JP5844790B2 - 癌を治療するための、o−アセチル化型のgd2ガングリオシドに特異的なモノクローナル抗体を含む医薬組成物 - Google Patents
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Description
acid)である。ガラクトース分子には2分子のシアル酸が結合している。末端シアル酸にO−アセチル部分を加えてO−アセチル化GD2が生成されるように修飾することができる。GD2に特異的でありかつそのO−アセチル化型も認識する抗体を用いることで、特定の種類のがん、特に神経外胚葉起源の腫瘍が、GD2およびそのO−アセチル化型であるO−アセチル化GD2を様々な比率で発現していることを示すことができるであろう。
治療または診断のためのインビボでのモノクローナル抗体の使用のためには、後者が特定の特異性、親和性、および非毒性という要件を満たす必要がある。しかし、モノクローナルおよびキメラ抗GD2抗体について行われた臨床研究から、キメラ化またはヒト化で解決されない大きな悪性副作用である抗GD2抗体による神経毒性が立証された。実際、抗GD2抗体を投与された神経外胚葉起源の癌患者は、抗体を投与されている間痛みに苦しみ、これらの患者の一部は末梢神経系の神経障害を発症した。この作用は、末梢系の神経線維細胞の表面にGD2ガングリオシドが存在することで説明される。
to Disialoganglisosides (GD2, GD3) and their O-Acetylated Derivative;Cerato et
al., Hybridoma Volume 16, Number 4, 1997, 307-316
)に記載されている。
GD2ガングリオシドを認識せず、O−アセチル化GD2ガングリオシドに特異的なモノクローナル抗体は、末梢神経線維を認識せず、そのため神経毒性を生じないという利点を有し得る。したがって、このような抗体は抗GD2モノクローナル抗体と比較して、GD2ガングリオシドをO−アセチル化型で発現する神経外胚葉起源のヒトの癌等の特定の種類の癌の免疫ターゲッティングに大きな利点を有し得る。
or less)精製された抗体(血清または血漿、全免疫グロブリン)を含む画分を抽出することが含まれてなる。この抗体をクロマトグラフィー技術または免疫吸着によってさらに精製してもよい。第2の方法では、抗体を合成することができる脾臓またはリンパ節細胞等の細胞を採取し、特に、当業者に公知のプロセスに従うウイルス形質転換または体細胞ハイブリダイゼーションにより、それらを不死化することが含まれてなる。不死化細胞の中から、クローニングによって、目的の抗体を産生する細胞のスクリーニングが可能になり、細胞培養することで、これらの抗体を培養液上清から単離し、それらを大量精製することが可能になる。最後に第3の方法には、抗体を合成することができる細胞、特に動物(免疫化されているか否かに関わらず)またはヒトから採取した脾臓、リンパ節、または末梢リンパ球細胞からRNAを単離し、cDNAライブラリーを編集し、そこから当業者に公知の方法に基づくスクリーニング、特にファージディスプレイ発現系としても知られるバクテリオファージ表面でのライブラリー発現によって、目的の抗体の配列を選択することが含まれている。VH領域とVL領域を連結する「単鎖」断片(「単鎖Fv」、scFv)の形態またはVH−CH1ペプチドセグメント(後者は定常領域の第1ドメインに相当)に関連する軽鎖からなるF(ab)断片の形態で繊維状ファージの表面で発現される(「ファージディスプレイ」)、ヒトのVH領域とVL領域を組み合わせたライブラリーの構築。
modified antibody)」という用語で呼ぶ。
and Hunter試薬のような放射標識された反応性シントンを介して結合されるか、またはヨウ素同位元素もしくは211−アスタチンの場合であればスタニル化された活性エステルを介して結合されるか、あるいは放射性金属の場合であればキレート剤を用いて結合される。後者の場合、キレート剤の中から、どれが生体液中で金属と共に高い安定性を有する錯体を提供するか選ぶことは、当業者の知識範囲に含まれる。従って、DTPAを111−インジウムと有利に使用することができるが、90−イットリウムでの標識にはDOTAが好ましいであろう。
to Disialoganglisosides (GD2, GD3) and their O-Actylated Derivatives‘, Cerato et al., Hybridoma
Volume 16, n°4, 1997, 307-316’に記載されている)の任意の使用を提供し、前記抗体は毒性の化学物質、生物学的薬剤、または放射性薬剤に結合しており、ここで前記分子はO−アセチル化GD2ガングリオシドを発現する腫瘍細胞を死滅させることを意図したものである。
60C3ハイブリドーマ細胞から全RNAを抽出する。260nmでの吸光度を測定して全RNA濃度を決定する。
Biosciences社(サンノゼ、カリフォルニア州、米国)から入手したSMART(商標)RACE
cDNA Amplificationキットをメーカーの取扱説明書に従って用いて行った。逆転写に使用する全RNA量は1μgである。反応産物を、メーカーから入手可能なトリシンEDTA緩衝液100μL中に希釈した。体積2.5μLの希釈産物を遺伝子増幅に使用した。使用した60C3
VLのcDNAに特異的なアンチセンスプローブは、5’−60C3
VL:5’−TTT CAG CTC
CAG CTT GGT
CCC AGC −3’(配列番号9)である。増幅は、反応混合液をPERKIN−ELMER(PE)DNA
thermal Cycler 480(PERKIN ELMER
WELLESLEY社、マサチューセッツ州、米国)で以下の条件でインキュベートすることで行った:(94℃5秒、72℃3分)を5サイクル;その後(94℃5秒、次いで70℃10秒、その後72℃3分)を5サイクル、および(94℃5秒、次いで69℃10秒、および72℃3分)を25サイクル。RACE−PCRの反応産物を、泳動用緩衝液にトリスEDTA(pH8;40mMのトリス塩基(SIGMA
CHEMICALS Co製))、25mMのEDTA(INERCHIM社、Montlucon、フランス)、20mMの酢酸(イタリア、RodanoのCARLO
ERBA REAGENTI SPA社、Rodano、MI、イタリア)を用い、1%アガロースゲル電気泳動(Q.BIOGENE社、モーガンアーバイン、カリフォルニア州、米国)で分析する。次いで、QIAquick(登録商標)Gel
Extractionキット(QIAGEN社)をメーカーの取扱説明書に従って用いて、予想される分子量を有する産物を精製する。60C3
L−VL領域をコードするcDNA配列を確認するための得られた精製産物の核酸配列の決定は、GENOME
EXPRESS社(Meylan、フランス)が行った。60C3抗体の軽鎖可変領域と組み合わされたシグナルペプチドに相当する配列をこうして決定し、60C3
L−VLのcDNAを発現ベクターにクローニングするためのプローブを設計した。
L−VLcDNAを増幅させた。反応混合液は以下の通りである:0.5μgのオリゴd(T)18(NEW
ENGLAND BIOLABS社、ビバリー、マサチューセッツ州、米国)、1μgのRNA、および0.5mMのdNTP(PROMEGA社、マディソン、ウィスコンシン州、米国)、これらを滅菌水で12μLにする(qsp12μL)。この混合液を65℃(乾燥制御された浴)で5分間、その後4℃(氷水)で2分間インキュベートしてRNAを変性させる。この反応混合液に、4μLの5×First−strand
Buffer溶液(INVITROGEN LIFE BIOTECHNOLOGIES社)、10mMのDTT(INVITROGEN
LIFE BIOTECHNOLOGIES社)、160UのRnasine(PROMEGA社)、および800Uの逆転写酵素(INVITROGEN
LIFE BIOTECHNOLOGIES社)を加える。得られた混合液を37℃で1時間、その後反応を停止させるために70℃で15分間インキュベートする。以下の合成オリゴヌクレオチドを用いたPCR遺伝子増幅によって、60C3
L−VLcDNAのコピーを得る;5’−BamHI 60C3 L−VL:5’−AG
GGA TCC AAA
GAC AAA ATG
GAT−3’(センスプローブ、配列番号10)および3’−XhoI
60C3 L−VL:5’−TT CAG
CTC GAG CTT
GGT CCC AGC
ACC−3’(アンチセンスプローブ、配列番号11)。
LIFE TECHNOLOGIES社)、1μLのPCR緩衝液(INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES社)、1μLのcDNA(マトリックス)、1.5mMのMgCl2(INVITROGEN
LIFE TECHNOLOGIES社)、500μMのプローブ3’−Xhol 60C3 L−VLおよびプローブ5’−BamHI
60C3。
THERMAL CYCLER)を用いて以下の条件で行った:94℃5分;次いで94℃30秒、55℃45秒、および72℃1分を35サイクル。
Extractionキット(QIAGEN社)をメーカーの取扱説明書に従って用いて、60C3
L−VLcDNAを精製する。
L−VL
L−VLcDNAの消化、並びに消化したベクターの脱リン酸化
10×緩衝剤(5μL)、BSA 100×(0.5μL)、ベクターpcDNA3(登録商標)または60C3 L−VLcDNA(1(μg)、制限酵素BamHI(10U)、制限酵素XhoI(10U)。制限酵素、反応緩衝液、およびBSA溶液の供給元はNew
England Biolabs Inc.社であった。反応を37℃の水浴中で3時間続ける。消化したベクターおよびインサートを、QIAquick(登録商標)Gel
Extractionキット(QIAGEN社)をメーカーの取扱説明書に従って用いて精製する。次いでベクターをCIP(NEW
ENGLAND BIOLABS Inc.社)を用いて37℃で1時間脱リン酸化する。反応混合液の組成は以下の通りである:10×NEB3緩衝剤(5μL)、ベクター(1μg)、CIP(1μL)。この反応は、ベクターのセルフライゲーションの割合を減少させることでライゲーション収率を高める。実際、遊離端部の5’端および3’端のリン酸部分を消化して抑制すると、ベクターの自発的な閉鎖が妨げられる。
L−VLcDNAが挿入される。この反応はさらに16℃の水浴中で16時間、以下の反応媒体中で行われる:ライゲーション緩衝液
5×(4μL)(NEW ENGLAND BIOLABS Inc.社)、200ngの消化および脱リン酸化されたベクター、T4リガーゼ(400U)(NEW
ENGLAND BIOLABS Inc.社)、(1kbのインサートについて)170ngの精製cDNA。インサート:ベクターのモル比は3:1である。
blue(STRATAGENE社)の形質転換
CHEMICALS CO社)および12.5μg/mLのテトラサイクリン(SIGMA CHEMICALS CO社)を含む2XTY寒天培地の入ったペトリ皿に蒔く。37℃で一晩インキュベートした後、抵抗性のコロニーが発達する。
L−VLの存在の確認
LIFE TECHNOLOGIES社)、10μLのPCR緩衝液(INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES社)、1μLのcDNA(マトリックス)、1.5mMのMgCl2(INVITROGEN
LIFE TECHNOLOGIES社)、500μMのプローブ3’−XhoI 60C3 L−VLおよびプローブ5’−BamHI
60C3。
L−VLの製造
CHEMICALS CO社)および12.5μg/mLのテトラサイクリン(SIGMA CHEMICALS CO社)を含む5mLのLB選択液体培地に加え、37℃で16時間インキュベートする。次いで、QIAprepスピンミニプレップキット(QIAGEN社)をメーカーの取扱説明書に従って用いて、この細菌希釈液からプラスミドDNAのミニプレップを行う。
P3Non2ハイブリドーマ細胞から全RNAを抽出する。260nmでの吸光度を測定することで、全RNA濃度を決定する。
ENGLAND BIOLABS Inc.社、ビバリー、マサチューセッツ州、米国)、1μgのRNA、0.5mMのdNTP(PROMEGA社、マディソン、ウィスコンシン州、米国)、これらを滅菌水で12μLにした(qsp12μL)。この混合液を65℃(乾燥制御された浴)で5分間、次いで4℃(氷水)で2分間インキュベートし、RNAを変性させる。次いでこの反応混合液に、4μLの5×First−strand
Buffer溶液(INVITROGEN LIFE BIOTECHNOLOGIES社)、10mMのDTT(INVITROGEN
LIFE BIOTECHNOLOGIES社)、160UのRnasine(PROMEGA社)、および800Uの逆転写酵素(Invitrogen
Life Biotechnologies社)を加える。得られた混合液を37℃で1時間、次いで反応を停止させるために70℃で15分間インキュベートする。60C3
L−VLcDNAのコピーを、以下の合成オリゴヌクレオチドを用いたPCR遺伝子増幅で得る;5’−XhoI
hu−Cκ:5’−AG CTC GAG
CTG AAA CGA
ACT GTG GCT
GCA C−3’(センスプローブ、配列番号12)および3’−XbaI hu−Cκ:5’−CTT CTA
GAT TTA ACA
CTC TCC CCT
GTT GA−3’(アンチセンスプローブ、配列番号13)。
LIFE TECHNOLOGIES社)、1μLのPCR緩衝液(INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES社)、1μLのcDNA(マトリックス)、1.5mMのMgCl2(INVITROGEN
LIFE TECHNOLOGIES社)、500μMのプローブ3’−XbaI hu−Cκおよびプローブ5’−XhoI hu−Cκ。
THERMAL CYCLER)を用いて以下の条件で行った:94℃5分;次いで94℃30秒、55℃45秒、および72℃1分を35サイクル。
Gel Extractionキット(QIAGEN社)をメーカーの取扱説明書に従って用いて、hu−CκcDNAを精製する。
L−VLおよびhu−CκcDNAの消化、および消化したベクターの脱リン酸化
10×緩衝剤(5μL)、BSA 100×(0.5μL)、ベクターpcDNA3(登録商標)60C3 L−VLまたはhu−CκcDNA(1μg)、制限酵素XhoI(10U)、制限酵素XbaI(10U)。制限酵素、反応緩衝液、およびBSA溶液の供給元はNEW
ENGLAND BIOLABS Inc.社であった。反応を37℃の水浴中で3時間続けた。消化したベクターおよびインサートを、QIAquick(登録商標)Gel
Extractionキット(QIAGEN社)をメーカーの取扱説明書に従って用いて精製する。次いで、ベクターをCIP(NEW
ENGLAND BIOLABS Inc.社)を用いて37℃で1時間脱リン酸化する。反応媒体の組成は以下の通りである:NEB310×緩衝剤(5μL)、ベクター(1μg)、CIP(1μL)。
L−VL中に、消化されたcDNAであるhu−CκcDNAが挿入される。この反応はさらに16℃の水浴中で16時間、以下の反応媒体中で行われる:ライゲーション緩衝液
5×(4μL)(NEW ENGLAND BIOLABS Inc.社)、200ngの消化および脱リン酸化されたベクター、T4リガーゼ(400U)(NEW
ENGLAND BIOLABS Inc.社)、(1kbのインサートについて)170ngの精製cDNA。インサート:ベクターのモル比は3:1である。ライゲーション反応産物を、コンピテント細菌大腸菌XL1
blue(STRATAGENE社)の形質転換に使用する。
L−VL中にインサートhu−Cκの存在の確認
LIFE TECHNOLOGIES社)、10μLのPCR緩衝液(INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES社)、1μLのcDNA(マトリックス)、1.5mMのMgCl2(INVITROGEN
LIFE TECHNOLOGIES社)、500μMのプローブ3’−XbaI hu−Cκおよびプローブ5’−XhoI hu−Cκ。増幅は、MJ−リサーチ社製のPTC200サーマルサイクラーを用いて以下の条件で行った:94℃5分;次いで94℃30秒、55℃45秒、および72℃1分を35サイクル。増幅されたPCR産物のサイズを1%アガロースゲル電気泳動分析で確認する。適切に形質転換されたクローンでのみ、予想されるサイズのPCR産物が得られる。
CHEMICALS CO社)および12.5μg/mLのテトラサイクリン(SIGMA CHEMICALS CO社)を含む5mLのLB選択液体培地に加え、37℃で16時間インキュベートする。次いで、QlAprepスピンミニプレップキット(QIAGEN社)をメーカーの取扱説明書に従って用いて、この細菌希釈液からプラスミドDNAのミニプレップを行う。
100×(0.5μL)、ベクター(1μg)、制限酵素BamHI(10U)、制限酵素XhoI(10U)。制限酵素、反応緩衝液、およびBSA溶液の供給元はNEW
ENGLAND BIOLABS Inc.社であった。反応を37℃の水浴中で3時間続ける。消化したベクターを、QIAquick(登録商標)Gel
Extractionキット(QIAGEN社)をメーカーの取扱説明書に従って用いて精製する。次いでベクターをCIP(NEW
ENGLAND BIOLABS Inc.社)を用いて37℃で1時間脱リン酸化する。反応媒体の組成は以下の通りである:NEB3緩衝剤10×(5μL)、ベクター(1μg)、CIP(1μL)。
8B6ハイブリドーマ細胞から全RNAを抽出する。260nmでの吸光度を測定して全RNA濃度を決定する。
BIOSCIENCES社(サンノゼ、カリフォルニア州、米国)から入手したSMART(商標)RACE
cDNA Amplificationキットをメーカーの取扱説明書に従って用いて行った。逆転写に使用する全RNA量は1μgである。反応産物を、メーカーから入手可能なトリシンEDTA緩衝液100μL中に希釈した。体積2.5μLの希釈産物を遺伝子増幅に使用した。使用した8B6
VL cDNAに特異的なアンチセンスプローブは以下の通りである:κ型マウス抗体軽鎖の定常部muCκをコードするcDNAとハイブリダイズする3’−muCκ:5’−gtt
cat act cgt
cct tgg tca
acg tga ggg−3’。増幅は、反応混合液をPERKIN−ELMER(PE)DNA
thermal Cycler 480(PERKIN ELMER
WELLESLEY社、マサチューセッツ州、米国)で以下の条件でインキュベートすることで行った:(94℃5秒、72℃3分)を5サイクル、次いで(94℃5秒、次いで70℃10秒、その後72℃3分)を5サイクル、(94℃5秒、69℃10秒、72℃3分)を25サイクル。RACE−PCR反応産物を、泳動用緩衝液にトリスEDTA(pH8;40mMのトリス塩基(SIGMA
CHEMICALS Co社))、25mMのEDTA(INERCHIM社、Montlucon、フランス)、20mMの酢酸(CARLO
ERBA REAGENTI SPA社、Rodano、MI、イタリア)を用い、1%アガロースゲル電気泳動(Q.BIOGENE社、モーガンアーバイン、カリフォルニア州、米国)で分析する。次いで、QIAquickGel
Extractionキット(QIAGEN社)をメーカーの取扱説明書に従って用いて、予想される分子量を有する産物を精製する。8B6
V−VL領域をコードするcDNA配列を確認するための得られた精製産物の核酸配列の決定は、GENOME
EXPRESS社(Meylan、フランス)が行った。8B6抗体の軽鎖可変領域と組み合わされたシグナルペプチドに相当する配列をこうして決定し、8B6
L−VLcDNAを発現ベクターにクローニングするためのプローブを設計した。
L−VLcDNAを増幅させた。反応混合液は以下の通りである:0.5μgのオリゴd(T)18(NEW
ENGLAND BIOLABS社、ビバリー、マサチューセッツ州、米国)、1μgのRNA、および0.5mMのdNTP(PROMEGA社、マディソン、ウィスコンシン州、米国)、これらを滅菌水で12μLにする(qsp12μL)。この混合液を65℃(乾燥制御された浴)で5分間、その後4℃(氷水)で2分間インキュベートしてRNAを変性させる。次いでこの反応混合液に、4μLの5×First−strand
Buffer溶液(INVITROGEN LIFE BIOTECHNOLOGIES社)、10mMのDTT(INVITROGEN
LIFE BIOTECHNOLOGIES社)、160UのRnasine(PROMEGA社)、および800Uの逆転写酵素(INVITROGEN
LIFE BIOTECHNOLOGIES社)を加える。得られた混合液を37℃で1時間、その後反応を停止させるために70℃で15分間インキュベートする。以下の合成オリゴヌクレオチドを用いたPCR遺伝子増幅によって、8B6
L−VLcDNAのコピーを得る;5’− BamHI 8B6
L−VL:5’− AAG GGA
TCC GCC ACC
ATG AAG TTG
CCT GTT −3’(センスプローブ、配列番号14)および3’−XhoI
8B6 L−VL:5’−CCG TTT
TAT CTC GAG
CTT GGT CCC−3’(アンチセンスプローブ、配列番号15)。
LIFE TECHNOLOGIES社)、10μLのPCR緩衝液(INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES社)、1μLのcDNA(マトリックス)、1.5mMのMgC12(INVITROGEN
LIFE TECHNOLOGIES社)、500μMのプローブ3’−XhoI 8B6 L−VLおよびプローブ5’−BamHI
8B6 L−VL。
THERMAL CYCLER)を用いて以下の条件で行った:94℃5分;次いで94℃30秒、55℃45秒、および72℃1分を35サイクル。
Extractionキット(QIAGEN社)をメーカーの取扱説明書に従って用いて、8B6
L−VLcDNAを精製する。
10×緩衝剤(5μL)、BSA 100×(0.5μL)、8B6 L−VLcDNA(1μg)、制限酵素BamHI(10U)、制限酵素XhoI(10U)。制限酵素、反応緩衝液、およびBSA溶液の供給元はNEW
ENGLAND BIOLABS Inc.社であった。反応を37℃の水浴中で3時間続ける。消化したインサートを、QIAquick(登録商標)Gel
Extractionキット(QIAGEN社)をメーカーの取扱説明書に従って用いて精製する。
L−VLcDNAが挿入される。この反応をさらに16℃の水浴中で16時間、以下の反応媒体中で行う:ライゲーション緩衝液
5×(4μL)(NEW ENGLAND BIOLABS Inc.社)、200ngの消化および脱リン酸化されたベクターpcDNA3(登録商標)hu−Cκ、T4リガーゼ(400U)(NEW
ENGLAND BIOLABS Inc.社)、(1kbのインサートについて)170ngの精製8B6 L−VLcDNA。インサート:ベクターのモル比は3:1である。ライゲーション反応産物を、コンピテント細菌大腸菌XL1
blue(STRATAGENE社)の形質転換に使用する。
L−VLの存在の確認
LIFE TECHNOLOGIES社)、10μLのPCR緩衝液(Invitrogen Life Technologies社)、1μLのcDNA(マトリックス)、1.5mMのMgCl2(INVITROGEN
LIFE TECHNOLOGIES社)、500μMのプローブ3’−XhoI 8B6 L−VLおよびプローブ5’−BamHI
8B6 L−VL。増幅は、MJ−リサーチ社製のPTC200サーマルサイクラーを用いて以下の条件で行った:94℃5分;次いで94℃30秒、55℃45秒、および72℃1分を35サイクル。増幅されたPCR産物のサイズを1%アガロースゲル電気泳動分析で確認する。適切に形質転換されたクローンでのみ、予想されるサイズのPCR産物が得られる。
Lの製造
CHEMICALS CO社)および12.5μg/mLのテトラサイクリン(SIGMA CHEMICALS CO社)を含む5mLのLB選択液体培地に加え、37℃で16時間インキュベートする。次いで、QIAprep(登録商標)スピンミニプレップキット(QIAGEN社)をメーカーの取扱説明書に従って用いて、この細菌希釈液からプラスミドDNAのミニプレップを行う。
BIOSCIENCES社(サンノゼ、カリフォルニア州、米国)から入手したSMART(商標)RACE
cDNA Amplificationキットをメーカーの取扱説明書に従って用いて行った。逆転写に使用する全RNA量は1μgである。反応産物を、メーカーから入手可能なトリシンEDTA緩衝液100μL中に希釈した。体積2.5μLの希釈産物を遺伝子増幅に使用した。使用した60C3VHのcDNAに特異的なアンチセンスプローブは、κ型マウス抗体軽鎖のmuC−κ定常部をコードするcDNAにハイブリダイズする3’−60C3
L−VH:5’−TGC AGA GAC
AGT GAC CAG
CAG AGT AGT
CCC−3’(アンチセンスプローブ、配列番号16)である。増幅は、反応混合液をPERKIN−ELMER(PE)DNA
thermal Cycler 480(PERKIN ELMER
WELLESLEY社、マサチューセッツ州、米国)で以下の条件でインキュベートすることで行った:(94℃5秒、72℃3分)を5サイクル、その後(94℃5秒、次いで70℃10秒、その後72℃3分)を5サイクル、および(94℃5秒、その後69℃10秒、72℃3分)を25サイクル。RACE−PCRの反応産物を、泳動用緩衝液にトリスEDTA(pH8;40mMのトリス塩基(SIGMA
CHEMICALS Co社))、25mMのEDTA(INERCHIM社、Montlucon、フランス)、20mMの酢酸(CARLO
ERBA REAGENTI SPA社、Rodano、MI、イタリア)を用い、1%アガロースゲル電気泳動(Q.BIOGENE社、モーガンアーバイン、カリフォルニア州、米国)で分析する。次いで、QIAquick(登録商標)Gel
Extractionキット(QIAGEN社)をメーカーの取扱説明書に従って用いて、予想される分子量を有する産物を精製する。60C3
L−VH領域をコードするcDNA配列を確認するための得られた精製産物の核酸配列の決定は、GENOME
EXPRESS社(Meylan、フランス)が行った。60C3抗体の軽鎖可変領域と組み合わされたシグナルペプチドに相当する配列をこうして決定し、60C3
L−VHのcDNAを発現ベクターにクローニングするためのプローブを設計した。
L−VHcDNAを増幅させた。反応混合液は以下の通りである:0.5μgのオリゴd(T)18(NEW
ENGLAND BIOLABS社、ビバリー、マサチューセッツ州、米国)、1μgのRNA、および0.5mMのdNTP(PROMEGA社、マディソン、ウィスコンシン州、米国)、これらを滅菌水で12μLにする(qsp12μL)。この混合液を65℃(乾燥制御された浴)で5分間、その後4℃(氷水)で2分間インキュベートしてRNAを変性させる。この反応混合液に、4μLの5×First−strand
Buffer溶液(INVITROGEN LIFE BIOTECHNOLOGIES社)、10mMのDTT(INVITROGEN
LIFE BIOTECHNOLOGIES社)、160UのRnasine(PROMEGA社)、および800Uの逆転写酵素(INVITROGEN
LIFE BIOTECHNOLOGIES社)を加える。得られた混合液を37℃で1時間、その後反応を停止させるために70℃で15分間インキュベートする。以下の合成オリゴヌクレオチドを用いたPCR遺伝子増幅によって、60C3
L−VHcDNAのコピーを得る;5’−BamHI 60C3 L−VH:5’−CAG
GAT CCG AAC
ACA CTG ACT
CTA ACC ATG
G−3’(センスプローブ、配列番号17)および3’−NheI
60C3 L−VH:5’−T GCT
AGC TGC AGA
GAC AGT GAC
CAG AGT−3’(アンチセンスプローブ、配列番号18)。
Life Technologies社)、10μLのPCR緩衝液(INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES社)、1μLのcDNA(マトリックス)、1.5mMのMgCl2(INVITROGEN
LIFE TECHNOLOGIES社)、500μMのプローブ3’−NheI 60C3 L−VHおよびプローブ5’−BamHI
60C3 L−VH。
THERMAL CYCLER)を用いて以下の条件で行った:94℃5分間;次いで94℃30秒、55℃45秒、および72℃1分を35サイクル。
Extractionキット(QIAGEN社)をメーカーの取扱説明書に従って用いて、60C3
L−VHcDNAを精製する。
II SK(+)60C3 L−VHの構築
ENGLAND BIOLABS Inc.社)でベクターを消化して平滑末端断面を作ることを含んでなる。得られた直鎖状プラスミドをdTTP存在下でTaqポリメラーゼで処理し、ベクターの3’末端にさらにチミジンを付加してセルフライゲーションを防ぐ。60C3
L−VHcDNAを得るために使用するTaqDNAポリメラーゼは、PCR産物の各3’末端に1つの末端アデニンを付加する5’−3’エキソヌクレアーゼ活性を有し、このような産物は上記のベクターに直接クローニングすることができる。このライゲーション反応はA/T相補性のおかげで、平滑末端によるライゲーション反応と比べて収率が非常に高い。このライゲーション反応産物を、コンピテント細菌大腸菌XL1
blue(STRATAGENE社)の形質転換に使用する。
II SK(+)中に60C3 L−VHインサートの存在の確認
LIFE TECHNOLOGIES社)、10μLのPCR緩衝液(INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES社)、1.5mMのMgCl2(INVITROGEN
LIFE TECHNOLOGIES社)、500μMのプローブ3’−NheI 60C3 L−VHおよびプローブ5’−BatnHI
60C3 L−VH。増幅は、MJ−リサーチ社製のPTC200サーマルサイクラーを用いて以下の条件で行った:94℃5分;次いで94℃30秒、55℃45秒、および72℃1分を35サイクル。増幅されたPCR産物のサイズを1%アガロースゲル電気泳動分析で確認する。適切に形質転換されたクローンでのみ、予想されるサイズのPCR産物が得られる。
II SK(+)60C3 L−VHの製造
CHEMICALS Co社)および12.5μg/mLのテトラサイクリン(SIGMA CHEMICALS Co社)を含む5mLのLB選択液体培地に加え、37℃で16時間インキュベートする。次いで、QIAprepスピンミニプレップキット(QIAGEN社)をメーカーの取扱説明書に従って用いて、この細菌希釈液からプラスミドDNAのミニプレップを行う。
II SK(+)60C3 L−VH中の60C3
L−VHインサートの方向の確認
II SK(+)60C3 L−VHを酵素消化することで確認する。実際、Tクローニング技術では、インサートが一方向であることは要求されないため、インサートはセンス方向またはアンチセンス方向に挿入され得る。60C3
L−VHインサートは、センス方向のときだけ、2つのBamHI制限酵素認識部位によってフランキング部位が得られる。したがって、酵素BamHIでの消化後、電気泳動分析によって、60C3
L−VHcDNAをセンス方向で有するクローンを識別および選択することができる。
LP1ハイブリドーマ細胞から全RNAを抽出する。260nmでの吸光度を測定して全RNA濃度を決定する。
マの全RNA抽出物から、hu−Cγ1cDNAを増幅させた。反応混合液は以下の通りである:0.5μgのオリゴd(T)18(NEW
ENGLAND BIOLABS社、ビバリー、マサチューセッツ州、米国)、1μgのRNA、および0.5mMのdNTP(PROMEGA社、マディソン、ウィスコンシン州、米国)、これらを滅菌水で12μLにする(qsp12μL)。この混合液を65℃(乾燥制御された浴)で5分間、その後4℃(氷水)で2分間インキュベートしてRNAを変性させる。次いでこの反応混合液に、4μLの5×First−strand
Buffer溶液(Invitrogen Life Biotechnologies社)、10mMのDTT(Invitrogen
Life Biotechnologies社)、160UのRnasine(PROMEGA社)、および800Uの逆転写酵素(Invitrogen
Life Biotechnologies社)を加える。得られた混合液を37℃で1時間、その後反応を停止させるために70℃で15分間インキュベートする。以下の合成オリゴヌクレオチドを用いたPCR遺伝子増幅によって、hu−Cγ1cDNAのコピーを得る;5’−Nhel
hu−Cγ1:5’−CA GCT AGC
ACC AAG GGC
CCA TCG GTC
TTC C−3’(センスプローブ、配列番号19)および3’−XbaI hu−Cγ1:5’−AGC CTC
TCC CTG TCT
CCG GGT AAA
TAA TCT AGA
CG−3’(アンチセンスプローブ、配列番号20)。
LIFE TECHNOLOGIES社)、10μLのPCR緩衝液(INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES社)、1μLのcDNA(マトリックス)、1.5mMのMgCl2(INVITROGEN
LIFE TECHNOLOGIES社)、500μMのプローブ3’−XbaI hu−Cγ1およびプローブ5’−NheI hu−Cγ1。
THERMAL CYCLER)を用いて以下の条件で行った:94℃5分;次いで、94℃30秒、55℃45秒、および72℃1分を35サイクル。
Extractionキット(QIAGEN社)をメーカーの取扱説明書に従って用いて、hu−Cγ1cDNAを精製する。
L−VHcDNAを有する組換えプラスミドの構築:pBluescript
II SK(+)KM60C3 H
II SK(+)60C3 L−VHおよびhu−Cγ1cDNAの消化、並びに消化したベクターの脱リン酸化
100×(0.5μL)、ベクターpBluescript II SK(+)60C3
L−VHまたはhu−Cγ1cDNA(1μg)、制限酵素NheI(10U)、制限酵素XbaI(10U)。制限酵素、反応緩衝液、およびBSA溶液の供給元はNEW
ENGLAND BIOLABS Inc.社であった。反応を37℃の水浴中で3時間続ける。消化したベクターおよびインサートを、QIAquick(登録商標)Gel
Extractionキット(QIAGEN社)をメーカーの取扱説明書に従って用いて精製する。次いでベクターをCIP(NEW
ENGLAND BIOLABS Inc.社)を用いて37℃で1時間脱リン酸化する。
II SK(+)60C3 L−VH中に、消化されたhu−Cγ1cDNAが挿入される。このライゲーション反応をさらに16℃の水浴中で16時間、以下の反応媒体中で行う:ライゲーション緩衝液
5×(4μL)(NEW ENGLAND BIOLABS Inc.社)、200ngの消化および脱リン酸化されたベクターpBluescript
II SK(+)60C3 L−VH、T4リガーゼ(400U)(NEW
ENGLAND BIOLABS Inc.社)、(1kbのインサートについて)170ngの精製hu−Cγ1cDNA。インサート:ベクターのモル比は3:1である。このライゲーション反応産物を、コンピテント細菌大腸菌XL1
blue(STRATAGENE社)の形質転換に使用する。
II SK(+)60C3 L−VH中のhu−Cγ1インサートの存在および方向の確認
LIFE TECHNOLOGIES社)、10μLのPCR緩衝液(INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES社)、1.5mMのMgCl2(INVITROGEN
LIFE TECHNOLOGIES社)、500μMのセンスプローブおよびアンチセンスプローブ。この増幅はMJ−リサーチ社製のPTC200サーマルサイクラーを用いて以下の条件で行った:94℃5分;次いで94℃30秒、55℃45秒、および72℃1分を35サイクル。使用したプローブは、5’−BamHI
60C3 L−VH:5’−CAG GAT
CCG AAC ACA
CTG ACT CTA
ACC ATG G−3’(センスプローブ、配列番号21)および3’−XbaI
hu−Cγ1:5’−AGC CTC TCC
CTG TCT CCG
GGT AAA TAA
TCT AGA CG−3’(アンチセンスプローブ、配列番号21)である。
II SK(+)KM60C3 Hの製造
CHEMICALS Co社)および12.5μg/mLのテトラサイクリン(SIGMA CHEMICALS Co社)を含む5mLのLB選択液体培地に加え、37℃で16時間インキュベートする。次いで、QIAprepスピンミニプレップキット(QIAGEN社)をメーカーの取扱説明書に従って用いて、この細菌希釈液からプラスミドDNAのミニプレップを行う。
8B6の発現ベクターの構築:pcDNA3/Hygro 8B6−H
II SK(+)hu−Cγ1の獲得
II SK(+)KM60C3 HからベクターpBluescript
II SK(+)hu−Cγ1を製造した。反応媒体の組成は以下の通りである:NEB2 10×緩衝剤(5μL)、BSA 100×(0.5μL)、ベクター(1μg)、制限酵素BamHI(10U)、制限酵素XbaI(10U)。制限酵素、反応緩衝液、およびBSA溶液の供給元はNEW
ENGLAND BIOLABS Inc.社であった。反応を37℃の水浴中で3時間続ける。次いで、このベクターを、QIAquick Gel Extractionキット(QIAGEN)をメーカーの取扱説明書に従って用いて精製する。次いで、ベクターをCIP(NEW
ENGLAND BIOLABS Inc.社)を用いて37℃で1時間脱リン酸化する。反応媒体の組成は以下の通りである:NEB3 10×緩衝剤(5μL)、ベクター(1μg)、CIP(1μL)。
8B6ハイブリドーマ細胞から全RNAを抽出する。260nmでの吸光度を測定して全RNA濃度を決定する。
BIOSCIENCES社(サンノゼ、カリフォルニア州、米国)から入手したSMART
RACE cDNA Amplificationキットをメーカーの取扱説明書に従って用いて行った。逆転写に使用した全RNA量は1μgであった。反応産物を、メーカーから入手可能なトリシンEDTA緩衝液100μL中に希釈した。体積2.5μLの希釈産物を遺伝子増幅に使用した。使用した8B6
L−VHcDNAに特異的なアンチセンスプローブは、γ3型マウス抗体の重鎖muC−γ3定常部をコードするcDNAにハイブリダイズする3’−muCγ3:5’−tGA
TCA ACT CAG
TCT TGC TGG
CTG GGT GGG−3’(配列番号23)。増幅は、反応混合液をPERKIN−ELMER(PE)DNA
thermal Cycler 480(米国マサチューセッツ州のPERKIN ELMER
WELLESLEY社、マサチューセッツ州、米国)で以下の条件でインキュベートすることで行った:(94℃5秒、72℃3分)を5サイクル;その後(94℃5秒、次いで70℃10秒、72℃3分)を5サイクル;その後(94℃5秒、次いで69℃10秒、その後72℃3分)を25サイクル。このRACE−PCRの反応産物を、泳動用緩衝液にトリスEDTA(pH8;40mMトリス塩基(SIGMA
CHEMICALS Co))、25mMのEDTA(INERCHIM社、Montlucon、フランス)、20mMの酢酸(CARLO
ERBA REAGENTI SPA社、Rodano、MI、イタリア)を用い、1%アガロースゲル電気泳動(Q.BIOGENE社、モーガンアーバイン、カリフォルニア州、米国)で分析する。次いで、QIAquick(登録商標)Gel
Extractionキット(QIAGEN社)をメーカーの取扱説明書に従って用いて、予想される分子量を有する産物を精製する。8B6
L−VH領域をコードするcDNA配列を確認するための得られた精製産物の核酸配列の決定は、GENOME
EXPRESS社(Meylan、フランス)が行った。8B6抗体の重鎖可変領域と組み合わされたシグナルペプチドに相当する配列をこうして決定し、8B6
L−VHのcDNAを発現ベクターpBluescript II SK(+)hu−Cγ1にクローニングするためのプローブを設計した。
L−VHcDNAを増幅させた。反応混合液は以下の通りである:1μLのオリゴd(T)18(NEW
ENGLAND BIOLABS Inc.社、ビバリー、マサチューセッツ州、米国)、1μgのRNA、および0.5mMのdNTP(PROMEGA社、マディソン、ウィスコンシン州、米国)、これらを滅菌水で12μLにする(qsp12μL)。この混合液を65℃(乾燥制御された浴)で5分間、その後4℃(氷水)で2分間インキュベートしてRNAを変性させる。次いでこの反応混合液に、4μLの5×First−strand
Buffer溶液(INVITROGEN LIFE BIOTECHNOLOGIES社)、10mMのDTT(INVITROGEN
LIFE BIOTECHNOLOGIES社)、160UのRnasine(PROMEGA社)、および800Uの逆転写酵素(INVITROGEN
LIFE BIOTECHNOLOGIES社)を加える。得られた混合液を37℃で1時間、その後反応を停止させるために70℃で15分間インキュベートする。以下の合成オリゴヌクレオチドを用いたPCR遺伝子増幅によって、8B6
L−VHcDNAのコピーを得る;5’−BamHI 8B6 L−VH:5’−CCG
TCG GAT CCG
GCC ACC ATG
AAG TTG TGG−3’(センスプローブ、配列番号24)および3’−NheI
8B6 L−VH:5’−CGG GGT
GCT AGC TGA
GGA GAC TGT−3’(アンチセンスプローブ、配列番号25)。
LIFE TECHNOLOGIES社)、10μLのPCR緩衝液(INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES社)、1μLのcDNA(マトリックス)、1.5mMのMgCl2(INVITROGEN
LIFE TECHNOLOGIES社)、500M.Mのプローブ3’−NheI 8B6 L−VHおよびプローブ5’−BamHI
8B6 L−VH。
THERMAL CYCLER)を用いて以下の条件で行った:94℃5分;次いで94℃30秒、55℃45秒、および72℃1分を35サイクル。
Extractionキット(QIAGEN社)をメーカーの取扱説明書に従って用いて、8B6
L−VHcDNAを精製する。
L−VHcDNAを消化する。反応媒体の組成は以下の通りである:NEB2
10×緩衝剤(5μL)、BSA 100×(0.5μL)、8B6 L−VHcDNA(1μg)、制限酵素BamHI(10U)、制限酵素NheI(10U)。制限酵素、反応緩衝液、およびBSA溶液の供給元はNEW
ENGLAND BIOLABS Inc.社であった。反応を37℃の水浴中で3時間続ける。消化したインサートを、QIAquick(登録商標)Gel
Extractionキット(QIAGEN社)をメーカーの取扱説明書に従って用いて精製する。
II SK(+)hu−Cγ1中に、消化された8B6 L−VHcDNAが挿入される。この反応をさらに16℃の水浴中で16時間、以下の反応媒体中で行う:ライゲーション緩衝液
5×(4μL)(NEW ENGLAND BIOLABS Inc.社)、200ngの消化および脱リン酸化されたベクターpBluescript
II SK(+)hu−Cγ1、T4リガーゼ(400U)(NEW ENGLAND BIOLABS
Inc.社)、(1kbのインサートについて)170ngの精製8B6
L−VHcDNA。インサート:ベクターのモル比は3:1である。このライゲーション反応産物を、コンピテント細菌大腸菌XL1
blue(STRATAGENE社)の形質転換に使用する。
II SK(+)KM8B6 Hを制限酵素BamIおよびXbaIで消化する。反応媒体の組成は以下の通りである:NEB2
10×緩衝剤(5μL)、BSA 100×(0.5μL)、ベクター(1μg)、制限酵素BamHI(10U)、制限酵素XbaI(10U)。制限酵素、反応緩衝液、およびBSA溶液の供給元はNEW
ENGLAND BIOLABS Inc.社であった。反応を37℃の水浴中で3時間続ける。遊離したインサートを、QIAquick(登録商標)Gel
Extractionキット(QIAGEN社)をメーカーの取扱説明書に従って用いて精製する。
10×緩衝剤(5μL)、BSA 100×(0.5μL)、ベクター(1μg)、制限酵素BamHI(10U)、制限酵素XbaI(10U)。制限酵素、反応緩衝液、およびBSA溶液の供給元はNEW
ENGLAND BIOLABS Inc.社であった。反応を37℃の水浴中で3時間続ける。消化したベクターおよびインサートを、QIAquick(登録商標)Gel
Extractionキット(QIAGEN社)をメーカーの取扱説明書に従って用いて精製する。次いでベクターをCIP(NEW
ENGLAND BIOLABS Inc.社)を用いて37℃で1時間脱リン酸化する。反応媒体の組成は以下の通りである:NEB3緩衝剤 10×(5μL)、ベクター(1μg)、CIP(1μL)。
5×(4μL)(NEW ENGLAND BIOLABS Inc.社)、200ngの消化および脱リン酸化されたベクターpcDNA3/Hygro、T4リガーゼ(400U)(NEW
ENGLAND BIOLABS Inc.社)、(1kbのインサートについて)170ngの人工修飾抗体重鎖をコードする精製cDNA。インサート:ベクターのモル比は3:1である。このライゲーション反応産物を、コンピテント細菌大腸菌XL1
blue(STRATAGENE社)の形質転換に使用する。
LIFE TECHNOLOGIES社)、10μLのPCR緩衝液(INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES社)、1.5mMのMgCl2(INVITROGEN
LIFE TECHNOLOGIES社)、500μMのプローブ3’およびプローブ5’。この増幅はMJ−リサーチ社のPTC200サーマルサイクラーを用いて以下の条件で行った:94℃5分;次いで94℃30秒、55℃45秒、および72℃1分を35サイクル。使用するプローブは、5’−BamHI
60C3 L−VH:5’−CCG TCG
GAT CCG GCC
ACC ATG AAG
TTG TGG−3’(センスプローブ、配列番号26)および3’−Nhel 8B6 L−VH:5’−CGG
GGT GCT AGC
TGA GGA GAC
TGT−3’(アンチセンスプローブ、配列番号27)である。
KM8B6 Lの製造
CHEMICALS Co社)および12.5μg/mLのテトラサイクリン(SIGMA CHEMICALS Co社)を含む5mLのLB選択液体培地に加え、37℃で16時間インキュベートする。次いで、QIAprep(登録商標)スピンミニプレップキット(QIAGEN社)をメーカーの取扱説明書に従って用いて、この細菌希釈液からプラスミドDNAのミニプレップを行う。
GMBH社、Hilden、ドイツ)をメーカーの取扱説明書に従って用いて、それぞれ人工修飾KM8B6抗体の軽鎖(図4)および重鎖(図9)をコードするプラスミドpDNA3(登録商標)KM8B6−LおよびpDNA3.1/Hygro(著作権)KM8B6−Hでコトランスフェクションした。形質転換した細胞は、ジェネテシン(登録商標)およびハイグロマイシンB(登録商標)(INVITROGEN
LIFE TECHNOLOGIES社、カールズバッド、カリフォルニア州、米国)に対する抵抗性で選択した。抵抗性クローンは、限定希釈法による従来のクローニング技術によって得た。次いでこれらを、ELISA免疫酵素アッセイを用いて、KM8B6抗体の発現および分泌に基づいて選択した。KM8B6抗体を3.8ng/mLで分泌する、安定なトランスフェクタントクローンを選択した。
et al、1997)の培養液上清から産生した。これらをマウスIgG3の不可逆的な同種親和性凝集現象(Chapman
et al、1990)を制限する本発明者らが開発した手法に基づいて、プロテインAクロマトグラフィー(GE HEALTHCARE AMERSHAM BIOSCIENCE
AB社、ウプサラ、スウェーデン)で精製した。カラムを、最初に0.1Mトリス塩酸(pH7.6)の緩衝剤で平衡化する。10%の平衡化緩衝剤を含む培養液上清サンプル2Lを、流速1mL/分でカラムに流す。次いで、カラムを10体積の平衡化緩衝剤で洗浄する。プロテインAに固定された材料を、酸性緩衝剤(0.1Mクエン酸塩、0.3MのNaCl、pH3)で溶出して画分ごとに回収し、これを回収用チューブに緩衝剤(1Mのトリス塩酸、pH7.6)を予め入れておくことで回収後すぐに中和する。回収画分の吸光度変化を測定することで、この精製の進行をモニターする。次いで、有用な画分をPBS溶液(0.3MのNaCl、pH7.4)に透析し、0.22μmのフィルターで濾過して滅菌する。280nmでの吸光度を測定してタンパク質の量を決定し、次いでマウスIgG3の同種親和性凝集現象を防ぐために、mAb濃度を1mL当たりのAcNが0.9mg以下の濃度になるように調整する。精製したAcMをそのまま4℃で使用まで保存する。
KM8B6−LおよびpcDNA3/Hygro KM8B6−Hで安定にコトランスフェクションされたクローンに由来するCHO細胞培養液上清から、人工修飾KM8B6抗体をプロテインAアフィニティークロマトグラフィーで精製した。
sous Bois、フランス)および5%のβ−メルカプトエタノール(PROMEGA社)を含む0.5Mのトリス塩酸(pH6.8)緩衝液にサンプルを取る。これを5分間煮沸し、次いでLaemmliの方法に基づくSDS−PAGE電気泳動で分析する。1.5mm厚のポリアクリルアミドゲル(VWR社)(ゲルの上部と下部のポリアクリルアミド濃度はそれぞれ4.5%および12%)のウェルに3μgのタンパク質を置く。室温、200Vで45分間電気泳動した後、ゲルを固定し、クーマシーブルーR250(SIGMA
CHEMICALS Co社)で染色する。分子量マーカーPrecision Plus Protein(登録商標)Standards(BIO−RAD社)の移動度から分子量を計算する。
IMMUNORESEARCH EUROPE LTD社、Cambrideshire、英国)で標識したヤギF(ab)2抗マウス免疫グロブリン抗体または抗ヒト免疫グロブリン抗体の存在下で再度30分間インキュベートする。再度PBSで3回洗浄した後、死細胞および細胞残骸を除去した後、フローサイトメーターFACScan(Beton−Dockinson社、マウンテンビュー、カリフォルニア州
を用いてSSC/FL1−Hウィンドウ内で、10000個の細胞を分析する。二次抗体のみで非特異的に標識されたコントロールを用いてベースを調節した後に1Logを超える蛍光を有する細胞を陽性と呼ぶ。
A/S社、ロスキレ、デンマーク)の各ウェルに、105個の細胞を含む体積50μLのPBS中を分注する。次いで、プレートを37℃のオーブンに一晩置いてPBSを蒸発させる。プレートは、直接使用することもできるし、使用まで室温で数ヶ月保存することもできる。分析のために、非特異的部位を飽和させる目的で、プレートを最初に室温で1時間、1%BSAを含む200μLのPBS緩衝液(pH7.4)と一緒に撹拌しながらインキュベートする。次いでプレートを、0.1%BSAを含むPBS緩衝液に希釈した抗体溶液100μLと一緒に撹拌しながら室温で2時間インキュベートする。200μLのPBS緩衝液でそれぞれ3回洗浄した後、全マウス免疫グロブリンまたは全ヒト免疫グロブリンのいずれかに特異的なビオチン化抗体に由来するF(ab’)2溶液(JACKSON
IMMUNORESEARCH EUROPE LTD社、Cambrideshire、英国)を0.1%PBS−BSAに1/2500に希釈した溶液100μLを、各ウェルに入れる。室温で撹拌しながら1時間インキュベートし、PBSで3回洗浄した後、ビオチン化ストレプトアビジンペルオキシダーゼ(JACKSON
IMMUNORESEARCH EUROPE LTD社、Cambrideshire、英国)の0.1%PBS−BSA溶液を1時間反応させ、その後洗浄して除去する。固定された複合体の発達は、100μLのABTS基質(ROCHE
DIAGNOSTICS GMBH社、マンハイム、ドイツ)を添加することで行った。分光光度計(MultisanEX;Thermo
Electron Corporation社、ウォルサム、マサチューセッツ州)を用いて異なる時間間隔でプレートのを405nmで読み取ることで、吸光度を決定する。
et al.(1991)に記載されている技術に従って、組織ガングリオシドを抽出する。抽出するサンプルを10体積のクロロホルム/メタノール(C:M)混合物(1:1、v/v)中で粉砕し、室温で一晩機械的に撹拌する。濾過後、残渣を2.5体積の(C:M)(1:1、v/v)に取り、さらに6時間撹拌する。次いで、混合物を濾過し、ロータリーエバポレータ上でこれら2つの濾液を減圧下で蒸発させる。次いで、乾燥残渣を酢酸塩の形態のDEAE−Sephadex
A−25(SIGMA CHEMICALS Co社)を2mL含むカラムに入れる。15mLの媒体Aで中性脂質を除去する。次いで、0.4Mの酢酸ナトリウム(SIGMA
CHEMICALS Co社)を含む15mLのメタノールでガングリオシドを溶出する。McLuerの方法(1990)に従ってC18疎水性ゲルのSep−Pakカラム(Waters
Co.社、ミルフォード、マサチューセッツ州)を用いて脱塩するために、得られた画分にpH7.4のPBSを30mL添加する。C18ゲルを、最初に2カラム体積のメタノールで、その後1:2(v/v)メタノール/PBS混合物で前処理(condition)する。次いで、脱塩する抽出物を流速1mL/分でカラムに流す。ガングリオシドの炭化水素鎖は、疎水性結合を通してゲルと相互作用するが、塩およびその他の非疎水性分子は2カラム体積の蒸留水で除去される。次いで、1体積のメタノール、続けて1体積の2:1(v/v)クロロホルム/メタノール混合物で、スフィンゴ糖脂質を溶出する。このカラムから溶出されるガングリオシドは、好適な更なる1体積の2:1(v/v)C/M混合物に濃縮され、−20℃で保存される。
ALDRICH CHEMIE GMBH社、STENHEIM、ドイツ)を用いて行われる。
Gold+スライドガラス(VWR社)に回収する。切片を3分間風乾し、次いでアセトンで10分間固定し、再度風乾する。次いで、免疫組織化学的方法で分析するまで、切片を−20℃で保存する。組織サンプルの免疫染色は、以下の一次マウスmAbを用いて行った:
10B8(IgG3、κ)
mAb(IgG3、κ)
France社、Cergy Saint Christophe、フランス)
Envision+ SystemのPeroxydase HRPキット(DAKO社、Glostrup、デンマーク)をメーカーの取扱説明書に従って用いて行った。次いで、水性マウント媒体Aquadex(VWR社)と共に、スライドとカバーガラスの間にサンプルをマウントする。次いで、倍率100倍および400倍の光学顕微鏡を用いた光学顕微鏡分析によって標識を確認する。各サンプルにつきランダムに選択した3つの顕微鏡フィールドのデジタル顕微鏡写真を分析する。
%ADCC活性=(上清中の51Cr−自発的に遊離した51Cr)/(全51Cr−自発的に遊離した51Cr)
H、 Zhang S、
Cheung NK、 Ragupathi
G、 Livingston PO;Antibodies
against GD2 ganglioside
can eradicate syngenic
cancer micrometastases. Cancer
Res. 1998、 58:
2844−9)における8B6抗体の抗腫瘍活性を測定した。これらのEL4細胞はO−アセチル化GD2抗原も発現する。A1グレードの承認を受けた動物小屋で飼育した24頭のマウスに、12週齢の時点で、PBSに懸濁した20×104個のEL−4細胞を皮下注射で投与した。マウス12頭のバッチを2つ構成した。バッチAのマウスには、70μgのmAb
8B6を200μLのPBS緩衝液でi.v.投与し、これはEL4細胞の注射後1日目から21日目まで3日間隔で行った。バッチBのマウスには、同じ手順で200μLのPBS溶液だけを投与した。次いで、腫瘍の体積を2日間隔で測定した。腫瘍体積は以下の式を用いて評価した:体積(mm3)=長さ(mm)×幅2(mm)×0.5(Zeng
G、Li DD、Gao L、Birkle
S、Bieberich E、Tokuda A、Yu RK;Alteration
of ganglioside composition
by stable transfection
with antisense vectors
against GD3−synthase gene expression.
Biochemistry 1999 38:
8762−9)。体積>3000mm3を示したマウスを屠殺する。
mAbで処置したマウスは58%が生存している。40日後、処置したマウスの25%がまだ生存しており、50日後では、マウスの8%がまだ生存しており、明白な腫瘍を示さず、治癒したとみなされる。
Claims (8)
- O−アセチル化GD2ガングリオシドを認識し、かつ、GD2ガングリオシドを認識しない抗体を含み、
前記抗体は、配列番号2、配列番号3および配列番号4で表されるアミノ酸配列を含むH鎖可変領域の相補性決定領域を有し、かつ、配列番号6、配列番号7および配列番号8で表されるアミノ酸配列を含むL鎖可変領域の相補性決定領域を有する、
O−アセチル化GD2を発現する癌の治療のための医薬組成物。 - O−アセチル化型のGD2ガングリオシドのみを認識する前記抗体が、O−アセチル化GD2に対して107 mol/リットルを超える親和性を有し、GD2自体に対してはその10分の1より低い親和性を有するκ−IgGである、請求項1に記載の医薬組成物。
- O−アセチル化型のGD2ガングリオシドのみを認識する前記抗体が、モノクローナル抗体またはF(ab)もしくはscFvを含むその抗原結合性断片である、請求項1に記載の医薬組成物。
- O−アセチル化型のGD2ガングリオシドのみを認識する前記抗体が、キメラ抗体またはF(ab)もしくはscFvを含むその抗原結合性断片である、請求項1に記載の医薬組成物。
- O−アセチル化型のGD2ガングリオシドのみを認識する前記抗体が、ヒト化抗体またはF(ab)もしくはscFvを含むその抗原結合性断片である、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記抗体またはF(ab)もしくはscFvを含むその抗原結合性断片が、分子Xに結合しており、該分子Xが、毒性分子、薬剤、プロドラッグ、または特異性に関連しない二次抗体である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記毒性分子が、毒性の化学分子、生物学的分子、または放射性分子であり、前記分子が、O−アセチル化GD2ガングリオシドを発現する腫瘍細胞を死滅させることを意図したものである、請求項6に記載の医薬組成物。
- 前記抗体が、糖の付加でFc領域が変異しており、これによって免疫細胞および補体系分子の活性化を調節する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の医薬組成物。
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