WO2006098087A1 - 膵臓癌診断用マーカータンパク質 - Google Patents

膵臓癌診断用マーカータンパク質 Download PDF

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Tesshi Yamada
Kazufumi Honda
Setsuo Hirohashi
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G01N33/6851—Methods of protein analysis involving laser desorption ionisation mass spectrometry

Definitions

  • the present invention relates to a plurality of spleen cancer marker proteins having a specific molecular weight, and a method for detecting spleen cancer using these as indices.
  • Spleen cancer is one of the intractable cancers, and effective treatment other than surgery has not been established, so early treatment is important. It is known that CA19-9, an existing serum tumor marker, is used as a diagnostic method for spleen cancer! /, Ru (Tumor Marker Clinical Manual, Hisao Okura, Medical School, p88-89, pl24- 127). Recently, helical CT, magnetic resonance equipment (MRI), endoscopic ultrasonography (EUS), etc. are used in the diagnosis of spleen cancer. However, spleen cancer is an advanced cancer at the time of discovery that its symptoms are poor at an early stage, and treatment is still often difficult. Therefore, it can be said that development of a diagnostic technique that can detect spleen cancer early and accurately and easily is desired.
  • the present inventors have recently performed mass spectrometry using a protein chip method on a blood sample of a spleen cancer patient. As a result, the expression levels of a plurality of blood proteins having specific molecular weights are found to be healthy. It was found that spleen cancer can be detected accurately and easily by using these blood proteins as an index, which is significantly different from the expression level in. The present invention is based on such knowledge.
  • the present invention aims to provide a spleen cancer marker protein that serves as an indicator of spleen cancer. It has been the target.
  • Another object of the present invention is to provide a method for detecting spleen cancer.
  • the method for detecting spleen cancer according to the present invention comprises:
  • a group force of 28, 080 ⁇ 15, 17, 272 ⁇ 9, 17, 253 ⁇ 9, 8, 766 ⁇ 5, and 14, 779 ⁇ 8 (mZz) force in the blood sample obtained from the subject force is also selected Measure the expression level of at least one protein of molecular weight,
  • spleen cancer is detected in a subject when the expression level of a protein having a molecular weight of 14, 779 ⁇ 8 (mZz) is high.
  • the present invention it is possible to accurately and easily detect spleen cancer by using a blood protein having a specific molecular weight as a spleen cancer marker, thereby detecting spleen cancer at an early stage. 'Can be treated. Therefore, it is extremely significant that the present invention is provided that utilizes a powerful blood protein as a spleen cancer marker.
  • FIG. 1 shows the molecular weight captured by a cation exchange protein chip (C10, pH4).
  • FIG. 2 shows the molecular weight captured by a cation exchange protein chip (C10, pH4)
  • 16 is a mass spectrometry chart of healthy subjects or patients with spleen cancer regarding blood proteins of 17, 253 ⁇ 9 (m / z).
  • FIG. 3 shows the mass spectrometry of a healthy subject or a spleen cancer patient with respect to a blood protein having a molecular weight of 17,253 ⁇ 9 (m / z) captured by a reversed-phase protein chip (H50). Is.
  • FIG. 4 shows the mass peak of the protein having a molecular weight of 17,272 ⁇ 9 (m / z) trapped by the cation exchange protein chip (C10, pH 4) in Example 1 and Example 2. This is a result of U test comparing the ionic strength of healthy subjects and spleen cancer patients.
  • FIG. 5 shows the mass peak of the protein having a molecular weight of 17, 253 ⁇ 9 (m / z) captured by the cation exchange protein chip (C10, pH 4) in Example 1 and Example 2. This is a result of U test comparing the ionic strength of healthy subjects and spleen cancer patients.
  • FIG. 6 shows the ionic strength of the mass peak of the protein having a molecular weight of 17, 253 ⁇ 9 (m / z) captured by the reversed-phase protein chip (H50) in Example 1 and Example 2. It is the result of the U test comparing the healthy subject group with the spleen cancer patient group.
  • FIG. 7 shows healthy subjects or spleen cancer patients related to blood proteins having molecular weights of 17,272 ⁇ 9 (m / z) captured by a cation exchange protein chip (C10, pH 4) in Example 4. It is a mass spectrometry chart.
  • FIG. 8 shows healthy subjects or patients with spleen cancer related to blood proteins captured by a cation exchange protein chip (C10, pH 4) having a molecular weight of 8,766 ⁇ 5 (m / z) in Example 4. It is a mass spectrometry chart.
  • FIG. 9 shows healthy subjects or spleen cancers related to blood proteins captured by a cation exchange protein chip (C10, pH 4) having a molecular weight of 28,080 ⁇ 15 (m / z) in Example 4. It is a mass spectrometry chart of a patient.
  • FIG. 10 shows the mass of a healthy subject or a patient with spleen cancer related to a blood protein having a molecular weight of 14,799 ⁇ 9 (m / z) captured by a reversed-phase protein chip (H50) in Example 4. It is an analysis chart.
  • FIG. 11 is a diagram showing an ROC curve and its AUC value obtained in Example 4.
  • FIG. 11 is a diagram showing an ROC curve and its AUC value obtained in Example 4.
  • Spleen cancer marker proteins include 28, 080 ⁇ 15, 17, 272 ⁇ 9, 17, 25 Multiple blood proteins with molecular weights of 3 ⁇ 9, 8, 766 ⁇ 5 (mZz) or 14, 779 ⁇ 8 (mZz).
  • the value of the molecular weight of each blood protein indicates the value at the center of mass distribution in mass spectrometry.
  • a blood protein having a molecular weight of 28, 080 ⁇ 15, 17, 272 ⁇ 9, 17, 253 ⁇ 9 or 8,766 ⁇ 5 (mZz) is expressed in the spleen cancer patient. The level is low compared to the expression level of healthy subjects.
  • the blood protein having a molecular weight of 14, 779 ⁇ 8 (mZz) is characterized in that its expression level in spleen cancer patients is higher than that of healthy individuals.
  • the spleen cancer marker proteins according to the present invention may be used alone or in combination as an index of spleen cancer. These marker proteins can be detected with higher accuracy when used alone as a multi-marker in combination with the ability to detect splenic cancer with high accuracy even when used alone.
  • the spleen cancer marker protein according to the present invention can be used for detection of spleen cancer in combination with a known spleen cancer marker such as CA19-9.
  • the technique used for measuring the expression level of the spleen cancer marker protein is not particularly limited as long as it is a technique that can quantify the spleen cancer marker protein, but is preferably mass spectrometry, more preferably time-of-flight mass spectrometry. It is.
  • mass spectrometry for example, spleen cancer marker protein can be quantified using the ionic strength of the mass peak as an index.
  • the apparatus used in the above-described mass spectrometry can be used without particular limitation as long as it is an apparatus or system that can measure the expression level of a spleen cancer marker protein.
  • Examples of such an apparatus or system include a quadrupole mass spectrometer, a time-of-flight mass spectrometer, a quadrupole ion trap mass spectrometer, and a Fourier transform ion cyclotron mass spectrometer.
  • Protein chip and time-of-flight mass spectrometer and software power used for measurement 'analysis S Force including a chip-chip system integrated with an installed computer, preferably a quadrupole mass spectrometer, time-of-flight Type mass spectrometer or protein chip system.
  • the energy absorbing molecule used there is no particular limitation as long as it can be used for mass spectrometry of the marker protein according to the present invention, and examples thereof include sinapinic acid and oc-CHCA ( ⁇ -cyano-4-hydroxy cinnamic acid).
  • the mass spectrometry is preferably performed by a protein chip method.
  • the protein chip method refers to a technique in which an intended sample is added to a protein chip and the molecular weight of the protein in the sample captured by the protein chip is measured by mass spectrometry. According to the protein chip method, it is possible to efficiently and rapidly purify and identify multiple proteins in a short time using a small amount of sample. Therefore, it can be used advantageously in the detection of spleen cancer. it can.
  • the protein chip used in the present invention is not particularly limited as long as it can capture the spleen cancer marker protein.
  • the protein chip is a reverse phase protein chip, a metal ion-fixed protein chip, or a cation exchange type. It is a protein chip. Therefore, according to one embodiment of the present invention, the spleen cancer marker protein is a reverse phase protein chip, a metal ion-fixed protein chip, and a cation exchange protein chip.
  • the protein chip is a reversed-phase protein chip and a Z or cation exchange protein chip.
  • the protein chip is a metal ion fixed protein chip and a Z or cation exchange protein chip.
  • the spleen cancer marker protein according to the present invention is suitably captured on a cation exchange protein chip at pH 4 or 7. Therefore, according to a more preferred embodiment of the present invention, the cation exchange protein chip is adjusted to pH 4 or 7.
  • the cation exchange group in the cation exchange protein chip is preferably a carboxyl group or a carboxyalkyl group, and more preferably a carboxymethyl group.
  • preferred specific examples of the above cation exchange protein chip include WCX 2 or CM10 (both Ciphergen Biosystems, Inc.): Address: Japan, Yokohama, Kanagawa Prefecture, Kobe-cho, Hodogaya-ku, Kobe 134 Yokohama Business Park, East Tower 14F) More preferably, CM10 is more preferable.
  • the functional group in the reversed-phase protein chip is preferably at least one selected from an alkyl group, an aralkyl group and an aryl group, more preferably 6 to 12 carbon atoms, and An alkyl group, an aralkyl group, or an aryl group, at least one selected, and more preferably an alkyl group having 6 to 12 carbon atoms.
  • the functional group may be substituted, but is preferably unsubstituted.
  • preferred examples of the above-mentioned reversed-phase protein chip include H4 and H50 (all manufactured by Cyphergen Biosystems), and more preferred is H50.
  • the metal ion immobilized on the protein chip in the metal ion-immobilized protein chip is preferably a copper ion or a zinc ion, and more preferably a copper ion.
  • a preferred example of the metal ion-fixed protein chip is IMAC 30 (manufactured by Cyphergen Biosystems).
  • the protein in the sample is urged to be captured by the protein chip, and impurities are removed.
  • the protein chip is treated with a solution such as a solution and washed.
  • a solution such as a solution and washed.
  • the solution used in this case include a sodium acetate buffer solution, a tris (hydroxymethyl) aminomethane / hydrogen chloride buffer solution, and a phosphate buffer solution.
  • the spleen cancer marker protein according to the present invention is used because it has a property of being captured by the cation exchange protein chip at pH 4 or 7.
  • the solution is preferably a buffer that has a pH of 4 or 7. Therefore, according to a preferred embodiment of the present invention, the cation exchange protein chip is adjusted to pH 4 or 7.
  • the solution used is preferably a acetonitrile solution or a trifluoroacetic acid solution.
  • the solution used is preferably a sodium phosphate solution, a sodium chloride solution or a sodium acetate solution.
  • 28 080 ⁇ 15, 17, 272 ⁇ 9, 17, 253 ⁇ 9, 8 , 766 ⁇ 5 and 14, 779 ⁇ 8 (mZz) force of group force There is provided the use of at least one blood protein of selected molecular weight as a spleen cancer marker protein. Further, according to another preferred embodiment of the present invention, there is provided use of a blood protein having a molecular weight of 17,272 ⁇ 9 and Z or 17,253 ⁇ 9 (m / z) as a spleen cancer marker protein. Is done.
  • the blood protein having molecular weights of 28, 080 ⁇ 15, 17, 272 ⁇ 9, 14, 779 ⁇ 8 (mZz) and 8,766 ⁇ 5 (mZz) Use as a spleen cancer marker protein is provided.
  • the spleen cancer marker protein according to the present invention is used for accurate and simple detection of spleen cancer. Therefore, according to another aspect of the present invention, a method for detecting spleen cancer comprising:
  • a group force of 28, 080 ⁇ 15, 17, 272 ⁇ 9, 17, 253 ⁇ 9, 8, 766 ⁇ 5, and 14, 779 ⁇ 8 (mZz) force in the blood sample obtained from the subject force is also selected Measure the expression level of at least one protein of molecular weight,
  • a method in which a spleen cancer is detected in a subject when the expression level of a protein having a molecular weight of 14, 779 ⁇ 8 (mZz) is high.
  • the protein has a molecular weight of 17, 272 ⁇ 9 and Z or 17, 253 ⁇ 9 (mZz). Use what you have.
  • the molecular weight is 28, 080 ⁇ 15, 17, 272 ⁇ 9, 14, 779 ⁇ 8 (mZz) and 8, 766 5 ( m / z) is used.
  • the determination that spleen cancer has been detected is performed by comparing the expression level in the healthy subject with the expression level in the subject for the spleen cancer marker protein. Is done by.
  • the expression level in healthy individuals is set in advance as a threshold according to race, sex, age, and the like.
  • the expression level in the person can be set by a known statistical method with reference to the quantitative value of the spleen cancer marker protein in the healthy person measured by the above method.
  • Specific examples of the method for setting the expression level include (average value standard deviation of spleen cancer marker protein levels in healthy subjects) or ROC (Receiver Operating Characteristic) analysis, preferably ROC. It is analysis.
  • the determination that spleen cancer was detected was made by referring to the quantitative value of the spleen cancer marker protein in the patient by the statistical method as described above, the expression level in the subject,
  • the present invention which may be performed by comparing the above, includes a powerful embodiment.
  • the blood sample in the present invention is usually derived from a human.
  • the blood sample in the present invention is preferably plasma.
  • the method for collecting and preparing the blood sample is not particularly limited as long as it does not affect the measurement of the marker protein according to the present invention, and can be performed by a method known to those skilled in the art.
  • the spleen cancer marker protein according to the present invention can also be used in a method for monitoring spleen cancer in patients.
  • the monitoring method as described above can be advantageously used for accurately grasping the progression of spleen cancer, administering a more appropriate drug, and applying an appropriate treatment at a more appropriate time.
  • a method for monitoring spleen cancer in a patient comprising:
  • the protein in the above monitoring method, has a molecular weight of 17, 272 ⁇ 9 and Z or 17, 253 ⁇ 9 (mZz) as a protein. Is used.
  • the molecular weight is 28, 080 ⁇ 15, 17, 272 ⁇ 9, 14, 779 ⁇ 8 (m / z) and Use one with 8, 766 ⁇ 5 (mZz).
  • the plasma was treated with 9M Urea, 2% CHAPS (3- [3- Cholamidoproppyl) dimethylammonio] propanesulfonic acid) to prepare a sample.
  • This sample was added to three types of protein chips using a workstation robot Biomek 2000 (Beckman Coulter). These protein chips include cation exchange protein chip CM10 (Syphage Bion Systems), metal ion-fixed protein chip IMAC 30 (Cyphergen Biosystems), or reversed-phase protein chip H50 (Ciphergen). 'Biosystems' was used. For CM10, follow the procedure described in the instruction manual of Cyphergen Biosystems, wash under strict conditions using a pH 7 buffer solution, or relaxed conditions using a pH 4 buffer solution. Used for mass spectrometry.
  • Sinapic acid as a laser absorber matrix was added to the chip and dried. Next, this chip is placed in a quadrupole hybrid mass spectrometer Q-star XL (Applied Biosystems) equipped with a time-of-flight mass spectrometer, and a low molecular weight tank of approximately 2-40 KD or less. Mass and ionization were measured for quality and peptide. Mass spectrometer Q- s The mass 'ionization information obtained from tar XL is analyzed using the analysis software Analyst QS (Applied Biosystems), and the mass' ionization information data is smoothed using the Gaussian window function.
  • the peak chart for 17,253 ⁇ 9 (m / z) at CM10 (pH 4) was as shown in FIG.
  • the peak chart for 17, 253 ⁇ 9 (m / z) at H50 is as shown in FIG.
  • shaft of the peak chart in the said FIGS. 1-3 shows relative ion intensity.
  • the peak of V deviation showed a tendency to decrease in spleen cancer patients compared to healthy subjects.
  • Example 2 33 patients with spleen cancer different from Example 1 and 45 healthy subjects were used as a validation set, and the three peaks found in Example 1 were analyzed in the same manner as in Example 1. A mass analysis was performed and 17, 272 ⁇ 9 (m / z) at C10 (pH 4), 17, 253 ⁇ 9 (m / z) at C10 (pH 4) and 17, 253 ⁇ 9 (m / z) at H50 The correct answer rate of spleen cancer was analyzed.
  • Example 2 For each of Example 1 and Example 2, regarding the ionic strength of the three mass peaks found in Example 1, a healthy subject group and a spleen cancer patient group were compared and a U test was performed.
  • shaft in the said FIGS. 4-6 shows relative ionic strength.
  • the ionic strength of the spleen cancer patient group is significantly lower than that of the healthy group. won.
  • Example 1 The results of Example 1 and Example 2 showed the same tendency.
  • CM10, pH4 a cation exchange protein chip
  • the mass peak at 14, 779 ⁇ 8 (m / z) is significantly more significant in the spleen cancer patient group than in the healthy group. It was expensive.
  • the mass peaks of 17, 272 ⁇ 9, 17, 253 ⁇ 9 and 8,766 ⁇ 5 (mZz) were compared with those in the healthy group.
  • the peak intensity in the cancer patient group was significantly lower, and the peak intensity in the spleen cancer patient group was significantly higher in the mass peak of 14,779 ⁇ 8 (mZz) than in the healthy group.
  • CM10 Cyphergen Biosystems
  • H50 reverse phase chip H50
  • Machine learning using the rbf SVM algorithm was performed using the above peak information of mass spectrometry as a learning set. As a result, 28,080 ⁇ 15, 17, 272 ⁇ 9, 8,766 ⁇ 5 (m / z) in CM10 (pH 4) and 14,779 8 (m / z) in H50 were detected.
  • each peak chart was as shown in FIGS.
  • the vertical axis of the peak chart indicates relative ionic strength.
  • the ROC curve and its AUC value for the above four peaks are as shown in Fig. 11.
  • the sensitivity was 97.2%
  • the specificity was 94.4%
  • the AUC value was 0.979.
  • the discrimination ability of the above four peaks was confirmed by LOO (leave-one-out) cross validation.
  • Example 5 A verification test was conducted in the same manner as in Example 4, using 33 patients with pre-treatment spleen cancer different from Example 4 and 45 healthy subjects as a verification set. As a result, when all four peaks in Example 4 were detected, the discrimination rate was 91.0%, the sensitivity was 90.9%, and the specificity was 91.1%.
  • Example 4 the U test was performed by comparing the healthy group and the spleen cancer patient group with respect to the peak intensities of the four mass peaks.
  • Example 4 The results in Example 4 and Example 5 were as shown in Table 3. The value of each statistical result shows the average value of peak ionic strength, S.D.
  • Example 4 and Example 5 showed the same tendency.
  • sample preparation and mass spectrometry were performed in the same manner as in Example 1, and 17,272 ⁇ 9 (m in CM10 (pH 4) / z), 8, 766 ⁇ 5 (m / z) and 28, 080 ⁇ 15 (m / z), and 14, 779 ⁇ 8 (m / z) at H50.
  • the CA19-9 in the plasma of the above spleen cancer patients and healthy individuals was used with the CA19-9 ImmunoRadio Assay Kit (Fujirebione Earth). Detected. The cut-off value of CA19-9 in plasma was 37 UZmL, and spleen cancer was detected.

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Abstract

　分子量 ２８，０８０±１５、１７，２７２±９、１７，２５３±９、８，７６６±５（ｍ／ｚ）または１４，７７９±８（ｍ／ｚ）の血中タンパク質である、膵臓癌マーカータンパク質が開示されている。さらに、これらタンパク質を指標とした、膵臓癌を検出する方法が開示されている。

Description

明 細 書
脾臓癌診断用マーカータンパク質
関連出願
[0001] 本特許出願は、先に出願された日本国における特許出願である特願 2005— 070 512号（出願日： 2005年 3月 14日）に基づく優先権の主張を伴うものであり、かかる 先の特許出願における全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。 発明の背景
[0002] 発明の分野
本発明は、特定の分子量を有する複数の脾臓癌マーカータンパク質、およびこれ らを指標とする脾臓癌の検出方法に関する。
[0003] 昔景桉術
脾臓癌は難治性癌の一つであり、外科的手術以外の有効な治療法は確立されて いないため、早期治療が重要となる。脾臓癌の診断手法としては、既存の血清腫瘍 マーカーである CA19— 9が用いられることが知られて!/、る（腫瘍マーカー臨床マ- ュアル、大倉 久直、医学書院、 p88〜89、 pl24〜127)。また、最近では、脾臓癌 の診断において、ヘリカル CT、磁気共鳴装置 (MRI)、内視鏡的超音波検査法 (EUS) などが用いられている。し力しながら、脾臓癌は、早期の段階においてその症状に乏 しぐ発見の時点では進行癌となっており、治療は困難となっていることが依然として 多い。したがって、脾臓癌を早期において、的確かつ簡易に発見することが可能な 診断技術の開発が望まれるといえる。
発明の概要
[0004] 本発明者らは、今般、脾臓癌患者の血液試料につ!、て、プロテインチップ法による 質量分析を行ったところ、特定の分子量の複数の血中タンパク質の発現レベルが、 健常者における発現レベルと有意に異なり、これら血中タンパク質を指標とすることに より脾臓癌の検出を的確かつ簡易に行うことができることを見出した。本発明はかか る知見に基づくのものである。
したがって、本発明は、脾臓癌の指標となる脾臓癌マーカータンパク質の提供を目 的としている。
また、本発明は、脾臓癌の検出方法の提供を目的としている。
[0005] そして、本発明による脾臓癌マーカータンパク質は、
分子量 28, 080± 15、 17, 272± 9、 17, 253± 9、 8, 766 ± 5 (mZz)または 14 , 779 ± 8 (mZz)の血中タンパク質である。
[0006] また、本発明による脾臓癌を検出する方法は、
被検者力ら得た血液試料における、 28, 080 ± 15、 17, 272 ± 9、 17, 253 ± 9、 8, 766± 5および 14, 779±8 (mZz)力もなる群力も選択される分子量の、少なくと も一つのタンパク質の発現レベルを測定し、
健常者の発現レベルと比較して、
28, 080± 15、 17, 272± 9、 17, 253± 9および 8, 766 ± 5 (m/z)力らなる群力 ら選択される分子量の、少なくとも一つの前記タンパク質の発現レベルが低い場合、 および Zまたは
14, 779 ± 8 (mZz)の分子量のタンパク質の発現レベルが高い場合、被検者にお ける脾臓癌が検出されたものとする、方法である。
[0007] 本発明によれば、特定の分子量の血中タンパク質を脾臓癌マーカーとして利用す ることにより脾臓癌の検出を的確かつ簡易に行うことが可能であり、これにより脾臓癌 を早期に発見 '治療することが可能となる。したがって、力かる血中タンパク質を脾臓 癌マーカーとして利用する本発明が提供されることは、極めて意義がある。
図面の簡単な説明
[0008] [図 1]は、陽イオン交換型プロテインチップ (C10、 pH4)によって捕捉された、分子量
17, 272± 9 (m/z)の血中タンパク質に関する、健常者または脾臓癌患者の質量 分析チャートである。
[図 2]は、陽イオン交換型プロテインチップ (C10、 pH4)によって捕捉された、分子量
17, 253± 9 (m/z)の血中タンパク質に関する、健常者または脾臓癌患者の質量 分析チャートである。
[図 3]は、逆相型プロテインチップ (H50)によって捕捉された、分子量 17, 253 ± 9 (m/z)である血中タンパク質に関する、健常者または脾臓癌患者の質量分析チヤ一 トである。
[図 4]は、実施例 1および実施例 2において、陽イオン交換型プロテインチップ (C10、 pH4)によって捕捉された、分子量 17, 272 ± 9 (m/z)であるタンパク質の質量ピ ークのイオン強度に関し、健常者群と脾臓癌患者群とを比較した U検定の結果であ る。
[図 5]は、実施例 1および実施例 2において、陽イオン交換型プロテインチップ (C10、 pH4)によって捕捉された、分子量 17, 253 ± 9 (m/z)であるタンパク質の質量ピ ークのイオン強度に関し、健常者群と脾臓癌患者群とを比較した U検定の結果であ る。
[図 6]は、実施例 1および実施例 2において、逆相型プロテインチップ (H50)によって 捕捉された、分子量 17, 253 ± 9 (m/z)であるタンパク質の質量ピークのイオン強 度に関し、健常者群と脾臓癌患者群とを比較した U検定の結果である。
[図 7]は、実施例 4において、陽イオン交換型プロテインチップ (C10、 pH4)によって 捕捉された、分子量 17, 272± 9 (m/z)の血中タンパク質に関する、健常者または 脾臓癌患者の質量分析チャートである。
[図 8]は、実施例 4において、陽イオン交換型プロテインチップ (C10、 pH4)によって 捕捉された、分子量 8, 766± 5 (m/z)の血中タンパク質に関する、健常者または 脾臓癌患者の質量分析チャートである。
[図 9]は、実施例 4において、陽イオン交換型プロテインチップ (C10、 pH4)によって 捕捉された、分子量 28, 080± 15 (m/z)である血中タンパク質に関する、健常者 または脾臓癌患者の質量分析チャートである。
[図 10]は、実施例 4において、逆相型プロテインチップ (H50)によって捕捉された、 分子量 14, 799± 9 (m/z)である血中タンパク質に関する、健常者または脾臓癌 患者の質量分析チャートである。
[図 11]は、実施例 4において得られた、 ROC曲線およびその AUC値を示す図である 発明の具体的説明
本発明による脾臓癌マーカータンパク質は、 28, 080± 15、 17, 272± 9、 17, 25 3± 9、8, 766± 5 (mZz)または 14, 779 ± 8 (mZz)の分子量を有する複数の血 中タンパク質である。ここで、各血中タンパク質の分子量の値は、質量分析における 、質量分布中心の値を示す。そして、上記脾臓癌マーカータンパク質において、分 子量 28, 080± 15、 17, 272± 9、 17, 253± 9または 8, 766± 5 (mZz)の血中 タンパク質は、その脾臓癌患者における発現レベルが、健常者の発現レベルと比較 して低いことを特徴とする。また、上記脾臓癌マーカータンパク質において、分子量 14, 779±8 (mZz)の血中タンパク質は、その脾臓癌患者における発現レベルが、 健常者の発現レベルと比較して高 、ことを特徴とする。
[0010] 本発明による脾臓癌マーカータンパク質は、それぞれを単独で脾臓癌の指標とし て用いてもよぐ組み合わせて用いてもよい。これらのマーカータンパク質は、単独で 使用しても精度の高い脾臓癌の検出を可能とする力 組み合わせてマルチマーカー として使用する場合、より精度の高い検出が可能となる。また、本発明による脾臓癌 マーカータンパク質は、 CA19— 9などの公知の脾臓癌マーカーと組み合わせて脾 臓癌の検出に利用することもでき、本発明には力かる態様も包含される。
[0011] 上記脾臓癌マーカータンパク質の発現レベルの測定に用いられる手法は、脾臓癌 マーカータンパク質を定量できる手法であれば特に限定されないが、好ましくは質量 分析であり、より好ましくは飛行時間型質量分析である。力かる質量分析においては 、例えば、質量ピークのイオン強度を指標として脾臓癌マーカータンパク質を定量す ることがでさる。
[0012] また、上記方質量分析において用いられる装置としては、脾臓癌マーカータンパク 質の発現レベルを測定可能な装置またはシステムであれば、特に制限なく使用でき る。このような装置またはシステムとしては、例えば、四重極型質量分析計、飛行時間 型質量分析計、四重極イオントラップ質量分析計、フーリエ変換型イオンサイクロトロ ン型質量分析計などの装置、プロテインチップおよび飛行時間型質量分析計および 測定'解析に使用するソフトウェア力 Sインストールされたコンピュータが一体となったプ 口ティンチップシステムなどが挙げられる力 好ましくは四重極型質量分析計、飛行 時間型質量分析計またはプロテインチップシステムである。
[0013] また、本発明における質量分析において、使用されるエネルギー吸収分子としては 、本発明によるマーカータンパク質の質量分析に使用可能であれば特に限定されな いが、例えば、シナピン酸 (sinapinic acid)または oc— CHCA ( α— Cyano- 4- hydroxy cinnamic acid)などが挙げられる。
[0014] さらに、上記質量分析は、プロテインチップ法により行われることが好ましい。ここで 、プロテインチップ法とは、意図する試料をプロテインチップに添加し、プロテインチッ プにより捕捉された試料中のタンパク質の分子量を質量分析により測定する手法を いう。プロテインチップ法によれば、少量の試料を用いて短時間で複数のタンパク質 の精製 ·同定などを効率的かつ迅速に行うことが可能であり、したがって、脾臓癌の 検出において有利に使用することができる。
[0015] 本発明において用いられるプロテインチップは、脾臓癌マーカータンパク質を捕捉で きるものであれば特に限定されないが、好ましくは逆相型プロテインチップ、金属ィォ ン固定型プロテインチップまたは陽イオン交換型プロテインチップである。したがって 、本発明の一つの態様によれば、脾臓癌マーカータンパク質は、逆相型プロテイン チップ、金属イオン固定型プロテインチップ、および陽イオン交換型プロテインチップ 力もなる群力も選択される少なくとも一つのプロテインチップに捕捉されるものである また、本発明のより好ましい態様によれば、上記プロテインチップは、逆相型プロティ ンチップおよび Zまたは陽イオン交換型プロテインチップである。
また、本発明の別の好ましい態様によれば、上記プロテインチップは、金属イオン 固定型プロテインチップおよび Zまたは陽イオン交換型プロテインチップである。 また、本発明による脾臓癌マーカータンパク質は、 pH4または 7において陽イオン 交換型プロテインチップに好適に捕捉される。したがって、本発明のより好ましい態 様によれば、上記陽イオン交換型プロテインチップは、 pH4または 7に調整されたも のである。
[0016] また、陽イオン交換型プロテインチップにおける陽イオン交換基は、好ましくはカル ボキシル基またはカルボキシアルキル基であり、より好ましくはカルボキシメチル基で ある。さらに、上記陽イオン交換型プロテインチップの好ましい具体例としては、 WCX 2または CM10 (いずれもサイファージェン 'バイオシステムズ（Ciphergen Biosystems, Inc.)社製:住所：日本国 神奈川県横浜巿 保土ケ谷区神戸町 134 横浜ビジネスパ ーク イーストタワー 14F)が挙げられる力 より好ましくは CM10である。また、逆相型 プロテインチップにおける官能基は、好ましくはアルキル基、ァラルキル基およびァリ 一ル基カも選択される少なくとも一つのものであり、より好ましくは炭素数 6〜 12であ り、かつアルキル基、ァラルキル基またはァリール基力 選択される少なくとも一つの ものであり、さらに好ましくは炭素数 6〜 12のアルキル基である。上記官能基は置換 されていてもよいが、好ましくは無置換である。さらに、上記逆相型プロテインチップ の好ま 、具体例としては、 H4または H50 ( ヽづれもサイファージェン 'バイオシステ ムズ社製）が挙げられるが、より好ましくは H50である。また、金属イオン固定型プロ ティンチップにおいてプロテインチップに固定される金属イオンとしては、好ましくは 銅イオンまたは亜鉛イオンであり、より好ましくは銅イオンである。さらに、上記金属ィ オン固定型プロテインチップの好まし 、具体例としては IMAC 30 (サイファージェン · バイオシステムズ社製）が挙げられる。
[0017] プロテインチップ法にあっては、試料をプロテインチップに添カ卩した後、試料中のタ ンパク質をプロテインチップへ捕捉させることを促し、かつ不純物を除去するため、所 望により、緩衝液などの溶液によってプロテインチップを処理し、洗浄する。この際に 使用される溶液としては、具体的には、酢酸ナトリウム緩衝溶液、トリス (ヒドロキシメチ ル)ァミノメタン/塩化水素緩衝溶液、リン酸緩衝溶液などが挙げられる。そして、陽ィ オン交換型プロテインチップを用いる場合、本発明による脾臓癌マーカータンパク質 は、陽イオン交換型プロテインチップに pH4または 7にお 、て捕捉される性質を有す ることから、使用される溶液は、好ましくは pH4または 7である緩衝液である。したがつ て、本発明の好ましい態様によれば、陽イオン交換型プロテインチップは pH4または 7に調整されたものである。
また、逆相型プロテインチップの場合、使用される溶液としては、好ましくはァセトニ トリル溶液またはトリフルォロ酢酸溶液である。
また、金属イオン固定型プロテインチップの場合、使用される溶液としては、好ましく はリン酸ナトリウム溶液、塩ィ匕ナトリウム溶液または酢酸ナトリウム溶液である。
[0018] また、本発明の另 Uの態様によれば、 28, 080± 15、 17, 272± 9、 17, 253± 9、 8 , 766± 5および 14, 779±8 (mZz)力 なる群力 選択される分子量の、少なくとも 一つの血中タンパク質の、脾臓癌マーカータンパク質としての使用が提供される。ま た、本発明の別の好ましい態様によれば、 17, 272± 9および Zまたは 17, 253± 9 (m/z)の分子量の血中タンパク質の、脾臓癌マーカータンパク質としての使用が提 供される。また、本発明の別の好ましい態様によれば、分子量 28, 080± 15、 17, 2 72± 9、 14, 779±8 (mZz)および 8, 766 ± 5 (mZz)を有する血中タンパク質の、 脾臓癌マーカータンパク質としての使用が提供される。
[0019] また、本発明による脾臓癌マーカータンパク質は、上述の通り、脾臓癌の的確かつ 簡易な検出に用いられるものである。したがって、本発明の別の態様によれば、脾臓 癌を検出する方法であって、
被検者力ら得た血液試料における、 28, 080 ± 15、 17, 272 ± 9、 17, 253 ± 9、 8, 766± 5および 14, 779±8 (mZz)力もなる群力も選択される分子量の、少なくと も一つのタンパク質の発現レベルを測定し、
健常者の発現レベルと比較して、
28, 080± 15、 17, 272± 9、 17, 253± 9および 8, 766 ± 5 (mZz)力もなる群 力も選択される分子量の、少なくとも一つのタンパク質の発現レベルが低い場合、お よび Zまたは
14, 779 ± 8 (mZz)の分子量のタンパク質の発現レベルが高い場合、被検者に おける脾臓癌が検出されたものとする、方法が提供される。
[0020] また、本発明の別の好ま 、態様によれば、上記方法にお!、て、上記タンパク質と して、 17, 272± 9および Zまたは 17, 253 ± 9 (mZz)の分子量を有するものを用 いる。また、本発明の別の好ましい態様によれば、上記方法において、上記タンパク 質として、分子量 28, 080± 15、 17, 272± 9、 14, 779±8 (mZz)および 8, 766 士 5 (m/z)を有するものを用いる。
[0021] 本発明による上記方法において、脾臓癌の検出されたことの判定は、上述の通り、 脾臓癌マーカータンパク質について、健常者における発現レベルと、被検者におけ る発現レベルとを比較することによって行われる。そして、健常者における発現レべ ルは、人種、性別、年齢などに応じて、予め閾値として設定される。そして、上記健常 者における発現レベルは、上述の手法により測定された健常者における脾臓癌マー カータンパク質の定量値を参照して公知の統計手法により設定することができる。上 記発現レベルの具体的な設定手法としては、例えば、（健常者における脾臓癌マー カータンパク質のレベルの平均値士標準偏差）または ROC (Receiver Operating Cha racteristic)分析などが挙げられ、好ましくは ROC分析である。なお、脾臓癌が検出さ れたことの判定は、上述のような統計手法により患者における脾臓癌マーカータンパ ク質の定量値を参照して予め設定された閾値と、被検者における発現レベルとを比 較することにより行ってもよぐ本発明には力かる態様も包含される。
[0022] また、本発明における血液試料は、通常はヒト由来のものとされる。さら〖こ、本発明 における血液試料は、好ましくは血漿である。血液試料の採取および調製手法は、 本発明によるマーカータンパク質の測定に影響を与えない限り特に限定されず、当 業者に公知の手法により行うことができる。
[0023] また、本発明による脾臓癌マーカータンパク質はまた、患者にお!、て、脾臓癌をモ 二タリングする方法に利用することができる。上述のようなモニタリング方法は、脾臓 癌の進行を正確に把握し、より適切な時期に、より適切な薬剤を投与したり、適切な 治療を施したりするのに有利に利用することができる。
[0024] したがって、本発明の別の態様によれば、患者において、脾臓癌をモニタリングす る方法であって、
唐、者力ら得た血液試料における、 28, 080 ± 15、 17, 272 ± 9、 17, 253 ± 9、 8, 766 ± 5および 14, 779 ± 8 (mZz)力 なる群力 選択される分子量の、少なくとも 一つのタンパク質の発現レベルを測定し、
28, 080± 15、 17, 272± 9、 17, 253 ± 9および 8, 766 ± 5 (mZz)力もなる群 力も選択される分子量の、少なくとも一つのタンパク質の発現レベルが経時的に低下 した場合、および Zまたは
14, 779 ± 8 (m/z)の分子量のタンパク質の発現レベルが経時的に上昇した場 合、脾臓癌が進行したものとする、方法が提供される。
[0025] また、本発明の別の好ましい態様によれば、上記モニタリング方法において、タン パク質として、 17, 272 ± 9および Zまたは 17, 253 ± 9 (mZz)の分子量を有するも のを用いる。また、本発明の別の好ましい態様によれば、上記モニタリング方法にお ヽて、タンノ ク質として、分子量 28, 080± 15、 17, 272± 9、 14, 779 ± 8 (m/z) および 8, 766 ± 5 (mZz)を有するものを用いる。
実施例
[0026] 以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に 限定されるものではない。
例 1
ピークの撰択
樑血
2002年 9月力ら 2003年 10月までの期間にお!/、て、国立がんセンター中央病院に おける治療前脾臓がん患者 104名および健常者 116名について、 EDTA採血管を 用いて採血を行 、、得られた血漿を以下の実験に用いた。
[0027] プロテインチップ法による分析
上記血漿を 9M Urea, 2% CHAPS (3- [3- Cholamidoproppyl)dimethylammonio]prop anesulfonic acid)にて処理し、検体を調製した。この検体を、ワークステーションロボッ トバイオメック 2000 (Beckman Coulter社製）を用いて、 3種類のプロテインチップに 添加した。これらプロテインチップとしては、陽イオン交換型プロテインチップ CM10 ( サイファージヱン 'バイオシステムズ社製）、金属イオン固定型プロテインチップ IMAC 30 (サイファージェン ·バイオシステムズ社製）、または逆相型プロテインチップ H50 ( サイファージェン 'バイオシステムズ社製）を用いた。なお、 CM10については、サイフ ァージェン 'バイオシステムズ社の取扱説明書に記載の手順に従 、、 pH7の緩衝液 を用いる厳密条件、または pH4の緩衝液を用いる緩和条件にて洗浄を行い、以下の 質量分析に用いた。
[0028] 皙畺分析
上記チップに、レーザー吸収体マトリックスであるシナピン酸を添加し、乾燥した。 次に、このチップを、飛行時間型質量分析機を搭載した四重極型ハイブリッド質量分 析機 Q- star XL (Applied Biosystems社）内に配置し、約 2— 40KD以下の低分子タン ノ ク質およびペプチドについて、質量およびイオン化量を測定した。質量分析器 Q- s tar XLから得られた質量'イオン化情報は、解析用ソフトウェアー Analyst QS (Applied Biosystems社)を用い、質量'イオン化情報データに対する、ガウシアン窓関数によ るスム ~ンンクを行い、 らには、 Improving protein identincation from peptide mass f ingerprinting through a parameterized multi-level scoring algorithm and an optimize d peak detection (Electrophoresis. 1999 Dec;20(18):3535- 50.の記載に準じてベース ラインおよびノイズレベルの調整を行い、ピーク情報へ変換した。なお、質量分析機 において許容される質量誤差は 0. 05%程度であるとして、データの解析を行った。
[0029] 機械学習
上記のようにして得られた 2,000〜35,000Daの範囲のピーク情報について、脾臓癌 患者 71例および健常者 71例を学習セットとして、 SVM (support vector machine :rbf ^radius basis functioa)および linear)、 NN (neural network;、および FNN (fuzzy neur al network)のアルゴリズムによる機械学習を行った。その結果、表 1に示される通りで あった。 3つのピーク、 CM10 (pH4)における 17, 272± 9 (m/z)および 17, 253士 9 (m/z)、並びに H50における 17, 253± 9 (m/z)力 いずれのアルゴリズムによる 解析でも判別率 約 80%以上を示した。
[0030] [表 1]
Figure imgf000012_0001
Figure imgf000012_0002
[0031] ピークチャート
また、健常者および脾臓癌患者における、 CM10 (pH4)における 17, 272± 9 (m /z)に関するピークチャートは、図 1に示される通りであった。
また、 CM10 (pH4)における 17, 253± 9 (m/z)に関するピークチャートは、図 2に 示される通りであった。 また、 H50における 17, 253± 9 (m/z)に関するピークチャートは、図 3に示される 通りであった。
上記図 1〜図 3におけるピークチャートの縦軸は相対的なイオン強度を示す。 Vヽずれのピークも、健常者と比較して脾臓癌患者にぉ 、て減少する傾向を示した。
[0032] 実施例 2 実施例 1とは異なる脾臓癌患者 33例および健常者 45例を検証セットとして、実施 例 1にて見出された 3つのそれぞれのピークについて実施例 1と同様の手法により質 量分析を行い、 C10 (pH4)における 17, 272± 9 (m/z)、 C10 (pH4)における 17, 253± 9 (m/z)および H50における 17, 253 ± 9 (m/z)について、脾臓癌の正答率 を解析した。
CM10 (pH4)における 17, 272 ± 9 (m/z)については、半 IJ另 IJ率 72. 2%、感度 58 . 8%、特異度 82. 2%であった。
CM10 (pH4)における 17, 253 ± 9 (m/z)については、半 IJ另 IJ率 79. 7%、感度 85 . 3%、特異度 75. 6%であった。
H50における 17, 253 ± 9 (m/z)については、半 IJ另 IJ率 79. 7%、感度 82. 4%、特 異度 77. 8%であった。
[0033] U枪定（Mann Whitney U test)による檢 tH
実施例 1および実施例 2についてそれぞれ、実施例 1で見出された三つの質量ピ ークのイオン強度に関し、健常者群と、脾臓癌患者群とを比較して U検定を行った。
CM10 (pH4)における 17, 272± 9 (m/z)に関する結果は、図 4に示される通りで めつに。
また、 CM10 (pH4)における 17, 253 ± 9 (m/z)に関する結果は、図 5に示される 通りであった。
また、 H50における 17, 253 ± 9 (m/z)に関する結果は、図 6に示される通りであつ た。
上記図 4〜図 6における縦軸は相対的なイオン強度を示す。
いずれのピークも、健常者群と比較して、脾臓癌患者群のイオン強度は有意に低 かった。
また、実施例 1および実施例 2の結果は同様の傾向を示して 、た。
実施例 3
実施 f列 1における質量分析により検出された、 28, 080± 15、 17, 272± 9, 17, 2 53 ± 9、 8, 766± 5または 14, 779 ± 8 (mZz)の質量ピークのイオン強度に関し、 T 検定による統計解析を行った。結果は表 2に示される通りであった。
[表 2]
Figure imgf000014_0001
Figure imgf000014_0002
陽イオン交換型プロテインチップ（CM10、 pH4)を用いた場合、分子量 28, 080 ± 15、 17, 272± 9、 17, 253± 9および 8, 766 ± 5 (m/z)の質量ピーク【こつ!ヽて は、健常者群と比較して、脾臓癌患者群のイオン強度が有意に低力 た。さらに、陽 イオン交換型プロテインチップ（CM10、 pH7)を用いた場合、 14, 779±8 (m/z) の質量ピークは、健常者群と比較して、脾臓癌患者群のイオン強度が有意に高かつ た。また、逆相型プロテインチップ (H50)を用いた場合、 17, 272± 9、 17, 253± 9 および 8, 766 ± 5 (mZz)の質量ピークについては、健常者群と比較して、脾臓癌患 者群のピーク強度が有意に低ぐ 14, 779±8 (mZz)の質量ピークは、健常者群と 比較して、脾臓癌患者群のピーク強度が有意に高力つた。また、金属イオン固定型 プロテインチップ (IMAC 30、銅イオン固定型）を用いた場合、 28, 080± 15および 8, 766± 5 (mZz)の質量ピークは、健常者群と比較して、脾臓癌患者群のピーク強 度が有意に低力つた。
[0036] 実施例 4
皙量分析
国立がんセンター中央病院における治療前脾臓がん患者 71名および健常者 71名 について、実施例 1と同様の手法により、サンプルを調製して質量分析を行った。プ 口ティンチップとしては、陽イオン交換チップ CM10 (サイファージェン 'バイオシステ ムズ社製)および逆相チップ H50 (サイファージェン 'バイオシステムズ社製)を用い た。なお、 CM10については、サイファージェン 'バイオシステムズ社の取扱説明書に 記載の手順に従!ヽ、 pH4の緩衝液を用いる緩和条件にて洗浄を行った。
[0037] 機械学習
上記質量分析のピーク情報を学習セットとして、 rbf SVMのアルゴリズムによる機械 学習を行った。その結果、 CM10 (pH4)における 28, 080± 15、 17, 272± 9、 8, 766 ± 5 (m/z)および H50における 14, 779士 8 (m/z)とが検出された。
[0038] ピークチャート
また、実施例 3の結果、各ピークチャートは、図 7〜図 10に示される通りであった。こ こで、ピークチャートの縦軸は、相対的なイオン強度を示す。
図 7〜図 9に示される通り、 CM10 (pH4)における 17, 272± 9 (m/z)、 8, 766士 5 (m/z)および 28, 080± 15 (m/z)は、健常者と比較して脾臓癌患者において低 い傾向を示した。一方、図 10において示される通り、 H50における 14, 779 ± 8 (m/ z)は、健常者と比較して脾臓癌患者において高い傾向を示した。
[0039] ROC曲線
また、上記四つのピークに関する ROC曲線およびその AUC値は図 11に示される 通りであった。特に上記四つのピークのすべてが検出される場合 (4ピークコンビネー シヨン)、感度 97. 2%、特異度 94. 4%であり、その AUC値は 0. 978であった。な お、上記四つのピークについては、 LOO (leave- one- out) cross validationによっても 、識別能力を確認した。
[0040] 実施例 5 実施例 4とは異なる治療前脾臓癌患者 33例および健常者 45例を検証セットとして 、実施例 4と同様の手法により、検証試験を行った。その結果、実施例 4における四 つのピークのすべてが検出される場合、判別率 91. 0%、感度 90. 9%、特異度 91 . 1%であった。
[0041] U検定による検証
実施例 4および実施例 5につ 、てそれぞれ、上記四つの質量ピークのピーク強度 に関し、健常者群と、脾臓癌患者群とを比較して U検定を行った。
実施例 4および実施例 5における結果は、表 3に示される通りであった。なお、各統 計結果の値は、ピークのイオン強度の平均値士 S. D.を示す。
[0042] [表 3]
Figure imgf000016_0001
[0043] U検定の結果、実施例 4および実施例 5は同様の傾向を示した。
CM10 (pH4)における 17, 272 ± 9 (m/z) , 8, 766 ± 5 (m/z)および 28, 080 ± 15 (m/z)についてはいずれも、健常者群と比較して、脾臓癌患者群のピーク強度 は有意に低かった。一方、 H50における 14, 779 ±8 (m/z)については、健常者と 比較して脾臓癌患者群のピーク強度は有意に高力つた。
[0044] 実施例 6
CA19— 9 皙量ピーク を指標 した、膝臓癌の枪出
東京医科大学病院における治療前脾臓癌患者 29名および健常者 39名について 、実施例 1と同様の手法により、サンプルの調製および質量分析を行い、 CM10 (pH 4)における 17, 272 ± 9 (m/z) , 8, 766 ± 5 (m/z)および 28, 080± 15 (m/z)並 びに H50における 14, 779 ±8 (m/z)を検出した。また、上記脾臓癌患者および健 常者の血漿中 CA19-9を、 CA19-9ィムノラジオアツセィキット（富士レビオネ土製)用い て検出した。なお、血漿中 CA19-9のカットオフ値は、 37UZmLとして脾臓癌の検出 を行った。
[0045] 結果は、表 3に示される通りであった。なお、表 3において、 SELDIとは、 CM10(p H4)における 17, 272±9(m/z)、 8, 766±5 (m/z)および 28, 080±15(m/z) 並びに H50における 14, 779 ±8 (m/z)がいずれも検出された場合を意味する。ま た、コンビネーションとは、 SELDIと、 CA19— 9とがいずれも検出された場合を意味 する。また、 nは検出された被検者の数を示す。なお、臨床段階は、日本脾臓病学会 編集 脾癌取扱い規約の記載に準じ、分類されている。
[表 4]
Figure imgf000017_0001
[0046] 上記 CM10(pH4)における 17, 272±9 (m/z)、 8, 766 ±5 (m/z)および 28, 0 80±15(m/z)並びに H50における 14, 779±8(m/z)と、 CA19— 9とを併せて指標 とすることにより、脾臓癌患者の 100%が検出された。

Claims

請求の範囲
[1] 分子量 28, 080± 15, 17, 272± 9, 17, 253± 9, 8, 766 ± 5 (m/z) ¾yt«14 , 779 ± 8 (mZz)の血中タンパク質である、脾臓癌マーカータンパク質。
[2] 分子量 17, 272± 9または 17, 253± 9 (mZz)の血中タンパク質である、請求項 1に記載の脾臓癌マーカータンパク質。
[3] 分子量 28, 080± 15, 17, 272± 9, 17, 253± 9または 8, 766± 5 (m/z) ( |ίί 記血中タンパク質の脾臓癌患者における発現レベルが、健常者の発現レベルと比較 して低いことを特徴とする、請求項 1に記載の脾臓癌マーカータンパク質。
[4] 分子量 14, 779 ± 8 (mZz)の前記血中タンパク質の脾臓癌患者における発現レ ベルが、健常者の発現レベルと比較して高いことを特徴とする、請求項 1に記載の脾 臓癌マーカータンパク質。
[5] 逆相型プロテインチップ、金属イオン固定型プロテインチップおよび陽イオン交換 型プロテインチップ力もなる群力も選択される少なくとも一つのプロテインチップに捕 捉されるものである、請求項 1に記載の脾臓癌マーカータンパク質。
[6] 前記プロテインチップが、逆相型プロテインチップおよび Zまたは陽イオン交換型 プロテインチップである、請求項 5に記載の脾臓癌マーカータンパク質。
[7] pH4または 7にお 、て前記陽イオン交換型プロテインチップに捕捉されるものであ る、請求項 1に記載の脾臓癌マーカータンパク質。
[8] 脾臓癌を検出する方法であって、
被検者力ら得た血液試料における、 28, 080 ± 15、 17, 272 ± 9、 17, 253 ± 9、
8, 766± 5および 14, 779±8(mZz)力もなる群力も選択される分子量の、少なくと も一つのタンパク質の発現レベルを測定し、
健常者の発現レベルと比較して、
28, 080± 15、 17, 272± 9、 17, 253± 9および 8, 766 ± 5 (m/z)力らなる群力 ら選択される分子量の、少なくとも一つの前記タンパク質の発現レベルが低い場合、 および Zまたは
14, 779 ± 8 (mZz)の分子量の前記タンパク質の発現レベルが高い場合、前記被 検者における脾臓癌が検出されたものとする、方法。
[9] 前記タンパク質が、 17, 272± 9および Zまたは 17, 253± 9 (mZz)の分子量を 有するものであり、健常者の発現レベルと比較して、前記タンパク質の発現レベルが 低い場合、前記被検者における脾臓癌が検出されたものとする、請求項 8に記載の 方法。
[10] 前記タンパク質力 分子量 28, 080± 15、 17, 272± 9、 14, 779±8 (mZz)お よび 8, 766 ± 5 (mZz)を有するものであり、
健常者の発現レベルと比較して、
分子量 28, 080± 15、 17, 272± 9および 8, 766 ± 5 (mZz)を有する前記タンパ ク質の発現レベルが低ぐかつ分子量 14, 779 ± 8 (mZz)を有する前記タンパク 質の発現レベルが高い場合、前記被検者における脾臓癌が検出されたものとする、 請求項 8に記載の方法。
[11] 前記測定が質量分析により行われる、請求項 8に記載の方法。
[12] 前記質量分析が飛行時間型質量分析である、請求項 11に記載の方法。
[13] 前記質量分析がプロテインチップ法により行われる、請求項 11に記載の方法。
[14] 前記プロテインチップ法にぉ 、て用いられるプロテインチップ力 逆相型プロテイン チップ、金属イオン固定型プロテインチップ、および陽イオン交換型プロテインチップ 力もなる群力も選択される少なくとも一つものである、請求項 13に記載の方法。
[15] 前記プロテインチップが、逆相型プロテインチップおよび Zまたは陽イオン交換型 プロテインチップである、請求項 14に記載の方法。
[16] 前記陽イオン交換型プロテインチップが、 pH4または 7に調製されたものである、請 求項 14に記載の方法。
[17] 患者において、脾臓癌をモニタリングする方法であって、
前記唐、者力ら得た血液試料における、 28, 080 ± 15、 17, 272 ± 9、 17, 253 ± 9
、8, 766± 5および 14, 779 ±8 (mZz)力 なる群から選択される分子量の、少なく とも一つのタンパク質の発現レベルを測定し、
28, 080± 15、 17, 272± 9、 17, 253± 9および 8, 766 ± 5 (mZz)力もなる群 力 選択される分子量の、少なくとも一つの前記タンパク質の発現レベルが経時的に 低下した場合、および zまたは 14, 779 ± 8 (m/z)の分子量の前記タンパク質の発現レベルが経時的に上昇し た場合、脾臓癌が進行したものとする、方法。
[18] 前記タンパク質が、 17, 272± 9および Zまたは 17, 253± 9 (mZz)の分子量を 有するであり、該タンパク質の発現レベルが経時的に低下した場合、脾臓癌が進行 したものとする、請求項 17に記載の方法。
[19] 前記タンパク質力 分子量 28, 080± 15、 17, 272± 9、 14, 779 ±8 (m/z) *5 よび 8, 766 ± 5 (mZz)を有するものであり、
分子量 28, 080± 15、 17, 272± 9および 8, 766 ± 5 (mZz)の前記タンノ ク質 の発現レベルが経時的に低下し、かつ分子量 14, 779 ±8 (mZz)の前記タンパク 質の発現レベルが経時的に上昇した場合、脾臓癌が進行したものとする、請求項 17 に記載の方法。
[20] 前記測定が質量分析により行われる、請求項 17に記載の方法。
[21] 前記質量分析が飛行時間型質量分析である、請求項 20に記載の方法。
[22] 前記質量分析がプロテインチップ法により行われる、請求項 20に記載の方法。
[23] 前記プロテインチップ法にぉ 、て用いられるプロテインチップ力 逆相型プロテイン チップ、金属イオン固定型プロテインチップおよび陽イオン交換型プロテインチップ 力もなる群力も選択される少なくとも一つものである、請求項 21に記載の方法。
[24] 前記プロテインチップが、逆相型プロテインチップおよび Zまたは陽イオン交換型 プロテインチップである、請求項 23に記載の方法。
[25] 前記陽イオン交換型プロテインチップが、 pH4または 7に調製されたものである、請 求項 23に記載の方法。
[26] 28, 080± 15、 17, 272± 9、 17, 253± 9、 8, 766± 5および 14, 779 ± 8 (m/ z)からなる群力も選択される分子量の、少なくとも一つの血中タンパク質の、脾臓癌 マーカータンパク質としての使用。
[27] 前記血中タンパク質が、 17, 272± 9および Zまたは 17, 253± 9 (mZz)の分子 量を有するものである、請求項 26に記載の使用。
[28] 前記血中タンパク質力 分子量 28, 080± 15、 17, 272± 9, 14, 779 ±8 (m/z
)および 8, 766 ± 5 (mZz)を有するものである、請求項 26に記載の使用。
[29] 28, 080± 15、 17, 272± 9、 17, 253± 9および 8, 766 ± 5 (m/z)力らなる群力 ら選択される分子量の、前記血中タンパク質の脾臓癌患者における発現レベル力 健常者の発現レベルと比較して低いことを特徴とする、請求項 26に記載の使用。
[30] 分子量 14, 779 ± 8 (mZz)の前記血中タンパク質の脾臓癌患者における発現レ ベルが、健常者の発現レベルと比較して高いことを特徴とする、請求項 26に記載の 使用。
[31] 質量分析における、請求項 26に記載の使用。
[32] 前記質量分析が飛行時間型質量分析である、請求項 31に記載の使用。
[33] 前記質量分析がプロテインチップ法により行われる、請求項 31に記載の使用。
[34] 前記血中タンパク質が、逆相型プロテインチップ、金属イオン固定化型プロテイン チップ、および陽イオン交換型プロテインチップ力もなる群力 選択される少なくとも 一つのプロテインチップに捕捉される、請求項 33に記載の使用。
[35] 前記プロテインチップが、逆相型プロテインチップおよび Zまたは陽イオン交換型 プロテインチップである、請求項 34に記載の使用。
[36] 前記血中タンパク質が、 pH4または 7において前記陽イオン交換型プロテインチッ プに捕捉される、請求項 33に記載の使用。
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Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009029731A (ja) * 2007-07-25 2009-02-12 Japan Health Science Foundation 膵癌の新規腫瘍マーカー
JP2010066225A (ja) * 2008-09-12 2010-03-25 Nagoya Univ 質量分析法を利用した複数癌腫の血液検出のための方法および生物マーカー
WO2010087434A1 (ja) * 2009-01-30 2010-08-05 財団法人 ヒューマンサイエンス振興財団 膵臓癌の検出法
JP2013506142A (ja) * 2009-10-01 2013-02-21 フェノメノーム ディスカバリーズ インク 膵臓癌の血清ベースのバイオマーカー並びに疾患検出及び診断のためのその使用
JP2013527464A (ja) * 2010-06-01 2013-06-27 メタノミクス ヘルス ゲーエムベーハー 対象において膵臓がんを診断する手段及び方法
WO2015050107A1 (ja) 2013-10-01 2015-04-09 東レ株式会社 膵腫瘍の検出方法、抗体及び膵腫瘍検出用キット
CN110214271A (zh) * 2017-01-19 2019-09-06 株式会社岛津制作所 分析数据解析方法以及分析数据解析装置
US11162956B2 (en) 2015-03-02 2021-11-02 Toray Industries, Inc. Method and kit for the detection of pancreatic dysfunction
WO2022202826A1 (ja) 2021-03-24 2022-09-29 東レ株式会社 悪性膵嚢胞性腫瘍の判定補助方法及び判定補助用キット

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK179161B1 (en) * 2016-05-26 2017-12-18 Man Diesel & Turbo Filial Af Man Diesel & Turbo Se Tyskland A large two-stroke compression-ignited internal combustion engine with fuel injection system for low flashpoint fuel and a fuel valve therefore

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003528296A (ja) * 1999-11-16 2003-09-24 マトリテック， インコーポレイテッド 質量に基づく分離を含む疾患マーカーの同定
JP2003532055A (ja) * 2000-03-20 2003-10-28 イースタン バージニア メディカル スクール 前立腺癌マーカー

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4424988B2 (ja) * 2001-09-25 2010-03-03 国立がんセンター総長 新規なスクリーニング法によるがんマーカーの探索

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003528296A (ja) * 1999-11-16 2003-09-24 マトリテック， インコーポレイテッド 質量に基づく分離を含む疾患マーカーの同定
JP2003532055A (ja) * 2000-03-20 2003-10-28 イースタン バージニア メディカル スクール 前立腺癌マーカー

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP1870711A4 *

Cited By (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009029731A (ja) * 2007-07-25 2009-02-12 Japan Health Science Foundation 膵癌の新規腫瘍マーカー
JP2010066225A (ja) * 2008-09-12 2010-03-25 Nagoya Univ 質量分析法を利用した複数癌腫の血液検出のための方法および生物マーカー
WO2010087434A1 (ja) * 2009-01-30 2010-08-05 財団法人 ヒューマンサイエンス振興財団 膵臓癌の検出法
US10024857B2 (en) 2009-10-01 2018-07-17 Med-Life Discoveries Lp Serum-based biomarkers of pancreatic cancer and uses thereof for disease detection and diagnosis
JP2013506142A (ja) * 2009-10-01 2013-02-21 フェノメノーム ディスカバリーズ インク 膵臓癌の血清ベースのバイオマーカー並びに疾患検出及び診断のためのその使用
US11079385B2 (en) 2009-10-01 2021-08-03 Med-Life Discoveries Lp Serum-based biomarkers of pancreatic cancer and uses thereof for disease detection and diagnosis
JP2014240841A (ja) * 2009-10-01 2014-12-25 フェノメノーム ディスカバリーズ インク 膵臓癌の血清ベースのバイオマーカー並びに疾患検出及び診断のためのその使用
US10656155B2 (en) 2009-10-01 2020-05-19 Med-Life Discoveries Lp Serum-based biomarkers of pancreatic cancer and uses thereof for disease detection and diagnosis
JP2013527464A (ja) * 2010-06-01 2013-06-27 メタノミクス ヘルス ゲーエムベーハー 対象において膵臓がんを診断する手段及び方法
KR101894111B1 (ko) 2010-06-01 2018-08-31 메타노믹스 헬스 게엠베하 대상체에서 췌장암을 진단하기 위한 수단 및 방법
KR20130119335A (ko) * 2010-06-01 2013-10-31 메타노믹스 헬스 게엠베하 대상체에서 췌장암을 진단하기 위한 수단 및 방법
KR20160065876A (ko) 2013-10-01 2016-06-09 도레이 카부시키가이샤 췌장 종양의 검출 방법, 항체 및 췌장 종양 검출용 키트
WO2015050107A1 (ja) 2013-10-01 2015-04-09 東レ株式会社 膵腫瘍の検出方法、抗体及び膵腫瘍検出用キット
US11162956B2 (en) 2015-03-02 2021-11-02 Toray Industries, Inc. Method and kit for the detection of pancreatic dysfunction
US11733250B2 (en) 2015-03-02 2023-08-22 Toray Industries, Inc. Method and kit for the detection of pancreatic dysfunction
CN110214271A (zh) * 2017-01-19 2019-09-06 株式会社岛津制作所 分析数据解析方法以及分析数据解析装置
CN110214271B (zh) * 2017-01-19 2022-11-15 株式会社岛津制作所 分析数据解析方法以及分析数据解析装置
WO2022202826A1 (ja) 2021-03-24 2022-09-29 東レ株式会社 悪性膵嚢胞性腫瘍の判定補助方法及び判定補助用キット
KR20230159454A (ko) 2021-03-24 2023-11-21 도레이 카부시키가이샤 악성 췌장 낭포성 종양의 판정 보조 방법 및 판정 보조용 키트

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