CN105601738B - 一种山羊角蛋白抗体的制备方法 - Google Patents

一种山羊角蛋白抗体的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及文物考古技术领域，公开了一种山羊角蛋白抗体的制备方法，包括：A）角蛋白提取；B）抗原制备、免疫、血液收集；C）抗血清分离；D）抗体的制备。本发明方法制备的山羊角蛋白抗体对山羊角蛋白的反应灵敏度高，所需使用的抗原量极少。

Description

一种山羊角蛋白抗体的制备方法
技术领域
本发明涉及文物考古技术领域，尤其涉及羊毛制品文物检测领域。
背景技术
山羊粗毛可造毛笔、马鬃尾制刷之类，而山羊绒具有细、轻、柔软、滑糯、保暖性优良等特点，是一种贵重的纺织原料。
中国古代在北方地区山羊毛织品广泛应用于服饰和毛毯，而在南方地区山羊毛多用于毛笔、刷制品。中国历史悠久，从中国早期的墓葬中出土有大量的羊毛制品，出土的大量山羊毛制品对研究古代社会环境和人文活动具有重要参考价值。
对山羊毛制品的鉴定主要是对山羊角蛋白的鉴定。山羊毛角蛋白是一种硬化，不易溶解的蛋白质，其中既有含羧基等在内的酸性基，也有含胺基，亚胺基等在内的碱性基，所以在酸、碱、盐、氧化剂、还原剂、卤素等中羊毛都具有一定的不稳定性。这对山羊毛制品的鉴别造成了一定困难。
目前，蛋白质检测技术如基于抗原-抗体结合的酶联免疫技术是一种广泛用于文物检测的先进技术，而前期的羊毛羊角蛋白抗体制备是一大难题。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种山羊角蛋白抗体的制备方法。本发明方法制备的山羊角蛋白抗体对山羊角蛋白的反应灵敏度高，所需使用的抗原量极少。
本发明的具体技术方案为：一种山羊角蛋白抗体的制备方法，步骤如下：
A）配制6-8wt%的一硫酸氢钾水溶液，用饱和氢氧化钠溶液将一硫酸氢钾水溶液的pH调节为3.5-5；接着按1:（50-65）的浴比将山羊毛添加到溶液中，在30-35℃下水浴震荡0.5-1.5h；然后取出羊毛并水洗至中性；将羊毛加入到其60-100倍质量的混合溶液A中，在95-105℃下反应3.5-4.5h后过滤，得到粗角蛋白溶液，将粗角蛋白溶液透析、冷冻干燥后制得山羊角蛋白粉。
本发明方法提取制得的山羊角蛋白粉，纯度高，复配成抗原液后效果好。
B）用生理盐水将上述制得的山羊角蛋白粉配制成0.75-1.25mg/mL的角蛋白溶液，将角蛋白溶液与Quick Antibody-Rabbit 5W佐剂按体积比1:(0.8-1.1)混合，得到免疫抗原液，使用免疫抗原液对兔子进行皮下多点注射，进行初次免疫；在初次免疫后的第3、5周时，使用免疫抗原液对兔子进行皮下多点注射，进行加强免疫；在进行初次免疫后的第7、9周时，使用免疫抗原液对兔子进行皮下多点注射，进行再加强免疫；当兔子血样中的抗体效价达到 1:20000 时，收集兔子血液。
本发明使用的Quick Antibody-Rabbit 5W佐剂无毒无害，不含蛋白质成分，不破坏抗原天然构型，而且免疫方式简单，无需乳化抗原，只需要简单混合即可免疫，同时免疫周期短，抗原用量少。
C）从上述收集的血液中分离得到抗血清。
D）将蛋白A填料与磷酸盐缓冲溶液混合，搅拌后抽真空 20-25min，得到无气泡的蛋白A填料液；将蛋白A填料液在无气泡条件下加入到玻璃柱中，得到蛋白柱；对蛋白柱进行清洗；对上述制得的抗血清进行稀释，稀释后加入到蛋白柱中进行上样，重复上样一次；对蛋白柱再次清洗，用甘氨酸溶液对抗体进行洗脱，洗脱后清洗蛋白柱，制得抗体。
本发明采用山羊角蛋白制备而得的抗体具有较强的特异性，该抗体能够与山羊角蛋白具有明显的免疫反应，灵敏度高，能够对古代山羊毛制品中已经断裂的山羊角蛋白分子做出检测。
作为优选，骤A）中的所述混合溶液A由亚硫酸氢钠、尿素、十二烷基苯磺酸钠和水组成；其中亚硫酸氢钠的浓度为6wt %，尿素的浓度为6M，十二烷基苯磺酸钠的浓度为1 wt%。
本发明的混合溶液A中，由于山羊毛的鳞片层以及皮质层相对较厚，需要严格控制亚硫酸氢钠的用量，亚硫酸氢钠能够迅速打开羊毛硫蛋白中的二硫键，使羊毛鳞片层受损，从而利于溶剂进入皮质层。尿素的能够加快溶解羊毛的速度。而十二烷基苯磺酸钠能够降低溶液表面张力，促使溶液渗透进入羊毛内部，增加羊毛的溶解率。同时亚硫酸氢钠以及十二烷基苯磺酸钠的钠离子具有强烈水化能力，对羊毛产生溶胀作用，使得皮质层中的物质溶出。本发明采用阴离子表面活性剂十二烷基苯磺酸钠，成本低，临界胶束浓度低，用量少。
作为优选，步骤A）中的所述混合溶液A由亚硫酸氢钠、尿素、皂素、十二烷基苯磺酸钠和水组成；其中亚硫酸氢钠的浓度为6wt %，尿素的浓度为6M，皂素的浓度为0.5wt%，十二烷基苯磺酸钠的浓度为0.8 wt %。
上述混合溶液A中的皂素为天然非离子表面活性剂，与十二烷基苯磺酸钠复配使用后，对羊毛的渗透能力更强，对角蛋白的提取率有提高作用。
作为优选，步骤A）中所述粗角蛋白液溶液的透析方法如下：将粗角蛋白液溶液装入截留分子量为14000的透析袋中，将透析袋浸泡于50-100倍质量的去离子水中透析4-5天，每隔7-9h更换去离子水，最后得到纯净角蛋白溶液。
作为优选，在对兔子进行初次免疫、加强免疫以及再加强免疫过程中，每个注射点的注射量为100μL。
作为优选，在步骤C）中，从血液中分离得到抗血清的方法为：将收集到的血液置于室温下凝固，然后将凝固血液置于 36-38℃的温箱内放置25-35min，再置于4℃的冰箱中11-13h，使血块充分收缩并得到完全析出的粗抗血清；收集粗抗血清，在4℃环境中，在3000g 条件下离心14-16min，取上清液，放置于-80℃储存备用。
作为优选，步骤D）的具体过程为：
将蛋白A填料与磷酸盐缓冲溶液按1.5g/（6-7）mL的配比混合，搅拌后抽真空 20-25min，得到无气泡的蛋白A填料液；然后将6-7体积份的蛋白A填料液在无气泡条件下加入到玻璃柱中，得到蛋白柱；用20体积份的磷酸盐缓冲溶液对蛋白柱进行清洗，清洗流速为60mL/h；用磷酸盐缓冲溶液将15体积份的抗血清稀释至20mL，稀释后加入到蛋白柱中进行上样，重复上样一次；用30体积份的磷酸盐缓冲溶液对蛋白柱再次清洗，清洗流速为60mL/h；用浓度为0.2mol/L、pH为3.0的甘氨酸溶液对抗体进行洗脱；洗脱后用磷酸盐缓冲溶液洗涤蛋白柱，制得抗体，将抗体装于离心管中并于4℃保存待用。
作为优选，步骤D）中所用的磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.05mol/L，pH为7.4。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：本发明方法制备的山羊角蛋白抗体对山羊角蛋白的反应灵敏度高，所需使用的抗原量极少。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1
一种山羊角蛋白抗体的制备方法，步骤如下：
A）配制7wt%的一硫酸氢钾水溶液，用饱和氢氧化钠溶液将一硫酸氢钾水溶液的pH调节为4。接着按1:58的浴比将山羊毛添加到溶液中，在32℃下水浴震荡1h。然后取出羊毛并用蒸馏水水洗过滤直至水洗液pH值为7。将羊毛加入到其80倍质量的混合溶液A中，所述混合溶液A中亚硫酸氢钠的浓度为6wt %，尿素的浓度为6M，十二烷基苯磺酸钠的浓度为1wt %。在100℃下反应4h后过滤，得到粗角蛋白溶液，将粗角蛋白溶液装入截留分子量为14000的透析袋中，将透析袋浸泡于50-100倍质量的去离子水中透析4.5天，每隔8h更换去离子水，得到纯净角蛋白溶液，冷冻干燥后制得山羊角蛋白粉。
B）用生理盐水将上述制得的山羊角蛋白粉配制成1mg/mL的角蛋白溶液，将角蛋白溶液与Quick Antibody-Rabbit 5W佐剂按体积比1:0.95混合，得到免疫抗原液，使用免疫抗原液对兔子进行皮下多点注射，进行初次免疫；在初次免疫后的第3、5周时，使用免疫抗原液对兔子进行皮下多点注射，进行加强免疫；在进行初次免疫后的第7、9周时，使用免疫抗原液对兔子进行皮下多点注射，进行再加强免疫。在对兔子进行初次免疫、加强免疫以及再加强免疫过程中，每个注射点的注射量为 100μL。当兔子血样中的抗体效价达到 1:20000 时，收集兔子血液。
C）将收集到的血液置于室温下凝固，然后将凝固血液置于 37℃的温箱内放置30min，再置于4℃的冰箱中12h，使血块充分收缩并得到完全析出的粗抗血清；收集粗抗血清，在4℃环境中，在3000g 条件下离心15min，取上清液即为抗血清，放置于-80℃储存备用。
D）将蛋白A填料与磷酸盐缓冲溶液按1.5g/6.5mL的配比混合，搅拌后抽真空22min，得到无气泡的蛋白A填料液；然后将6.5体积份的蛋白A填料液在无气泡条件下加入到玻璃柱中，得到蛋白柱；用20体积份的浓度为0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液对蛋白柱进行清洗，清洗流速为60mL/h；用浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液将15体积份的抗血清稀释至20体积份，稀释后加入到蛋白柱中进行上样，重复上样一次；用30体积份的浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液对蛋白柱再次清洗，清洗流速为60mL/h；用浓度为0.2mol/L、pH为3.0的甘氨酸溶液对抗体进行洗脱；洗脱后用0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液洗涤蛋白柱，制得抗体，将抗体装于离心管中并于4℃保存待用。上述所用的磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.05mol/L，pH为7.4。
E）特异性检测：取步骤 A）制得的山羊角蛋白用质量浓度为1%的牛血清白蛋白溶液配制成1μg/mL的浓度包被在酶标板中12h，用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤三次。每孔加入200μL，质量浓度为1%的牛血清白蛋白溶液在37℃下封闭2h ；用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤3次，然后将山羊角蛋白抗体分别用质量浓度为1%的牛血清白蛋白溶液稀释1:240000，1:60000，1： 20000，1:10000，1:5000，1:1000，1:200倍，每孔加入100μL山羊角蛋白抗体，37℃下孵育1h，用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤5次；每孔加入100μL的辣根过氧化酶标二抗，37℃下孵育1h，所述二抗采用质量浓度为1%的牛血清白蛋白稀释5000倍；最后每孔加入100μL的质量浓度为1%的四甲基联苯胺溶液于黑暗处显色，10min后，加入100μL 2mol/L的H2SO4终止反应；用酶标仪测定OD450nm，根据OD450nm值，对抗原抗体的结合性等情况进行判断；当OD值达到阳性标准时就可以确定样品中含有山羊毛；若样品中不含有山羊毛，则OD 就会低于阳性标准，根据此标准，可以判断山羊角蛋白的存在。
结果显示除空白对照呈无色外，样品孔呈黄色。用酶标板测定OD450nm处的吸光度的结果为：对纯化后的抗体进行240000、 60000、20000、10000、5000、1000、200倍稀释后得到的OD450nm值分别为0.298、0.476、0.934、1.477、1.579、1.825、2.093，空白对照的OD值为0.044。按照平台 OD450nm值达到0.6为阳性要求，即使将制备的抗体稀释至20000倍，仍能检测到山羊角蛋白的阳性信号，显色清晰，结果明确。从以上结果可以说明，由本发明方法制备的抗体对山羊角的反应灵敏度极高，所需要的抗原量极少，且操作简便，投入小，宜大规模 推广利用。
实施例2
一种山羊角蛋白抗体的制备方法，步骤如下：
A）配制7wt%的一硫酸氢钾水溶液，用饱和氢氧化钠溶液将一硫酸氢钾水溶液的pH调节为4.2。接着按1:57的浴比将山羊毛添加到溶液中，在33℃下水浴震荡1h。然后取出羊毛并用蒸馏水水洗过滤直至水洗液pH值为7。将羊毛加入到其80倍质量的混合溶液A中，所述混合溶液A中亚硫酸氢钠的浓度为6wt %，尿素的浓度为6M，皂素的浓度为0.5wt%，十二烷基苯磺酸钠的浓度为0.8 wt %。在100℃下反应4h后过滤，得到粗角蛋白溶液，将粗角蛋白溶液装入截留分子量为14000的透析袋中，将透析袋浸泡于50-100倍质量的去离子水中透析4.5天，每隔8h更换去离子水，得到纯净角蛋白溶液，冷冻干燥后制得山羊角蛋白粉。
B）用生理盐水将上述制得的山羊角蛋白粉配制成1mg/mL的角蛋白溶液，将角蛋白溶液与Quick Antibody-Rabbit 5W佐剂按体积比1:1混合，得到免疫抗原液，使用免疫抗原液对兔子进行皮下多点注射，进行初次免疫；在初次免疫后的第3、5周时，使用免疫抗原液对兔子进行皮下多点注射，进行加强免疫；在进行初次免疫后的第7、9周时，使用免疫抗原液对兔子进行皮下多点注射，进行再加强免疫。在对兔子进行初次免疫、加强免疫以及再加强免疫过程中，每个注射点的注射量为 100μL。当兔子血样中的抗体效价达到 1:20000时，收集兔子血液。
C）将收集到的血液置于室温下凝固，然后将凝固血液置于 37℃的温箱内放置30min，再置于4℃的冰箱中12h，使血块充分收缩并得到完全析出的粗抗血清；收集粗抗血清，在4℃环境中，在3000g 条件下离心15min，取上清液即为抗血清，放置于-80℃储存备用。
D）将蛋白A填料与磷酸盐缓冲溶液按1.5g/6.5mL的配比混合，搅拌后抽真空23min，得到无气泡的蛋白A填料液；然后将6.5体积份的蛋白A填料液在无气泡条件下加入到玻璃柱中，得到蛋白柱；用20体积份的浓度为0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液对蛋白柱进行清洗，清洗流速为60mL/h；用浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液将15体积份的抗血清稀释至20体积份，稀释后加入到蛋白柱中进行上样，重复上样一次；用30体积份的浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液对蛋白柱再次清洗，清洗流速为60mL/h；用浓度为0.2mol/L、pH为3.0的甘氨酸溶液对抗体进行洗脱；洗脱后用0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液洗涤蛋白柱，制得抗体，将抗体装于离心管中并于4℃保存待用。上述所用的磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.05mol/L，pH为7.4。
实施例3
一种山羊角蛋白抗体的制备方法，步骤如下：
A）配制6wt%的一硫酸氢钾水溶液，用饱和氢氧化钠溶液将一硫酸氢钾水溶液的pH调节为3.5。接着按1: 50的浴比将山羊毛添加到溶液中，在30℃下水浴震荡1.5h。然后取出羊毛并用蒸馏水水洗过滤直至水洗液pH值为7。将羊毛加入到其60倍质量的混合溶液A中，所述混合溶液A中亚硫酸氢钠的浓度为6wt %，尿素的浓度为6M，皂素的浓度为0.5wt%，十二烷基苯磺酸钠的浓度为0.8 wt %。在95℃下反应4.5h后过滤，得到粗角蛋白溶液，将粗角蛋白溶液装入截留分子量为14000的透析袋中，将透析袋浸泡于50倍质量的去离子水中透析5天，每隔7h更换去离子水，得到纯净角蛋白溶液，冷冻干燥后制得山羊角蛋白粉。
B）用生理盐水将上述制得的山羊角蛋白粉配制成0.75mg/mL的角蛋白溶液，将角蛋白溶液与Quick Antibody-Rabbit 5W佐剂按体积比1:0.8混合，得到免疫抗原液，使用免疫抗原液对兔子进行皮下多点注射，进行初次免疫；在初次免疫后的第3、5周时，使用免疫抗原液对兔子进行皮下多点注射，进行加强免疫；在进行初次免疫后的第7、9周时，使用免疫抗原液对兔子进行皮下多点注射，进行再加强免疫。在对兔子进行初次免疫、加强免疫以及再加强免疫过程中，每个注射点的注射量为 100μL。当兔子血样中的抗体效价达到 1:20000 时，收集兔子血液。
C）将收集到的血液置于室温下凝固，然后将凝固血液置于 36℃的温箱内放置35min，再置于4℃的冰箱中11h，使血块充分收缩并得到完全析出的粗抗血清；收集粗抗血清，在4℃环境中，在3000g 条件下离心14min，取上清液即为抗血清，放置于-80℃储存备用。
D）将蛋白A填料与磷酸盐缓冲溶液按1.5g/6mL的配比混合，搅拌后抽真空 20min，得到无气泡的蛋白A填料液；然后将6体积份的蛋白A填料液在无气泡条件下加入到玻璃柱中，得到蛋白柱；用20体积份的浓度为0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液对蛋白柱进行清洗，清洗流速为60mL/h；用浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液将15体积份的抗血清稀释至20体积份，稀释后加入到蛋白柱中进行上样，重复上样一次；用30体积份的浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液对蛋白柱再次清洗，清洗流速为60mL/h；用浓度为0.2mol/L、pH为3.0的甘氨酸溶液对抗体进行洗脱；洗脱后用0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液洗涤蛋白柱，制得抗体，将抗体装于离心管中并于4℃保存待用。上述所用的磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.05mol/L，pH为7.4。
实施例4
一种山羊角蛋白抗体的制备方法，步骤如下：
A）配制8wt%的一硫酸氢钾水溶液，用饱和氢氧化钠溶液将一硫酸氢钾水溶液的pH调节为5。接着按1: 65的浴比将山羊毛添加到溶液中，在35℃下水浴震荡0.5h。然后取出羊毛并用蒸馏水水洗过滤直至水洗液pH值为7。将羊毛加入到其100倍质量的混合溶液A中，所述混合溶液A中亚硫酸氢钠的浓度为6wt %，尿素的浓度为6M，皂素的浓度为0.5wt%，十二烷基苯磺酸钠的浓度为0.8 wt %。在105℃下反应3.5h后过滤，得到粗角蛋白溶液，将粗角蛋白溶液装入截留分子量为14000的透析袋中，将透析袋浸泡于100倍质量的去离子水中透析4天，每隔9h更换去离子水，得到纯净角蛋白溶液，冷冻干燥后制得山羊角蛋白粉。
B）用生理盐水将上述制得的山羊角蛋白粉配制成1.25mg/mL的角蛋白溶液，将角蛋白溶液与Quick Antibody-Rabbit 5W佐剂按体积比1: 1.1混合，得到免疫抗原液，使用免疫抗原液对兔子进行皮下多点注射，进行初次免疫；在初次免疫后的第3、5周时，使用免疫抗原液对兔子进行皮下多点注射，进行加强免疫；在进行初次免疫后的第7、9周时，使用免疫抗原液对兔子进行皮下多点注射，进行再加强免疫。在对兔子进行初次免疫、加强免疫以及再加强免疫过程中，每个注射点的注射量为 100μL。当兔子血样中的抗体效价达到 1:20000 时，收集兔子血液。
C）将收集到的血液置于室温下凝固，然后将凝固血液置于 38℃的温箱内放置25min，再置于4℃的冰箱中13h，使血块充分收缩并得到完全析出的粗抗血清；收集粗抗血清，在4℃环境中，在3000g 条件下离心16min，取上清液即为抗血清，放置于-80℃储存备用。
D）将蛋白A填料与磷酸盐缓冲溶液按1.5g/7mL的配比混合，搅拌后抽真空25min，得到无气泡的蛋白A填料液；然后将7体积份的蛋白A填料液在无气泡条件下加入到玻璃柱中，得到蛋白柱；用20体积份的浓度为0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液对蛋白柱进行清洗，清洗流速为60mL/h；用浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液将15体积份的抗血清稀释至20体积份，稀释后加入到蛋白柱中进行上样，重复上样一次；用30体积份的浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液对蛋白柱再次清洗，清洗流速为60mL/h；用浓度为0.2mol/L、pH为3.0的甘氨酸溶液对抗体进行洗脱；洗脱后用0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液洗涤蛋白柱，制得抗体，将抗体装于离心管中并于4℃保存待用。上述所用的磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.05mol/L，pH为7.4。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (6)

1.一种山羊角蛋白抗体的制备方法，其特征在于步骤如下：
A）配制6-8wt%的一硫酸氢钾水溶液，用饱和氢氧化钠溶液将一硫酸氢钾水溶液的pH调节为3.5-5；接着按1:（50-65）的浴比将山羊毛添加到溶液中，在30-35℃下水浴震荡0.5-1.5h；然后取出羊毛并水洗至中性；将羊毛加入到其60-100倍质量的混合溶液A中，在95-105℃下反应3.5-4.5h后过滤，得到粗角蛋白溶液，将粗角蛋白溶液透析、冷冻干燥后制得山羊角蛋白粉；所述混合溶液A由亚硫酸氢钠、尿素、皂素、十二烷基苯磺酸钠和水组成；其中亚硫酸氢钠的浓度为6wt %，尿素的浓度为6M，皂素的浓度为0.5wt%，十二烷基苯磺酸钠的浓度为0.8 wt %；
B）用生理盐水将上述制得的山羊角蛋白粉配制成0.75-1.25mg/mL的角蛋白溶液，将角蛋白溶液与Quick Antibody-Rabbit 5W佐剂按体积比1:(0.8-1.1)混合，得到免疫抗原液，使用免疫抗原液对兔子进行皮下多点注射，进行初次免疫；在初次免疫后的第3、5周时，使用免疫抗原液对兔子进行皮下多点注射，进行加强免疫；在进行初次免疫后的第7、9周时，使用免疫抗原液对兔子进行皮下多点注射，进行再加强免疫；当兔子血样中的抗体效价达到 1:20000 时，收集兔子血液；
C）从上述收集的血液中分离得到抗血清；
D）将蛋白A填料与磷酸盐缓冲溶液混合，搅拌后抽真空 20-25min，得到无气泡的蛋白A填料液；将蛋白A填料液在无气泡条件下加入到玻璃柱中，得到蛋白柱；对蛋白柱进行清洗；对上述制得的抗血清进行稀释，稀释后加入到蛋白柱中进行上样，重复上样一次；对蛋白柱再次清洗，用甘氨酸溶液对抗体进行洗脱，洗脱后清洗蛋白柱，制得抗体。
2.如权利要求1所述的一种山羊角蛋白抗体的制备方法，其特征在于，步骤A）中所述粗角蛋白液溶液的透析方法如下：将粗角蛋白液溶液装入截留分子量为14000的透析袋中，将透析袋浸泡于50-100倍质量的去离子水中透析4-5天，每隔7-9h更换去离子水，最后得到纯净角蛋白溶液。
3.如权利要求1所述的一种山羊角蛋白抗体的制备方法，其特征在于，在对兔子进行初次免疫、加强免疫以及再加强免疫过程中，每个注射点的注射量为 100μL。
4.如权利要求1所述的一种山羊角蛋白抗体的制备方法，其特征在于，在步骤C）中，从血液中分离得到抗血清的方法为：将收集到的血液置于室温下凝固，然后将凝固血液置于36-38℃的温箱内放置25-35min，再置于4℃的冰箱中11-13h，使血块充分收缩并得到完全析出的粗抗血清；收集粗抗血清，在4℃环境中，在3000g 条件下离心14-16min，取上清液，放置于-80℃储存备用。
5.如权利要求1或4所述的一种山羊角蛋白抗体的制备方法，其特征在于，步骤D）的具体过程为：
将蛋白A填料与磷酸盐缓冲溶液按1.5g/（6-7）mL的配比混合，搅拌后抽真空 20-25min，得到无气泡的蛋白A填料液；然后将6-7体积份的蛋白A填料液在无气泡条件下加入到玻璃柱中，得到蛋白柱；用20体积份的磷酸盐缓冲溶液对蛋白柱进行清洗，清洗流速为60mL/h；用磷酸盐缓冲溶液将15体积份的抗血清稀释至20体积份，稀释后加入到蛋白柱中进行上样，重复上样一次；用30体积份的磷酸盐缓冲溶液对蛋白柱再次清洗，清洗流速为60mL/h；用浓度为0.2mol/L、pH为3.0的甘氨酸溶液对抗体进行洗脱；洗脱后用磷酸盐缓冲溶液洗涤蛋白柱，制得抗体，将抗体装于离心管中并于4℃保存待用。
6.如权利要求5所述的一种山羊角蛋白抗体的制备方法，其特征在于，步骤D）中所用的磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.05mol/L，pH为7.4。
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