CN104447989A - 一种家蚕丝素蛋白抗体的制备方法 - Google Patents

一种家蚕丝素蛋白抗体的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种家蚕丝素蛋白抗体的制备方法，采用氯化钙乙醇体系提取丝素蛋白，然后将丝素蛋白作为完全抗原注射到家兔体内，进行动物免疫，得到丝素蛋白抗体。步骤如下：丝素蛋白提取：采用氯化钙乙醇体系提取；多肽免疫和抗血清制备：将丝素蛋白粉与弗氏佐剂混合乳化，在家兔皮下多点注射，并反复加强免疫，直到取抗血清检测抗体效价达到标准时停止免疫；抗体纯化：家兔抗体效价达到标准后，取血，使血块充分凝固，分离抗血清；家蚕丝素蛋白抗体的有效性是通过酶联免疫步骤鉴定，将获得的丝素蛋白抗体作为一抗，采用标准的酶联免疫方法，确认丝素蛋白抗体能够与丝素蛋白相互作用，可用于酶联免疫实验。

Description

一种家蚕丝素蛋白抗体的制备方法
技术领域
本发明属于生物抗体领域，尤其涉及一种利用丝素蛋白制备家蚕丝素蛋白多克隆抗体的方法。
背景技术
家蚕是一种高经济价值的吐丝昆虫，主要由丝素蛋白和丝胶蛋白构成。但是丝胶蛋白在缫丝的过程中容易脱落，因此，对丝绸的鉴定主要是对丝素蛋白的鉴定。丝绸作为人类智慧的结晶，起源问题研究近年来也越来越热，迫切需要一种更科学的方法来鉴定早期墓葬中的丝织品。以往鉴定古代丝织品的方法也比较多，但是由于受外界多种因素的影响，比如光照，酸，碱，微生物等环境因素，蚕丝大分子大部分已经降解成为肽段和氨基酸，采用传统的一些方法很难检测到丝素蛋白的存在，这样以来就很难探寻丝绸的起源，并且年代越早的证据越难寻觅。因此如何采用自然科学的先进手段，建立丝织品微痕检测技术体系，从印痕，残留物，土壤中提取古代丝绸的信息，对丝绸起源的研究非常迫切。目前蛋白质检测的先进技术是基于抗体-抗原的Western Blotting 或ELISA法，家蚕抗体的制备是该研究的一个关键的环节。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种家蚕丝素蛋白抗体的制备方法。
为此采用如下的技术方案：一种家蚕丝素蛋白抗体的制备方法，其特征在于采用如下步骤：
A）提取丝素蛋白：将桑蚕丝以1:100的浴比在质量浓度为0.5%的NaCO3溶液中沸煮30min进行脱胶，脱胶两次后得到丝素；将丝素用去离子水洗净，并于40-60℃的烘箱中放置12h；将烘干后的丝素在98±2℃的水浴中以1:25的浴比用质量浓度50%的CaCl2溶液溶解1.5h；将溶解了丝素蛋白的CaCl2溶液自然冷却至室温，然后过滤，用截留分子量为8000-14000的透析袋透析，并每隔4h换一次去离子水，72h后得到纯的丝素蛋白溶液；将丝素蛋白溶液浓缩后冷冻干燥24h；得到粘结成块的丝素蛋白，研磨后得到丝素蛋白粉；
B）用生理盐水将步骤A）得到的丝素蛋白稀释为1-2mg/ml，将稀释后的丝素蛋白与完全弗氏佐剂按体积比1:1混合，然后加入青霉素和链霉素进行乳化处理，得到初次免疫抗原乳化液；使用初次免疫抗原乳化液对兔子进行皮下多点注射，注射量为100μL，进行初次免疫；
C）用生理盐水将步骤A）得到的丝素蛋白稀释为0.5-1.5mg/ml，将稀释后的丝素蛋白与不完全弗氏佐剂按体积比1：1混合，然后加入青霉素和链霉素乳化处理，得到强免疫抗原乳化液；在完成步骤B）初次免疫后的第3周和第5周时，分别使用强免疫抗原乳化液对兔子进行皮下多点注射，注射量为100μL，进行加强免疫；
D）重复步骤C）所述的加强免疫，当兔子血样中的抗体效价达到1/20000时，杀死兔子并收集血液，分离得到抗血清；
E）将收集到的血液置于室温下凝固，然后将凝固血液置于37℃温箱内放置30min，再置于4℃冰箱中12h，使血块充分收缩并得到完全析出的抗血清；收集抗血清，在温度为4℃于3000g条件下离心15min，分装上清液，放置于-80℃储存备用；
F）准备1.5g的蛋白A填料，用6-7ml PH为7.4的磷酸盐缓冲溶液混合，搅拌后抽真空15min，得到无气泡的蛋白A填料；然后将蛋白A填料在保证无气泡的条件下加入到玻璃柱中，得到蛋白柱；用20ml、0.05mol/l、PH7.4的磷酸盐缓冲溶液对蛋白柱进行清洗，清洗流速为60ml/h；用0.05mol/l，PH7.4的磷酸盐缓冲溶液，将15ml的抗血清稀释至20ml，稀释后加入到蛋白柱中进行上样，重复上样一次；
用30ml、0.05mol/l、PH7.4的磷酸盐缓冲溶液对蛋白柱进行清洗，清洗流速为60ml/h；用PH 3.0、0.2mol/l的甘氨酸溶液对抗体进行洗脱；洗脱完成后用PH7.4、0.05mol/l的磷酸盐缓冲溶液洗涤蛋白柱，将得到纯化后的抗体装于离心管中并于4℃保存待用；
G）特异性检测：取步骤A）制得的丝素蛋白用质量浓度为1%的牛血清白蛋白溶液配制成1μg/ml的浓度包被在酶标板中12h，用PH7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤三次；每孔加入200μL，质量浓度为1%的牛血清白蛋白溶液在37℃下封闭2h；用PH7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤3次，然后将丝素蛋白抗体分别用质量浓度为1%的牛血清白蛋白溶液稀释1:240000，1:60000，1：20000，1:10000，1:5000，1:1000，1:200倍，每孔加入100μL丝素蛋白抗体，37℃下孵育1h，用PH7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤5次；每孔加入100μL的辣根过氧化酶标二抗，37℃下孵育1h，所述二抗采用质量浓度为1%的牛血清白蛋白稀释5000倍；最后每孔加入100μL的质量浓度为1%的四甲基联苯胺溶液于黑暗处显色，10min后，加入100μL 2mol/L的 H2SO4终止反应；用酶标仪测定OD450nm，根据OD450nm值，对抗原抗体的结合性等情况进行判断；当OD值达到阳性标准时就可以确定样品中含有丝素；若样品中不含有丝素，则OD就会低于阳性标准，根据此标准，可以快速的判断丝素蛋白的存在。
本发明的有益效果: 1）采用桑蚕丝直接提取出来的丝素蛋白多肽制备出来的多克隆抗体具有较强的特异性，经酶联免疫分析法分析知，该抗体能够与家蚕丝素蛋白具有明显的免疫反应，灵敏度很高，能够用于检测家蚕丝素蛋白。2）采用丝素蛋白多肽制备出来的多克隆抗体能够对古代丝织品中已经断裂的丝素蛋白分子做出检测，从而为中国早期墓葬中丝织品的检测提供了一种敏感、特异、快捷的辨识方法，为丝绸考古和起源问题提供了新的科学依据。
具体实施方式：
采用如下步骤：
A）提取丝素蛋白：将桑蚕丝以1:100的浴比在质量浓度为0.5%的NaCO3溶液中沸煮30min进行脱胶，脱胶两次后得到丝素；将丝素用去离子水洗净，并于40-60℃的烘箱中放置12h；将烘干后的丝素在98±2℃的水浴中以1:25的浴比用质量浓度50%的CaCl2溶液溶解1.5h；将溶解了丝素蛋白的CaCl2溶液自然冷却至室温，然后过滤，用截留分子量为8000-14000的透析袋透析，并每隔4h换一次去离子水，72h后得到纯的丝素蛋白溶液；将丝素蛋白溶液浓缩后冷冻干燥24h；得到粘结成块的丝素蛋白，研磨后得到丝素蛋白粉；
B）用生理盐水将步骤A）得到的丝素蛋白稀释为1-2mg/ml，将稀释后的丝素蛋白与完全弗氏佐剂按体积比1:1混合，然后加入青霉素和链霉素进行乳化处理，得到初次免疫抗原乳化液；使用初次免疫抗原乳化液对兔子进行皮下多点注射，注射量为100μL，进行初次免疫；
C）用生理盐水将步骤A）得到的丝素蛋白稀释为0.5-1.5mg/ml，将稀释后的丝素蛋白与不完全弗氏佐剂按体积比1：1混合，然后加入青霉素和链霉素乳化处理，得到强免疫抗原乳化液；在完成步骤B）初次免疫后的第3周和第5周时，分别使用强免疫抗原乳化液对兔子进行皮下多点注射，注射量为100μL，进行加强免疫；
D）重复步骤C）所述的加强免疫，当兔子血样中的抗体效价达到1/20000时，杀死兔子并收集血液，分离得到抗血清；
E）将收集到的血液置于室温下凝固，然后将凝固血液置于37℃温箱内放置30min，再置于4℃冰箱中12h，使血块充分收缩并得到完全析出的抗血清；收集抗血清，在温度为4℃于3000g条件下离心15min，分装上清液，放置于-80℃储存备用；
F）准备1.5g的蛋白A填料，用6-7ml PH为7.4的磷酸盐缓冲溶液混合，搅拌后抽真空15min，得到无气泡的蛋白A填料；然后将蛋白A填料在保证无气泡的条件下加入到玻璃柱中，得到蛋白柱；用20ml、0.05mol/l、PH7.4的磷酸盐缓冲溶液对蛋白柱进行清洗，清洗流速为60ml/h；用0.05mol/l，PH7.4的磷酸盐缓冲溶液，将15ml的抗血清稀释至20ml，稀释后加入到蛋白柱中进行上样，重复上样一次；
用30ml、0.05mol/l、PH7.4的磷酸盐缓冲溶液对蛋白柱进行清洗，清洗流速为60ml/h；用PH 3.0、0.2mol/l的甘氨酸溶液对抗体进行洗脱；洗脱完成后用PH7.4、0.05mol/l的磷酸盐缓冲溶液洗涤蛋白柱，将得到纯化后的抗体装于离心管中并于4℃保存待用；
G）特异性检测：取步骤A）制得的丝素蛋白用质量浓度为1%的牛血清白蛋白溶液配制成1μg/ml的浓度包被在酶标板中12h，用PH7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤三次；每孔加入200μL，质量浓度为1%的牛血清白蛋白溶液在37℃下封闭2h；用PH7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤3次，然后将丝素蛋白抗体分别用质量浓度为1%的牛血清白蛋白溶液稀释1:240000，1:60000，1：20000，1:10000，1:5000，1:1000，1:200倍，每孔加入100μL丝素蛋白抗体，37℃下孵育1h，用PH7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤5次；每孔加入100μL的辣根过氧化酶标二抗，37℃下孵育1h，所述二抗采用质量浓度为1%的牛血清白蛋白稀释5000倍；最后每孔加入100μL的质量浓度为1%的四甲基联苯胺溶液于黑暗处显色，10min后，加入100μL 2mol/L的 H2SO4终止反应；用酶标仪测定OD450nm，根据OD450nm值，对抗原抗体的结合性等情况进行判断；结果显示除空白对照呈无色外，样品孔呈黄色。用酶标板测定OD450nm处的吸光度的结果为：对纯化后的抗体进行240000、60000、20000、10000、5000、1000、200倍稀释后得到的OD450nm值分别为0.316、0.561、1.044、1.574、1.674、1.965、2.11，空白对照的OD值为0.042。按照平台OD450nm值达到0.6为阳性要求，即使将制备的抗体稀释至60000倍，仍能检测到丝素蛋白的阳性信号，显色清晰，结果明确。从以上结果可以说明，由本发明方法制备的抗体对丝素的反应灵敏度极高，所需要的抗原量极少，且操作简便，投入小，宜大规模推广利用。

Claims (1)

1.一种家蚕丝素蛋白抗体的制备方法，其特征在于采用如下步骤：
A）提取丝素蛋白：将桑蚕丝以1:100的浴比在质量浓度为0.5%的NaCO3溶液中沸煮30min进行脱胶，脱胶两次后得到丝素；将丝素用去离子水洗净，并于40-60℃的烘箱中放置12h；将烘干后的丝素在98±2℃的水浴中以1:25的浴比用质量浓度50%的CaCl2溶液溶解1.5h；将溶解了丝素蛋白的CaCl2溶液自然冷却至室温，然后过滤，用截留分子量为8000-14000的透析袋透析，并每隔4h换一次去离子水，72h后得到纯的丝素蛋白溶液；将丝素蛋白溶液浓缩后冷冻干燥24h；得到粘结成块的丝素蛋白，研磨后得到丝素蛋白粉；
B）用生理盐水将步骤A）得到的丝素蛋白稀释为1-2mg/ml，将稀释后的丝素蛋白与完全弗氏佐剂按体积比1:1混合，然后加入青霉素和链霉素进行乳化处理，得到初次免疫抗原乳化液；使用初次免疫抗原乳化液对兔子进行皮下多点注射，注射量为100μL，进行初次免疫；
C）用生理盐水将步骤A）得到的丝素蛋白稀释为0.5-1.5mg/ml，将稀释后的丝素蛋白与不完全弗氏佐剂按体积比1：1混合，然后加入青霉素和链霉素乳化处理，得到强免疫抗原乳化液；在完成步骤B）初次免疫后的第3周和第5周时，分别使用强免疫抗原乳化液对兔子进行皮下多点注射，注射量为100μL，进行加强免疫；
D）重复步骤C）所述的加强免疫，当兔子血样中的抗体效价达到1/20000时，杀死兔子并收集血液，分离得到抗血清；
E）将收集到的血液置于室温下凝固，然后将凝固血液置于37℃温箱内放置30min，再置于4℃冰箱中12h，使血块充分收缩并得到完全析出的抗血清；收集抗血清，在温度为4℃于3000g条件下离心15min，分装上清液，放置于-80℃储存备用；
F）准备1.5g的蛋白A填料，用6-7ml PH为7.4的磷酸盐缓冲溶液混合，搅拌后抽真空15min，得到无气泡的蛋白A填料；然后将蛋白A填料在保证无气泡的条件下加入到玻璃柱中，得到蛋白柱；用20ml、0.05mol/l、PH7.4的磷酸盐缓冲溶液对蛋白柱进行清洗，清洗流速为60ml/h；用0.05mol/l，PH7.4的磷酸盐缓冲溶液，将15ml的抗血清稀释至20ml，稀释后加入到蛋白柱中进行上样，重复上样一次；
用30ml、0.05mol/l、PH7.4的磷酸盐缓冲溶液对蛋白柱进行清洗，清洗流速为60ml/h；用PH 3.0、0.2mol/l的甘氨酸溶液对抗体进行洗脱；洗脱完成后用PH7.4、0.05mol/l的磷酸盐缓冲溶液洗涤蛋白柱，将得到纯化后的抗体装于离心管中并于4℃保存待用；
G）特异性检测：取步骤A）制得的丝素蛋白用质量浓度为1%的牛血清白蛋白溶液配制成1μg/ml的浓度包被在酶标板中12h，用PH7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤三次；每孔加入200μL，质量浓度为1%的牛血清白蛋白溶液在37℃下封闭2h；用PH7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤3次，然后将丝素蛋白抗体分别用质量浓度为1%的牛血清白蛋白溶液稀释1:240000，1:60000，1：20000，1:10000，1:5000，1:1000，1:200倍，每孔加入100μL丝素蛋白抗体，37℃下孵育1h，用PH7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤5次；每孔加入100μL的辣根过氧化酶标二抗，37℃下孵育1h，所述二抗采用质量浓度为1%的牛血清白蛋白稀释5000倍；最后每孔加入100μL的质量浓度为1%的四甲基联苯胺溶液于黑暗处显色，10min后，加入100μL 2mol/L的 H2SO4终止反应；用酶标仪测定OD450nm，根据OD450nm值，对抗原抗体的结合性等情况进行判断；当OD值达到阳性标准时就可以确定样品中含有丝素；若样品中不含有丝素，则OD就会低于阳性标准，根据此标准，可以判断丝素蛋白的存在。
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