ）工程（ａ）で測定した物質の濃度を、対照となる健常血液試料中のその物質の濃度と比較する工程；
（ｃ）工程（ａ）で測定した物質が[Ａグループ]の物質である場合、工程（ａ）で測定した物質の濃度が、対照となる健常血液試料中のその物質の濃度と比較して低いとき、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いと評価し、及び／又は、工程（ａ）で測定した物質が［Ｂグループ］の物質である場合、工程（ａ）で測定した物質の濃度が、対照となる健常血液試料中のその物質の濃度と比較して高いとき、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いと評価する工程；
（２）工程（ｂ）が、工程（ａ）で測定した２種以上の物質の各濃度と、対照となる健常血液試料中の２種以上の物質の各濃度とを、２種以上の物質の各濃度を変数とする多変量解析における予測式に代入して得た予測値を比較する工程であり、
前記予測式が、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い場合に予測値が高くなる予測式である場合には、工程（ｃ）は、被検者について得られた予測値が健常血液試料について得られた予測値よりも高いときに、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いと評価する工程であり、
前記予測式が、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い場合に予測値が低くなる予測式である場合には、工程（ｃ）は、被検者について得られた予測値が健常血液試料について得られた予測値よりも低いときに、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いと評価する工程であることを特徴とする上記（１）に記載の判定方法や、
（３）物質が、ＡＰＯＡ４の部分ペプチド、ＡＰＯＡ１の部分ペプチド、ＩＴＩＨ３の部分ペプチド、ＡＰＯＡ４、ＡＰＯＡ１及びＩＴＩＨ３からなる群から選択される１種又は２種以上である上記（１）又は（２）に記載の判定方法。
（４）部分ペプチドがプロテアーゼで消化されたペプチドであることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の判定方法。
（５）多変量解析が、ロジスティック回帰分析又は重回帰分析であることを特徴とする上記（２）〜（４）のいずれかに記載の判定方法。
（６）[Ｂグループ]がさらにＣＡ１９−９抗原を含んでおり、
工程（ａ）で濃度を測定する物質が、［Ａグループ］及び［Ｂグループ］に記載される物質群から選択される２種以上の物質であって、少なくともＣＡ１９−９抗原を含んでいることを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれかに記載の判定方法。
（７）工程（ａ）における物質の濃度の測定を質量分析法により行うことを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれかに記載の判定方法。
（８）物質が、ＡＰＯＡ４の部分ペプチド又はＡＰＯＡ１の部分ペプチドを少なくとも含んでおり、
判定方法が、工程（ａ）で測定したＡＰＯＡ４の部分ペプチド又はＡＰＯＡ１の部分ペプチドの濃度が、対照となる健常血液試料中のＡＰＯＡ４の部分ペプチド又はＡＰＯＡ１の部分ペプチドの濃度と比較して低い程度がより大きいとき、前記被検者が膵がんを有している可能性が高い又は前記被験者における膵がんの発症リスクが高いと評価する工程（ｄ）をさらに含むことを特徴とする上記（１）〜（７）のいずれかに記載の判定方法。
（９）がん又は膵がんが、早期膵がんであることを特徴とする上記（１）〜（８）のいずれかに記載の判定方法。
（１０）以下の［Ａグループ］及び［Ｂグループ］に記載される物質群から選択される１又は２種以上の物質からなることを特徴とする、
膵がん、胃がん、大腸がん、十二指腸がん及び胆管がんからなる群から選択される１種又は２種以上のがんの有無又は発症リスクの判定用バイオマーカーであって、
物質が[Ａグループ]の物質である場合、被検者から採取された判定用血液試料中の前記物質の濃度が、対照となる健常者における前記物質の濃度と比べて低いとき、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いことが示され、
物質が[Ｂグループ]の物質である場合、被検者から採取された判定用血液試料中の前記物質の濃度が、対照となる健常者における前記物質の濃度と比べて高いとき、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いことが示される、前記判定用バイオマーカー。
［Ａグループ］
ＡＰＯＡ４の部分ペプチド、ＡＰＯＡ１の部分ペプチド、ＴＴＨＹの部分ペプチド、Ｑ５ＶＹ３０の部分ペプチド、Ｈ０ＹＡＣ１の部分ペプチド、ＢＴＤの部分ペプチド、ＡＰＯＡ４、ＡＰＯＡ１、ＴＴＨＹ、Ｑ５ＶＹ３０、Ｈ０ＹＡＣ１、ＢＴＤ
［Ｂグループ］
ＩＴＩＨ３の部分ペプチド、ＩＴＩＨ３
（１１）物質が、ＡＰＯＡ４の部分ペプチド、ＡＰＯＡ１の部分ペプチド、ＩＴＩＨ３の部分ペプチド、ＡＰＯＡ４、ＡＰＯＡ１及びＩＴＩＨ３からなる群から選択される１種又は２種以上である上記（１０）に記載の判定用バイオマーカー。
（１２）物質が、ＡＰＯＡ４の部分ペプチド又はＡＰＯＡ１の部分ペプチドを少なくとも含んでおり、
被検者から採取された判定用血液試料中のＡＰＯＡ４の部分ペプチド又はＡＰＯＡ１の部分ペプチドの濃度が、対照となる健常血液試料中のＡＰＯＡ４の部分ペプチド又はＡＰＯＡ１の部分ペプチドの濃度と比較して低い程度がより大きいとき、前記被検者が膵がんを有している可能性が高い又は前記被験者における膵がんの発症リスクが高いことが示される上記（１０）又は（１１）に記載の判定用バイオマーカー。
（１３）
がん又は膵がんが、早期膵がんであることを特徴とする上記（１０）〜（１２）のいずれかに記載の判定用バイオマーカー。

また本発明の実施の他の形態として、
膵がん、胃がん、大腸がん、十二指腸がん及び胆管がんからなる群から選択される１種又は２種以上のがん（好ましくは膵がん）の有無又は発症リスクの診断方法であって、
前記診断方法が上記工程（ａ）〜（ｃ）（好ましくは上記工程（ａ）〜（ｄ））を含むことを特徴とする、前記診断方法；や、
膵がん、胃がん、大腸がん、十二指腸がん及び胆管がんからなる群から選択される１種又は２種以上のがん（好ましくは膵がん）の有無又は発症リスクの診断方法であって、
上記工程（ａ）〜（ｃ）（好ましくは上記工程（ａ）〜（ｄ））を含み、さらに、工程（ｃ）において、がんを有している可能性が高いと評価（診断）された被検者に対して、がんの治療剤を投与する工程（ｐ）、又は、工程（ｄ）において、膵がんを有している可能性が高いと評価（診断）された被検者に対して、膵がんの治療剤を投与する工程（ｑ）を任意で含む、前記診断方法；や、
膵がん、胃がん、大腸がん、十二指腸がん及び胆管がんからなる群から選択される１種又は２種以上のがん（好ましくは膵がん）の有無又は発症リスクを診断するためのデータを収集する方法であって、
前記方法が上記工程（ａ）〜（ｃ）（好ましくは上記工程（ａ）〜（ｄ））を含むことを特徴とする、前記方法；や、
膵がん、胃がん、大腸がん、十二指腸がん及び胆管がんからなる群から選択される１種又は２種以上のがん（好ましくは膵がん）の有無又は発症リスクの判定（診断）方法におけるバイオマーカーとして使用するための、本件物質群から選択される１又は２種以上の物質であって、
物質が[Ａグループ]の物質である場合、被検者から採取された判定用血液試料中の前記物質の濃度が、対照となる健常者における前記物質の濃度と比べて低いとき、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いことが示され、
物質が[Ｂグループ]の物質である場合、被検者から採取された判定用血液試料中の前記物質の濃度が、対照となる健常者における前記物質の濃度と比べて高いとき、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いことが示され、
被検者から採取された判定用血液試料中のＡＰＯＡ４の部分ペプチド又はＡＰＯＡ１の部分ペプチドの濃度が、対照となる健常血液試料中のＡＰＯＡ４の部分ペプチド又はＡＰＯＡ１の部分ペプチドの濃度と比較して低い程度がより大きいとき、前記被検者が膵がんを有している可能性が高い又は前記被験者における膵がんの発症リスクが高いことが示される、前記物質；
を挙げることができる。

本発明によると、膵がん、胃がん、大腸がん、十二指腸がん及び胆管がんからなる群から選択される１種又は２種以上のがん（好ましくは膵がん、より好ましくは早期膵がん）の有無又は発症リスクを精度よく判定できる判定方法や、判定用バイオマーカー等を提供することができる。本発明によって膵がんを早期に発見することができれば、早期の段階での治療が可能となり、進行してから発見する場合に比べて５年生存率の大幅な向上が期待できる。

健常群（６６例）及び早期膵がん群（５９例）における血漿中のＩＴＩＨ３ペプチド（ＥＨＬＶＱＡＴＰＥＮＬＱＥＡＲ［配列番号２］）（図１Ａ）、ＡＰＯＡ１ペプチド（ＴＨＬＡＰＹＳＤＥＬＲ［配列番号５］）（図１Ｂ）、及びＡＰＯＡ４ペプチド（ＬＬＰＨＡＮＥＶＳＱＫ［配列番号１２］）（図１Ｃ）の濃度を、質量分析法により定量した結果を示す図である。図中の黒丸は、個々の測定対象者の結果を示す。図中の一番長い横棒線は、中央値を示し、その上下にある横棒線は四分位値（２５％，７５％）を示す。 図２Ａは、３種類の群（健常群（６６例）、早期膵がん群（５９例）、及び前膵がん病変・慢性膵炎群（３０例））における血漿中の上記３種類のペプチドの定量結果を基に、多重ロジスティック回帰分析を用いて予測式（式（１））を設定し、早期膵がん又は前膵がん病変・慢性膵炎の発生確率（図中の縦軸参照）を予測した結果を示す図である。図２Ｂは、上記３種類の群における血漿中の上記３種類のペプチドの定量結果に加えて、ＣＡ１９−９濃度の測定値も組み合わせた多重ロジスティック回帰分析を用いて予測式（式（２））を設定し、早期膵がん又は前膵がん病変・慢性膵炎の発生確率（図中の縦軸参照）を予測した結果を示す図である。図中の黒丸又は灰色丸は、個々の測定対象者の結果を示す。図中の一番長い横棒線は、中央値を示し、その上下にある横棒線は四分位値（２５％，７５％）を示す。 図３Ａは、５種類の群（健常群（４４例）、ステージＩ膵がん群（４例）、ステージＩＩ膵がん群（１９例）、ステージＩＩＩ膵がん群（２６例）、及びステージＩＶ膵がん群（５１例））における血漿中の上記３種類のペプチドの定量結果を基に、図２Ａにおいて多重ロジスティック回帰分析によって設定した式（１）を用いて、各ステージの膵がんの発生確率（図中の縦軸参照）を予測した結果を示す図である。図３Ｂは、図２Ｂの式（２）を用いて血漿中の上記３種類のペプチドの定量結果に加えて、ＣＡ１９−９濃度の測定値も組み合わせて算出し、各ステージの膵がんの発生確率（図中の縦軸参照）を予測した結果を示す図である。図中の黒丸は、個々の測定対象者の結果を示す。図中の一番長い横棒線は、中央値を示し、その上下にある横棒線は四分位値（２５％，７５％）を示す。 図４Ａは、１１種類の群（健常群［ｎ＝４３］、膵がん群［ｎ＝８０］、前膵がん病変・慢性膵炎群［ｎ＝２９］、良性腫瘍群［ｎ＝４３］、肝外胆管がん群［ｎ＝１６］、結腸がん群［ｎ＝１２６］、十二指腸がん群［ｎ＝８］、食道がん群［ｎ＝１０］、肝細胞がん群［ｎ＝１２］、肝内胆管がん群［ｎ＝９］、及び胃がん群［ｎ＝１１９］）における血漿中の上記３種類のペプチドの定量結果を基に、式（１）を用いて、各種がん、良性腫瘍、又は前膵がん病変・慢性膵炎の発生確率（図中の縦軸参照）を予測した結果を示す図である。図４Ｂは、上記１１種類の群における血漿中の上記３種類のペプチドの定量結果に加えて、ＣＡ１９−９濃度の測定値も組み合わせた式（２）を用いて、各種がん、良性腫瘍、又は前膵がん病変・慢性膵炎の発生確率（図中の縦軸参照）を予測した結果を示す図である。図中の黒丸又は灰色丸は、個々の測定対象者の結果を示す。図中の一番長い横棒線は、中央値を示し、その上下にある横棒線は四分位値（２５％，７５％）を示す。 図５は、健常群ｎ＝１０９、早期膵がん群ｎ＝１３９、前膵がん病変群ｎ＝５６、膵炎群ｎ＝５、良性腫瘍群ｎ＝４１、結腸がん群ｎ＝１２６、食道がん群ｎ＝１０、肝細胞がん群ｎ＝１２、胃がん群ｎ＝１１９における血漿中のＡＰＯＡ４ペプチド（ＬＬＰＨＡＮＥＶＳＱＫ［配列番号１２］）の濃度を、質量分析法により定量した結果を示す図である。図中の黒丸は、個々の測定対象者の結果を示す。図中の一番長い横棒線は、中央値を示し、その上下にある横棒線は四分位値（２５％，７５％）を示す。 図６は、２種類の群（健常群（４５例）、並びにステージIII及びIVの膵がん群（４３例））における血漿中の上記３種類のペプチドの定量結果を基に、式（１）を用いて、ステージIII又はIVの膵がんの発生確率（図中の縦軸参照）を予測した結果を示す図である。図中の黒丸は、個々の測定対象者の結果を示す。図中の一番長い横棒線は、その群の中央値を示し、その上下にある横棒線は四分位値（２５％，７５％）を示す。 図７は、図６の結果を基に作成したＲＯＣ曲線を表す。図７のグラフの横軸は、「１００％−特異度（％）」（偽陽性率（％））を表し、縦軸は、「感度（％）」（真陽性率（％））を表す。

本発明におけるがんの有無又は発症リスクの判定方法としては、
膵がん、胃がん、大腸がん、十二指腸がん及び胆管がんからなる群から選択される１種又は２種以上のがんの有無又は発症リスクの判定方法であって、
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含むことを特徴とする判定方法（以下、「本件判定方法」とも表示する。）である限り特に制限されない。
（ａ）被検者から採取された判定用血液試料中の、以下の［Ａグループ］及び［Ｂグループ］に記載される物質群から選択される１又は２種以上の物質の濃度（以下、「被検者における物質濃度」とも表示する。）を測定する工程；
［Ａグループ］
ＡＰＯＡ４の部分ペプチド、ＡＰＯＡ１の部分ペプチド、ＴＴＨＹの部分ペプチド、Ｑ５ＶＹ３０の部分ペプチド、Ｈ０ＹＡＣ１の部分ペプチド、ＢＴＤの部分ペプチド、ＡＰＯＡ４、ＡＰＯＡ１、ＴＴＨＹ、Ｑ５ＶＹ３０、Ｈ０ＹＡＣ１、ＢＴＤ
［Ｂグループ］
ＩＴＩＨ３の部分ペプチド、ＩＴＩＨ３
（ｂ）工程（ａ）で測定した物質の濃度を、対照となる健常血液試料中のその物質の濃度（以下、「対照試料における物質濃度」とも表示する。）と比較する工程；
（ｃ）工程（ａ）で測定した物質が[Ａグループ]の物質である場合、工程（ａ）で測定した物質の濃度が、対照となる健常血液試料中のその物質の濃度と比較して低いとき、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いと評価し、及び／又は、
工程（ａ）で測定した物質が［Ｂグループ］の物質である場合、工程（ａ）で測定した物質の濃度が、対照となる健常血液試料中のその物質の濃度と比較して高いとき、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いと評価する工程；

本件判定方法は、本発明におけるがんの有無又は発症リスクの高低の、医師による診断を補助する方法であって、医師による診断行為を含まない。

また、本発明におけるがんの有無の判定用バイオマーカーとしては、
以下の［Ａグループ］及び［Ｂグループ］に記載される物質群から選択される１又は２種以上の物質からなることを特徴とする、
膵がん、胃がん、大腸がん、十二指腸がん及び胆管がんからなる群から選択される１種又は２種以上のがんの有無又は発症リスクの判定用バイオマーカーであって、
物質が[Ａグループ]の物質である場合、被検者から採取された判定用血液試料中の前記物質の濃度が、対照となる健常者における前記物質の濃度と比べて低いとき、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いことが示され、
物質が[Ｂグループ]の物質である場合、被検者から採取された判定用血液試料中の前記物質の濃度が、対照となる健常者における前記物質の濃度と比べて高いとき、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いことが示される、
前記判定用バイオマーカー（以下、「本件判定用バイオマーカー」とも表示する。）である限り特に制限されない。

本発明における工程（ａ）としては、被検者から採取された判定用血液試料中の、以下の［Ａグループ］及び［Ｂグループ］に記載される物質群から選択される１又は２種以上の物質の濃度を測定する工程である限り特に制限されない。

ＡＰＯＡ４はアポリポプロテインＡ−４を表す。ヒトのＡＰＯＡ４のアミノ酸配列は配列番号２５（UniProtのアクセッションナンバー P06727）に示される。ＡＰＯＡ１はアポリポプロテインＡ−１を表す。ヒトのＡＰＯＡ１のアミノ酸配列は配列番号２６（UniProtのアクセッションナンバー P02647）に示される。ＴＴＨＹはトランスサイレチンを表す。ヒトのＴＴＨＹのアミノ酸配列は配列番号２７（UniProtのアクセッションナンバー P02766）に示される。Ｑ５ＶＹ３０はレチノール結合タンパク質４を表す。ヒトのレチノール結合タンパク質４のアミノ酸配列は配列番号２８（UniProtのアクセッションナンバー P02753）に示されるほか、UniProtアクセッションナンバー Q5VY30（ヒトのレチノール結合タンパク質４のアイソフォーム）にも示される。Ｈ０ＹＡＣ１は血漿カリクレイン重鎖１を表す。ヒトの血漿カリクレイン重鎖１のアミノ酸配列は配列番号２９（UniProtのアクセッションナンバー P03952）に示されるほか、UniProtアクセッションナンバー H0YAC1にも示され、また、ヒトの血漿カリクレイン重鎖１の一部のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列がUniProtアクセッションナンバーE9PBC5、B4DMX2、A8K9A9にも示される。ＢＴＤはビオチダーゼを表す。ヒトビオチダーゼのアミノ酸配列は配列番号３０（UniProtのアクセッションナンバーP43251）に示される。ＩＴＩＨ３はインターαトリプシンインヒビター重鎖３を表す。ヒトのインターαトリプシンインヒビター重鎖３のアミノ酸配列は配列番号３１（UniProtのアクセッションナンバーQ06033）に示される。

本発明における「部分ペプチド」とは、一般的に「部分タンパク質」と呼ばれるものをも含む。本発明において、あるタンパク質の「部分ペプチド」とは、そのタンパク質のアミノ酸配列中の任意の連続する５個以上（好ましくは７個以上、より好ましくは９個以上、さらに好ましくは１１個以上）のアミノ酸からなるペプチドを意味する。本発明における「部分ペプチド」としては、対応する特定のタンパク質の全長のアミノ酸配列（以下、「対応する全長アミノ酸配列」とも表示する。）のうち、一部のアミノ酸配列からなる限り、アミノ酸数の上限に特に制限はなく、対応する全長アミノ酸配列のアミノ酸数よりも１個又は２個以上少ないアミノ酸数であればよいが、対応する全長アミノ酸配列のアミノ酸数に対して９０％以下、７０％以下、５０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下のアミノ酸数が挙げられる。なお、対応する全長アミノ酸配列のアミノ酸数に対して特定の割合（％）のアミノ酸数を算出する場合、小数点以下の数値は切り捨てることとする。本発明における「部分ペプチド」のアミノ酸数の上限の具体例としては、１００個以下、５０個以下、３０個以下、２０個以下、１８個以下、１５個以下が挙げられる。本発明における「部分ペプチド」のアミノ酸数の好適な範囲の具体例として、５〜１００個、５〜５０個、７〜３０個、７〜２０個、９〜１８個、１１〜１５個が好ましく挙げられる。

本発明における「部分ペプチド」のアミノ酸配列は、対応する全長アミノ酸配列に基づいて適宜設定することができる。例えば、ＡＰＯＡ４の部分ペプチドは、ＡＰＯＡ４の全長アミノ酸配列（配列番号２５）中の任意の連続する５個以上（好ましくは７個以上、より好ましくは９個以上、さらに好ましくは１１個以上）のアミノ酸を選択することにより適宜設定することができる。

本発明における「部分ペプチド」としては、プロテアーゼで消化されたペプチド（本明細書において「プロテアーゼ消化ペプチド」とも表示する。）が好ましく挙げられ、かかるペプチドは、物質の濃度を質量分析法で測定する場合に特に好ましく挙げられる。上記プロテアーゼとしては、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、ブロメライン、エラスターゼ、クロストリパイン、Ｖ８プロテアーゼ、サーモリシン、リシルエンドペプチダーゼ、アルギニンエンドペプチダーゼ、プロリルエンドペプチダーゼ、アスパラギン酸−Ｎプロテアーゼ等が挙げられ、中でも、トリプシンが特に好ましく挙げられる。

本発明における「部分ペプチド」として、具体的には、以下の表１〜７に記載のトリプシン消化ペプチドが特に好ましく挙げられる。

本発明において、物質としては、本件物質群から選択される１又は２種以上（例えば３種以上、４種以上又は５種以上）の物質であればよいが、より高い判定精度を得る観点から、ＡＰＯＡ４の部分ペプチド、ＡＰＯＡ１の部分ペプチド、ＩＴＩＨ３の部分ペプチド、ＡＰＯＡ４、ＡＰＯＡ１及びＩＴＩＨ３からなる群から選択される１種又は２種以上（例えば３種以上、４種以上又は５種以上）や、ＡＰＯＡ４の部分ペプチド、ＡＰＯＡ１の部分ペプチド、ＴＴＨＹの部分ペプチド、Ｑ５ＶＹ３０の部分ペプチド、Ｈ０ＹＡＣ１の部分ペプチド、ＢＴＤの部分ペプチド及びＩＴＩＨ３の部分ペプチドからなる群から選択される１種又は２種以上（例えば３種以上、４種以上又は５種）が好ましく挙げられ、ＡＰＯＡ４の部分ペプチド、ＡＰＯＡ１の部分ペプチド及びＩＴＩＨ３の部分ペプチドからなる群から選択される１種、好ましくは２種、より好ましくは３種がより好ましく挙げられ、ＡＰＯＡ４のプロテアーゼ消化ペプチド、ＡＰＯＡ１のプロテアーゼ消化ペプチド及びＩＴＩＨ３プロテアーゼ消化ペプチドからなる群から選択される１種、好ましくは２種、より好ましくは３種がさらに好ましく挙げられ、ＡＰＯＡ４のトリプシン消化ペプチド、ＡＰＯＡ１のトリプシン消化ペプチド及びＩＴＩＨ３トリプシン消化ペプチドからなる群から選択される１種、好ましくは２種、より好ましくは３種がさらにより好ましく挙げられる。

ＡＰＯＡ４のトリプシン消化ペプチドとして、具体的には、配列番号５〜１４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられ、より高い判定精度を得る観点から、配列番号６〜１４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドが好ましく、配列番号９〜１４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドがより好ましく、配列番号１０、１２〜１４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドがさらに好ましく、配列番号１２又は１４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドがさらにより好ましく、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるペプチドが最も好ましく挙げられる。また、膵がんと、他のがん（胆管がん、結腸がん、十二指腸がん、及び胃がん）を判別する観点からは、配列番号９、１０、１２に示されるアミノ酸配列からなるペプチドが好ましい。ＩＴＩＨ３のトリプシン消化ペプチドとして、具体的には、配列番号１〜３に示されるアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられ、より高い判定精度を得る観点から、配列番号２又は３に示されるアミノ酸配列からなるペプチドが好ましく挙げられ、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチドがより好ましく挙げられる。ＴＴＨＹのトリプシン消化ペプチドとして、具体的には、配列番号２３又は２４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられ、より高い判定精度を得る観点から、配列番号２３に示されるアミノ酸配列からなるペプチドが好ましく挙げられる。

本発明において判定や診断の対象となる本発明におけるがんとしては、膵がん、胃がん、大腸がん、十二指腸がん及び胆管がんからなる群から選択される１種又は２種以上（例えば３種以上、４種以上又は５種）のがんである限り特に制限されないが、中でも、膵がん、又は膵がんを含む２種以上（例えば３種以上、４種以上又は５種）のがんであることが好ましく、中でも、膵がんがより好ましく、中でも、早期膵がんが特に好ましい。早期膵がんとは、ステージ０、ステージＩ又はステージIIの膵がんを意味する。

上記被検者としては、ヒトである限り特に制限されないが、本発明におけるがんのうち、少なくとも１種のがん（好ましくは膵がん）の有無又は発症リスクが不明であるヒトであることが好ましく、本発明におけるがんのうち、好ましくは２種以上（好ましくは、膵がんを含む２種以上のがん）、より好ましくは３種以上（好ましくは、膵がんを含む３種以上のがん）、さらに好ましくは４種以上（好ましくは、膵がんを含む４種以上のがん）、より好ましくは５種のがんの有無又は発症リスクが不明であるヒトが好ましく挙げられる。

本発明において測定の対象とする判定用血液試料としては、被検者から採取された血清、血漿、全血などが挙げられ、中でも血清が好ましく挙げられる。

本発明における工程（ｂ）としては、工程（ａ）で測定した物質の濃度を、対照となる健常血液試料中のその物質の濃度と比較する工程である限り特に制限されない。

本発明において、判定用血液試料中の本件物質群の濃度は、採取された判定用血液試料中の本件物質群を特異的に検出できる公知の方法、例えば、質量分析法を用いて測定することができる。かかる質量分析法とは、判定用血液試料中に含まれる本件物質群を、イオン源を用いて気体状のイオンとし（イオン化）、分析部において、真空中で運動させ電磁気力を用いて、或いは飛行時間差によりイオン化した血液試料を質量電荷比に応じて分離し、検出できる質量分析計を用いた測定方法のことをいう。上記のイオン源を用いてイオン化する方法としては、例えば、電子イオン化（ＥＩ）法、化学イオン化（ＣＩ）法、電界脱離イオン化（ＦＤ）法、高速原子衝撃（ＦＡＢ）法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法を挙げることができる。また、分析部において、各種イオン化法によりイオン化した本件物質群は、アナライザーで質量に応じて分離される。かかるアナライザーとしては、例えば、磁場型質量分離装置（Ｓｅｃｔｏｒ ＭＳ）、四重極型質量分離装置（ＱＭＳ）、飛行時間型質量分離装置（ＴＯＦＭＳ）、フーリエ変換イオンサイクロトロン型質量分離装置（ＦＴ−ＩＣＲＭＳ）を挙げることができ、さらにこれらを組み合わせたものでもよい。また、２以上の質量分析法を組み合わせたタンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を利用することができる。また、ガスクロマトグラフ（ＧＣ）、液体クロマトグラフ（ＬＣ）、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）、超高速液体クロマトグラフ（ＵＨＰＬＣ）により、判定用血液試料中に含まれる本件物質群を、夾雑物から分離・精製して分析することができる。かかるＬＣ、ＨＰＬＣ、及びＵＨＰＬＣとしては、陽イオン又は陰イオン交換クロマトグラフや、順相又は逆相クロマトグラフを挙げることができ、これらを組み合わせたものであってもよい。

本発明において、判定用血液試料中の本件物質群の濃度は、絶対値であっても、相対値であってもよく、相対値とする場合、例えば、濃度が既知の本件物質群（内部標準）を基準とした相対値を挙げることができる。

本発明において、「対照となる健常血液試料中のその物質の濃度」（「対照試料における物質濃度」）は、比較対象である「被検者における物質濃度」に対応するものを用いる。このため、「被検者における物質濃度」が絶対値である場合は、「対照試料における物質濃度」も絶対値を用い、「被検者における物質濃度」が相対値である場合は、「対照試料における物質濃度」も相対値を用いる。上記「対照となる健常血液試料中のその物質の濃度」は、本件判定方法等を実施する際、健常者（対照者）から採取された血液試料（すなわち「健常血液試料」）を用いてその都度測定してもよいが、予め測定したものを用いてもよい。また、上記健常血液試料は、被検者由来の判定用血液試料と同種の血液試料を用いることが好ましく、例えば、被検者由来の判定用血液試料が血清、血漿又は全血である場合は、健常血液試料もそれと同種の血液試料を用いることが好ましい。また、健常血液試料は、健常者から採取された後に、被検者由来の判定用血液試料と同様の処理が施されたものが好ましい。

本発明における工程（ｂ）の好ましい態様としては、工程（ａ）で測定した２種以上の物質の各濃度と、対照となる健常血液試料中の２種以上の物質の各濃度とを、２種以上の物質の各濃度を変数とする多変量解析における予測式（以下、「多変量解析方程式」とも表示する。）に代入して得た予測値を比較する工程が好ましく挙げられる。

上記の「多変量解析」としては、多変量解析が、多重ロジスティック回帰分析又は重回帰分析が好ましく挙げられ、中でも、多重ロジスティック回帰分析がより好ましく挙げられ、ステップワイズ法の多重ロジスティック回帰分析がさらに好ましく挙げられる。これらの多変量解析により、上記の予測式を算出することや、その予測式に物質の各濃度を代入して予測値を得ること等は、市販のデータ解析ソフトウェアを用いて行うことができる。早期膵がん群と健常群における、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（すなわち、ＡＰＯＡ４のトリプシン消化ペプチド）、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（すなわち、ＡＰＯＡ１のトリプシン消化ペプチド）、及び、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（すなわち、ＩＴＩＨ３トリプシン消化ペプチド）の３種の濃度（ピーク強度）を、多重ロジスティック回帰分析して算出した予測式（式（１））を以下に示す。

なお、式（１）中、「ＳＥＱ．２」は、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（すなわち、ＩＴＩＨ３トリプシン消化ペプチド）のピーク強度を示し、「ＳＥＱ．５」は、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（すなわち、ＡＰＯＡ１のトリプシン消化ペプチド）のピーク強度を示し、「ＳＥＱ．１２」は、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（すなわち、ＡＰＯＡ４のトリプシン消化ペプチド）のピーク強度を示す。被検者における上記３種のペプチドのピーク強度をこの予測式に代入した場合、その被検者が本発明におけるがん（好ましくは膵がん、より好ましくは早期膵がん）である確率が高いほど、又は、かかるがんの発症リスクが高いほど、予測式により得られる予測値の値が高くなる。

本発明における工程（ｃ）において、
工程（ａ）で測定した物質が上記［Ａグループ］の物質である場合、工程（ａ）で測定した「被検者における物質濃度」が、「対照試料における物質濃度」よりも低いとき、前記被検者が本発明におけるがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いと評価（判定）し、及び／又は、
工程（ａ）で測定した物質が上記［Ｂグループ］の物質である場合、工程（ａ）で測定した「被検者における物質濃度」が、「対照試料における物質濃度」よりも高いとき、前記被検者が本発明におけるがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いと評価（判定）する。

「被検者における物質濃度」が、「対照試料における物質濃度」よりも低いか否か、或いは高いか否かを判定するための閾値（カットオフ値）は、当業者であれば、物質の種類等に応じて適宜設定することができる。かかる閾値としては、例えば、「対照試料における物質濃度」の平均値（以下、単に「平均値」とも表示する。）、「平均値＋標準偏差（ＳＤ）」、「平均値＋２ＳＤ」、「平均値＋３ＳＤ」、「対照試料における物質濃度」の中央値（以下、単に「中央値」とも表示する。）、「中央値＋ＳＤ」、「中央値＋２ＳＤ」、「中央値＋３ＳＤ」、「対照試料における物質濃度」の四分位値（２５％値又は７５％値）等を挙げることができる。また、その他の閾値として、対照試料群（例えば１０〜２０名の健常者からなる健常者群）における物質の濃度の平均値と、本発明におけるがんのいずれか１種の患者群（例えば１０〜２０名の患者からなる患者群）におけるその物質の濃度の平均値とを平均した値；や、対照試料群（例えば１０〜２０名の健常者からなる健常者群）における物質の濃度の中央値と、本発明におけるがんのいずれか１種の患者群（例えば１０〜２０名の患者からなる患者群）におけるその物質の濃度の中央値とを平均した値；も挙げることができる。また、閾値は、「感度」（本発明におけるがんを有している者を、陽性（がんを有している可能性が高い）と正しく判定できる割合）と、「特異度」（本発明におけるがんを有していない者を、陰性（がんを有している可能性が低い）と正しく判定できる割合）とが高くなるように、「被検者における物質濃度」のデータと、「対照試料における物質濃度」のデータを基に、統計解析ソフトウェアを用いたＲＯＣ（Receiver Operating Characteristic）曲線を用いて算出することもできる。ＲＯＣ曲線を用いて閾値を算出する具体的な方法は例えば以下のとおりである。
統計解析ソフトウェア等を用いてＲＯＣ曲線を描く際に、感度と特異度が変化する全ての測定値（ペプチド濃度の測定値）を提示することができる。その全ての測定値における感度、特異度について、ＲＯＣ曲線のグラフの左上の端の点（感度＝１、１−特異度＝０）からの距離を以下の式で算出し、その距離が最も小さい測定値を閾値として採用することができる。
（ＲＯＣ曲線のグラフの左上の端の点からの距離）^２＝（１−感度）^２＋（１−特異度）^２
また、感度と特異度の和が最大となる値（Youden's index）を閾値として採用することもできる。

本発明において、本発明におけるがんの判定精度（診断制度）としては、本発明におけるがんのうち、少なくともいずれか１種のがん（好ましくは膵がん、より好ましくは早期膵がん）の感度及び特異度が共に、０．６以上、好ましくは０．６５以上、より好ましくは０．７以上、さらに好ましくは０．７５以上、より好ましくは０．８以上、さらに好ましくは０．８５以上、より好ましくは０．９以上であることが好適に挙げられる

本発明において、物質が上記［Ａグループ］の物質である場合、被検者におけるその物質の濃度が、「対照試料における物質濃度」よりもどの程度低下したときに、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いと評価することができるかは、本発明におけるがんの種類やその者の個人的な特徴等により異なるため、一概に特定することはできないが、好ましくは１０％以上の減少、より好ましくは１５％以上の減少、さらに好ましくは２０％以上の減少、さらにより好ましくは３０％以上の減少が挙げられ、これらの数値は本発明におけるがんが膵がん（好ましくは、早期膵がん）である場合に好適に適用できる。より具体的には、[Ａグループ]の物質がＡＰＯＡ１の部分ペプチド、又は、ＡＰＯＡ１である場合の、上記の低下する程度としては、好ましくは１０％以上の減少、より好ましくは１５％以上の減少、さらに好ましくは２０％以上の減少、さらにより好ましくは３０％以上の減少、より好ましくは３５％以上の減少が挙げられ、これらの数値は本発明におけるがんが膵がん（好ましくは、早期膵がん）である場合に好適に適用できる。また、[Ａグループ]の物質がＡＰＯＡ４の部分ペプチド、又は、ＡＰＯＡ４である場合の、上記の低下する程度としては、好ましくは１０％以上の減少、より好ましくは１５％以上の減少、さらに好ましくは２０％以上の減少、さらにより好ましくは３０％以上の減少、より好ましくは３５％以上の減少が挙げられ、これらの数値は本発明におけるがんが膵がん（好ましくは、早期膵がん）である場合に好適に適用できる。

本発明において、物質が上記［Ｂグループ］の物質である場合、被検者におけるその物質の濃度が、「対照試料における物質濃度」よりもどの程度上昇したときに、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いと評価することができるかは、本発明におけるがんの種類やその者の個人的な特徴等により異なるため、一概に特定することはできないが、好ましくは１０％以上の上昇、より好ましくは１５％以上の上昇、さらに好ましくは２０％以上の上昇、さらにより好ましくは３０％以上の上昇、より好ましくは３５％以上の上昇が挙げられ、これらの数値は本発明におけるがんが膵がん（好ましくは、早期膵がん）である場合に好適に適用できる。より具体的には、[Ｂグループ]の物質がＩＴＩＨ３の部分ペプチド、又は、ＩＴＩＨ３である場合の、上記の上昇する程度としては、好ましくは１０％以上の上昇、より好ましくは１５％以上の上昇、さらに好ましくは２０％以上の上昇、さらにより好ましくは３０％以上の上昇、より好ましくは３５％以上の上昇が挙げられ、これらの数値は本発明におけるがんが膵がん（好ましくは、早期膵がん）である場合に好適に適用できる。

本発明において、工程（ｂ）が、工程（ａ）で測定した２種以上の物質の各濃度と、対照となる健常血液試料中の２種以上の物質の各濃度とを、２種以上の物質の各濃度を変数とする多変量解析における予測式に代入して得た予測値を比較する工程である場合は、工程（ｃ）として以下の工程が好ましく挙げられる。
工程（ｂ）における予測式が、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い場合又は前記がんの発症リスクが高い場合に予測値が高くなる予測式である場合には、工程（ｃ）は、被検者について得られた予測値が健常血液試料について得られた予測値よりも高いときに、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いと評価する工程であり、
工程（ｂ）における予測式が、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い場合又は前記がんの発症リスクが高い場合に予測値が低くなる予測式である場合には、工程（ｃ）は、被検者について得られた予測値が健常血液試料について得られた予測値よりも低いときに、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いと評価する工程；

本発明のより好適な態様として、
[Ｂグループ]がさらにＣＡ１９−９抗原を含んでおり、
工程（ａ）で濃度を測定する物質が、［Ａグループ］及び［Ｂグループ］に記載される物質群から選択される２種以上の物質であって、少なくともＣＡ１９−９抗原を含んでいることが挙げられる。判定にさらにＣＡ１９−９抗原の濃度を用いると、膵がんの判定精度をより高めることができる場合がある。

早期膵がん群と健常群における、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（すなわち、ＡＰＯＡ４のトリプシン消化ペプチド）、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（すなわち、ＡＰＯＡ１のトリプシン消化ペプチド）、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（すなわち、ＩＴＩＨ３トリプシン消化ペプチド）、及び、ＣＡ１９−９抗原の４種の濃度（ピーク強度）を、多重ロジスティック回帰分析して算出した予測式（式（２））を以下に示す。

なお、式（２）中、「ＳＥＱ．２」は、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（すなわち、ＩＴＩＨ３トリプシン消化ペプチド）のピーク強度を示し、「ＳＥＱ．５」は、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（すなわち、ＡＰＯＡ１のトリプシン消化ペプチド）のピーク強度を示し、「ＳＥＱ．１２」は、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（すなわち、ＡＰＯＡ４のトリプシン消化ペプチド）のピーク強度を示し、「ＣＡ１９．９」は、ＣＡ１９−９のピーク強度を示す。被検者における上記４種のピーク強度をこの予測式に代入した場合、その被検者が本発明におけるがん（好ましくは膵がん、より好ましくは早期膵がん）である確率が高いほど、又は、かかるがんの発症リスクが高いほど、予測式により得られる予測値の値が高くなる。また、式（２）の予測式は、前述の式（１）の予測式よりも本発明におけるがん（好ましくは膵がん、より好ましくは早期膵がん）の判定精度が高い点で好ましく挙げられる。

工程（ｂ）における予測式が、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い場合又は前記がんの発症リスクが高い場合に予測値が高くなる予測式である場合には、工程（ｃ）において、本発明におけるがんのいずれか１種を有する者におけるその予測値が、対照試料におけるその予測値よりも上昇する程度としては、本発明におけるがんの種類や、その者の個人的な特徴や、予測式の内容等により異なるため、一概に特定することはできないが、好ましくは１０％以上の上昇、より好ましくは３０％以上の上昇、さらに好ましくは５０％以上の上昇、さらにより好ましくは８０％以上の上昇、より好ましくは１００％以上の上昇、さらに好ましくは１５０％以上の上昇、さらにより好ましくは２００％以上の上昇、より好ましくは３００％以上の上昇が挙げられ、これらの数値は本発明におけるがんが膵がん（好ましくは、早期膵がん）である場合に好適に適用できる。

工程（ｂ）における予測式が、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い場合又は前記がんの発症リスクが高い場合に予測値が低くなる予測式である場合には、工程（ｃ）において、本発明におけるがんのいずれか１種を有する者におけるその予測値が、対照試料におけるその予測値よりも減少する程度としては、本発明におけるがんの種類や、その者の個人的な特徴や、予測式の内容等により異なるため、一概に特定することはできないが、好ましくは１０％以上の減少、より好ましくは３０％以上の減少、さらに好ましくは５０％以上の減少、さらにより好ましくは８０％以上の減少、より好ましくは１００％以上の減少、さらに好ましくは１５０％以上の減少、さらにより好ましくは２００％以上の減少、より好ましくは３００％以上の減少が挙げられ、これらの数値は本発明におけるがんが膵がん（好ましくは、早期膵がん）である場合に好適に適用できる。

本発明における判定方法等のより好適な態様として、物質が、ＡＰＯＡ４の部分ペプチド又はＡＰＯＡ１の部分ペプチドを少なくとも含んでおり、
判定方法等が、工程（ａ）で測定したＡＰＯＡ４の部分ペプチド又はＡＰＯＡ１の部分ペプチドの濃度が、対照となる健常血液試料中のＡＰＯＡ４の部分ペプチド又はＡＰＯＡ１の部分ペプチドの濃度と比較して低い程度がより大きいとき、前記被検者が膵がんを有している可能性が高い又は前記被験者における膵がんの発症リスクが高いと評価する（好ましくは、被検者が、胃がん、肝細胞癌、食道がん、結腸がんではなく、膵がんを有している可能性が高い又は前記被験者における膵がんの発症リスクが高いと評価する、より好ましくは、被検者が、胃がん、肝細胞癌、食道がんではなく、膵がんを有している可能性が高い又は前記被験者における膵がんの発症リスクが高いと評価する）工程（ｄ）をさらに含む判定方法等が挙げられる。また、本発明における判定用バイオマーカーのより好適な態様として、物質が、ＡＰＯＡ４の部分ペプチド又はＡＰＯＡ１の部分ペプチドを少なくとも含んでおり、
被検者から採取された判定用血液試料中のＡＰＯＡ４の部分ペプチド又はＡＰＯＡ１の部分ペプチドの濃度が、対照となる健常血液試料中のＡＰＯＡ４の部分ペプチド又はＡＰＯＡ１の部分ペプチドの濃度と比較して低い程度がより大きいとき、前記被検者が膵がんを有している可能性が高い又は前記被験者における膵がんの発症リスクが高いことが示される（好ましくは、被検者が、胃がん、肝細胞癌、食道がん、結腸がんではなく、膵がんを有している可能性が高い又は前記被験者における膵がんの発症リスクが高いことが示される、より好ましくは、被検者が、胃がん、肝細胞癌、食道がんではなく、膵がんを有している可能性が高い又は前記被験者における膵がんの発症リスクが高いことが示される）判定用バイオマーカーが挙げられる。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

１．ヒト血清からのペプチド試料の調製
以下の方法で、ヒト血清からペプチド試料を調製した。

１−１ 方法
ヒトから血清を採取し、尿素溶液中でタンパク質変性処理を行った後、ペプチダーゼによる消化処理を行い、ペプチド試料を調製した。より具体的には、ヒトから採取した血清を１０分の１に希釈した希釈血清１０μＬに、８Ｍ尿素溶液１５μＬを添加して、タンパク質変性処理を行った後、還元アルキル化を行い、次いで、リジルエンドペプチダーゼ及びトリプシンで処理して、ペプチド試料を調製した。

２．早期膵がんの判定用バイオマーカーの候補のスクリーニング
早期膵がんの判定用バイオマーカーの候補をスクリーニングするために、早期膵がん患者由来の血清試料を用いたＳＷＡＴＨ−ＭＳ測定法を行った。

２−１ 方法
早期膵がん群（ステージI［６名］及びステージII［２４名］の早期膵がん患者３０名
［男性１８名、女性１２名］）と、比較対照として健常群（健常者３０名［男性１３名、女性１７名］）から血清を採取し、上記実施例１の「方法」の項目に記載の方法に従ってペプチド試料を調製した。ナノＬＣシステム（Ultimate 3000 RSLCnano；DIONEX社製）を、正イオン化モードで作動させたナノＥＳＩ−質量分析計（TripleTOF 5600； SCIEX社製）に接続し、ＩＤＡ測定法及びＳＷＡＴＨ−ＭＳ測定法を用いて、調製したペプチド試料を分析した。

２−２ 結果
早期膵がん群と、健常群との間で発現が変動するペプチドとして、１１種類のタンパク質（ＩＴＩＨ３、Ｑ５ＶＹ３０、ＡＰＯＡ１、ＡＰＯＡ４、ＢＴＤ、Ｈ０ＹＡＣ１、ＫＮＧ１、ＡＰＯＢ、ＦＥＴＵＡ、ＡＰＯＥ、及びＴＴＨＹ）を構成する、以下の２４種類のペプチドが同定された。
３種類のＩＴＩＨ３ペプチド（ＥＶＳＦＤＶＥＬＰＫ［配列番号１］、ＥＨＬＶＱＡＴＰＥＮＬＱＥＡＲ［配列番号２］、及びＤＹＩＦＧＮＹＩＥＲ［配列番号３］）；
１種類のＱ５ＶＹ３０ペプチド（ＹＷＧＶＡＳＦＬＱＫ［配列番号４］）；
１種類のＡＰＯＡ１ペプチド（ＴＨＬＡＰＹＳＤＥＬＲ［配列番号５］）；
９種類のＡＰＯＡ４ペプチド（ＳＥＬＴＱＱＬＮＡＬＦＱＤＫ［配列番号６］、ＬＧＥＶＮＴＹＡＧＤＬＱＫ［配列番号７］、ＥＡＶＥＨＬＱＫ［配列番号８］、ＳＬＡＰＹＡＱＤＴＱＥＫ［配列番号９］、ＳＬＡＥＬＧＧＨＬＤＱＱＶＥＥＦＲ［配列番号１０］、ＩＳＡＳＡＥＥＬＲ［配列番号１１］、ＬＬＰＨＡＮＥＶＳＱＫ［配列番号１２］、ＬＡＰＬＡＥＤＶＲ［配列番号１３］、及びＩＤＱＴＶＥＥＬＲ［配列番号１４］）；
１種類のＢＴＤペプチド（ＬＳＳＧＬＶＴＡＡＬＹＧＲ［配列番号１５］）；
１種類のＨ０ＹＡＣ１ペプチド（ＩＡＹＧＴＱＧＳＳＧＹＳＬＲ［配列番号１６］）；
１種類のＫＮＧ１ペプチド（ＹＦＩＤＦＶＡＲ［配列番号１７］）；
３種類のＡＰＯＢペプチド（ＡＬＶＤＴＬＫ［配列番号１８］、ＬＳＬＰＤＦＫ［配列番号１９］、及びＩＴＬＰＤＦＲ［配列番号２０］）；
１種類のＦＥＴＵＡペプチド（ＡＨＹＤＬＲ［配列番号２１］）；
１種類のＡＰＯＥペプチド（ＬＡＶＹＱＡＧＡＲ［配列番号２２］）；
２種類のＴＴＨＹペプチド（ＡＡＤＤＴＷＥＰＦＡＳＧＫ［配列番号２３］、及びＧＳＰＡＩＮＶＡＶＨＶＦＲ［配列番号２４］；

３．早期膵がんの判定用バイオマーカーの同定
実施例２のスクリーニングにより得られた２４種類のペプチドの中から、早期膵がんの判定用バイオマーカーを同定するために、ＭＲＭ測定法による定量解析を行った。その際、測定対象の早期膵がん患者と、比較対照の健常者の人数も増やして解析を行った。

３−１ 方法
早期膵がん群（ステージI［８名］及びステージII［５１名］の早期膵がん患者５９名
［男性３７名、女性２２名］）と、比較対照として健常群（健常者６６名［男性３１名、女性３５名］）から血漿を採取し、上記実施例１の「方法」の項目に記載の方法に従ってペプチド試料を調製し、マイクロＬＣシステム（microLC200；eksigent社製）を、正イオン化モードで作動させたナノＥＳＩ−三連四重極型質量分析計（QTRAP6500；SCIEX社製）に接続し、ＭＲＭ測定法を用いて、調製したペプチド試料中の上記２４種類のペプチドのピーク強度（すなわちピーク面積）を測定し、既知の濃度のペプチド（測定対象のペプチドと同じアミノ酸配列からなる、安定同位体標識ペプチド）のピーク強度（すなわちピーク面積）に対する相対値（例えば、図１の縦軸の「ピーク強度」に相当）を算出した。また、算出した定量値を基に、OriginPro（Light Stone株式会社製）を用いてＲＯＣ曲線を作成し、早期膵がん群と健常群の間で、ＡＵＣ値が０．７超を示すペプチドを、早期膵がんの判定用バイオマーカーとして同定した。また、早期膵がんの判定用バイオマーカーとして同定した各ペプチドのそれぞれについて閾値を設定し、早期膵がんの感度と特異度を算出した。

３−２ 結果
実施例２のスクリーニングにより得られた２４種類のペプチドのうち、７種類のタンパク質（ＩＴＩＨ３、Ｑ５ＶＹ３０、ＡＰＯＡ１、ＡＰＯＡ４、ＢＴＤ、Ｈ０ＹＡＣ１、及びＴＴＨＹ）を構成する、以下の１７種類のペプチドが、早期膵がんの判定用バイオマーカーとして同定された（表８参照）。
２種類のＩＴＩＨ３ペプチド（ＥＨＬＶＱＡＴＰＥＮＬＱＥＡＲ［配列番号２］、及びＤＹＩＦＧＮＹＩＥＲ［配列番号３］）；
１種類のＱ５ＶＹ３０ペプチド（ＹＷＧＶＡＳＦＬＱＫ［配列番号４］）；
１種類のＡＰＯＡ１ペプチド（ＴＨＬＡＰＹＳＤＥＬＲ［配列番号５］）；
９種類のＡＰＯＡ４ペプチド（ＳＥＬＴＱＱＬＮＡＬＦＱＤＫ［配列番号６］、ＬＧＥＶＮＴＹＡＧＤＬＱＫ［配列番号７］、ＥＡＶＥＨＬＱＫ［配列番号８］、ＳＬＡＰＹＡＱＤＴＱＥＫ［配列番号９］、ＳＬＡＥＬＧＧＨＬＤＱＱＶＥＥＦＲ［配列番号１０］、ＩＳＡＳＡＥＥＬＲ［配列番号１１］、ＬＬＰＨＡＮＥＶＳＱＫ［配列番号１２］、ＬＡＰＬＡＥＤＶＲ［配列番号１３］、及びＩＤＱＴＶＥＥＬＲ［配列番号１４］）；
１種類のＢＴＤペプチド（ＬＳＳＧＬＶＴＡＡＬＹＧＲ［配列番号１５］）；
１種類のＨ０ＹＡＣ１ペプチド（ＩＡＹＧＴＱＧＳＳＧＹＳＬＲ［配列番号１６］）；
２種類のＴＴＨＹペプチド（ＡＡＤＤＴＷＥＰＦＡＳＧＫ［配列番号２３］、及びＧＳＰＡＩＮＶＡＶＨＶＦＲ［配列番号２４］）；

かかる７種類のバイオマーカータンパク質のうち、ＩＴＩＨ３は、健常者と比べ早期膵がん患者において増加するのに対して、残りの６種類のタンパク質（Ｑ５ＶＹ３０、ＡＰＯＡ１、ＡＰＯＡ４、ＢＴＤ、Ｈ０ＹＡＣ１、及びＴＴＨＹ）は、健常者と比べ早期膵がん患者において減少するバイオマーカーである（表８参照）。早期膵がんの判定用バイオマーカーとして同定した各ペプチドのうち、血漿中のＩＴＩＨ３ペプチド（ＥＨＬＶＱＡＴＰＥＮＬＱＥＡＲ［配列番号２］）（図１Ａ）、ＡＰＯＡ１ペプチド（ＴＨＬＡＰＹＳＤＥＬＲ［配列番号５］）（図１Ｂ）、及びＡＰＯＡ４ペプチド（ＬＬＰＨＡＮＥＶＳＱＫ［配列番号１２］）（図１Ｃ）の濃度を、質量分析法により定量した結果をそれぞれ、図１Ａ、図１Ｂ及び図１Ｃに示す。また、早期膵がんの判定用バイオマーカーとして同定した各ペプチドのそれぞれについて閾値を設定し、早期膵がんの判定における感度と特異度を算出した結果も表８に示す。早期膵がんの判定用バイオマーカーとして同定した各ペプチドは、早期膵がんの判定において、好適な感度と特異度を示した。なお、上記の閾値は以下のように算出した。OriginPro（Light Stone株式会社製）を用いてＲＯＣ曲線を描く際に、感度と特異度が変化する全ての測定値（ペプチド濃度の測定値）が提示される。その全ての測定値における感度、特異度について、ＲＯＣ曲線のグラフの左上の端の点（感度＝１、１−特異度＝０）からの距離を以下の式で算出し、その距離が最も小さい測定値を表８における閾値として採用した。
（ＲＯＣ曲線のグラフの左上の端の点からの距離）^２＝（１−感度）^２＋（１−特異度）^２

表８中の「比率」は、各ペプチドについて、健常群に対する早期膵がん群の定量値の比率を示す。

４．バイオマーカーペプチドの組合せによる早期膵がんの判定
早期膵がん群及び健常群から採取した血漿を用いて、腫瘍マーカー（ＣＡ１９−９）測定ＥＬＩＳＡキットによりＣＡ１９−９濃度を測定し、両群を判別すると、ＡＵＣ値は０．８６１９であり、また、閾値を２４．９に設定した場合の感度及び特異度は、それぞれ７７．９７％及び８１．５４％であった。すなわち、本実施例で同定された１７種類のペプチド（表８参照）単独では、既存のがんマーカー（ＣＡ１９−９）よりも、早期膵がんの精度を上回るものはなかった。そこで、ＣＡ１９−９よりも精度よく早期膵がんを判定できるペプチドの組合せの探索を試みた。なお、感度や特異度の数値から、ＣＡ１９−９が早期膵がんの判定マーカーとして十分な精度を持っているようにも見えるがそれは正しくない。ＣＡ１９−９は消化器系のがんのマーカーとして人間ドック等の検診などでも用いられており、血液中のＣＡ１９−９濃度が高い被検者がその後精密検査を受けて、消化器のいずれかにがんがあるかを調べる。すなわち、現状では、数少ない早期膵がん患者の多くは、ＣＡ１９−９濃度が高いことをきっかけに早期膵がんを発見した者であるため、早期膵がんとＣＡ１９−９濃度の相関関係が見かけ上、高くなっていると考えられる。しかし、実際は、膵がんは早期ではほとんどが見過ごされており、ＣＡ１９−９は早期膵がんのマーカーとしての実用性は低いと考えられる。

４−１ 方法
表８に示す１７種類のペプチドについて、実施例３で得られた早期膵がん群及び健常群における定量結果を基に、或いは、かかる定量結果に加えて、血漿中のＣＡ１９−９濃度の測定値を基に、統計解析ソフト（「EZR on R commander」、Version 1.33）を用いた多重ロジスティック回帰分析を行い、早期膵がんの発生確率（Ｐ）を予測した。

４−２ 結果
ＩＴＩＨ３ペプチド（ＥＨＬＶＱＡＴＰＥＮＬＱＥＡＲ［配列番号２］）、ＡＰＯＡ１ペプチド（ＴＨＬＡＰＹＳＤＥＬＲ［配列番号５］）、及びＡＰＯＡ４ペプチド（ＬＬＰＨＡＮＥＶＳＱＫ［配列番号１２］）の３種類のペプチドを組み合わせて、早期膵がん群及び健常群を判別すると、ＡＵＣ値は０．９００７であり、また、閾値を０．６１２８に設定した場合の感度及び特異度は、それぞれ７４．５８％及び９３．８５％であり、ＣＡ１９−９よりも精度よく早期膵がんを判定できることが示された（図２Ａ参照）。なお、上記３種類のペプチドの組合せを用いた早期膵がんの発生確率は、以下の式（１）に示す多重ロジスティック回帰方程式を用いて算出した。

［式（１）中、「ＳＥＱ．２」は、ＩＴＩＨ３ペプチド（ＥＨＬＶＱＡＴＰＥＮＬＱＥＡＲ［配列番号２］）のピーク強度（図１Ａ参照）を示し、「ＳＥＱ．５」は、ＡＰＯＡ１ペプチド（ＴＨＬＡＰＹＳＤＥＬＲ［配列番号５］）のピーク強度（図１Ｂ参照）を示し、「ＳＥＱ．１２」は、ＡＰＯＡ４ペプチド（ＬＬＰＨＡＮＥＶＳＱＫ［配列番号１２］）のピーク強度（図１Ｃ参照）を示す。］

また、上記３種類のペプチドと、ＣＡ１９−９とを組み合わせて、早期膵がん群及び健常群を判別すると、ＡＵＣ値は０．９３４３であり、また、閾値を０．４７６７に設定した場合の感度及び特異度は、それぞれ８４．７５％及び９３．８５％であり、上記３種類のペプチドの組合せよりも精度よく早期膵がんを判定できることが示された（図２Ｂ参照）。なお、上記３種類のペプチドと、ＣＡ１９−９との組合せを用いた早期膵がんの発生確率は、以下の式（２）に示す多重ロジスティック回帰方程式を用いて算出した。

［式（２）中、「ＳＥＱ．２」は、ＩＴＩＨ３ペプチド（ＥＨＬＶＱＡＴＰＥＮＬＱＥＡＲ［配列番号２］）のピーク強度（図１Ａ参照）を示し、「ＳＥＱ．５」は、ＡＰＯＡ１ペプチド（ＴＨＬＡＰＹＳＤＥＬＲ［配列番号５］）のピーク強度（図１Ｂ参照）を示し、「ＳＥＱ．１２」は、ＡＰＯＡ４ペプチド（ＬＬＰＨＡＮＥＶＳＱＫ［配列番号１２］）のピーク強度（図１Ｃ参照）を示し、「ＣＡ１９．９」は、ＣＡ１９−９濃度の測定値を示す。］

なお、同じタンパク質由来のペプチドであれば、別のアミノ酸配列のペプチドであっても、ある程度類似した診断性能を持つかを調べるために、同じタンパク質由来のペプチド間のシグナル強度の相関係数を算出した。その結果を表９〜１２に示す。

表９〜１２から分かるように、同じタンパク質由来のペプチド間ではシグナル強度の相関性が比較的高いことが示された。したがって、同じタンパク質由来のペプチドであれば、別のアミノ酸配列のペプチドであっても、おおむね類似した診断性能を有する傾向が示された。ただし、表８に示されているように、同じタンパク質由来のペプチドであっても、診断性能が優れている程度には差もあった。

５．バイオマーカーペプチドの組合せによる膵がん発症リスクの判定
本実施例で同定した早期膵がんの判定用バイオマーカーが、（早期）膵がん発症リスクの判定にも有効であるか否かを検証した。

５−１ 方法
慢性膵炎患者や前膵がん病変患者は、膵がんを発症するリスクが健常人よりも高いと一般的にされている。慢性膵炎患者（３名）及び前膵がん病変患者（２７名）を、前膵がん病変・慢性膵炎群とした。かかる前膵がん病変・慢性膵炎群から血漿を採取し、実施例１の「方法」の項目に記載の方法に従って、ペプチド試料を調製し、上記３種類のペプチド、すなわち、ＩＴＩＨ３ペプチド（ＥＨＬＶＱＡＴＰＥＮＬＱＥＡＲ［配列番号２］）、ＡＰＯＡ１ペプチド（ＴＨＬＡＰＹＳＤＥＬＲ［配列番号５］）、及びＡＰＯＡ４ペプチド（ＬＬＰＨＡＮＥＶＳＱＫ［配列番号１２］）の濃度を定量した。得られた定量結果を基に、あるいは、かかる定量結果に加えて、血漿中のＣＡ１９−９濃度の測定値を基に、実施例４の「方法」の項目に記載の多重ロジスティック回帰分析を行い、前膵がん病変・慢性膵炎の発生確率を予測した。なお、上記３種類のペプチドの組合せを用いた前膵がん病変・慢性膵炎の発生確率は、上記式（１）に示す多重ロジスティック回帰方程式を用いて算出し、上記３種類のペプチドと、ＣＡ１９−９との組合せを用いた前膵がん病変・慢性膵炎の発生確率は、上記式（２）に示す多重ロジスティック回帰方程式を用いて算出した。

上記３種類のペプチドを組み合わせて、前膵がん病変・慢性膵炎群及び健常群を判別すると、前膵がん病変・慢性膵炎群における前膵がん病変・慢性膵炎の発生確率は、０．６０２９であり、健常群における前膵がん病変・慢性膵炎の発生確率（０．２３３８）と比べ高かった（図２Ａ参照）。また、上記３種類のペプチドと、ＣＡ１９−９とを組み合わせて前膵がん病変・慢性膵炎群及び健常群を判別した場合も同様に、前膵がん病変・慢性膵炎群における前膵がん病変・慢性膵炎の発生確率（０．４９５３）は、健常群における前膵がん病変・慢性膵炎の発生確率（０．１７０４）と比べ高かった（図２Ｂ参照）。
これらの結果は、膵がんを将来発症するリスクが健常人よりも高い者から採取された血漿中の上記３種類のペプチド濃度は、健常人における上記３種類のペプチド濃度と比べ、変動することを示している。

また、前膵がん病変・慢性膵炎群及び健常群の血漿中の上記３種類のペプチド濃度を基に、ＲＯＣ曲線を作成したところ、ＡＵＣ値は、０．８１１６と高い値を示した。また、前膵がん病変・慢性膵炎群と、健常群とを区別するためのカットオフ値として、０．４４８１を設定したところ、前膵がん病変・慢性膵炎患者の感度（前膵がん病変・慢性膵炎群の中で検査陽性者の割合）及び特異度（健常群の中で検査陰性の割合）は、それぞれ０．７６６７及び０．８０３０であった。
これらの結果は、膵がん発症前の対象者から採取された血漿中の上記３種類のペプチド濃度を測定し、適切なカットオフ値を設定すると、上記３種類のペプチド濃度を指標として、前膵がん病変・慢性膵炎を判定できる、すなわち、膵がんを発症するリスクの高低を判定できることを示している。前膵がん病変・慢性膵炎である可能性が高い場合は、膵がんを発症するリスクが高いと判定することができ、膵がん病変・慢性膵炎である可能性が低い場合は、膵がんを発症するリスクが低いと判定することができる。

６．異なるステージの膵がんの判定
本実施例で同定した早期膵がんの判定用バイオマーカーが、中期〜末期（ステージIII〜IV）の膵がんの判定にも有効か否かを検討した。

６−１ 方法
ステージI膵がん群（ステージIの膵がん患者４名［男性１名、女性３名］）、ステージII膵がん群（ステージIIの膵がん患者１９名［男性１３名、女性６名］）、ステージIII膵がん群（ステージIIIの膵がん患者２６名［男性１３名、女性１３名］）、及びステージIV膵がん群（ステージIVの膵がん患者５１名［男性３２名、女性１９名］）と、比較対照として健常群（健常者４４名［男性２９名、女性１５名］から血漿を採取し、実施例５の「方法」の項目に記載の方法に従って、上記３種類のペプチド（ＩＴＩＨ３ペプチド、ＡＰＯＡ１ペプチド、及びＡＰＯＡ４ペプチド）の濃度の定量と、得られた定量結果を基にした多重ロジスティック回帰分析を行い、各ステージの膵がんの発生確率を予測した。

６−２ 結果
上記３種類のペプチドを組み合わせて、ステージI〜IV膵がん群及び健常群を判別すると、いずれのステージの膵がんについても、ＣＡ１９−９よりも精度よく判定できることが示された（図３及び表１３参照）。

表１３中の数値は、上記３種類のペプチド（表１３中の「３種類のペプチド」）、上記３種類のペプチド、及びＣＡ１９−９（表１３中の「３種類のペプチド＋ＣＡ１９−９」）、並びにＣＡ１９−９（表中の「ＣＡ１９−９」）の定量結果をもとに、各ステージの膵がん群と健常群とを判別したときのＡＵＣ値を示す。

７．膵がん以外のがんの判定
本実施例で同定した早期膵がんの判定用バイオマーカーが、膵がん以外のがんの判定にも有効であるか否かを検証した。

７−１ 方法
７種類のがん群、すなわち、肝外胆管がん群（胆管がん患者１６名［男性１０名、女性６名］）、結腸がん群（結腸がん患者１２６名［男性７６名、女性５０名］）、十二指腸がん群（十二指腸がん患者８名［男性３名、女性５名］）、食道がん群（食道がん患者１０名［男性９名、女性１名］）、肝細胞がん群（肝細胞がん患者１２名［男性１０名、女性２名］）、肝内胆管がん群（肝内胆管がん患者９名［男性５名、女性４名］）、及び胃がん群（胃がん患者１１９名［男性８４名、女性３５名］）と、比較対照として健常群（健常者４４名［男性２９名、女性１５名］）、膵がん群（膵がん患者１０１名［男性６０名、女性４１名］）、前膵がん病変・慢性膵炎群（前がん病変の状態の慢性膵炎患者４９名［男性２４名、女性２５名］）、及び良性腫瘍群（良性腫瘍患者４４名［男性２２名、女性２２名］）とから血漿を採取し、実施例５の「方法」の項目に記載の方法に従って、上記３種類のペプチド（ＩＴＩＨ３ペプチド、ＡＰＯＡ１ペプチド、及びＡＰＯＡ４ペプチド）の濃度の定量と、得られた定量結果を基にした多重ロジスティック回帰分析を行い、上記７種類のがんの発生確率を予測した。

７−２ 結果
上記３種類のペプチドを組み合わせて、各種がん群及び健常群を判別すると、７種類のがん群のうち、４種類のがん群（胆管がん群、結腸がん群、十二指腸がん群、及び胃がん群）における各がんの発生確率は、それぞれ、０．７２４８、０．６９３７、０．８５３２及び０．６１０８であり、非がん群である健常群及び良性腫瘍群における各がんの発生確率（０．０９４９及び０．４２４９）と比べ高かった（図４Ａ参照）。また、上記３種類のペプチドと、ＣＡ１９−９とを組み合わせて各種がん群及び健常群を判別した場合も同様に、上記４種類のがん群における各がんの発生確率は、それぞれ、０．６８９１、０．５８４０、０．８２９３、及び０．５１３４であり、非がん群である健常群及び良性腫瘍群における各がんの発生確率（０．０７９１８及び０．３３９３）と比べ高かった（図４Ｂ参照）。
これらの結果は、胆管がん、結腸がん、十二指腸がん、及び胃がんを発症している者から採取された血漿中の上記３種類のペプチド濃度は、かかるがんを発症しない者における上記３種類のペプチド濃度と比べ、変動することを示している。
また、各群の血漿中の上記３種類のペプチド濃度を基に、健常群を判別するためのＲＯＣ曲線を作成したところ、上記４種類のがん群におけるＡＵＣ値は、ＣＡ１９−９を用いた場合と比べ、高い値を示した（表１４参照）。
これらの結果は、上記３種類のペプチドを組み合わせると、膵がんに加えて、４種類のがん（胆管がん、結腸がん、十二指腸がん、及び胃がん）を精度よく判定できることを示している。

表１４中の数値は、上記３種類のペプチド（表中の「３種類のペプチド」）、上記３種類のペプチド、及びＣＡ１９−９（表１４中の「３種類のペプチド＋ＣＡ１９−９」）、並びにＣＡ１９−９（表１４中の「ＣＡ１９−９」）の定量結果をもとに、各がん群と健常群とを判別したときのＡＵＣ値を示す。

８．膵がんと、他のがんとの判別
膵がんと、他のがん（胃がん、肝細胞癌、食道がん、結腸がん）とを判別可能なバイオマーカーの候補をスクリーニングするために、実施例７で用いた、膵がん以外の各がんの検体（各がんにつき１０検体）と、実施例６で用いた膵がん（１０検体）について、実施例３と同様の方法による定量プロテオーム解析により網羅的な探索を行った。その結果、膵がんと、他のがん（胃がん、肝細胞癌、食道がん、結腸がん）との判別能が最も高い分子として、ＡＰＯＡ４が同定された。この解析にはＡＰＯＡ４ペプチドとして、配列番号９、１０、１２を用いた。

各がん群における血漿中の各ＡＰＯＡ４ペプチド（配列番号９、１０又は１２）の濃度を定量した。ＡＰＯＡ４ペプチド濃度は、膵がんで最も低下し、他のがん（胃がん、肝細胞癌、食道がん、結腸がん）では膵がんほどは低下しないため、膵がんと他のがんとを判別することができることが示された。さらに、他のがんの中でも、特に、胃がん、肝細胞癌、食道がんでは、ＡＰＯＡ４ペプチド濃度があまり低下しないため、ＡＰＯＡ４ペプチド濃度により、膵がんとこれらの３種のがんとを、より精度よく判別することができる。

また、各がん群におけるＡＰＯＡ４ペプチド濃度のデータを基に、膵がんと他のいずれかのがんとを判別するＲＯＣ曲線をそれぞれ作成し、各ＡＵＣを算出した。その結果を表１５に示す。なお、ＡＰＯＡ４配列番号９、ＡＰＯＡ４配列番号１０、ＡＰＯＡ４配列番号１２の上段においては、膵がん群として、実施例６の膵がん群（ｎ＝１００）を用い、ＡＰＯＡ４配列番号１２の下段においては、膵がん群として実施例３の早期膵がん群のうち３８名（ｎ＝３８）と、実施例６の膵がん群（ｎ＝１００）を合わせた膵がん群を用い、胃がん群についてはいずれも実施例７の胃がん群（ｎ＝１１９）を用い、肝細胞がん群についてはいずれも実施例７の肝細胞がん群（ｎ＝１２）を用い、食道がん群についてはいずれも実施例７の食道がん群（ｎ＝１０）を用い、大腸がん群としてはいずれも実施例７の結腸がん群（ｎ＝１２６）を用いた。

表１５の結果から、ＡＰＯＡ４ペプチド（好ましくは配列番号９、１０、１２）を利用すると、膵がんと、他のがん（胃がん、肝細胞癌、食道がん、結腸がん）とを判別することができ、中でも、膵がんと、胃がん、肝細胞癌、食道がんとをより高精度で判別することができることが示された。

なお、各がん群（健常群ｎ＝１０９、早期膵がん群ｎ＝１３９、前膵がん病変群ｎ＝５６、膵炎群ｎ＝５、良性腫瘍群ｎ＝４１、結腸がん群ｎ＝１２６、食道がん群ｎ＝１０、肝細胞がん群ｎ＝１２、胃がん群ｎ＝１１９）における血漿中のＡＰＯＡ４ペプチド（配列番号１２）の濃度を定量した結果を図５に示す。図５から、ＡＰＯＡ４ペプチド濃度は、膵がんで最も低下し、他のがん（胃がん、肝細胞癌、食道がん、結腸がん）では膵がんほど低下しないため、膵がんと他のがんとを判別することができることが示された。さらに、他のがんの中でも、特に、胃がん、肝細胞癌、食道がんでは、ＡＰＯＡ４ペプチド濃度があまり低下しないため、ＡＰＯＡ４ペプチド濃度により、膵がんとこれらの３種のがんとを、より精度よく判別することができることが示された。

９．単一施設の症例における中期〜末期の膵がんの判定
本実施例で同定した早期膵がんの判定用バイオマーカーが、中期〜末期（ステージIII〜IV）の膵がんの判定にも有効であることは上記の実施例６においてすでに示した。ただし、この実験では複数の医療施設の患者の検体を使用していた。本実施例で同定した早期膵がんの判定用バイオマーカーが単一の医療施設の症例における中期〜末期（ステージIII〜IV）の膵がんの判定にも有効であることを念のため確認した。なお、単一の医療施設として、神戸大学医学部附属病院の膵がん患者の検体を使用した。

９−１ 方法
ステージIII及びIVの膵がん群（ステージIII及びIVの膵がん患者４３名と、比較対照として健常群（健常者４５名から血漿を採取し、実施例５の「方法」の項目に記載の方法に従って、上記３種類のペプチド（ＩＴＩＨ３ペプチド、ＡＰＯＡ１ペプチド、及びＡＰＯＡ４ペプチド）の濃度の定量と、得られた定量結果を基にした多重ロジスティック回帰分析を行い、ステージIII又はIVの膵がんの発生確率を予測した。

９−２ 結果
このような方法で予測したステージIII又はIVの膵がんの発生確率を図６に示す。また、図６の結果を基に作成したＲＯＣ曲線を図７に示す。このように、上記３種類のペプチドを組み合わせて、ステージIII及びIVの膵がん群と健常群とを判別すると、ＡＵＣ値は０．８５１と高い値を示した。また、ステージIII又はIVの膵がん群と、健常群とを区別するためのカットオフ値として、Youden's index（感度と特異度の和が最大となる値）である０．４２６を設定した場合の感度及び特異度は、それぞれ６９．８％及び９３．３％であった。これらの結果から、上記３種類のペプチド（ＩＴＩＨ３ペプチド、ＡＰＯＡ１ペプチド、及びＡＰＯＡ４ペプチド）を組み合わせると、ステージIII及びIVの膵がんについても、精度よく判定できることが示された（図６、図７）。

本発明によれば、膵がん、胃がん、大腸がん、十二指腸がん及び胆管がんからなる群から選択される１種又は２種以上のがん（好ましくは膵がん、より好ましくは早期膵がん）の有無や発症リスクを精度よく判定できる判定方法や、判定用バイオマーカー等を提供することができる。本発明によって膵がんを早期に発見することができれば、早期の段階での治療が可能となり、進行してから発見する場合に比べて５年生存率の大幅な向上が期待できる。

Claims (13)

1. 膵がん、胃がん、大腸がん、十二指腸がん及び胆管がんからなる群から選択される１種又は２種以上のがんの有無又は発症リスクの判定方法であって、
   前記判定方法が以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含むことを特徴とする、前記判定方法。
   （ａ）被検者から採取された判定用血液試料中の、以下の［Ａグループ］及び［Ｂグループ］に記載される物質群から選択される１又は２種以上の物質の濃度を測定する工程；
   ［Ａグループ］
   ＡＰＯＡ４の部分ペプチド、ＡＰＯＡ１の部分ペプチド、ＴＴＨＹの部分ペプチド、Ｑ５ＶＹ３０の部分ペプチド、Ｈ０ＹＡＣ１の部分ペプチド、ＢＴＤの部分ペプチド、ＡＰＯＡ４、ＡＰＯＡ１、ＴＴＨＹ、Ｑ５ＶＹ３０、Ｈ０ＹＡＣ１、ＢＴＤ
   ［Ｂグループ］
   ＩＴＩＨ３の部分ペプチド、ＩＴＩＨ３
   （ｂ）工程（ａ）で測定した物質の濃度を、対照となる健常血液試料中のその物質の濃度と比較する工程；
   （ｃ）工程（ａ）で測定した物質が[Ａグループ]の物質である場合、工程（ａ）で測定した物質の濃度が、対照となる健常血液試料中のその物質の濃度と比較して低いとき、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いと評価し、及び／又は、
   工程（ａ）で測定した物質が［Ｂグループ］の物質である場合、工程（ａ）で測定した物質の濃度が、対照となる健常血液試料中のその物質の濃度と比較して高いとき、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いと評価する工程；
2. 工程（ｂ）が、工程（ａ）で測定した２種以上の物質の各濃度と、対照となる健常血液試料中の２種以上の物質の各濃度とを、２種以上の物質の各濃度を変数とする多変量解析における予測式に代入して得た予測値を比較する工程であり、
   前記予測式が、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い場合に予測値が高くなる予測式である場合には、工程（ｃ）は、被検者について得られた予測値が健常血液試料について得られた予測値よりも高いときに、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いと評価する工程であり、
   前記予測式が、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い場合に予測値が低くなる予測式である場合には、工程（ｃ）は、被検者について得られた予測値が健常血液試料について得られた予測値よりも低いときに、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いと評価する工程であることを特徴とする請求項１に記載の判定方法。
3. 物質が、ＡＰＯＡ４の部分ペプチド、ＡＰＯＡ１の部分ペプチド、ＩＴＩＨ３の部分ペプチド、ＡＰＯＡ４、ＡＰＯＡ１及びＩＴＩＨ３からなる群から選択される１種又は２種以上である請求項１又は２に記載の判定方法。
4. 部分ペプチドがプロテアーゼで消化されたペプチドであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の判定方法。
5. 多変量解析が、ロジスティック回帰分析又は重回帰分析であることを特徴とする請求項２〜４のいずれかに記載の判定方法。
6. [Ｂグループ]がさらにＣＡ１９−９抗原を含んでおり、
   工程（ａ）で濃度を測定する物質が、［Ａグループ］及び［Ｂグループ］に記載される物質群から選択される２種以上の物質であって、少なくともＣＡ１９−９抗原を含んでいることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の判定方法。
7. 工程（ａ）における物質の濃度の測定を質量分析法により行うことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の判定方法。
8. 物質が、ＡＰＯＡ４の部分ペプチド又はＡＰＯＡ１の部分ペプチドを少なくとも含んでおり、
   判定方法が、工程（ａ）で測定したＡＰＯＡ４の部分ペプチド又はＡＰＯＡ１の部分ペプチドの濃度が、対照となる健常血液試料中のＡＰＯＡ４の部分ペプチド又はＡＰＯＡ１の部分ペプチドの濃度と比較して低い程度がより大きいとき、前記被検者が膵がんを有している可能性が高い又は前記被験者における膵がんの発症リスクが高いと評価する工程（ｄ）をさらに含むことを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の判定方法。
9. がんが、早期膵がんであることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の判定方法。
10. 以下の［Ａグループ］及び［Ｂグループ］に記載される物質群から選択される１又は２種以上の物質からなることを特徴とする、
    膵がん、胃がん、大腸がん、十二指腸がん及び胆管がんからなる群から選択される１種又は２種以上のがんの有無又は発症リスクの判定用バイオマーカーであって、
    物質が[Ａグループ]の物質である場合、被検者から採取された判定用血液試料中の前記物質の濃度が、対照となる健常者における前記物質の濃度と比べて低いとき、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いことが示され、
    物質が[Ｂグループ]の物質である場合、被検者から採取された判定用血液試料中の前記物質の濃度が、対照となる健常者における前記物質の濃度と比べて高いとき、前記被検者が前記１種又は２種以上のがんを有している可能性が高い又は前記被験者における前記がんの発症リスクが高いことが示される、
    前記判定用バイオマーカー。
    ［Ａグループ］
    ＡＰＯＡ４の部分ペプチド、ＡＰＯＡ１の部分ペプチド、ＴＴＨＹの部分ペプチド、Ｑ５ＶＹ３０の部分ペプチド、Ｈ０ＹＡＣ１の部分ペプチド、ＢＴＤの部分ペプチド、ＡＰＯＡ４、ＡＰＯＡ１、ＴＴＨＹ、Ｑ５ＶＹ３０、Ｈ０ＹＡＣ１、ＢＴＤ
    ［Ｂグループ］
    ＩＴＩＨ３の部分ペプチド、ＩＴＩＨ３
11. 物質が、ＡＰＯＡ４の部分ペプチド、ＡＰＯＡ１の部分ペプチド、ＩＴＩＨ３の部分ペプチド、ＡＰＯＡ４、ＡＰＯＡ１及びＩＴＩＨ３からなる群から選択される１種又は２種以上である請求項１０に記載の判定用バイオマーカー。
12. 物質が、ＡＰＯＡ４の部分ペプチド又はＡＰＯＡ１の部分ペプチドを少なくとも含んでおり、
    被検者から採取された判定用血液試料中のＡＰＯＡ４の部分ペプチド又はＡＰＯＡ１の部分ペプチドの濃度が、対照となる健常血液試料中のＡＰＯＡ４の部分ペプチド又はＡＰＯＡ１の部分ペプチドの濃度と比較して低い程度がより大きいとき、前記被検者が膵がんを有している可能性が高い又は前記被験者における膵がんの発症リスクが高いことが示される請求項１０又は１１に記載の判定用バイオマーカー。
13. がんが、早期膵がんであることを特徴とする請求項１０〜１２のいずれかに記載の判定用バイオマーカー。

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