BR112016007037B1

BR112016007037B1 - Método para detectar câncer pancreático

Info

Publication number: BR112016007037B1
Application number: BR112016007037-2A
Authority: BR
Inventors: Mitsuaki SANADA; Michimoto Kobayashi; Aiko Takayama; Yoshiyuki SASAJIMA; Giman Jung; Tesshi Yamada; Kazufumi Honda
Original assignee: National Cancer Center; Toray Industries, Inc
Priority date: 2013-10-01
Filing date: 2014-09-30
Publication date: 2023-12-26
Also published as: JPWO2015050107A1; DK3054298T3; CN105637366A; CA3189270A1; CA2925099C; CA2925099A1; EP3054298B1; BR112016007037A2; CN105637366B; KR20160065876A; KR102235380B1; EP3054298A1; RU2693006C2; US20160245815A1; RU2016116773A3; EP3054298A4; WO2015050107A1; JP6519056B2; CA3189276A1; RU2016116773A

Abstract

método para detectar câncer pancreático, anticorpo monoclonal e kit para a detecção de câncer pancreático. pretende-se fornecer um método para detectar um tumor pancreático (câncer pancreático ou tumor pancreático benigno) com baixa invasividade para um sujeito de teste e com alta sensibilidade e precisão de detecção. a presente invenção fornece um método para detectar um tumor pancreático por medição das quantidades de variantes de proteína apoa2 em uma amostra de um sujeito de teste com o uso de anticorpos anti-apoa2, anticorpos anti-apoa2 para uso no método, e um kit para a detecção de um tumor pancreático, que compreende os anticorpos.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a um método para detectar um tumor pancreático, isto é, câncer pancreático ou tumor pancreático benigno, que compreende medir as quantidades de variantes de proteína APOA2 em uma amostra de um sujeito de teste com o uso de anticorpos que se ligam especificamente a proteínas APOA2 (anticorpos anti-APOA2), anticorpos anti- APOA2 para uso no método e um kit para a detecção de câncer pancreático ou tumor pancreático benigno, que compreende os anticorpos.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA

[002] De acordo com as estatísticas de 2012, a causa número um de morte no Japão é câncer. Os cânceres são desenvolvidos a partir de tecidos normais e caracterizados pela formação de massas tumorais causadas pelo crescimento anormal de células cancerosas, da infiltração de células cancerosas que formam a massa tumoral para tecidos adjacentes e metástase distante para diversos órgãos através de vasos sanguíneos vasculares ou dutos linfáticos. As concentrações de várias proteínas nos fluidos corporais, como sangue ou urina de pacientes são conhecidos por variar nesse princípio e na progressão do câncer. Essas proteínas são chamadas de marcadores tumorais (marcadores para detecção de câncer) e espera-se ser aplicada para vários propósitos de diagnóstico incluindo a detecção precoce de câncer e acompanhamento pós-tratamento (por exemplo, Literaturas de Patentes 1 a 3). No entanto, os problemas dos marcadores tumorais convencionais usados no diagnóstico clínico são que a grande maioria deles oferece uma taxa positiva na ordem de 50 a 70% e a maioria dos marcadores tumorais exibem falso- negativo, especialmente, para cânceres precoces. Uma vez que os cânceres avançados ou cânceres terminais caracterizados por infiltração a tecidos adjacentes ou metástase distante resultam em prognóstico pobre, a detecção precoce é importante para o tratamento efetivo desses cânceres. Portanto, tem sido esperado a descoberta de um marcador tumoral capaz de detectar precocemente o câncer com excelente sensibilidade.

[003] Tumores pancreáticos referem-se a todos os tumores formados no pâncreas e são classificados em câncer pancreático, que é um tumor maligno e tumor pancreático benigno, que é um tumor benigno.

[004] O câncer pancreático é conhecido como um câncer intratável entre muitos cânceres. Qualquer método de tratamento efetivo exceto operação cirúrgica ainda não foi estabelecido. Portanto, a detecção precoce ou prevenção de seu princípio é especialmente importante. Marcadores tumorais séricos, CT helicoidal, aparelho de imagem por ressonância magnética (MRI), ultrassonografia endoscópica (EUS), ou similares são usados como um método para diagnosticar o câncer pancreático (Literatura Não Patente 1). No entanto, o câncer pancreático raramente exibe sinais em um estágio inicial e é com frequência detectado depois de se tornar câncer avançado. Portanto, esse câncer geralmente é difícil de tratar. Dessa forma, houve uma demanda por uma nova técnica de diagnóstico capaz de detectar exatamente e facilmente o câncer pancreático.

[005] Por outro lado, o tumor pancreático benigno é uma condição patológica em um estágio anterior ao câncer pancreático, e tem sido sugerido seu envolvimento no princípio do câncer pancreático. No entanto, o tumor pancreático benigno oferece melhor prognóstico do que o do câncer pancreático e é esperado para levar à prevenção de princípio de câncer pancreático por sua excisão através de operação cirúrgica. Portanto, para o tumor pancreático benigno, sua detecção precoce também é considerada importante.

[006] A proteína APOA2 (apolipoproteína A2 ou apolipoproteína A- II) (número de acesso no GenBank NP_001634.1) é um membro da família da apolipoproteína que constitui lipoproteínas plasmáticas. Dez ou mais apolipoproteínas são conhecidas até o momento e suas principais funções, por exemplo, são a estabilização estrutural das lipoproteínas, a ativação de enzimas envolvidas no metabolismo lipoproteico e efeitos como ligantes para receptores de lipoproteínas presentes na superfície celular. A proteína APOA2 é sintetizada como um precursor de 100 aminoácidos que contêm um peptídeo sinal em um tecido de fígado. Sua forma madura presente no sangue consiste de 77 aminoácidos. A forma madura da proteína APOA2 é uma apolipoproteína que constitui uma lipoproteína de alta densidade (HDL) que tem um resíduo de glutamina (Q) em sua terminação amino (terminação N), um resíduo de treonina (T) na 76a posição contada a partir da terminação N e resíduos de glutamina (Q) no C-terminal (77a posição contada a partir da terminação N). Além disso, relatou-se que a proteína APO2 tem variantes diferentes de massa, incluindo proteína APOA2-ATQ (proteína APOA2 inteira), proteína APOA2 (proteína APOA2 desprovida de resíduo de glutamina C-terminal (Q)) e proteína APOA2 (proteína APOA2 desprovida dos resíduos de treonina e glutamina C-terminal (TQ)) (Literatura Não Patente 2).

[007] De acordo com a análise baseada nos dados conformacionais da proteína APOA2 (PBD ID: 1L6L) registrada no banco de dados de estrutura de proteína (PBD; Banco de Dados de Proteína; http://www.rcsb.org/pdb/home.do), as proteínas APOA2 são dimerizadas através da ligação bissulfeto (ligação SS) entre os seus resíduos de cisteína no lado N-terminal. Dessa forma, descobriu-se que a proteína APOA2 existe no sangue como dímeros que têm vários pesos moleculares resultantes das combinações das 3 variantes. Especificamente, esses dímeros são conhecidos por incluir, por exemplo, um dímero que consiste nas proteínas APOA2-ATQ inteiras (dímero de proteína APOA2-ATQ/ATQ), um dímero da proteína APOA2- ATQ e da proteína APOA2-AT (dímero de proteína APOA2-ATQ/AT), um dímero que consiste nas proteínas APOA2-AT (dímero de proteína APOA2- AT/AT), um dímero de proteína APOA2-AT e a proteína APOA2-A (dímero de proteína APOA2-AT/A) e um dímero que consiste nas proteínas APOA2-A (dímero de proteína APOA2-A/A). Além disso, a proteína APOA2 é também conhecida por ser dimerizada com outra proteína como proteína APOD, proteína APOE ou APOA1-M através de uma ligação bissulfeto e para existir como um monômero (Literaturas Não Patente 3 e 4).

[008] Esses diferentes dímeros de proteínas APOA2 são conhecidos por exibir variações quantitativas no sangue de pacientes com câncer pancreático em comparação com pessoas normais. Especialmente, o dímero de proteína APOA2-ATQ/AT foi encontrado como uma proteína que tem um valor de massa de peso molecular 17253 ± 9 (m/z) como resultado de espectrometria de massa. Revelou-se que: esse dímero de proteína é significativamente diminuído em pacientes de câncer pancreático em comparação com pessoas normais; e o câncer pancreático pode ser detectado com precisão tão elevada como um valor de AUC (área sob a curva) de 0,85 ou maior pelo uso do dímero de proteína como um marcador de câncer pancreático (Literaturas de Patente 4 e 5 e Literatura Não Patente 5).

[009] No entanto, 3 etapas complicadas incluindo medição com um espectrômetro de massa são necessárias para atingir a precisão de discriminação do valor de AUC. Por exemplo, na primeira etapa, uma amostra de sangue para uso em espectrometria de massa é pré-tratada com ureia 9 M e CHAPS 2%. No entanto, a ureia é suscetível à degradação e dessa forma a armazenamento inadequado em longo prazo. Portanto, para condições constantes de pré-tratamento, é necessário preparar uma solução que contem ureia a cada medição. Na etapa subsequente, a amostra pré-tratada é capturada sobre a superfície de um chip de proteína (fabricado pela Ciphergen Biosystems K.K.). Nessa etapa de captura, a adsorção é realizada através do uso das propriedades, como estado de carga de hidrofobicidade, da superfície do chip de proteína. Portanto, as condições de lavagem ou condições de preparação de reagente são conhecidas por ter um grande impacto na eficiência de captura. Na etapa final, a amostra capturada é analisada com um espectrômetro de massa. O espectrômetro de massa requer habilidades para operação como ajuste de intensidade de laser e tem baixo rendimento no manuseio de amostras. No caso onde muitas proteínas diferentes estão contidas em uma amostra, um sinal obtido junto à cada proteína interfere com os sinais das outras proteínas. Portanto, esses sinais são difíceis de serem atribuídos. Além disso, o espectrômetro de massa ainda enfrenta desafios no desempenho quantitativo e é, portanto, inadequado para propósitos de diagnóstico, que necessitam de medição altamente precisa. Portanto, o problema dessa abordagem são altas barreiras contra seu uso atual.

[0010] ELISA é conhecido como um método de alto rendimento, acessível e prático para avaliar muitas amostras, em comparação com espectrometria de massa. ELISA, que é uma abordagem versátil, não necessita de qualquer habilidade operacional. Além disso, essa abordagem é altamente específica porque emprega dois anticorpos e permite quantificação altamente reprodutível com o uso de padrões. Portanto, ELISA permite análise abrangente e altamente quantitativa das variantes de proteína APOA2 presentes com diferentes pesos moleculares em uma amostra.

LISTA DE CITAÇÕES LITERATURA DE PATENTE

[0011] Literatura de Patente 1: publicação de patente JP (Kokai) 2001-289861 A (2001).

[0012] Literatura de Patente 2: publicação de patente JP (Kokai) 2002-323499 A (2002).

[0013] Literatura de Patente 3: publicação de patente JP (Kokai) 2009-034071 A (2009).

[0014] Literatura de Patente 4: publicação internacional documento WO 2006/098087.

[0015] Literatura de Patente 5: publicação de patente JP (Kokai) 2010-175452 A (2010).

LITERATURA NÃO PATENTE

[0016] Literatura Não Patente 1: Clinical Practice Guidelines for Pancreatic Cancer based on evidence-based medicine, 2009, Japan Pancreas Society (Committee for revision of clinical guidelines for pancreatic cancer), Kanahara & Co., Ltd.

[0017] Literatura Não Patente 2: Pankhurst G. et al., 2003, J. Lipid Res., Vol. 44, pág. 349-355

[0018] Literatura Não Patente 3: Blanco-Vaca F. et al., 2001, J. Lipid Res., Vol. 42, pág. 1727-1739

[0019] Literatura Não Patente 4: Rocco AG. et al., 2006, Biophys J., Vol. 91, pág. 3043-3049

[0020] Literatura Não Patente 5: Honda K. et al., 2012, PLoS One, Vol. 7, pág. e46908

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO PROBLEMA TÉCNICO

[0021] Em geral, os marcadores tumorais são usados na detecção de tumores. No entanto, os tumores pancreáticos são conhecidos por serem difíceis de detectar com o uso de marcadores tumorais. Entre os tumores pancreáticos, especialmente, pacientes com câncer pancreático inicial são difíceis de se distinguir de pessoas normais. Portanto, a detecção precoce do câncer pancreático com o uso de marcadores tumorais é muito difícil. Alguns marcadores tumorais capazes para detectar tumor pancreático benigno até o momento são conhecidos.

[0022] Um objeto da presente invenção é fornecer um método para detectar um tumor pancreático, isto é, câncer pancreático ou tumor pancreático benigno, com o uso de variantes de uma proteína APOA2 marcadora tumoral pancreática com alta sensibilidade de detecção do tumor pancreático e com maior comodidade e maior rendimento do que aqueles dos métodos de detecção descritos nas Literaturas de Patentes 4 e 5 e Literatura Não Patente 5 e um kit para a detecção de um tumor pancreático.

SOLUÇÃO DO PROBLEMA

[0023] A fim de atingir o objeto, os presentes inventores primeiro visaram desenvolver um método para detectar câncer pancreático pelo uso de um método de ensaio ELISA que direciona o dímero de proteína APOA2- ATQ/AT. Com base em um método geralmente realizado, os presentes inventores têm então tentado detectar o dímero de proteína APOA2-ATQ/AT com o uso de anticorpos contra as respectivas regiões C-terminais da proteína APOA2-ATQ (anticorpos terminais de proteína anti-APOA2) que constituem o dímero de proteína APOA2-ATQ/AT. Apesar de tudo, descobriu-se que esse dímero não pode ser detectado com alta precisão, provavelmente devido à interferência de substâncias presentes no sangue ou da influência de impedimento estérico causado pela ligação desses dois anticorpos ao mesmo antígeno.

[0024] Consequentemente, os presentes inventores têm conduzido estudos diligentes e consequentemente estabelecido um método para medir separadamente a quantidade total da proteína APOA2-ATQ e a quantidade total da proteína APOA2-AT pelo uso de ELISA sanduíche usando anticorpos de proteína anti-APOA2 que se ligam especificamente às regiões C- terminais e anticorpos que se ligam especificamente às regiões exceto às regiões C-terminais de proteína APOA2 (anticorpos sem terminação de proteína anti-APOA2) em combinação. Ao invés de medir a quantidade do dímero de proteína APOA2-ATQ/AT como convencionalmente realizado, os presentes inventores obtiveram o valor de medição da quantidade total da proteína APOA2-ATQ e o valor de medição da quantidade total da proteína APOA2-AT, e combinaram os resultados. Com o uso desse método de análise, pacientes com câncer pancreático podem ser discriminados de pessoas normais com alta precisão. Os presentes inventores ainda encontraram um efeito inesperado causado pelo uso desse método de análise, isto é, a detecção de tumor pancreático benigno, o qual foi inatingível com o uso de marcadores tumorais relatados anteriormente. Os presentes inventores descobriram que tumores pancreáticos incluindo tumor pancreático benigno e câncer pancreático inicial podem ser detectados com sensibilidade muito alta com base nesta técnica, levando à conclusão da presente invenção.

[0025] A presente invenção engloba os seguintes aspectos: (1) Um método para detectar um tumor pancreático por medição das quantidades de variantes de proteína APOA2 em uma amostra de fluido corporal de um sujeito de teste, cujo método de detecção compreende: (A) uma primeira etapa de medição da quantidade de proteína APOA2-ATQ na amostra com o uso de um anticorpo terminal anti-APOA2-ATQ que se liga especificamente a uma região C-terminal da proteína APOA2-ATQ que compreende a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, e um anticorpo não terminal anti-APOA2-ATQ que se liga à sequência de aminoácidos exceto a região C-terminal; (B) uma segunda etapa de medição da quantidade de proteína APOA2-AT na amostra com o uso de um anticorpo terminal anti-APOA2-AT que se liga especificamente a uma região C-terminal da proteína APOA2-AT que compreende a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 e um anticorpo não terminal anti-APOA2-AT que se liga à sequência de aminoácidos exceto a região C-terminal; e (C) uma terceira etapa de inserção, para um discriminante pré-definido, o valor de medição da quantidade de proteína APOA2-ATQ obtido na primeira etapa e o valor de medição da quantidade de proteína APOA2-AT obtido na segunda etapa, e determinar se o sujeito de teste tem um tumor pancreático quando o valor discriminante resultante do sujeito de teste é estatisticamente significativamente diferente em comparação com o valor de medição do valor discriminante de um sujeito normal; (2) O método de detecção de acordo com (1), em que as regiões C-terminais da proteína APOA2-ATQ e da proteína APOA2-AT consistem, cada uma, em uma sequência que compreende 6 ou mais aminoácidos consecutivos, incluindo o C-terminal; (3) O método de detecção de acordo com (1) ou (2), em que o discriminante é qualquer um dos selecionados a partir do grupo que consiste em uma expressão de regressão logística, uma expressão preparada por análise com uma máquina de vetor de suporte, uma expressão preparada pela análise de uma rede neural e uma expressão preparada por análise discriminante; (4) O método de detecção de acordo com (3), em que a expressão de regressão logística compreende, como uma variável, o valor de medição da proteína APOA2-ATQ, o valor de medição da proteína APOA2-AT e/ou o produto do valor de medição da proteína APOA2-ATQ e o valor de medição da proteína APOA2-AT; (5) O método de detecção de acordo com (4), em que o valor discriminante do sujeito de teste obtido da expressão de regressão logística é 2/3 ou mais baixo que o valor de um sujeito normal; (6) O método de detecção de acordo com qualquer um dentre (1) a (5), em que o tumor pancreático é câncer pancreático tumor pancreático benigno; (7) O método de detecção de acordo com (6), que ainda compreende uma quarta etapa de medição da quantidade de um marcador de câncer pancreático CA19-9 ou DU-PAN-2 em uma amostra de fluidos corporais do sujeito de teste determinado como tendo um tumor pancreático na terceira etapa, e determinar se o sujeito de teste tem um câncer pancreático quando o valor de medição excede um valor de referência predeterminado e determinar o sujeito de teste como tendo tumor pancreático benigno quando o valor de medição for igual ou inferior ao valor de referência; (8) O método de detecção de acordo com qualquer um dentre (1) a (7), em que a amostra de fluido corporal é sangue, plasma ou soro; (9) O método de detecção de acordo com qualquer um dentre (1) a (8), em que o câncer pancreático é câncer pancreático inicial; (10) Um anticorpo monoclonal ou um fragmento do mesmo, cujo anticorpo monoclonal sendo um anticorpo terminal anti-APOA2-ATQ que se liga especificamente a uma região C-terminal da proteína APOA2-ATQ que compreende a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, em que a CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada compreende as sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOs: 4, 5 e 6, respectivamente, e a CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve compreende as sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOs: 7, 8 e 9, respectivamente; (11) Um anticorpo monoclonal ou um fragmento do mesmo, cujo anticorpo monoclonal sendo um anticorpo terminal anti-APOA2-ATQ que se liga especificamente a uma região C-terminal da proteína APOA2-ATQ que compreende a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, em que a CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada compreende as sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOs: 10, 11 e 12, respectivamente, e a CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve compreende as sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOs: 13, 14 e 15, respectivamente; (12) Um anticorpo monoclonal ou um fragmento do mesmo, cujo anticorpo monoclonal sendo um anticorpo não terminal de proteína anti-APOA2 que reconhece uma sequência de aminoácidos exceto uma região C-terminal de uma proteína APOA2 que compreende uma sequência de aminoácidos representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 3, em que a CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada compreende as sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOs: 16, 17 e 18, respectivamente, e a CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve compreende as sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOs: 19, 20 e 21, respectivamente; (13) Um anticorpo monoclonal ou um fragmento do mesmo, cujo anticorpo monoclonal sendo um anticorpo não terminal de proteína anti-APOA2 que reconhece uma sequência de aminoácidos exceto uma região C-terminal de uma proteína APOA2 que compreende uma sequência de aminoácidos representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 3, em que a CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada compreende as sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOs: 22, 23 e 24, respectivamente, e a CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve compreende as sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOs: 25, 26 e 27, respectivamente; (14) Um kit para a detecção de um tumor pancreático, que compreende um ou mais tipos de anticorpos ou fragmentos do mesmo de acordo com (10) a (13).

[0026] O presente relatório descritivo engloba o conteúdo descrito nos relatórios descritivos e/ou desenhos do pedido de patente japonesa 2013206682 e 2014-166188, e na qual a prioridade do presente pedido se baseia.

EFEITOS VANTAJOSOS DA INVENÇÃO

[0027] De acordo com a presente invenção, um tumor pancreático pode ser convenientemente detectado com alto rendimento e alta sensibilidade pelo ensaio de variantes de uma proteína APOA2 marcadora de tumor pancreático no sangue. Por exemplo, as quantidades de variantes de proteína APOA2 específicas contidas em uma amostra de fluido corporal, como sangue, coletadas a partir de um paciente podem ser simplesmente medidas para determinar se o paciente tem ou não um tumor pancreático ou para avaliar a possibilidade de ter um tumor pancreático.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0028] A Figura 1(A) mostra resultados de medidas da atividade de ligação de um clone 7F2 de anticorpo monoclonal terminal anti-APOA2-ATQ contra diversas variantes de proteína APOA2. A Figura 1(B) mostra resultados de medidas da atividade de ligação de um clone 6G2 de anticorpo monoclonal terminal anti-APOA2-ATQ contra diversas variantes de proteína APOA2.

[0029] A Figura 2(A) mostra resultados de medidas da atividade de ligação do anticorpo monoclonal 7F2 ou 6G2 terminal anti-APOA2-ATQ ou um anticorpo policlonal terminal APOA2-ATQ (na figura, indicado por “anticorpo Poli”) contra proteína APOA2-ATQ ou proteína APOA2-AT. A Figura 2(B) é um gráfico em que a especificidade de ligação de cada anticorpo foi avaliada dividindo o valor de medição da atividade de ligação do anticorpo contra a proteína APOA2-ATQ obtida na Figura 2(A) pelo valor de medição de sua atividade de ligação contra a proteína APOA2-AT.

[0030] A Figura 3 mostra resultados de medidas da atividade de ligação de um anticorpo policlonal terminal anti-APOA2-AT contra diversas variantes de proteína APOA2.

[0031] A Figura 4(A) mostra resultados de medidas da atividade de ligação de um anticorpo monoclonal MAB1 sem terminação de proteína anti- APOA2 contra diversas variantes de proteína APOA2. A Figura 4(B) mostra resultados de medidas da atividade de ligação de um anticorpo monoclonal MAB2 sem terminação de proteína anti-APOA2 contra diversas variantes de proteína APOA2.

[0032] A Figura 5 mostra resultados de análise de um dímero de proteína APOA2 (APOA2-ATQ/AT) contidos no plasma de 40 sujeitos de cada um dos pacientes com câncer pancreático e de pessoas normais por espectrometria de massa.

[0033] A Figura 6 mostra os resultados de análise de um dímero de proteína APOA2 (APOA2-ATQ/AT) contidos no plasma de 40 sujeitos cada um dos pacientes com câncer pancreático e pessoas normais por ELISA sanduíche com o uso de um anticorpo monoclonal que reconhece especificamente a sequência de aminoácidos de uma região C-terminal da proteína APOA2-ATQ (anticorpo monoclonal terminal anti-APOA2-ATQ) e um anticorpo policlonal que reconhece especificamente a sequência de aminoácidos de uma região C-terminal da APOA2-AT (anticorpo policlonal terminal anti-APOA2-AT).

[0034] A Figura 7 mostra os resultados de análise da proteína APOA2-ATQ contidos no plasma de 40 sujeitos cada um dos pacientes com câncer pancreático e pessoas normais por ELISA sanduíche com o uso de um anticorpo monoclonal que reconhece especificamente a sequência de aminoácidos de uma região C-terminal da proteína APOA2-ATQ (anticorpo monoclonal terminal anti-APOA2-ATQ) e um anticorpo que reconhece especificamente uma sequência de aminoácidos exceto a região C-terminal (anticorpo não terminal anti-APOA2-ATQ).

[0035] A Figura 8 mostra os resultados de análise da proteína APOA2-ATQ contidos no plasma de 40 sujeitos cada um dos pacientes com câncer pancreático e pessoas normais por ELISA sanduíche com o uso de um anticorpo policlonal que reconhece especificamente a sequência de aminoácidos de uma região C-terminal da proteína APOA2-AT (anticorpo policlonal terminal anti-APOA2-AT) e um anticorpo que reconhece especificamente uma sequência de aminoácidos exceto a região C-terminal (anticorpo não terminal anti-APOA2-AT).

[0036] A Figura 9 é um gráfico do produto das quantidades de duas variantes de proteína APOA2 (proteína APOA2-ATQ e proteína APOA2- AT) contidas no plasma de 40 sujeitos cada um dos pacientes com câncer pancreático e pessoas normais.

[0037] A Figura 10 é um gráfico do produto das concentrações de duas variantes de proteína APOA2 (proteína APOA2-ATQ e proteína APOA2- AT) contidas no plasma de 244 pacientes com câncer pancreático e 109 pessoas normais.

[0038] A Figura 11 mostra uma curva ROC preparada mediante a substituição dos valores de medição de pacientes com câncer pancreático (estágio I e II na classificação UICC) e pessoas normais em uma expressão de regressão logística. A Figura 11(A) mostra os resultados de análise do produto dos valores de medição de ELISA sanduíche de duas variantes de proteína APOA2 (proteína APOA2-ATQ e proteína APOA2-AT). A Figura 11(B) mostra os resultados de análise de um dímero de proteína APOA2 (APOA2-ATQ/AT) por espectrometria de massa.

[0039] A Figura 12 mostra uma curva ROC preparada mediante a substituição dos valores de medição de pacientes com tumor pancreático benigno e pessoas normais em uma expressão de regressão logística. A Figura 12(A) mostra os resultados de análise do produto dos valores de medição de duas variantes de proteína APOA2 (proteína APOA2-ATQ e proteína APOA2- AT) analisadas por ELISA sanduíche. A Figura 12(B) mostra os resultados de análise do valor de medição de CA19-9.

DESCRIÇÃO DAS REALIZAÇÕES

[0040] O alvo a ser analisado de acordo com a presente invenção é um tumor pancreático. No presente relatório descritivo, o “tumor pancreático” se refere a todo tumor formado no pâncreas. Especificamente, o tumor pancreático é “câncer pancreático”, que é um tumor maligno ou “tumor pancreático benigno”, que é um tumor benigno.

[0041] No presente relatório descritivo, o “câncer pancreático” refere-se a todo tumor maligno formado no pâncreas. Especificamente, o câncer pancreático inclui, por exemplo, carcinoma ductal invasivo do pâncreas, carcinoma intraductal tubular do pâncreas, carcinoma de células acinares do pâncreas, cistadenocarcinoma seroso do pâncreas, cistadenocarcinoma mucinoso do pâncreas (um tipo de neoplasia cística mucinosa do pâncreas), carcinoma mucinoso papilar intraductal do pâncreas (um tipo de neoplasia mucinosa papilar intraductal do pâncreas) e tumor do pâncreas neuroendócrino (um tipo de neoplasia endócrina do pâncreas) (“General Rules for the Study of Pancreatic Cancer”, A 6a Edição, versão revisada de 2013, Japan Pancreas Society, Kanahara & Co., Ltd.). O câncer pancreático alvo não é limitado pelo grau de progressão. Qualquer câncer precoce, câncer avançado e câncer terminal são incluídos no escopo da presente invenção.

[0042] No presente relatório descritivo, o “câncer inicial” refere-se a um tumor que está confinado a uma zona local em que o tumor se desenvolveu (dentro da membrana mucosa) sem infiltração para seus tecidos vizinhos ou com infiltração apenas para uma área limitada local. Especificamente, o câncer inicial refere-se a um câncer em estágio 0, IA, IB, IIA ou IIB de acordo com a classificação da UICC (Unio Internationalis Contra Cancrum) (“TNM Classification of Malignant Tumours”, 7a edição, versão Japonesa, 2012, TNM Committee of the Japan National Committee for UICC, Kanahara & Co., Ltd). Conforme mencionado acima, o câncer pancreático é um câncer intratável com prognóstico muito fraco. No entanto, se o câncer pancreático inicial pode ser detectado, a taxa de sobrevida em 5 anos pode ser notavelmente aprimorada.

[0043] O “tumor pancreático benigno” inclui cistadenoma mucinoso (um tipo de neoplasia cística mucinosa do pâncreas), adenoma intraductal mucinoso papilar (um tipo de neoplasia intraductal papilar mucinosa do pâncreas), tumor neuroendócrino do pâncreas (um tipo de neoplasia endócrina do pâncreas), cistadenoma seroso, e epitélio atípico e carcinoma in situ que ocorrem no pâncreas (“General Rules for the Study of Pancreatic Cancer”, A 6a Edição, Versão Revisada de 2013, Japan Pancreas Society, Kanahara & Co., Ltd).

1. ANTICORPO ANTI-APOA2 E FRAGMENTO DO MESMO

[0044] A primeira realização da presente invenção refere-se a anticorpos anti-APOE2 (incluindo anticorpos terminais de proteína anti-APOA2 e anticorpos sem terminação de proteína anti-APOA2) e fragmentos dos mesmos.

1-1. ANTICORPO ANTI-APOA2

[0045] No presente relatório descritivo, a “proteína APOA2” corresponde a uma proteína APOA2 de cada espécie de organismo e é preferencialmente uma proteína APOA2 humana-derivada (número de acesso no GenBank NP_001634.1). Especificamente, a proteína APOA2 inclui variantes da proteína APOA2 tipo selvagem humana-derivada mostradas nas SEQ ID NOs: 1, 2, e 3, e inclui ainda os seus mutantes naturais e seus fragmentos.

[0046] No presente relatório descritivo, as “variantes” significam diferentes formas moleculares da proteína APOA2 que podem estar presentes no plasma, soro ou outros fluidos corporais de seres humanos ou animais. As variantes da proteína APOA2 correspondem, por exemplo, a proteínas APOA2 que diferem na estrutura de uma região C-terminal, ou de seus mutantes naturais. Especificamente, as variantes da proteína APOA2 correspondem, por exemplo, à proteína APOA2-ATQ que é mostrada na SEQ ID NO: 1 e tem a sequência de aminoácidos de uma região C-terminal terminando em ATQ, proteína APOA2-AT que é mostrada na SEQ ID NO: 2 e a sequência de aminoácidos de uma região C-terminal terminando em AT, e proteína APOA2-A que é mostrada na SEQ ID NO: 3 e a sequência de aminoácidos de uma região C-terminal terminando em A.

[0047] No presente relatório descritivo, “a região C-terminal (região carboxila-terminal)” refere-se a uma região que consiste em 6 a 25 aminoácidos, preferencialmente 8 a 20 aminoácidos ou 10 a 17 aminoácidos, incluindo um aminoácido no C-terminal e alguns aminoácidos consecutivos adjacentes ao mesmo na sequência de aminoácidos.

[0048] No presente relatório descritivo, o “mutante natural” refere- se a um mutante que ocorre naturalmente que tem, por exemplo, uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, 2, ou 3 pela deleção, substituição ou adição de um ou vários aminoácidos, ou que tem 90% ou mais, 92% ou mais ou 94% ou mais, preferencialmente 95% ou mais, mais preferencialmente 97% ou mais, ainda mais preferencialmente 98% ou mais, ou 99% ou mais de identidade à sequência de aminoácidos. A “identidade” refere-se à razão (%) do número de resíduos de aminoácidos idênticos na sequência de aminoácidos para o número de todos os resíduos de aminoácidos (incluindo o número de gaps) em outra sequência de aminoácidos quando essas duas sequências aminoácido estão alinhados com ou sem gaps de modo a atingir o maior grau de coincidência. O termo “vários” refere-se a um número inteiro de 2 a 10, por exemplo, um número inteiro de 2 a 7, 2 a 5, 2 a 4, ou 2 ou 3. Exemplos específicos do mutante natural incluem mutantes baseados em polimorfismos como SNPs (polimorfismos de nucleotídeo único) e mutantes de splicing (variantes de splicing). A substituição é preferencialmente substituição de aminoácido conservativa. Isto é porque a substituição de aminoácido conservativa permite que a proteína resultante tenha uma estrutura ou propriedades substancialmente equivalentes à proteína APOA2 que tem a sequência de aminoácidos descrita acima. Os aminoácidos conservativos referem-se à relação entre os aminoácidos classificados nos mesmos grupos de aminoácidos. Por exemplo, um grupo de aminoácido apolar (glicina, alanina, fenilalanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, prolina e triptofano), um grupo de aminoácido polar (os aminoácidos exceto para os aminoácidos apolares), um grupo de aminoácido carregado (aminoácidos ácidos (ácido aspártico e ácido glutâmico) e um grupo de aminoácido básico (arginina, histidina, e lisina)), um grupo de aminoácido não carregado (os aminoácidos exceto para os aminoácidos carregados), um grupo de aminoácido aromático (fenilalanina , triptofano, e tirosina), um grupo de aminoácido ramificado (leucina, isoleucina, e valina) e um grupo de aminoácido alifático (glicina, alanina, leucina, isoleucina, e valina) são conhecidos como os grupos de aminoácidos.

[0049] Os “fragmentos” referem-se a fragmentos de diversas variantes da proteína APOA2 e os seus mutantes naturais, que compreendem as regiões C-terminais das variantes da proteína APOA2 e os mutantes. Especificamente, os fragmentos das mesmas correspondem a produtos da digestão de diversas variantes da proteína APOA2 e seus mutantes.

[0050] A presente invenção fornece anticorpos terminais de proteína anti-APOA2 incluindo um anticorpo terminal anti-APOA2-ATQ e um anticorpo terminal anti-APOA2-AT.

[0051] O “anticorpo terminal anti-APOA2-ATQ” refere-se a um anticorpo capaz de reconhecer especificamente e se ligar a um epítopo presente na região C-terminal da proteína APOA2-ATQ, ou um fragmento da mesma. A frase “reconhecer especificamente e se ligar” significa que o anticorpo não pode nem reconhecer nem se ligar a ou dificilmente reconhecer e se ligar a outras variantes da proteína APOA2 por causa de reatividade cruzada muito fraca ou nenhuma com as variantes da proteína APOA2. Especificamente, o anticorpo terminal anti-APOA2-ATQ refere-se a um anticorpo que se liga especificamente à região C-terminal da proteína APOA2- ATQ, mas não exibe ligação à região C-terminal da proteína APOA2-AT e à região C-terminal da proteína APOA2-A, etc. Esse anticorpo direcionado para a terminação pode ser qualquer um dos anticorpos policlonais e monoclonais ou os fragmentos dos mesmos. Um anticorpo monoclonal é preferencial para alcançar produção em larga escala e para a obter efeitos homogêneos.

[0052] Por outro lado, o “anticorpo terminal anti-APOA2-AT” refere-se a um anticorpo capaz de reconhecer especificamente e se ligar a um epítopo presente na região C-terminal da proteína APOA2-AT, ou um fragmento da mesma. Especificamente, o anticorpo terminal anti-APOA2-AT refere-se a um anticorpo que se liga especificamente à região C-terminal da proteína APOA2-AT, mas não exibe ligação à região C-terminal da proteína APOA2-ATQ e à região C-terminal da proteína APOA2-A, etc. Esse anticorpo direcionado para a terminação pode ser qualquer um dos anticorpos policlonais e monoclonais ou os fragmentos dos mesmos. Um anticorpo monoclonal é preferencial para alcançar produção em larga escala e para a obter efeitos homogêneos.

[0053] A presente invenção fornece ainda um “anticorpo não terminal de proteína anti-APOA2” que reconhece uma sequência de aminoácidos exceto a região C-terminal da proteína APOA2.

[0054] O “anticorpo não terminal de proteína anti-APOA2” refere- se a um anticorpo anti-APOA2 que reconhece e se liga a um epítopo presente em uma região exceto a região C-terminal na sequência de aminoácidos inteira de cada variante da proteína APOA2. Especificamente, o anticorpo não terminal de proteína anti-APOA2 difere totalmente dos anticorpos terminais de proteína anti-APOA2 no epítopo reconhecido através disso. O termo “não terminação” para o anticorpo não terminal de proteína anti-APOA2 é usado por razões de conveniência em relação aos anticorpos terminais de proteína anti-APOA2. Dessa forma, seu epítopo não está particularmente limitado desde que o epítopo esteja presente em uma região exceto a região C-terminal. O anticorpo não terminal de proteína anti-APOA2 também pode incluir um anticorpo que reconhece e se liga a um epítopo presente na terminação N.

[0055] O anticorpo não terminal de proteína anti-APOA2 usado na presente invenção é preferencialmente um anticorpo que tem quase os mesmos níveis de atividade de ligação contra uma proteína APOA2 que tem uma certa sequência C-terminal e atividade de ligação contra uma proteína APOA2 que tem uma sequência C-terminal diferente daquela da proteína APOA2 quando a atividade de ligação é comparada entre essas proteínas APOA2, e não inibe a ligação dos anticorpos terminais de proteína anti-APOA2 às regiões C- terminais. Exemplos específicos desses incluem um “anticorpo não terminal anti-APOA2-ATQ” que se liga a uma sequência de aminoácidos exceto a região C-terminal da proteína APOA2-ATQ mostrada na SEQ ID NO: 1, um “anticorpo não terminal anti-APOA2-AT” que se liga a uma sequência de aminoácidos exceto a região C-terminal da proteína APOA2-AT mostrada na SEQ ID NO: 2. Nesse caso, os anticorpos têm os mesmos níveis de atividade de ligação contra essas proteínas APOA2, e qualquer um dos anticorpos não inibe a ligação do anticorpo terminal anti-APOA2-ATQ e do anticorpo terminal anti-APOA2AT às regiões C-terminais das proteínas APOA2. O anticorpo não terminal de proteína anti-APOA2 pode ser qualquer um dos anticorpos policlonais e monoclonais ou fragmentos dos mesmos. Um anticorpo monoclonal é preferencial para alcançar produção em larga escala e para a obter efeitos homogêneos.

[0056] O “anticorpo monoclonal” usado no presente relatório descritivo refere-se a um anticorpo que consiste em uma única imunoglobulina ou que compreende regiões de estrutura (desse ponto em diante citadas como “FRs”) e regiões determinantes de complementaridade (desse ponto em diante citadas como “CDRs”) e é capaz de reconhecer especificamente e se ligar a um antígeno em particular (epítopo).

[0057] A típica molécula de imunoglobulina é um tetrâmero constituído por dois pares de cadeias polipeptídicas, isto é, dois pares de cadeia leve-pesada, em que a cadeia pesada de cada par está ligada à cadeia leve através de ligação bissulfeto. Cada cadeia pesada é composta por uma região variável da cadeia pesada (região V da cadeia H; desse ponto em diante citada como “VH”) no lado N-terminal e uma região constante da cadeia pesada (região C da cadeia H; desse ponto em diante citada como “CH”) no lado C- terminal. Cada cadeia leve é composta por uma região variável da cadeia leve (região V da cadeia H; desse ponto em diante citada como “VL”) no lado N- terminal e uma região constante da cadeia leve (região C da cadeia H; desse ponto em diante citada como “CL”) no lado C-terminal. Dessas regiões, VH e VL são particularmente importantes devido ao seu envolvimento na especificidade de ligação do anticorpo. Essas regiões VH e VL, cada uma consiste em aproximadamente 110 resíduos de aminoácidos e internamente têm três CDRs (CDR1, CDR2 e CDR3) envolvidas diretamente na especificidade de ligação para o antígeno e quatro FRs (FR1, FR2, FR3 e FR4) que funcionam como as estruturas de esqueleto da região variável. As CDR são conhecidas por serem complementares sob a forma conformacional à molécula de antígeno e para determinar a especificidade do anticorpo (E.A. Kabat et al., 1991, Sequences of proteins of immunological interest, Vol. 1, eds. 5, publicação NIH). As sequências de aminoácido das regiões constantes raramente variam entre anticorpos intraespecíficos, enquanto que as sequências de aminoácidos das CDRs são altamente variáveis entre os anticorpos e, portanto, são também denominadas regiões hipervariáveis. Na região variável, as CDR e as FRs são dispostas na ordem de FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 e a partir da terminação N para o C-terminal. Na molécula de imunoglobulina, VL e VH são pareadas por dimerização para formar um sítio de ligação ao antígeno. A imunoglobulina é conhecida por ter cada uma das classes de IgG, IgM, IgA, IgE e IgD. O anticorpo da presente invenção pode ser de qualquer classe. IgG é preferencial.

[0058] O anticorpo monoclonal terminal anti-APOA2-ATQ da presente invenção se liga especificamente na região C-terminal da proteína APOA2-ATQ mostrada na SEQ ID NO: 1, mas não exibe atividade de ligação contra a proteína APOA2-AT mostrada na SEQ ID NO: 2 e a proteína APOA2-A mostrada na SEQ ID NO: 3. Exemplos específicos desse anticorpo incluem clones do anticorpo monoclonal terminal anti-APOA2-ATQ representado pelos nomes de clone 7F2 e 6G2 descritos no Exemplo 1 mencionado posteriormente. O clone 7F2 tem CDR1 que consiste na sequência representada pela SEQ ID NO: 4, CDR2 consiste na sequência representada pela SEQ ID NO: 5 e CDR3 consiste na sequência representada pela SEQ ID NO: 6 em uma cadeia pesada, e CDR1 consiste na sequência representada pela SEQ ID NO: 7, CDR2 consiste na sequência representada pela SEQ ID NO: 8 e CDR3 consiste na sequência representada pela SEQ ID NO: 9 em uma cadeia leve. O clone 6G2 tem CDR1 que consiste na sequência representada pela SEQ ID NO: 10, CDR2 consiste na sequência representada pela SEQ ID NO: 11 e CDR3 consiste na sequência representada pela SEQ ID NO: 12 em uma cadeia pesada, e CDR1 consiste na sequência representada pela SEQ ID NO: 13, CDR2 consiste na sequência representada pela SEQ ID NO: 14 e CDR3 consiste na sequência representada pela SEQ ID NO: 15 em uma cadeia leve.

[0059] O anticorpo não terminal de proteína anti-APOA2 da presente invenção é preferencialmente um anticorpo que tem os mesmos níveis de atividade de ligação contra as variantes da proteína APOA2 mostradas nas SEQ ID NOs: 1 a 3, quando a atividade de ligação é comparada entre eles. Exemplos específicos dos mesmos incluem clones de anticorpo anti-APOA2 representados por nomes de clone MAB1 e MAB2 descritos no Exemplo 5 mencionado posteriormente. O clone MAB1 tem CDR1 que consiste na sequência representada pela SEQ ID NO: 16, CDR2 consiste na sequência representada pela SEQ ID NO: 17 e CDR3 consiste na sequência representada pela SEQ ID NO: 18 em uma cadeia pesada, e CDR1 consiste na sequência representada pela SEQ ID NO: 19, CDR2 consiste na sequência representada pela SEQ ID NO: 20 e CDR3 consiste na sequência representada pela SEQ ID NO: 21 em uma cadeia leve. O clone MAB2 tem CDR1 que consiste na sequência representada pela SEQ ID NO: 22, CDR2 consiste na sequência representada pela SEQ ID NO: 23 e CDR3 consiste na sequência representada pela SEQ ID NO: 24 em uma cadeia pesada, e CDR1 consiste na sequência representada pela SEQ ID NO: 25, CDR2 consiste na sequência representada pela SEQ ID NO: 26 e CDR3 consiste na sequência representada pela SEQ ID NO: 27 em uma cadeia leve. O anticorpo não terminal anti-APOA2-ATQ ou o anticorpo não terminal anti-APOA2-AT podem ser usados como anticorpo não terminal de proteína anti-APOA2.

[0060] Os “fragmentos dos mesmos” para os “anticorpos policlonais e monoclonais ou fragmentos dos mesmos” são fragmentos parciais dos anticorpos policlonais e monoclonais e referem-se a cadeias polipeptídicas que têm atividade substancialmente equivalente à atividade de ligação dos anticorpos específica ao antígeno, ou complexos dos mesmos. Os fragmentos de cada um correspondem a uma porção de anticorpo contendo pelo menos um sítio de ligação ao antígeno mencionado acima, isto é, uma cadeia polipeptídica que tem pelo menos um par de VL-VH, ou um complexo dos mesmos. Exemplos específicos dos mesmos incluem um grande número de fragmentos de anticorpos suficientemente caracterizados resultantes da clivagem de uma imunoglobulina com várias peptidases. Exemplos mais específicos desses incluem Fab, F(ab’)2 e Fab’. O Fab é um fragmento resultante da clivagem por papaína da molécula de IgG no lado N-terminal das ligações bissulfeto nas dobradiças e é constituído por um polipeptídio que consiste em VH e CH1, que é adjacente à VH, entre os três domínios que constituem CH (CH1, CH2 e CH3), e uma cadeia leve. O F(ab’)2 é um dímero de Fab’ resultante da clivagem por pepsina da molécula de IgG no lado C-terminal das ligações bissulfeto nas dobradiças. O Fab’ é substancialmente equivalente na estrutura ao Fab, apesar de ser um pouco mais longo do que a cadeia H do Fab, incluindo uma dobradiça (Fundamental Immunology, Paul ed., 3a ed., 1993). O Fab’ pode ser obtido por redução de F(ab’)2 sob condições brandas e clivagem das pontes bissulfeto na região de dobradiça. Todos esses fragmentos de anticorpo contêm o sítio de ligação ao antígeno e têm a capacidade de se ligar especificamente ao antígeno (isto é, uma variante da proteína APOA2 específica na presente invenção).

[0061] O fragmento do anticorpo monoclonal da presente invenção pode ser sintetizado quimicamente ou pelo uso de um método de DNA recombinante. Exemplos desses incluem fragmentos de anticorpos recentemente sintetizados com o uso do método de DNA recombinante. Especificamente, o fragmento corresponde, mas não se limita a, uma molécula de polipeptídio monomérico em que uma ou mais VLs e uma ou mais VHs do anticorpo monoclonal da presente invenção são artificialmente ligadas através de um peptídeo ligante ou similares tendo um comprimento apropriado de uma sequência, ou de um polipeptídeo multimérico do mesmo. Exemplos desse polipeptídeo incluem anticorpos sintéticos, como Fv de cadeia simples (scFv: fragmento de cadeia única de região variável) (consulte Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995, Pierce Chemical co., Rockford, IL), diacorpo, triacorpo e tetracorpo. Na molécula de imunoglobulina, VL e VH estão normalmente posicionadas em cadeias polipeptídicas separadas (cadeia L e cadeia H). Um Fv de cadeia simples é um fragmento de anticorpo sintético que tem uma estrutura onde essas regiões variáveis estão ligadas através de um ligante flexível que tem um comprimento suficiente, de modo que a VL e VH estejam contidas em uma cadeia polipeptídica. Ambas as regiões variáveis no Fv de cadeia simples são automontadas entre si para formar um sítio de ligação ao antígeno funcional. O Fv de cadeia simples pode ser obtido por integração de um DNA recombinante que o Fv de cadeia única no genoma de fago com o uso de uma técnica conhecida, seguido pela expressão. O diacorpo é uma molécula que tem uma estrutura baseada na estrutura dimérica dos Fvs de cadeia simples (Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 6444-6448). Por exemplo, quando o ligante tem um comprimento mais curto do que aproximadamente 12 resíduos de aminoácidos, os dois sítios variáveis no Fv de cadeia simples podem não ser automontados. Ao contrário, VL em uma cadeia Fv pode ser montada com VH em outra cadeia Fv pela formação do diacorpo, isto é, pela interação entre os dois Fvs de cadeias simples. Como resultado, dois sítios de ligação funcional ao antígeno funcionais podem ser formados (Marvin et al., 2005, Acta Pharmacol. Sin., 26: 649-658). A adição posterior de resíduos de cisteína nas terminações C dos Fvs de cadeia única permite uma ligação bissulfeto entre essas duas cadeias de Fv, de modo que um diacorpo estável possa ser formado (Alafsen et al., 2004, Prot. Engr. Des. Sel., 17: 2127). Embora o diacorpo seja um fragmento de anticorpo bivalente conforme descrito acima, os seus sítios de ligação ao antígeno não têm que se ligar ao mesmo epítopo e podem ter biespecificidade de reconhecimento e especificamente se ligar a diferentes epítopos, respectivamente. O triacorpo ou tetracorpo tem uma estrutura trimérica ou tetramérica baseada na estrutura do Fv de cadeia simples, como no diacorpo. O triacorpo e o tetracorpo são fragmentos de anticorpo trivalentes e quadrivalentes, respectivamente, e cada um pode ser cada um anticorpo multiespecífico. O fragmento de anticorpo da presente invenção inclui ainda fragmentos de anticorpos identificados com o uso de uma biblioteca de exibição por fago (consulte, por exemplo, McCafferty et al., 1990, Nature, Vol. 348, 552-554), em que esses fragmentos de anticorpo têm a capacidade para se ligar aos seus antígenos. Além disso, consulte, por exemplo, Kuby, J., Immunology, 3a Ed., 1998, W.H. Freeman & Co., Nova York.

[0062] Na presente invenção, cada um dos anticorpos anti-APOA2 ou um fragmento dos mesmos podem ser modificados. Nesse contexto, a modificação inclui qualquer uma das modificações funcionais (por exemplo, glicosilação) necessária para que o anticorpo anti-APOA2 ou o fragmento do mesmo tenha atividade de ligação específica contra a proteína APOA2, e a marcação necessária para detectar o anticorpo da presente invenção ou o fragmento do mesmo. Exemplos de marcação de anticorpo incluem marcação com corantes fluorescentes (FITC, rodamina, Texas Red, Cy3 e Cy5), proteínas fluorescentes (por exemplo, PE, APC e GFP), enzimas (por exemplo, peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina e glicose oxidase), ou biotina ou estreptavidina. A glicosilação do anticorpo pode ser alterada, a fim de ajustar a afinidade do anticorpo para o antígeno. Essa alteração pode ser obtida, por exemplo, por alteração de um ou mais sítios de glicosilação na sequência do anticorpo. Para ser mais específico, uma ou mais substituições de aminoácidos podem ser introduzidas a uma sequência de aminoácidos que constituem um ou mais sítios de glicosilação, por exemplo, em FR, para remover os sítios de glicosilação. Como resultado, a glicosilação dos sítios pode ser cancelada. Essa desglicosilação é efetiva para aumentar a afinidade do anticorpo ao antígeno (patentes US 5714350 e 6350861).

1-2. PREPARAÇÃO DE IMUNÓGENO

[0063] No caso de preparação dos anticorpos terminais de proteína anti-APOA2 na presente invenção, cada variante da proteína APOA2 é primeiro preparada como um imunógeno (antígeno). Exemplos da variante de proteína APOA2 que podem ser usadas como um imunógeno na presente invenção incluem proteínas APOA2 que têm uma sequência de aminoácidos representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 3 e mutantes das mesmas, e fragmentos polipeptídicos das proteínas ou dos mutantes, e seus polipeptídeos de fusão com outros peptídeos (por exemplo, peptídeos de sinal e peptídeos de marcação). A variante da proteína APOA2 como imunógeno pode ser sintetizada por uma abordagem conhecida na técnica, por exemplo, um método de síntese peptídica em fase sólida, por exemplo, com o uso da informação sobre a sequência de aminoácidos representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 3. A variante da proteína APOA2 pode ser preparada, por exemplo, por um método descrito abaixo.

[0064] Qualquer uma das proteínas que ocorrem naturalmente e proteínas APOA2 recombinantes podem ser usadas como a variante da proteína APOA2. Uma proteína APOA2 sintética, a totalidade ou uma porção da qual foi quimicamente sintetizada por síntese peptídica ou similares podem ser usadas como um imunógeno. Por exemplo, a variante da proteína APOA2 que é preparada com o objetivo de obter cada ligação de anticorpo à terminação C da proteína APOA2 (anticorpo terminal de proteína anti-APOA2) pode ser qualquer uma das proteínas APOA2 que ocorrem naturalmente, proteínas APOA2 recombinantes e proteínas APOA2 sintéticas, a totalidade ou uma porção da qual foi quimicamente sintetizada por síntese peptídica ou similares, que compreende uma sequência de aminoácidos que consiste em pelo menos 6 ou mais aminoácidos consecutivos das regiões C-terminais de diversas variantes da proteína APOA2.

[0065] As proteínas APOA2 que ocorrem naturalmente podem ser recuperados a partir de amostras incluindo fluidos corporais como sangue (incluindo soro e plasma), ou sobrenadantes de cultura de células cultivadas pelo uso de uma técnica de separação e purificação de proteínas conhecida na técnica, por exemplo, filtração em gel, cromatografia de troca iônica ou cromatografia de afinidade.

[0066] As proteínas APOA2 recombinantes podem ser expressas em microrganismos, células de inseto ou células animais contendo DNAs que codificam as proteínas e, em seguida, recuperadas a partir das células pelo uso de uma técnica de separação e purificação de proteínas conhecida na técnica.

[0067] As proteínas APOA2 sintéticas podem ser sintetizadas por um método conhecido na técnica, por exemplo, um método de síntese peptídica em fase sólida, por exemplo, com o uso de informações publicadas sobre a sequência de aminoácidos da proteína APOA2. Essas proteínas APOA2 sintéticas podem estar, cada uma, ligada a uma proteína carreadora como KLH (hemocianina de lapa californiana), OVA (ovalbumina) ou BSA (albumina de soro bovino).

[0068] No caso do uso de um fragmento da variante da proteína APOA2 como um imunógeno na preparação do anticorpo terminal de proteína anti-APOA2, qualquer um dos fragmentos de proteína APOA2 que ocorrem naturalmente, fragmentos de proteína APOA2 recombinante e fragmentos de proteínas APOA2 sintéticas também podem ser usados. Por exemplo, um oligopeptídeo ou um polipeptídeo que compreende 6 ou mais, preferencialmente 10 ou mais, mais preferencialmente 18 ou mais, ainda mais preferencialmente 30 ou mais resíduos consecutivos de aminoácido incluindo o C-terminal de uma sequência representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 3 pode ser usado como o fragmento da proteína APOA2 servindo como um antígeno. Por exemplo, um peptídeo que compreende as sequências de aminoácidos representadas por SEQ ID NO: 28 ou 29 pode ser usado.

[0069] No caso do uso um fragmento da proteína APOA2 que ocorre naturalmente como um imunógeno, por exemplo, na preparação de anticorpo terminal de proteína anti-APOA2, a proteína APOA2 purificada é tratada com a protease adequada, como a tripsina e então fracionada em uma coluna de fase reversa para obter os picos. A sequência de aminoácidos do peptídeo contida em cada pico é determinada com um espectrômetro de massa. O pico do peptídeo que compreende, como uma sequência parcial, uma sequência que consiste em 6 ou mais aminoácidos consecutivos da região C- terminal da proteína APOA2 mostrada em qualquer das SEQ ID NOs: 1 e 3 pode ser usada como o imunógeno.

[0070] No caso do uso de uma sequência de aminoácidos parcial da proteína APOA2 recombinante como um imunógeno, por exemplo, na preparação do anticorpo terminal de proteína anti-APOA2, uma porção da sequência de DNA que codifica uma sequência parcial de 6 ou mais aminoácidos consecutivos incluindo os resíduos de aminoácidos C-terminais da proteína APOA2 mostrados em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 3, em uma sequência de DNA que codifica a proteína APOA2 mencionada acima, pode ser inserida em vetores para expressão, que são então transferidos para várias células para se obter a sequência parcial de aminoácidos de cada variante da proteína APOA2 representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 3.

[0071] Também no caso da preparação do anticorpo não terminal da proteína anti-APOA2 na presente invenção, o seu método de preparação pode ser basicamente o mesmo que o método para a preparação dos anticorpos terminais de proteína anti-APOA2, exceto que uma região que pode ser usada como um imunógeno na proteína APOA2 é diferente das regiões usadas como um imunógeno para a preparação dos anticorpos terminais de proteína anti-APOA2. Especificamente, a totalidade ou uma porção de uma região exceto a região C-terminal da proteína APOA2 pode ser usada como um imunógeno. No caso de se preparar o anticorpo não terminal de proteína anti- APOA2, como no caso da preparação dos anticorpos terminais de proteína anti- APOA2, um oligopeptídeo ou um polipeptídeo que compreende os resíduos de aminoácidos da região exceto a região C-terminal da proteína APOA2 que também pode ser usado como um antígeno.

PREPARAÇÃO DE PROTEÍNA APOA2 RECOMBINANTE

[0072] Desse ponto em diante, a preparação de uma proteína APOA2 recombinante (variante da proteína APOA2 recombinante) mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 3 serão descritas de forma detalhada.

(A) PREPARAÇÃO DE POLINUCLEOTÍDEO QUE CODIFICA A VARIANTE DA PROTEÍNA APOA2 RECOMBINANTE

[0073] Os fagos ou plasmídeos capazes de replicação autônoma em micróbios hospedeiros podem ser usados como vetores para uso na expressão de diversas variantes de proteína APOA2. Exemplos dos plasmídeos incluem plasmídeos derivados de E. coli (pET30a, pGEX6p, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, etc.), plasmídeos derivados de Bacillus subtilis (pUB110, pTP5, etc.) e plasmídeos derivados de enzimas (YEp13, YEp24, YCp50, etc.). Exemplos de fagos incluem X fagos (Xgt11, XZAP, etc.). Além disso, vetores de vírus de animais como vírus vaccínia ou vírus de inseto como baculovírus também podem ser usados.

[0074] O método para inserir um polinucleotídeo que codifica a variante de proteína APOA2 para os vetores envolve, por exemplo, clivagem do polinucleotídeo purificado com enzimas de restrição apropriadas e ligação do fragmento resultante nos vetores clivados com as enzimas de restrição apropriadas por uso de DNA ligase ou similares.

(B) TRANSFERÊNCIA DE VETOR DE EXPRESSÃO DE VARIANTE DE PROTEÍNA APOA2 PARA O HOSPEDEIRO

[0075] Os vetores de expressão de variante de proteína APOA2 obtidos são transferidos para hospedeiros capazes de expressar os vetores de expressão para obter transformantes que expressam variantes de proteína APOA2. Os hospedeiros usados não são especialmente limitados desde que os hospedeiros sejam adequados para os vetores usados e são capazes de expressar a variante de proteína APOA2. Por exemplo, bactérias (E. coli (Escherichia coli), Bacillus subtilis, leveduras, células de insetos ou células animais (células COS e células CHO (Journal of immunology, 1998, Vol. 160, 3393-3402)) são preferencialmente usadas. O método para transferir os vetores para as bactérias não é especialmente limitado desde que o método seja um método conhecido na técnica para transferir os vetores para as bactérias. Exemplos dos mesmos incluem um método de choque térmico, um método com o uso de íons de cálcio e eletroporação. Todas essas técnicas são conhecidas e descritas em várias literaturas. Consulte, por exemplo, Greene & Sambrook, 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Quarta Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova York. Um método de Lipofectina (PNAS, 1989, Vol. 86, 6077; e PNAS, 1987, Vol. 84, 7413), eletroporação, um método de fosfato de cálcio (Virology, 1973, Vol. 52, 456-467), um método de DEAE-dextrano ou similares é preferencialmente usado na transformação das células animais.

[0076] No caso de usar bactérias como hospedeiras, preferencialmente, os vetores de expressão de variante de proteína APOA2 são capazes de se replicar em bactérias de forma autônoma nas bactérias e também são constituídos por uma sequência promotora, uma sequência de ligação ribossômica, a sequência de DNA que codifica a variante de proteína APOA2 e uma sequência terminal da transcrição. Os vetores de expressão também podem conter um gene que codifica um fator regulador que controla o promotor. Qualquer promotor que pode funcionar nos hospedeiros como E. coli pode ser usado.

[0077] Do mesmo modo, no caso de usar células eucariontes como leveduras, células animais ou células de insetos como os hospedeiros, transformantes que expressam a variante de proteína APOA2 também podem ser obtidos de acordo com uma abordagem conhecida na técnica. Os vetores de expressão de variante de proteína APOA2 para uso nas células eucariontes contêm uma sequência promotora e a sequência de DNA que codifica a variante de proteína APOA2, que pode ser ligada, se desejado, a um elemento cis (por exemplo um enhancer), um sinal de splicing (um sítio doador, um sítio aceitante, um ponto de ramificação, etc.), um sinal de adição poli-A, uma sequência marcadora seletiva, uma sequência de ligação ribossômica (sequência SD), e similares.

(c) CULTURA DE T RANSFORMANTE E EXPRESSÃO DE VARIANTE DE PROTEÍNA APOA2 RECOMBINANTE

[0078] Subsequentemente, os transformantes preparados são cultivados. O método para cultivar os transformantes em um meio é realizado de acordo com um método normal para uso na cultura dos hospedeiros. No caso do uso, por exemplo, bactérias como os hospedeiros, o meio não é especialmente limitado desde que o meio contenha uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, sais inorgânicos, etc., utilizável pelas bactérias e as bactérias sejam capazes de crescer ou se proliferar no meio. Qualquer um dos meios natural e sintético pode ser usado. Exemplos mais específicos dos mesmos incluem um meio LB, mas não se limitam a esse, como um assunto óbvio. Para a cultura seletiva dos transformantes, um antibiótico como ampicilina ou tetraciclina pode ser adicionado ao meio, se necessário. A cultura é geralmente realizada a 37°C por 6 a 24 horas sob condições aeróbicas como cultura com aeração e agitação. Durante o período de cultura, o pH é preferencialmente mantido em um pH neutro ou por volta de um pH neutro. O pH é ajustado com o uso de um ácido inorgânico ou orgânico ou uma solução alcalina ou similares. Quando os transformantes são células animais como células CHO, as células hospedeiras podem ser inoculadas em 1 x 105 células/mL para um meio DMEM fabricado pela GIBCO/Thermo Fisher Scientific, Inc. e cultivadas em uma incubadora de 37°C com CO2 5%. Durante a cultura, um antibiótico como ampicilina ou tetraciclina pode ser adicionado ao meio, se necessário.

[0079] Quando os vetores de expressão de variante de proteína APOA2 são vetores tipo indução de expressão de proteína que contêm um sistema de controle de expressão de proteína (que corresponde, por exemplo, a um gene repressor e um operador das bactérias hospedeiras), a expressão da variante de proteína APOA2 precisa ser induzida por um tratamento predeterminado dos transformantes. O método de indução de expressão difere dependendo do sistema de controle de expressão de proteína contido nos vetores. Portanto, o tratamento de indução adequado para o sistema pode ser realizado. Por exemplo, o sistema de controle de expressão de proteína mais geralmente usado nos vetores tipo indução de expressão de proteína para uso nas bactérias hospedeiras é um sistema que consiste em um gene repressor lac e um operador lac. Esse sistema é capaz de induzir a expressão por tratamento com IPTG (isopropil-1-tio-β-D-galactosideo). Pode-se permitir que os transformantes que têm os vetores de expressão de proteína APOA2 que contêm esse sistema expressem a variante de proteína APOA2 de interesse pela adição de IPTG em uma quantidade apropriada (por exemplo, concentração final: 1 mM) no meio.

(D) EXTRAÇÃO E/OU RECUPERAÇÃO DE VARIANTE DE PROTEÍNA APOA2 RECOMBINANTE

[0080] Quando a variante de proteína APOA2 é produzida dentro dos corpos bacterianos ou das células após a cultura, os corpos bacterianos ou as células podem ser recuperados e rompidos, seguido por extração de proteína. Quando a variante de proteína APOA2 é produzida fora dos corpos bacterianos ou das células, a solução de cultura pode ser usada diretamente, ou o sobrenadante obtido pela remoção dos corpos bacterianos ou das células através de centrifugação ou similares, podem ser usados. Em seguida, a variante de proteína APOA2 pode ser isolada e purificada a partir das culturas usando, sozinho ou em combinação apropriada, métodos gerais de purificação de proteínas, por exemplo, precipitação de sulfato de amônio, filtração em gel, cromatografia de troca iônica e cromatografia de afinidade. Se foi obtida ou não a variante de proteína APOA2 pode ser confirmado por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS ou similares.

1 -3. PREPARAÇÃO DE ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-APOA2 1 -3-1. MÉTODOS PARA PREPARAR ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-APOA2 E HIBRIDOMA

[0081] Hibridomas que produzem o anticorpo monoclonal anti- APOA2 da presente invenção podem ser preparados por um método descrito abaixo. No entanto, o método de preparação não está limitado a isso, e qualquer um dos outros métodos conhecidos na técnica pode ser usado para a preparação.

(1) MÉTODO PARA PREPARAR ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-APOA2

[0082] A fim de preparar o anticorpo monoclonal terminal de proteína anti-APOA2 que se liga especificamente à região C-terminal de qualquer proteína APOA2 mostrada na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3 na sequência de aminoácidos que constitui a proteína APOA2, anticorpos monoclonais podem ser preparados com a variante de proteína APOA2 ou um peptídeo que compreende a região C-terminal da proteína variante APOA2 como um imunógeno e em seguida triados para um anticorpo que se liga somente à variante de proteína APOA2 específica com o uso da proteína APOA2 mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 3 ou o peptídeo que compreende a região C-terminal da variante de proteína APOA2. Por exemplo, o anticorpo monoclonal terminal anti-APOA2-ATQ pode ser selecionado por triagem usando, como um índice, ligação específica à região C-terminal da proteína APOA2-ATQ mostrada na SEQ ID NO: 1 sem ou quase sem ligação à variante de proteína APOA2 mostrada na SEQ ID NO: 2 ou 3. Além disso, o anticorpo monoclonal terminal anti-APOA2-AT pode ser selecionado por triagem usando, como um índice, ligação específica à região C-terminal da proteína APOA2-AT mostrada na SEQ ID NO: 2 sem ou quase sem ligação à variante de proteína APOA2 mostrada na SEQ ID NO: 1 ou 3.

[0083] A fim de preparar o anticorpo não terminal de proteína anti- APOA2 que reconhece aminoácidos exceto a região C-terminal da proteína APOA2, podem ser preparados anticorpos monoclonais com a variante de proteína APOA2 ou um peptídeo que compreende uma sequência parcial dos mesmos como um imunógeno e em seguida triado para o anticorpo de interesse usando, com índice, os mesmos níveis de atividade de ligação contra as variantes de proteína APOA2 mostradas nas SEQ ID NOs: 1 a 3 ou seus peptídeos que diferem no C-terminal quando a atividade de ligação é comparada entre eles.

(2) PREPARAÇÃO DE CÉLULAS QUE PRODUZEM ANTICORPO ANTI-APOA2

[0084] A proteína APOA2 recombinante obtida como um imunógeno nos parágrafos 1 a 2 é dissolvida em uma solução tampão para preparar uma solução de imunógeno. Para imunização efetiva, um adjuvante pode ser adicionado, se necessário. Exemplos do adjuvante incluem adjuvante completo de Freund (FCA) e adjuvante incompleto de Freund (FIA) comercialmente disponíveis. Esses adjuvantes podem ser usados sozinhos ou como uma mistura.

[0085] Em seguida, um mamífero, por exemplo, um rato, um camundongo (por exemplo, um camundongo endogâmico BALB/C) ou um coelho é imunizado pela administração da solução de imunógeno preparada. Exemplos de métodos de administração de imunógeno incluem, mas não se limitam a, injeção subcutânea com o uso de FIA ou FCA, injeção intraperitoneal com o uso de FIA e injeção intravenosa com o uso de 0,15 mol de cloreto de sódio. Uma dose do imunógeno é determinada apropriadamente de acordo com o tipo de animal a ser imunizado, uma via de administração, etc., e é aproximadamente de 50 a 200 μg por animal. Os intervalos entre as doses de imunização não são especialmente limitadas. Após a preparação, 2 a 6, preferencialmente 3 ou 4 estímulos são realizados em intervalos de alguns dias a algumas semanas, preferencialmente em intervalos de 1 a 4 semanas. Após a preparação, um título de anticorpo no soro do animal imunizado é medido por ELISA (ensaio imunoabsorvente ligado à enzima) ou similares. Desde que um aumento suficiente no título do anticorpo seja confirmado, o imunógeno é injetado por via intravenosa ou intraperitoneal para a imunização final. 2 a 5 dias, preferencialmente 3 dias após a data da imunização final, as células que produzem anticorpos são coletadas.

1 -3-2. MÉTODO PARA PREPARAR HIBRIDOMA QUE PRODUZ ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-APOA2 (1) RECUPERAÇÃO DE CÉLULAS PRODUTORAS DE ANTICORPOS A PARTIR DE ANIMAIS IMUNIZADOS E FUSÃO CELULAR

[0086] As células que produzem anticorpo obtidas a partir do animal imunizado podem ser submetidas à fusão celular com células de mieloma para preparar hibridomas que produzem o anticorpo monoclonal que reconhece especificamente a região em particular da proteína APOA2. Exemplos de células que produzem anticorpo incluem células de baço, células de linfonodo e células de sangue periférico. Células de baço ou células de linfonodo locais são preferenciais. Uma linhagem celular estabelecida disponível geral derivada de camundongo ou similares pode ser usada como células de mieloma para a fusão com as células que produzem anticorpo. A linhagem celular usada preferencialmente tem seletividade de droga e tem a propriedade de serem incapazes de sobreviver a um estado não fundido em um meio seletivo HAT (contendo hipoxantina, aminopterina e timidina) e serem capazes de crescer apenas nesses em um estado fundido com as células que produzem anticorpo. Além disso, a linhagem celular estabelecida é preferencialmente derivada de um animal da mesma espécie que o animal imunizado. Exemplos específicos das células de mieloma incluem linhagens celulares deficientes em hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferase (HGPRT) derivadas de camundongo BALB/c, (HGPRT) P3X62-Ag.8 (ATCCTIB9), P3X63- Ag.8.U1 (JCRB9085), P3/NSI/1-Ag4-1 (JCRB0009), P3x63Ag8.653 (JCRB0028) e SP2/0-Ag14 (JCRB0029).

[0087] Para a fusão celular entre as células de mieloma e as células que produzem anticorpo, as células que produzem anticorpo e as células de mieloma são misturadas em uma razão de aproximadamente 1:1 a 20:1 em um meio livre de soro para a cultura celular do animal, como um meio DMEM ou RPMI1640 e fusionadas entre si através de reação na presença de um promotor de fusão celular. Por exemplo, polietileno glicol que tem um peso molecular médio de 1.500 a 4.000 Da pode ser usado como o promotor da fusão celular a uma concentração de aproximadamente 10 a 80%. Se necessário, um auxiliar como sulfóxido de dimetila pode ser usado em combinação com este para melhorar a eficiência da fusão. Alternativamente, as células que produzem anticorpo e as células de mieloma podem ser fusionadas entre si com o uso de um aparelho de fusão celular disponível comercialmente que emprega estímulo elétrico (por exemplo, eletroporação) (Nature, 1977, Vol. 266, 550 a 552).

(2) SELEÇÃO DE HIBRIDOMA DE INTERESSE

[0088] Em um método para selecionar hibridomas que produzem o anticorpo monoclonal anti-APOA2 de interesse a partir de células após o tratamento de fusão celular, a suspensão celular é diluída apropriadamente, por exemplo, com um meio RPMI1640 contendo soro bovino feral e então semeada a aproximadamente 2 x 106 células/poço em uma placa de microtitulação de 96 poços. Um meio seletivo é adicionado a cada poço onde as células são subsequentemente cultivadas com o meio seletivo apropriadamente substituído por um novo. A temperatura de cultura é de 20 a 40°C, preferencialmente aproximadamente 37°C. Quando as células de mieloma são da linhagem deficiente em HGPRT ou da linhagem deficiente em timidina quinase, apenas hibridomas das células de mieloma podem ser deixadas para crescer seletivamente ou proliferar pelo uso de um meio seletivo contendo hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT). Portanto, o crescimento celular de aproximadamente 10 dias após o início da cultura no meio seletivo pode ser selecionado como os hibridomas.

[0089] Os hibridomas selecionados no meio HAT são primeiro triados pelo uso de atividade de ligação contra diversas variantes de proteína APOA2 mostradas nas SEQ ID NOs: 1 a 3 como um índice. Subsequentemente, os hibridomas que produzem o anticorpo tendo atividade de ligação contra a variante de proteína APOA2 são testados quanto à reatividade cruzada para selecionar aqueles aceitáveis. Reatividade cruzada aceitável significa reatividade cruzada em um nível desprezível para os objetivos pretendidos para o anticorpo. Por exemplo, um anticorpo monoclonal para um ensaio imunológico pode ser considerado como praticamente sem reatividade cruzada quando a intensidade de sinal da reação cruzada em um sistema de ensaio final pode ser suprimida em um nível de fundo para menos que 1% da intensidade do sinal da reação específica.

[0090] Por exemplo, ELISA pode ser usado para confirmar a especificidade de reação para a variante de proteína APOA2 específica. Nesse método ELISA, uma microplaca na qual diversas variantes de proteína APOA2 ou fragmentos das mesmas são imobilizados separadamente como antígenos em diferentes poços são preparadas ou reagidas pela adição de amostras diluídas apropriadamente do sobrenadante da cultura dos hibridomas. Após reação suficiente, os poços são lavados e ainda reagiram pela adição de uma forma marcada de um anticorpo secundário direcionado para uma imunoglobulina. Os poços são lavados novamente e podem ser por fim analisados pelo uso do marcador do anticorpo secundário ligado com os poços para determinar quantitativamente a atividade de ligação do anticorpo presente no sobrenadante da cultura contra os antígenos. Por exemplo, para a preparação do anticorpo monoclonal terminal de proteína anti-APOA2, a especificidade pode ser determinada pelo uso, como um índice, da exibição da atividade de ligação apenas contra a região C-terminal da variante de proteína APOA2 específica sem reatividade cruzada com outras variantes de proteína APOA2. Para a preparação do anticorpo monoclonal não terminal de proteína anti-APOA2, o anticorpo é selecionado pelo uso, como um índice, dos mesmos níveis de atividade de ligação contra todas as variantes de proteína APOA2 que diferem no C-terminal sem a inibição da ligação do anticorpo monoclonal terminal de proteína anti-APOA2 à região C-terminal pelo anticorpo preparado.

[0091] Os hibridomas também podem ser selecionados por uso de uma técnica de DNA recombinante. Primeiramente, os mRNAs são extraídos do grupo do hibridoma obtido de acordo com o método anteriormente mencionado. A extração do mRNA pode ser realizada pelo uso de um método conhecido na técnica. Subsequentemente, os cDNAs são obtidos a partir de mRNAs com o uso de primers Oligo dT ou primers aleatórios. Os cDNAs são usados como modelos em PCR com o uso de conjuntos de primers que compreendem a sequência de nucleotídeos da sequência sinal a montante do gene que codifica a região variável e uma sequência de nucleotídeos na lateral da região constante. Os produtos de amplificação obtidos podem ser inseridos nos vetores de clonagem apropriados e clonados para obter uma biblioteca de genes da região variável dos anticorpos produzidos pelos hibridomas. Como um exemplo mais específico não limitante, PCR é realizada com o uso de Primer lg de Camundongo fornecido pela Novagen/Merck KGaA e então produtos da amplificação (cDNAs da região variável da imunoglobulina de camundongo) são inseridos nos sítios EcoRI dos Vetores ZERO BLUNT PCR TOPO fornecidos pela Invitrogen Corp. e clonados. O grupo de vetor obtido pode ser usado como uma biblioteca dos genes que codificam a região variável das sequências de aminoácidos. Em seguida, uma sonda é projetada com base na sequência de aminoácidos de cada região variável de cada CDR divulgada na presente invenção. A biblioteca pode ser triada para clones positivos para selecionar os hibridomas que produzem o anticorpo da presente invenção.

(3) PRODUÇÃO DE ANTICORPO COM O USO DE HIBRIDOMA

[0092] Os hibridomas, de acordo com a presente invenção, podem ser usados na produção de anticorpo para a formação de ascites com o uso de um camundongo. Especificamente, os hibridomas são inoculados por via intraperitoneal em um camundongo de origem de células parceiras de fusão usadas para preparar os hibridomas, ou para um camundongo nu. Os ascites podem ser coletados apropriadamente para recuperar um fluido de ascite que contém anticorpo. Mais especificamente, hibridomas obtidos com células SP2/0 como uma parceira de fusão são inoculados por via intraperitoneal em um camundongo BALB/c após um lapso de 10 dias após a inoculação com pristina, e um fluido de ascite que contém anticorpos pode ser recuperado.

[0093] Os hibridomas, de acordo com a presente invenção, podem ser usados na produção de anticorpo por cultura com o uso de um meio adequado. Especificamente, os hibridomas podem ser inoculados a 1 x 105 células/mL em um meio Hibridoma-SFM fabricado pela Gibco/Thermo Fisher Scientific, Inc. e cultivados em uma incubadora a 5% de CO2 a 37°C, até os hibridomas serem mortos para obter um sobrenadante de cultura que contém anticorpo, embora o método de produção de anticorpo de acordo com a presente invenção não esteja limitado a isso.

(4) MÉTODO PARA PREPARAR ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-APOA2 RECOMBINANTE OU UM FRAGMENTO DO MESMO POR MANIPULAÇÃO DE DNA RECOMBINANTE

[0094] O anticorpo da presente invenção ou o fragmento do mesmo também pode ser obtido por manipulação de DNA recombinante com o uso de uma sequência de cDNA que codifica a sequência de aminoácidos do anticorpo.

[0095] São usadas sequências de nucleotídeos que codificam as sequências de aminoácidos das regiões variáveis do anticorpo derivado de um hibridoma que produz anticorpo monoclonal anti-APOA2, por exemplo, o hibridoma que produz o anticorpo monoclonal terminal de proteína anti-APOA2 obtido pela abordagem descrita no parágrafo “1-3-2(2)”. Essas sequências de nucleotídeos de VH e VL são ligadas às sequências de nucleotídeos que codificam CH e CL arbitrários, respectivamente, e os polinucleotídeos resultantes podem ser incorporados nos vetores de expressão apropriados, que então são transferidos às células hospedeiras, após a expressão como uma molécula de imunoglobulina completa. Alternativamente, de acordo com a técnica de anticorpo de enxerto de CDR, polinucleotídeos que codificam as sequências de aminoácidos das sequências CDR nas sequências de aminoácidos das regiões variáveis obtidas pela abordagem descrita no parágrafo “1-3-2(2)” podem ser incorporados nos vetores de expressão apropriados, que então são transferidos às células hospedeiras, seguido pela expressão como uma molécula de imunoglobulina completa. Nesse sentido, uma abordagem é conveniente, na qual a cadeia pesada e a cadeia leve a serem pareadas podem ser expressas na mesma célula hospedeira e produzidas como um dímero de cadeia pesada/cadeia leve. Especificamente, cada célula é cotransfectada, por exemplo, com o vetor de expressão de cadeia leve e o vetor de expressão de cadeia pesada e o anticorpo de acordo com a presente invenção também pode ser obtido a partir dessa célula transformada. Alternativamente, polinucleotídeos que codificam as sequências de aminoácidos descritas acima podem ser incorporados diretamente aos vetores de expressão apropriados, que são então transferidos para células hospedeiras, seguido pela expressão como fragmentos da molécula de imunoglobulina. Alternativamente, conforme mencionado anteriormente, polinucleotídeos que codificam respectivamente VL e VH ou a cadeia leve e a cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos podem ser ligados através de uma sequência de nucleotídeos que codifica um ligante apropriado, então incorporados aos fagos e expressos como Fv de cadeia única ou como um fragmento de anticorpo sintético como um diacorpo. Além disso, de acordo com a técnica de exibição por fago de anticorpo recém desenvolvida (Brinkmann et al., 1995, J. Immunol Methods, 182, 41-50; e publicação internacional documento WO 97/13844 e documento WO 90-02809), que envolve a expressão de anticorpos recombinantes na superfície do fago através da exploração de uma técnica de elaboração de gene, anticorpos Fv de cadeia única diversificados por genes embaralhados artificialmente que codificam cadeias pesadas e leves podem ser expressos como proteínas de fusão de fagos para obter anticorpos específicos.

[0096] Os métodos para preparação do polinucleotídeo que codifica o anticorpo anti-APOA2 recombinante ou o fragmento do mesmo, preparação de vetores que carregam o polinucleotídeo e que transferem os vetores aos hospedeiros podem ser realizados pelo uso de uma técnica de DNA recombinante conhecida. O anticorpo anti-proteína APOA2 recombinante de interesse ou o fragmento do mesmo pode ser obtidos a partir da solução de cultura das células transformadas ou a partir do interior das células.

[0097] Por exemplo, plasmídeos, fagomídeos, cosmídeos ou vetores virais (por exemplo, vetor baseado no vírus SV40, vetor baseado no vírus EB e vetor baseado no BPV) podem ser usados como vetores de expressão de imunoglobulina, embora os vetores não estejam limitados a esses. Por exemplo, um vetor BCMGS Neo, que é um vetor baseado no BPV, é um vetor desejável para a expressão eficiente de um gene estranho pela transformação de células COS7 ou similares a essas (Hajime Karasuyama, “Bovine papilloma virus vector”, Masami Muramatsu and Hiroto Okayama, ed., Experimental Medicine, Suppl.: Handbook of Gene Engineering, 1991, Yodosha Co., Ltd., 297-299).

[0098] Os vetores podem conter elementos de controle (por exemplo, um promotor, um enhancer, um terminador, um sítio de poliadenilação e um sítio de splicing), necessários para a expressão do anticorpo ou do fragmento do mesmo, ou um marcador seletivo opcional, em adição ao polinucleotídeo que codifica o anticorpo ou o fragmento do mesmo.

[0099] As hospedeiras descritas nos parágrafos “1-2 Preparation of Immunogen”, bem como células SP2/0 (mieloma de camundongo (European Journal of Cancer Prevention (1996) Vol. 5, 512-519; e Cancer Research (1990) Vol. 50, 1495-1502) são preferencialmente usadas como hospedeiras para transformação.

[00100] As células hospedeiras contendo os vetores para a expressão do anticorpo de acordo com a presente invenção ou do fragmento do mesmo podem ser cultivadas de acordo com um método de rotina, de modo que o anticorpo seja produzido no sobrenadante da cultura ou nas células hospedeiras. Especificamente, quando as hospedeiras são células CHO, as células hospedeiras podem ser inoculadas a 1 x 105 células/mL para um meio DMEM fabricado pela Gibco/Thermo Fisher Scientific, Inc. e cultivadas em uma incubadora a 5% de CO2 a 37°C para obter um sobrenadante de cultura contendo anticorpo. Quando as células hospedeira são, por exemplo, células de E. coli, as células hospedeiras podem ser inoculadas em um meio geral para uso em cultura de E. coli, como um meio LB e cultivadas para a indução da expressão de proteína para produzir o anticorpo no sobrenadante da cultura ou nas células hospedeiras.

[00101] O anticorpo produto de expressão ou fragmento do mesmo que contém regiões constantes pode ser purificado e recuperado a partir do sobrenadante da cultura ou de lisados celulares com o uso de uma coluna de proteína A, uma coluna de proteína G, uma coluna de afinidade de anticorpo anti-imunoglobulina, ou similares. Ao contrário, esse método de purificação não pode ser aplicado ao produto de expressão que consiste em regiões variáveis sem conter regiões constantes. Portanto, outros métodos de purificação apropriados são aplicados a esse. O anticorpo ou fragmento do mesmo pode ser expresso como uma estrutura C-terminal fusionada, por exemplo, com uma sequência marcadora vantajosa para a purificação, como um marcador de histidina e, através disso, purificado por cromatografia de afinidade com o uso do ligante correspondente. A menos que seja a proteína de fusão com marcador, esse anticorpo ou um fragmento do mesmo pode ser purificado de acordo com um método de purificação de proteína de rotina, como precipitação com sulfato de amônio, cromatografia de troca iônica, cromatografia de fase reversa, cromatografia de filtração em gel ou cromatografia em hidroxilapatita.

[00102] Para confirmar a especificidade para a variante de proteína APOA2 específica ou o fragmento da mesma o anticorpo monoclonal ou o fragmento do mesmo usado na presente invenção é testado preferencialmente quanto à reatividade cruzada com outras variantes antes do uso, conforme mencionado acima. Os antígenos para os quais a reatividade cruzada, por exemplo, do anticorpo monoclonal terminal de proteína anti- APOA2-ATQ da presente invenção ou o fragmento do mesmo que devem ser confirmados são a proteína APOA2-AT e a proteína APOA2-A.

[00103] É mais preferencial confirmar a reatividade cruzada do anticorpo ou do fragmento do mesmo usado na presente invenção com as proteínas descritas acima, bem como com outras proteínas que têm uma estrutura parcial em comum com as variantes de proteína APOA2. ELISA, por exemplo, com a proteína APOA2-ATQ como um antígeno pode ser usado para confirmar a reação cruzada. O anticorpo a ser testado quanto à especificidade de reação, isto é, o anticorpo terminal de proteína anti-APOA2 ou o fragmento do mesmo é reagido com a variante de proteína APOA2 na presença de outras proteínas antigênicas para as quais a reatividade cruzada deve ser confirmada. A reatividade cruzada pode ser confirmada observando a competição entre a variante de proteína APOA2 e as proteínas antigênicas. Esse método para confirmar a reatividade cruzada através do uso dos princípios da inibição competitiva elimina a necessidade de preparar sistemas de reação para todos os antígenos e, portanto, permite triagem rápida.

1 -3-3. CONFIRMAÇÃO ESTRUTURAL DE REGIÃO NA PROTEÍNA APOA2 RECONHECIDA PELO ANTICORPO MONOCLONAL TERMINAL DE PROTEÍNA ANTI- APOA2

[00104] O tipo da variante de proteína APOA2 reconhecido especificamente pelo anticorpo monoclonal anti-APOA2 obtido pode ser determinado por preparação de genes de diversas variantes de proteína APOA2 com o uso de reação PCR ou similares, com base no gene da proteína APOA2 e com a análise da atividade de ligação do anticorpo monoclonal contra as diversas variantes de proteína APOA2 obtidas a partir dos genes.

[00105] No caso do anticorpo monoclonal terminal de proteína anti- APOA2, esse método é realizado especificamente da seguinte forma: primeiramente, o gene APOA2 inteiro ou comprimentos variáveis de fragmentos com falta de 6 bases ou 9 bases, incluindo o códon de parada do gene APOA2 a partir do códon de parada na direção da extremidade 5’ são preparados e os vetores de expressão tendo insertos desses fragmentos são preparados. Esse método para preparação dos fragmentos gênicos que têm mutação de deleção é descrito em “Zoku-Seikagaku Jikken Koza 1, Idenshi Kenkyuho II (Experiments in Biochemistry, segunda série, Methods em Gene research in English), páginas 289-305, The Japanese Biochemical Society ed”. Em seguida, diversas variantes de proteína APOA2 são preparadas conforme o método mencionado acima a partir de células hospedeiras que abrigam os respectivos vetores de expressão da variante de proteína APOA2. Subsequentemente, a atividade de ligação do anticorpo monoclonal anti-proteína APOA2 contra as diversas variantes de proteína APOA2 é avaliado por ELISA com o uso dessas proteínas como antígenos. O anticorpo monoclonal pode ser determinado como um anticorpo monoclonal terminal de proteína anti-APOA2 que se liga especificamente à variante de proteína APOA2 específica quando o anticorpo monoclonal exibe atividade de ligação apenas contra a variante específica e exibe nenhuma ou quase nenhuma atividade de ligação contra as outras variantes.

[00106] A variante de proteína APOA2 reconhecida pelo anticorpo monoclonal terminal de proteína anti-APOA2 obtido também pode ser confirmada por um método conforme descrito abaixo.

[00107] Primeiramente, peptídeos que têm as sequências das regiões C-terminais das diversas variantes de proteína APOA2 são, cada um, sintetizados em uma fase sólida por um método conhecido na técnica. Subsequentemente, a atividade de ligação do anticorpo monoclonal terminal de proteína anti-APOA2 contra os diversos peptídeos é avaliada por ELISA com o uso desses peptídeos como antígenos. O anticorpo monoclonal anti-proteína APOA2 pode ser determinado como um anticorpo monoclonal terminal de proteína anti-APOA2 que se liga especificamente à variante de proteína APOA2 específica quando descoberto que o anticorpo monoclonal tem atividade de ligação apenas contra o peptídeo que tem a sequência da região C-terminal específica.

1 -4. PREPARAÇÃO DE ANTICORPO POLICLONAL ANTI-APOA2

[00108] O anticorpo policlonal anti-APOA2 pode ser preparado por um método conhecido na técnica. Desse ponto em diante, o método para obter um anticorpo terminal de proteína anti-APOA2 que se liga especificamente à variante de proteína APOA2 específica será dado especificamente como um exemplo.

1 -4-1. OBTENÇÃO DE ANTISSORO

[00109] Para preparar o anticorpo policlonal terminal de proteína anti-APOA2, primeiramente, um fragmento C-terminal que tem um comprimento de no mínimo 6 ou mais aminoácidos na sequência da variante de proteína APOA2 específica, por exemplo, o peptídeo mostrado na SEQ ID NO: 28 ou 29, é dissolvido em uma solução tampão para preparar uma solução de imunógeno. Para imunização efetiva, um adjuvante pode ser adicionado, se necessário. Exemplos do adjuvante incluem adjuvante completo de Freund (FCA) e adjuvante incompleto de Freund (FIA) comercialmente disponíveis. Esses adjuvantes podem ser usados sozinhos ou como uma mistura.

[00110] A seguir, um mamífero, por exemplo, um rato, um camundongo (por exemplo, um camundongo endogâmico Balb/c) ou um coelho são imunizados pela administração da solução de imunógeno preparada. Uma dose da solução de imunógeno é determinada de maneira apropriada de acordo com o tipo do animal a ser imunizado, uma rota de administração, etc., e pode envolver aproximadamente 50 a 200 μg do imunógeno por animal. Exemplos dos métodos de administração da solução de imunógeno incluem, mas não se limitam a, injeção subcutânea com o uso de FIA ou FCA, injeção intraperitoneal com o uso de FIA e injeção intravenosa com o uso de cloreto de sódio 150 mM. Os intervalos entre as doses de imunização não são especialmente limitados. Após a preparação, 2 a 10, preferencialmente 3 ou 4 estímulos são realizados em intervalos de alguns dias a algumas semanas, preferencialmente em intervalos de 1 a 4 semanas. Após a preparação, um título de anticorpo no soro do animal imunizado é medido repetidamente por ELISA (ensaio imunoabsorvente ligado à enzima) ou similares. Desde que um aumento suficiente no título do anticorpo seja observado, a solução de imunógeno é injetada por via intravenosa ou por via intraperitoneal para a imunização final. O antissoro que contém o anticorpo policlonal que reconhece a proteína APOA2 pode ser recuperado a partir do sangue do animal imunizado dessa forma.

1 -4-2. PURIFICAÇÃO DE ANTICORPO ANTI-APOA2 (1) PREPARAÇÃO DE COLUNA DE PEPTÍDEO IMOBILIZADO

[00111] As colunas de afinidade são preparadas respectivamente por imobilização do peptídeo de região C-terminal da proteína APOA2 e um peptídeo de região C-terminal da proteína APOA2 adicionada ao grupo amida C-terminal. O método detalhado está descrito em “Experimental Protocol for Anti-Peptide Antibodies”, 2a edição, Gakken Medical Shujunsha Co., Ltd. Por exemplo, carreadores de formil-Celulofina ou CNBr agarose que têm grupos funcionais capazes de se ligar aos grupos amino de peptídeos, ou carreadores capazes de se ligar aos resíduos de cisteína em sequências de peptídeos através de grupos maleimida ligados covalentemente aos carreadores podem ser usados como carreadores para uso nas colunas de afinidade. O comprimento do peptídeo a ser imobilizado tem 6 ou mais aminoácidos, preferencialmente 10 ou mais aminoácidos, mais preferencialmente 18 ou mais aminoácidos, ainda mais preferencialmente 30 ou mais aminoácidos, incluindo o C-terminal da proteína APOA2.

(2) PURIFICAÇÃO DE ANTICORPO

[00112] O anticorpo policlonal terminal de proteína anti-APOA2 pode ser purificado a partir do antissoro com o uso de colunas de afinidade de peptídeo imobilizado. Por exemplo, o antissoro é diluído com uma solução tampão adequada. Os anticorpos lgG contidos no antissoro são adsorvidos na coluna de afinidade de peptídeo imobilizado da região C-terminal da proteína APOA2, e esta fração adsorvida é recuperada. Subsequentemente, imunoglobulinas que exibem atividade de ligação contra uma região exceto a região C-terminal do peptídeo são removidas por adsorção com o uso da coluna de afinidade de peptídeo imobilizado da proteína APOA2 amidada C-terminal. Por fim, a fração não adsorvida resultante é obtida como um anticorpo policlonal terminal de proteína anti-APOA2 que reconhece especificamente a variante de proteína APOA2 específica.

2. MÉTODO PARA DETECTAR TUMOR PANCREÁTICO

[00113] O segundo aspecto da presente invenção refere-se a um método para detectar um tumor pancreático, por exemplo, câncer pancreático ou tumor pancreático benigno, in vitro. O método da presente invenção é baseado na descoberta de que as quantidades de ambas ou uma das duas variantes da proteína APOA2, por exemplo, a proteína APOA2-ATQ e a proteína APOA2-AT no sangue são significativamente diminuídas em pacientes com tumor pancreático, em comparação a pessoas normais. Uma característica desse método é testar as duas variantes de proteína APOA2 com o uso de anticorpos que reconhecem especificamente as regiões C-terminais das variantes de proteína APOA2 (anticorpos terminais de proteína anti-APOA2) ou fragmentos dessas e anticorpos de proteína anti-APOA2 que reconhecem as sequências de aminoácidos das regiões exceto essas regiões C-terminais (anticorpos sem terminação de proteína anti-APOA2) ou fragmentos dessas. Uma característica adicional do método para detectar um tumor pancreático é a análise multivariada com o uso dos valores de medição de duas variantes de proteína APOA2 analisadas.

[00114] O método da presente invenção compreende a etapa de avaliação dos marcadores para a detecção de tumor pancreático e a etapa para determinar afecção. Deste ponto em diante, cada etapa será descrita em detalhes.

2-1. ETAPA DE T ESTE DE MARCADORES PARA DETECÇÃO DE TUMOR PANCREÁTICO

[00115] A “etapa de teste de marcadores para detecção de tumor pancreático” é a etapa de medição in vitro das quantidades dos marcadores para detecção de tumor pancreático, por exemplo, as duas variantes de proteína APOA2 (proteína APOA2-ATQ e proteína APOA2-AT), presentes em um fluido corporal derivado de um sujeito de teste.

[00116] No presente relatório descritivo, o “sujeito de teste” refere- se a um indivíduo que é um sujeito para a detecção de tumor pancreático, preferencialmente um indivíduo com suspeita de ter um tumor pancreático. Nesse contexto, os exemplos de indivíduos incluem vertebrados. O indivíduo é preferencialmente um mamífero, por exemplo, um primata (humano, macaco, chimpanzé, orangotango, gorila, etc.), um roedor (camundongo, rato, porquinho da Índia), um animal ungulado (gado, cavalo, ovelha, cabra, etc.), mais preferencialmente um humano. No presente relatório descritivo, quando o sujeito de teste é um humano, esse sujeito de teste é particularmente citado como um “sujeito de teste humano” abaixo.

[00117] No presente relatório descritivo, o “fluido corporal” é uma amostra que é submetida à detecção de tumor pancreático e significa um fluido biológico. O fluido corporal não é particularmente limitado, desde que o fluido corporal seja um fluido biológico que possivelmente contenha os marcadores para detecção de tumor pancreático da presente invenção. O fluido corporal inclui, por exemplo, sangue, urina, sobrenadantes de cultura de linfócitos, líquido cefalorraquidiano, sucos digestivos (incluindo, por exemplo, suco pancreático, suco do intestino grosso, secreções de glândulas do esôfago e saliva), suor, ascite, secreção nasal, lágrimas, fluido vaginal e sêmen. Sangue ou urina são preferenciais. No presente relatório descritivo, o “sangue” inclui sangue total, plasma e soro. O sangue total não é limitado por seu tipo e pode ser, por exemplo, sangue venoso, sangue arterial ou sangue do cordão umbilical. O fluido corporal pode ser uma combinação de dois ou mais fluidos corporais obtidos do mesmo indivíduo. O método para a detectar um tumor pancreático de acordo com a presente invenção permite a detecção mesmo a partir de um sangue ou urina pouco invasivos, sendo, portanto, muito útil como um método de detecção conveniente.

[00118] O “fluido corporal” derivado de um sujeito de teste refere- se ao fluido corporal já coletado do sujeito de teste, e o ato de coletar do fluido corporal não está incluso no escopo da presente invenção. O fluido corporal derivado de um sujeito de teste pode ser submetido ao método da presente invenção imediatamente após ser coletado do sujeito de teste. Alternativamente, o fluido corporal derivado de um sujeito de teste pode ser refrigerado ou congelado imediatamente após a coleta ou após um tratamento apropriado e levado à temperatura ambiente antes de ser submetido ao método da presente invenção. O tratamento apropriado antes da refrigeração ou congelamento inclui, por exemplo, o tratamento de anticoagulação do sangue total por adição de heparina ou similares, seguido pela separação como plasma ou soro. Esse tratamento pode ser realizado com base em uma técnica conhecida.

[00119] No presente relatório descritivo, as “quantidades das variantes de proteína APOA2” referem-se às respectivas quantidades das duas variantes de proteína APOA2 presentes no fluido corporal de um sujeito de teste. As quantidades podem ser quaisquer quantidades absolutas ou relativas. As quantidades absolutas correspondem às massas ou aos volumes das duas variantes de proteína APOA2 contidas em uma quantidade pré-determinada do fluido corporal. As quantidades relativas referem-se, por exemplo, a valores de medição relativos das duas variantes de proteína APOA2 derivadas do sujeito de teste para os valores de medição de padrões usados. Exemplos das quantidades relativas incluem concentrações, intensidade de fluorescência e absorbância.

[00120] As quantidades das variantes de proteína APOA2 podem ser medidas in vitro pelo uso de um método conhecido na técnica. Exemplos desses incluem um método de medição com o uso de substâncias capazes de se ligar especificamente às duas variantes de proteína APOA2, respectivamente.

[00121] No presente relatório descritivo, o termo “capaz de se ligar especificamente” significa que uma determinada substância pode se ligar substancialmente apenas à variante de proteína APO2 específica como um alvo da presente invenção. Nesse caso, a presença de ligação não específica é aceitável sem influenciar a detecção da variante de proteína APO2 específica.

[00122] Exemplos de substâncias “capazes de ligar especificamente” incluem as proteínas de ligação a APOA2. Mais especificamente, as substâncias capazes de se ligar especificamente são, por exemplo, “anticorpos terminais de proteína anti-APOA2” que reconhecem a diferença na estrutura da região C-terminal e se ligam às variantes de proteína APOA2 como seus respectivos antígenos, preferencialmente “anticorpos terminais de proteína anti-APOA2 humana”, cada um reconhecendo e se ligando a apenas uma das variantes de proteína APOA2 quando as variantes de proteína APOA2 humana que compreendem a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, 2 ou 3 são usadas como antígenos, ou fragmentos de anticorpos desses anticorpos. Alternativamente, seus derivados modificados quimicamente podem ser usados. Nesse contexto, “derivados modificados quimicamente” também incluem, por exemplo, os anticorpos terminais proteica anti-APOA2 ou os fragmentos de anticorpos destes modificados funcionalmente conforme necessários para a aquisição ou manutenção da atividade ligante específica para a variação proteica APOA2 específica ou os anticorpos terminais proteica anti-APOA2 ou os fragmentos de anticorpos modificados com os marcadores necessários para a detecção.

[00123] Exemplos da modificação funcional incluem glicosilação, desglicosilação e peguilação. Exemplos da modificação com marcadores incluem a marcação com corantes fluorescentes (FITC, rodamina, Vermelho Texas, Cy3 e Cy5), proteínas fluorescentes (por exemplo, PE, AP, GFP e EGFP), enzimas (por exemplo, peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina e glicose oxidase), biotina, avidina ou estreptavidina.

[00124] Os anticorpos para uso no ensaio das variantes proteicas de proteína APOA2 podem ser qualquer um dos anticorpos policlonais e monoclonais. Os anticorpos monoclonais são preferenciais por obterem detecção específica. Por exemplo, um anticorpo policlonal terminal de proteína anti-APOA2 que se liga especificamente à terminação de proteína APOA2 pode ser preparado pelo método anteriormente mencionado.

[00125] As duas variantes de proteína APOA2 podem ser analisadas por um método imunológico com o uso dos anticorpos anti-APOA2, cada um se ligando apenas à variante de proteína APOA2 específica. O método imunológico pode ser qualquer método com o uso dos anticorpos anti-APOA2, e é preferencial ELISA com o uso dos anticorpos terminais de proteína anti- APOA2 como anticorpos imobilizados ou anticorpos marcados que são combinados com outro anticorpo que se liga a uma região exceto à terminação C da proteína APOA2 (anticorpo não terminal de proteína anti-APOA2). Por exemplo, a quantidade da proteína APOA2-ATQ pode ser medida por ELISA sanduíche com o uso dos anticorpos terminais anti-APOA2-ATQ como um anticorpo marcado e com o uso do anticorpo não terminal anti-APOA2-ATQ como um anticorpo imobilizado. A proteína APOA2-AT pode ser medida por ELISA sanduíche com o uso dos anticorpos terminais anti-APOA2-AT como um anticorpo imobilizado e com o uso dos anticorpos sem terminação anti-APOA2- AT como um anticorpo marcado. O anticorpo não terminal de proteína anti- APOA2 está disponível comercialmente junto à Abcam plc. Fitzgerald Industries International, ou similares, e esse produto disponível comercialmente pode ser usado.

2-2. ETAPA PARA DETERMINAR DISTÚRBIO

[00126] A “etapa para determinar afecção” é uma etapa para determinar (ou avaliar) in vitro seja para constatar o câncer pancreático ou o tumor pancreático benigno com base nas quantidades das proteínas medidas na etapa de análise dos marcadores para detecção do tumor pancreático. As quantidades dos marcadores analisados para detecção de tumor pancreático, por exemplo, as variantes de proteína APOA2 (quantidades da proteína APOA2-ATQ e da proteína APOA2-AT) na amostra de fluido corporal de um sujeito de teste são medidas para detecção de tumor pancreático para determinar se há ou não tumor pancreático ou para avaliar a possibilidade de ter um tumor pancreático. Esta etapa compreende 3 etapas (primeira a terceira etapas). Deste ponto em diante, cada etapa será descrita em detalhes.

[00127] Na primeira etapa, a quantidade de proteína APOA2-ATQ na amostra de fluido corporal de um sujeito de teste é medida com o uso de um anticorpo terminal anti-APOA2-ATQ que se liga especificamente à região C- terminal da proteína APOA2-ATQ que compreende a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, e um anticorpo não terminal anti-APOA2-ATQ que se liga a uma sequência de aminoácidos exceto a região C-terminal.

[00128] Então, na segunda etapa, a quantidade de proteína APOA2-AT é medida com o uso de um anticorpo terminal anti-APOA2-AT que se liga especificamente a uma região C-terminal da proteína APOA2-AT que compreende a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2, e um anticorpo não terminal anti-APOA2-AT que se liga a uma sequência de aminoácidos exceto a região C-terminal. Nesse contexto, desejavelmente, as regiões C-terminais da proteína APOA2-ATQ e da proteína APOA2-AT consistem, cada uma, em uma sequência que compreende 6 ou mais aminoácidos consecutivos, incluindo o C-terminal. As quantidades das variantes de proteína APOA2 podem ser medidas por ELISA, por exemplo, apesar do método de medição de acordo com a presente invenção não seja limitado a esse. O anticorpo não terminal anti-APOA2-ATQ usado juntamente com o anticorpo terminal anti-APOA2-ATQ na primeira etapa pode ser idêntico como um anticorpo não terminal de proteína anti-APOA2 para o anticorpo não terminal anti-APOA2-AT usado juntamente com o anticorpo terminal anti- APOA2-AT na segunda etapa. Em resumo, o anticorpo não terminal anti- APOA2-AT também pode ser usado na primeira etapa, enquanto que o anticorpo não terminal anti-APOA2-ATQ também pode ser usado na segunda etapa.

[00129] Na terceira etapa, o valor da medição da quantidade de proteína APOA2-ATQ obtida na primeira etapa e o valor da medição da quantidade de proteína APOA2-AT obtida na segunda etapa são inseridos para um discriminante pré-definido para determinar um valor descriminante do sujeito de teste. O sujeito de teste é determinado como tendo um tumor pancreático quando este valor discriminante é diferente, estatisticamente significativo, em comparação com o valor discriminante de um sujeito normal. Nesse contexto, o discriminante usado pode ser ajustado por um método mencionado anteriormente.

[00130] Alternativamente, mesmo sem determinar o valor discriminante, o sujeito de teste humano pode ser convenientemente determinado como tendo um tumor pancreático quando a quantidade tanto da proteína APOA2-ATQ como da proteína APOA2-AT na amostra coletada do sujeito de teste humano é significativamente diferente da quantidade dessa em uma amostra coletada de uma pessoa normal, especialmente, significativamente menor que a quantidade.

[00131] O método para detectar um tumor pancreático de acordo com a presente invenção pode ainda compreender uma quarta etapa como em relação ao sujeito de teste determinado como tendo um tumor pancreático na terceira etapa. Na quarta etapa, a quantidade de um marcador conhecido de câncer pancreático em uma amostra de fluido corporal desse sujeito de teste pode ser medida para determinar discriminadamente se o sujeito de teste tem um câncer pancreático ou um tumor pancreático benigno. Nesse método, um marcador conhecido como sendo capaz de detectar câncer pancreático, mas incapaz de detectar um tumor pancreático benigno é usado como o marcador de câncer pancreático conhecido. Especificamente, um antígeno Sialyl-Lewis A “CA19-9” (antígeno carboidrato 19-9) ou uma glicoproteína similar à mucina “DU-PAN-2” (antígeno 2 associado ao câncer pancreático) pode ser usado (DADOS DE LABORATÓRIO: seleção e interpretação de teste 2013-2014, supervisionado por Fumimaro Takaku, Igaku Shoin Ltd., páginas 636-638). O valor de referência para discriminação de câncer pancreático é de 37 (U/mL) para CA19-9 e 150 (U/mL) para DU-PAN-2. As quantidades de CA19-9 ou DU- PAN-2 podem ser medidas por ELISA, por exemplo, apesar do método de medição de acordo com a presente invenção não seja limitado a esse.

[00132] A determinação do câncer pancreático ou tumor pancreático benigno na quarta etapa pode ser especificamente realizada da seguinte forma: primeiro, a quantidade de CA19-9 ou DU-PAN-2 na amostra de fluido corporal do sujeito de teste humano é medida. Em seguida, o sujeito de teste pode ser determinado como tendo um câncer pancreático quando o valor de medição da quantidade de CA19-9 ou DU-PAN-2 exceder o valor de referência correspondente para discriminação de câncer pancreático. Além disso, o sujeito de teste pode ser determinado como tendo tumor pancreático benigno quando o valor de medição for igual ou menor que esse valor de referência. Isso é baseado no fato de que o método da presente invenção para a medição das quantidades das variantes de proteína APOA2 alcança detecção do tumor pancreático benigno que não foi obtida anteriormente.

[00133] O método para detectar um tumor pancreático de acordo com a presente invenção também pode ser usado em combinação com uma variante de proteína adicional de APOA2 como a proteína APOA2-A, ou a quantidade total das proteínas APOA2. Como uma realização, também está incluída no escopo da presente invenção.

[00134] “Sujeito normal” refere-se a um indivíduo que pelo menos não tem tumor pancreático, preferencialmente um indivíduo saudável. O sujeito normal ainda precisa ter as mesmas amostras do organismo que o sujeito de teste. Quando o sujeito de teste para a detecção for, por exemplo, um humano (sujeito de teste humano), o sujeito normal também deve ser um humano (no presente relatório descritivo, citado como uma “pessoa normal” abaixo). As condições físicas do sujeito de teste são preferencialmente as mesmas ou similares àquelas do sujeito de teste. As condições físicas correspondem a, por exemplo, etnia, sexo, idade, altura e peso corporal para humanos.

[00135] As concentrações dos marcadores para detecção de tumor pancreático no fluido corporal do sujeito normal são preferencialmente medidas da mesma maneira que o método para a medição das concentrações dos marcadores para detecção de tumor pancreático no fluido corporal de um sujeito de teste descrito na etapa de análise dos marcadores para detecção de tumor pancreático. As concentrações dos marcadores para detecção de tumor pancreático no fluido corporal do sujeito normal podem ser medidas toda vez que as concentrações dos marcadores para detecção de tumor pancreático no fluido corporal do sujeito de teste forem medidas. Alternativamente, as concentrações dos marcadores para detecção de tumor pancreático medidas antes também podem ser usadas. Especialmente, as concentrações dos marcadores para detecção de tumor pancreático são medidas antes sob diversas condições físicas de sujeitos normais. Os valores são inseridos em um computador e banco de dados. Esta abordagem é conveniente, pois as concentrações dos marcadores para detecção de tumor pancreático de um sujeito normal em condições físicas ótimas para comparação com o sujeito de teste podem ser usadas meramente por inserção das condições físicas do sujeito de teste no computador.

[00136] No presente relatório descritivo, exemplos específicos do termo “estatisticamente significativo”, por exemplo, quando o valor obtido tem um valor crítico pequeno (nível de significância) incluem p < 0,05, p < 0,01 ou p < 0,001. Nesse contexto, o termo “p” ou “valor p” representa a probabilidade de uma hipótese estatística ser verdadeira ao acaso na distribuição hipotética das estatísticas em um teste estatístico. Portanto, quanto menor de “p” ou “valor p” significa que a hipótese está mais próxima da verdade. A frase “diferente estatisticamente significativo” significa que há uma diferença significativa no processamento estatístico de quantidades distintas dos marcadores para detecção de tumor pancreático obtidos do sujeito de teste e do sujeito normal ou valores discriminantes distintos obtidos por inserção das quantidades do discriminante. O sujeito de teste é avaliado como tendo um tumor pancreático quando é diferente estatisticamente significativo em comparação ao sujeito normal. Um método de teste conhecido na técnica capaz de determinar a presença ou ausência de significância pode ser usado apropriadamente como método de teste para o processamento estatístico sem limitações específicas. Por exemplo, um teste t de Student ou um método de teste de comparação múltipla podem ser usados.

[00137] No presente relatório descritivo, o “discriminante” é um produto final de análise multivariada e é caracterizado por um ou mais conjuntos de valores. O valor do discriminante é eventualmente calculado de acordo com esse discriminante. No presente relatório descritivo, a “análise multivariada” é uma abordagem matemática que é usada para a construção do discriminante pelo uso de valores de medição dos marcadores para detecção de tumor pancreático. No presente relatório descritivo, o “conjunto de valores” refere-se a uma combinação de valores como as características dos marcadores para detecção de tumor pancreático ou uma faixa desses valores. Esse conjunto de valores e as propriedades dos valores no conjunto dependem do tipo de características presentes nos marcadores para detecção de tumor pancreático e da análise multivariada que seja usada para construir o descriminante que define o conjunto de valores.

[00138] No presente relatório descritivo, o “valor descriminante” é um valor que pode ser usado como um índice para produzir a predição de que o sujeito de interesse poderia ter um tumor pancreático. Como um exemplo específico, o sujeito de interesse pode ser previsto como tendo um tumor pancreático pelo valor discriminante. Como outro exemplo, o sujeito de interesse pode ser previsto como não tendo tumor pancreático pelo valor discriminante.

[00139] O discriminante pode ser construído por análise multivariada com o uso de um algoritmo de análise de dados. Exemplos do algoritmo de análise de dados que podem ser usados na construção do discriminante incluem modelos lineares generalizados, incluindo análise de regressão logística, redes neurais, máquinas de vetor de suporte (SVM), análise de discriminante, abordagens não paramétricas, PLS (mínimos quadrados parciais), árvores de decisão, análise do componente principal, modelos aditivos generalizados, lógica difusa, SOM (mapas de auto-organização) e algoritmo genético. Dentre essas, a análise de regressão logística, uma rede neural, SVM ou a análise discriminante podem ser preferencialmente usadas, ainda que o algoritmo de análise de dados de acordo com a presente invenção não está limitado a essas. Os detalhes destes métodos estatísticos são encontrados nas seguintes referências: Ruczinski, I. et al., 2003, Journal of Computational and Graphical Statistics, Vol. 12, páginas 475 a 511; Friedman, J., Journal of the American Statistical Association, 1989, Vol. 84, páginas 165 a 175; Hastie, T. et al., 2001, The Elements of Statistical Learning, Springer Series in Statistics; Breiman, L., 1984, Classification and regression trees, Chapman and Hall: Breiman, L., 2001, Machine Learning, Vol. 45, páginas 5 a 32; Pepe, M., 2003, The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction, Oxford Statistical Science Series; e Duda, R. et al., 2000, Pattern Classification, Wiley Interscience, 2a edição.

[00140] Na presente invenção, a análise com o uso do discriminante é conduzida através das seguintes etapas: primeira, um evento a ser discriminado é definido como uma variável objetiva. A “variável objetiva” é um evento a ser discriminado de acordo com o discriminante. Na presente invenção, a variável objetiva refere-se ao sujeito de teste humano ter ou não um tumor pancreático. No caso onde o evento a ser discriminado, por exemplo, por análise de regressão logística é ou não um sujeito de teste humano com tumor pancreático, a variável objetiva pode ser definida para “1” quando o sujeito de teste humano é um paciente com tumor pancreático e para “0” quando o sujeito de teste humano é uma pessoa normal. Em seguida, as variáveis explicativas para a previsão da variável objetiva são definidas. As “variáveis explicativas” são variáveis usadas para prever a variável objetiva de acordo com o discriminante. No caso de, por exemplo, análise de regressão logística, os valores de medição dos marcadores para detecção de tumor pancreático, por exemplo, a proteína APOA2-ATQ e a proteína APOA2-AT podem ser definidos como as variáveis explicativas. Em seguida, um discriminante que envolve as variáveis explicativas em combinação é construído pelo uso de qualquer um dos algoritmos de análise de dados mencionados acima, e um valor discriminante é calculado. Com base no valor do discriminante obtido, o evento a ser discriminado é previsto. No caso de, por exemplo, análise de regressão logística, o sujeito de teste humano pode ser previsto como sendo um paciente com tumor pancreático (isto é, “1”) ou uma pessoa normal (isto é, 0) a partir do valor discriminante. Finalmente, os resultados da previsão do evento são comparados com o valor da variável objetiva para avaliar o desempenho de discriminação do discriminante. Nesse contexto, o “desempenho de discriminação” refere-se a um índice que indica qual grau de previsão do evento a ser discriminado pode ser preciso. Os desfechos de discriminação (sensibilidade e especificidade) ou os valores AUC dos dados do caso podem ser usados como o desempenho de discriminação. O valor do discriminante obtido a partir do discriminante é preferencialmente usado como uma referência para determinar se é ou não um tumor pancreático ou para avaliar a possibilidade de ter um tumor pancreático.

[00141] No presente relatório descritivo, o “valor AUC (área sob a curva)” significa uma área sob a curva característica de operação do receptor (curva ROC) e serve como um índice para a medição da precisão de uma previsão, método de determinação, detecção ou diagnóstico para a classificação de pacientes em um grupo positivo e um grupo negativo. Nessa curva, um valor (taxa de falso positivo) determinado pela subtração da probabilidade de produzir resultados positivos para pacientes positivos (sensibilidade) e a probabilidade de produzir resultados negativos para pacientes negativos (especificidade) de 1 é plotado como os resultados produzidos pelo método a ser avaliado.

[00142] No presente relatório descritivo, “sensibilidade” significa um valor de (número de positivos verdadeiros) / (número de positivos verdadeiros + número de falsos negativos). A sensibilidade maior permite detecção precoce de câncer pancreático ou detecção de tumor pancreático benigno e leva a uma ressecção completa de uma lesão ou redução na taxa de recorrência.

[00143] No presente relatório descritivo, a “especificidade” significa um valor de (número de negativos verdadeiros) / (número de negativos verdadeiros + número de falsos negativos). A especificidade maior previne testes adicionais inúteis atribuíveis à classificação incorreta de sujeitos normais em pacientes com câncer pancreático inicial ou pacientes com tumor pancreático benigno e leva a um alívio de carga de pacientes ou redução do custo médico.

[00144] Desse ponto em diante, o método para analisar se um sujeito de teste humano tem um tumor pancreático de acordo com o discriminante com base na análise de regressão logística com o uso dos valores de medição das variantes proteicas de APOA2 serão descritos especificamente.

2-2-1. MÉTODO DE DISCRIMINAÇÃO COM O USO DA ANÁLISE DE REGRESSÃO LOGÍSTICA

[00145] Um método para obter um discriminante com o uso da análise de regressão logística pode ser usado como o método de análise para determinar se há ou não tumor pancreático ou avaliar a possibilidade de ter tumor pancreático.

[00146] Inicialmente, todos os sujeitos de teste humanos são divididos de acordo com as informações clínicas em 2 grupos: pacientes com tumor pancreático e pessoas normais. A variável objetiva é definida para “1” para os pacientes com tumor pancreático e para “0” para as pessoas normais. A seguir, o discriminante é estabelecido a partir dos valores de medição das duas variantes proteicas de APOA2 obtidas a partir de amostras biológicas que têm a informação clínica. O discriminante pode ser predefinido como uma expressão de regressão logística que compreende, como uma variável (variável explicativa), o valor de medição da proteína APOA2-ATQ e/ou o valor de medição da proteína APOA2-AT e/ou o produto do valor de medição da proteína APOA2-AT e o valor de medição da proteína APOA2-ATQ. A validade da expressão de regressão logística como o discriminante pode ser avaliada pelo uso de um índice como valores AIC (critério de informações de Akaike) ou os valores BIC de Schwarz pertencentes à categoria de um método de probabilidade máxima.

[00147] Uma expressão que compreende o valor de medição da proteína APOA2-ATQ, o valor de medição da proteína APOA2-AT e o produto do valor da medição da proteína APOA2-AT e o valor de medição da proteína APOA2-ATQ como variáveis explicativas, como na expressão matemática 1, expressão matemática 2 e expressão matemática 3, podem ser usadas como a expressão de regressão logística.

[00148] Expressão matemática 1: a x (APOA2-ATQ) + b x (APOA2-AT) + d.

[00149] Expressão matemática 2: a x (APOA2-ATQ) + b x (APOA2-AT) + c x (APOA2-ATQ) x (APOA2-AT) + d.

[00150] Expressão matemática 3: c x (APOA2-ATQ) x (APOA2- AT) + d.

[00151] (Nas expressões matemáticas 1 a 3, a, b, c e d, cada um representa qualquer número real, exceto zero; (APOA2-ATQ) representa o valor de medição da proteína APOA2-ATQ e (APOA2-AT) representa o valor de medição da proteína APOA2-AT).

[00152] No caso de obter o discriminante sob a forma de uma expressão de regressão logística, os valores de medição da proteína APOA2- ATQ e da proteína APOA2-AT obtidos a partir de um sujeito de teste humano e de uma pessoa normal são inseridos na expressão de regressão logística, e os valores discriminantes resultantes podem ser comparados para determinar se o sujeito de teste humano tem um tumor pancreático. Por exemplo, o sujeito de teste humano pode ser determinado como tendo um tumor pancreático quando o valor discriminante diferente estatisticamente significativo do sujeito de teste humano é 2/3 ou menor, mais preferencialmente 1/2 ou menor, ainda mais preferencialmente 1/4 ou menor do valor discriminante da pessoa normal.

3. KIT PARA DETECÇÃO DE T UMOR PANCREÁTICO

[00153] O terceiro aspecto da presente invenção refere-se a um kit para detecção de um tumor pancreático.

[00154] No presente relatório descritivo, o “kit para a detecção de um tumor pancreático” refere-se a um artigo que é usado diretamente ou indiretamente para avaliar se há ou não um tumor pancreático, a gravidade do tumor pancreático, a presença ou ausência de melhora, ou o grau de melhora ou para a triagem de uma substância candidata útil na prevenção, melhora ou tratamento do tumor pancreático.

[00155] O kit do presente aspecto compreende, como constituintes, substâncias capazes de reconhecer especificamente e se ligar às variantes de proteína APOA2, preferencialmente duas variantes de proteína APOA2 mostradas nas SEQ ID NOs: 1 e 2, cuja expressão varia em uma amostra de fluido corporal, particularmente sangue, soro ou plasma em associação com a ocorrência de um tumor pancreático. Especificamente, o kit compreende, por exemplo, os anticorpos terminais de proteína anti-APOA2, etc., ou fragmentos dessa, ou derivados modificados quimicamente dos anticorpos ou fragmentos. Esses anticorpos podem ser ligados com um carreador de fase sólida conforme descrito acima. Nesse caso, preferencialmente, os anticorpos podem se ligar com tiras para teste conforme descrito acima. O kit pode adicionalmente compreender, por exemplo, um anticorpo secundário marcado, um substrato necessário para a detecção do marcador, um carreador, um tampão de lavagem um diluente da amostra, um substrato de enzima, uma solução de parada de reação, proteínas APOA2 purificadas como padrões e um manual de instruções.

EXEMPLOS

[00156] Desse ponto em diante, a presente invenção será ainda descrita especificamente com referência aos Exemplos abaixo. No entanto, a presente invenção não se destina a ser limitada por esses Exemplos.

EXEMPLO 1 PREPARAÇÃO DE ANTICORPO MONOCLONAL QUE RECONHECE ESPECIFICAMENTE A REGIÃO C-TERMINAL DA PROTEÍNA APOA2-ATQ (ANTICORPO MONOCLONAL TERMINAL ANTI-APOA2-ATQ) (A) PREPARAÇÃO DO ANTICORPO DE PRODUÇÃO CELULAR QUE RECONHECE A REGIÃO C-TERMINAL DA PROTEÍNA APOA2-ATQ

[00157] Um peptídeo que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 29, que é a sequência de uma região C-terminal da proteína APOA2-ATQ é pouco solúvel em água e baixa antigênica. Portanto, a hidrofilicidade foi conferida a esta pela adição de 3 resíduos de arginina à lateral N-terminal, e um resíduo de cisteína foi ainda adicionado à terminação N para sintetizar um peptídeo. Subsequentemente, a proteína OVA foi ligada ao resíduo de cisteína do peptídeo com o uso de Ovalbumina Ativada por Maleimida (fabricada pela Pierce Biotechnology, Inc.). O peptídeo resultante foi administrado por via intraperitoneal como um imunógeno em uma dose 100 μg do imunógeno por camundongo, para camundongos (BALB/c) em intervalos de 2 semanas. Da primeira à quarta dose de imunização, a solução de imunógeno foi ainda misturada com o Sistema Adjuvante Sigma (fabricado pela Sigma-Aldrich Corp.) e administrada. Após a quarta dose, o título do anticorpo no soro de camundongo foi medido por ELISA.

[00158] O imunógeno foi ajustado para 03 μg/mL com solução PBS, então adicionado a 100 μL/poço para Immunoplate Maxisorp (fabricada pela Nalge Nunc International), e imobilizado durante a noite. No dia seguinte, a solução foi descartada e uma solução tampão de bloqueio A (BSA 0,5%, Tween 20 0,05% e PBS) foi adicionada a esta a 400 iiL/poço. A placa foi deixada descansando à temperatura ambiente por 1 hora. A solução em cada poço foi descartada. Em seguida, o poço foi lavado pela adição de 400 μL de PBS-T (Tween 20 0,05% e PBS). O soro de camundongo diluído com solução tampão de bloqueio A foi acrescentado a esta a 100 μL/poço e reagiu à temperatura ambiente por 1 hora. A solução em cada poço foi descartada. Em seguida, o poço foi lavado com PBS-T. Em seguida, Imunoglobulinas Anti-Camundongo de Coelho/HRP fabricadas pela Dako, Agilent Company) diluída 500 vezes com solução tampão de bloqueio A foi adicionada a esta 100 μL/poço e reagiu à temperatura ambiente por 1 hora. Após lavagem com PBS-T, uma solução TMB (fabricada pela Pierce Biotechnology, Inc.) foi adicionada a esta a 50 μL/poço para reação enzimática. Em seguida, a reação foi terminada pela adição de solução de ácido sufúrico 0,5 N a 50 iiL/poço. A absorbância foi medida a 450 nm. Como resultado, um aumento suficiente no título do anticorpo foi constatado. Portanto, a solução de imunógeno foi administrada ao camundongo para imunização final. Três dias após a data de imunização final, células produtoras de anticorpos foram obtidas a partir do baço de cada camundongo.

(B) RECUPERAÇÃO DE CÉLULAS PRODUTORAS DE ANTICORPOS A PARTIR DE CAMUNDONGOS E FUSÃO CELULAR

[00159] As células produtoras de anticorpo obtidas de cada camundongo na etapa (a) e células SP2/0 (mieloma de camundongo) foram misturadas a uma razão de 1:10 em um meio RPMI1640 e submetidas à reação de fusão na presença de polietilenoglicol 80%. Subsequentemente, as células de fusão foram cultivadas por aproximadamente 1 semana em um meio HAT para selecionar hibridomas.

(A) SELEÇÃO DE HlBRIDOMA QUE PRODUZ ANTICORPO QUE RECONHECE A REGIÃO C-TERMINAL DA PROTEÍNA APOA2-ATQ

[00160] A seguir, a partir dos hibridomas selecionados em um meio HAT, anticorpos que reconhecem especificamente a região C-terminal da proteína APOA2-ATQ foram selecionados pelo uso, como um índice, da diferença na atividade de ligação contra a proteína APOA2-AT humana-derivada recombinante e a proteína APOA2-ATQ. Como resultado da triagem por ELISA da mesma forma que na etapa (1), dois hibridomas, clone 7F2 e clone 6G2 foram obtidos. Como resultado da análise de sequência dos genes que codificam esses anticorpos monoclonais, as sequências CDR de 7F2 foram mostradas como sendo as sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOs: 4 a 9 e as sequências CDR de 6G2 foram mostradas como sendo as sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOs: 10 a 15.

EXEMPLO 2 DETECÇÃO DA PROTEÍNA APOA2-ATQ POR ELISA COM O USO DE ANTICORPO MONOCLONAL TERMINAL ANTI-APOA2-ATQ

[00161] O anticorpo monoclonal terminal anti-APOA2-ATQ 7F2 ou 6G2 obtido no Exemplo 1 foi usado para detectar a proteína APOA2-ATQ por ELISA. A proteína APOA2-ATQ humana-derivada recombinante, proteína APOA2-AT ou proteína APOA2-A foi ajustada para 1 μg/mL com uma solução PBS, em seguida adicionada a 100 μL/poço na Immunoplate Maxisorp e imobilizada durante a noite. No dia seguinte, a solução foi descartada e uma solução tampão de bloqueio A foi adicionada a esta a 400 μL/poço. A placa foi deixada descansando à temperatura ambiente por 1 hora. A solução em cada poço foi descartada. Em seguida, o poço foi lavado com a adição de 400 μL de PBS-T. O anticorpo 7F2 ou 6G2 diluído a 0,2 μg/mL com um diluente (NP40 1%, tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM e BSA 1%, pH 8,0) foi adicionado a este a 100 μL/poço e reagiu à temperatura ambiente por 2 horas. A solução em cada poço foi descartada. Então após a lavagem com PBS-T, Imunoglobulinas Anti-Camundongo de Coelho Policlonais/HRP diluídas 5000 vezes com um diluente foram adicionadas a este a 100 μL/po^o e reagiu à temperatura ambiente por 1 hora. Após a lavagem com PBS-T, uma solução TMB foi adicionada a esta a 100 μL/poço para reação enzimática. Em seguida, a reação foi terminada pela adição de solução de ácido sulfúrico 0,5 N a 100 μL/poço. A absorbância foi medida a 450 nm.

[00162] Os resultados são mostrados na Figura 1. Ambos os clones 7F2 e 6G2 do anticorpo monoclonal terminal anti-APOA2-ATQ obtidos na presente invenção foram confirmados como reconhecendo especificamente a proteína APOA2-ATQ.

EXEMPLO 3 AVALIAÇÃO DA ESPECIFICIDADE DA LIGAÇÃO DO ANTICORPO MONOCLONAL TERMINAL ANTI-APOA2-ATQ E ANTICORPO POLICLONAL TERMINAL ANTI-APOA2- ATQ CONTRA A PROTEÍNA APOA2-ATQ

[00163] Um total de 3 anticorpos, isto é, o clone 7F2 e o clone 6G2 do anticorpo monoclonal terminal anti-APOA2-ATQ obtidos no Exemplo 1 e um anticorpo policlonal terminal anti-APOA2-ATQ obtido pelo método descrito nos parágrafos “1 a 4. Preparação do anticorpo policlonal anti-APOA2” (os detalhes do método estão descritos em “Experimental Protocol for Anti-Peptide Antibodies”, 2a edição, Gakken Medical Shujunsha Co., Ltd.), foram avaliados quanto a sua especificidade para o antígeno. Nesse experimento, foram usadas as formas marcadas com POD do clone 7F2, do clone 6G2 e do anticorpo policlonal terminal anti-APOA2-ATQ. A marcação dos anticorpos com POD foi realizada com o uso do KIT-SH PEROXIDASE LABELING (fabricado pela Dojindo Laboratories).

[00164] A proteína APOA2-ATQ humana-derivada recombinante ou proteína APOA2-AT foi ajustada para 1 μg/mL com uma solução PBS, em seguida adicionada a 100 μL/poço na Immunoplate Maxisorp e imobilizada durante a noite. Após a lavagem com PBS-T, solução tampão de bloqueio B (leite desnatado 1%, Tween 20 0,05% e PBS) foi adicionada a esta a 400 μL/poço. A placa foi deixada descansando à temperatura ambiente por 1 hora. A solução em cada poço foi descartada. Subsequentemente, a forma marcada com POD do anticorpo 7F2 ou 6G2 ou do anticorpo policlonal terminal anti-APOA2-ATQ diluído a 0,5 μg/mL com um diluente foi adicionada a esta a 100 μL/poço e reagiu à temperatura ambiente por 2 horas. Após mais uma lavagem com PBS-T, uma solução TMB foi adicionada a esta a 100 iiL/poço para revelação da cor. Finalmente, a reação foi terminada pela adição de uma solução de ácido sulfúrico 0,5 N a 100 iiL/poço. A absorbância foi medida a 450 nm.

[00165] A Figura 2(A) mostra os valores de medição de cada anticorpo que reagiu com um poço de proteína não imobilizada (branco), o poço de proteína imobilizada APOA2-AT e o poço de proteína imobilizada APOA2-ATQ. A Figura 2(B) é um gráfico representando um valor obtido como a especificidade da ligação de cada anticorpo terminal anti-APOA2-ATQ multiplicando seu valor de atividade de ligação para a proteína APOA2-ATQ por seu valor de atividade de ligação para a proteína APOA2-AT, em que o valor da atividade do ligante para a proteína APOA2-AT foi calculado subtraindo o valor da medição do anticorpo que reagiu com o poço de proteína imobilizada APOA2-ATQ a partir do branco, e o valor de atividade de ligação para a proteína APOA2-ATQ foi calculado subtraindo o valor de medição do anticorpo que reagiu com o poço de proteína imobilizada APOA2- ATQ a partir do branco. Ambos os anticorpos monoclonais terminais anti-APOA2- ATQ, 7F2 e 6G2 foram confirmados como tendo especificidade de ligação mais forte para a proteína APOA2-ATQ do que o anticorpo policlonal terminal anti-APOA2- ATQ.

EXEMPLO 4 DETECÇÃO DA PROTEÍNA APOA2-AT POR ELISA COM O USO DE ANTICORPO TERMINAL ANTI-APOA2-AT

[00166] A proteína APOA2-AT foi detectada por ELISA com o uso de um anticorpo policlonal terminal anti-APOA2-AT que reconhece especificamente a região C-terminal da proteína APOA2-AT.

(A) PREPARAÇÃO DE ANTICORPO POLICLONAL TERMINAL ANTI-APOA2-AT

[00167] O anticorpo policlonal terminal anti-APOA2-AT foi obtido pelo uso do método descrito nos parágrafos “1 a 4. Preparação de anticorpo policlonal anti-APOA2” (os detalhes do método estão descritos em “Experimental Protocol for Anti-Peptide Antibodies”, 2a Edição, Gakken Medical Shujunsha Co., Ltd.). O imunógeno usado foi preparado por adição de um resíduo de cisteína à terminação N de um peptídeo consistindo na região C-terminal da proteína APOA2-AT mostrada na SEQ ID NO: 28 e ainda ligando uma proteína carreadora KLH a este. Esse imunógeno foi administrado a coelhos em intervalos de 1 semana. Após a quarta dose, o título do anticorpo no soro de coelho foi medido por ELISA da mesma forma que no Exemplo 1. Como resultado, um aumento suficiente no título do anticorpo foi constatado. Portanto o antissoro foi recuperado 1 semana após a data da imunização final.

[00168] Um carreador formil-Celulofina foi ligado ao peptídeo e usado como uma coluna de afinidade para purificar o antissoro. Especificamente, o antissoro após a purificação passou através da coluna de afinidade (carreador formil-Celulofina ligado com uma forma amidada C-terminal do peptídeo), de modo que as imunoglobulinas exibindo atividade de ligação contra uma região exceto a região C-terminal do peptídeo foram removidas por adsorção. Por fim, essa fração não adsorvida foi obtida como o anticorpo policlonal terminal anti-APOA2-AT.

(B) DETECÇÃO DA PROTEINA APOA2-AT COM O USO DE ELISA

[00169] A proteína APOA2-AT humana-derivada recombinante, proteína APOA2-ATQ ou proteína APOA2-A foi ajustada para 1 μg/mL com uma solução PBS, em seguida adicionada a 100 μL/poço na Immunoplate Maxisorp e imobilizada durante a noite. No dia seguinte, a solução foi descartada e uma solução tampão de bloqueio A foi adicionada a esta a 400 μL/poço. A placa foi deixada descansando à temperatura ambiente por 1 hora. A solução em cada poço foi descartada. Em seguida, o poço foi lavado pela adição de 400 μL de PBS-T. O anticorpo policlonal terminal anti-APOA2-AT diluído a 0,2 μg/mL com um diluente foi adicionado a este a 100 μL/poço e reagiu à temperatura ambiente por 2 horas. A solução em cada poço foi descartada. Então, após a lavagem com PBS-T, lgG Anti-Coelho, Fragmento F(ab’)2 de Jumento Ligado a HRP (fabricado pela GE Healthcare Japan Corp.) diluído 1000 vezes com um diluente foi adicionado a esta a 100 μL/poço e reagiu à temperatura ambiente por 1 hora. Após a lavagem com PBS-T, uma solução TMB foi adicionada a esta a 100 μL/poço para reação enzimática. Em seguida, a reação foi terminada pela adição de solução de ácido sulfúrico 0,5 N a 100 μL/poço. A absorbância foi medida a 450 nm.

[00170] Os resultados são mostrados na Figura 3. O anticorpo obtido na presente invenção foi confirmado como reconhecendo especificamente apenas a proteína APOA2-AT entre as variantes proteicas de APOA2.

EXEMPLO 5 DETECÇÃO DA PROTEÍNA APOA2 POR ELISA COM O USO DE ANTICORPO DE NÃO- TERMINAÇÃO DA PROTEÍNA ANTI-APOA2

[00171] Anticorpos que reconhecem uma sequência de aminoácidos exceto a região C-terminal da proteína APOA2 foram preparados com o uso do método descrito no Exemplo 1.

[00172] Os hibridomas foram triados usando, como um índice, atividade de ligação contra a região sem terminação da proteína APOA2 para selecionar anticorpos. Como resultado dessa triagem, hibridomas produzindo dois anticorpos monoclonais sem terminação da proteína anti-APOA2, clone MAB1 e clone MAB2 foram obtidos. Como resultado da análise de sequência dos genes que codificam esses anticorpos monoclonais, as sequências CDR de MAB1 foram mostradas como sendo as sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOs: 16 a 21, e as sequências CDR de MAB2 foram mostradas como sendo as sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOs: 22 a 27.

[00173] O anticorpo monoclonal sem terminação da proteína anti- APOA2, MAB1 ou MAB2, foi usado para detectar as variantes proteicas da APOA2 por ELISA. A proteína APOA2-AT humana-derivada recombinante, proteína APOA2-ATQ ou proteína APOA2-A foi ajustada para 1 μg/mL com uma solução PBS, em seguida adicionada a 100 μL/poço na Immunoplate Maxisorp e imobilizada durante a noite. No dia seguinte, a solução foi descartada e uma solução tampão de bloqueio A foi adicionada a esta a 400 μL/poço. A placa foi deixada descansando à temperatura ambiente por 1 hora. A solução em cada poço foi descartada. Em seguida, o poço foi lavado pela adição de 400 μL de PBS-T. Cada anticorpo diluído em 0,5 μg/mL com um tampão A de bloqueio foi adicionado a este a 100 μL/poço e reagiu à temperatura ambiente por 1 hora. A solução em cada poço foi descartada. Então, após a lavagem com PBS-T, lgG Anti-Coelho, Fragmento F(ab’)2 de Jumento Ligado a HRP (fabricado pela GE Healthcare Japan Corp.) diluído 5000 vezes com um diluente foi adicionado a esta a 100 μL/poço e reagiu à temperatura ambiente por 1 hora. Após a lavagem com PBS-T, uma solução TMB foi adicionada a esta a 100 μL/poço para reação enzimática. Em seguida, a reação foi terminada pela adição de solução de ácido sulfúrico 0,5 N a 100 μL/poço. A absorbância foi medida a 450 nm.

[00174] As Figuras 4(A) e 4(B) mostram os resultados da análise das variantes proteicas da APOA2 por ELISA com o uso dos anticorpos MAB1 e MAB2, respectivamente. Ambos os anticorpos monoclonais MAB1 e MAB2 obtidos na presente invenção apresentaram os mesmos níveis de atividade de ligação contra as variantes da proteína APOA2 e foram, portanto, confirmados como sendo anticorpos sem terminação da proteína anti-APOA2 que reconhecem uma sequência de aminoácidos exceto a região C-terminal.

EXEMPLO COMPARATIVO 1 DETECÇÃO DE DÍMERO DE PROTEÍNA APOA2 (APOA2-ATQ/AT) NO SANGUE COM O USO DE ESPECTROMETRIA DE MASSA

[00175] A força iônica de um pico de peptídeo que tem uma massa de 17252 (m/z) foi medida pelo uso de SELDI-QqTOF-MS (espectrometria de massa por tempo de vôo quadripolar híbrido com desempenho de alta resolução de dessorção/ionização de superfície melhorada a laser), de acordo com uma abordagem similar ao Experimento 1 descrito na patente JP 5200246 a partir de plasma coletado de 40 sujeitos cada um dos pacientes com câncer pancreático e pessoas normais por seu consentimento informado no National Cancer Center Hospital.

[00176] A Figura 5 mostra os resultados de diferenciação dos pacientes com câncer pancreático das pessoas normais. Essa abordagem exibiu valor AUC = 0,894 e foi, dessa forma, confirmada como tendo alta precisão na discriminação do câncer pancreático.

EXEMPLO COMPARATIVO 2 DETECÇÃO DE DÍMERO DA PROTEÍNA APOA2 (APOA2-ATQ/AT) NO SANGUE COM O USO DE ELISA SANDUÍCHE

[00177] O plasma obtido da mesma forma como no Exemplo Comparativo 1 foi usado como uma amostra. A detecção do dímero da proteína APOA2 (APOA2-ATQ/AT) foi tentada por ELISA sanduíche com o uso do anticorpo monoclonal 7F2 terminal anti-APOA2-ATQ que reconhece especificamente a região C-terminal da proteína APOA2-ATQ e a forma marcada por POD do anticorpo policlonal terminal anti-APOA2-AT que reconhece especificamente a região C- terminal da proteína APOA2-AT.

[00178] A marcação com POD do anticorpo monoclonal terminal anti- APOA2-ATQ foi realizada com o uso do KIT-SH PEROXIDASE LAGELING e os detalhes seguiram o protocolo anexo. O anticorpo policlonal terminal anti-APOA2-AT foi ajustado a 5 μg/mL com uma solução PBS, então adicionado a 100 μL/poço na Immunoplate Maxisorp e imobilizado durante a noite. No dia seguinte, a solução foi descartada e o poço foi lavado com a adição de 400 μL de PBS-T. Solução tampão de bloqueio C (BSA 1%, Tween 20 0,05% e PBS) foi adicionada a esta a 400 iiL/poço e a placa foi deixada descansando à temperatura ambiente por 1 hora. A solução foi descartada para preparar uma placa imobilizada com anticorpo. Em seguida, o plasma diluído 16 vezes com um diluente foi adicionado a esta a 100 iiL/poço e reagiu à temperatura ambiente por 1 hora. A solução em cada poço foi descartada. Em seguida, o poço foi lavado com PBS-T. A forma marcada com POD do anticorpo monoclonal terminal anti-APOA2-ATQ diluído a 0,4 μg/mL com um diluente foi adicionado a este a 100 iiL/poço e reagiu à temperatura ambiente por 1 hora. Após a lavagem com PBS-T, uma solução TMB foi adicionada a esta a 100 iiL/poço para reação enzimática. Em seguida, a reação foi terminada pela adição de solução de ácido sulfúrico 0,5 N a 100 iiL/poço. A absorbância foi medida a 450 nm.

[00179] A Figura 6 mostra os resultados de diferenciação dos pacientes com câncer pancreático das pessoas normais. Essa abordagem exibiu valor AUC = 0,529 e, dessa forma, não ofereceu precisão na discriminação de câncer pancreático equivalente à espectrometria de massa do Exemplo Comparativo 1. Os resultados desse experimento indicam a possibilidade de que devido às regiões C-terminais do dímero da proteína APOA2-ATQ/AT estarem posicionadas na proximidade uma da outra, o anticorpo policlonal da terminação anti-APOA2-AT e o anticorpo monoclonal da terminação anti-APOA2-ATQ não podem se ligar a esta ao mesmo tempo devido ao bloqueio estérico.

EXEMPLO COMPARATIVO 3 DETECÇÃO DA PROTEÍNA APOA2-ATQ NO SANGUE COM O USO DE ELISA SANDUÍCHE

[00180] O plasma obtido da mesma forma como no Exemplo Comparativo 1 foi usado como uma amostra. A proteína APOA2-ATQ foi analisada por ELISA sanduíche com o uso de uma forma marcada por POD do anticorpo monoclonal terminal anti-APOA2-ATQ 7F2 e um anticorpo policlonal sem terminação de proteína anti-APOA2 (Fitzgerald Industries International) que reconhece um sítio exceto a região C-terminal da proteína APOA2.

[00181] A marcação por POD do anticorpo 7F2 foi realizada da mesma forma que no Exemplo Comparativo 2. O anticorpo policlonal sem terminação da proteína anti-APOA2 foi ajustado a 2 μg/mL com uma solução PBS, então adicionado a 100 μL/po^o na Immunoplate Maxisorp e imobilizado durante a noite. No dia seguinte, a solução foi descartada e o poço foi lavado com a adição de 400 μL de PBS-T. Solução tampão de bloqueio C foi adicionada a esta a 400 μL/po^o e a placa foi deixada descansando à temperatura ambiente por 1 hora. Em seguida, a solução foi descartada para preparar uma placa imobilizada com anticorpo. Em seguida, o plasma diluído 10000 vezes com um diluente foi adicionado a esta a 100 μL/poço e reagiu à temperatura ambiente por 1 hora. A solução de antígeno em cada poço foi descartada. Em seguida, o poço foi lavado com PBS-T. A forma marcada com POD do anticorpo 7F2 diluído a 0,2 μg/mL com um diluente foi adicionado a este a 100 μL/poço e reagiu à temperatura ambiente por 1 hora. Após a lavagem com PBS-T, uma solução TMB foi adicionada a esta a 100 μL/poço para reação enzimática. Em seguida, a reação foi terminada pela adição de solução de ácido sulfúrico 0,5 N a 100 μL/po^o. A absorbância foi medida a 450 nm.

[00182] A Figura 7 mostra os resultados de diferenciação dos pacientes com câncer pancreático das pessoas normais. Essa abordagem exibiu valor AUC = 0,515 e foi, dessa forma, confirmada como tendo excelente precisão na discriminação do câncer pancreático.

EXEMPLO COMPARATIVO 4 DETECÇÃO DA PROTEÍNA APOA2-AT NO SANGUE COM O USO DE ELISA SANDUÍCHE

[00183] O plasma obtido da mesma forma como no Exemplo Comparativo 1 foi usado como uma amostra. A proteína APOA2-AT foi analisada por ELISA sanduíche com o uso do anticorpo policlonal terminal anti-APOA2-AT e uma forma marcada com POD do anticorpo policlonal sem terminação de proteína anti-APOA2. A marcação por POD do anticorpo policlonal sem terminação de proteína anti-APOA2 e o ELISA sanduíche foram realizados da mesma forma que no Exemplo Comparativo 3. A razão de diluição do plasma foi ajustada para 6000 vezes.

[00184] A Figura 8 mostra os resultados de diferenciação dos pacientes com câncer pancreático das pessoas normais. Essa abordagem exibiu valor de AUC = 0,814 e foi, dessa forma, confirmada como tendo alta precisão na discriminação de câncer pancreático, que foi, entretanto, inferior no desempenho de discriminação para a espectrometria de massa do Exemplo Comparativo 1.

EXEMPLO 6 DISCRIMINAÇÃO DO CÂNCER PANCREÁTICO POR COMBINAÇÃO DOS VALORES DE MEDIÇÃO DE DUAS PROTEÍNAS APOA2 (PROTEÍNA APOA2-ATQ E PROTEÍNA APOA2-AT) NO SANGUE

[00185] A Figura 9 mostra os resultados da discriminação de pacientes com câncer pancreático de pessoas normais pela plotagem do produto dos valores de medição da proteína APOA2-ATQ e da proteína APOA2-AT obtidas no Exemplo Comparativo 3 e no Exemplo Comparativo 4, respectivamente. Essa abordagem exibiu valor de AUC = 0,906 e foi, dessa forma, confirmada como exibindo alta precisão na discriminação de câncer pancreático, que foi superior até mesmo à espectrometria de massa do Exemplo Comparativo 1.

EXEMPLO 7 DISCRIMINAÇÃO DE CÂNCER PANCREÁTICO COM O USO DE ELISA SANDUÍCHE

[00186] O plasma coletado de 244 pacientes com câncer pancreático e 109 pessoas normais através de seu consentimento informado no National Cancer Center Hospital foi usado como uma amostra. Duas variantes de proteína APOA2 (proteína APOA2-ATQ e proteína APOA2-AT) no sangue foram analisadas de acordo com a abordagem do Exemplo 6. As soluções de antígeno das proteínas humanas-derivadas recombinantes, proteína APOA2-ATQ e proteína APOA2-AT, foram usadas como preparações para calcular as concentrações das duas proteínas no plasma.

[00187] A Figura 10 mostra um diagrama de dispersão no qual as duas proteínas no plasma de cada sujeito foram plotadas. Mostrou-se que o uso de duas proteínas é capaz de discriminar os pacientes com câncer pancreático de pessoas normais com alta precisão.

EXEMPLO 8 DISCRIMINAÇÃO DE CÂNCER PANCREÁTICO POR PROCESSAMENTO DO VALOR DE MEDIÇÃO COM ALGORITMO DE ANÁLISE DE DADOS

[00188] Um discriminante que oferece alta precisão na discriminação de câncer pancreático pode ser obtido por processamento de análise estatística dos valores de medição obtidos no Exemplo 7. O processamento estatístico fornecido abaixo foi realizado e comparado com o mesmo método de discriminação de câncer pancreático com o uso de espectrometria de massa como no Exemplo Comparativo 1.

(A) DISCRIMINAÇÃO DE CÂNCER PANCREÁTICO COM O USO DE ANÁLISE DE REGRESSÃO LOGÍSTICA

[00189] A variável objetiva foi definida como “1” para os pacientes com câncer pancreático e como “0” para as pessoas normais. As concentrações das duas variantes da proteína APOA2 (proteína APOA2-ATQ e proteína APOA2-AT) no sangue obtidas em (1) foram usadas como variáveis explicativas na análise de regressão logística para calcular os discriminantes. A Tabela 2 mostra os resultados do cálculo sobre os valores AUC e os resultados de discriminação (sensibilidade e especificidade) dos dados do caso nos discriminantes obtidos. Nessa tabela o bom desempenho de discriminação do câncer pancreático inicial (estágio I) foi obtido no discriminante construído pelo uso do produto de duas concentrações de proteína (proteína APOA2-ATQ e proteína APOA2-AT), como uma variável explicativa, como no Exemplo 6. Os valores de medição da proteína APOA2-ATQ e da proteína APOA2-AT em cada amostra foram inseridos neste discriminante e o valor do discriminante resultante foi usado para discriminar pacientes com câncer pancreático (estágios I e II) das pessoas normais. A curva ROC obtida é mostrada na Figura 11(A). A Figura 11(B) é uma curva ROC obtida a partir da discriminação dos pacientes com câncer pancreático das pessoas normais com o uso da quantidade do dímero da proteína APOA2-ATQ/AT medida por espectrometria de massa. A Tabela 2 mostra os resultados de comparação do desempenho de discriminação para cada estágio de câncer pancreático. Na Tabela 2, o estágio de câncer pancreático segue a classificação de estágios UICC: o estágio I refere-se a IA e IB de acordo com a classificação de estágios UICC e o estágio II refere-se aos IIA e IIB de acordo com a classificação de estágios UICC. Na Tabela 2, “ELISA” representa os resultados de análise obtidos a partir do discriminante pelo uso, como uma variável explicativa, do produto das quantidades das duas proteínas (proteína APOA2-ATQ e proteína APOA2-AT) obtidas por ELISA. “Espectrometria de massa” representa os resultados de análise obtidos com o uso da quantidade do dímero da proteína APOA2 (APOA2-ATQ/AT) obtidos por espectrometria de massa. Essa abordagem foi confirmada como sendo capaz da detecção prematura de câncer pancreático com sensibilidade muito alta se comparada com a espectrometria de massa. TABELA 1 AT e ATQ representam os valores de medição da proteína APOA2-AT e da proteína APOA2-ATQ, respectivamente, no teste ELISA. ATxATQ representa o produto desses valores de medição. TABELA 2

EXEMPLO 9 DISCRIMINAÇÃO DE TUMOR PANCREÁTICO BENIGNO POR PROCESSAMENTO DO VALOR DE MEDIÇÃO COM ALGORITMO DE ANÁLISE DE DADOS

[00190] A APOA2 foi usada na discriminação de vários pacientes com tumor pancreático benigno de pessoas normais e em comparação com CA19-9 para o desempenho de discriminação.

[00191] O mesmo discriminante (o produto das quantidades da proteína APOA2-ATQ e da proteína APOA2-AT) como usado para a discriminação dos pacientes com câncer pancreático das pessoas normais no Exemplo 8 foi usado na discriminação com o uso de APOA2. O desempenho de discriminação obtido com o uso de APOA2 foi calculado da mesma forma que o cálculo dos resultados de discriminação (sensibilidade e especificidade) na Tabela 1.

[00192] A quantidade de CA19-9 nas amostras de fluido corporal dos sujeitos de teste humanos foi medida por um método imunológico. Tipicamente, o valor de referência da discriminação é 37 (U/mL) para a discriminação de pacientes com câncer pancreático das pessoas normais com o uso de CA19-9. Pela discriminação, os sujeitos de teste humanos são determinados como sendo pessoas normais quando a quantidade de CA19-9 é igual ou menor do que o valor de referência, e determinados como sendo pacientes com câncer pancreático quando a quantidade de CA19-9 excede o valor de referência (DADOS DE LABORATÓRIO: seleção e interpretação de 2013 a 2014, supervisionado por Fumimaro Takaku Igaku Shoin Ltd., páginas 636 a 637). Esse Exemplo teve a intenção de testar se pacientes com tumor pancreático benigno podem ser discriminados das pessoas normais com o uso de CA19-9 com base no valor de referência. Para essa finalidade, cada sujeito de teste foi determinado como sendo um paciente com tumor pancreático benigno pela discriminação de quando a quantidade de CA19-9 excedeu o valor de referência.

[00193] A Figura 12(A) mostra uma curva ROC obtida a partir da discriminação dos pacientes com tumor pancreático benigno das pessoas normais com o uso de APOA2. A Figura 12(B) mostra uma curva ROC obtida a partir da discriminação dos pacientes com tumor pancreático benigno das pessoas normais com o uso de CA19-9. A Tabela 3 mostra os resultados de comparação do desempenho da discriminação de cada tumor pancreático benigno. O método de discriminação da presente invenção com o uso de APOA2 foi confirmado como sendo capaz de detectar tumor pancreático benigno com sensibilidade muito alta. Ao contrário, o uso de CA19-9 ofereceu sensibilidade quase igual a zero e, dessa forma, tornou dificultoso detectar o tumor pancreático benigno. TABELA 3

EXEMPLO 10 DISCRIMINAÇÃO DE CÂNCER PANCREÁTICO E TUMOR PANCREÁTICO BENIGNO POR COMBINAÇÃO DE APOA2 E CA19-9

[00194] Câncer pancreático e tumor pancreático benigno foram discriminados pela combinação de APOA2 e CA19-9. Em primeiro, tumor pancreático benigno, câncer pancreático inicial (estágios I e II) e câncer pancreático (todos os estágios) foram detectados pelos métodos descritos nos Exemplos 8 e 9 com o uso de APOA2. O número de pessoas afetadas nas quais qualquer uma das doenças foi detectada foi calculado como o número de APOA2 positivas. Em seguida, pacientes positivos para APOA2 foram submetidos à discriminação com o uso de CA19-9 pelo método descrito no Exemplo 9. O número de pessoas nas quais a quantidade de CA19-9 excedeu o valor de referência foi calculado como o número de CA19-9 positivos. A razão do número de CA19-9 positivos para o número de APOA2 positivos foi ainda calculada. Os resultados são mostrados na Tabela 4.

[00195] Essa abordagem foi confirmada como tendo alta probabilidade de que pacientes APOA2 positivos e pacientes CA19-9 podem ser determinados como tendo câncer pancreático, enquanto que pacientes APOA2 positivos e CA19-9 negativos podem ser determinados como tendo tumor pancreático benigno. Esses resultados demonstraram que, de acordo com o método da presente invenção, os sujeitos de teste podem ser determinados discriminadamente como tendo câncer pancreático ou tumor pancreático benigno pela combinação de APOA2 e CA19-9. TABELA 4 * representa o número de pessoas afetadas CA19-9 positivas contabilizando para pessoas afetadas APOA2 positivas

EXEMPLO 11 DISCRIMINAÇÃO DE CÂNCER PANCREÁTICO E TUMOR PANCREÁTICO BENIGNO POR COMBINAÇÃO DE APOA2 E DU-PAN-2

[00196] Câncer pancreático e tumor pancreático benigno foram discriminados pela combinação de APOA2 e DU-PAN-2. A discriminação foi realizada da mesma forma que no método descrito no Exemplo 10, exceto que DU-PAN-2 foi usado ao invés de CA19-9. A quantidade de DU-PAN-2 nas amostras de fluido corporal dos sujeitos de teste foi medida por um método imunológico. Tipicamente, o valor de referência da discriminação é 150 (U/mL) para a discriminação de pacientes com câncer pancreático das pessoas normais com o uso de DU-PAN-2. Pela discriminação, os sujeitos de teste são determinados como sendo pessoas normais quando a quantidade de DU-PAN-2 é igual ou menor do que o valor de referência, e determinados como sendo pacientes com câncer pancreático quando a quantidade de DU-PAN-2 excede o valor de referência (DADOS DE LABORATÓRIO: seleção e interpretação de 2013 a 2014, supervisionado por Fumimaro Takaku Igaku Shoin Ltd., páginas 637 a 638). Nesse Exemplo, a discriminação foi realizada com o uso desse valor de referência de DU-PAN-2. Os resultados são mostrados na Tabela 5. TABELA 5 * representa o número de pessoas afetadas DU-PAN-2 positivas contabilizando para pessoas afetadas APOA2 positivas

[00197] Essa abordagem foi confirmada como tendo alta probabilidade de que pacientes APOA2 positivos e pacientes DU-PAN-2 podem ser determinados como tendo câncer pancreático, enquanto que pacientes APOA2 positivos e DU-PAN-2 negativos podem ser determinados como tendo tumor pancreático benigno. Esses resultados demonstraram que, de acordo com o método da presente invenção, os sujeitos de teste podem ser determinados discriminadamente como tendo câncer pancreático ou tumor pancreático benigno pela combinação de APOA2 e DU-PAN-2.

[00198] Os resultados dos Exemplos 7 a 11 descritos acima demonstraram que o método da presente invenção é útil na detecção altamente sensível do câncer pancreático, incluindo câncer pancreático inicial (estágios I e II) ou tumor pancreático benigno, que foi anteriormente considerado como dificultosa, por análise com o uso de um discriminante baseado nos valores de medição das variantes de APOA2. Esses resultados também demonstraram que o método da presente invenção é útil na obtenção de discriminação de alta precisão entre pacientes com câncer pancreático e tumor pancreático benigno, que foi anteriormente considerada inatingível, analisando os resultados da detecção em combinação com o marcador de câncer pancreático (CA19-9 ou DU-PAN-2).

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

[00199] De acordo com a presente invenção, um tumor pancreático pode ser detectado com máximo resultado por um método simples e não invasivo. Como resultado, é realizada a detecção prematura do tumor pancreático.

[00200] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente citadas no presente pedido são incorporadas ao presente pedido como referência em sua totalidade.

Claims

1. MÉTODO PARA DETECTAR CÂNCER PANCREÁTICO ou tumor pancreático benigno, caracterizado por ser por medição in vitro das quantidades de variantes de proteína APOA2 em uma amostra de fluido corporal de um sujeito de teste, o método de detecção compreendendo: (A) uma primeira etapa de medição da quantidade de proteína APOA2-ATQ na amostra usando um anticorpo terminal anti-APOA2-ATQ que compreende as CDRs 1, 2 e 3 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6, respectivamente, e as CDRs 1, 2 e 3 da cadeia leve de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9, respectivamente; ou que compreende as CDRs 1, 2 e 3 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12, respectivamente, e as CDRs 1, 2 e 3 da cadeia leve de SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 15, respectivamente; que se liga especificamente a uma região C-terminal da proteína APOA2-ATQ que compreende a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, e um anticorpo não terminal anti-APOA2-ATQ que se liga à sequência de aminoácidos diferente da região C-terminal; (B) uma segunda etapa de medição da quantidade de proteína APOA2-AT na amostra usando um anticorpo terminal anti-APOA2-AT que se liga especificamente a uma região C-terminal da proteína APOA2-AT que compreende a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2, e um anticorpo não terminal anti-APOA2-AT que se liga à sequência de aminoácidos diferente da região C-terminal; e (C) uma terceira etapa de inserção, para um discriminante pré- definido, do valor de medição da quantidade de proteína APOA2-ATQ obtido na primeira etapa e do valor de medição da quantidade de proteína APOA2-ATQ obtido na segunda etapa, e determinação do sujeito de teste como tendo câncer pancreático ou tumor pancreático benigno quando o valor discriminante resultante do sujeito de teste é significativamente diferente estatisticamente em comparação com o valor discriminante de um sujeito normal; em que a proteína APOA2-ATQ é a proteína APOA2 inteira e a proteína APOA2-AT é a proteína APOA2 desprovida de resíduo de glutamina C- terminal.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelas regiões C-terminais da proteína APOA2-ATQ e da proteína APOA2-AT consistirem, cada uma, em uma sequência que compreende 6 ou mais aminoácidos consecutivos, incluindo o C-terminal.

3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo discriminante ser qualquer um selecionado a partir do grupo que consiste em uma expressão de regressão logística, uma expressão preparada por análise com uma máquina de vetor de suporte, uma expressão preparada pela análise de uma rede neural e uma expressão preparada por análise discriminante.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pela expressão de regressão logística compreender, como uma variável, o valor de medição da proteína APOA2-ATQ, o valor de medição da proteína APOA2- AT e/ou o produto do valor de medição da proteína APOA2-ATQ e o valor de medição da proteína APOA2-AT.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo valor discriminante do sujeito de teste obtido a partir da expressão de regressão logística ser 2/3 ou menor que o valor discriminante de um sujeito normal.

6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por ainda compreender uma quarta etapa de medição in vitro da quantidade de um marcador de câncer pancreático CA19-9 ou DU- PAN-2 em uma amostra de fluido corporal do sujeito de teste determinado como tendo um tumor pancreático ou tumor pancreático benigno na terceira etapa, e determinação do sujeito de teste como tendo um câncer pancreático quando o valor de medição exceder um valor de referência predeterminado, e determinação do sujeito de teste como tendo tumor pancreático benigno quando o valor de medição for igual ou menor que o valor de referência.

7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pela amostra de fluido corporal ser sangue, plasma ou soro.

8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo câncer pancreático ser câncer pancreático inicial.