CN111863129A

CN111863129A - 一种脑脊液中突变的检测方法及检测装置

Info

Publication number: CN111863129A
Application number: CN202010645624.4A
Authority: CN
Inventors: 陈丽昆; 邵阳; 王富锋; 洪晓愉
Original assignee: Nanjing Shihe Gene Biotechnology Co Ltd; Sun Yat Sen University Cancer Center
Current assignee: Nanjing Shihe Gene Biotechnology Co Ltd; Sun Yat Sen University Cancer Center
Priority date: 2020-07-07
Filing date: 2020-07-07
Publication date: 2020-10-30

Abstract

本发明开发了一种针对初治的肺癌脑转移患者脑脊液样本中能否检出肿瘤特有突变的预测模型，属于生物医学技术领域。通过输入患者颅内病灶相关信息：病灶的最大直径（Tsize）和颅内所有病灶中与脑室的最短距离（LVDmin），即可预测脑脊液中能否检出突变。在临床上可以准确提示患者腰穿的必要性以及送检的必要性，从而提高患者获益。

Description

一种脑脊液中突变的检测方法及检测装置

技术领域

本发明涉及一种预测肺癌初治患者脑脊液突变检出与否的模型设计和检测装置、可以准确预测送检患者的临床获益，属于医学分子生物学技术领域。

背景技术

肺癌是全世界最常见的癌症之一，肺癌患者脑转移通常预后不良。10％的肺癌初治患者及20-40％的经治患者在疾病进展过程中可能发生脑转移。明确脑部病灶的分子特征可以为后续治疗提供有益的信息，由于肿瘤异质性颅内外病灶可能差异较大。脑转移患者的治疗极具挑战。

随着检测技术的发展，NGS的应用愈发广泛，组织样本是比较理想的检测类型。但是，对于大多数患者而言，脑部病灶的组织样本并不可取。液态活检技术的出现，外周血ctDNA可以用作肿瘤组织的替代物，但血脑屏障可阻止ctDNA从脑肿瘤中释放出来。因此，外周血ctDNA仅反映了颅外病灶的分子特征。近年来，脑脊液(CSF)ctDNA已成为评估脑转移分子特征比较理想的媒介。多项研究表明，CSF ctDNA较外周ctDNA相比更准确地代表了脑肿瘤的基因组突变。但由于脑脊液量较少，这导致CSF ctDNA分析的高度不确定性。此外通过腰椎穿刺收集脑脊液是一种微创手术，在手术过程中和手术后可能出现神经损伤，感染，疼痛等风险。因此，如何避免不必要的腰椎穿刺及提高CSF ctDNA阳性检出率是临床的迫切需求。

发明内容

本发明提出了一种用于改善常规的脑脊液样本检出率偏低问题的方法。本方法通过结合颅内病灶影像学特征以及临床信息，建立模型并开发Nomogram图以预测脑转移肺癌患者CSF ctDNA阳性的可能性，从而最大程度地提高临床获益，减少不必要的腰椎穿刺等医疗费用。

本发明的第一个方面，提供了：

一种脑脊液中突变的检测方法，所述的检测方法是非治疗与诊断目的，包括以下步骤：

第1步，从患者样本的颅内MRI图像中获得病灶的最大直径以及颅内所有病灶中与脑室的最短距离；

第2步，获得患者脑脊液样本的基因突变信息；

第3步，以病灶的最大直径以及颅内所有病灶中与脑室的最短距离为自变量，以是否发生了基因突变作为因变量，构建出概率模型；

第4步，获得待测患者的病灶的最大直径以及颅内所有病灶中与脑室的最短距离，通过第3步中得到的模型判定脑脊液样本是否发生了基因突变的概率。

在一个实施方式中，所述的基因突变信息包括点突变、插入缺失突变以及融合突变。

在一个实施方式中，所述的概率模型是通过Nomogram图获得。

在一个实施方式中，第3步中，概率模型中是以Logit P＝a*Tsize-b*LVDmin为模型方程；其中，a和b为参数，Tsize是指病灶的最大直径，LVDmin指颅内所有病灶中与脑室的最短距离。

在一个实施方式中，a为0.1，b为0.16。

本发明的第二个方面，提供了：

一种脑脊液中突变的检测装置，包括：

图像识别模块，用于从患者样本的颅内MRI图像中获得病灶的最大直径以及颅内所有病灶中与脑室的最短距离；

测序模块，用于区域患者脑脊液样本的基因突变信息；

概率计算模块，用于以病灶的最大直径以及颅内所有病灶中与脑室的最短距离为自变量，以是否发生了基因突变作为因变量，构建出概率模型；

判定模块，用于获得待测患者的病灶的最大直径以及颅内所有病灶中与脑室的最短距离，通过第3步中得到的模型判定脑脊液样本是否发生了基因突变的概率。

本发明的第三个方面，提供了：

一种计算机可读取介质，其记载有可以运行脑脊液中突变的检测步骤的程序。

本发明的第四个方面，提供了：

图像识别装置用于制造脑脊液样本突变检测设备中的应用。

在一个实施方式中，所述的图像识别装置可以是医用阅片器。

有益效果

1本专利开发了一个预测临床脑脊液ctDNA检出与否的模型。模型的输入端为：病灶的最大直径Tsize(单位：mm)和颅内所有病灶中与脑室的最短距离(LVDmin)，输出结果为：患者脑脊液ctDNA检出概率。

2通过本专利发明的模型可以准确预测肺癌脑转移患者送检脑脊液样本检出肿瘤特有突变的概率：对于检出概率比较高的患者而言，可以通过送检脑脊液样本获取其变异信息用于指导后续治疗；对于检出概率比较低的患者而言，可以减少送检，降低其检测成本，减少其治疗等待时间.

3本模型预测脑脊液检出的敏感性和特异性分别达到：90％和74％。

附图说明

图1是本发明的流程图；

图2是本发明最终模型示意图；

图3是穷举法建立不同模型的AIC、BIC指数对比图；

图4是模型预测性能示意图；

图5是模型预测AUC分析；

图6是模型对送检患者脑脊液CSF突变结果的提升示意图；

具体实施方式

一、患者入组及临床信息收集：

本发明共纳入了66例经过MRI影像学检查确认的肺癌脑实质转移的初治患者，同步收集患者基线脑脊液样本和临床信息，临床信息分为两个部分：

1基础临床信息，包括：患者年龄，性别，吸烟状况，病理分型，中枢神经系统症状等；

2颅内病灶特征信息，通过颅内增加MRI确定颅内病灶的表型特征，包括颅内病灶的总数Tnum(单位：个)，病灶的最大直径Tsize(单位：mm)，颅内病灶距脑室的距离LVD(单位：mm)，距离的具体测量方式如下：

对于病灶与脑室的距离是根据病灶位置选择相应距离最近的脑室，病灶距离脑室的最短距离是依次在冠状位，矢状位和水平位测量病灶距离脑室的距离，选择其中最短距离。分为两种：颅内最大病灶与脑室的最短距离(LLVD)：最大病灶在以上三个层面上的最短距离；颅内所有病灶中与脑室的最短距离(LVDmin)：先选择距离脑室最近的病灶，然后选这个病灶在三个层面的最短距离。

二、NGS检测CSF肿瘤特有突变结果获取：

对66例脑脊液基线样本通过Qiagen循环核酸试剂盒进行cfDNA提取，通过现有的方法进行文库构建；进一步通过425个肿瘤相关基因的检测panel进行文库构建，上机测序，通过生物信息学分析获取样本最终的突变信息。

另外，由于在本领域中，通过生物信息学的方法判定是否产生了基因突变，只是一种获得人体样本中间状态的参数，突变的存在并非是代表存在有疾病的产生，判定是否发生了突变有时也是只考察样本组织中是否发生了相关的变化，这与疾病的治疗与诊断无关。因此，本发明的方法也是适用于非治疗与诊断目的。

本发明中所使用的检测Panel参阅CN109880910A专利，其可以用于检测425个基因。

所涉及到的基因如下：

CSF ctDNA阳性和阴性的判断方法：样本中检出任何的点突变，插入缺失突变，融合突变定义为ctDNA阳性，否则定义为ctDNA阴性。拷贝数变异不纳入突变考虑。

本发明中，所述的突变的定义如下：

“点突变”是指单个碱基置换引起的突变，导致编码氨基酸发生变化；

“插入缺失突变”是指一个或多个碱基插入或缺失导致编码氨基酸的增加或减少，这些类型的突变可能是“蛋白编码框内的”，导致蛋白质中氨基酸的加入或减少；或可导致“移码”，通常导致蛋白质的过早截短；

“融合突变”是指两个或多个基因的编码区首尾相连.置于同一套调控序列(包括启动子、增强子、核糖体结合序列、终止子等)控制之下，构成的嵌合基因。

三、单因素分析初步筛选影响CSF ctDNA检出的变量：

将患者的基础临床信息和颅内病灶的特征信息作为自变量，将脑脊液CSF ctDNA检出与否作为因变量，通过单因素逻辑回归分析(Logistic regression)对进行变量筛选；患者总数为66，具体公式为：Logit p～factor，p value<0.2的因素纳入下一步流程。

初步分析结果显示为：病灶的最大直径Tsize，颅内最大病灶与脑室的最短距离(LLVD)和颅内所有病灶中与脑室的最短距离(LVDmin)3个因素纳入后续模型建立。

四、穷举法建立模型：

利用穷举法进行模型建立，利用Tsize，LLVD和LVDmin三个变量列出所有可能的模型组合，同时有以上变量信息的患者数为55，通过AIC和BIC指数进行模型评估选择最佳模型(AIC和BIC值越小说明模型的拟合度越高)。对于同时含有两个及两个以上参数的模型，是采用了线性模型的方式进行拟合，模型中的自变量为各个参数或者参数的组合，因变量是对数发生比率，例如，根据模型拟合度和简约程度初步模型：Logit P＝a×Tsize+b×LVDmin，其中a和b分别为拟合过程中的系数。

最佳的五个模型：

不同的模型条件下，AIC和BIC指数如图3所示。从图中可以看出，采用Tsize+LVDmin作为联合模型时，其具有最低的AIC和BIC指数，并且优于三参数的Tsize+LLVD+LVDmin。

五、通过交叉验证确定模型的性能：

分别通过两种方法确定模型的性能，均比较理想。

方法(1)采用7:3交叉验证，即通过随机抽样将样本分为2份，每次选择70％样本作为训练集，另外30％作为验证集。根据训练集模型计算验证集的准确性等信息；重复随机抽样100次。

如图4所示，结果显示：Logit P＝Tsize+LVDmin模型区域下面积(AUC)：0.78(0.69-0.86)；准确性(Accuracy)：75％(69％-84％)；敏感性(Sensitivity)：82％(70％-80％)；特异性(Specificity)：67％(57％-81％)

方法(2)留一法交叉验证，即每次只留取一个样本用作训练集，剩余的样本用作训练集，生成模型参数，根据训练集模型确定验证集模型的准确性。

结果显示：准确性(Accuracy)：78％；敏感性(Sensitivity)：81％；特异性(Specificity)：74％。

六、基于所有样本确定模型参数和生成Nomogram。

根据前期分析和交叉验证的结果确定的模型纳入变量Tsize和LVDmin，计算最终的模型为：Logit P＝0.1Tsize-0.16LVDmin，并生成最终的Nomogram图形用于判断患者送检的脑脊液突变检出概率(图2)。通过模型分析CSF ctDNA检出概率＞50％的患者可以尝试送检。同时也对最终的模型进行AUC分析，结果如下：敏感性和特异性分别达到91％和74％，如图5所示。

七、模型产生的实际效果

如图6所示，基于最新的模型进行人群筛选后，对于送检患者脑脊特的突变检出率从最初的58％提升至82％。并且避免了40％的患者盲目送检。

Claims

1.一种脑脊液中突变的检测方法，其特征在于，所述的检测方法是非治疗与诊断目的，包括以下步骤：

第2步，获得患者脑脊液样本的基因突变信息；

2.根据权利要求1所述的脑脊液中突变的检测方法，其特征在于，在一个实施方式中，所述的基因突变信息包括点突变、插入缺失突变以及融合突变。

3.根据权利要求1所述的脑脊液中突变的检测方法，其特征在于，在一个实施方式中，所述的概率模型是通过Nomogram图获得。

4.根据权利要求1所述的脑脊液中突变的检测方法，其特征在于，在一个实施方式中，第3步中，概率模型中是以Logit P= a*Tsize-b*LVDmin为模型方程；其中，a和b为参数，Tsize是指病灶的最大直径，LVDmin指颅内所有病灶中与脑室的最短距离。

5.根据权利要求1所述的脑脊液中突变的检测方法，其特征在于，在一个实施方式中，a为0.1，b为0.16。

6.一种脑脊液中突变的检测装置，其特征在于，包括：

测序模块，用于区域患者脑脊液样本的基因突变信息；

7.一种计算机可读取介质，其记载有可以运行脑脊液中突变的检测步骤的程序。

8.图像识别装置用于制造脑脊液样本突变检测设备中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的图像识别装置可以是医用阅片器。