MXPA04000130A - Metodo para tratar mieloma multiple. - Google Patents

Abstract

La presente invencion concierne a metodos para el tratamiento de mieloma multiple. Mas particularmente, la presente invencion concierne a un metodo para inducir apoptosis en celulas de mieloma por administracion de un anticuerpo semejante a K121.

Description

METODO PARA TRATAR MIELOMA MULTIPLE CAMPO DE LA INVENCION La presente invención concierne a métodos para el tratamiento de mieloma múltiple. Más particularmente, la presente invención concierne a un método para inducir apoptosis en células de mieloma por administración de un anticuerpo similar a 121.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION El mieloma múltiple (MM) es una malignidad de las células B caracterizada por la acumulación de células B (células plasmáticas) diferenciadas terminalmente en la médula ósea. Búsquedas recientes han identificado algunos de los defectos moleculares y genéticos que se encuentran en células de plasma mielornatoso (Drach J. y colaboradores (2000) Cáncer Res Clin Oncol. 126: 441; Ludwig, H. y colaboradores (1999) Annals Oncol. 10 (6) : S31) . Estos datos indican que eventos moleculares múltiples dan como resultado profunda inestabilidad genética de las células, resistencia a la quimioterapia y neovascularización creciente de la médula ósea. La terapia actual para MM es altas dosis de quimioterapia y/o trasplante autólogo de células germinales sanguíneas. Actualmente, el tratamiento posterior es favorecido debido a un índice de sobrevivencia mayor a cinco años (52 % versus 12 %) . Recientemente, los agentes antiangiogénicos tales como la Talidomida han producido una respuesta objetiva en aproximadamente 30 % de los pacientes resistentes. El MM es fatal irreversiblemente a pesar de estas terapias drásticas, con tiempos de sobrevivencia medios de 4-6 años dependiendo del modo de tratamiento (Kyle, RA. Y colaboradores (2001) The Oncologist. 6 (2) : 119) . Actualmente hay 40,000 pacientes con MM en los Estados Unidos, con un estimado de aproximadamente 14,000 nuevos pacientes que son diagnosticados cada año (Chauhan, D. y Anderson KC. (2001) Apoptosis, 6 (1-2) : 47) . La incidencia mundial de MM está entre 1.5 - 4.5/ 100,000 anuales dependiendo del país (Hurez, D. (1993) Revue du Praticien, 43 (3) :271) . Las células B malignas en MM producen cantidades excesivas de cadenas ligeras, un componente de la inmunoglobulina, y estas cadenas ligeras están presentes en el suero y orina de los individuos con esta enfermedad. Aproximadamente 70 % de pacientes con MM producen cadenas ligeras de tipo kappa, con el 30 % restante que son de tipo lambda (Kyle, RA, (1999) Path Biol. 47(2):148). K121 es un anticuerpo monoclonal de murina (mAb) que reconoce específicamente a las cadenas ligeras kappa libres humanas y a un antígeno expresado sobre la superficie de células de mieloma de tipo kappa. Este antigeno se denomina antigeno de mieloma kappa o KMA (Boux, HA, y colaboradores (1983) J Exp Med. 158: 1769). Se estableció que el KMA consiste de cadenas ligeras kappa libres expresadas en asociación covalente con actina sobre la membrana celular (Goodnow y colaboradores (1985) J. Immunol. 135:1276) . K121 no exhibe reactividad cruzada con cualquier célula linfoide normal o maligna o con moléculas de inmunoglobulina humana intactas (Boux, HA y colaboradores (1984) Eur. J. Immunol. 14: 216) . Se ha desarrollado un inmunoensayo cuantitativo para medir cadenas ligeras kappa libres en el suero y orina de pacientes que sufren de MM, usando 121 (Axiak, SM. (1987) J Immunol Methods, 99:141) . La literatura reciente sugiere que la cuantificación de cadenas ligeras libres puede usarse para monitorear el progreso y la respuesta a la terapia de estos pacientes (Drayson, M. (2001) Blood 97 (9) : 2900) . Se sugiere también que el K121 puede usarse para liberar citotoxinas en células de mieloma kappa (Goodnow y colaboradores (1985) J. Immunol. 135: .1276). Realmente, se ha desarrollado una inmunotoxina que comprende el péptidp citolitico melitin unido a un fragmento scFV K121 (scFv-mel) como u agente terapéutico potencial para el tratamiento de MM (Dunn, RD. y colaboradores, (1996) Immunotechnology 2: 229).

SUMARIO DE IA INVENCION Los inventores de la presente encontraron actualmente que K121 solo (es decir sin conjugar con una toxina o con un agente citolitico) es capaz de matar a células de apoyo KMA por inducción de apoptosis. Además, los inventores de la presente han demostrado que 121 solo puede evitar el crecimiento de células tumorales in vivo. Estos hallazgos indican que Anticuerpos similares a K121 son potencialmente útiles como agentes terapéuticos primarios en el tratamiento de iuieloma múltiple. Por consiguiente, en un primer aspecto la presente invención proporciona un método para el tratamiento de mieloma múltiple tipo kappa en un sujeto, el método comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de un anticuerpo similar a K121, en donde el anticuerpo similar a K121 no está conjugado a una toxina o a un agente citolitico. La presente invención también proporciona el uso de un anticuerpo similar a 121 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de mieloma múltiple de tipo kappa, en donde el anticuerpo similar a K121 no está conjugado a una toxina o a un agente citolitico. En una modalidad preferida del primer aspecto, el método comprende adicionalmente la etapa de tratar al sujeto para reducir los niveles de cadenas ligeras kappa libres presentes en el fluido del sujeto antes de la administración del anticuerpo similar a K121. Preferiblemente, los niveles de las cadenas ligeras kappa libres presentes en el suero del sujeto son reducidos. Puede lograrse una reducción en los niveles de las cadenas ligeras kappa libres por ejemplo, por plasmaféresis . Se prefiere que el tratamiento para reducir los niveles de las cadenas ligeras kappa libres se efectúa en el sujeto justo antes de la administración del anticuerpo similar a K121. En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un método para el trasplante de células hematopoyéticas autólogas en un sujeto, el método comprende : (i) remover una población de células hemtopoyéticas progenitoras del sujeto, (ii) tratar a la población celular con un anticuerpo similar a K121, y (iii) trasplantar la población celular tratada en la etapa (ii) en el sujeto, en donde el anticuerpo similar a K121 no está conjugado a una toxina o a un agente citolitico. En una modalidad preferida del segundo aspecto, el método también involucra la infusión intravenosa de un anticuerpo similar a K121 en el sujeto. En una modalidad preferida del segundo aspecto, el método de trasplante autólogo se efectúa en el sujeto durante o después de la terapia citoreductora. En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un método para matar a células de mieloma de tipo kappa en una población mezclada de células, el método comprende poner en contacto a la población mezclada de células con un anticuerpo similar a K121, en donde el anticuerpo similar a K121 no está conjugado a una toxina o a un agente citolitico . En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un método para inducir apoptosis en células de apoyo de ???, el método comprende exponer a las células a un anticuerpo similar a K121,, en donde el anticuerpo similar a 121 no está conjugado a una toxina o a un agente citolitico. En una modalidad preferida del cuarto aspecto, las células de apoyo de KM¾. son células de mieloma de tipo kappa. En una modalidad de la presente invención, el anticuerpo similar a K121 comprende los bucles del CDR (CDR1, CDR2 y CDR3) del anticuerpo 121 como se muestra en la Figura 9a. En otra modalidad, el anticuerpo similar a K121 comprende los genes VL y VH como se muestra en la Figura 9a . En una modalidad preferida adicional de la presente invención, el anticuerpo similar a K121 es un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1 (a) . Actividad citotóxica de mAb K121 sobre células linfoblastoides HMy2 y K562 que se midió por infiltración de LDH ' citoplásmico (absorbancia a 492 nm) . Las células incubadas por 20 horas en la presencia y en ausencia de 121 mAb (6.25 µ?) (b) Cinéticas de muerte celular inducida por K121 (c) Dependencia de la concentración de la muerte de células HMy2 por K121. Figura 2. Análisis citométrico de flujo de apoptosis inducida por K121 de células HMy2. Perfil de dispersión ligera de células HMy2 incubadas con PBS o por 121 por 16 y 20 horas. FSC y SSC corresponden al tamaño celular y a la complejidad celular respectivamente. Figura 3(a). Análisis citométrico de flujo de apoptosis inducida por 121 de células HMy2 usando Anexina V-FITC. Las células HMy2 fueron incubadas en la ausencia (Control) o en la presencia de K121 a 37· °C por 16 h o 20 h. Después, las células fueron incubadas con Anexina V-FITC y se contaron las manchadas con ioduro de propidio. (b) Citotoxicidad de K121 mAb sobre células HMy2 llevadas a cabo en paralelo con el ensayo de Anexina V. Las células HMy2 fueron incubadas a 37 °C por 16 o por 20 h en la ausencia (control) o presencia (5.35 µ?) de K121 mAb. El cultivo sobrenadante se cosechó para análisis de infiltración de LDH citosólico. Figura 4(a). Análisis citométrico de flujo de la apoptosis inducida por K121 de células HMy2 usando el ensayo de TUNEL. Las células HMy2 fueron incubadas en la ausencia (Control o en presencia de K121 a 37 °C por 16 o por 20 h. Después, las células se fijaron y el DNA intracelular se fijó enzimáticamente con Fluoresceina-12-dUTP en el extremo 3r y. (b) Citotoxicidad de células HMy2 después de 16 y de 20 h de incubación con y sin 121 llevada a cabo en paralelo con el ensayo TUNEL. Las células HMy2 se incubaron a 37 °C por 16 o 20 h en la ausencia (control) o presencia (5.35 uM) de K121 mAb. El cultivo sobrenadante se cosechó para análisis citosólico de infiltración de LDH. Figura 5. Transcurso del tiempo de niveles de suero de la IgG humana secretada por H y2 en ratones SCID después de (a) sin tratamiento (PBS) , (b) tratamiento con scFv-mel o (c) tratamiento con 121 mAb. Se inyectaron células (107) i.p. en el día cero y tratamiento con scFv-mel (0.5 mg/dosis) o K121 mAb (1.25 mg/dosis) dados en los días 1 - 3. En el grupo de tratamiento, cada símbolo representa valores de IgG para un ratón individual . Figura 6. Efecto del tratamiento con anticuerpo sobre el crecimiento tumoral en ratones SCID. Ratones SCID inyectados con células HMy2 en el día 0 y 121 mAb administradas durante 3 días (dia 1, 2 y 3) a niveles de dosis totales de 3.0, 1.5, 0.3, 0.15 y 0 (control de PBS) mg. Se evaluó el crecimiento tumoral por cuantificación de IgG humana en suero de ratones. Los valores graficados son medias de 6 ratones, excepto para el valor de la Semana 6 en un grupo no tratado, en donde el valor es de un solo ratón. Figura 7. Efecto la dosis del anticuerpo sobre la sobrevivencia de ratones de apoyo de tumor. Figura 8. Niveles de IgG humana en el suero de ratones sin tratar y tratados con anticuerpo, 42 días después de la inyección de células tumorales . Los valores son para ratones individuales . Figura 9 (a) .La secuencia de aminoácidos y la secuencia de DNA correspondiente para las regiones variables de cadena pesada de K121 (VH) y la cadena ligera (VL) . Las regiones de CDR se muestran en negrilla, (b) Oligonucleótidos sobrepuestos (VH1-VH6) derivados del gen de VH de K121, (c) Oligonucleótidos sobrepuestos (VL1 -VL6) derivados del gen de VL de K121, (d) cebadores de PCR., para la extensión del oligonucleótido de K121 de VH, (e) cebadores de PCR para la extensión de oligonucleótido de K121 de VL, (f) Representación esquemática de un método para crear las regiones variables de cadena ligera y de cadena pesada del anticuerpo monoclonal K121 usando la extensión del oligonucleótido. Figura 10. Cebadores de PCR para amplificación por PCR de genes de VL y VH de K121. Los sitios de enzimas de restricción para clonación direccional en los vectores de expresión de mamíferos están subrayados. Los cebadores cK-VH-R y c -VL-R incluyen un sitio receptor empalmado (mostrado en negrillas) . Figura 11(a) ELISA para detección y cuantificación del anticuerpo humano el sobrenadante de células CHO transfectadas . El sobrenadante del cultivo de las células CHO transfectadas se diluyó en seriadamente y el anticuerpo humano que enlaza a la IgG+A+M anti-humana de cabra inmovilizada se detectó con el conjugado AP específico de Fe anti-humano de cabra. Se efectuó una curva estándar en paralelo usando diluciones seriadas de IgGl K humana. El anticuerpo enlazado se visualizó por medio del desarrollo de color y la medición de la absorbancia a 405 nm, (b) Una ELISA para detección de K121 quimérico que enlaza a la cadena ligera kappa humana. El sobrenadante del cultivo de las células CHO transfectadas y sin transfectar se diluyó seriadamente y se detectó el anticuerpo que enlaza a las cadenas ligeras kappa humanas inmovilizadas, usando el conjugado AP especifico de Fe anti-humano de cabra. Después de desarrollo de color se detectó el anticuerpo enlazado por absorbancxa a 405 nm. Figura 12. Actividad citotóxica de 121 quimérico (C 121) sobre células linfoblastoides HMy2 y 562 que se midió por la infiltración de LDH citoplásmica. Se incubaron células objetivo en la presencia de PBS (control), 5.5 uM de K121 de murina (mK121) o 0.8 µ? de K121 quimérico (cK121) por 20 h a 37 °C en una atmósfera con C02 al 5 %. Figura 13. Concentración de c 121 secretada por clones individuales. La concentración de cK121 se determinó por medio de una ELISA usando células recubiertas con IgG, IgA e IgM anti-humanas . Los -datos representan clones positivos 1 - 5 y un clon 6 negativo. Figura 14 (a) . Representación esquemática de un método para la humanización de K121 VL usando un gen de VL humano como una estructura, (b) La secuencia de DNA de una estructura VL humana y un VL de K121 (c) Oligonucleótidos para la humanización de K121 VL usando PCR. Figura 15 (a) . Secuencia 'de DNA de los genes de cadena pesada variable de VH3 humana (hVH) , (b) cebadores para mutagénesis de VH para uso en la humanización de DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Cuando se usa en la presente la frase ""anticuerpo similar a K121" se refiere a un anticuerpo que compite con un anticuerpo que tiene las regiones VL y VH mostradas en la Figura 9a para enlazar a las células de mieloma de tipo kappa. Preferiblemente, el término "anticuerpo similar a 121" se refiere a un anticuerpo que enlaza al mismo epitope que un anticuerpo que tiene las regiones VH y VL mostradas en la Figura 9a. El anticuerpo similar a K121 comprende preferiblemente los bucles de CDR (CDR1, CDR2 y CDR3) del anticuerpo 121 como se muestra en la Figura 9a. El anticuerpo similar a K121 puede comprender los genes de VH y de VL del anticuerpo K121 como se muestra en la Figura 9a. Los anticuerpos similares a 121 pueden identificarse por su capacidad para competir con 121 (formas quiméricas o humanizadas de K121) al enlazar a ??? sobre células HMy2. En este procedimiento, K121 puede estar conjugado con biotina usando los procedimientos establecidos (Hofman K, y colaboradores (1982) Biochemistry 21: 978- 84) . Los anticuerpos similares a K121 son entonces evaluados por su capacidad para competir con el enlace de K121 biotinilado a KMA sobre células HMy2. El enlace de K121 biotinilado a células HMy2 puede evaluarse por la adición de estrepatvidina marcada con fluoresceina la cual enlaza a la biotina sobre moléculas de K121. La tinción por fluorescencia de células se cuantifica entonces por citometria de flujo , y el efecto competitivo del anticuerpo similar a 121 expresado como un porcentaje de los niveles de fluorescencia obtenidos en ausencia del competidor. Para los propósitos de esta invención, el término ??anticuerpo", a menos que se especifique lo contrario, incluye fragmentos bivalentes de anticuerpos completos que retienen su actividad de enlace por un antigeno objetivo. Dichos fragmentos incluyen por ejemplo, a fragmentos F(ab')2. En una modalidad preferida de la presente invención, el anticuerpo similar a K121 es un anticuerpo recombinante o monoclonal. En una modalidad adicional preferida, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico o humanizado. Cuando se usa en los métodos de la presente invención, el anticuerpo similar a K121 no está conjugado a una toxina o a un agente citolitico. Por "toxina" se quiere decir cualquier toxina conocida en el arte tal como la toxina de la difteria, saprina, ricino y la exotoxina de Pseudomonas . Por ^agente citolitico" se quiere decir un agente tal como -el melitin que causa la lisis celular. En el transcurso de esta especificación la palabra "comprendido", o variaciones tales como "comprende" o "que comprende", se entenderá para implicar la inclusión de un elemento, entero o etapa o grupo de elementos, enteros o etapas establecidos, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, entero o etapa, o grupo de elementos, enteros o etapas. Anticuerpos Monoclonales Un experto en el arte puede producir fácilmente los anticuerpos monoclonales dirigidos contra epitopes de KMA. Es bien conocida la metodología general para elaborar anticuerpos monoclonales por medio de hibridoma. Pueden crearse líneas celulares que producen anticuerpos inmortales por medio de fusión celular, y también por medio de otras técnicas tales como la transformación directa de linfocitos B con DNA oncogénico, o la transfección con el virus de Epstein-Barr . Grupos de anticuerpos monoclonales producidos contra epitopes de KMA pueden ser cribados por varias propiedades; es decir por afinidad de epítope e isotipo. Los anticuerpos monoclonales derivados de ratón pueden ser usados tanto para inmunoterapia In vivo directa como por inmunoterapia extracorporal . No obstante, se ha observado que cuando los anticuerpos monoclonales derivados de ratón son usados en humanos como agentes terapéuticos, el paciente produce anticuerpos, anti-ratón humanos. Asi, los anticuerpos monoclonales derivados de ratón no son preferidos para terapia, especialmente para uso a largo plazo. Con las técnicas de ingeniería genética establecidas es posible, no obstante, crear anticuerpos humanizados o quiméricos que tengan porciones derivadas de humano y derivadas de animal. El animal puede ser un ratón u otro roedor tal como la rata. Si la región variable del anticuerpo quimérico es derivado de ratón, aunque la región constante sea derivada de humano, el anticuerpo quimérico generalmente será menos inmunogénico que un anticuerpo monoclonal derivado de ratón "puro". Estos anticuerpos quiméricos serían probablemente más adaptados para uso terapéutico, lo que debiera hacer que los anticuerpos derivados de ratón "puros" sean inadecuados. Anticuerpos Quiméricos Las metodologías para generar anticuerpos quiméricos están disponibles para los expertos en la materia. Por ejemplo, las cadenas ligeras y pesadas pueden ser expresadas separadamente, usando por ejemplo, cadenas ligeras de inmunoglobulina y cadenas pesada de inmunoglobulina en plásmidos separados. Estos pueden entonces ser purificadas y conjuntadas in vitxo en anticuerpos completos; se han descrito las metodologías para lograr dicho conjunto. Ver, por ejemplo, Scharff, M., Harvey Lectures 69; 125 (1974) . Ver también Oi y colaboradores, Bio Techniques 4 (4) : 214- 221 (1986) ; y Sun y colaboradores, Hybridoma 5 (1986) Suppl 1: 517-20. , Una construcción de DNA tal puede comprender DNA que codifica a genes redistribuidos funcionalmente para la región variable de una cadena pesada o ligera de un anticuerpo similar a K121 enlazado al DNA que codifica a una región constante humana. Células linfoides tales como mielomas o hibridomas transíectados con las construcciones de DNA para las cadenas ligera y pesada pueden expresar y conjuntar las cadenas del anticuerpo. Se describen también los parámetros de reacción in vitro para la formación de los anticuerpos de IgG desde cadenas pesadas y ligeras aisladas reducidas. Ver, por ejemplo, Beychock, S., Cells of Immunoglobulin Synthesis, Academic Press, New York, p. 69, 1979. La co-expresión de las cadenas ligeras y pesadas en las mismas células para lograr asociación intracelular y la unión de las cadenas pesadas y ligeras en anticuerpos de H2L2IgG completos, es también posible. Dicha co-expresión puede lograrse usando ya sea el mismo o diferentes plásmidos en la misma célula huésped. Anticuerpos Humanizados En otra modalidad preferida de la presente invención el anticuerpo similar a K121 es humanizado, esto es, un anticuerpo producido por técnicas de modelaje molecular en donde el contenido humano del anticuerpo es maximizado mientras que causa poco o ninguna pérdida de afinidad de enlace atribuible a la región variable del anticuerpo de murina . Los métodos descritos posteriormente son aplicables a la humanización de anticuerpos similares a 121. Puede usarse un procedimiento en dos etapas, el cual involucra (a) seleccionar secuencias de anticuerpo humano que son usadas como estructuras humanas para la humanización, y (b) determinar cuales residuos de región variable del anticuerpo monoclonal animal deberán ser seleccionados por inserción en la estructura humana seleccionada. La primera etapa involucra la selección de las mejores secuencias de estructura humana seleccionadas para las cuales está disponible la información de las secuencias. Este proceso de selección está basado en el siguiente criterio de selección. (1) Porciento de Identidades Las secuencias de las regiones variables de cadena ligera y pesada de un anticuerpo monoclonal de animal, esto es para ser humanizado son alineadas óptimamente y son comparadas preferiblemente con las secuencias de las regiones variables ligera y pesada del anticuerpo humano conocido . Una vez que las secuencias han sido comparadas asi, se observan las identidades de los residuos y se determinan los porcientos de identidades. Todos los otros factores que son iguales, es deseable para seleccionar un anticuerpo humano que tiene el porciento de identidad más alto con el anticuerpo animal . (2) Ambigüedades de Secuencia en casos en donde las secuencias se derivan por secuenciación directa de la protexna, las secuencias de la cadena del anticuerpo conocidas pueden ser evaluadas por la presencia de residuos no identificados y/o ambigüedades, las cuales son secuencias inciertas. La más común de dichas incertidumbres es la identificación errónea de un aminoácido ácido por un aminoácido amida debido a pérdida de amoniaco durante el procedimiento de secuenciación, por ejemplo, identificación incorrecta de un residuo de ácido glutámico, cuando el residuo actualmente presente en la proteina fue un residuo glutamina. Todos los otros factores que son iguales, son deseables para seleccionar una cadena de anticuerpo humano que tenga tan pocas de dichas ambigüedades como sea posible. (3) Espaciador de la región de Pin Las regiones variables de cadena del anticuerpo contienen puentes disulfuro intra-regió . La distancia (número de residuos) entre los residuos cisterna que comprenden estos puentes es mencionada como el espaciador de la región de Pin (Chothia y colaboradores, J. Mol. Biol. 196: 901 (1987)). Todos los otros factores que son iguales, es más deseable que el espaciador de la región de Pin de un anticuerpo humano seleccionado sea similar o idéntico al del anticuerpo animal. Es también deseable que el espaciador de la región de Pin de la secuencia humana sea similar a la de una estructura tridimensional del anticuerpo conocido, para facilitar el modelaje computacional . Con base en el criterio anteriormente mencionado, el anticuerpo humano (o anticuerpos) que tengan la mejor combinación completa de características deseables es seleccionado como la estructura para humanización del anticuerpo animal. Las cadenas ligera y pesada seleccionadas pueden ser del mismo o de diferentes anticuerpos humanos. La segunda etapa en los métodos de esta invención involucra la determinación de cual de las secuencias de región variable del anticuerpo animal seria seleccionada para injertar en la estructura humana. Este proceso de selección está basado en el siguiente criterio de selección: (1) Selección del residuo Se evalúan dos tipos de residuos de región variable potenciales en las secuencias del anticuerpo animal, el primero de los cuales se denomina "residuo mínimo". Este residuo minimo comprende bucles estructurales de CDR más cualquier residuo adicional requerido, como se muestra por medio del modelaje computacional, para apoyar y/o orientar los bucles estructurales de CDR. El otro tipo de residuos de región variable potenciales se mencionan como ^residuos máximos". Comprenden los residuos mínimos más cualquier residuo adicional el cual, como se determina por medio del modelaje computacional, cae en aproximadamente 10 Á de los residuos del bucle estructural de CDR y posee una superficie accesible a solvente acuoso (Lee y colaboradores, J. Biol. C em. 55: 379 (1971)). (2) Modelaje Computacional Para identificar residuos de región variable, el modelaje computacional se lleva a cabo sobre (a) las secuencias de región variable del anticuerpo animal que es para ser humanizado, (b) las secuencias de la estructura del anticuerpo humano seleccionado, y (c) todos los anticuerpos recombinantes posibles que comprenden las secuencias de la estructura del anticuerpo humano en la cual los varios residuos del anticuerpo animal máximos y mínimos han sido injertados.

El modelaje computacional se efectúa usando programas adecuados pata modelaje de proteínas e información estructural obtenida de un anticuerpo que (a) tiene unas secuencias de aminoácidos de región variable más cercanamente idénticas a las del anticuerpo animal y (b) tiene una estructura tridimensional conocida. Un ejemplo de programa que puede usarse es el programa SYBYL Biopolymer Module (Tripos Associates). El anticuerpo del cual puede obtenerse la información estructural puede ser pero no es necesariamente un anticuerpo humano. Con base en los resultados obtenidos en el análisis anteriormente mencionado, cadenas recombinantes que contienen regiones variables de animal que producen una estructura de modelaje computacional que se aproximan más estrechamente al del anticuerpo animal son seleccionadas para humanización. Pueden hacerse anticuerpos humanos integralmente, usando bibliotecas de expresión de inmunoglobulina humana (Stratagene Corp., La Jolla, Calif.) para producir fragmentos de anticuerpos humanos (VH, Vl Fv, Fd, Fab, o F(ab' )?)/ y usando estos fragmentos para construir anticuerpos humanos completos, usando técnicas similares a aquellas para producir anticuerpos quiméricos. Modos de Administración Los anticuerpos similares a K121 pueden ser administrados directamente a un sujeto en necesidad de tratamiento para mieloma múltiple.. El crecimiento de células tumorales puede ser inhibido o reducido al administrar a un sujeto en necesidad del tratamiento una cantidad efectiva de un anticuerpo similar a K121. Típicamente, el anticuerpo puede ser administrado en una cantidad de aproximadamente 0.001 a 2000 mg/kg de peso corporal por dosis, y más preferiblemente aproximadamente 0.01 a 500 mg/ks de peso corporal por dosis. Pueden administrarse dosis repetidas cuando lo prescriba el médico tratante. No obstante, son adecuadas también otras cantidades. Generalmente, la administración del anticuerpo es conducida por infusión de modo que la cantidad de anticuerpo presente que puede producir un efecto dañino puede conservarse bajo control al variar la velocidad de administración. Típicamente, la infusión de una dosis puede terminar en unas cuantas horas. No obstante, también se contempla en la presente la infusión constante de una dosis para propósitos terapéuticos que permitirá el mantenimiento de un nivel constante del anticuerpo en suero. La infusión del anticuerpo similar a K121 puede conducirse como sigue. El entubamiento intravenoso (I.V.) puede ser pretratado, por ejemplo con NaCl al 0.9 % y albúmina de suero humano al 5 % y ser colocado para administración intravenosa. La infusión I.V. puede comprender un volumen total de 250 mi de NaCl al 0.9 % y albúmina de suero humano al 5 % y puede infusroñarse durante un periodo de aproximadamente 2 horas dependiendo de los efectos colaterales observados dependientes de la velocidad. Pueden tomarse los signos vitales, por ejemplo, cada quince minutos durante la infusión y cada hora post-infusión hasta que sean estables. Un examen profundo físico cardiopulmonar puede hacerse antes de, y a la conclusión de la infusión. La medicación que incluye acetaminofeno, difenhidramina, epinefrina, y corticoesteroides pueden conservarse a la mano para el tratamiento de reacciones alérgicas que podrían tener lugar. La administración del anticuerpo puede repetirse si al médico le parece deseable. Como podrán apreciar los expertos en la materia, algunos pacientes de mieloma tienen niveles significativos de la cadena ligera kappa libre en su circulación. Cuando los anticuerpos similares a K121 reaccionan con las cadenas ligeras kappa libres, su presencia en el fluido del sujeto puede reducir la eficiencia del tratamiento. Por consiguiente, en una modalidad preferida de la invención el método de tratamiento comprende adicionalmente la etapa de tratar al sujeto para reducir los niveles de las cadenas kappa libres que circulan en el fluido (por ejemplo sangre) del sujeto antes de la administración del anticuerpo similar., a K121. Esta etapa de tratamiento adicional puede involucrar, por ejemplo, plasmaféresis . Como sabrán los expertos en la materia, la plsmafaresis es un proceso en el cual el plasma es removido de las células sanguíneas por medio de un dispositivo conocido como un separador celular. El trabajo del separador ya sea por centrifugación de la sangre a alta velocidad para separar las células del fluido o bien por el paso de la sangre a través de una membrana con poros tan pequeños que solamente pueda pasar a través de ellos el plasma. Las células son regresadas al sujeto, mientras que el plasma, el cual contiene las cadenas ligeras kappa libres, es descartado y reemplazado con otros fluidos. Los medicamentos para evitar la coagulación de la sangre (por ejemplo un anticoagulante) pueden darse a través de la vena durante el procedimiento. Los anticuerpos similares a 121 son también aplicables a la purga de células plasmáticas malignas desde muestras biológicas, ya sea muestras de tejido o de fluido . La purga de células de mieloma de una muestra de fluido es parte de la invención y puede practicarse poniendo en contacto un fluido biológico sospechoso de comprender células plasmáticas malignas con un anticuerpo similar a K121 que sea capaz de enlazar selectivamente a y causar la apoptosis de las células malignas. Este método puede ser utilizado para purgar células indeseables ex vivo al extraer una muestra biológica de un paciente, eliminar las células malignas por epoptosis inducida por anticuerpos similares a K121 y luego regresar la muestra purgada al paciente. Se apreciará que métodos de tratar mieloma múltiple que involucran el uso del anticuerpo similar a 121 pueden efectuarse aislados o como un adjunto a regímenes de radioterapia o de quimioterapia conocidos. Por ejemplo, el tratamiento con el anticuerpo similar a K121 pude conducirse conjuntamente con o después de tratamiento con fármacos tales como melfalan o ciclofosfamida. A fin de que la presente invención pueda ser comprendida más claramente se describirán las formas preferidas con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes . Ejemplo 1: Evaluación de Citotoxicidad Se evaluó la actividad citotóxica de m¾b K121 usando el Equipo para Ensayo de Citotoxicidad No-Radioactiva Cyto Tox96 (Promega) el cual mide la lactato deshidrogenasa (LDH) liberada en el sobrenadante, por células durante la lisis celular. Células HMy2 (positivas a KMA) y K562 (negativas a MA) fueron cosechadas desde cultivos madre y fueron resuspendidas a 1 x 106 células/mi en 2 x RPMI suplementado con FBS al 5 %. Se añadieron alícuotas de 3 x 104 células a pocilios individuales de una placa de cultivo de tejido de 96 pocilios. Se añadió K121 mAb, a concentraciones de 2.5, 5.0, 7.5, 10, 12.5 µ?, en un volumen de 30 µ? a los pocilio apropiados por duplicado. Después de 20 horas de incubación a 37 °C en una atmósfera de C02 al 5 %, el sobrenadante de cada pocilio fue colectado y centrifugado a 2000 rpm por un minuto. El sobrendante clarificado (50 µ?) se transfirió a otra placa de ensayo para microtítulo de 96 pocilios y se mezcló con un volumen igual de substrato. La placa se incubó a temperatura ambiente en la obscuridad por 30 minutos y la reacción se detuvo con 50 µ? de solución para detención. Se midieron los valores de absorbancia en un lector de placas para microelisa Organon Teknika (Turnhout, Bélgica) a 492 nm. El medio de cultivo (1 x RPMI suplementado con FBS al 2.5 %) solo, fue incluido como un control de respaldo porque el FBS y el rojo de fenol en el medio pueden dar como resultado niveles de LDH aparentemente elevados. En el transcurso del tiempo de estudio, las células H y2 fueron incubadas con 12.5 µ? de 121 mAb y el sobrendante del cultivo fue cosechado a 4, 8, 12, 16 y 20 horas después de la adición del anticuerpo.

Ejemplo 2. Ensayos de Apoptosis Se evaluó el mecanismo de la actividad citotóxica de K121 sobre células H y2 de dos maneras, el enlace con Anexina V y el ensayo TUNEL . Se llevó a cabo un ensayo de LDH en paralelo durante ambos ensayos para confirmar que tuvo lugar la muerte celular. Enlace con Anexina V. La Anexina V es una proteina que enlaza específicamente a fosfotidil-serina en la membrana celular. El enlace tiene lugar una vez que la membrana ha comenzado a romperse y desconectar al fosfolípido del medio extracelular. Como un resultado este método mide la etapa precoz de la apoptosis. El método de enlace con Anexina V se describe brevemente. Células HMy2 fueron cosechadas desde cultivos madre y resuspendidas en lxRPMI suplementado con FBS al 5 % a una densidad de 1 x 106 células/ml. Se añadieron alícuotas de 500 microlitros de células en una placa de cultivo de tejido de 6 pocilios. Se añadió un volumen igual de 121 mAb a una concentración de 10.7 uM a las células y la bandeja de ensayo se incubó a 37 °C en una atmósfera de C02 al 5 %. Para el control negativo, se añadió un volumen igual de PBS. Se cosecharon las células por centrifugación desde los pocilios a t = 16 y 20 h. Una alícuota del sobrenadante se ensayó para LDH extracelular y el compactado celular se lavó en regulador de enlace (10 mM de HEPES, 140 mM de NaCl y 2.5 mM de CaCl2-2H20) . Las células lavadas fueron resuspendidas en 100 µ? de regulador de enlace y se incubaron con 2 µ? de Anexina V-FITC (Bender MedSystems, Vienna, Austria) por 15 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron 400 µ? adicionales de regulador de enlace y se contaron las células teñidas con 1 µ? del mg/1 de ioduro de propidio (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI) sobre hielo por 15 min. Se analizaron las células por citometria de flujo usando un FACScan (BD) . Ensayo TUNEL . En las etapas finales de la apoptosis, el DNA microsómico sufrió un patrón de fragmentación característico. El ensayo TUNEL se efectúa sobre una enzima transferasa terminal para marcar los extremos 3' del DNA fragmentado. Por consiguiente, este ensayo es una medida de las etapas finales de la apoptosis. Abreviando, pocilios por duplicado que contenían células HMy2 en la presencia de K121/ o PBS fueron dispuestas e incubadas como se describió en la sección previa. Se efectuaron ensayos marcadores del extremo del corte de dUTP mediados por TdT, usando el Sistema de Detección de Apoptosis con Fluoresceína (Promega, Madison, WI) . Se prepararon las células y se efectuó el ensayo como describieron los fabricantes. Resumiendo, las células se lavaron en PBS y se fijaron con formaldehido al 10 % seguido por alcohol al 70 %. Se marcó enzimáticamente el DNA intracelular con fluoresceina-12-dUTP en el extremo 3' y se analizó en el FACScan. Ejemplo 3. Modelo de Tumor en Ratón SCID A fin de evaluar los efectos anti-tumorales potenciales de 121 in vivo, ratones SCID de 6 semanas de edad fueron inyectados intraperitonealmente (i.p.) en el día 0 con células HMy2. Subsecuentemente a la inyección de células tumorales, se administró a los ratones ya sea anticuerpo K121 o PBS por inyección i.p. Cuando las células H y2 secretaron la IgG humana/- se monitoreó el progreso del crecimiento celular por cuantificación de la IgG humana en el suero de ratones receptores usando un inmunoensayo especifico para la IgG humana. Ejemplo 4: Cuantificación de la IgG Humana Se usó un ensayo inmunoabsorbente unido a la enzima (ELISA) para cuantificar los niveles de IgG humana en el suero de ratones SCID. Se incubó la proteina A en PBS-Az (50 µ?/pocillo de 100 µg/ml) en una placa ELISA de 96 pocilios a 37 °C por 1 hora. Se lavaron los pocilios 3 veces con PBS-Az y se bloquearon los sitios de enlace no-especifico con BSA al 3 % en PBS-Az a 37 °C por 1 hora. Los pocilios fueron lavados dos veces en PBS-Az e incubados a 37 °C por 1 hora con 50 µ?/pocillo de suero de ratón diluido 2.5 veces con BSA al 1 % en PBS-Az . Siguiendo con 3 lavados con PBS-Az, los anticuerpos enlazados fueron detectados con 50 µ?/pocillo de conjugado AP de cadena ligera kappa anti-humano de cabra (dilución 1:1000 en BSA al 1 %-PBS-Az) a 37 °C por 1 hora. Los complejos antigeno-anticuerpo enlazados fueron visualizados por medio de la adición del substrato fosfato de p-nitrofenilo (pNPP) (50 µ?/pocillo a 1 mg/ml) en regulador de substrato para ELISA (glicina 0.1 M, 1 itiM de MgCl2, 1 mM de ZnCl2, pH 10.4) siguiendo dos lavados en PBS-Az, uno en agua de MilliQ y uno en regulador de substrato para ELISA. Se desarrolló el color a temperatura ambiente por 10 minutos y la reacción se detuvo por medio de la adición de NaOH 3M (50 µ?/pocillo) . Se determinó la absorbancia a 405 nm usando un lector de placa para microelisa Organon Teknika (Turnhout, Bélgica) . Para la cuantificación de la IgG humana, se incluyó una curva estándar en el ensayo . Se reemplazó el suero de ratón con diluciones en serie de IgGl kappa humana purificada (6 µg/ml- 6 ng/ml; Serotec Ltd, Oxford, Inglaterra) . Ejemplo 5: La Incubación con K121 dio como Resultado la Muerte de Células de Apoyo Antigénico La incubación de células HMy2 y K562 con K121 reveló que el mAb induce la muerte de células objetivo especificas tanto de manera dependiente del tiempo como de la concentración (Figura 1) . La actividad citotóxica de K121 fue detectada primero aproximadamente 12 horas después de la adición al cultivo de células objetivo y el nivel de muerte celular aumentó durante las 8 horas siguientes. El efecto citotóxico de K121 fue máximo a la concentración final de 3.6 µ? con citotoxicidad significativa que es detectada a 2.5 µ?. La actividad citotóxica de K121 observada tuvo lugar en ausencia de células efectoras accesorias añadidas o componentes de suero (es decir complemento) . Se observaron células HMy2 incubadas en la presencia o en ausencia de 121 a 200 x de ampliación bajo un microscopio de rayos invertidos. Se llevaron a cabo estudios concurrentes de células HMy2 incubadas con una inmunotoxina (Dunn, RD, y colaboradores, (1996) Immunotechnology 2: 229). Las células incubadas con K12lMab mostraron signos de contracción celular y de "formación de ampollas" en la membrana. En contraste el scFv-mel ocasionó aglomeración celular y lisis de membrana . El análisis citométrico de flujo de células HMy2 tratadas con 121 mostró un incremento en las propiedades de dispersión de la luz de 90 ° en comparación con células no tratadas (Figura 2) lo cual refleja un incremento en la granularidad interna y en la condensación de cromatina en las células tratadas con anticuerpo. Hubo una disminución concomitante en las propiedades de dispersión de los rayos iniciales de células tratadas con anticuerpo lo cual indica de contracción celular. La combinación del incremento de granularidad , condensación de cromatina y contracción celular exhibidas por las células tratadas con K121 sugiere que estas células se secaron como un resultado de la inducción de apoptosis. Ejemplo 6: La Interacción de K121 con Células Objetivo Induce la Apoptosis. Se usaron dos sistemas de ensayo independientes para determinar el mecanismo por el cual K121 mata a células de apoyo antigénico. Se evaluaron las etapas tempranas de apoptosis por medio del enlace de Anexina V a células tratadas con K121. La tinción por inmunofluorescencia con Anexina-FITC reveló números crecientes de células HMy2 teñidas positivamente, 16 y 20 horas después de iniciar el tratamiento con K121 en comparación con células tratadas no teñidas (Figura 3a) . El porcentaje creciente de células teñidas con Anexina V se correlacionó con la proporción de incremento de células muertas como se determinó por tinción con ioduro de propidio (Figura 3a) e infiltración de LDH (Figura 3b) . El análisis de fragmentación de DNA, una etapa tardía del proceso de apoptosis, se evaluó usando el método TUNEL. La flecha en la fluorescencia observada en células HMy2 incubadas con K121 fue significativo después de 16 y 20 horas de incubación en comparación con las células no tratadas (Figura 4a) y es típica del patrón de fragmentación de DNA asociado con la apoptosxs. De nuevo, la medición de la apoptosis se correlaciona con números crecientes de células muertes como se determinó por infiltración de LDH (Figura 4b) . Cuando se toman juntos estos datos muestran que células tratadas con K121 son sometidas a apoptosis. Ejemplo 7; K121 evita el Crecimiento de células tumorales HMy2 en Ratones A ratones SCID que recibieron 107 células HMy2 en el día cero se les administró ya sea tres dosis consecutivas de K121 (1.25. mg cada una) (n=6) o bien scFv-mel (0.5 mg cada una) (n=7) en los días 1, 2 y 3 o PBS (1.25 mg cada una) (n=6) como un control del tratamiento. Se tomaron muestras de sangre antes de administración de las células tumorales a intervalos semanales post-inyección de células tumorales, y se monitoreó el crecimiento de células HMy2 por la apariencia de IgG humana en el suero de los animales. En los ratones control tratados con PBS, se detectó la IgG humana en el suero de 6/6 animales (Figura 5a) con el tiempo para la detección inicial de IgG humana que varía desde 3 semanas hasta 8 semanas post-inyección de células tumorales. De manera similar, los ratones tratados con una inmunotoxina que comprende el péptido citolítico melitin unido a un fragmento de 121 scFv (scFv-mel) mostraron niveles elevados de IgG humana elevados 3 semanas después de inyección de las células (Figura 5b) . En contraste, no se detectó IgG humana en el suero de animales tratados con K121 durante el mismo periodo (Figura 5c) . En general, los animales tratados con PBS y scFv-mel exhibieron espon amiento abdominal, aletargaron y, después de 9 semanas, 5/6 ratones murieron. Los ratones tratados con 121 no presentaron estos síntomas y todos vivieron en la semana 9, tiempo en el cual uno de los ratones de este grupo, junto con el animal sobreviviente del grupo de control, se sacrificaron y se abrieron. Los animales tratados con K121 no tuvieron anormalidades de órganos grandes . El animal sin tratar, no obstante, tuvo una gran masa tumoral en la cavidad abdominal, un bazo agrandado y derramamiento de los pulmones. Las muestras de tejido de ambos animales fueron examinadas de la manera usual por técnicas inmunoquimicas por infiltración de HMy2. Estos estudios demostraron claramente que K121 solo es capaz de evitar el crecimiento de células tumorales linfoblastoides humanas en un modelo de ratón (SCID) inmunodeficiente . En un segundo ejemplo, ratones SCID que fueron inyectados con 107 células HMy2 en el día cero recibieron niveles de dosificación variables de K121 en los días 1, 2 y 3 como sigue: Grupo 1; control con PBS (n=6) Grupo 2; 1.0 mg de K121 por dosis. Dosificación total de anticuerpo, 3.0 mg (n=6) Grupo 3: 0.5 mg de K121 por dosis. Dosificación total de anticuerpo, 1.5 mg (n=6) Grupo 4; 0.1 mg de K121 por dosis. Dosificación total de anticuerpo, 0.3 mg (n=6) Grupo 5; 0.05 mg de 121 por dosis. Dosificación total de anticuerpo, 0.15 mg (n=6) Se monitoreó el progreso del tumor por cuantificación de IgG humana en el suero de los ratones. Todos los ratones sin tratar desarrollaron niveles elevados de IgG humana en el dia 28 (Figura 6) y la mayoría (4/5) de este grupo murieron en el día 42 (Figura 7) .El examen post-mórtem reveló bazos agrandados y tumores macroscópicos en hígado y riñon. Los ratones de apoyo tumoral tratados con K121 mostraron ya sea principio desplazado del progreso del tumor o ausencia completa de crecimiento tumoral como se indica por los niveles de IgG humana en suero (Figuras 6 y 8) y el análisis post-mórtem desde la terminación del experimento en el día 56. A través de los 4 grupos de tratamiento 7 de 24 ratones mostraron niveles no detectables de IgG humana en su suero en el día 42 (Figura 8) . Seis de estos ratones no mostraron signos importantes de crecimiento tumoral en el examen post-mórtem en el dia 56. Todos los ratones sin tratar murieron o fueron eutanasiados por razones éticas en el dia 49, mientras que 13/24 ratones en los grupos de tratamiento con anticuerpo sobrevivieron hasta el dia 56 (Figura 7) . Resumiendo, los ratones de apoyo de tumor respondieron al tratamiento con K121 de una manera dependiente de la dosis. Fue obvia la ausencia completa de crecimiento de tumor en el dia 42 en 30 % de los ratones, con este efecto que fue más pronunciado en los ratones que recibieron una dosificación total de 1.5 mg de K121 (Figura 8) . El crecimiento del tumor fue rápido y agresivo en los ratones sin tratar, con 100 % de mortalidad en el dia 49 (Figura 7) . En este punto de tiempo, los grupos de tratamiento combinado mostraron mortalidad de menos de 10 Ejemplo 8: Síntesis de un anticuerpo similar a K121 por reunión de oligonucleótidos usando PCR Un ejemplo de la estrategia usada para crear un anticuerpo monoclonal por extensión de oligonucleótidos sintéticos usando la PCR se ha descrito previamente en la literatura (Sato y colaboradores (1994) Molecular Immunology 31 (5) : 371) . A fin de crear un anticuerpo monoclonal similar a 121 desde la secuencia de DNA publicada (como se muestra en la Figura 9a) el gen VH puede dividirse en seis oligonucleótidos sobrepuestos VH1-VH6 (Figura 9b) . Igualmente el gen de 121 VL puede ser dividido en seis oligonucleótidos sobrepuestos VL1-VL6 (Figura 9c) . Tres de los oligonucleótidos VH tendrían la secuencia de DNA del extremo 5' al extremo 3' en el sentido de la hebra (Figura 9d, VH1, 3 y 5) y tres tendrían la secuencia de DNA del extremo 3' al extremo 5' en sentido contrario de la hebra (Figura 9d, VH2, 4 y 6) . De manera similar, tres de los oligonucleótidos VL tendrían la secuencia del extremo 5' Al extremo 3' en el sentido de la hebra (Figura 9e, VL1, 3 y 5) y tres tendrían la secuencia de DNA del extremo 3' al extremo 5' en sentido contrario de la hebra (Figura 9e, VL2, 4 y 6) . La primera PCR usando una Taq polimerasa conjuntaría los tres grupos de oligonucleótidos para producir tres fragmentos de DNA de doble hebra (Figura 9f) .Los tres productos de la primera amplificación serían entonces extraídos por medio de gel y los fragmentos de DNA aislados se pueden usar como molde para reunir la secuencia del gen completa usando una Taq polimerasa. En el montaje final del gen VH un cebador de PCR complementario en la región 5' del gen (VHF) y un cebador de 3' a 5' complementa io en la región 3' del gen (VHR) podría usarse para crear la secuencia del gen K121 VH completa. De manera similar los cebadores de PCR en las regiones 5' (VLF) y 3' (VLR) del gen VL se podrían usar para la amplificación del gen de K121 VL completo. Los productos genéticos finales deberán ser secuenciados para confirmar la presencia y la fidelidad de los genes V completos . Los genes VL y VH de K121 deberán entonces ser ligados en un vector de expresión de mamífero que contenga los genes de la región constante de Ig de murina relevantes; Cyl para la cadena pesada y CK para la cadena ligera. Una línea celular de mamífero podría entonces ser transfectada con los vectores resultantes y la expresión del K121 funcional deberá ser monitoreado por inmunoensayos como se describe para el anticuerpo quimérico. Ejemplo 9: Construcción del anticuerpo quimérico, CK121 Aislamiento de los genes VL y VH de K121 Los genes de región variable de cadena pesada (K121 VH) y de cadena ligera (K121 VL) del anticuerpo monoclonal, K121, fueron aislados por PCR. El molde para amplificación del gen VH y VL fue la construcción del gen scFv-mel. Cebadores de PCR (Figura 10 ) usados para amplificación se denominaron para introducir sitios de restricción compatibles para clonación direccional en los vectores de expresión de mamíferos pCMV-?? y pCMV-KR (Mahler y colaboradores, (1997) Immunotechnology 3:31) . Los productos de la amplificación por PCR fueron separados por electroforesis sobre gel de agarosa al 1 % y las bandas de DNA del tamaño esperado fueron extraídas usando un equipo de extracción de gel QIAquick (Qiagen, Alemania) . Los fragmentos del gen aislado fueron entonces ligados en el vector pGEM-T y fueron transformados en células bacterianas competentes, JM109 (Promega, EUA) . Después de incubación toda la noche, por medio del cribado por PCR usando cebadores específicos del vector (MI3) se identificaron las colonias que contenían un inserto . Los clones positivos de VH y VL fueron seleccionados y se preparó el DNA plásmido usando el equipo Wizard Mini-prep (Promega, EUA) . Dos clones que representan VH y VL fueron secuenciados en un secuenciador de DNA automático ABI en el Sydney University Prince Alfred Macromolecular Analysis Centre (SUPAMAC) . Las secuencias de DNA de las VH y VL de K121 fueron idénticas a las mostradas en la Figura 9a con los sitios de encima de restricción adicionales y los nucleótidos incorporados en los cebadores de PCR (Figura 10) . Ligadura de las VH y VL de K121 en el vector de expresión Los genes de las VH y VL de K121 fueron restringidos de los clones pGEM-T usando las enzimas de restricción Bam HI y Apa LI. Los insertos de "VH y VL restringidos fueron purificados por extracción sobre gel. Una secuencia lider para las cadenas pesada y ligera fue aislada por restricción de pCMV-?? con Apa LI y Hind III seguido por extracción sobre gel del inserto de la secuencia lider. La secuencia lider digerida por Hind III y Apa LI fue ligada simultáneamente con los genes VL y H de K121 en Hind III y Bam HI pCMV-?? y pCMV-KR restringidos respectivamente. Después de transformación en células JM109 competentes, las colonias que contenían insertos fueron cribadas por PCR usando los cebadores específicos del gen VL y VH. El DNA plásmido se preparó desde clones positivos y los insertos fueron confirmados por digestión de enzima de restricción con Bam HI y Hind III. En esta etapa los plásmidos pCMV-yl-cVH y pCMV-KR-cVL podrían ser secuenciados usando cebadores específicos del vector para confirmar la secuencia de K121 VH y de VL DNA correcta. Transfección de plásmidos de expresión en células CHO Se desarrollaron células CHO-K1 (Ovario de Hámster Chino) en medio DNEM/F12 con FBS al 10 % (Sigma Aldrich, EUA) y se incubaron a 37 °C en una atmósfera de C02 al 5 %. Se incubaron un total de 5 µg de las preparaciones de plásmido, pCMV-yl -cVH y pCMV-KR-cVL, con 4 x 106 células CHO en 200 µ? de medio RPMI (Sigma Aldrich, EUA) suplementado con PBS al 10 % y 2 ?p? de L-glutamina Trace Biosciences, NSW) . La mezcla célula/DNA se colocó en una cubeta y se llevó a cabo la electroporación en un Gene Pulser (BioRad, EUA) con los siguientes ajustes; resistencia de 100 ohms, 0.3 voltios, capacitancia Ext de 960 \xFO y constante de tiempo de 33- 38 mseg. Después se transfirieron las células a 10 mi de medio DMEM/F12 con FBS al 10 % se desarrollaron por 48 horas a 37 °C en una atmósfera de CO2 al 5 %. La selección de las células transfectadas^ se efectuó usando el medio de selección neo que contenia 400 g/ml de antibiótico G418 (GENETICIN, Sigma Aldrich, EUA) en DMEM/F12. Después de 3 días el sobrenadante del cultivo se reemplazó y las células se expandieron a 150 cm2 en matraces para cultivo de tejido. Después de 7 dias en medio de selección se evaluó la expresión de cK121 por medio de dos ELISAs separadas . Ejemplo 10: Evaluación del Anticuerpo Quimérico Expresado, cK121 El procedimiento para la ELISA se llevó a cabo como se detalla en el Ejemplo 4 con algunos cambios en reactivos específicos, Abreviando, para determinar la expresión de un anticuerpo quimérico que contenia la región Fe humana, se efectuó una ELISA por recubrimiento de los pocilios de una placa de 96 pocilios con IgG, IgA e IgM anti-humana de cabra (50 µ?/pocillo de 10 g/ml) .

Medio acondicionado de las células CHO transfectadas se incubó entonces en los pocilios, seguido por un conjugado ??- (especifico de Fe) anti-humano de cabra y se desarrolló el color con el substrato pNPP (Sigma Aldrich, EUA) . Se preparó una curva estándar para la primera ELISA, usando diluciones en serie de IgGl kappa humana (6 µg/ml~6ng/ml) . En paralelo, se sometió el sobrenadante clarificado de las células CHO transfectadas a diluciones en serie y las muestras fueron analizadas (Figura lia) . Se obtuvo una curva de dilución similar a la curva estándar para el cK-121 que expresa en las células CHO. La concentración estimada de c 121 en el medio acondicionado de células CHO fue de 6 ng/µ?. Se llevó a cabo una segunda ELISA para demostrar el enlace del anticuerpo expresado al antigeno reconocido específicamente por K121. Los pocilios de la segunda placa de ensayo fueron recubiertos con cadenas ligeras kappa libres humanas (50 µ?/pocillo de 100 µ?/ mi de solución) . En la segunda ELISA, el sobrenadante de células CHO clarificado mostró enlace a las cadenas ligeras kappa libres humanas en un rango de diluciones de muestra (Figura 11b) . Por comparación, no se observó enlace para medio acondicionado con células CHO sin transfectar. Ejemplo 11: Purificación de cK121 Se llevó a cabo la purificación de c 121 por precipitación con sulfato de amonio de proteínas en el medio acondicionado con células CHO (1.4 litros). Después de diálisis extensiva de la proteína resolbilzzada en PBS-Az la muestra se sometió a purificación por afinidad sobre Agarosa Proteína A (Sigma Aldrich, EUA) . Las muestras eluidas se dializaron en PBS a pH 7.4, se concentraron en un agitador celular Amicon (Millipore, EUA) y se esterilizaron por filtración (Minisart RC15f 0.2 µp?, Sartorius, AG) . La concentración de cK121, se estimó usando un coeficiente de extinción de 14 a una absorbancia de 280 nm. Ejemplo 12: Citotoxicidad de CK121 sobre células linfoblastoides HMy2 y K562 Se determinó la citotoxicidad de cK121 sobre células linfoblastoides HMy2 y 562 usando el ensayo de infiltración de LDH citoplásmico como se describió en el Ejemplo 1. El cK121 purificado exhibió actividad citotóxica significativa contra células HMy2 positivas al antígeno y no reaccionó con la línea celular de apoyo no-antigénico, K562 (Figura 12) . Estos resultados indican que cK121 retuvo la capacidad para inducir la muerte celular en la línea celular objetivo. Para confirmar que el mecanismo de muerte celular es la apoptosis se efectuó el ensayo descrito en el Ejemplo 2 sobre células HMy2 usando cK121 purificado.

Ejemplo 13; Selección de células secretoras de cK121 estable La producción en gran escala de cK121 requiere la selección de una linea celular que sea capaz de la secreción del anticuerpo cK121 estable en ausencia del antibiótico de selección, G418. Por consiguiente, los clones de los pocilios que produjeron resultados positivos en las ELISAs (a 405 nm > 0.2) fueron seleccionados y clonados por medio de dilución limitante. Subsecuentemente, células CHO de clones únicos que fueron capaces de producir cK121 secretado fueron desarrollados en DMEM-F12 sin el antibiótico. Las células que continuaron secretando cK121 en la ausencia de antibiótico fueron seleccionadas como lineas celulares que producen cK121 estable. Se evaluó medio acondicionado desde lineas celulares CHO cK121 por inmunoensayo como se describe en el Ejemplo 9 y la cantidad de anticuerpo producido se determinó desde la curva estándar de IgGl kappa humana. La figura 13 mostró 5 clones positivos que fueron seleccionados para expresión futura (clones 1-5) . Se incluyó un clon negativo como una muestra control. A fin de llevar a cabo estudios funcionales adicionales sobre los clones CK121 producidos en el Ejemplo 13 puede conducirse un experimento de expresión en gran escala. El cK121 puede ser purificado y pueden efectuarse experimentos de estudio con animales in vivo. Ejemplo 14: Estrategia para humanizar el gen de región de cadena ligera variable K121 (VL) usando una región de estructura VL humana de tipo VK Una presentación esquemática del procedimiento de PCR usado para humanizar el 121 VL se expone en la Figura 14a. La región de estructura VL (hVL se identificó previamente y se aisló del cDNA usando una estrategia con base en la PCR previamente descrita (Asvadi, PhD Thesrs, UTS, 1998) . El DNA plásmido de un solo clon que contenia el gen de hVL fue secuenciado y se comparó con la secuencia de DNA de K121 VL en la figura 14b. La secuencia de DNA mostrada en negrillas codifica a las regiones determinantes complementarias (CDRs) de K121. Los oligonucleótidos usados para incorporar la secuencia de DNA para las CDR1, CDR2 y CDR3 de K121 en la región estructural de hVL se muestran en la Figura 14c. La región estructural que contiene las CDR2 de 'K121 pueden distinguirse de hVL por digestión de los genes con la enzima de restricción Agel y se muestra el sitio de restricción en la VLC del cebador de PCR. Amplificación por PCR Como se muestra en la Figura 14a el molde para la amplificación por PCR fue el gen de hVL y las reacciones en la primera PCR se llevaron a cabo usando pares de cebadores VLA + VLE, VLB + VLF, VLC + VLG y VLD + VLB.. La amplificación de los cuatro fragmentos se llevó a cabo usando el equipo TITANIUM Taq PCR (Clontech, CA) . Los productos de cada reacción se visualizaron por electroforesis sobre gel de agarosa con bromuro de etidio y se aislaron por extracción del gel (Promega, MA) . Se llevó a cabo una segunda PCR para conjuntar los cuatro fragmentos amplificados. El producto amplificado resultante fue de aproximadamente 380 pb. La banda de DNA fue extraída del gel y se ligó en el vector pGEM-T de conformidad con el protocolo recomendado por el fabricante (Promega, MA) . Una alícuota de la mezcla de ligado se transformó en células competentes térmicamente ÜM109 y se plaquearon las muestras sobre placas de amp-LB. Después se incubó toda la noche a 37 °C, se picaron las colonias solas y se desarrollaron toda la noche en medio SOC de conformidad con el protocolo (Promega, MA) . Se aisló el DNA plásmido usando un sistema de purificación de DNA izard Plus Miniprep. Diez clones fueron sometidos a digestión con las enzimas de restricción Agel y Bam Hl de acuerdo con el procedimiento de digestión recomendado (Promega, MA) . Los productos de digestión se visualizaron sobre un gel de agarosa al 1 % que contenía bromuro de etidio. Un solo clon que produjo un fragmento de DNA de aproximadamente el tamaño correcto podría ser secuenciado para confirmar que el inserto contenia el gen de VL modificado. El gen de VL de 121 humanizado podría entonces ser ligado el vector de expresión de mamífero pCMV-KR como se describe en el Ejemplo 9. Ejemplo 15: Humanización del gen de región variable de K121 de la cadena pesada (VH) usando un gen de estructura VH3 humana. El gen de región variable de la cadena pesada humano, hVH, se aisló y se clonó usando una estrategia de PCR como se describe en el Ejemplo 14. ün plásmido pGEM-T que contenía el gen de hVH se usó como molde para el procedimiento de Mutagénesís en Sitio Dirigido QuickChange (Figura 15a) . Los cebadores usados para incorporar las tres CDRs de la VH de 121 en la estructura de hVH se exponen en la Figura 15b. Después de cada vuelta de mutagénesis en el plásmido podría ser secuenciado para confirmar que la secuencia de DNA es correcta. El gen del K121 de la VH podría entonces ser ligado en el vector de expresión de mamífero pCMV-?? como se describe en el Ejemplo 9. Discusión Los experimentos detallados en la presente demuestran que el anticuerpo monoclonal de murina K121 induce la muerte celular en una línea celular linfoblastoide humana, HMy2, en la ausencia de cualquier célula efectora accesoria o proteínas complemento de suero añadidas. Se mostró previamente que las células HMy2 expresan a un antígeno, KMA, el cual es reconocido por K121. Cuando las células HMy2 se incubaron con K121 solo a una concentración de 3.6 µ?, tuvo lugar muerte celular significativa como se indica por la liberación de LDH intracelular (Figura 1) . Se demostró la especificidad de la actividad citotóxica de 121 por el hecho de que el tratamiento de la línea celular negativa a KMA, K562 no dio como resultado muerte celular significativa (Figura 1) . La observación microscópica de células HMy2 incubadas en la presencia o ausencia de K121 indicó que la muerte celular tiene lugar en la presencia de K121. En la presencia de células K121 las células parecieron contraerse y hubo evidencia de "formación de ampollas" en la membrana. Estos efectos son típicos de células que sufren un proceso de apoptosis o de muerte celular programado limitado (Kerr, JFR y colaboradores, (1972) Br J Cáncer 26: 239) . En contraste, la incubación de células HMy2 con la inmnbtoxina scFv-mel dio como resultado la aglomeración y la lisis de membrana. Claramente, la apariencia de células incubadas con K121 fue diferente a las incubadas con la inmunotoxína scFv-mel. Estas observaciones preliminares sugieren que el mecanismo que da como resultado la muerte celular usando K121 es diferente al efecto citotóxico de scFv-mel. El análisis de las propiedades de dispersión de la luz de las células HMy2 que sufren la muerte celular inducida por K121 reveló cambios en la estructura interna y en el tamaño de las células que fueron consistentes con la apoptosis (Figura 2) . Esta interpretación del mecanismo por el cual K121 mata a células objetivo se confirmó por los dos ensayos separados para apoptosis que mide etapas tempranas y tardías del proceso respectivamente (Figuras 3 y 4) . Así, K121, en ausencia de cualquier factor exógeno, induce apoptosis en células de apoyo a KMA xn vltro. Además, 121 evita el crecimiento de células tumorales in vivo. La administración de K121 a ratones que han recibido una dosis de células HMy2 para inducir tumor evita el crecimiento de tumor que se mide por la presencia de IgG humana en el suero de los ratones receptores (figura 5) . Se observó el crecimiento de tumor en todos los ratones en el grupo tratado con PBS como se indica por los niveles de IgG humana en suero y morfología grande de la disección. La apoptosis es un evento biológico importante involucrado en el desarrollo embrionario y, en particular, el desarrollo y funcionamiento del sistema inmune (Mastrangelo AJ. y Betenbaugh M. (1998) TIBTECH. 16:88). En contraste a la muerte celular que se origina de la necrosis, la apoptosis tiene lugar en la ausencia de cualquier patología y no evoca una respuesta inflamatoria ( err, JFR y colaboradores, (1972) Br J Cáncer 26:239) . Esta es una consideración importante con respecto al uso de agentes terapéuticos potenciales que pueden activar la apoptosis en células objetivo. Todas las publicaciones mencionadas anteriormente se incorporan íntegramente a la presente como referencia. Cualquier discusión de documentos, actos, materiales, dispositivos, artículos o los similares que se han incluido en la presente especificación es solamente con el propósito de proporcionar un contexto para la presente invención. Lo que no se toma como una admisión de que cualquiera de estos temas forma parte del arte previo base o que fuera del conocimiento general común en el campo relevante a la presente invención que existió en Australia antes de la fecha de prioridad de cada reivindicación de esta solicitud. Los expertos en la materia apreciarán que pueden hacerse numerosas variaciones y/o modificaciones a la invención como se muestra en las modalidades específicas sin alejarse del espíritu o del alcance de la invención que se describe ampliamente. Las modalidades de la presente son, por consiguiente, para ser consideradas en todos aspectos como ilustrativas y no restrictivas .

LISTADO DE SECUENCIAS PacMab Pty Ltd <120> Método para tratar mieloma múltiple <130> 500564 <150> AU PR 6179 <151> 2001-07-06 <160> 50 <170> Patentln versión 3.1 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn lie Lys Asp Thr ?n ?fs 0 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45 Gly Arg lie Asp Pro Ala Asn Gly Asn T r Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Ala lie lie Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Val Tyr Hls Asp Tyr Asp Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ala Ser 115 <210> 2 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 2 caggtgcagc tgcagcagtc aggggcggag cttgrtgaagc caggggcctc agtcaagttg 60 tcctgtacag cttctggctt caacattaaa gacacctata tgcactgggt gaagcagagg 120 cctgaacagg gcctggagtg gattggaagg 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Claims (13)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES : 1. Un método para el tratamiento del mieloma múltiple del tipo kappa en un sujeto, en donde el método comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de un anticuerpo similar a K121, caracterizado porque el anticuerpo similar a K121 no está conjugado a una toxina o agente citolitico.
2. 2. Un método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende adicionalmente la etapa de tratar al sujeto para reducir los niveles de las cadenas ligeras kappa libres presentes en el fluido del sujeto antes de la administración del anticuerpo similar a 121.
3. 3. Un método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque los niveles de cadenas ligeras kappa libres son reducidos por plasmaféresis .
4. 4. Un método para el trasplante autólogo de células hematopoyéticas en un sujeto que sufre de mieloma múltiple de tipo kappa, el método comprende: (i) remover la población de células progenitoras hematopoyéticas del sujeto, (ii) tratar la población celular con un anticuerpo similar a K121, y (iii) trasplantar la población celular tratada de la etapa (II) al sujeto, caracterizado porque el anticuerpo similar a K121 no está conjugado a una toxina o a un agente citolítico.
5. 5. Un método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el método comprende adicionalmente la infusión intravenosa de un anticuerpo similar a K121 en el suj eto .
6. 6. Un método de conformidad con la reivindicación 4 o la reivindicación 5, caracterizado porque el método de trasplante autólogo se efectúa en el sujeto durante o después de terapia citoreductiva.
7. 7. Un método para matar células de mieloma de tipo kappa en una población mezclada de células, el método comprende poner en contacto la población mezclada de células con un anticuerpo similar a 121, caracterizado porque el anticuerpo similar a K121 no está conjugado a una toxina o agente citolítico.
8. 8. Un método para inducir apoptosis en células de apoyo a ??, el método comprende exponer las células a un anticuerpo similar a K121, caracterizado porque el anticuerpo similar a K121 no está conjugado a una toxina o a un agente citolítico.
9. 9. Un método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque las células de apoyo a KMñ. son células de mieloma del tipo kappa.
10. 10. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el anticuerpo similar a K121 es un anticuerpo monoclonal .
11. 11. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el anticuerpo similar a K121 comprende los bucles de CDR (CDR1, CDR2 y CDR3) del anticuerpo K121 como se muestra en la Figura 9a.
12. 12. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el anticuerpo similar a K121 comprende los genes de VL y VH del anticuerpo K121 como se muestra en la Figura 9a.
13. 13. Un método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque el anticuerpo similar a K121 es un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado.