ES2296952T3 - Metodo para tratar el mieloma multiple. - Google Patents
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Abstract
Uso de un anticuerpo que no está conjugado con una toxina o un agente citolítico en la preparación de un medicamento para el tratamiento del mieloma múltiple de tipo kappa en un sujeto en el que el anticuerpo destruye las células de mieloma de tipo kappa presentes en una población mixta de células y el anticuerpo comprende la región VH expuesta en la SEQ ID NO:1 y la región VL expuesta en la SEQ ID NO:3 o compite con un anticuerpo que comprende la región VH expuesta en la SEQ ID NO:1 y la región VL expuesta en la SEQ ID NO:3 por la unión al antígeno de mieloma kappa (AMK).
Description
Método para tratar el mieloma múltiple.
La presente invención se refiere a métodos para
el tratamiento del mieloma múltiple. Más particularmente, la
presente invención se refiere a un método para inducir la apoptosis
en células de mieloma mediante la administración de un anticuerpo
similar a K121.
El mieloma múltiple (MM) es una neoplasia
maligna de células B caracterizada por la acumulación de células B
terminalmente diferenciadas (células plasmáticas) en la médula ósea.
Investigaciones recientes han identificado algunos de los defectos
genéticos y moleculares que se producen en células plasmáticas de
mieloma (Drach, J. et al. (2000) Cancer Res Clin Oncol.
126:441; Ludwig, H. et al. (1999) Annals Oncol. 10 (6):S31).
Estos datos indican que acontecimientos moleculares múltiples dan
como resultado una inestabilidad genética profunda en las células,
una resistencia a la quimioterapia y un aumento de la
neovascularización de la médula ósea. El tratamiento actual para el
MM es la quimioterapia de dosis alta y/o el trasplante autólogo de
células madre de sangre periférica. En la actualidad, se favorece
este último tratamiento debido a una tasa de supervivencia superior
a 5 años (el 52% frente al 12%). Recientemente, los agentes
antiangiogénicos tales como la talidomida han producido una
respuesta objetivo en aproximadamente el 30% de los pacientes que no
responden al tratamiento. El MM es irreversiblemente mortal a pesar
de estos tratamientos drásticos, con tiempos medios de supervivencia
de 4-6 años dependiendo del modo de tratamiento
(Kyle, RA. et al. (2001) The Oncologist. 6 (2):119).
Actualmente hay 40.000 pacientes con MM en los
Estados Unidos, con un cálculo aproximado de que cada año se
diagnostican aproximadamente 14.000 nuevos pacientes (Chauhan, D. y
Anderson KC. (2001) Apoptosis. 6 (1-2): 47). La
incidencia de MM a nivel mundial está entre
1,5-4,5/100.000/año dependiendo del país (Hurez, D.
(1993) Revue du Praticien. 43 (3):271).
Las células B malignas en el MM producen
cantidades excesivas de cadena ligera, un componente de la
inmunoglobulina, y estas cadenas ligeras están presentes en el
suero y la orina de los individuos con esta enfermedad.
Aproximadamente, el 70% de los pacientes con MM producen cadenas
ligeras de tipo kappa, siendo el 30% restante de tipo lambda (Kyle,
RA. (1999) Path Biol. 47(2):148).
K121 es un anticuerpo monoclonal (Acm) murino
que reconoce específicamente las cadenas ligeras kappa libres
humanas y un antígeno expresado en la superficie de las células de
mieloma de tipo kappa. Este antígeno se denomina antígeno de
mieloma kappa o AMK (Boux, HA. et al. (1983) J Exp Med.
158:1769). Se ha establecido que el AMK consiste en cadenas ligeras
kappa libres expresadas en asociación no covalente con la actina en
la membrana celular (Goodnow et al. (1985) J. Immunol. 135:
1276). El K121 no muestra reactividad cruzada con ninguna célula
linfoide normal o maligna ni con moléculas intactas de
inmunoglobulina humana (Boux, HA et al. (1984) Eur. J.
Immunol. 14: 216).
Se ha desarrollado un inmunoensayo cuantitativo
para medir las cadenas ligeras kappa en el suero y la orina de
pacientes que padecen MM usando K121 (Axiak, SM. (1987) J Immunol
Methods. 99:141). La bibliografía reciente sugiere que la
cuantificación de las cadenas ligeras libres puede usarse para
monitorizar el progreso y la respuesta al tratamiento de estos
pacientes (Drayson, M. (2001) Blood 97 (9):2900).
También se ha sugerido que el K121 puede usarse
para administrar citotoxinas a células de mieloma kappa (Goodnow
et al. (1985) J. Immunol. 135:1276). De hecho, se ha
desarrollado una inmunotoxina que comprende el péptido citolítico
melitina unido a un fragmento scFv (scFv-mel) de
K121 como un agente terapéutico potencial para el tratamiento del
MM (Dunn, RD. et al., (1996) Immunotechnology 2: 229). El
K121 se ha usado previamente para tratar la leucemia prolinfocítica
B (WESTON et al., (1998) Leukemia and Lymphoma 29:361).
Los presentes inventores han descubierto ahora
que el K121 solo (es decir, no conjugado con una toxina o un agente
citolítico) puede destruir células que portan AMK mediante inducción
de la apoptosis. Además, los presentes inventores han demostrado
que el K121 solo puede evitar el crecimiento de las células
tumorales in vivo. Estos hallazgos indican que los
anticuerpos similares a K121 son potencialmente útiles como agentes
terapéuticos primarios en el tratamiento del mieloma múltiple.
En consecuencia, en un primer aspecto, la
presente invención proporciona un método para el tratamiento del
mieloma múltiple de tipo kappa en un sujeto, comprendiendo el método
administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo similar
a K121, en el que el anticuerpo similar a K121 no está conjugado con
una toxina o un agente citolítico.
\newpage
La presente invención también proporciona el uso
de un anticuerpo similar a K121 para la preparación de un
medicamento para el tratamiento del mieloma múltiple de tipo kappa,
en el que el anticuerpo similar a K121 no está conjugado con una
toxina o un agente citolítico.
En una realización preferida del primer aspecto
el método comprende además la etapa de tratar al sujeto para
reducir los niveles de cadenas ligeras kappa libres presentes en el
fluido del sujeto antes de la administración del anticuerpo similar
a K121. Preferiblemente, se reducen los niveles de cadenas ligeras
kappa libres presentes en el suero del sujeto. Puede conseguirse
una reducción en los niveles de cadenas ligeras kappa libres
mediante, por ejemplo, plasmaférisis. Se prefiere que el
tratamiento para reducir los niveles de cadenas ligeras kappa libres
se lleve a cabo en el sujeto justo antes de la administración del
anticuerpo similar a K121.
En un segundo aspecto, la presente invención
proporciona un método para el trasplante autólogo de células
hematopoyéticas en un sujeto, comprendiendo el método
- (i)
- extraer una población de células progenitoras hematopoyéticas del sujeto,
- (ii)
- tratar la población de células con un anticuerpo similar a K121, y
- (iii)
- trasplantar la población de células tratadas de la etapa (ii) en el sujeto,
en el que el anticuerpo similar a K121 no está
conjugado con una toxina o un agente citolítico.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida del segundo
aspecto, el método implica también la infusión intravenosa de un
anticuerpo similar a K121 en el sujeto.
En una realización preferida del segundo
aspecto, el método de trasplante autólogo se lleva a cabo en el
sujeto durante o tras la terapia citorreductora.
En un tercer aspecto, la presente invención
proporciona un método para destruir células de mieloma de tipo
kappa en una población mixta de células, comprendiendo el método
poner en contacto la población mixta de células con un anticuerpo
similar a K121, en el que el anticuerpo similar a K121 no está
conjugado con una toxina o un agente citolítico.
En un cuarto aspecto, la presente invención
proporciona un método para inducir la apoptosis en células que
portan AMK, comprendiendo el método exponer las células a un
anticuerpo similar a K121, en el que el anticuerpo similar a K121 no
está conjugado con una toxina o un agente citolítico.
En una realización preferida del cuarto aspecto,
las células que portan AMK son células de mieloma de tipo kappa.
En una realización de la presente invención, el
anticuerpo similar a K121 comprende los bucles de CDR (CDR1, CDR2 y
CDR 3) del anticuerpo K121 tal como se muestra en la figura 9a. En
otra realización, el anticuerpo similar a K121 comprende los genes
de VH y VL del anticuerpo K121 tal como se muestra en la figura
9a.
En una realización preferida adicional de la
presente invención, el anticuerpo similar a K121 es un anticuerpo
quimérico o un anticuerpo humanizado.
Figura 1. (a) Actividad citotóxica del Acm K121
sobre las células linfoblastoides HMy2 y K562 tal como se mide
mediante la fuga de la LDH citoplásmica (absorbancia a 492 nm).
Células incubadas durante 20 h en presencia y ausencia del Acm K121
(6,25 \muM) (b) Cinética de la muerte celular inducida por K121
(c) Dependencia de la concentración de la destrucción de las células
HMy2 por K121.
Figura 2. Análisis por citometría de flujo de la
apoptosis inducida por K121 de las células HMy2. Perfil de
dispersión de la luz de las células HMy2 incubadas con PBS o K121
durante 16 y 20 h. FSC y SSC corresponden al tamaño celular y a la
complejidad celular, respectivamente.
Figura 3. (a) Análisis por citometría de flujo
de la apoptosis inducida por K121 de las células HMy2 usando anexina
V-FITC. Se incubaron células HMy2 en ausencia
(control) o presencia de K121 a 37ºC durante 16 h o 20 h. Después,
se incubaron las células con anexina V-FITC y se
realizó una contratinción con yoduro de propidio. (b) Citotoxicidad
del Acm K121 sobre células HMy2 llevada a cabo en paralelo con el
ensayo de anexina V. Se incubaron células HMy2 a 37ºC durante 16 ó
20 h en ausencia (control) o presencia (5,35 \muM) del Acm K121.
Se recogió el sobrenadante del cultivo para el análisis de la fuga
de la LDH citosólica.
Figura 4. (a) Análisis por citometría de flujo
de la apoptosis inducida por K121 de las células HMy2 usando el
ensayo TUNEL. Se incubaron células HMy2 en ausencia (control) o
presencia de K121 a 37ºC durante 16 h o 20 h. Después, se fijaron
las células y se marcó de manera enzimática el ADN intracelular con
fluoresceína-12-dUTP en el extremo
3'. (b) Citotoxicidad de las células HMy2 tras 16 y 20 horas de
incubación con y sin K121 llevada a cabo en paralelo con el ensayo
TUNEL. Se incubaron células HMy2 a 37ºC durante 16 ó 20 h en
ausencia (control) o presencia (5,35 \muM) del Acm K121. Se
recogió el sobrenadante del cultivo para el análisis de la fuga de
la LDH citosó-
lica.
lica.
Figura 5. Evolución temporal de los niveles
séricos de la IgG humana secretada por Hmy2 en ratones SCID tras (a)
ningún tratamiento (PBS), (b) tratamiento con
scFv-mel o (c) tratamiento con el Acm K121. Se
inyectaron células (10^{7}) i.p. en el día 0 y tratamiento con
scfv-mel (0,5 mg/dosis) o Acm K121 (1,25 mg/dosis)
administrado en los días 1-3. Dentro de un grupo de
tratamiento, cada símbolo representa los valores de IgG para un
ratón individual.
Figura 6. Efecto del tratamiento con anticuerpo
sobre el crecimiento tumoral en ratones SCID. Se inyectó a los
ratones SCID con células HMy2 en el día 0 y Acm K121 administrado
durante 3 días (día 1, 2 y 3) a niveles totales de dosis de 3,0,
1,5, 0,3, 0,15 y 0 (control PBS) mg. Se evaluó el crecimiento
tumoral mediante la cuantificación de la IgG humana en suero de
ratón. Los valores representados son las medias de 6 ratones,
excepto para el valor de la semana 6 del grupo no tratado, en el que
el valor es de un único ratón.
Figura 7. Efecto de la dosis de anticuerpo sobre
la supervivencia de los ratones que portan tumores.
Figura 8. Niveles de IgG humana en el suero de
ratones no tratados y tratados con anticuerpo 42 días tras la
inyección de células tumorales. Los valores son para ratones
individuales. *IgG humana no detectable; \dagger mortalidades.
Figura 9. (a) La secuencia de aminoácidos y
secuencia de ADN correspondiente para las regiones variables de
cadena pesada (VH) y cadena ligera (VL) de K121. Las regiones CDR se
muestran en negrita. (b) Oligonucleótidos (VH1-VH6)
solapantes derivados del gen de VH de K121. (c) Oligonucleótidos
(VL1-VL6) solapantes derivados del gen de VL de
K121. (d) Cebadores de PCR para la extensión de oligonucleótidos de
la VH de K121. (e) Cebadores de PCR para la extensión de
oligonucleótidos de la VL de K121. (f) Representación esquemática de
un método para crear las regiones variables de las cadenas pesada y
ligera del anticuerpo monoclonal K121 usando la extensión de
oligonucleótidos.
Figura 10. Cebadores de PCR para la
amplificación por PCR de los genes de VH y VL de K121. Están
subrayados los sitios de enzimas de restricción para la clonación
direccional en los vectores de expresión de mamífero. Los cebadores
cK-VH-R y
cK-VL-R incluyen un sitio aceptor de
corte y empalme (mostrado en negrita).
Figura 11. (a) ELISA para la detección y
cuantificación de anticuerpos humanos en el sobrenadante de células
CHO transfectadas. Se diluyó en serie el sobrenadante del cultivo de
las células CHO transfectadas y se detectó el anticuerpo humano que
estaba unido a la IgG+A+M de cabra anti-humana
inmovilizada con conjugado AP específico de Fc de cabra
anti-humano. Se realizó una curva patrón en paralelo
usando diluciones seriadas de la IgG1 \kappa humana. Se visualizó
el anticuerpo unido mediante el desarrollo de color y se midió la
absorbancia a 405 nm. (b) Un ELISA para la detección de la unión del
K121 quimérico a la cadena ligera kappa humana. Se diluyó en serie
el sobrenadante del cultivo de células CHO transfectadas y no
transfectadas y se detectó el anticuerpo que estaba unido a las
cadenas ligeras kappa humanas inmovilizadas usando conjugado AP
específico de Fc de cabra anti-humano. Tras el
desarrollo de color se detectó el anticuerpo unido mediante la
absorbancia a 405 nm.
Figura 12. Actividad citotóxica del K121
quimérico (cK121) sobre las células linfoblastoides HMy2 y K562 tal
como se mide mediante la fuga de la LDH citoplásmica. Se incubaron
las células diana en presencia de PBS (control), K121 murino 5,5
\muM (mK121) o K121 quimérico 0,8 \muM (cK121) durante 20 h a
37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 5%.
Figura 13. Concentración del cK121 secretado por
los clones individuales. Se determinó la concentración de cK121
mediante un ELISA usando pocillos recubiertos con IgG, IgA e IgM
anti-humanas. Los datos representan los clones
positivos 1-5 y un clon negativo 6.
Figura 14. (a) Representación esquemática de un
método para la humanización de la VL de K121 usando un gen de VL
humana como región framework. (b) La secuencia de ADN de una VL de
la región framework humana y VL de K121. (c) Oligonucleótidos para
la humanización de la VL de K121 usando PCR.
Figura 15. (a) Secuencia de ADN de los genes de
cadena pesada variable VH3 (hVH) humana y de K121. (b) Cebadores de
mutagénesis de VH para su uso en la humanización de K121.
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando se usa en el presente documento, la
expresión "anticuerpo similar a K121" se refiere a un
anticuerpo que no está conjugado con una toxina o agente citolítico
y que comprende las regiones VH y VL mostradas en la figura 9a o
compite con un anticuerpo que comprende las regiones VH y VL
mostradas en la figura 9a por la unión a las células de mieloma de
tipo kappa. Preferiblemente, la expresión "anticuerpo similar a
K121" se refiere a un anticuerpo que se une al mismo epítopo que
un anticuerpo que tiene las regiones VH y VL mostradas en la figura
9a.
\newpage
El anticuerpo similar a K121 preferiblemente
comprende los bucles de CDR (CDR1, CDR2 y CDR3) del anticuerpo K121
tal como se muestra en la figura 9a. El anticuerpo similar a K121
puede comprender los genes de VH y VL del anticuerpo K121 tal como
se muestra en la figura 9a.
Los anticuerpos similares a K121 pueden
identificarse por su capacidad para competir con K121 (o formas
quiméricas o humanizadas de K121) en la unión al AMK en las células
HMy2. En este procedimiento, el K121 puede conjugarse con biotina
usando procedimientos establecidos (Hofmann K, et al. (1982)
Biochemistry 21: 978-84). Los anticuerpos similares
a K121 se evalúan entonces mediante su capacidad para competir con
la unión del K121 biotinilado al AMK en las células HMy2. La unión
del K121 biotinilado a las células HMy2 puede evaluarse mediante la
adición de estreptavidina marcada con fluoresceína que se unirá a la
biotina en las moléculas de K121. La tinción fluorescente de las
células se cuantifica entonces mediante citometría de flujo y se
expresa el efecto competitivo del anticuerpo similar a K121
expresado como un porcentaje de los niveles de fluorescencia
obtenidos en ausencia del competidor.
Para los fines de esta invención, el término
"anticuerpo", a menos que se especifique lo contrario, incluye
fragmentos bivalentes de anticuerpos completos que conservan su
actividad de unión para un antígeno diana. Tales fragmentos
incluyen, por ejemplo, los fragmentos F(ab')_{2}.
En una realización preferida de la presente
invención, el anticuerpo similar a K121 es un anticuerpo
recombinante o monoclonal. En una realización preferida adicional,
el anticuerpo es un anticuerpo quimérico o humanizado.
Cuando se usa en los métodos de la presente
invención, el anticuerpo similar a K121 no está conjugado con una
toxina o agente citolítico. Por "toxina" se entiende cualquier
toxina conocida en la técnica tal como ricina, saprina, toxina
diftérica y exotoxina de Pseudomonas. Por "agente
citolítico" se entiende un agente tal como melitina que provoca
la lisis de las células.
A lo largo de esta memoria descriptiva, se
entenderá que la palabra "comprender" o variaciones tales como
"comprende" o "que comprende", implicará la inclusión de
un elemento, número entero, etapa, o grupo de elementos, números
enteros o etapas indicados, pero no la exclusión de cualquier otro
elemento, número entero o etapa, o grupo de elementos, números
enteros o etapas.
\vskip1.000000\baselineskip
Los anticuerpos monoclonales dirigidos frente a
los epítopos de AMK pueden producirse fácilmente por un experto en
la técnica. Se conoce bien la metodología general para preparar
anticuerpos monoclonales mediante hibridomas. Pueden crearse líneas
celulares inmortales productoras de anticuerpos mediante la fusión
celular, y también mediante otras técnicas tales como
transformación directa de linfocitos B con ADN oncogénico, o
transfección con el virus de Epstein-Barr. Pueden
examinarse los paneles de anticuerpos monoclonales producidos frente
a los epítopos de AMK para detectar diversas propiedades, es decir
la afinidad por isotipo y epítopo.
Pueden usarse anticuerpos monoclonales derivados
de ratón tanto en la inmunoterapia directa in vivo como en
la extracorpórea. Sin embargo, se ha observado que cuando se usan
anticuerpos monoclonales derivados de ratón en seres humanos como
agentes terapéuticos, el paciente produce anticuerpos humanos
anti-ratón. Por tanto, no se prefieren los
anticuerpos monoclonales derivados de ratón para el tratamiento,
especialmente para su uso a largo plazo. Con técnicas establecidas
de ingeniería genética es posible, sin embargo, crear anticuerpos
quiméricos o humanizados que tienen partes derivadas de animal o
derivadas de ser humano. El animal puede ser un ratón u otro roedor
tal como una rata.
Si la región variable del anticuerpo quimérico
se deriva de ratón mientras que la región constante se deriva de
ser humano, el anticuerpo quimérico será generalmente menos
inmunogénico que un anticuerpo monoclonal derivado de ratón
"puro". Probablemente, estos anticuerpos quiméricos serán más
adecuados para su uso terapéutico, si se da el caso de que los
anticuerpos derivados de ratón "puros" no son adecuados.
\vskip1.000000\baselineskip
Los expertos en la técnica disponen de
metodologías para generar anticuerpos quiméricos. Por ejemplo,
pueden expresarse por separado las cadenas pesadas y ligeras,
usando, por ejemplo, cadena ligera de inmunoglobulina y cadenas
pesadas de inmunoglobulina en plásmidos separados. Éstas pueden
entonces purificarse y unirse in vitro en anticuerpos
completos; se han descrito metodologías para conseguir tal unión.
Véase, por ejemplo, Scharff, M., Harvey Lectures 69:125 (1974).
Véanse también Oi et al., Bio Techniques
4(4):214-221 (1986); y Sun et al.
Hybridoma 5 (1986) Supl. 1:517-20. Un constructo de
ADN de este tipo puede comprender genes reorganizados
funcionalmente codificantes de ADN para la región variable de una
cadena pesada o ligera de un anticuerpo similar a K121 unido al ADN
que codifica para una región constante humana. Las células
linfoides, tales como mielomas o hibridomas transfectadas con los
constructos de ADN para la cadena pesada o ligera pueden expresar y
unir las cadenas de anticuerpo.
También se han descrito parámetros de reacción
in vitro para la formación de anticuerpos IgG a partir de
cadenas pesadas y ligeras aisladas reducidas. Véase, por ejemplo,
Beychok, S., Cells of Immunoglobulin Synthesis, Academic Press,
Nueva York, pág. 69, 1979. También es posible la coexpresión de
cadenas pesadas y ligeras en las mismas células para conseguir la
asociación intracelular y la unión de las cadenas pesadas y ligeras
para dar anticuerpos IgG H_{2}L_{2} completos. Tal coexpresión
puede conseguirse usando o bien los mismos o bien diferentes
plásmidos en la misma célula huésped.
En otra realización preferida de la presente
invención, el anticuerpo similar a K121 es humanizado, es decir, un
anticuerpo producido mediante técnicas de modelado molecular en las
que se maximiza el contenido humano del anticuerpo mientras que se
produce poco o nada de pérdida de afinidad de unión atribuible a la
región variable del anticuerpo murino.
Los métodos descritos a continuación pueden
aplicarse a la humanización de anticuerpos similares a K121. Puede
usarse un enfoque en dos etapas que implica (a) seleccionar
secuencias de anticuerpo humano que se usan como regiones framework
humanas para la humanización, y (b) determinar qué residuos de la
región variable del anticuerpo monoclonal animal debe seleccionarse
para la inserción en la región framework humana elegida.
La primera etapa implica la selección de las
secuencias de la región framework humana disponibles para la que se
dispone de información sobre la secuencia. Este proceso de selección
se basa en los siguientes criterios de selección.
Las secuencias de las regiones variables de las
cadenas pesada y ligera de un anticuerpo monoclonal animal que va
de humanizarse se alinean de manera óptima y se comparan
preferiblemente con todas las secuencias conocidas de la región
variable de las cadenas pesada y ligera de anticuerpos humanos.
Una vez se comparan así las secuencias, se
anotan las identidades de los residuos y se determinan las
identidades en porcentaje. Siendo iguales todos los demás factores,
es deseable seleccionar un anticuerpo humano que tiene la mayor
identidad en porcentaje con el anticuerpo animal.
En los casos en que las secuencias se deducen
mediante la secuenciación directa de la proteína, pueden evaluarse
las secuencias conocidas de las cadenas de los anticuerpos humanos
para determinar la presencia de ambigüedades y/o residuos no
identificados, que son incertidumbres de secuencia. La más común de
tales incertidumbres es la identificación errónea de un aminoácido
ácido por un aminoácido de amida debido a la pérdida de amoniaco
durante el procedimiento de secuenciación, por ejemplo, la
identificación incorrecta de un residuo de ácido glutámico, cuando
el residuo presente en realidad en la proteína era un residuo de
glutamina. Siendo iguales todos los demás factores, es deseable
seleccionar una cadena de anticuerpo humano que tenga el menor
número posible de ambigüedades.
Las regiones variables de las cadenas de los
anticuerpos contienen puentes disulfuro intradominio. La distancia
(número de residuos) entre los residuos de cisteína que comprenden
estos puentes se denomina el espaciado de la región horquilla
(Chothia et al, J. Mol. Biol. 196:901 (1987)). Siendo iguales
todos los demás factores, lo más deseable es que el espaciado de la
región horquilla de un anticuerpo humano seleccionado sea similar o
idéntico al del anticuerpo animal. También es deseable que el
espaciado de la región horquilla de secuencia humana sea similar al
de una estructura tridimensional conocida de anticuerpo, para
facilitar el modelado asistido por ordenador.
Basándose en los criterios anteriores, el
anticuerpo humano (o anticuerpos) que tiene(n) la mejor
combinación global de las características deseables se
selecciona(n) como la región framework para la humanización
del anticuerpo animal. Las cadenas pesadas y ligeras seleccionadas
pueden proceder de los mismos o de diferentes anticuerpos
humanos.
La segunda etapa de los métodos de esta
invención implica la determinación de cuáles de las secuencias de
la región variable de anticuerpo animal deben seleccionarse para el
injerto en la región framework humana. Este proceso de selección se
basa en los siguientes criterios de selección:
Se evalúan dos tipos de posibles residuos de la
región variable en las secuencias del anticuerpo animal, el primero
de los cuales se denomina "residuos mínimos". Estos residuos
mínimos comprende bucles estructurales de CDR más cualquier residuo
adicional requerido, tal como se muestra mediante el modelado
asistido por ordenador, para soportar y/u orientar los bucles
estructurales de CDR.
El otro tipo de posibles residuos de la región
variable se denominan "residuos máximos". Éstos comprenden los
residuos mínimos más cualquier residuo adicional que, tal como se
determina mediante modelado asistido por ordenador, entran dentro
de aproximadamente 10 \ring{A} de los residuos de bucles
estructurales de CDR y presentan una superficie accesible en
disolvente acuoso (Lee et al, J. Biol. Chem. 55:379
(1971)).
Para identificar los posibles residuos de la
región variable, se lleva a cabo el modelado asistido por ordenador
sobre (a) las secuencias de la región variable del anticuerpo animal
que va a humanizarse, (b) las secuencias de la región framework de
anticuerpo humano seleccionadas, y (c) todos los anticuerpos
recombinantes posibles que comprenden las secuencias de la región
framework de anticuerpo humano en las que se han injertado los
diversos residuos mínimos y máximos de anticuerpo animal.
El modelado asistido por ordenador se lleva a
cabo usando programas adecuados para el modelado de proteínas e
información estructural obtenida de un anticuerpo que (a) tiene
secuencias de aminoácidos de la región variable lo más idénticas
posible a las del anticuerpo animal y (b) tiene una estructura
tridimensional conocida. Un ejemplo de los programas que pueden
usarse es el programa SYBYL Biopolymer Module (Tripos Associates).
El anticuerpo del que puede obtenerse la información estructural
puede ser, pero no es necesario que lo sea necesariamente, un
anticuerpo humano.
Basándose en los resultados obtenidos en los
análisis anteriores, se seleccionan para la humanización las
cadenas recombinantes que contienen las regiones variables animales
que producen una estructura de modelado asistido por ordenador que
más se aproxima a la del anticuerpo animal.
Pueden prepararse anticuerpos completamente
humanos usando bibliotecas de expresión de inmunoglobulina humana
(Stratagene Corp., La Jolla, Calif.) para producir fragmentos de
anticuerpos humanos (V_{H}, V_{L}, F_{V}, Fd, Fab, o
F(ab')_{2}), y usando estos fragmentos para formar
anticuerpos humanos completos usando técnicas similares a las que se
utilizan para producir anticuerpos quiméricos.
Los anticuerpos similares a K121 pueden
administrarse directamente a un sujeto que necesita tratamiento para
el mieloma múltiple.
Puede inhibirse o reducirse el crecimiento de
las células tumorales administrando a un sujeto que necesita el
tratamiento una cantidad eficaz de un anticuerpo similar a K121.
Habitualmente, el anticuerpo puede administrarse en una cantidad de
aproximadamente 0,001 a 2000 mg/kg de peso corporal por dosis, y más
preferiblemente de aproximadamente 0,01 a 500 mg/kg de peso
corporal por dosis. Pueden administrarse dosis repetidas según lo
recete el médico responsable. Sin embargo, también son adecuadas
otras cantidades. Generalmente, la administración del anticuerpo se
realiza mediante infusión de modo que el anticuerpo presente que
puede producir un efecto perjudicial pueda mantenerse bajo control
variando la tasa de administración. Habitualmente, la infusión de
una dosis puede durar algunas horas. Sin embargo, en el presente
documento también se contempla la infusión constante de una dosis
para fines terapéuticos que permitirán el mantenimiento de un nivel
constante del anticuerpo en suero. La infusión del anticuerpo
similar a K121 puede realizarse tal como sigue. La sonda intravenosa
(i.v.) puede pretratarse, por ejemplo, con NaCl al 0,9% y albúmina
sérica humana al 5% y colocarse para la administración intravenosa.
La infusión i.v. puede comprender un volumen total de 250 ml de NaCl
al 0,9% y albúmina sérica humana al 5% y realizarse una infusión
durante un periodo de aproximadamente 2 horas dependiendo de
cualquier efecto secundario dependiente de la tasa observado. Deben
tomarse los signos vitales, por ejemplo, cada quince minutos
durante la infusión y cada hora después de la infusión hasta que
sean estables. Debe realizarse un examen físico cardiopulmonar
exhaustivo antes de, y al final de la infusión. Pueden tenerse a
mano medicamentos incluyendo paracetamol, difenhidramina,
epinefrina y corticosteroides para el tratamiento de reacciones
alérgicas si se producen. Puede repetirse la administración del
anticuerpo si el médico lo considera deseable.
Tal como apreciarán los expertos en la técnica,
algunos pacientes con mieloma tienen niveles significativos de
cadena ligera kappa en su circulación. Debido a que los anticuerpos
similares a K121 reaccionan con las cadenas ligeras kappa libres,
su presencia en el fluido del sujeto puede reducir la eficacia del
tratamiento. En consecuencia, en una realización preferida de la
invención, el método de tratamiento comprende además la etapa de
tratar al sujeto para reducir los niveles de cadenas ligeras kappa
libres circulantes en el fluido (por ejemplo la sangre) del sujeto
antes de la administración del anticuerpo similar a K121. Esta etapa
adicional de tratamiento puede implicar, por ejemplo,
plasmaféresis. Tal como conocerán los expertos en la técnica, la
plasmaféresis es un procedimiento en el que se extrae el plasma de
las células sanguíneas mediante un dispositivo conocido como
separador celular. El separador funciona o bien centrifugando la
sangre a alta velocidad para separar las células del fluido o bien
haciendo pasar la sangre a través de una membrana con poros tan
pequeños que sólo puede pasar el plasma a su través. Las células se
devuelven al sujeto, mientras que el plasma, que contiene las
cadenas ligeras kappa libres, se desecha y sustituye con otros
fluidos. Puede administrarse medicación para evitar que se coagule
la sangre (por ejemplo un anticoagulante) a través de una vena
durante el procedimiento.
\newpage
Los anticuerpos similares a K121 también pueden
aplicarse al purgado de células plasmáticas malignas de muestras
biológicas, ya sean muestras de fluido o de tejido. El purgado de
células de mieloma de una muestra de fluido es parte de la
invención y puede ponerse en práctica poniendo en contacto un fluido
biológico del que sospecha que comprende células plasmáticas
malignas con un anticuerpo similar a K121 que puede unirse de manera
selectiva a y producir la apoptosis de las células malignas. Este
método puede utilizarse para purgar células no deseadas ex
vivo extrayendo una muestra biológica de un paciente, eliminando
las células malignas mediante la apoptosis inducida por anticuerpos
similares a K121 y reponiendo luego la muestra purgada en el
paciente.
Se apreciará que los métodos para tratar el
mieloma múltiple que implican el uso de un anticuerpo similar a
K121 pueden realizarse aislados o como un complemento de regímenes
de radioterapia o quimioterapia conocidos. Por ejemplo, el
tratamiento con anticuerpo similar a K121 puede realizarse junto con
o tras el tratamiento con fármacos tales como melfalán o
ciclofosfamida.
Con el fin de que pueda entenderse más
claramente la presente invención, se describirán formas preferidas
con referencia a los siguientes ejemplos no limitativos.
Se evaluó la actividad citotóxica del Acm K121
usando el kit de ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox96
(Promega) que mide la lactato-deshidrogenasa (LDH)
liberada en el sobrenadante por las células durante la lisis
celular. Se recogieron células HMy2 (positivas para AMK) y K562
(negativas para AMK) de los cultivos madre y se resuspendieron a 1
x 10^{6} células/ml en 2xRPMI complementado con un 5% de FBS. Se
añadieron alícuotas de 3 x 10^{4} células a los pocillos
individuales de una placa de cultivo tisular de 96 pocillos. Se
añadió el Acm K121, a concentraciones de 2,5, 5,0, 7,5, 10, 12,5
\muM, en un volumen de 30 \mul a los pocillos apropiados por
duplicado. Tras 20 h de incubación a 37ºC en una atmósfera de
CO_{2} al 5%, se recogió el sobrenadante de cada pocillo y se
centrifugó a 3000 g durante 1 min. Se transfirió el sobrenadante (50
\mul) clarificado a otra placa de ensayo de microtitulación de 96
pocillos y se mezcló con un volumen igual de sustrato. Se incubó la
placa a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 min y se
paró la reacción con 50 \mul de disolución de parada. Se midieron
los valores de la absorbancia en un lector de placas de microelisa
Organon Teknika (Tumhout, Bélgica) a 492 nm. Se incluyó el medio de
cultivo (1xRPMI complementado con un 2,5% de FBS) solo como control
inicial porque el FBS y el rojo de fenol en el medio pueden dar como
resultado niveles de LDH aparentes elevados. Para los estudios de
la evolución temporal, se incubaron células HMy2 con 12,5 \muM
del Acm K121 y se recogió el sobrenadante del cultivo a las 4, 8,
12, 16 y 20 horas tras la adición del anticuerpo.
Se evaluó el mecanismo de la actividad
citotóxica de K121 sobre las células HMy2 de 2 modos, unión a
anexina V y el ensayo TUNEL. Se llevó a cabo un ensayo de LDH
paralelo durante ambos ensayos para confirmar que se producía la
muerte celular.
Unión a anexina V. La anexina V es una
proteína que se une específicamente a la fosfatidilserina en la
membrana celular. La unión se produce una vez que la membrana ha
empezado a romperse y el fosfolípido "se vuelca" al medio
extracelular. Como resultado, este método mide la fase más temprana
de la apoptosis. Se describe brevemente el método de unión a
anexina V. Se recogieron células HMy2 de los cultivos madre y se
resuspendieron en 1xRPMI complementado con un 5% de FBS hasta una
densidad de 1 x 10^{6} células/ml. Se añadieron alícuotas de
quinientos microlitos de células a una placa de cultivo tisular de 6
pocillos. Se añadió un volumen igual de Acm K121 a una
concentración de 10,7 \muM a las células y se incubó la placa de
ensayo a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 5%. Para el control
negativo se añadió un volumen igual de PBS. Se recogieron las
células mediante centrifugación de los pocillos a t=16 y 20 h. Se
sometió a ensayo una alícuota del sobrenadante para determinar la
LDH extracelular y se lavó el sedimento celular en tampón de unión
(HEPES 10 mM, NaCl 140 mM y CaCl_{2}\cdot2H_{2}O 2,5 mM). Se
resuspendieron las células lavadas en 100 \mul de tampón de unión
y se incubaron con 2 \mul de anexina V-FITC
(Bender MedSystems, Viena, Austria) durante 15 min a temperatura
ambiente. Se añadieron 400 \mul adicionales de tampón de unión y
se realizó la contratinción de las células con 1 \mul de yoduro
de propidio 1 mg/ml (Sigma-Aldrich, St Louis, MI)
sobre hielo durante 15 min. Entonces se analizaron las células
mediante citometría de flujo usando un FACScan (BD).
Ensayo TUNEL. En las fases finales de la
apoptosis, el ADN cromosómico experimenta un patrón característico
de fragmentación. El ensayo TUNEL se basa en una enzima transferasa
terminal para marcar los extremos 3' del ADN fragmentado. Por
tanto, este ensayo es una medida de las fases finales de la
apoptosis. En resumen, los pocillos por duplicado que contenían
células HMy2 en presencia de K121/o PBS se organizaron e incubaron
tal como se describió en la sección anterior. Se realizó el ensayo
de marcaje (TUNEL) de los extremos de corte de dUTP mediado por TdT
usando la fluoresceína del sistema de detección de apoptosis
(Promega, Madison, WI). Se prepararon las células y se realizó el
ensayo tal como se describe por los fabricantes. Brevemente, se
lavaron las células en PBS y se fijaron con formaldehído al 10%
seguido de alcohol al 70%. Se marcó de manera enzimática el ADN
intracelular con
fluoresceína-12-dUTP en el extremo
3' y se analizó en el FACScan.
Con el fin de evaluar los posibles efectos
antitumorales de K121 in vivo, se inyectaron células HMy2 a
ratones SCID de 6 semanas de edad por vía intraperitoneal (i.p.) en
el día 0. Después de la inyección de células tumorales, se
administró a los ratones o bien anticuerpo K121 o bien PBS mediante
inyección i.p. Debido a que las células HMy2 secretan IgG humana,
se monitorizó la progresión del crecimiento tumoral mediante la
cuantificación de la IgG humana en el suero de los ratones
receptores usando un inmunoensayo específico de IgG humana.
Se usó un ensayo (ELISA) de inmunoabsorción
unido a enzimas para cuantificar los niveles de IgG humana en los
sueros de ratones SCID. Se incubó la proteína A en
PBS-Az (50 \mul/pocillo de 100 \mug/ml) en una
placa para ELISA de 96 pocillos a 37ºC durante 1 hora. Se lavaron
los pocillos 3 veces con PBS-Az y se bloquearon los
sitios de unión no específica con BSA al 3% en
PBS-Az a 37ºC durante 1 hora. Se lavaron los
pocillos dos veces en PBS-Az y se incubaron a 37ºC
durante 1 hora con 50 \mul/pocillo de suero de ratón diluido 2,5
veces con BSA al 1% en PBS-Az. Tras 3 lavados con
PBS-Az, se detectaron los anticuerpos unidos con 50
\mul/pocillo de conjugado AP de cadena ligera \kappa de cabra
anti-humana (dilución de 1:1000 en BSA al
1%-PBS-Az) a 37ºC durante 1 hora. Se visualizaron
los complejos antígeno-anticuerpo unidos mediante la
adición de sustrato de fosfato de p-nitrofenilo
(pNPP) (50 \mul/pocillo a 1 mg/ml) en tampón de sustrato para
ELISA (glicina 0,1 M, MgCl_{2} 1 mM, ZnCl_{2} 1 mM, pH 10,4)
tras 2 lavados en PBS-Az, uno en agua MilliQ y uno
en tampón de sustrato para ELISA. Se desarrolló el color a
temperatura ambiente durante 10 min y se paró la reacción mediante
la adición de NaOH 3 M (50 \mul/pocillo). Se determinó la
absorbancia a 405 nm usando un lector de placas de microelisa
Organon Teknika (Tumhout, Bélgica).
Para la cuantificación de la IgG humana, se
incluyó en el ensayo una curva patrón. Se sustituyó el suero de
ratón con diluciones seriadas de IgG1 humana kappa (6 \mug/ml - 6
ng/ml; Serotec Ltd, Oxford, Inglaterra).
La incubación de células HMy2 y K562 con K121
reveló que el Acm induce la muerte de células diana específicas de
una manera dependiente tanto del tiempo como de la concentración
(figura 1). En primer lugar, se detectó la actividad citotóxica de
K121 aproximadamente 12 h tras la adición al cultivo de células
diana y el nivel de muerte celular aumentó durante las 8 h
siguientes. El efecto citotóxico de K121 fue máximo a una
concentración final de 3,6 \muM, detectándose una citotoxicidad
significativa a 2,5 \muM. La actividad citotóxica observada de
K121 se producía en ausencia de componentes séricos o células
efectoras auxiliares (es decir, complemento) añadidos.
Se observaron las células HMy2 incubadas en
presencia o ausencia de K121 a un aumento de 200x con un microscopio
óptico invertido. Se llevaron a cabo estudios simultáneos de las
células HMy2 incubadas con una inmunotoxina
scFv-mel (Dunn, RD. et al., (1996)
Immunotechnology 2: 229). Las células incubadas con Acm K121
mostraron signos de contracción celular y "formación de
ampollas" en la membrana. Por el contrario la
scFv-mel produjo la aglutinación de las células y la
lisis de la membrana.
El análisis por citometría de flujo de las
células HMy2 tratadas con K121 mostró un aumento en las propiedades
de dispersión de la luz a 90º en comparación con las células no
tratadas (figura 2), lo que refleja un aumento en la granularidad
interna y la condensación de cromatina en las células tratadas con
anticuerpo. Hubo una disminución concomitante en las propiedades de
dispersión de la luz frontal de las células tratadas con anticuerpo,
lo que es indicativo de la contracción celular. La combinación del
aumento de granularidad, la condensación de cromatina y la
contracción celular mostradas por las células tratadas con K121
sugería que estas células estaban muriendo como resultado de la
inducción de la apoptosis.
Se usaron dos sistemas de ensayo independientes
para determinar el mecanismo mediante el cual el K121 destruye las
células que portan el antígeno. Se evaluó la apoptosis de fase
temprana mediante la unión de anexina V a las células tratadas con
K121. La tinción inmunofluorescente con anexina
V-FITC reveló números crecientes de células HMy2
teñidas positivamente 16 y 20 h tras iniciar el tratamiento con K121
en comparación con las células no tratadas con anticuerpo (figura
3a). El porcentaje creciente de células teñidas con anexina V se
correlacionaba con el aumento de la proporción de células muertas
según se determina mediante la tinción con yoduro de propidio
(figura 3a) y la fuga de LDH (figura 3b).
\newpage
El análisis de la fragmentación de ADN, un
proceso de fase tardía en la apoptosis, se evaluó usando el método
TUNEL. El desplazamiento en la fluorescencia observada en las
células HMy2 incubadas con K121 era significativo tras 16 y 20
horas de incubación si se comparaba con las células no tratadas
(figura 4a) y es típico del patrón de fragmentación de ADN asociado
a la apoptosis. Una vez más, la medición de la apoptosis se
correlacionaba con números crecientes de células muertas según se
determina mediante la fuga de LDH (figura 4b). Si se toman juntos,
estos datos muestran que las células tratadas con K121 están
experimentando apoptosis.
\vskip1.000000\baselineskip
A los ratones SCID que habían recibido 10^{7}
células de HMy2 en el día 0 se les administró o bien 3 dosis
consecutivas de K121 (1,25 mg cada una) (n=6) o
scFv-mel (0,5 mg cada una) (n=7) en los días 1, 2 y
3 o PBS (1,25 mg cada una) (n=6) como control de tratamiento. Se
extrajeron muestras de sangre antes de la administración de las
células tumorales y a intervalos semanales después de la inyección
de las células tumorales, y se monitorizó el crecimiento de las
células HMy2 mediante la aparición de IgG humana en el suero de los
animales. En los ratones control tratados con PBS, se detectó la
IgG humana en el suero de 6/6 animales (figura 5a), oscilando el
tiempo para la detección inicial de la IgG humana desde 3 semanas
hasta 8 semanas después de la inyección de las células tumorales.
De manera similar, los ratones tratados con una inmunotoxina que
comprende el péptido citolítico melitina unido a un fragmento scFv
de K121 (scFv-mel) mostraron niveles elevados de IgG
humana 3 semanas tras la inyección de las células (figura 5b). Por
el contrario, la IgG humana no se detectó en el suero de los
animales tratados con K121 durante el mismo periodo (figura 5c). En
general, los animales tratados con PBS y scFv-mel
mostraron distensión abdominal, se volvieron letárgicos y, tras 9
semanas, 5/6 ratones habían muerto. Los ratones tratados con K121
no presentaron estos síntomas y todos estaban vivos en la semana 9,
momento en el que un ratón de este grupo, junto con el animal
superviviente del grupo control, se sacrificó y diseccionó. El
animal tratado con K121 no tenía ninguna anomalía macroscópica en
los órganos. El animal no tratado, sin embargo, tenía una gran masa
tumoral en la cavidad abdominal, un bazo agrandado y consunción de
los pulmones. Las muestras de tejido de ambos animales se están
examinando en la actualidad mediante técnicas inmunocitoquímicas
para la infiltración de HMy2. Estos estudios demostraron claramente
que el K121 solo puede prevenir el crecimiento de células tumorales
linfoblastoides humanas en un modelo de ratón (SCID)
inmunodeficiente.
En un segundo ejemplo, los ratones SCID a los
que se les inyectaron 10^{7} células de HMy2 en el día 0
recibieron niveles variables de dosificación de K121 en los días 1,
2 y 3 tal como sigue:
Grupo 1; control de PBS (n=6)
Grupo 2; 1,0 mg de K121 por dosis. Dosificación
total de anticuerpo, 3,0 mg (n=6)
Grupo 3; 0,5 mg de K121 por dosis. Dosificación
total de anticuerpo, 1,5 mg (n=6)
Grupo 4; 0,1 mg de K121 por dosis. Dosificación
total de anticuerpo, 0,3 mg (n=6)
Grupo 5; 0,05 mg de K121 por dosis. Dosificación
total de anticuerpo, 0,15 mg (n=6)
\vskip1.000000\baselineskip
Se monitorizó la progresión tumoral mediante la
cuantificación de la IgG humana en el suero de los ratones.
Todos los ratones no tratados desarrollaron
niveles elevados de IgG humana hacia el día 28 (figura 6) y la
mayoría (4/5) de este grupo murió hacia el día 42 (figura 7). La
autopsia reveló bazos agrandados y tumores macroscópicos en hígado
y riñón. Los ratones que portaban tumores tratados con K121
mostraron o bien una aparición retardada de la progresión tumoral o
ausencia completa de crecimiento tumoral tal como se indica mediante
los niveles de IgG humana en suero (figuras 6 y 8) y la autopsia
tras la finalización del experimento el día 56. A lo largo de los 4
grupos de tratamiento, 7 de 24 ratones mostraron niveles
indetectables de IgG humana en su suero el día 42 (figura 8). Seis
de estos ratones no mostraron ningún signo macroscópico de
crecimiento tumoral en la autopsia en el día 56. Todos los ratones
no tratados murieron o se sacrificaron por razones éticas hacia el
día 49, mientras que 13/24 ratones en los grupos de tratamiento con
anticuerpo sobrevivieron hasta el día 56 (figura 7).
En resumen, los ratones que portaban tumores
respondieron al tratamiento con K121 de una manera dependiente de
la dosis. La completa ausencia de crecimiento tumoral el día 42 era
evidente en el 30% de los ratones, siendo este efecto más
pronunciado en los ratones que recibieron una dosificación total de
1,5 mg de K121 (figura 8). El crecimiento tumoral fue rápido y
agresivo en los ratones no tratados, con una mortalidad del 100%
hacia el día 49 (figura 7). En este momento, los grupos de
tratamiento combinado mostraron una mortalidad inferior
al 10%.
al 10%.
Un ejemplo de la estrategia usada para crear un
anticuerpo monoclonal mediante la extensión de oligonucleótidos
sintéticos usando la PCR se ha descrito previamente en la
bibliografía (Sato et al. (1994) Molecular Immunology 31
(5): 371). Con el fin de crear un anticuerpo monoclonal similar a
K121 a partir de la secuencia de ADN publicada (tal como se muestra
en la figura 9a), puede dividirse el gen de VH en seis
oligonucleótidos VH1-VH6 solapantes (figura 9b).
Asimismo, el gen de VL de K121 puede dividirse en seis
oligonucleótidos VL1-VL6 solapantes (figura 9c).
Tres de los oligonucleótidos de VH tendrían la secuencia de ADN
sentido (figura 9d, VH1, 3 y 5) y tres tendrían la secuencia de ADN
antisentido (figura 9d, VH2, 4 y 6). De manera similar, tres de los
oligonucleótidos de VL tendrían la secuencia de ADN sentido (figura
9e, VL1, 3 y 5) y tres tendrían la secuencia de ADN antisentido
(figura 9e, VL2, 4 y 6).
La primera PCR que usa una Taq polimerasa uniría
los tres conjuntos de oligonucleótidos para producir tres
fragmentos de ADN bicatenario (figura 9f). Los tres productos de la
primera amplificación se extraerían entonces en gel y los
fragmentos de ADN aislados se usarían como moldes para unir la
secuencia génica completa usando una Taq polimerasa. En la unión
final del gen de VH se usaría un cebador de PCR complementario para
la región 5' del gen (VHF) y un cebador antisentido complementario
para la región 3' del gen (VHR) para crear la secuencia completa
del gen de VH de K121. De manera similar, los cebadores de PCR para
las regiones 5' (VLF) y 3' (VLR) del gen de VL deberían usarse para
la amplificación del gen completo de VL de K121. Deberían
secuenciarse los productos génicos finales para confirmar la
presencia y fidelidad de los genes de la región V completos.
Los genes de VH y VL de K121 sintetizados deben
ligarse entonces a un vector de expresión de mamífero que contiene
los genes de la región constante de la Ig murina relevantes;
C\gamma1 para la cadena pesada y C\kappa para la cadena ligera.
Entonces debe transfectarse una línea celular de mamífero con los
vectores resultantes y debe monitorizarse la expresión del K121
funcional mediante inmunoensayo tal como se describe para el
anticuerpo quimérico.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aislaron mediante PCR los genes de la región
variable de la cadena pesada (VH de K121) y la cadena ligera (VL de
K121) del anticuerpo monoclonal, K121. El molde para la
amplificación del gen de VH y VL fue el constructo génico de
scFv-mel. Los cebadores de PCR (figura 10) usados
para la amplificación se diseñaron para introducir sitios de
restricción compatibles para la clonación direccional en los
vectores de expresión de mamífero pCMV-\gamma1 y
pCMV-KR (Mahler et al., (1997)
Immunotechnology 3:31).
Se separaron los productos de la amplificación
por PCR mediante electroforesis sobre un gel de agarosa al 1% y se
extrajeron las bandas de ADN del tamaño esperado usando un kit de
extracción en gel QIAquick (Qiagen, Alemania). Entonces se ligaron
los fragmentos génicos en el vector pGEM-T y se
transformaron en células bacterianas competentes, JM109 (Promega,
EE.UU.). Tras la incubación durante la noche, la selección por PCR
usando cebadores (M13) específicos de vector identificó las
colonias que contenían un inserto. Se eligieron los clones positivos
de VH y VL, y se preparó el ADN del plásmido usando el kit Wizard
Mini-prep (Promega, EE.UU.). Se secuenciaron dos
clones que representaban VH y VL sobre un secuenciador de ADN
automatizado ABI por el Centro de Análisis Macromolecular Príncipe
Alfred de la Universidad de Sydney (Sydney University Prince Alfred
Macromolecular Analysis Centre) (SUPAMAC). Las secuencias de ADN de
VH y VL de K121 eran idénticas a las mostradas en la figura 9a con
los sitios de enzimas de restricción y nucleótidos adicionales
incorporados en los cebadores de PCR
(figura 10).
(figura 10).
\vskip1.000000\baselineskip
Se cortaron los genes para VH y VL de K121 a
partir de los clones de pGEM-T usando las enzimas de
restricción Bam HI y ApaLI. Se purificaron mediante extracción en
gel los insertos de VH y VL cortados. Se aisló una secuencia líder
para las cadenas pesada y ligera mediante el corte de
pCMV-\gamma1 con Apa LI e Hind III seguido de la
extracción en gel del inserto de secuencia líder. La secuencia líder
digerida con Hind III y Apa LI se ligó simultáneamente con los
genes VH y VL de K121 en los pCMV-\gamma1 y
pCMV-KR cortados con Hind III y BamHI,
respectivamente. Tras la transformación en células JM109
competentes, se seleccionaron por PCR las colonias que contenían
insertos usando los cebadores específicos del gen VH y VL. Se
preparó ADN del plásmido a partir de clones positivos y se
confirmaron los insertos mediante la digestión con enzimas de
restricción con Bam HI e Hind III. En esta fase deben secuenciarse
los plásmidos pCMV-\gamma1-cVH y
pCMV-KR-cVL usando cebadores
específicos de vector para confirmar la secuencia de ADN de VH y VL
de K121 correctas.
Se hicieron crecer células
CHO-K1 (Chinese Hamster Ovarian, (ovario de hámster
chino)) en medio DMEM/F12 con 10% de FSB (Sigma Aldrich, EE.UU.) y
se incubaron a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 5%. Se incubó un
total de 5 \mug de las preparaciones de plásmido,
pCMV-\gamma1-cVH y
pCMV-KR-cVL, con 4 x 10^{6}
células CHO en 200 \mul de medio RPMI (Sigma Aldrich, EE.UU.)
complementado con 10% de FSB y L-glutamina 2 mM
(Trace Biosciences, NSW). Se colocó la mezcla de células/ADN en una
cubeta y se llevó a cabo la electroporación en un electroporador
Gene Pulser (BioRad, EE.UU.) con los siguientes parámetros;
resistencia 100 ohmios, 0,3 voltios, capacitancia ext 960 \muFD y
constante de tiempo 33-38 ms. Después se
transfirieron las células a 10 ml de medio DMEM/F12 con 10% de FSB
y se hicieron crecer durante 48 h a 37ºC en una atmósfera de
CO_{2} al 5%. Se realizó la selección de las células
transfectadas usando medio de selección complementado con neomicina
que contenía 400 \mug/ml de antibiótico G418 (GENETICIN, Sigma
Aldrich, EE.UU.) en DMEM/F12. Tras 3 días se sustituyó el
sobrenadante del cultivo y se expandieron las células en frascos de
cultivo tisular de 150 cm^{2}. Tras 7 días en medio de selección
se evaluó la expresión de cK121 mediante dos ELISA separados.
El procedimiento para el ELISA se llevó a cabo
tal como se detalla en el ejemplo 4 con algunos cambios en los
reactivos específicos. Brevemente, para determinar la expresión de
un anticuerpo quimérico que contenía la región Fc humana, se
realizó un ELISA recubriendo los pocillos de una placa de 96
pocillos con IgG, IgA e IgM de cabra anti-humanas
(50 \mul/pocillo de 10 \mug/ml). El medio condicionado de las
células CHO transfectadas se incubó entonces en los pocillos,
seguido de un conjugado AP (específico de Fc) de cabra
anti-humano y desarrollo de color con el sustrato
pNPP (Sigma Aldrich, EE.UU.). Se preparó una curva patrón para el
primer ELISA usando diluciones seriadas de IgG1 humana kappa (6
\mug/ml - 6 ng/ml). En paralelo, se sometió el sobrenadante
clarificado de las células CHO transfectadas a dilución seriada y se
analizaron las muestras (figura 11a). Se obtuvo una curva de
dilución similar a la curva patrón para las células CHO que
expresaban cK121. La concentración estimada de cK121 en el medio
acondicionado con células CHO era de 6 ng/\mul.
Se llevó a cabo un segundo ELISA para demostrar
la unión del anticuerpo expresado al antígeno reconocido
específicamente por K121. Se recubrieron los pocillos de la segunda
placa de ensayo con cadenas ligeras kappa libres humanas (50
\mul/pocillo de 100 \mug/ml de disolución). En el segundo ELISA,
el sobrenadante de células CHO clarificadas mostraba unión a
cadenas ligeras kappa libres humanas en un intervalo de diluciones
de la muestra (figura 11b). En comparación, no se observó unión
para el medio acondicionado con células CHO no transfectadas.
Se llevó a cabo la purificación de cK121
mediante la precipitación con sulfato de amonio de proteínas en el
medio de células CHO condicionado (1,4 litro). Tras la diálisis
extensa de la proteína solubilizada de nuevo en
PBS-Az, se sometió la muestra a purificación por
afinidad sobre proteína A - agarosa (Sigma Aldrich, EE.UU.). Se
dializaron las muestras eluidas en PBS pH 7,4, se concentraron en
una celda agitada de Amicon (Millipore, EE.UU.) y se esterilizaron
mediante filtración (Minisart RC15, 0,2 \mum, Sartorius, AG). Se
calculó la concentración de cK121 usando un coeficiente de
extinción de 14 a una absorbancia de 280 nm.
Se determinó la citotoxicidad de cK121 sobre las
células linfoblastoides HMy2 y K562 usando la fuga del ensayo de
LDH citoplásmica tal como se describe en el ejemplo 1. El cK121
purificado mostraba una actividad citotóxica significativa frente a
las células HMy2 positivas para el antígeno y no reaccionó con la
línea de células que no portaban antígeno, K562 (figura 12). Estos
resultados indican que el cK121 ha conservado la capacidad para
inducir la muerte celular en la línea de células diana. Para
confirmar que el mecanismo de la muerte celular es la apoptosis,
deben realizarse los ensayos descritos en el ejemplo 2 sobre células
HMy2 usando cK121 purificado.
La producción a gran escala de cK121 requiere la
selección de una línea celular que puede secretar anticuerpos
estables en ausencia del antibiótico de selección, G418. Por tanto,
se seleccionaron clones de los pocillos que producían resultados
positivos en ambos ELISA (A 405 nm >0,2) y se clonaron limitando
la dilución. Posteriormente, se cultivaron las células CHO de los
únicos clones que podían producir el cK121 secretado en
DMEM-F12 sin el antibiótico. Se seleccionaron las
células que siguieron secretando cK121 en ausencia de antibiótico
como líneas estables de células productoras de cK121. Se evaluó el
medio condicionado de líneas de células CHO de cK121 mediante
inmunoensayo tal como se describe en el ejemplo 9 y se determinó la
cantidad de anticuerpo producida a partir de la curva patrón de
IgG1 humana kappa. La figura 13 muestra 5 clones positivos que se
seleccionaron para la expresión futura (clones 1-5).
Se incluyó un clon negativo como muestra control.
Con el fin de llevar a cabo estudios funcionales
adicionales sobre los clones de cK121 producidos en el ejemplo 13
puede realizarse un experimento de expresión a gran escala. El cK121
puede purificarse y pueden realizarse experimentos de estudio en
animales in vivo.
En la figura 14a se representa un perfil
esquemático del procedimiento de PCR usado para humanizar la VL de
K121. Se identificó previamente la región framework VL humana (hVL)
y se aisló del ADNc usando una estrategia basada en PCR descrita
anteriormente (Asvadi, PhD Thesis, UTS, 1998). Se secuenció el ADN
del plásmido de un único clon que contenía el gen de hVL y se
comparó con la secuencia de ADN de VL de K121 en la figura 14b. La
secuencia de ADN mostrada en negrita codifica para las regiones
determinantes de complementariedad (CDR) de K121. En la figura 14c
se muestran los oligonucleótidos utilizados para incorporar la
secuencia de ADN para CDR1, CDR2 y CDR3 de K121 en la región
framework hVL. La región framework que contenía la CDR2 de K121
puede distinguirse de la hVL por la digestión de los genes con la
enzima de restricción Age1, y el sitio de restricción se muestra en
el cebador de PCR, VLC.
Tal como se muestra en la figura 14a, el molde
para la amplificación por PCR era el gen de hVL y las reacciones en
la primera PCR se llevaron a cabo usando parejas de cebadores VLA +
VLE, VLB + VLF, VLC + VLG y VLD + VLH. Se llevó a cabo la
amplificación de los cuatro fragmentos usando el kit para PCR Taq
TITANIUM (Clontech, CA). Se visualizaron los productos de cada
reacción mediante electroforesis en gel de agarosa con bromuro de
etidio y se aislaron mediante extracción en gel (Promega, MA). Se
llevó a cabo una segunda PCR para unir los cuatro fragmentos
amplificados. El producto amplificado resultante era aproximadamente
de 380 pb. Se extrajo en gel la banda de ADN y se ligó en el vector
pGEM-T según el protocolo recomendado por el
fabricante (Promega, MA). Se transformó una alícuota de la mezcla
de ligación en células JM109 competentes con calor y se depositaron
las muestras sobre placas LB-amp. Tras la incubación
durante la noche a 37ºC, se tomaron colonias individuales y se
cultivaron durante la noche en medio SOC según el protocolo
(Promega, MA). Se aisló el ADN del plásmido usando un sistema de
purificación de ADN Wizard Plus Miniprep. Se sometieron a digestión
diez clones con las enzimas de restricción Age1 y Bam H1 según el
procedimiento de digestión recomendado (Promega, MA). Se
visualizaron los productos de la digestión sobre un gel de agarosa
al 1% que contenía bromuro de etidio. Debe secuenciarse un clon
individual que producía un fragmento de ADN de aproximadamente el
tamaño correcto para confirmar que el inserto contiene el gen de VL
modificado. El gen de VL de K121 humanizado debe ligarse entonces a
un vector pCMV-KR de expresión de mamífero tal como
se describe en el ejemplo 9.
Se aisló el gen de la región variable de la
cadena pesada humano, hVH, y se clonó usando una estrategia de PCR
tal como se describe en el ejemplo 14. Se usó un plásmido
pGEM-T que contenía el gen de hVH como molde para
el procedimiento del kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange
(figura 15a). En la figura 15b se representan los cebadores
utilizados para incorporar las tres CDR de VH de K121 en la región
framework hVH. Tras cada ronda de mutagénesis debe secuenciarse el
plásmido para confirmar que la secuencia de ADN es correcta.
Entonces debe ligarse el gen de VH de K121 humanizado en el vector
de expresión de mamífero pCMV-\gamma1 tal como se
describe en el ejemplo 9.
Los experimentos detallados en el presente
documento demuestran que el anticuerpo monoclonal murino K121 induce
la muerte celular en una línea de células linfoblastoides humanas,
HMy2, en ausencia de cualquier proteína de complemento sérico
añadida o célula efectora auxiliar. Se ha mostrado previamente que
las células HMy2 expresan un antígeno, AMK, que se reconoce por
K121. Cuando se incubaron las células HMy2 con K121 solo a una
concentración de 3,6 \muM, se produjo una muerte celular
significativa tal como se indicaba mediante la liberación de la LDH
intracelular (figura 1).
La especificidad de la actividad citotóxica de
K121 se demuestra por el hecho de que el tratamiento de una línea de
células negativas para AMK, K562, no dio como resultado una muerte
celular significativa (figura 1).
\newpage
La observación microscópica de las células HMy2
incubadas en presencia o ausencia de K121 indicó que la muerte
celular se producía en presencia de K121. En presencia de K121,
parecía que las células se contraían y había indicios de
"formación de ampollas" en la membrana. Estos efectos son
típicos de células que experimentan un proceso denominado muerte
celular programada o apoptosis (Kerr, JFR. et al., (1972) Br
J Cancer 26:239). Por el contrario, la incubación de las células
HMy2 con la inmunotoxina scFv-mel dio como resultado
la aglutinación de las células y la lisis de la membrana.
Claramente, el aspecto de las células incubadas con K121 era
diferente al de las incubadas con la inmunotoxina,
scFv-mel. Estas observaciones preliminares sugieren
que el mecanismo que da como resultado la muerte celular usando
K121 es diferente al efecto citotóxico de
scFv-mel.
El análisis de las propiedades de dispersión de
la luz de las células HMy2 que experimentan muerte celular inducida
por K121 reveló cambios en el tamaño y la estructura interna de las
células que eran compatibles con la apoptosis (figura 2). Esta
interpretación del mecanismo mediante el que K121 destruye las
células diana se confirmó mediante dos ensayos separados para
determinar la apoptosis que medían las fases temprana y tardía del
proceso respectivamente (figures 3 y 4). Así, K121, en ausencia de
cualquier factor exógeno, induce la apoptosis en células que portan
AMK in vitro. Además, K121 previene el crecimiento de células
tumorales in vivo. La administración de K121 a ratones que
habían recibido una dosis inductora de tumores de las células HMy2
prevenía el crecimiento tumoral tal como se mide mediante la
presencia de IgG humana en el suero de ratones receptores (figura
5). Se observó crecimiento tumoral en todos los ratones en el grupo
tratado con PBS tal como se indica mediante los niveles de IgG
humana sérica y la morfología macroscópica en la disección.
La apoptosis es un acontecimiento biológico
importante implicado en el desarrollo embrionario y, en particular,
en el desarrollo y funcionamiento del sistema inmunitario
(Mastrangelo AJ. y Betenbaugh M. (1998) TIBTECH. 16:88). A
diferencia de la muerte celular que surge de la necrosis, la
apoptosis se produce en ausencia de cualquier patología y no
provoca una respuesta inflamatoria (Kerr, JFR. et al., (1972)
Br J Cancer 26:239). Esto es una consideración importante con
respecto al uso de posibles agentes terapéuticos que pueden
desencadenar la apoptosis en las células diana.
<110> PacMab Pty Ltd
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método para tratar el mieloma
múltiple
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 500564
\vskip0.400000\baselineskip
<150> AU PR 6179
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
06-07-2001
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 119
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 357
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<212> ADN
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<213> Mus musculus
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\newpage
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<212> ADN
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<213> Mus musculus
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<212> ADN
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<213> Mus musculus
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\hskip-.1em\dddseqskipgatcccccca gatggtacta atgctgcccc tgatgacccc ggttccctgg tgccagtgg
\hfill59
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<212> ADN
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<212> ADN
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<213> Mus musculus
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<212> ADN
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<213> Mus musculus
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<212> ADN
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<212> ADN
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<213> Mus musculus
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<212> ADN
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\hskip-.1em\dddseqskipcgttatattg gtcgataggc atgtgcaagc ctcccccctg gttcgacctt tatttc
\hfill56
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<212> ADN
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<212> ADN
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<213> Mus musculus
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\hfill58
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<210> 20
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<211> 18
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<212> ADN
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\hskip-.1em\dddseqskipcaggtgcagc tgcagcag
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<210> 21
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<212> ADN
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\hskip-.1em\dddseqskipggtgaccgtg gtcccttgg
\hfill19
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<212> ADN
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<213> Mus musculus
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<212> ADN
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<212> ADN
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<220>
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<212> ADN
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<220>
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<212> ADN
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<212> ADN
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<211> 34
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<212> ADN
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<211> 45
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<213> Mus musculus
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<212> PRT
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<212> ADN
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<213> Mus musculus
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<211> 73
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<212> ADN
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<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactaaatatg acccgaagtt ccagggccga ttc
\hfill33
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Cebador de PCR
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<400> 48
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\hskip-.1em\dddseqskipgaatcggccc tggaacttcg ggtcatattt agt
\hfill33
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
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<211> 45
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<212> ADN
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<220>
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<400> 49
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\hskip-.1em\dddseqskiptgcgagaggg gtctaccatg attacgacgg ggactactgg ggccg
\hfill45
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\hskip-.1em\dddseqskipcggccccagt agtccccgtc gtaatcatgg tagacccctc tcgca
\hfill45
Claims (14)
1. Uso de un anticuerpo que no está conjugado
con una toxina o un agente citolítico en la preparación de un
medicamento para el tratamiento del mieloma múltiple de tipo kappa
en un sujeto en el que el anticuerpo destruye las células de mieloma
de tipo kappa presentes en una población mixta de células y el
anticuerpo comprende la región VH expuesta en la SEQ ID NO:1 y la
región VL expuesta en la SEQ ID NO:3 o compite con un anticuerpo que
comprende la región VH expuesta en la SEQ ID NO:1 y la región VL
expuesta en la SEQ ID NO:3 por la unión al antígeno de mieloma kappa
(AMK).
2. Uso según la reivindicación 1, cuyo
medicamento induce la apoptosis en células que portan AMK.
3. Uso según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que el sujeto se ha tratado previamente para
reducir los niveles de cadenas ligeras kappa libres presentes en un
fluido del sujeto.
4. Uso según la reivindicación 3, en el que el
tratamiento previo comprende plasmaférisis.
5. Uso según la reivindicación 3 o la
reivindicación 4, que comprende tratar una población de células
progenitoras hematopoyéticas extraída del sujeto con el
anticuerpo.
6. Uso según la reivindicación 5, en el que el
sujeto ha recibido previamente terapia citorreductora.
7. Uso según cualquier reivindicación anterior,
en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
8. Uso según cualquier reivindicación anterior,
en el que el anticuerpo comprende los bucles de CDR del anticuerpo
tal como se muestra en la figura 9a.
9. Uso según cualquier reivindicación anterior,
en el que el anticuerpo es un anticuerpo quimérico o un anticuerpo
humanizado.
10. Método para tratar células de mieloma de
tipo kappa, en el que el tratamiento destruye las células de mieloma
de tipo kappa presentes en una población mixta de células que
comprende tratar una población de células progenitoras
hematopoyéticas extraída de un sujeto con un anticuerpo que no está
conjugado con una toxina o un agente citolítico, en el que el
anticuerpo comprende la región VH expuesta por la SEQ ID NO:1, y la
región VL expuesta en la SEQ ID NO:3 o compite con un anticuerpo que
comprende la región VH expuesta en la SEQ ID NO:1 y la región VL
expuesta en la SEQ ID NO:3 por la unión al antígeno de mieloma
kappa.
11. Método según la reivindicación 10, en el que
el tratamiento induce la apoptosis en células que portan AMK
presentes en una población mixta de células.
12. Método según la reivindicación 10 o la
reivindicación 11, en el que el anticuerpo es un anticuerpo
monoclonal.
13. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 12, en el que el anticuerpo comprende los
bucles de CDR del anticuerpo tal como se muestra en la figura
9a.
14. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 13, en el que el anticuerpo es un anticuerpo
quimérico o un anticuerpo humanizado.
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