CN102892787B - 放射性金属标记抗钙粘素抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于提供一种癌组织特异性高蓄积的放射性金属抗钙粘素抗体、抗癌效果高且安全性高的癌治疗药物和癌诊断药物。一种放射性金属标记抗钙粘素抗体，其为放射性金属元素通过金属螯合试剂与抗钙粘素抗体结合而成的抗体。

Description

放射性金属标记抗钙粘素抗体
技术领域
本发明涉及癌细胞特异性高蓄积的放射性金属标记抗钙粘素抗体，还涉及含有该抗体的癌治疗药物和癌诊断药物。
背景技术
癌位居死亡原因的第一位，因而希求新的治疗方法。作为癌的治疗方法，有外科治疗法、放射线治疗法、化学治疗法（抗癌剂），但在外科手术后也可以采用由抗癌剂进行的治疗。
作为抗癌剂，可以使用烷基化剂、代谢拮抗剂、生物碱类抗癌剂、抗生物质抗癌剂、铂制剂等，但这些抗癌剂的治疗效果还不能说是充分的，存在非癌细胞特异性、副作用发生频率高的问题。从这样的观点出发，希望开发更优异的抗癌剂。
另一方面，钙粘素（Cadherin）是在细胞表面表达的Ca2+依赖性的粘合分子。在该钙粘素中，已知有E钙粘素、N钙粘素、P钙粘素（CDH3）等典型的钙粘素，此外还有原钙粘素、桥粒钙粘素等。已知这些钙粘素同源结合而形成粘附、连接，通过细胞内的连环蛋白与细胞内骨架系统（肌动蛋白纤维）连接，据认为通过这样的机理控制着细胞粘合。
另外，除了细胞粘合以外，钙粘素据认为也参与胚胎发生、形态发生、突触形成、突触可塑性，还参与癌的浸润、转移。因此，有报告抗钙粘素抗体在癌治疗中是有用的（专利文献1～3）
现有技术文献 
专利文献
专利文献1：日本特表2005-522982号公报
专利文献2：日本特表2008-538909号公报
专利文献3：日本特表2009-528257号公报
发明内容
发明要解决的课题
但是，抗钙粘素抗体的抗癌效果不能说是充分的，因而希望开发更优异的癌治疗药物。
因此，本发明的课题在于提供一种癌组织蓄积性高的放射性金属标记抗钙粘素抗体，以其为有效成分的抗癌效果高的癌治疗药物、和在其有效性预测与治疗效果确认中可以使用的癌诊断药物。
用于解决课题的方法
为此，本发明的发明人为了解决上述课题而进行了各种研究，结果发现，通过金属螯合试剂使放射性金属元素与抗钙粘素抗体结合而得到的放射性金属标记抗钙粘素在荷癌动物的癌组织中特异性蓄积，且其抗癌效果相比于抗钙粘素抗体给药组格外显著地提高，从而完成了本发明。
即，本发明提供一种放射性金属元素通过金属螯合试剂结合而成的抗钙粘素抗体，还提供以其为有效成分的癌治疗药物和癌诊断药物。
另外，本发明提供用于在癌治疗或癌诊断中使用的上述抗钙粘素抗体。
另外，本发明提供上述抗钙粘素抗体在癌治疗药物或癌诊断药物的制造中的使用。
本发明还提供以投与有效量的上述抗钙粘素抗体为特征的癌治疗方法或癌诊断方法。
发明的效果 
以本发明的放射性金属标记抗钙粘素抗体为有效成分的癌治疗药物，向癌组织的蓄积性高且癌组织缩小效果好，因此，如果使用该药物，就能够副作用少且有效地进行癌治疗。另外，通过使用本发明的癌诊断药物，能够进行本发明的癌治疗药物的有效性的预测和治疗效果的确认。
附图说明
图1是表示使用流式细胞术进行的抗体亲和性评价的结果。
图2是表示投与67Ga-DOTA-PPMX2016抗体（投入比1∶10）96小时后的体内分布。
图3是表示投与67Ga-DOTA-PPMX2016抗体（投入比1∶3）96小时后的体内分布。
图4是表示投与67Ga-DOTA-PPMX2029抗体（投入比1∶10）96小时后的体内分布。
图5是表示投与67Ga-DOTA-PPMX2029抗体（投入比1∶3）96小时后的体内分布。
图6是表示投与67Ga-DOTA-PPMX2025抗体（投入比1∶10）96小时后的体内分布。
图7是表示投与67Ga-DOTA-PPMX2025抗体（投入比1∶3）96小时后的体内分布。
图8是表示将67Ga-DOTA-PPMX2025抗体的DOTA投入比设为1∶1、1∶3、1∶10时投与96小时后的体内分布。
图9是表示投与111In-DOTA-PPAT-052-27c抗体（投入比1∶3）96小时后的体内分布。
图10是表示投与111In-DOTA-PPAT-052-27c抗体（投入比1∶3）48小时后的体内分布。
图11是表示投与111In-DOTA-PPAT-052-28c抗体（投入比1∶3）48小时后和96小时后的体内分布。
图12是表示90Y-DOTA-PPMX2029抗体（投入比1∶3）在异种移植模型中的抗肿瘤效果。
图13是表示90Y-DOTA-PPAT-052-27c抗体（投入比1∶3）在异种移植模型中的抗肿瘤效果。
图14是表示确认CDH3蛋白质表达的免疫组织化学染色的结果。
具体实施方式
本发明的放射性金属标记抗钙粘素抗体是放射性金属元素通过金属螯合试剂结合而成的抗钙粘素抗体，癌治疗药物和癌诊断药物含有该抗体。
抗钙粘素抗体只要是与钙粘素特异性结合的抗体，则没有特别限 制。在这里，作为钙粘素，可以列举E钙粘素、N钙粘素、P钙粘素等，但更优选P钙粘素。
抗钙粘素抗体中包括单克隆抗体和多克隆抗体、以及保持与抗原决定簇特异性结合的能力的抗体及T-细胞受体片段等抗体的变种和衍生物。
另外，抗钙粘素抗体的种类没有特别限制，可以适当使用小鼠抗体、人抗体、大鼠抗体、兔抗体、绵羊抗体、骆驼抗体、鸡抗体等，和出于使其对人的异种抗原性下降等的目的而人为改变的基因重组型抗体，例如，嵌合抗体、人源化抗体等。基因重组型抗体可以使用已知的方法制造。嵌合抗体是由人以外的哺乳动物，例如小鼠抗体的重链、轻链的可变区和人源抗体的重链、轻链的恒定区组成的抗体，可以通过连接编码小鼠抗体可变区的DNA和编码人源抗体恒定区的DNA，将其重组入表达载体中，并导入宿主中，使其产生而得到（例如，参照Cabilly S.等，Proc NatlAcad Sci USA.198481（11）3273-7、Morrison等，Proc Natl Acad Sci USA.198481（21）6851-5、欧洲专利申请公开序号第171496号）。人源化抗体也被称为重构（reshaped）人源抗体，是将人以外的哺乳动物，例如小鼠抗体的互补性决定区（CDR：complementarity determining region）向人源抗体的互补性决定区移植而得到的抗体，其通常的基因重组方法也是已知的。具体而言，通过PCR法，从以使末端部具有重叠序列的方式制得的数个寡核苷酸，合成以使小鼠抗体的CDR和人源抗体的构架区（framework region：FR）连接的方式设计的DNA序列。将所得到的DNA与编码人源抗体恒定区的DNA连接，接着重组入表达载体中，导入宿主中而使之产生，由此可以得到（参照欧洲专利申请公开序号EP239400、国际专利申请公开序号WO96/02576）。通过CDR所连接的人源抗体的FR，选择互补性决定区形成良好的抗原结合部位的FR。根据需要，人源化抗体的互补性决定区可以取代抗体可变区的构架区的氨基酸，以形成适当的抗原结合部位（Sato,K.et al.,Cancer Res,1993,53,851-856.）。
嵌合化、人源化抗体的氨基酸序列优选与来自保藏杂交瘤的表达cDNA的Vh或Vl区域的氨基酸序列为100％同一的序列，但也优选通过基因工程学的改变而具有90％以上同一的序列的抗体。在人源化、 嵌合化的过程中，一直进行着以改善抗原结合为目的的残基取代的调整。这种改变了一部分序列的抗体，可以认为基本上是来自原来的杂交瘤的抗体。
使用基因工程学方法制作嵌合化抗体和人源化抗体的方法已经是已知的方法。即，将确认为基础的单克隆抗体的VH、VL序列进行基因工程学的改变后，由通常的方法嵌合化或人源化。
另外，人源抗体的获取方法也是已知的。例如，在体外（in vitro）以所希望的抗原或表达所希望抗原的细胞致敏人淋巴细胞，使致敏淋巴细胞与人骨髓瘤细胞，例如U266融合，也能够得到具有与抗原结合活性的所希望的人源抗体（参照特公平1-59878）。另外，通过由所希望的抗原免疫具有人源抗体基因全部的库的转基因动物，能够获取所希望的人源抗体（参照WO93/12227、WO92/03918、WO94/02602、WO94/25585、WO96/34096、WO96/33735）。还已知使用人源抗体文库，通过淘选获取人源抗体的技术。例如，将人源抗体的可变区作为单链抗体（scFv），通过噬菌体展示法使之在噬菌体的表面表达，能够选择与抗原结合的噬菌体。如果分析所选择的噬菌体的基因，就能够决定编码与抗原结合的人源抗体可变区的DNA序列。如果清楚了与抗原结合的scFv的DNA序列，就能够制作表达该序列的适当的载体，获取人源抗体。这些方法已经是周知的，可以参考WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388。
另外，这些抗钙粘素抗体，只要不丧失识别由钙粘素基因编码的蛋白质的全长或一部分长度的特性，也可以是抗体片段（fragment）等低分子化抗体和抗体的修饰物等。作为抗体片段的具体例子，例如，可以列举Fab、Fab’、F（ab’）2、Fv、Diabody等。在得到这样的抗体片段时，可以构建编码这些抗体片段的基因，将其导入表达载体后，在适当的宿主细胞中使之表达（例如，参照Co,M.S.et al.,J.Immunol.（1994）152,2968-2976；Better,M.and Horwitz,A.H.,Methods Enzymol.（1989）178,476-496；Pluckthun,A.and Skerra,A.,Methods Enzymol.（1989）178,497-515；Lamoyi,E.,Methods Enzymol.（1986）121,652-663；Rousseaux,J.et al.,Methods Enzymol.（1986）121,663-669； Bird,R.E.and Walker,B.W.,Trends Biotechnol.（1991）9,132-137）。
作为抗体的修饰物，也可以使用与聚乙二醇（PEG）等各种分子结合的抗体。这样的抗体修饰物可以通过在所得到的抗体上施加化学修饰而得到。其中，抗体的修饰方法在该领域已经被确立。
另外，在本发明中，出于增强细胞损伤活性的目的等，也能够使用改变了糖链的抗体等。抗体的糖链改变技术已经是已知的（例如，WO00/61739、WO02/31140等）。
另外，在本发明中，也包含对2种以上不同抗原具有特异性的多特异性抗体。通常，这样的分子是结合2个抗原的分子（即，双重特异性抗体），在本发明中的“多特异性抗体”是包含对其以上（例如，3种的）抗原具有特异性的抗体的多特异性抗体。多特异性抗体可以是由全长构成的抗体，或是那样的抗体的片段（例如，F（ab’）2二特异性抗体）。
本发明的抗钙粘素抗体及其抗体片段，能够通过任意适当的方法，例如，以体内、培养细胞、体外翻译反应和重组DNA表达系统来制造。
制造单克隆抗体和抗体产生细胞（杂交瘤细胞）的方法在该技术领域众所周知的（Campbell.“Monoclonal Antibody Technology:Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology”,Elsevier Science Publishers,Amsterdam,The Netherlands,1984:St.Groth et al.,J.Immunol.Methods 35:1-21,1980）。将钙粘素基因所编码的蛋白质或片段作为免疫原使用，对已知生成抗体的任意动物（小鼠、兔等）通过皮下或腹腔内注射而能够免疫。在进行免疫时可以使用佐剂，那样的佐剂在该技术领域中是周知的。
多克隆抗体能够通过从免疫动物分离含有抗体的抗血清，使用ELISA分析、蛋白质免疫印迹分析或放射免疫分析等在该技术领域众所周知的方法，针对具有所希望的特异性的抗体的存在进行筛选而得到。
单克隆抗体能够通过从免疫过的动物切除脾脏细胞，使之与多发性骨髓瘤细胞融合，制作产生单克隆抗体的杂交瘤细胞而得到。使用ELISA分析、蛋白质免疫印迹分析或放射免疫分析等在该技术领域众所周知的方法，选择产生识别目的蛋白质或其片段的抗体的杂交瘤细 胞。对分泌所希望抗体的杂交瘤细胞进行克隆，在适当的条件下培养，回收所分泌的抗体，使用在该技术领域中众所周知的方法，例如离子交换柱、亲和色谱等能够进行纯化。或者，也可以使用转基因小鼠（XenoMouse）株制造人源型单克隆抗体（参照Green,J.Immunol,Methods 231:11-23,1999;Wells,Eek,Chem Biol 2000Aug:7（8）：R185-6）。另外，现在也进行了基于不进行免疫的噬菌体展示的单克隆抗体的制作，本发明的单克隆抗体，表示使用单一的抗体产生细胞或编码由其得到的抗体的DNA而生产的单一分子种类的抗体，使用上述的任意方法制造均可。
编码单克隆抗体的DNA可以通过惯用的方法（例如，使用能够与编码单克隆抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针）而容易地分离并确定序列。杂交瘤细胞是这样的DNA优选的起始材料。先将其分离，随即插入表达DNA的载体中，重组入E.coli细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢（CHO）细胞或者不被转化就不产生免疫球蛋白的多发性骨髓瘤细胞等宿主细胞中，从重组的宿主细胞产生单克隆抗体。另外，作为其他的方式，可以使用从由McCafferty等（Nature348:552-554（1990））记载的技术制造的抗体噬菌体文库分离抗体或抗体片段。
在单克隆抗体表达中使用的宿主细胞系，优选使用哺乳动物起源的细胞系。能够选择最适合想表达的单克隆抗体的宿主细胞系。作为一般的宿主细胞系，可以列举来自CHO的细胞株（中国仓鼠卵巢细胞系）、CV1（猴肾脏系）、COS（具有SV40T抗原的CV1衍生物）、SP2/0（小鼠骨髓瘤）、P3x63-Ag3.653（小鼠骨髓瘤）和293（人肾脏）、293T（具有SV40T抗原的293衍生物），但不限定于这些。宿主细胞系可以从商业设施或the American Tissue Culture Collection（ATCC）或从发表文献的发表机关获得。
优选的宿主细胞系是dhfr基因表达缺陷的来自CHO的细胞株或SP2/0的任意种类。分别参照Urland，G.等，Effect ofgamma rays at the dihydrofolate reductase locus:deletions and inversions,Somat.Cell.Mol.Genet.Vol.12,1986.p5555-566、和Schulman,M.等，A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies,Nature Vol.276,1978, p269-270。最优选的宿主细胞系是DHFR缺陷CHO。向宿主细胞系转染质粒可以使用任意的技术进行。作为具体的方法，可以列举转染（包括磷酸钙法、DEAE法、脂质体和电穿孔）、利用仙台病毒等的包膜导入DNA的方法、显微注射和使用逆转录病毒或腺病毒等病毒载体的感染，但不受这些方法的限定。参照Current Protocols in Molecular Biology,Chapter 9Introduction of DNA into Mammalian Cells,John Wiley and Sons,Inc.。最优选的是向通过电穿孔向宿主中导入质粒。
本发明的抗钙粘素抗体的钙粘素中的识别部位优选序列号2的1-655部分。
另外，作为本发明的抗钙粘素抗体，优选杂交瘤细胞PPMX2016、PPMX2025、PPMX2029、PPAT-052-02、PPAT-052-03、PPAT-052-09、PPAT-052-24、PPAT-052-25、PPAT-052-26、PPAT-052-28和基因导入CHO  细胞株PPAT-052-27c、PPAT-052-02c、PPAT-052-03c、PPAT-052-09c、PPAT-052-21c、PPAT-052-24c、PPAT-052-25c、PPAT-052-26c、PPAT-052-28c、PPAT-052-29c产生的抗体。另外，在本说明中，冠以PPMX和PPAT的序号，可以用于表示抗体生产细胞或该抗体生产细胞产生的抗体的任何意义。
作为与上述抗钙粘素抗体结合的放射性金属，在作为癌治疗药物使用时，优选是细胞损伤性放射性金属，作为癌诊断药物使用时，优选是细胞非损伤性放射性金属。
作为这样的细胞损伤性放射性金属，例如，可以列举钇90（90Y）、铼186（186Re）、铼188（188Re）、铜67（67Cu）、铁59（59Fe）、锶89（89Sr）、金198（198Au）、汞203（203Hg）、铅212（212Pb）、镝165（165Dy）、钌103（103Ru）、铋212（212Bi）、铋213（213Bi）、钬166（166Ho）、钐153（153Sm）和镥177（177Lu）等。
在这些放射性金属中，从半衰期、放射线能量、容易的标记反应、标记率、配位化合物的稳定性等方面出发，优选90Y、153Sm、177Lu。
另一方面，作为在诊断药物中使用的细胞非损伤性放射性金属，可以适合地使用锝99m（99mTc）、铟111（111In）、铟113m（113mIn）、镓67（67Ga）、镓68（68Ga）、铊201（201Tl）、铬51（51Cr）、钴57（57Co）、钴58（58Co）、钴60（60Co）、锶85（85Sr）、汞197（197Hg）、铜64（64Cu）， 但不限定于这些。
在使这些放射性金属元素与抗钙粘素抗体结合时，优选使金属螯合试剂与该抗体反应，并使放射性金属元素与其反应，成为配位化合物。这样操作得到的修饰抗体，放射性金属元素通过金属螯合试剂与抗钙粘素抗体结合。
作为在这样的配位化合物形成中可以使用的金属螯合试剂的例子，例如，可以列举（1）8-羟基喹啉、8-乙酰氧基喹啉、8-羟基喹哪啶、硫酸氧基喹啉、邻乙酰基喔星、邻苯甲酰基喔星、邻对硝基苯甲酰基喔星、作为具有喹啉骨架的喹诺酮类化合物的诺氟沙星、氧氟沙星、依诺沙星、环丙沙星、洛美沙星、托氟沙星、氟罗沙星、司帕沙星等喹啉衍生物；（2）四氯对苯醌酸、铝试剂、硫脲、焦没食子酚、铜铁试剂、铋试剂（Ⅱ）（Bismuthiol Ⅱ）、没食子酰基没食子酸、硫醇盐（thiolide）、2-巯基苯并噻唑、四苯基氯化砷鎓等化合物；（3）乙二胺四乙酸（EDTA）、二亚乙基三胺五乙酸（DTPA）和具有与它们类似的骨架的二羟基乙基甘氨酸、二氨基丙醇四乙酸、乙二胺二乙酸、乙二胺二丙酸盐酸盐、羟乙基乙二胺三乙酸、乙二胺四（亚甲基膦酸）、乙二醇醚二胺四乙酸、六亚甲基二胺四乙酸、羟乙基亚氨基二乙酸、亚氨基二乙酸、二氨基丙烷四乙酸、次氮基三乙酸、次氮基三丙酸、次氮基三（亚甲基膦酸）三钠盐、三亚乙基四胺六乙酸、甲基DTPA、环己基DTPA、氨基苄基EDTA、异硫氰基苄基EDTA、异硫氰基苄基DTPA、甲基异硫氰基苄基DTPA、环己基异硫氰基苄基DTPA、马来酰亚胺丙基酰胺苄基EDTA、马来酰亚胺戊基酰胺苄基EDTA、马来酰亚胺十二烷基酰胺苄基EDTA、马来酰亚胺戊基酰胺苄基DTPA、马来酰亚胺十二烷基酰胺苄基EDTA、马来酰亚胺十二烷基酰胺苄基DTPA；（4）1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸（DOTA）、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸（NOTA）、1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四乙酸（TETA）、1,4,7,10-四氮杂环十二烷（Cyclem）、1,4,8,11-四氮杂环十四烷（Cyclam）、异硫氰基苄基DOTA、异硫氰基苄基NOTA等。
这些金属螯合试剂中，从金属螯合物容易向抗体的导入反应、标记率、配位化合物的安全性等方面出发，优选异硫氰基苄基DOTA、甲基异硫氰基苄基DTPA、环己基异硫氰基苄基DTPA。
放射性金属元素与抗钙粘素抗体的结合可以按照通常方法进行。例如，可以通过使金属螯合试剂与抗钙粘素抗体反应，预先制备标记前体，接着使放射性金属元素反应而进行。
在本发明的癌治疗药物和癌诊断药物中，抗钙粘素抗体与金属螯合试剂的摩尔比在癌细胞蓄积性和抗癌效果中是很重要的，该摩尔比（抗体∶螯合试剂）优选为1∶0.1～1∶4.5，更优选为1∶0.5～1∶3。在设为这样的摩尔比时，优选以1∶0.1～1∶小于5，特别优选以1∶1～1∶3的摩尔比投入使之反应。抗体的螯合物修饰数能够通过使用MALDI-TOF质量分析法等测定分子量，比较未修饰抗体与修饰抗体的分子量算出（美国专利公报第7514078号，Lu等，J Pharm Sci,94（4），2005，p788-797、Tedesco等，J Clin Onco,23（16S），2005,4765）。另外，抗体的螯合物修饰数也可以通过螯合物滴定法测定。已知使用碱土类金属比色试剂（偶氮胂Ⅲ）的方法（Bradyr等，Nucl Med Biol,31,795-802,2004、Dadachova等，Nucl Med Biol,26,977-982,1999）。
本发明的癌治疗药物和癌诊断药物，有作为已标记制剂提供的方法和作为含有标记前体的试剂盒制剂提供的方法，在本发明中可以是任意方法。在作为已标记制剂提供时，可以将含有完成标记的抗钙粘素抗体的癌治疗药物或癌诊断药物直接投与使用。在作为试剂盒制剂提供时，可以在用所希望的放射性金属元素进行标记后投与使用。
由于放射性金属元素结合而成的抗钙粘素抗体向癌组织的蓄积性高，且癌细胞损伤活性高，所以，作为对癌组织以外组织的损伤性少、安全性高的癌治疗药物是有用的。另外，相比于抗钙粘素抗体单独的抗癌活性，放射性金属元素结合而成的抗钙粘素抗体的抗癌活性具有显著高的特征。该抗癌活性在抗体∶螯合试剂的摩尔比为1∶0.1～1∶4.5时特别显著。
本发明的癌治疗药物可以和其它抗癌剂并用。作为那样的其它抗癌剂，可以列举烷基化剂、代谢拮抗剂、微管抑制剂、抗生物质抗癌剂、拓扑异构酶抑制剂、铂制剂、分子标的药、激素剂、生物制剂等。作为烷基化剂，可以列举环磷酰胺等氮芥类抗癌剂、雷莫司汀等亚硝基脲类抗癌剂、达卡巴嗪等。作为代谢拮抗剂，可以列举5-FU、UFT、卡莫氟、卡培他滨、替加氟、TS-1、吉西他滨、阿糖胞苷等。作为微 管抑制剂，可以列举长春新碱等生物碱类抗癌剂、多西紫杉醇、紫杉醇等紫杉醇类抗癌剂。作为抗生物质抗癌剂，可以列举丝裂霉素C、多柔比星、表柔比星、柔红霉素、博莱霉素等。作为拓扑异构酶抑制剂，可以列举具有拓扑异构酶Ⅰ抑制作用的伊立替康和拓扑替康、具有拓扑异构酶Ⅱ抑制作用的依托泊苷。作为铂制剂，可以列举顺铂、伯尔定、奈达铂、奥沙利铂。作为分子标的药，可以列举曲妥珠单抗、利妥昔单抗、伊马替尼、吉非替尼、厄洛替尼、贝伐珠单抗、硼替佐米、舒尼替尼、索拉菲尼等。作为激素剂，可以列举地塞米松、非那雄胺、他莫昔芬。作为生物制剂，可以列举干扰素α、β和γ、白介素2。
另外，本发明的治疗药物，既可以与癌治疗法并用，也可以与外科手术以及此外的放射线疗法（包括伽玛刀疗法、射波刀（Cyber knife）疗法、硼中子捕捉疗法、质子线治疗-重粒子线治疗法）、MR引导下聚焦超声手术、冷冻疗法、无线电波凝固疗法、乙醇注入疗法、动脉塞栓疗法等并用。
本发明的癌治疗药物，对包含人的哺乳类的多种癌是有效的，例如，可以列举咽癌、喉癌、舌癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、胃癌，大肠癌、子宫癌、卵巢癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、肾癌、前列腺癌、恶性黑色素瘤、甲状腺癌等上皮癌；骨肉瘤、软骨肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、白血病和恶性淋巴瘤、骨髓瘤等非上皮癌等。
本发明的癌治疗药物可以在水性溶液，优选在汉克斯溶液、林格氏溶液或生理食盐缓冲液等生理学上适合性的缓冲液中溶解。还可以在油性或水性的介质中成为悬浊液、溶液或乳浊液等形状。
本发明的癌治疗药物的给药量根据患者的症状、给药途径、体重、年龄等而不同，例如，成人的1次给药量优选为37～3700MBq。
本发明的癌治疗药物通常以非口服给药途径，例如以注射剂（皮下注射、静脉注射、肌肉注射、腹腔内注射等）、经皮、经粘膜、经鼻、经肺等给药。
本发明的癌诊断药物可以在肿瘤的影像检查中使用。在体内存在表达CDH3蛋白的肿瘤时，本发明的诊断药物在肿瘤中蓄积，可以通 过使用单光子发射断层成像装置（SPECT）、正电子发射断层成像装置（PET）、闪烁照相机等仪器检出放射线而将肿瘤摄像。例如，在投与本发明的诊断药物前，可以用于治疗效果的预测。在治疗前投与诊断药物，对肿瘤进行影像检查，蓄积性越高，预测治疗药物的效果就越高。另外，也可以用于治疗效果的判断。对于不仅接受本发明的治疗药物，而且还接受过任何治疗的患者，投与本发明的诊断药物并对肿瘤进行影像检查，观察蓄积性随时间的变化，由此能够把握肿瘤随时间的缩小或增大。
在诊断药物中使用的抗体，希望是识别与治疗药物竞争的抗原决定簇的抗体，更希望是识别与治疗药物同一的抗原决定簇的抗体。最希望是与治疗药物同一的抗体。
给药途径通常从静脉向血管内给药，但也可以通过动脉给药。给药量根据患者的症状、给药途径、体重、年龄等而不同，例如，成人的1次给药量优选为37～1120MBq。
实施例
接着，列举实施例更详细地说明本发明，但本发明不受这些实施例的任何限定。
实施例1可溶型CDH3抗原的制作 
为了制成抗CDH3抗体制作的免疫原，制作使C末端跨膜区域以后缺失的可溶型CDH3（sCDH3）蛋白质。
（1）可溶型CDH3抗原表达载体的制作
以CDH3全长cDNA为模板，使用以使相当于CDH3细胞外区域的部分（相当于序列号2的1-654，以下记作sCDH3cDNA）被扩增的方式所设计的正向引物（序列号3：CGCGGTACCATGGGGCTCCCTCGT（hCDH3FullFW））和反向引物（序列号4：CCGTCTAGATAACCTCCCTTCCAGGGTCC（hCDH3SolbRV）），进行PCR反应。在反应中，使用KOD-Plus（东洋纺社），以94℃-15秒、55℃-30秒、68℃-90秒、30循环的反应条件进行。
此后，以琼脂糖凝胶电泳切出包含目的大小约2.0kbp的条带的凝胶片段，使用QIA快速凝胶提取试剂盒（Quiagen公司），得到目的 sCDH3cDNA。
为了在表达用载体pEF4/myc-HisB中插入该sCDH3cDNA，以2种限制性内切酶Kpn Ⅰ和Xba Ⅰ处理后，在以相同的Kpn Ⅰ和Xba Ⅰ处理过的pEF4/myc-HisB中使用T4DNA连接酶按照通常方法插入，得到表达载体pEF4-sCDH3-myc-His。
（2）可溶型CDH3蛋白质的表达
以FuGENE6转染试剂的操作方案为准，在转染前日，在直径10cm的培养皿中接种8×105个CHO细胞，培养一晚后，在400μL的无血清RPMI1640培养基中混合8μg的表达载体pEF4-sCDH3-myc-His和16μL的FuGENE6试剂，室温放置15分钟后，加入细胞培养液中进行转染。转染次次日，使用选择试剂（Zeocin），以有限稀释法进行克隆。
可溶型CDH3表达CHO细胞的选拔，以使用抗c-Myc单克隆抗体（SANTA CRUZ BIOTECHNOLOY公司）的蛋白免疫印迹法进行。选择向培养上清中的分泌量多、增殖良好的细胞株，结果得到可溶型CDH3表达CHO细胞株（EXZ1702）。被选择的可溶型CDH3表达CHO细胞株（EXZ1702），使用3个培养面积1500cm2的滚瓶，每个滚瓶中的无血清培养基CHO-S-SFM-Ⅱ（Invitrogen公司）333mL中进行72小时培养，回收培养上清。从得到的培养上清，通过由HisTrap（注册商标）HP柱（GE HEALTHCARE BIO-SCIENCE公司）进行的亲和色谱和由Superdex（注册商标）200pg柱（GE HEALTHCARE BIO-SCIENCE公司）进行的凝胶过滤色谱，得到可溶型CDH3蛋白质。实施例2CDH3表达CHO细胞株的树立
为了得到抗CDH3抗体筛选用细胞株，进行表达全长CDH3的CHO细胞的树立。
（1）CDH3基因表达载体的制作
为了在哺乳类表达载体pEF4/myc-HisB（Invitrogen公司）中插入序列号1所示的全长人源CDH3DNA，以2种限制性内切酶Kpn Ⅰ（Takara Bio公司）和Xba Ⅰ（Takara Bio公司）在37℃处理1小时后，由通常方法通过T4DNA连接酶（Promega公司）插入以相同的Kpn Ⅰ和Xba Ⅰ处理过的pEF4/myc-HisB，得到表达载体pEF4-CDH3-myc-His。
（2）CDH3稳定表达株的获取
以FuGENE（注册商标）6转染试剂（Roche Diagnostics K.K.公司）的操作方案为准，在转染前日，在直径10cm的培养皿中接种8×105个CHO细胞，培养一晚后，在400μL的无血清RPMI1640培养基（SIGMA-ALDRICH公司）中混合8μg表达载体pEF4-CDH3-myc-His和16μL的FuGENE6试剂，室温放置15分钟后，加入细胞培养液中进行转染。转染次次日，使用选择试剂（Zeocin），以有限稀释法进行克隆。
CDH3全长表达CHO细胞的克隆选拔，以使用抗c-Myc单克隆抗体（SANTA CRUZ BIOTECHNOLOY公司）的蛋白免疫印迹法进行。其结果，得到表达量高且增殖良好的CDH3全长表达CHO细胞株（EXZ1501）。由流式细胞术确认EXZ1501与市售抗CDH3抗体（R&DSYSTEMS公司）反应，确认在EXZ1501的细胞膜上表达CDH3蛋白质。
实施例3抗CDH3单克隆抗体的制作
（1）以可溶型CDH3蛋白质作为免疫原的单克隆抗体的制作
等量混合在生理食盐水中溶解的50μg可溶型CDH3蛋白质和Titer-MAX Gold（注册商标）（Titer Max公司），通过在MRL/Ipr小鼠（日本SLC株式会社）的腹腔内和皮下注射进行初次免疫。第2次以后的免疫通过将同样制备的相当于25μg蛋白质的量的混合可溶型CDH3蛋白质和Titer-MAX Gold混合，在腹腔内和皮下注射而实施。从最终免疫3日后，从小鼠无菌制备脾脏细胞，按照通常方法，由聚乙二醇法进行与小鼠骨髓瘤细胞SP2/O-Ag14或P3-X63-Ag8.653的细胞融合。
（2）抗CDH3抗体产生杂交瘤的选拔
抗CDH3抗体的选拔以使用表达全长CDH3的CHO细胞株（EXZ1501）的流式细胞术进行。
即，以2mM EDTA-PBS处理表达全长CDH3的CHO细胞株（EXZ1501），从培养板剥离后，悬浊在FACS溶液中，使其为1×106个/mL。以50μL/孔接种在96孔板中，加入杂交瘤培养上清，以4℃使之反应60分钟，以FACS溶液（200μL/孔）洗净2次后，加入AlexaFluor488标记抗小鼠IgG-山羊F（ab’）2（Invitrogen公司），以4℃ 使之反应30分钟。此后，以FACS溶液洗净2次后，实施流式细胞术，选拔产生与CDH3表达CHO细胞结合的抗体的杂交瘤，得到PPMX2016～PPAT-052-28的40个克隆。选拔的全部杂交瘤与CDH3表达CHO细胞株（EXZ1501）和NCI-H358反应，由流式细胞术确认和CHO细胞不反应。抗体使用蛋白质G柱由杂交瘤的培养上清纯化，在以后的实验中使用。选拔出的杂交瘤中，将PPMX2016（NITEBP-897）、PPMX2025（NITE BP-898）、PPMX2029（NITE BP-899）、PPAT-052-02（NITE BP-1034）、PPAT-052-03（NITE BP-1035）、PPAT-052-09（NITE BP-1036）、PPAT-052-24（NITE BP-1037）、PPAT-052-25（NITE BP-1038）、PPAT-052-26（NITE BP-1039）和PPAT-052-28（NITE BP-1040）于2010年2月10日和2011年1月18日在国家技术评估学会专利微生物保藏中心保藏（日本国千叶县木更津市上总镰足2-5-8）。
实施例4抗体基因的克隆
（1）将编码针对人源CDH3的小鼠单克隆抗体的V区的DNA如下克隆化。按照在Gough,Rapid and quantitative preparation of cytoplasmic RNA from small numbers of cells,Analytical Biochemistry,173,p93-95（1988）中记载的方法（但是，取代在该论文中记载的溶解缓冲液，使用另外的TNE缓冲液25mM Tris-HCl，pH7.5；1％NP-40；150mMNaCl；1mM EDTA，pH8.0），从小鼠杂交瘤细胞中分离细胞质中存在的RNA。作为具体的操作方法，在200μL的TNE缓冲液中悬浊5×106个杂交瘤，溶解细胞膜后，通过离心除去细胞核。在得到的约200μL细胞质上清中加入200μL提取缓冲液（10mM Tris-HCl，pH7.5；0.35MNaCl；1％（w/v）SDS；10mM EDTA，pH8.0；7M尿素）。以苯酚和氯仿提取该混合物，在得到的RNA溶液中，作为载体加入糖原（Roche，Cat No.901393）后，以乙醇使之沉淀。接着，加入10～50μL灭菌蒸馏水溶解RNA沉淀物，使细胞质RNA浓度为0.5～2μg/μL。
（2）由从杂交瘤制备的RNA制作cDNA文库
为了合成单链cDNA，制备20μL包含0.5～3μg如上所述制备得到的细胞质RNA、50mM Tris-HCl，pH8.3（室温）、75mM KCl、3mM MgCl2、10mM DTT、100ng随机引物、0.5mM dNTP、200单位的SuperscriptⅡ （逆转录酶，Invitrogen公司）的反应混合液，以42℃孵育50分钟。将这样合成的cDNA文库作为聚合酶链式反应（PCR）法的模板直接使用。
（3）由PCR法扩增编码抗CDH3抗体可变区的基因
实验中使用的引物均由Hokkaido System Science Co.,Ltd合成。A.使用与在用于以PCR法扩增编码小鼠L链V区的基因而使用的引物5’末端的FR1部分具有相同性的DNA引物、和在3’末端具有与小鼠L链内的J链基因具有相同性的4组引物（ⅰ）、或者在5’末端与L链信号部分（7组引物）和在3’末端具有与KC部分（KVL反义引物）具有相同性的引物组（ⅱ）的2种引物组，通过聚合酶链式反应，从该cDNA中分离鼠免疫球蛋白L链可变区DNA。引物序列如下。
（ⅰ）小鼠L链可变区克隆4组正义引物 
参考“Phage Display-A Laboratory Manual-,Barbas Burton Scott Silverman”PROTOCOL 9.5，由Hokkaido System Science Co.,Ltd合成17种正义引物、3种反义引物。
VK正义（FR1部分）将下述17种引物的混合物作为VK正义引物使用 
5’-GAY ATC CAG CTG ACT CAG CC-3’（简并度：2）：序列号5
5’-GAYATT GTT CTC WCC CAG TC-3’（简并度：4）：序列号6
5’-GAYATT GTG MTMACT CAG TC-3’（简并度：8）：序列号7
5’GAYATT GTGYTRACA CAG TC-3’（简并度：8）：序列号8
5’GAYATT GTRATGACM CAG TC-3’（简并度：8）：序列号9
5’GAYATT MAGATRAMC CAG TC-3’（简并度：16）：序列号10
5’GAYATT CAG ATG AYD CAG TC-3’（简并度：12）：序列号11
5’GAYATY CAGATGACA CAGAC-3’（简并度：4）：序列号12
5’GAY ATT GTT CTC AWC CAG TC-3’（简并度：4）：序列号13
5’GAYATT GWG CTS ACC CAATC-3’（简并度：8）：序列号14
5’GAYATT STRATG ACC CAR TC-3’（简并度：16）：序列号15
5’GAY RTT KTGATGACC CARAC-3’（简并度：16）：序列号16
5’GAYATT GTG ATG ACB CAG KC-3’（简并度：12）：序列号17
5’GAYATT GTGATAACY CAG GA-3’（简并度：4）：序列号18
5’GAY ATT GTG ATG ACC CAG WT-3’（简并度：4）：序列号19
5’-GAY ATT GTG ATG ACA CAA CC-3’（简并度：2）：序列号20
5’GAYATT TTG CTG ACT CAG TC-3’（简并度：2）：序列号21
J反义（4组引物）
J1/J2反义引物-（1）
5’-GGS ACC AAR CTG GAAATM AAA-3’（简并度：8）：序列号22
J4反义引物-（2）
5’-GGG ACAAAG TTG GAAATAAAA-3’：序列号23
J5反义引物-（3）
5’-GGG ACC AAG CTG GAG CTG AAA-3’：序列号24
J1/J2、J4、J5反义引物混合物（4）
（ⅱ）小鼠L链可变区克隆7组引物
VK正义（信号肽部分）
该引物以Novagen公司的小鼠Ig-引物组（Novagen:Merc k.Cat.No.69831-3）为基础，改变碱基序列以除去限制性内切酶部位。
A组正义引物 
5’-ATGRAGWCACAKWCYCAGGTCTTT-3’：序列号25
B组正义引物 
5’-ATGGAGACAGACACACACACTCCTGCTAT-3’：序列号26
C组正义引物 
5’-ATGGAGWCAGACACACTSCTGYTATGGGT-3’：序列号27
D组正义引物（使用下述2种引物的混合物）
5’-ATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGGIWTCTT-3’：序列号28
5’-ATGGGCWTCAAGATGRAGTCACAKWYYCWGG-3’：序列号29
E组正义引物（使用下述3种引物的混合物）
5’-ATGAGTGTGCYCACTCAGGTCCTGGSGTT-3’：序列号30
5’-ATGTGGGGAYCGKTTTYAMMCTTTTCAATTG-3’：序列号31
5’-ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCC-3’：序列号32
F组正义引物（使用下述4种引物的混合物）
5’-ATGAGIMMKTCIMTTCAITTCYTGGG-3’：序列号33
5’-ATGAKGTHCYCIGCTCAGYTYCTIRG-3’：序列号34
5’-ATGGTRTCCWCASCTCAGTTCCTTG-3’：序列号35
5’-ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTCT-3’：序列号36
G组正义引物（使用下述4种引物的混合物）
5’-ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT-3’：序列号37
5’-ATGGATTTWCARGTGCAGATTWTCAGCTT-3’：序列号38
5’-ATGGTYCTYATVTCCTTGCTGTTCTGG-3’：序列号39
5’-ATGGTYCTYATVTTRCTGCTGCTATGG-3’：序列号40
KVL反义引物
ACTGGATGGTGGGAAGATGGA：序列号41
B．用于以PCR法扩增小鼠H链V区基因而使用的引物
使用在5’末端与小鼠H链信号部分（4组引物）具有相同性的引物和在3’末端与IGHC部分具有相同性的引物、或者在5’末端与FR1部分具有相同性的1组引物和在3’末端与小鼠H链的固定恒定区（IGHC）具有相同性的2种引物组，通过聚合酶链式反应，从该cDNA中分离小鼠免疫球蛋白H链可变区DNA。引物序列如下。
（ⅰ）小鼠H链可变区克隆引物
VH正义（信号部分：4组引物）
该引物参考Current Protocols in Immunology（John Wiley and Sons,Inc.）Unit 2.12Cloning,Expression,and Modification of Antibody V Regions的Table 2,12,2制作。
5’-ATG GRATGS AGC TGK GTMATS CTC TT-3’（简并度：32）：序列号42
5’-ATG RAC TTC GGGYTGAGC TKG GTT TT-3’（简并度：8）：序列号43
5’-ATG GCT GTC TTG GGG CTG CTC TTC T-3’：序列号44
5’-ATG GRC AGR CTTACW TYY-3’（简并度：32）：序列号45
（ⅱ）小鼠H链可变区克隆引物
VH正义（FR1部分）
该引物是改变Tan等，“Superhumanized”Antibodies:Reduction of Immunogenic Potential by Complementarity-Determining Region Grafting with Human Germline Sequences:Application to an Anti-CD281,Journal of Immunology 169（2002）p1119-1125的正义引物的碱基序列而设计的。
5’-SAG GTS MAR CTK SAG SAG TCW GG-3’（简并度：256）：序列号46
VH反义（3、4共同的反义引物）
将碱基序列简并而设计，以使其能够与小鼠IgG所有的亚型退火。
5’-CAS CCC CAT CDG TCTATC C-3’（简并度：6）：序列号47实施例5嵌合抗CDH3免疫球蛋白表达载体的制作
表达质粒的制作：通过使用DNA Engine（Peltier Thermal Cycler,MJ Research,Bio-Rad）的PCR法，使用实施例4中所示的引物分别扩增抗CDH3小鼠单克隆抗体L链、H链的可变区。将扩增得到的DNA片段重组入亚克隆载体pGEM（Promega公司）中，使用与该载体的T7、在SP6启动子结合的通用引物确定碱基序列。以IMGT/V-QUEST Search page（http://imgt.cines.fr/IMGT_vquest/vquest?livret=O&Option=mouseIg）检索所得到的抗CDH3抗体的L链和H链的可变区碱基序列，确认抗体基因确实已克隆。
接着，设计分别将克隆化的编码抗CDH3抗体L链的V区的基因与编码人源Cκ区的基因连接的基因、将编码H链的V区的基因与编码人源Cγ1区的基因连接的基因，由GenScript公司人工合成这些L链、H链嵌合抗体基因的全长。此时，为了使在生产细胞中的基因表达有利，进行密码子使用频率的最佳化（按照Kim等在Codon optimization for highlevel expression of human erythropoietin（EPO）in mammalian cells,Gene,1997,p293-301的方法）进行。具体而言，在L链时，为了有效地翻译，将必须的DNA序列（Kozak,M.,J.,At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells.J.Mol.Biol,196,p947-950,1987）、小鼠IGKV的信号肽、抗CDH3抗体的L链的V区、人源Ck区依次排列基因，在其两端附加限制性内切酶部位（在5’一侧是Nhe Ⅰ，在3’一侧是EcoR Ⅰ）。嵌合H链也同样制作。以Nhe Ⅰ和EcoR Ⅰ切断这些人工合成基因，重组入表达载体pCAGGS的Nhe Ⅰ和EcoR Ⅰ部位中，得到抗CDH3嵌合抗体L链表达载体pCAGGS-IGK、H链表达载体pCAGGS-IGH。
实施例6嵌合抗CDH3免疫球蛋白稳定表达载体的制作
为了使用CHO细胞以高水平表达经过基因操作的抗体基因，与CMV启动子连接，制作重组入具有多聚腺苷酸信号的二氢叶酸还原酶（dhfr）基因的载体。
为了制作嵌合抗体的稳定表达生产细胞株，制作重组入dhfr基因的pCAGGS表达载体。具体而言，在一过性表达载体pCAGGS-IGH和pCAGGS-IGK中重组入具有CMV启动子和多聚腺苷酸信号的小鼠dhfr基因。将具有CMV启动子、Kozak序列的小鼠dhfr基因、SV40多聚腺苷酸信号分别由PCR法扩增，以PCR法连接这些基因的混合物，并且在两端附加HindⅢ部位，得到称为HindⅢ-CMV启动子-Kozak-dhfr-多聚腺苷酸-HindⅢ的基因片段。将该片段重组入pCAGGS-IGH或pCAGGS-IGK  的HindⅢ部位中，得到pCAGGS-IGH-CMVp-dhfr-A和pCAGGS-IGK-CMVp-dhfr-A。这些表达载体可以以CAG启动子使嵌合抗体表达，可以以CMV启动子使dhfr基因表达，可以有效地利用基因扩增生产嵌合抗体。
实施例7嵌合抗CDH3生产CHO细胞株的树立 
使用CHO dhfr-细胞（G.Urlaub等，Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in dihydrofolate reductase activity,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77,p4216-4220,1980），通过2种质粒（以氨苄青霉素耐性基因内的Pvu Ⅰ切断质粒，从环状质粒成为线状质粒），即，通过用于表达嵌合抗CDH3L链的pCAGGS-IGK-CMV-dhfr-A载体和用于表达嵌合抗CDH3H链的pCAGGS-IGH-CMV-dhfr-A载体同时进行转化。电穿孔以Lonza公司生产的Amaxa进行。在3×103细胞的0.1mL的Amaxa电穿孔CHO用缓冲液中加入DNA（L链、H链各质粒为2μg/试样），给予脉冲。
在含有10％透析过的FBS、不含HT（H，次黄嘌呤；T，胸苷）的Iscove’s Modified Dulbecco培养基（IMDM）中加入被电穿孔处理过的细胞。从基因导入3日后，将培养基更换为10％透析FBS、2mM L- 谷氨酸、不含HT的IMDM的培养基，以1mg/mL的G418进行neo+转化细胞的选择，得到嵌合抗体产生阳性细胞株克隆。接着，使用由G418选择得到的克隆进行基因扩增。在250nM、1000nM的2轮甲氨喋呤（MTX）中的扩增后，树立了每1升培养上清生产约50～100mg嵌合CDH3抗体的细胞株。确立的嵌合抗CDH3抗体稳定表达CHO细胞株保藏在国家技术评估学会专利微生物保藏中心。
［表1］
  细胞名称   保藏号   细胞名称   保藏号
  PPAT-052-02c   NITE BP-1041   PPAT-052-25c   NITE BP-1046
  PPAT-052-03c   NITE BP-1042   PPAT-052-26c   NITE BP-1047
  PPAT-052-09c   NITE BP-1043   PPAT-052-27c   NITE BP-1048
  PPAT-052-21c   NITE BP-1044   PPAT-052-28c   NITE BP-1049
  PPAT-052-24c   NITE BP-1045   PPAT-052-29c   NITE BP-1050
实施例8纯化抗体的取得
使用protein A从培养上清液进行抗体的纯化，取得纯化抗体。
实施例9亲和性的确认 
使用竞争法，进行小鼠和嵌合抗CDH3抗体亲和性的比较。由竞争法进行的嵌合抗CDH3抗体亲和性的测定，以使用被确认为是CDH3高表达的癌细胞NCI-H358株的流式细胞术（BD公司FACS Calibur）进行。
即，在96孔板中，混合50μL抗体稀释系列（400μg/mL～24ng/mL）和50μL的Alexa488标记抗体（4μg/mL）。通过以2mM EDTA-PBS处理NCI-H358细胞而将其从培养板剥离，在FACS（1％BSA PBS）溶液中悬浊，以使其成为1.5×106/mL，在加入了抗体混合液的孔中添加100μL。添加后，室温下使之反应60分钟，以FACS溶液（200μL/孔）洗净2次后，实施流式细胞术，测定各孔的荧光强度（GEO Mean）。
与只与Alexa488标记抗体（1μg/mL）反应的细胞的GEO Mean值比较，由所得到的GEO Mean值计算Alexa488标记抗体的结合抑制率。算出表示50％抑制的抗体浓度，进行比较。
在图1中表示作为小鼠抗体的PPM×2016和作为其嵌合抗体PPAT-052-27c的亲和性评价的结果。两者的亲和性几乎无差别。
实施例10标记抗体的制作
（1）DOTA与抗体的结合
在缓冲液（50mBicine-NaOH，150mM NaCl，pH8.5）中溶解抗体，将抗体浓度调整为10mg/mL。另一方面，在DMSO中溶解异硫氰基苄基DOTA（Macrocyclics公司生产，B-205），使其浓度为10mg/mL。抗体和DOTA的摩尔比成为1∶1（投入比1∶1）、1∶3（投入比1∶3）、1∶10（投入比1∶10）地混合搅拌，在25℃静置17小时。反应结束后，以脱盐柱（PD-10，GE Healthcare公司生产的17-0435-01）使用PBS进行纯化。使用抗体是PPM×2016、PPM×2025、PPM×2029、PPAT-052-27c、PPAT-052-28c的任意种类。
（2）螯合物导入率的确认
由螯合物滴定法测定抗体的螯合物导入率。预先由通常方法测定修饰抗体的蛋白质浓度，从IgG的分子量算出修饰抗体的摩尔数。
在100μL的由原子吸光分析法定量的1mg/mL标准铜溶液中，加入0.776mg偶氮胂Ⅲ试剂和3mL不含金属的5M醋酸铵（Sigma Aldrich公司生产）溶液，再加入超纯水，最终容量成为10mL，在暗处室温保存，制成偶氮胂Ⅲ溶液。在超纯水中溶解DOTA，制成DOTA标准液。在超纯水中溶解修饰抗体，制成修饰抗体溶液。混合10μL DOTA标准液或修饰抗体溶液和190μL偶氮胂Ⅲ溶液，以37℃孵育30分钟后，测定在630nm处的吸光度。由DOTA标准液的吸光度制成标准曲线，算出修饰抗体结合的DOTA数，作为DOTA平均修饰数。
其结果，DOTA投入比和实际的DOTA平均修饰数的关系如表2，
实际上确认了与抗体结合的DOTA数由DOTA的投入比决定。
［表2］
  抗体和DOTA投入比   DOTA平均修饰数
  PPMX2025（投入比1∶1）   0.9
  PPMX2025（投入比1∶3）   2.0
  PPMX2025（投入比1∶10）   5.3
  PPMX2016（投入比1∶1）   0.7
  PPMX2016（投入比1∶3）   2.1
  PPMX2016（投入比1∶10）   5.2
PPAT-052-27c（投入比1∶3）   1.8
（注）：PPAT-052-27c只实施投入比1∶3
（3）67Ga、111In或90Y标记抗体的制备
（ⅰ）67Ga、111In标记
在缓冲液（0.25M，醋酸铵-HCl，pH5.5）中溶解纯化的PPM×2016、PPM×2025、PPM×2029、PPAT-O52-27c抗体和PPAT-O52-28c抗体，是其为6mg/mL，加入67GaCl3溶液（Fuji Film RI Pharma公司生产）或 111InCl3溶液（MDS，Nordion Inc.公司生产），以45℃孵育1小时。
（ⅱ）90Y标记
在缓冲液（0.25M醋酸铵-HCl，pH5.5）中溶解纯化的PPMX2029、PPAT-052-27c抗体，使其为6mg/mL，加入90YCl3溶液（nuclitec公司生产），以45℃孵育1小时。
（ⅲ）标记率的确认
将一部分标记反应液作为样品，使用薄层色谱（PALL公司生产，61885）确认标记率。以生理食盐水作为展开溶剂，使用γ-计数器测定带的上端和下端的放射活性，由下式算出标记率。
［数1］
标记率＝（下端的计数／（上端的计数＋下端的计数））×100（％）
标记率在90％以上时，在后面的实验中使用。标记抗体以脱盐柱（PD-10，GE Healthcare公司生产的17-0435-01）使用PBS纯化。
实施例11螯合物导入率和体内分布的关联的研究
对于PPMX2016、PPMX2025、PPMX2029，研究由螯合物导入率之差产生的体内动态的不同。螯合物导入率针对DOTA投入比1∶1、1∶3、1∶10的3种进行研讨。
首先，在含有10％FBS的RPMI1640培养基中培养NCI-H358，以1×107个/小鼠移至在裸鼠（雌，7周龄，日本CLEA）的右腹侧部皮下，饲养到平均肿瘤体积成为100～150mm3。
接着，在NCI-H358移植小鼠中，以370kBq/只投与 67Ga-DOTA-PPMX2016抗体（投入比1∶3、1∶10）、 67Ga-DOTA-PPMX2025抗体（投入比1∶3、1∶10）、 67Ga-DOTA-PPMX2029抗体（投入比1∶3、1∶10）。
在投与后经过96小时的时刻，进行宰杀、解剖，摘出组织和肿瘤，在测定组织和肿瘤的重量后，由γ-计数器测定放射活性，通过下式算 出％ID/g。
［数2］
％ID/g＝（蓄积RI量／总投与量RI量×100（％））／重量（g）
在图2～图7中表示结果。所有的抗体在DOTA投入比1∶3时比1∶10时向肿瘤的蓄积性提高。这样的蓄积性提高带来治疗效果的增强。还可以避免在其它脏器由放射性物质滞留产生的副作用。
在图8中表示在非荷癌裸鼠（雌，7周龄，日本CLEA）中投与 67Ga-DOTA-PPMX2025抗体（投入比1∶1、1∶3、1∶10）370kBq/只的结果。在投入比1∶10时，向肝脏的蓄积性高，与之相对，在投入比1∶3和1∶1时，向肝脏的蓄积性变低。这意味着难以引起对肝脏的放射线损伤等副作用。
实施例12抗caldina嵌合抗体的体内动态研究
对于嵌合抗体PPAT-052-28c和PPAT-052-28c，研究体内动态。
首先，在含有10％FBS的RPMI1640培养基中培养NCI-H1373，以4×106个/小鼠移植在裸鼠（雌，9周龄，日本CLEA）的右腹侧部皮下，饲养到平均体积成为100～150mm3。
接着，在NCI-H1373移植小鼠中，以370kBq/只投与 111In-DOTA-PPAT-052-27c（投入比1∶3）和111In-DOTA-PPAT-052-28c（投入比1∶3）。
在投与后经过48小时乃至96小时的时间，进行屠杀、解剖，摘出组织和肿瘤，在测定组织和肿瘤的重量后，由γ-计数器测定放射活性，算出％ID/g。
在图9～图11中表示结果。PPAT-052-27c在投与48小时后，向肿瘤的蓄积显示高达46％ID/g的蓄积。另外，PPAT-052-28c在投与48小时后显示41％ID/g的高蓄积，在投与96小时后显示52％ID/g的高蓄积。
实施例13异种移植试验 
使用含有10％FBS的RPMI1640培养基培养NCI-H358，以1×107个/鼠移植在裸鼠（雌，7周龄，日本CLEA）的右腹侧部皮下。
将NCI-H358移植鼠分为6组（n=8），以7.4MBq/只、5.6MBq/只、3.7MBq/只、1.9MBq/只投与90Y-DOTA-PPMX2029抗体（投入比1∶3）。 作为对照，以80μg/只投与未标记PPMX2029，以100μL/只投与生理食盐水。投与在任一组中都在平均肿瘤体积成为100～150mm3的时刻进行。
投与后，每周进行2次（每3日或每4日）体重和肿瘤体积的测定，观察进行到投与后第51日。
在图12中表示试验结果。90Y-DOTA-PPMX2029抗体（投入比1∶3）表示和放射活性成正比例的抗肿瘤效果。
另外，使用含有10％FBS的RPMI1640培养基培养NCI-H1373，以5×106个/小鼠移植在裸鼠（雌，7周龄，日本CLEA）的右腹侧部皮下。
将NCI-H1373移植鼠分为4组（n=8），以5.6MBq/只、3.7MBq/只投与90Y-DOTA-PPAT-052-27c抗体（投入比1∶3）。作为对照，以60μg/只投与未标记PPMX2029，以100μL/只投与生理食盐水。投与在任一组中都在平均肿瘤体积成为100～150mm3的时刻进行。
投与后，每周进行2次（每3日或每4日）体重和肿瘤体积的测定，观察进行到投与后第26日。
在图13中表示试验结果。90Y-DOTA-PPAT-052-27c抗体（投入比1∶3）显示和放射活性成正比例的抗肿瘤效果。
实施例14免疫组织化学染色
为了确认在癌临床样品中的CDH3蛋白质表达，以癌样品组织阵列进行免疫染色。
癌细胞组织阵列使用上海芯超生物科技有限公司（Shanghai Outdo Biotech Co.,Ltd.）生产的胰腺癌（腺癌）、肺癌（腺癌）、肺癌（扁平上皮癌）和大肠癌（腺癌）。
将各组织阵列玻片进行脱石蜡处理，以10mMTris、1mM EDTA（pH9.0）、95℃进行40分钟赋予活化。以ENVISION+Kit（Dako公司生产）附属的封闭试剂进行内在性过氧化物酶的失活后，使抗CDH3抗体610227（BD BIOSCIENCE公司生产）、和作为阴性对照的抗HBs抗体Hyb-3423以5μg/mL的浓度在4℃反应一晚。将抗体溶液冲洗后，与ENVISION+Kit附属的聚合物二次抗体试剂室温反应30分钟。以ENVISION+Kit附属的显色试剂进行显色，以苏木素伊红溶液进行核染 色。
在图14中表示结果。癌细胞被抗CDH3抗体染色，正常细胞不被染色。

Claims (16)

1.一种放射性金属标记抗P钙粘素抗体，其特征在于：
其为放射性金属元素通过金属螯合试剂与抗P钙粘素抗体结合而成的抗体，
所述抗P钙粘素抗体是由保藏号为NITE BP-897、NITE BP-898、NITE BP-899、NITE BP-1040、NITE BP-1044、NITE BP-1048、NITEBP-1049或NITE BP-1050的抗体产生细胞所生产的单克隆抗体或其基因重组抗体或者其任一种的片段，
所述基因重组抗体是改变所述单克隆抗体而制作的嵌合抗体、人源化抗体，所述嵌合抗体具有与所述单克隆抗体相同的VH和VL区域，所述人源化抗体具有与所述单克隆抗体相同的CDR区域，
所述抗体的片段为Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Diabody。
2.如权利要求1所述的放射性金属标记抗P钙粘素抗体，其特征在于：
抗P钙粘素抗体是由保藏号为NITE BP-897、NITE BP-898、NITEBP-899或NITE BP-1040的抗体产生细胞所生产的单克隆抗体或其基因重组抗体或者其任一种的片段。
3.如权利要求1或2所述的放射性金属标记抗P钙粘素抗体，其特征在于：
金属螯合试剂是选自异硫氰基苄基DOTA、甲基异硫氰基苄基DTPA、环己基异硫氰基苄基DTPA中的金属螯合试剂。
4.如权利要求1或2所述的放射性金属标记抗P钙粘素抗体，其特征在于：
抗P钙粘素抗体和金属螯合试剂的摩尔比为1∶0.1～1∶4.5。
5.如权利要求1或2所述的放射性金属标记抗P钙粘素抗体，其特征在于：
抗钙粘素抗体和金属螯合试剂的摩尔比为1∶0.5～1∶3。
6.如权利要求1或2所述的放射性金属标记抗P钙粘素抗体，其特征在于：
放射性金属元素是作为癌治疗被使用的细胞损伤性放射性金属。
7.如权利要求6所述的放射性金属标记抗P钙粘素抗体，其特征在于：细胞损伤性放射性金属是选自钇90(90Y)、铼186(186Re)、铼188(188Re)、铜67(67Cu)、铁59(59Fe)、锶89(89Sr)、金198(198Au)、镝165(165Dy)、钌103(103Ru)、钬166(166Ho)、钐153(153Sm)和镥177(177Lu)中的放射性金属。
8.如权利要求6所述的放射性金属标记抗P钙粘素抗体，其特征在于：
细胞损伤性放射性金属是钇90(90Y)。
9.如权利要求1或2所述的放射性金属标记抗P钙粘素抗体，其特征在于：
放射性金属元素是作为癌诊断被使用的细胞非损伤性放射性金属。
10.如权利要求9所述的放射性金属标记抗P钙粘素抗体，其特征在于：细胞非损伤性放射性金属是选自锝99m(99mTc)、铟111(111In)、铟113m(113mIn)、镓67(67Ga)、镓68(68Ga)、铊201(201Tl)、钴57(57Co)、锶85(85Sr)和铜64(64Cu)中的放射性金属。
11.如权利要求10所述的放射性金属标记抗P钙粘素抗体，其特征在于：
细胞非损伤性放射性金属是选自铟111(111In)和铜64(64Cu)的放射性金属。
12.一种癌治疗药物，其特征在于：
以权利要求6～8中任一项所述的放射性金属标记抗P钙粘素抗体为有效成分。
13.一种癌诊断药物，其特征在于：
以权利要求9～11中任一项所述的放射性金属标记抗P钙粘素抗体为有效成分。
14.一种抗体产生细胞，其特征在于：
作为保藏号NITE BP-897、NITE BP-898、NITE BP-899、NITEBP-1040、NITE BP-1044、NITE BP-1048、NITE BP-1049或NITEBP-1050被保藏。
15.权利要求6～8中任一项所述的放射性金属标记抗P钙粘素抗体在癌治疗药物的制造中的使用。
16.权利要求9～11中任一项所述的放射性金属标记抗P钙粘素抗体在癌诊断药物的制造中的使用。
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