CN113881769B - 脑脊液cfDNA在用于乳腺癌转移诊疗中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及脑脊液cfDNA在用于乳腺癌转移诊疗中的用途，属于医学分子生物学技术领域。辅助乳腺癌脑转移患者诊疗的新媒介是指脑脊液cfDNA。本发明具有以下优势：本发明可以增加一种辅助乳腺癌脑转移患者诊断的新媒介，以补充影像学和脑脊液细胞学诊断乳腺癌脑转移敏感性的不足之处；此外，利用该媒介的cfDNA经高通量测序后，能够有效检出乳腺癌脑转移患者携带的靶向用药基因状态，从而更能有效提示患者靶向用药的选择，为患者带来更多靶向用药机会。

Description

脑脊液cfDNA在用于乳腺癌转移诊疗中的用途
技术领域
本发明涉及基因检测领域，具体而言，本发明涉及脑脊液cfDNA作为辅助乳腺癌脑转移患者诊疗的一种新媒介。该媒介可以辅助乳腺癌脑转移患者诊断，同时根据检测结果提示预后以及为临床治疗方案的设计提供指导及理论基础。
背景技术
根据世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)发布的全球最新癌症数据显示，2020年，预测全球新增癌症人数共计1,929万人。其中，乳腺癌新增人数达226万，约占新发癌症病例的11.7％。乳腺癌首次超过肺癌，成为全球第一大癌症。此外，乳腺癌在导致女性死亡的恶性中排名第二位，其中90％是死于转移瘤，经常发生转移的部位是肺、骨、肝脏和中枢神经系统，其中中枢神经系统转移的发生率大约为15％，尤其在HER2阳性及三阴性乳腺癌中，中枢神经系统转移的比例明显增高，约为30％-50％。此外，另一些数据显示约16％-30％乳腺癌病人在尸检时发现脑转移。乳腺癌患者出现脑转移后远期生存和预后不佳。究其原因，诊断和监测手段的单一性严重制约了乳腺癌脑转移患者的生存期和预后的提升。寻找具有高度敏感性和特异性的生物标志物，协助乳腺癌脑转移的诊断和治疗方案的制定，成为临床重点关注和急需解决的难题。
肿瘤细胞通过坏死、凋亡、分泌向体液中释放的游离DNA即为循环肿瘤DNA(Circulation tumor DNA，ctDNA)。ctDNA保留了肿瘤特异性基因特征和表观遗传学特征，如癌基因和抑癌基因的点突变、拷贝数变异、DNA甲基化和染色体重排，这一特点促使ctDNA成为潜在的生物标记物。ctDNA作为液体活检的一种方法，因其操作简单、侵害性小、易于监测的优势得到了广发研究。它可以在疾病不同时期发挥作用、协助筛查和早期诊断、术后检测残留病灶及预测复发、晚期患者指导靶向药物、动态监测治疗反应、判断预后，从而实现个体化治疗。
发明内容
本发明发现脑脊液cfDNA可作为一种辅助乳腺癌脑转移患者诊疗的新媒介，利用该媒介可以补充影像学诊断乳腺癌脑转移患者敏感性不足的问题。此外利用该媒介的cfDNA经高通量测序后，能够有效检出乳腺癌脑转移患者携带的突变，并且发现此媒介中靶向药物基因的变异率高于血浆样本cfDNA，从而更能有效提示患者靶向用药的选择，为患者带来更多靶向用药机会。
检测脑脊液cfDNA中基因变异的试剂在用于制备乳腺癌脑转移诊断试剂中的用途。
所述的基因变异是指突变或者拷贝数变异。
所述的突变是单核苷酸变异、插入缺失突变或者剪接突变。
检测脑脊液cfDNA中靶向基因突变的试剂在用于制备靶向药物敏感性预测试剂中的用途。
所述的靶向基因选自ERBB2、BRCA2或者PIK3CA。
一种乳腺癌脑转移诊断装置，包括：
提取模块，用于对脑脊液cfDNA进行提取；
文库制备模块，用于将提取模块中得到的cfDNA制备出高通量测序文库；
测序模块，用于对高通量测序文库进行测序，获得cfDNA中的基因变异信息；
判定模块，用于根据基因变异信息进行判定，若存在变异，则判定样本存在乳腺癌脑转移。
一种靶向药物敏感性预测装置，包括：
提取模块，用于对脑脊液cfDNA进行提取；
文库制备模块，用于将提取模块中得到的cfDNA制备出高通量测序文库；
测序模块，用于对高通量测序文库进行测序，获得cfDNA中的基因变异信息；
判定模块，用于根据基因变异信息进行判定，若存在靶向药物敏感基因的变异，则判定样本为靶向药物敏感患者。
一种计算机可读取介质，记载有可以运行以下步骤的计算机程序：
获取提取得到的脑脊液cfDNA制备的测序文库的下机数据；
将下机数据对比至参考基因组，获得脑脊液cfDNA的基因突变信息；
当存在有基因突变时，则判定该样本存在乳腺癌脑转移。
一种计算机可读取介质，记载有可以运行以下步骤的计算机程序：
获取提取得到的脑脊液cfDNA制备的测序文库的下机数据；
将下机数据对比至参考基因组，获得脑脊液cfDNA的基因突变信息；
当存在有靶向基因的变异时，则判定该样本为靶向药物敏感患者。
有益效果
基于液体活检的众多优势，也为攻克辅助乳腺癌脑转移患者诊疗这一难题提供了解决方案，大脑特有的体液“脑脊液(cerebral spinal fluid，CSF)”为一种独特的液体活检手段，即检测脑脊液ctDNA。
本次发明能够对临床表现有脑转移倾向，但影像学和细胞学尚无证据证明已发生脑转移患者，根据脑脊液cfDNA检测结果进行辅助诊断；此外，对于乳腺癌脑转移患者进行组织活检因其侵袭性从很根本上受到限制，明确肿瘤分子特征和靶向药物基因变异状态也因此受到限制，而脑脊液cfDNA检测结果可提供靶向药物治疗的机会。
附图说明
图1 5例同时有原发灶组织、血浆和脑脊液样本患者中三种样本类型平均突变丰度
图2 5例同时有原发灶组织、血浆和脑脊液样本患者中三种样本类型高频驱动基因和靶向用药基因图谱
图3 5例同时有原发灶组织、血浆和脑脊液样本患者中脑脊液、血浆分别与组织一致性对比分析结果
图4 10例脑脊液样本和10例血浆样本中基因突变类型对比分析结果
图5 10例脑脊液样本和10例血浆样本中靶向用药基因图谱
具体实施方式
本发明是基于世和基因生物技术股份有限公司内部数据库中10例通过影像学结果确诊为乳腺癌脑转移患者和5例未发生脑转移的乳腺癌患者，从这些患者的原发灶组织、血浆和脑脊液样本中提取肿瘤细胞中的遗传物质，通过NGS技术，获得患者不同样本基因突变结果。以影像学作为诊断金标准，对比脑脊液cfDNA检出基因变异状态，提供脑脊液cfDNA作为辅助诊断媒介的依据；此外，以原发灶组织为标准，对比脑脊液和血浆中高频驱动基因和靶向用药基因变异状态，提供脑脊液cfDNA作为辅助靶向治疗媒介的依据。
名词和术语
本发明中所述的“突变”包含以下三种情况：
单核苷酸变异(SNV)：单个碱基置换引起，导致编码氨基酸发生变化
插入缺失突变(Indel)：多个碱基插入或缺失导致编码氨基酸的增加或减少，这些类型的突变可能是“蛋白编码框内的”，导致蛋白质中氨基酸的加入或减少；或导致“移码”，通常导致蛋白质的过早截短。
剪接突变(Splicing mutation)：由于剪接的供体、受体部位或其旁保守序列的突变，改变RNA前体的剪接方式，使得产生的成熟RNA中含有内含子或缺失外显子序列的一类突变，这些类型的突变可能导致蛋白质功能的改变。
本发明中所述的“拷贝数变异”的定义为：
拷贝数变异(CNV)：染色体局部区域发生扩增或缺失，导致编码蛋白过表达或表达减少，缺失如ERBB2基因扩增。
本发明中所述的“脑脊液cfDNA检出”的定义为：脑脊液cfDNA中至少存在1种基因的突变或拷贝数变异。
从10例研究对象的组织样本、血浆样本和脑脊液样本中提取DNA或ctDNA，使用由425个基因构成的靶向测序Panel建立了富集文库，对DNA或ctDNA进行NGS测序，并对NGS检测产生的数据进行基因突变分析，得到每例样本的肿瘤特有变异和突变丰度。
本发明中所使用的检测Panel参阅CN109880910A专利，其可以用于检测425个基因。
所涉及到的基因如下：
对于以上Panel中的基因，可以通过现有技术中的已知试剂盒产品进行检测，例如南京世和基因生物技术股份有限公司生产的检测试剂盒世和基因世和一号等。
脑脊液cfDNA检出敏感性和特异性如下：
本发明的15例患者样本来源于世和基因生物技术股份有限公司数据库，其中10例患者经影像学结果确诊为乳腺癌脑转移患者，5例乳腺癌患者未发生脑转移。脑脊液cfDNA中至少存在1种基因的突变或拷贝数变异定义为脑脊液cfDNA检出。10例脑转移患者的脑脊液cfDNA均检出，脑脊液cfDNA辅助乳腺癌脑转移患者诊断的敏感性为100％。5例未发生脑转移患者的脑脊液cfDNA均未检出，脑脊液cfDNA辅助乳腺癌脑转移患者诊断的特异性为100％，如下表所示。
脑脊液、血浆与组织检测结果一致性如下：
本发明的10例确诊为乳腺癌脑转移患者中有5例患者同时有原发灶组织样本、血浆样本和脑脊液样本；此5例患者3种样本平均突变丰度无统计学差异(P＞0.05)，如图1所示。脑脊液cfDNA与组织样本的高频驱动基因和靶向药物基因检出一致性达到91.3％(21/23)，而血浆cfDNA与组织样本的一致性仅为56.52％(13/23)，如图2所示。此外，脑脊液cfDNA检出突变基因与组织检出突变基因一致性显著高于血浆cfDNA检出突变基因与组织检出突变基因一致性(P＝0.03)，如图3所示。结果表明，相比血浆样本，脑脊液cfDNA与组织样本的一致性更高，能充分展示肿瘤发生发展的驱动基因和靶向用药基因。
脑脊液cfDNA检测靶向药物靶点，辅助靶向药物选择如下：
与血浆样本相比，脑脊液cfDNA中检测到的基因拷贝数变异显著多于血浆样本(P＜0.0001)，如图4所示。此外，脑脊液cfDNA样本中检测到更多的用药靶点基因变异，如ERBB2拷贝数扩增和突变、BRCA2基因突变和PIK3CA基因突变，如图5所示；靶点基因对应的靶向药物如下表所示。结果表明，相比血浆样本，脑脊液cfDNA的检测到可以为患者带来更多靶向药物治疗机会。
脑脊液cfDNA在乳腺癌脑转移患者中检出的敏感性达到100％，特异性达到100％。脑脊液cfDNA相比血浆样本检出更多靶向药物靶点基因，如ERBB2、BRCA2和PIK3CA，为患者带来更多靶向药物选择的机会。

Claims (1)

1.检测脑脊液cfDNA中基因变异的试剂在用于制备乳腺癌脑转移患者的脑脊液cfDNA与组织样本的驱动基因突变和靶向药物基因变异检出一致性诊断试剂中的用途；
所述的驱动基因突变和靶向药物基因突变是指如下基因的突变：TP53、NOTCH2、CREBBP、PKHD1、ROS1、MYC、CDK12、ERBB2、PIK3CA和BRCA2；
所述的基因变异是指突变或者拷贝数变异；所述的突变是单核苷酸变异、插入缺失突变或者剪接突变。
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