JP7486821B2 - 患者由来アミロイド異種移植非ヒト動物モデル - Google Patents
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Description
本発明は、インビボ動物モデルの分野、具体的には、患者由来アミロイド異種移植（ＰＤＡＸ）非ヒト動物モデル、その使用、およびＰＤＡＸモデルを作製する方法に関する。本発明はまた、アミロイドーシスまたはアミロイド関連疾患を治療できる抗アミロイド薬を決定／獲得し、特徴づけ、検証し、開発し、および／または品質管理する方法およびプロセスならびにその薬学的組成物を製造する方法およびプロセスに関する。
アミロイドーシスは、不溶性原線維の形をとって凝集する特定の可溶性前駆タンパク質の細胞外沈着により特徴づけられるタンパク質フォールディング疾患である；概説として、Ｈａｚｅｎｂｅｒｇ、Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ． ３９（２０１３）、３２３～３４５を参照。直径がおよそ１０ｎｍである、これらの強固でかつ分岐していない原線維は、通常、逆平行立体配置に配置されたペプチドで構成される、分子βプリーツシート構造により特徴づけられる。原線維のこの構造は、それの不溶性、タンパク質分解に対する抵抗性、ならびにアミロイド特異的コンゴレッドおよびチオフラビンＳ色素に対する結合親和性の原因となる。以下の３つの機構が、独立してまたは相まって、作動するように思われる：その前駆タンパク質は、加齢に伴って（野生型トランスサイレチン）または高血清レベルにおいて（血清アミロイドＡタンパク質および免疫グロブリン遊離軽鎖）顕著になる、ミスフォールドする内在性性向を有し得る；遺伝性または後天性変異型タンパク質（トランスサイレチン）；ならびに前駆タンパク質（β－アミロイド前駆タンパク質）のタンパク質分解性リモデリング。細胞外マトリックスとの相互作用もまた、重要であるように思われ、いくつかの器官または組織におけるアミロイドの優先的沈着に関係し得る。器官および組織におけるアミロイド線維の細胞外沈着は、結果として、冒された器官の進行性機能喪失をもたらす組織浸潤および膨潤を生じる。
アミロイドーシスは、沈着が、脳におけるアミロイドβタンパク質斑を有するアルツハイマー病、または膵臓のランゲルハンス島におけるアミロイドアミリン沈着を有する２型糖尿病のような身体の１つの器官または部位に限定されている限局型と、原線維沈着が身体中の様々な器官および組織に生じる全身型とに大まかに区別される。最も頻度の高い全身性アミロイドーシスの１つが、アミロイドトランスサイレチン（ＡＴＴＲ）アミロイドーシスであり、それにおいては、ＡＴＴＲ原線維が、複数の器官および組織に蓄積し、急速な疾患進行および致死的な結果を伴う、多臓器機能不全をもたらす。
ＡＴＴＲアミロイドーシスは、心筋症（ＡＴＴＲ－ＣＭ）をもたらす心臓組織における優勢なアミロイド原線維蓄積、および多発ニューロパチー（ＡＴＴＲ－ＰＮ）をもたらす神経線維における原線維蓄積を有する、２つの主要な型の臨床像を示す（Ａｎｄｏら、Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊ．Ｒａｒｅ Ｄｉｓ． ８：３１（２０１３）１～１８）。ＴＴＲは、不溶性アミロイド線維へと凝集する生来の能力を有する。アミロイドミスフォールディングは、推定上全ての個体において低率で自然発生的に起こり、加齢および老化で増加する。健康な対象において、免疫系は、アミロイド原線維を排除する能力を有すると仮定されている；しかしながら、未だ完全には解明されていない理由により、アミロイド原線維は、ＡＴＴＲ患者において、免疫監視機構を逃れ、毒性レベルまで蓄積する。ＡＴＴＲ－ＣＭに関して、未だ利用可能な特定の処置はない。β遮断薬、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、およびアンジオテンシン受容体遮断薬などの通常の心不全処置は、ＡＴＴＲ－ＣＭにおいて耐容性が悪く、避けられるべきである（Ｇｅｒｔｚら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ． ６６（２０１５）、２４５１～２４６６）。ＡＴＴＲアミロイドの量を特異的に減少させることができる処置の非存在下で、心臓移植が今もなお、心機能を回復させるための唯一の利用可能なアプローチであるが、高齢および脆弱な患者集団には適用しにくい。肝臓移植は、変異体ＡＴＴＲについての選択肢と考えられたが、肝臓移植後、末梢性ニューロパチー、加えて心臓アミロイドーシスの両方が、進行し得る。トランスサイレチン安定化薬である、タファミジス（Ｖｙｎｄａｑｅｌ（登録商標））が、初期ＡＴＴＲ－ＰＮを有する患者用に２０１１年１１月、ヨーロッパで承認された。しかしながら、承認後治験において、タファミジス処置から１年後、神経学的障害スコアが５５％悪化し、それが疾患進行を止めることができなかったことを示唆した（Ｇｅｒｔｚら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ． ６６（２０１５）、２４５１～２４６６）。同様の結果は、最近、ＡＴＴＲ－ＣＭ患者におけるタファミジスに関して得られた。タファミジスは、ＡＴＴＲ－ＣＭ患者において、疾患進行の速度を低下させて、３０カ月間の処置後、３５％高い生存率および入院率をもたらした（Ｍａｕｒｅｒら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ． ３７９（２０１８）、１００７～１０１６）；しかしながら、ＡＴＴＲ－ＰＮにおいて観察されたことと同じように、タファミジス処置は、初期ステージ患者にとって、より有益であり、疾患進行を低下させたが、停止させず、患者に症状寛解をもたらさなかった。
新しい薬物治療の開発において、薬物の有効性および安全性を評価するために動物モデルは必須である。ＡＴＴＲにおいてだけでなく、全部ではないにしてもほとんどのアミロイドーシスにおいて、アミロイドーシス薬物処置は、今までのところ、トランスジェニック動物モデル、特にトランスジェニックマウスモデルを用いて研究されており、そのトランスジェニック動物モデルは大部分、ヒト患者において観察されるそれぞれの前駆タンパク質の変異に依存する。例えば、複数のトランスジェニックマウスモデルが、ＡＴＴＲアミロイドーシスのモデルを作製する試みとして科学界に提示されているが、それらは全て、ＡＴＴＲアミロイド沈着の欠如または希少、年齢、性別、遺伝的背景、および飼育条件に依存する高い変動性、ならびに全ての場合において、患者症状を模倣する表現型の欠如を含む重大な制限を被っている（Ｔａｋａｏｋａら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６（１９９７）、２６１～２６９；Ｔｅｎｇら、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ． ８１（２００１）、３８５～３９６；Ｓｏｕｓａら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ． １６１（２００２）、１９３５～１９４８；Ｎｏｇｕｃｈｉ、Ｅｘｐ．Ａｎｉｍ． ５１（２００２）、３０９～３１６；Ｐａｎａｙｉｏｔｏｕ、ＢＢ ｒｅｐｏｒｔｓ ８（２０１６）、４８～５４）。
トランスジェニックマウスモデルを特徴づける分析は、これらのトランスジェニックマウスモデルが非アミロイドＴＴＲ沈着を呈し、この非アミロイドＴＴＲ沈着は、アミロイドの特徴的な着色性質を有さず、不溶性である代わりに可溶性であり、かつマウスにおいて毒性を誘導しない。したがって、入手できるモデルは、可溶性沈着物のみを提示するこれらのモデルにおいて、不溶性アミロイド原線維を結合し、かつクリアリングする化合物の潜在能力を評価するのに適切ではない。したがって、新しい有効なアミロイドーシス治療の開発を可能にするためにアミロイドーシスのモデルを適切に作製する新しい系の必要性がある。
Ｈａｚｅｎｂｅｒｇ、Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ． ３９（２０１３）、３２３～３４５
Ａｎｄｏら、Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊ．Ｒａｒｅ Ｄｉｓ． ８：３１（２０１３）１～１８
Ｇｅｒｔｚら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ． ６６（２０１５）、２４５１～２４６６
Ｍａｕｒｅｒら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ． ３７９（２０１８）、１００７～１０１６
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本発明は、一般的に、患者由来アミロイド異種移植（ＰＤＡＸ）非ヒト動物モデルに関する。より具体的には、その動物モデルは、ＡＴＴＲアミロイドーシスまたはＡＴＴＲ関連疾患を患っている患者の組織または器官に由来するアミロイドトランスサイレチン（ＡＴＴＲ）原線維の植込片により特徴づけられる。
本発明によれば、前記組織は、心臓組織、腎臓組織、肝臓組織、胃腸組織、皮膚組織、筋肉組織、舌組織、脂肪組織、唾液腺組織、リンパ節組織、脳組織、膵臓組織、または任意のＡＴＴＲアミロイドーマであり、そのアミロイド原線維が、皮下に植え込まれ、または動物モデルの腎臓もしくは被膜下に、腹膜、筋肉、脳、室、神経、眼、舌、もしくは心臓に植え込まれる。
本発明の一実施形態において、動物は、マウス、ラット、すなわち、げっ歯類、または非ヒト霊長類、すなわち、一般的には、非ヒト哺乳動物である。
本発明のさらなる実施形態において、動物は、少なくともアミロイド原線維タンパク質について、非トランスジェニックである。
別の態様において、本発明は、アミロイドーシスまたはアミロイド関連疾患を治療できる抗アミロイド薬を決定および／または獲得する方法であって、前記方法が、薬物またはそのバリアントを本発明のモデルに投与するステップ、および前記モデルにおいてアミロイド原線維を決定するステップを含み、前記薬物またはそのバリアントを投与した際のアミロイド原線維の排除または低下が、対照と比較して加速していることが、抗アミロイド薬への適合性を示す、方法に関する。一実施形態において、方法は、投与後の第１および第２の時点における組織生検の収集、ならびに免疫組織化学法を含む、アミロイド原線維の分析および定量化を含む。好ましくは、アミロイド原線維の量は、植込片組織エリアに占めるパーセンテージとして表され、前記薬物またはそのバリアントで処置された群における植込片組織エリアに占めるアミロイド染色エリアが、対照群においてより有意に低い。追加または代替の実施形態において、アミロイド原線維の排除または低下の加速は、用量依存的に観察される。
本発明の方法の一実施形態において、薬物は、抗アミロイド原線維タンパク質抗体またはアミロイド原線維結合性分子を含む。
本発明の別の実施形態において、薬物は抗体であり、対照は、対応するアイソタイプ抗体である。
本発明のさらなる実施形態において、抗体は、ヒト由来、好ましくは、ヒトメモリーＢ細胞由来の抗体であり、そのバリアントは、異種性定常ドメインを含み、好ましくは、前記バリアント抗体がキメラ抗体であり、かつ前記異種性定常ドメインが、モデルに用いられた動物と同じ種に由来する。
本発明のさらなる実施形態において、薬物は、静脈内に、腹腔内に、皮下に、または経口で投与される。
別の態様において、本発明は、抗アミロイド薬および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物の製造プロセスであって、薬物またはそのバリアントを、抗アミロイド薬を決定および／または獲得するための本発明による方法に供するステップ、ならびに適切な抗アミロイド薬として決定された前記薬物を薬学的に許容される担体と混合するステップを含む、プロセスを提供する。
本発明の一実施形態において、薬学的組成物は、アミロイドーシスまたはアミロイド関連疾患の治療のために設計される。
本発明のさらなる態様は、アミロイドーシスまたはアミロイド関連疾患を治療できる抗アミロイド薬の特徴づけ、検証、開発、および／または品質管理のための方法であって、薬物またはそのバリアントを、抗アミロイド薬を決定および／もしくは獲得するための本発明による方法に供するステップ、前記方法により得られた情報をクライアント、契約当事者、もしくは協力パートナーへ伝達し、および／または適切な抗アミロイド薬であると決定された前記薬物を選択するステップ、ならびに任意で、アミロイドーシスまたはアミロイド関連疾患の治療のために、前記抗アミロイド薬または前記抗アミロイド薬を含む薬学的組成物を使用するステップを含む、方法に関する。したがって、本発明の一態様は、アミロイドーシスもしくはアミロイド関連疾患の治療のための医薬の製造における、薬物の特徴づけ、品質管理、および／もしくは開発、前臨床試験および／もしくは並行臨床試験、または薬物の選択もしくは検証のための、本発明によるモデルの使用に関する。
別の態様において、本発明は、ＡＴＴＲアミロイドーシスまたはＡＴＴＲ関連疾患を患っている患者から得られた組織生検からのＡＴＴＲ原線維の単離、および非ヒト動物における前記単離されたアミロイド原線維の植込みを含み、好ましくは、その総タンパク質濃度が、好ましくはＢＣＡアッセイで決定された場合、約０．５～５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約１～４ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約２±０．５ｍｇ／ｍｌである、本発明の患者由来アミロイド異種移植（ＰＤＡＸ）非ヒト動物モデルを作製する方法に関する。
本発明は、患者由来アミロイド異種移植（ＰＤＡＸ）非ヒト動物モデルに関する。抗アミロイド薬を試験するための適切なインビボ動物モデルがない中で、本発明者らは、この目的のために単純だが、非常に有効性の高いモデルを開発し、それは、有利には、必ずしもトランスジェニック動物に基づいているわけではない。ＰＤＡＸモデルは、アミロイドトランスサイレチン（ＡＴＴＲ）アミロイドーシスまたはＡＴＴＲ関連疾患を患っている患者の組織または器官から単離されたＡＴＴＲ原線維の植込片によって特徴づけられる。驚くべきことに、アミロイド原線維植込片は、動物において数日間維持され、さらに、薬物処置を受け入れやすい。特に、実施例１および２においてＡＴＴＲ原線維を植え込まれたマウスについて例示的に示されているように、アミロイド原線維植込片は、実験動物において許容され、組織学的分析後、組織生検において特徴的なアミロイドフィーチャーを提示する。さらに、実施例３および４において示されているように、ＰＤＡＸモデルは、別のマウスモデルにおいてインビボでＡＴＴＲ原線維のクリアリングを活発に促進することが示されている抗ＡＴＴＲ特異的抗体で、検証されている。したがって、ＰＤＡＸモデルは、化合物または薬物を抗アミロイド薬としてのそれらの適合性について試験するのに非常に適している。
以前、ｔｈｅ ＸＶＩｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ；２０１８年３月２６～２９日；Ｋｕｍａｍｏｔｏ、Ｊａｐａｎでのポスター発表においてＨｉｇａｋｉらは、ミスフォールディング型ＴＴＲに対する全身的に投与されたヒト化抗体（ｍｉｓ－ＴＴＲ抗体）による標的会合および抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）のインビボモデルに関して報告し、そこでは、基底膜マトリックス（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）中に懸濁したＨｉｓタグ付きＴＴＲ－Ｖ３０Ｍの凝集物がマウスの皮下に植え込まれている。
しかしながら、原理上、その植込みの方法は、本発明によるＰＤＡＸ動物モデルを作製するために使用することができるが、ＨｉｇａｋｉらのＡＤＣＰモデルマウスはそれ自体、本発明による適切な動物モデルを表しているだけで、意図された目的には適し得ない。
例えば、ヒトＡＴＴＲアミロイドーシスは単一遺伝子疾患であるという事実にも関わらず、それの表現型およびＡＴＴＲ原線維組成に多くのバリエーションがあり、例えば、異なる型のアミロイド原線維があり、Ａ型はＣ末端ＡＴＴＲ断片および完全長ＴＴＲからなるが、その他のＢ型は完全長ＴＴＲのみからなり、それが、ＴＴＲ Ｖａｌ３０－Ｍｅｔ変異についての表現型多様性に関係していると思われる；Ｓｕｈｒら、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２８１（２０１７）、３３７～３４７を参照。
さらに、アミロイド原線維タンパク質により引き起こされる様々な種類の全身性アミロイドーシスにおいて、組織および器官におけるアミロイド原線維タンパク質の沈着が、１つまたは複数の異なるアミロイド原線維タンパク質と共局在化および／または共凝集していることは知られている。実際、当技術分野において知られ、および例えば、Ｈｉｇａｓｈｉら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１８４（２００７）２８４～２９４に発表されているように、τ－およびα－シヌクレイン、ならびにＴＡＲ－ＤＮＡ結合性タンパク質４３（ＴＤＰ４３）が、アルツハイマー病およびレビー小体認知症の脳の病態において共存していることが見出されている；Ｌｅｅら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ２７（２００４）、１２９～１３４も参照。
ＡＴＴＲアミロイドーシスにおけるアポリポタンパク質ＡＩ（ａｐｏＡＩ）のアミロイド沈着物との共局在化が、アミロイドＡ（ＡＡ）アミロイドーシス（ＡＡアミロイドーシス）、免疫グロブリン（Ｉｇ）λ軽鎖アミロイドーシス（Ａλアミロイドーシス）、Ｉｇ κ軽鎖アミロイドーシス（Ａκアミロイドーシス）、およびＡβ２Ｍアミロイドーシスにおいてもまた見出されている；Ｓａｋａｔａら、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． Ｃｙｔｏｃｈｅｍ． ５３（２００５）、２３７～２４２を参照。したがって、人工的なインビトロで作製されたＴＴＲ－Ｖ３０Ｍ凝集物は、インビボでの、すなわち、ＡＴＴＲアミロイドーシスを患っている患者における、ＡＴＴＲ原線維の実際の構造を反映し得ない。
加えて、ＡＤＣＰが、抗ＴＴＲ抗体のインビボでの治療適用への適合性について意義があるのかどうかは、疑わしい可能性があり、まだ証明されていない。というのも、そのモデルに使用された抗体が、ＴＴＲ配列内のクリプトトープを含む人工的な抗原性ペプチドに対して産生されたヒト化マウスモノクローナル抗体であり、現在まで、インビトロで特徴づけされているに過ぎないためである；Ｈｉｇａｋｉら Ａｍｙｌｏｉｄ ２３（２０１６）、８６～９７を参照。
対照的に、本発明のＰＤＡＸモデルは、ヒト患者由来の組織およびその原線維をそれぞれ用い、ＴＴＲ凝集物に対する立体構造特異的ヒト由来モノクローナル抗体ＮＩ－３０１．３７Ｆ１で検証されており、その抗体は、もっぱらヒトＶ３０Ｍ－ＴＴＲタンパク質のみを発現し、かつマウスＴＴＲタンパク質を発現しないトランスジェニックマウス（ＦＡＰマウス）においてインビボでの診断的および治療的使用のための潜在能力を有することが実証されている；ＷＯ２０１５／０９２０７７ Ａ１およびＭｉｃｈａｌｏｎら、Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒａｒｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ １０（２０１５）、Ｓｕｐｐｌ．１：Ｐ３９を参照。
以前のＹｏｓｈｉｍｕｒａら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ２７（２０１６）、１５３２～１５３９には、アミリン（膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ））凝集物の同所植込みの方法により確立され、かつアミリン画像化プローブ、特に、９９ｍＴｃ標識ピリジルベンゾフラン誘導体の開発を研究することを意図された、膵島アミロイドモデルマウスが記載されている。具体的には、同所性アミリン凝集物は、そのペプチド溶液を希釈し、外科的方法でＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウス（週齢８～１０週間、雄）へ植え込まれた；Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら（２０１６）、上記、１５３７ページ、左欄におけるセクション「Ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ Ａｍｙｌｉｎ Ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ ｆｏｒ Ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ」を参照。
しかしながら、原理上、その植込みの方法は、本発明によるＰＤＡＸ動物モデルを作製するために使用することができるが、Ｙｏｓｈｉｍｕｒａらの膵島アミロイドモデルマウスは、本発明の目的としての適切な動物モデルを表しているだけで、意図された目的には適し得ない。これは、ＡＴＴＲについての上記Ｈｉｇａｋｉら（２０１８）のインビボモデルと同様に、インビトロで調製されたアミリン凝集物は、アミリンのインビボ構造を（完全に）反映することを予想することはできないからである。例えば、リン酸化ＴＤＰ４３（ｐＴＤＰ４３）とＩＡＰＰの間に会合が観察され、それは、特にＤＭおよび膵臓に高度のＩＡＰＰを有する対象において、強くかつ著しかった；Ｌｅｉｎｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ５９（２０１７）、４３～５６を参照。
したがって、アミロイドーシスの治療における抗体を提供するための、これまでのたいていのアプローチが失敗していることの一つの理由は、これまでの抗体候補が、インビトロで作製された組換えアミロイドタンパク質およびその原線維を用いてスクリーニングされており、しかしながら、それは、患部組織または器官におけるアミロイド原線維の実際の環境および３次元構造を考慮しておらず、加えて、その患部組織または器官は他のアミロイド原線維形成タンパク質をも含み得る。
好ましい実施形態において、植え込まれるＡＴＴＲ原線維は、心臓組織、腎臓組織、肝臓組織、胃腸組織、皮膚組織、筋肉組織、舌組織、脂肪組織、唾液腺組織、リンパ節組織、脳組織、膵臓組織、または任意のＡＴＴＲアミロイドーマから単離される。好ましい実施形態において、アミロイド原線維は、心臓組織から単離される。アミロイド原線維を組織から単離する方法は、以前に、例えば、Ｔｅｎｎｅｎｔ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ３０９（１９９９）、２６～４７に記載されている。特に、本発明によれば、アミロイド原線維は、その原線維の天然の立体構造を保存するために、界面活性剤を含まないプロトコールを用いて単離される。単離の有効性は、当業者に知られた、セミネイティブＳＤＳ－ＰＡＧＥ、その後、ウェスタンブロットのような標準技術により検証することができる。実施例１に記載され、および図１に示されているように、アミロイドトランスサイレチン（ＡＴＴＲ）原線維は、死後の凍結心臓組織から有効に単離され得る。
本発明によれば、アミロイド原線維は、皮下にまたは被膜下に植え込まれ、腎臓、腹膜、筋肉、脳、室、神経、眼、舌、または心臓に植え込まれる。実施例に示されているように、アミロイド原線維は、便利には、マウスの大腿に皮下注射され、そこで、それらは、薬物処置、および皮膚生検におけるさらなる分析を受け入れやすい沈着物を形成する。具体的には、実施例２は、組織学的分析後、本発明によるモデルの皮膚生検における沈着したアミロイド原線維がヒト生検におけるＡＴＴＲアミロイドの特徴的なフィーチャーを示す、すなわち、コンゴレッド陽性であり、かつヒトＴＴＲ抗体Ｄａｋｏ Ａ０００２でのＩＨＣにより強く染色されたことを示している（図２Ａ）。したがって、好ましい実施形態において、アミロイド原線維は皮下に植え込まれる。
本発明に適しているよく使われるモデル動物は、マウス、ラット、すなわち、げっ歯類、または非ヒト霊長類、すなわち、一般的には、非ヒト哺乳動物である。本発明の好ましい実施形態において、動物はマウスである。本発明の目的におけるモデル生物体としてのマウスは、有利には、飼育するのに便利でかつ安価であり、短い世代時間を有する、すなわち、相対的に短い期間で多くの動物が産生され得る。
少なくともマウスゲノムは操作するのが相対的に容易であるが、トランスジェニックのマウス系統または他の動物の確立は、常に、費用とかなり多大な時間を伴う。したがって、本発明によるＰＤＡＸモデルについて、野生型動物が用いられ得ることは非常に有利である。それゆえに、本発明の一実施形態において、動物は、少なくともアミロイド原線維タンパク質について、非トランスジェニックである。もちろん、適切な場合、例えば実際の患者の状況をより良く反映するために、トランスジェニック動物もまた用いられ得る。例えば、アミロイドーシスに加えて免疫不全に関連した疾患を患っている患者のモデルを作製するために、アミロイド原線維が免疫不全マウスに植え込まれることは考え得る。これは、追加の疾患、例えば、トランスジェニック動物モデルが利用できる免疫不全または他の疾患に関しての複合患者系における抗アミロイド薬の分析を可能にする。
さらなる態様において、本発明は、アミロイドーシスまたはアミロイド関連疾患を治療できる抗アミロイド薬を決定および／または獲得する方法に関する。その方法は、薬物またはそのバリアントを本発明のモデルに投与するステップ、および前記モデルにおいてアミロイド原線維を決定するステップを含み、前記薬物を投与した際のアミロイド原線維の排除または低下が、対照と比較して加速していることが、抗アミロイド薬への適合性を示しり、好ましくは、前記排除または低下の加速が用量依存的に観察される。意図された薬物よりむしろ、その薬物のバリアントが本発明のＰＤＡＸモデルにおいて用いられ、試験される場合があり、特に、動物において免疫応答を誘発する傾向にあり得る抗体または受容体ベースなどのタンパク質性薬の場合である。例えば、実施例に例証されているように、最終的に製造される薬物は親の完全ヒト抗体であるが、キメラバージョンの、その他の点では完全なヒト抗体を、試験に用いることができる。
当業者は、アミロイド原線維を決定する様々な方法を知っている。実施例２～５に詳細に示されているように、アミロイド原線維は、組織切片において、コンゴレッド染色、チオフラビンＳ染色、または適切な抗体での免疫組織化学法により分析され得る。薬物処置が、対照と比較して、アミロイド原線維の排除または低下を加速するかどうかを決定するために、その後、アミロイド原線維は、自動顕微鏡観察法および画像分析プロセスのような適切なデバイスおよびプロセスを用いて定量化される。さらに、実施例４および５に言及されているように、ＡＴＴＲ原線維は、モデルにおいて自然発生的な原線維排除プロセスを起こす。したがって、評価される薬物での処置による原線維排除または低下の加速が、抗アミロイド薬として適合性についてのアウトプットである。したがって、方法は、好ましくは、投与後の第１および第２の時点における組織生検を収集すること、ならびに免疫組織化学法を含む、アミロイド原線維の分析および定量化を含む。さらなる好ましい実施形態において、アミロイド原線維の量は、植込片組織エリアに占めるパーセンテージとして表され、前記薬物またはそのバリアントで処置された群における植込片組織エリアに占めるアミロイド染色エリアが、対照群においてより有意に低い。
好ましい実施形態において、第１の時点は、薬物またはそのバリアントの投与から３～１０時間後、より好ましくは５～８時間後、最も好ましくは６時間後であり、第２の時点は、薬物またはそのバリアントの投与から４８～１５６時間後、より好ましくは７２～１２０時間後、最も好ましくは９６時間後である。
原理上、利用可能な、患者の生検においてアミロイドーシスを診断するための全ての方法が、モデル生物体のアミロイド原線維移植片を決定／分析するために本発明の方法に適用され得る。
実施例３～５に示されているように、ＡＴＴＲ特異的抗体は、植え込まれたアミロイド原線維を特異的に結合し、それらの排除を加速することが示されている。したがって、本発明の方法の一実施形態において、薬物は、抗アミロイド原線維タンパク質抗体またはアミロイド原線維結合性分子を含む。さらなる実施形態において、薬物は抗体であり、対照は、対応するアイソタイプ抗体である。適切な抗体候補は、先行技術から知られており、例えば、抗トランスサイレチン（ＴＴＲ）抗体が、ＷＯ２０１５／０９２０７７ Ａ１、ＷＯ２０１４／１２４３３４ Ａ２、ＷＯ２０１８／００７９２３ Ａ３、ＷＯ２０１６／１２０８１０ Ａｌ、ＵＳ２０１７／００５８０２３ Ａ１、およびＵＳ９，８７９，０８０ Ｂ２に開示されている。もちろん、特に新規の抗体または化合物が、一般的に、抗アミロイド薬としてのそれらの適合性について評価されるために本発明の方法に適用され得ることは、本発明の範囲内で構想される。抗体以外にも、例えば小分子を含む、全ての型の薬物が、抗アミロイド薬としてのそれらの適合性について、本発明の方法により便利に試験され得る。
言及されているように、アミロイドーシスの治療における薬物を提供するためのこれまでのたいていのアプローチは、インビトロで作製された組換えアミロイドタンパク質およびその原線維でのリード候補化合物のスクリーニングを用いており、しかしながら、それは、患部組織または器官におけるアミロイド原線維の実際の環境および３次元構造を考慮しておらず、加えて、その患部組織または器官は他のアミロイド原線維形成タンパク質をも含み得る。
対照的に、本発明のＰＤＡＸ動物モデルは、抗アミロイド化合物、特に、処置されるべき患者において標的アミロイドタンパク質と、例えば毒性のアミロイド沈着物の所望かつ必要な位置で選択的に結合するほど特異的であることが合理的に予想することができる抗体、の獲得および選択を可能にする。
特定の好ましい実施形態において、候補抗体は、ヒト化抗体、ヒト様抗体、またはヒト抗体、好ましくはヒト由来抗体、最も好ましくはヒトメモリーＢ細胞から単離されたヒト由来抗体、およびその組換えバリアントであり、その組換えバリアントは、典型的には、最初のヒト由来抗体の可変重鎖および軽鎖、ならびに、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４サブタイプであるが、必ずしも最初のヒト由来抗体の定常ドメインと同一とは限らない、ヒト定常ドメインを実質的に含む。
しかしながら、本発明のＰＤＡＸモデルにおける試験および検証について実施例に例示されているように、好ましくは、ヒト化抗体、ヒト様抗体、またはヒト抗体のバリアントが用いられ、そのバリアントは、異種性定常ドメインを含み、好ましくは、前記バリアント抗体がキメラ抗体であり、かつ前記異種性定常ドメインが、モデルに用いられる動物と同じ種に由来する。
当業者は、薬物をモデル動物に投与するための様々な経路を知っている。したがって、本発明の方法の一実施形態において、薬物は、静脈内に、腹腔内に、皮下に、または経口で投与される。例えば、薬物は、実施例３および４に示されているように、単離されたアミロイド原線維の植込片を受けているマウスの尾静脈において静脈内注射される。
本発明のさらなる態様は、抗アミロイド薬またはそのバリアントおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物の製造プロセスに関する。このプロセスにおいて、上記のような本発明の方法により適切な抗アミロイド薬であることが決定された抗アミロイド薬が、薬学的に許容される担体と混合される。
薬学的に許容される担体および投与経路は、当業者に知られた、対応する文献から入手することができる。本発明の薬学的組成物は、当技術分野においてよく知られた方法に従って製剤化することができる；例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ （２０００）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＩＳＢＮ ０－６８３－３０６４７２；Ｖａｃｃｉｎｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ 第２版、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ、２００３；Ｂａｎｇａ、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ， Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ， ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ．第２版、Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓ （２００６）、ＩＳＢＮ：０－８４９３－１６３０－８を参照。適切な薬学的担体の例は、当技術分野においてよく知られており、それには、リン酸緩衝食塩水、水、油／水乳濁液などの乳濁液、様々な型の湿潤剤、無菌溶液などが挙げられる。そのような担体を含む組成物は、周知の通常の方法により製剤化することができる。これらの薬学的組成物は、適切な用量で対象に投与することができる。適切な組成物の投与は、種々の様式により果たされ得る。例には、経口、鼻腔内、直腸、局所的、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、真皮下、経皮、髄腔内、および頭蓋内の方法により、薬学的に許容される担体を含有する組成物を投与することが挙げられる。鼻腔用スプレー製剤などのエアロゾル製剤は、活性物質の精製された水溶液または他の溶液を、保存剤および等張剤と共に含む。そのような製剤は、好ましくは、鼻粘膜と適合したｐＨおよび等張状態へ調整される。単一ドメイン抗体分子（例えば、「ナノボディ（商標）」）などの経口投与用の薬学的組成物もまた、本発明において構想される。そのような経口製剤は、錠剤、カプセル、粉末、液体、または半固体の形をとり得る。錠剤は、ゼラチンまたはアジュバントなどの固体担体を含み得る。直腸または膣投与用の製剤は、適切な担体を含む坐剤として提供され得る；Ｏ’Ｈａｇａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２（９）（２００３）、７２７～７３５も参照。様々な型の投与に適している製剤に関するさらなるガイドラインは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、第１７版 （１９８５）および対応する最新版に見出すことができる。薬物送達のための方法の簡単な概説として、Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９（１９９０）、１５２７～１５３３を参照。
本発明のプロセスの一実施形態において、薬学的組成物は、ＡＴＴＲまたはＡＴＴＲ関連疾患の治療のために設計される。それにより、アミロイドーシスは、患者におけるＡＴＴＲ沈着、特にそのそれぞれの前駆タンパク質によって特徴づけられる。
別の態様において、本発明は、アミロイドーシスまたはアミロイド関連疾患を治療できる抗アミロイド薬の特徴づけ、検証、開発、および／または品質管理のための方法に関する。例えば、抗アミロイド薬は、用量応答研究、標的会合実験（標的との薬物結合）において特徴づけられ、または処置作用様式、例えば、原線維移植片部位における薬物による特異的な免疫応答の局所的活性化、もしくはＰＫ／ＰＤ関係、例えば、薬物曝露レベルの関数としての用量応答について、特徴づけられる。それにより、上記のような本発明の抗アミロイド薬を決定および／または獲得する方法に供された薬物についての情報は、クライアント、契約当事者、または協力パートナーへ伝達される。さらに、適切な抗アミロイド薬であると決定された薬物が選択され得、任意で、その抗アミロイド薬、またはその抗アミロイド薬を含む薬学的組成物が、アミロイドーシスまたはアミロイド関連疾患の治療に使用される。
本発明はさらに、アミロイドーシスまたはアミロイド関連疾患の治療のための医薬の製造における、薬物の特徴づけ、品質管理、および／もしくは開発、前臨床試験および／もしくは並行臨床試験、または薬物の選択もしくは検証のためのＰＤＡＸモデルの使用に関する。薬物を特徴づけるために、例えば、用量応答研究、または標的会合実験（標的との薬物結合）において、本発明のモデルを使用する方法は、当業者によく知られている。さらに、本発明によれば、モデルは、薬物の処置作用様式、例えば、原線維移植片部位における薬物による特異的な免疫応答の局所的活性化、またはＰＫ／ＰＤ関係、例えば、薬物曝露レベルの関数としての用量応答の特徴づけに使用される。
この関連において、ＰＤＡＸモデルが、個別化医療との関連において使用されることも考えられ、それは、個々の患者からアミロイド原線維が単離され、本発明のモデルを使用して抗アミロイド薬に対するそれらの応答について個々に分析されることを意味する。本発明のモデルのそのような使用に関して、有利には、患者を処置する前でも、および患者を、起こり得る有害作用に曝す前に、処置が特定の患者において有効であるかどうかを決定することが可能である。したがって、本発明のモデルの使用は、より的を絞ったアミロイドーシス治療を可能にする。
さらなる態様において、本発明は、本発明の患者由来アミロイド異種移植（ＰＤＡＸ）非ヒト動物モデルを作製する方法に関する。その方法は、ＡＴＴＲアミロイドーシスまたはＡＴＴＲ関連疾患を患っている患者から得られた組織生検からのＡＴＴＲ原線維の単離、および非ヒト動物における前記単離されたアミロイド原線維の植込みを含み、好ましくは、前記原線維調製物が、好ましくはビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイで決定された場合、約０．５～５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約１～４ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約２±０．５ｍｇ／ｍｌのアミロイド原線維の総タンパク質濃度を有し、高粘性を有する；例えば、Ｓｍｉｔｈら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． １５０（１９８５）、７６～８５を参照。どのようにして本発明のモデルが作製されるのかの例は、実施例１に描かれている。上記のように、アミロイド原線維が単離される組織生検は、心臓組織、腎臓組織、肝臓組織、胃腸組織、皮膚組織、筋肉組織、舌組織、脂肪組織、唾液腺組織、リンパ節組織、脳組織、膵臓組織、または沈着したアミロイドーマを有する任意の他の組織である。当業者は、アミロイド原線維を単離する種々の方法を知っており、例えば、原線維の天然立体構造を保存する単離方法は、Ｔｅｎｎｅｎｔ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ３０９（１９９９）、２６～４７において詳細に記載されている。実施例１に示されているように、単離されたアミロイド原線維は、皮下注射により植え込まれるが、被膜下植込み、腎臓、腹膜、筋肉、脳、室、神経、眼、舌、または心臓における植込みのような他の植込みの形式が考え得る。
以下の実施例１～５は、本発明の実施形態を例証するのを助けるものである。本発明が前述の記載によって限定されることは意図されず、その前述の記載が本発明の実施形態を例証するのに役立つように意図されていることは認識されているだろう。以下の実施例に提示された患者由来アミロイド異種移植（ＰＤＡＸ）マウスモデルは、死後の心臓組織から得られた患者由来ＡＴＴＲ原線維の皮下植込みを含む。
実施例１：ＰＤＡＸモデルの作製
ＡＴＴＲ原線維の単離
広範囲なＴＴＲアミロイド浸潤を示す凍結ヒト心臓試料を、アミロイドＴＴＲ原線維の生化学的抽出のために処理した。できる限り原線維の立体構造を保存するために界面活性剤を含まないプロトコールを用いた（Ｐｒａｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． ４７（１９６８）、９２４～３３；Ｔｅｎｎｅｎｔ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ３０９（１９９９）、２６～４７）。簡単に述べれば、手順は、可溶性タンパク質を抽出し、かつ排除するための氷冷ＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％（重量／体積）ＮａＮ３、プロテアーゼ阻害剤カクテル）中での機械的ホモジナイゼ－ションの繰り返し、その後、氷冷純水中での機械的ホモジナイゼ－ションの繰り返しからなった。これは、純水中のアミロイド原線維の懸濁を可能にする、アミロイド原線維上のＳＡＰタンパク質のカルシウム依存性結合を除去するために記載されている（Ｐｒａｓら（１９６８）、上記）。ＡＴＴＲ原線維を、ＮａＣｌおよびＥＤＴＡでの沈殿によりさらに精製し、遠心分離により濃縮した。総タンパク質濃度を、ＢＣＡアッセイで決定し、原線維調製物の高粘性を保証するために２ｍｇ／ｍｌに調整した。各原線維調製物を、以下に記載されているような標準手順を用いる、セミネイティブＳＤＳ－ＰＡＧＥ、およびＡＴＴＲ原線維特異的抗体ＮＩ－３０１．３７Ｆ１（１０ｎＭ）でのウェスタンブロットにより検証した。分析過程中、凝集物を保存するために、試料をローディングバッファーと混合し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上に直接ロードし、通常の熱変性ステップを省略した。各試料について、１０．０μｇの総タンパク質を、ＭＯＰＳバッファー中４～１２％ ｂｉｓ－ｔｒｉｓゲルにロードし、２００Ｖで４０分間、流した。タンパク質を、２０Ｖで６０分間のセミドライ式ブロッティングによりニトロセルロース膜へ転写した。膜を、ブロッキングバッファー（ＰＢＳバッファー中２％ ＢＳＡ、０．１％ ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４）中１時間、ブロッキングし、ブロッキングバッファー中１０ｎＭに希釈されたＮＩ－３０１．３７Ｆ１抗体と４℃で一晩、インキュベートした。化学発光基質と組み合わせた、ＨＲＰコンジュゲート型抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて、検出を実施した。
ＡＴＴＲ原線維の単離
広範囲なＴＴＲアミロイド浸潤を示す凍結ヒト心臓試料を、アミロイドＴＴＲ原線維の生化学的抽出のために処理した。できる限り原線維の立体構造を保存するために界面活性剤を含まないプロトコールを用いた（Ｐｒａｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． ４７（１９６８）、９２４～３３；Ｔｅｎｎｅｎｔ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ３０９（１９９９）、２６～４７）。簡単に述べれば、手順は、可溶性タンパク質を抽出し、かつ排除するための氷冷ＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％（重量／体積）ＮａＮ３、プロテアーゼ阻害剤カクテル）中での機械的ホモジナイゼ－ションの繰り返し、その後、氷冷純水中での機械的ホモジナイゼ－ションの繰り返しからなった。これは、純水中のアミロイド原線維の懸濁を可能にする、アミロイド原線維上のＳＡＰタンパク質のカルシウム依存性結合を除去するために記載されている（Ｐｒａｓら（１９６８）、上記）。ＡＴＴＲ原線維を、ＮａＣｌおよびＥＤＴＡでの沈殿によりさらに精製し、遠心分離により濃縮した。総タンパク質濃度を、ＢＣＡアッセイで決定し、原線維調製物の高粘性を保証するために２ｍｇ／ｍｌに調整した。各原線維調製物を、以下に記載されているような標準手順を用いる、セミネイティブＳＤＳ－ＰＡＧＥ、およびＡＴＴＲ原線維特異的抗体ＮＩ－３０１．３７Ｆ１（１０ｎＭ）でのウェスタンブロットにより検証した。分析過程中、凝集物を保存するために、試料をローディングバッファーと混合し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上に直接ロードし、通常の熱変性ステップを省略した。各試料について、１０．０μｇの総タンパク質を、ＭＯＰＳバッファー中４～１２％ ｂｉｓ－ｔｒｉｓゲルにロードし、２００Ｖで４０分間、流した。タンパク質を、２０Ｖで６０分間のセミドライ式ブロッティングによりニトロセルロース膜へ転写した。膜を、ブロッキングバッファー（ＰＢＳバッファー中２％ ＢＳＡ、０．１％ ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４）中１時間、ブロッキングし、ブロッキングバッファー中１０ｎＭに希釈されたＮＩ－３０１．３７Ｆ１抗体と４℃で一晩、インキュベートした。化学発光基質と組み合わせた、ＨＲＰコンジュゲート型抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて、検出を実施した。
図１Ａは、四量体ＷＴ－ＴＴＲ（１００ｎｇ、検出されず）、ミスフォールディング型凝集ＷＴ－ＴＴＲ（１００ｎｇ）、ならびにレーンあたり０．２μｇ、２．０μｇ、および２０μｇのＡＴＴＲ原線維抽出物のセミネイティブＳＤＳ-ＰＡＧＥおよびＮＩ－３０１．３７Ｆ１でのウェスタンブロット分析を示す。組織抽出手順は、結果として、ＡＴＴＲ原線維が高度に濃縮された画分を生じ、それは、二次抗体のみの対照（図１Ａ、右パネル）においては存在しなかった、高分子量の凝集物としてセミネイティブＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル上でＮＩ－３０１．３７Ｆ１により検出された（図１Ａ、左パネル）。同様の実験を、ＡＴＴＲアミロイドーシス（ＡＴＴＲ＋）を有する４人の異なるドナー、アミロイドーシスを有しない４人のドナー（ＡＴＴＲ－）、およびＡＴＴＲに関連していないアミロイドーシスを有する１人のドナー（Ａ＋ＴＴＲ－）から得られた死後の心臓組織から調製されたＡＴＴＲ原線維に関して実施した（図１Ｂ）。ＮＩ－３０１．３７Ｆ１は、非常に少ない量のアミロイドを有する１つ（試料７０）を含め、全てのＡＴＴＲ症例において患者由来ＡＴＴＲ原線維を選択的に検出し、ＡＴＴＲアミロイドーシスなしの組織から調製された同じ組織画分に存在する、非関連性タンパク質を検出しなかった。
患者由来の原線維の植込み
ＷＴ ＳＫＨ１雌マウスを、イソフルランで短時間麻酔して、大腿における皮下注射による１００μｇのＡＴＴＲ原線維抽出物の植込みを与えた。
ＷＴ ＳＫＨ１雌マウスを、イソフルランで短時間麻酔して、大腿における皮下注射による１００μｇのＡＴＴＲ原線維抽出物の植込みを与えた。
抗ＴＴＲ抗体
マウスキメラ抗体ｃｈ．ＮＩ－３０１．３７Ｆ１を、ＷＯ２０１５／０９２０７７ Ａ１に開示されたヒト由来モノクローナル抗体ＮＩ－３０１．３７Ｆ１から作製した。そのマウスキメラバリアントを、マウス定常ドメインバックボーンにおいて、ＮＩ－３０１．３７Ｆ１のヒト可変ドメインを含有するように設計した。特に、ヒト由来モノクローナル抗体ＮＩ－３０１．３７Ｆ１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のアミノ酸配列は、ＷＯ２０１５／０９２０７７ Ａ１の図１において開示されており、ＶＨ鎖については配列番号１０および５３、それぞれ、ならびにＶＬ鎖については配列番号１２であり、一方、マウス重鎖定常ドメインはＵｎｉｐｒｏｔエントリーＰ０１８６３に対応し、マウス軽鎖定常ドメインはＵｎｉｐｒｏｔエントリーＰ０１８３７に対応する。簡単に述べれば、遺伝子合成を用いて、ＮＩ－３０１．３７Ｆ１のヒト重鎖可変ドメインをコードする配列、続いて、マウスＩｇＧ２ａ重鎖定常ドメインをコードする配列を含む合成重鎖遺伝子（配列ｍｕｒ．３７Ｆ１ Ｈ参照）、およびＮＩ－３０１．３７Ｆ１のヒト軽鎖可変ドメインをコードする配列、続いて、マウスκ軽鎖定常ドメインをコードする配列を含む合成軽鎖遺伝子（配列ｍｕｒ．３７Ｆ１ Ｌ参照）を作製した。その後、これらの２つの遺伝子を、ＣＨＯ細胞のトランスフェクションに用いられる適切な発現ベクターへサブクローニングした。プロテインＡカラムでのクロマトグラフィーによる抗体の精製を含むＷＯ２０１５／０９２０７７ Ａ１に記載されているような標準プロセスを用いて、Ｃｈ．ＮＩ－３０１．３７Ｆ１抗体を細胞培地から精製した。
マウスキメラ抗体ｃｈ．ＮＩ－３０１．３７Ｆ１を、ＷＯ２０１５／０９２０７７ Ａ１に開示されたヒト由来モノクローナル抗体ＮＩ－３０１．３７Ｆ１から作製した。そのマウスキメラバリアントを、マウス定常ドメインバックボーンにおいて、ＮＩ－３０１．３７Ｆ１のヒト可変ドメインを含有するように設計した。特に、ヒト由来モノクローナル抗体ＮＩ－３０１．３７Ｆ１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のアミノ酸配列は、ＷＯ２０１５／０９２０７７ Ａ１の図１において開示されており、ＶＨ鎖については配列番号１０および５３、それぞれ、ならびにＶＬ鎖については配列番号１２であり、一方、マウス重鎖定常ドメインはＵｎｉｐｒｏｔエントリーＰ０１８６３に対応し、マウス軽鎖定常ドメインはＵｎｉｐｒｏｔエントリーＰ０１８３７に対応する。簡単に述べれば、遺伝子合成を用いて、ＮＩ－３０１．３７Ｆ１のヒト重鎖可変ドメインをコードする配列、続いて、マウスＩｇＧ２ａ重鎖定常ドメインをコードする配列を含む合成重鎖遺伝子（配列ｍｕｒ．３７Ｆ１ Ｈ参照）、およびＮＩ－３０１．３７Ｆ１のヒト軽鎖可変ドメインをコードする配列、続いて、マウスκ軽鎖定常ドメインをコードする配列を含む合成軽鎖遺伝子（配列ｍｕｒ．３７Ｆ１ Ｌ参照）を作製した。その後、これらの２つの遺伝子を、ＣＨＯ細胞のトランスフェクションに用いられる適切な発現ベクターへサブクローニングした。プロテインＡカラムでのクロマトグラフィーによる抗体の精製を含むＷＯ２０１５／０９２０７７ Ａ１に記載されているような標準プロセスを用いて、Ｃｈ．ＮＩ－３０１．３７Ｆ１抗体を細胞培地から精製した。
実施例２：ＰＤＡＸモデルの特徴づけ
患者由来ＡＴＴＲ原線維の植込みから２４時間後、マウスを屠殺し、原線維植込片を含む皮膚組織を収集し、固定し、包埋し（ＰＰＦＡ）、コンゴレッドでの組織学的分析およびヒトＴＴＲ抗体Ｄａｋｏ Ａ０００２でのＩＨＣ、ならびにマクロファージマーカーＣＤ６８、Ｆ４／８０、およびＩｂａ１のために切断した。コンゴレッド染色を、Ｐｕｔｃｈｌｅｒの改変を用いて実施した。簡単に述べれば、組織切片をヘマラムで染色し、水中で脱染し、溶液Ｉ（８０％ ＥｔＯＨ、３０ｇ／ｌ ＮａＣｌ、０．０１％ ＮａＯＨ）中および溶液ＩＩ（８０％ ＥｔＯＨ、３０ｇ／ｌ ＮａＣｌ、５ｇ／ｌ コンゴレッド、０．０１％ ＮａＯＨ）中で連続的に室温（ＲＴ）、それぞれ３０分間、インキュベートし、０．０１％ ＮａＯＨを含むおよび含まない１００％ ＥｔＯＨ中でクリアリングし、マウントした。切片を、明視野および偏光モードにおいて２０×対物レンズで画像化した。免疫染色を、標準手順に従い、ＲＴで２０分間のメタノール中３％ Ｈ２０２での内在性ペルオキシダーゼ活性のクエンチング、ＲＴで１時間のブロッキングバッファー（ＰＢＳ＋５％血清（ウマ／ヤギ）＋４％ ＢＳＡ）中でのインキュベーション、その後、４℃で一晩の一次抗体とのインキュベーションによって、実施した。検出を、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびジアミノベンジジン（Ｄａｋｏ）と組み合わせた適切な二次抗体（全て、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ－ｒｅｓｅａｒｃｈ製；１：４００）を用いて実施した。ＴＴＲ染色を、１：４００希釈のビオチンコンジュゲート型ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体と組み合わせた、１：５００希釈のＴＴＲ抗体Ｄａｋｏ Ａ０００２を用いて実施した；ＣＤ６８抗体を１：４００希釈で、Ｆ４／８０抗体を１：２００希釈で、およびＩＢＡ１抗体を１：７５０希釈で用い、それぞれ、ＰＢＳ中１：４００希釈のＨＲＰコンジュゲート型ビオチン ロバ抗ウサギＩｇＧと組み合わせた。
患者由来ＡＴＴＲ原線維の植込みから２４時間後、マウスを屠殺し、原線維植込片を含む皮膚組織を収集し、固定し、包埋し（ＰＰＦＡ）、コンゴレッドでの組織学的分析およびヒトＴＴＲ抗体Ｄａｋｏ Ａ０００２でのＩＨＣ、ならびにマクロファージマーカーＣＤ６８、Ｆ４／８０、およびＩｂａ１のために切断した。コンゴレッド染色を、Ｐｕｔｃｈｌｅｒの改変を用いて実施した。簡単に述べれば、組織切片をヘマラムで染色し、水中で脱染し、溶液Ｉ（８０％ ＥｔＯＨ、３０ｇ／ｌ ＮａＣｌ、０．０１％ ＮａＯＨ）中および溶液ＩＩ（８０％ ＥｔＯＨ、３０ｇ／ｌ ＮａＣｌ、５ｇ／ｌ コンゴレッド、０．０１％ ＮａＯＨ）中で連続的に室温（ＲＴ）、それぞれ３０分間、インキュベートし、０．０１％ ＮａＯＨを含むおよび含まない１００％ ＥｔＯＨ中でクリアリングし、マウントした。切片を、明視野および偏光モードにおいて２０×対物レンズで画像化した。免疫染色を、標準手順に従い、ＲＴで２０分間のメタノール中３％ Ｈ２０２での内在性ペルオキシダーゼ活性のクエンチング、ＲＴで１時間のブロッキングバッファー（ＰＢＳ＋５％血清（ウマ／ヤギ）＋４％ ＢＳＡ）中でのインキュベーション、その後、４℃で一晩の一次抗体とのインキュベーションによって、実施した。検出を、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびジアミノベンジジン（Ｄａｋｏ）と組み合わせた適切な二次抗体（全て、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ－ｒｅｓｅａｒｃｈ製；１：４００）を用いて実施した。ＴＴＲ染色を、１：４００希釈のビオチンコンジュゲート型ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体と組み合わせた、１：５００希釈のＴＴＲ抗体Ｄａｋｏ Ａ０００２を用いて実施した；ＣＤ６８抗体を１：４００希釈で、Ｆ４／８０抗体を１：２００希釈で、およびＩＢＡ１抗体を１：７５０希釈で用い、それぞれ、ＰＢＳ中１：４００希釈のＨＲＰコンジュゲート型ビオチン ロバ抗ウサギＩｇＧと組み合わせた。
アミロイド原線維植込片は、皮膚の構造化されかつ複雑な形態とは明らかに異なる、それらの形および外観により隣接する皮膚組織から容易に認識可能であった。図２Ａに示されているように、アミロイド原線維植込片は、コンゴレッド染色およびＴＴＲ ＩＨＣが陽性であった。原線維植込片は、マウスマクロファージマーカーＣＤ６８、Ｆ４／８０、およびＩｂａ１陰性に染色した小細胞で浸潤された。その代わりに、図２Ｂに示されているように、アミロイド原線維植込片を浸潤するその細胞は、単球マーカーＣＤ１１ｂ（インテグリンαＭとも名づけられている）陽性に染色し、これらの細胞が間違いなく好中球であり、それは、マクロファージのように、抗体媒介性食作用を行うことができる。好中球は、血液の中で最も豊富な免疫細胞型である。皮下注射による原線維移植は、６～８日間の間に、局所毛細血管の破裂を有する微小病変、ならびに、原線維移植片を被包し、それに浸潤し、それを完全に排除する好中球の放出を生じる。下記の実施例４に示されているように、この過程は、ＡＴＴＲ抗体ＮＩ－３０１．３７Ｆ１の存在下で加速され、その抗体がインビボで免疫系を活性化し得ることを示している。
実施例３：ＰＤＡＸモデルにおける、インビボでの化合物のＡＴＴＲ原線維との結合
ＰＤＡＸモデルを特徴づけるために、ＡＴＴＲ特異的抗体の、植え込まれた患者由来ＡＴＴＲ原線維とのインビボ結合を分析している。ＷＴ ＳＫＨ１雌マウスは、短時間ガス麻酔下で、大腿における皮下注射による患者由来ＡＴＴＲ原線維１００μｇの植込み、その後、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、または１５ｍｇ／ｋｇでの蛍光標識ＮＩ－３０１．３７Ｆ１またはアイソタイプ抗体の尾静脈における静脈内注射による投与を受けた。Ｖｉｖｏｔａｇ－６８０での抗体標識を、使用説明書（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に従って実施した。簡単に述べれば、Ｖｉｖｏｔａｇ－６８０エステル反応性色素を、ＤＭＳＯに溶解し、炭酸バッファー中に調製された抗体と混合した。暗闇中での２時間のインキュベーション後、その標識された抗体を、ＰＢＳバッファー中４℃で一晩の透析により精製した。
ＰＤＡＸモデルを特徴づけるために、ＡＴＴＲ特異的抗体の、植え込まれた患者由来ＡＴＴＲ原線維とのインビボ結合を分析している。ＷＴ ＳＫＨ１雌マウスは、短時間ガス麻酔下で、大腿における皮下注射による患者由来ＡＴＴＲ原線維１００μｇの植込み、その後、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、または１５ｍｇ／ｋｇでの蛍光標識ＮＩ－３０１．３７Ｆ１またはアイソタイプ抗体の尾静脈における静脈内注射による投与を受けた。Ｖｉｖｏｔａｇ－６８０での抗体標識を、使用説明書（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に従って実施した。簡単に述べれば、Ｖｉｖｏｔａｇ－６８０エステル反応性色素を、ＤＭＳＯに溶解し、炭酸バッファー中に調製された抗体と混合した。暗闇中での２時間のインキュベーション後、その標識された抗体を、ＰＢＳバッファー中４℃で一晩の透析により精製した。
移植から４８時間後、マウスを屠殺し、皮膚生検を収集し、固定し、包埋し（ＰＰＦＡ）、組織学的分析のために切断した。切片を脱水し、チオフラビンＳで染色し、Ｄａｐｉ含有封入剤でマウントした。スライドスキャニングを、Ｄａｐｉ、ＦＩＴＣ、およびＣｙ５チャネルを用いる２０×倍率での自動蛍光顕微鏡を用いて、実施した。
皮下ＡＴＴＲ原線維植込片は、それらの特異的な形および外観により隣接する皮膚組織から明らかに認識可能であり、強いチオフラビンＳ蛍光を提示し、保存されたアミロイド立体構造を有する原線維の存在を示した（図３Ａ）。蛍光標識抗体ＮＩ－３０１．３７Ｆ１の結合は、原線維上で用量依存的に増加したが、周囲組織上では増加しなかった（図３Ａ）；原線維結合は、ＮＩ－３０１．３７Ｆ１に対して選択的であり、アイソタイプ抗体に関しては観察されなかった。ＮＩ－３０１．３７Ｆ１蛍光はチオフラビンＳ蛍光と重複し、ＡＴＴＲ原線維上でのＮＩ－３０１．３７Ｆ１の結合を示した。これらの結果は、ＮＩ－３０１．３７Ｆ１が、マウスに植え込まれた患者由来ＡＴＴＲ原線維と用量依存的に結合することを示している。
原線維部位におけるＮＩ－３０１．３７Ｆ１－ＶＴ６８０蛍光強度は、ソフトウェアに基づいた画像分析により定量化され、抗体密度のプロキシとしての役割を果たした。蛍光強度は、試験された全用量範囲に渡って連続的に増加した；より具体的には、試験された最高用量（５ｍｇ／ｋｇおよび１５ｍｇ／ｋｇ）の間でさえもＮＩ－３０１．３７Ｆ１結合の飽和はなかったことを示す、蛍光強度の連続的増加があった。
キメラＮＩ－３０１．３７Ｆ１についての血漿レベルを、直接的ＴＴＲ ＥＬＩＳＡおよび既知濃度の抗体での較正曲線を用いて決定した。簡単に述べれば、９６ウェルマイクロプレートを、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）中１０μｇ／ｍｌの濃度に希釈されたヒト野生型ＴＴＲで３７℃で１時間コーティングした。非特異的結合部位を、ブロッキングバッファー（ＰＢＳバッファー中２％ ＢＳＡ、０．１％ ｔｗｅｅｎ－２０ ｐＨ７．４）で、ＲＴで１時間ブロッキングした。血漿試料を、ブロッキングバッファー中に二連で１：５００希釈した。較正試料を、同様に、キメラＮＩ－３０１．３７Ｆ１抗体をブロッキングバッファー中、二連で、５ｐＭから５ｎＭまでの濃度範囲で希釈することにより、調製した。希釈された血漿試料を、二連で（試料あたり合計四連）、以下のように定量化した：試料を、４℃で一晩、インキュベートし、キメラＮＩ－３０１．３７Ｆ１を、ブロッキングバッファー中１：４０００希釈度でのＨＲＰコンジュゲート型抗マウスＩｇＧ２ａ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）で検出し、その後、標準手順を用いて、ＨＲＰ活性を測定した。
ＡＴＴＲ原線維上での蛍光強度に対するＮＩ－３０１．３７Ｆ１－ＶＴ６８０濃度の分析により、０．５～１５ｍｇ／ｋｇの用量範囲に渡って直線相関が明らかになった。この直線相関は、最高１５ｍｇ／ｋｇまでの抗体用量で標的の飽和がないことを示している（図３Ｂ）。用量群０．０５ｍｇ／ｋｇについての結果は、相関分析から除外され、その抗体濃度が、非常に低い濃度におけるマトリックス干渉効果により過小評価された可能性があるからである。
実施例４：インビボでのＡＴＴＲ原線維クリアランス
患者由来ＡＴＴＲ原線維を、ＷＴマウスに皮下注射により植え込み、その後、５．０ｍｇ／ｋｇでのマウスキメラＮＩ－３０１．３７Ｆ１バリアント（ｃｈ．ＮＩ－３０１．３７Ｆ１）または対応するアイソタイプ抗体を静脈内に投与した。６時間または９６時間後、マウスを屠殺し、皮膚生検を、組織学的分析のために収集した。ＡＴＴＲ原線維を、市販のヒトＴＴＲ抗体Ｄａｋｏ Ａ０００２を用いる免疫組織化学法により検出した。定量化を、自動顕微鏡観察法および画像分析法を用いて実施し、ＡＴＴＲ原線維の量を、植込片組織エリアに占めるパーセンテージとして表した。
患者由来ＡＴＴＲ原線維を、ＷＴマウスに皮下注射により植え込み、その後、５．０ｍｇ／ｋｇでのマウスキメラＮＩ－３０１．３７Ｆ１バリアント（ｃｈ．ＮＩ－３０１．３７Ｆ１）または対応するアイソタイプ抗体を静脈内に投与した。６時間または９６時間後、マウスを屠殺し、皮膚生検を、組織学的分析のために収集した。ＡＴＴＲ原線維を、市販のヒトＴＴＲ抗体Ｄａｋｏ Ａ０００２を用いる免疫組織化学法により検出した。定量化を、自動顕微鏡観察法および画像分析法を用いて実施し、ＡＴＴＲ原線維の量を、植込片組織エリアに占めるパーセンテージとして表した。
皮下ＡＴＴＲ原線維植込片は、それらの特異的な形および外観により、隣接する皮膚組織から明らかに認識可能であった。植込みおよび処置投与から６時間後、ＡＴＴＲ原線維植込片を、ＩＨＣによりＴＴＲについて完全に染色し、ＴＴＲ染色は、両方の処置群において植込片組織エリアの平均６０～７０％を占めた（図４）。原線維植込みから９６時間後、ＴＴＲ染色エリアは、ｃｈ．ＮＩ－３０１．３７Ｆ１で処置された群においては植込片エリアのたった１２％、アイソタイプ群においては３９％を占めた（図４）。その２つの群間の差は、ｐ＜０．０００１で統計的に有意であった。これらの結果は、ＡＴＴＲ原線維排除が、ｃｈ．ＮＩ－３０１．３７Ｆ１での処置により加速されたことを実証している。
同様の実験を、コンゴレッド染色およびチオフラビンＳ染色に基づいて行い、それらは、ｃｈ．ＮＩ－３０１．３７Ｆ１での処置が、アイソタイプ抗体での処置と比較して、ＡＴＴＲ原線維排除を加速したことをさらに確認した。
インビボでＮＩ－３０１．３７Ｆ１の活性をさらに特徴づけるために、ＡＴＴＲ原線維移植マウスは、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、および５０ｍｇ／ｋｇでのｃｈ．ＮＩ－３０１．３７Ｆ１、または５０ｍｇ／ｋｇでのアイソタイプの静脈内の単回投与を受けた。各群からの１匹のマウスを、参照のため、薬物投与から６時間後、屠殺した（ｔ０）；全ての他のマウスを、９６時間後に屠殺し、皮膚生検を、上記のように組織学的分析のために収集した。
アイソタイプ処置マウスにおいて、ｔ０において移植片エリアの８６％を占めたＡＴＴＲ原線維は、４日（９６時間）後、５８％に減少し（図５）、このモデルにおける自発的原線維排除を反映した。原線維排除は、ｃｈ．ＮＩ－３０１．３７Ｆ１での処置により用量依存的に加速された。処置効果は、０．５ｍｇ／ｋｇ以上の用量において統計的に有意であったが（図５）、０．０５ｍｇ／ｋｇの非常に低い用量においては、限られた効果量および用量群あたりのマウスの少ない数により、有意ではなかった。完全な原線維排除は、５．０ｍｇ／ｋｇ用量と５０ｍｇ／ｋｇ用量の両方で得られた。
これらのデータは、インビボでのＮＩ－３０１．３７Ｆ１の活性を確認し、ＡＴＴＲ原線維の排除についての免疫系の活性化がすでに低用量で起こっていることを示している。
実施例５：抗体処置によるＰＤＡＸモデルの特徴づけ
実施例４に示されているような、ＰＤＡＸモデルにおけるインビボでのＡＴＴＲ原線維のクリアランスを、骨髄系細胞マーカーＩＢＡ１、ＤＣ１１Ｂ、およびＬＹ６Ｇについての染色によりさらに特徴づけた。
実施例４に示されているような、ＰＤＡＸモデルにおけるインビボでのＡＴＴＲ原線維のクリアランスを、骨髄系細胞マーカーＩＢＡ１、ＤＣ１１Ｂ、およびＬＹ６Ｇについての染色によりさらに特徴づけた。
同種移植片炎症因子１（ＡＩＦ１）としても知られたＩＢＡ１は、マクロファージ、加えて、活性化好中球についてのマーカーである。ＡＴＴＲ移植片組織を、ＩＢＡ１発現についてＩＨＣにより染色した。ＡＴＴＲ移植片組織内およびその周囲に存在する細胞は、移植から６時間後、少しのＩＢＡ１発現も存在しなかった（図６Ａ）。同様に、移植から９６時間後のＩＢＡ１発現は、少なく、または存在せず、ＡＴＴＲ移植片エリア内のほんのわずかな細胞においてのみ検出された。
表面抗原分類分子１１Ｂ（ＣＤ１１Ｂ）はまた、インテグリンαＭ（ＩＴＧＡＭ）、マクロファージ－１抗原（Ｍａｃ－１）、または補体受容体３（ＣＲ３）という名前でも知られており、単球およびマクロファージだけでなく、顆粒球およびナチュラルキラー細胞によっても発現されている。ＩＨＣによりＣＤ１１Ｂ発現について染色されたＡＴＴＲ移植片組織は、移植から６時間後、移植片組織の内部およびそれに隣接した、ＣＤ１１Ｂ陽性細胞を提示した（図６Ｂ）。この時点において、ＣＤ１１Ｂ陽性細胞は、典型的には、小さくかつアメーバ様であり、細胞の一部は伸長した突起を提示した。移植から９６時間後、本発明者らは、対照抗体処置マウス、およびｃｈ．ＮＩ－３０１．３７Ｆ１処置マウスの両方において、ＡＴＴＲ移植片全体を浸潤しているＣＤ１１Ｂ陽性細胞の大きな増加を観察した。
ＬＹ６Ｇは、ＧＰＩアンカー型タンパク質であり、ＬＹ６Ｃと共に、ミエロイド分化抗原ＧＲ－１のコンポーネントである。ＬＹ６Ｇは、主に、末梢好中球上に存在する。ＬＹ６Ｇ発現について染色されたＡＴＴＲ移植片切片は、処置に関係なく、移植から６時間後、ＡＴＴＲ移植片の内部および周囲にＬＹ６Ｇ陽性細胞を提示した（図６Ｃ）。対照的に、移植から９６時間後、ＬＹ６Ｇ発現細胞は検出されなかった。
Claims (21)
- 患者由来アミロイド異種移植（ＰＤＡＸ）非ヒト動物モデルであって、前記動物が、アミロイドーシスまたはアミロイド関連疾患を患っている患者の組織または器官に由来するアミロイド原線維の植込片により特徴づけられ、前記アミロイドおよびアミロイド原線維のそれぞれが、アミロイドトランスサイレチン（ＡＴＴＲ）を含み、前記アミロイド原線維が、皮下もしくは被膜下に植え込まれており、または腎臓、腹膜、筋肉、脳、神経、眼、舌、もしくは心臓に植え込まれている、モデル。
- 動物が、マウス、ラット、または非ヒト霊長類である、請求項１に記載のモデル。
- 動物が、少なくともアミロイド原線維タンパク質について、非トランスジェニックである、請求項１または２に記載のモデル。
- アミロイドーシスまたはアミロイド関連疾患を治療できる抗アミロイド薬を決定および／または獲得する方法であって、
（ａ）薬物を請求項１～３のいずれか一項に記載のモデルに投与するステップ、および
（ｂ）前記モデルにおいてアミロイド原線維を決定するステップを含み、前記薬物を投与した際のアミロイド原線維の排除または低下が、対照と比較して加速していることが、抗アミロイド薬への適合性を示す、方法。 - 免疫組織化学法を含む、投与後の第１および第２の時点において収集された組織生検に対してのアミロイド原線維の分析および定量化をさらに含む、請求項４に記載の方法。
- 前記アミロイド原線維の量が、植込片組織エリアに占めるパーセンテージとして表され、薬物で処置された群において、植込片組織エリアに占めるアミロイド染色エリアが対照群より有意に低い、請求項５に記載の方法。
- アミロイド原線維の排除または低下が用量依存的に観察される、請求項４から６のいずれか一つに記載の方法。
- 薬物が、抗アミロイド原線維タンパク質抗体を含む、請求項４～７のいずれか一項に記載の方法。
- 対照が、対応するアイソタイプ抗体である、請求項４～８のいずれか一項に記載の方法。
- 抗体が、ヒト由来の抗体であり、そのバリアントが、異種性定常ドメインを含む、請求項８または９に記載の方法。
- 抗体が、ヒトメモリーＢ細胞由来の抗体である、請求項１０に記載の方法。
- 前記バリアント抗体がキメラ抗体であり、かつ前記異種性定常ドメインが、モデルに用いられた動物と同じ種に由来する、請求項１０または１１に記載の方法。
- 薬物が、静脈内に、腹腔内に、皮下に、または経口で投与される、請求項８～１２のいずれか一項に記載の方法。
- 抗アミロイド薬および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物の製造方法であって、
（ａ）前記薬物を、請求項４～１３のいずれか一項に記載の方法に供するステップ、ならびに
（ｂ）適切な抗アミロイド薬として決定された前記薬物を薬学的に許容される担体と混合するステップ、を含む方法。 - 薬学的組成物が、アミロイドーシスまたはアミロイド関連疾患の治療のために設計される、請求項１４に記載の方法。
- アミロイドーシスまたはアミロイド関連疾患を治療できる抗アミロイド薬の特徴づけ、検証、開発、および／または品質管理のための方法であって、
（ｉ）前記薬物を請求項４～１３のいずれか一項に記載の方法に供するステップ、
（ｉｉ）（ｉ）において得られた情報をクライアント、契約当事者、もしくは協力パートナーへ伝達し、および／または適切な抗アミロイド薬であると決定された前記薬物を選択するステップ、ならびに、任意で
（ｉｉｉ）アミロイドーシスまたはアミロイド関連疾患の治療のために、前記抗アミロイド薬または前記抗アミロイド薬を含む薬学的組成物を使用するステップ、
を含む方法。 - アミロイドーシスまたはアミロイド関連疾患の治療のための医薬の製造における、薬物の特徴づけ、品質管理および／もしくは開発、前臨床試験および／もしくは並行臨床試験、または薬物の選択もしくは検証のための、請求項１～３のいずれか一項に記載のモデルの使用。
- （ｉ）アミロイドーシスまたはアミロイド関連疾患を患っている患者から得られた組織生検からのアミロイド原線維の単離、および
（ｉｉ）非ヒト動物における前記単離されたアミロイド原線維の植込みを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の患者由来アミロイド異種移植（ＰＤＡＸ）非ヒト動物モデルを作製する方法。 - 前記アミロイド原線維の総タンパク質濃度が、０．５～５ｍｇ／ｍｌである、請求項１８に記載の方法。
- 前記アミロイド原線維の総タンパク質濃度が、１～４ｍｇ／ｍｌである、請求項１８または１９に記載の方法。
- 前記アミロイド原線維の総タンパク質濃度が、２±０．５ｍｇ／ｍｌである、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の方法。
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