KR102190322B1 - 암줄기세포 암에 대한 새로운 치료적 진단적 전략으로서 o-아세틸화된-gd2 갱글리오사이드 타겟화 - Google Patents

암줄기세포 암에 대한 새로운 치료적 진단적 전략으로서 o-아세틸화된-gd2 갱글리오사이드 타겟화 Download PDF

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Abstract

본 발명은 암줄기세포 (CSC) 암 치료용, O-아세틸화된-GD2 갱글리오사이드를 인식하는 항체에 관한 것이다.
본 발명은 상기 항체를 포함하는 CSC 암 치료용 약학적 조성물 및 상기 항체를 환자에 투여하는 단계를 포함하는 이를 필요로하는 환자의 CSC 암을 치료하는 방법을 추가적으로 고려한다.
본 발명은 또한 CSC 암을 진단하는 방법 및 CSC 암의 바이오마커로서 O-아세틸화된-GD2 갱글리오사이드의 용도에 관한 것이다.
끝으로, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 조성물을 이용한 치료에 대한 CSC 암에 걸린 개체의 반응을 예측하는 방법에 관한 것이다.

Description

암줄기세포 암에 대한 새로운 치료적 진단적 전략으로서 O-아세틸화된-GD2 갱글리오사이드 타겟화{TARGETING O-ACETYLATED GD2 GANGLIOSIDE AS A NEW THERAPEUTIC AND DIAGNOSTIC STRATEGY FOR CANCER STEM CELLS CANCER}
본 출원은 2014년 4월 29일에 출원된 유럽특허출원 번호 13002268.4호의 이익을 향유하며, 이들은 여기에 참고로 편입된다.
본 발명은 항체, 약학적 조성물, 암줄기세포((Cancer Stem Cells:CSC) 암의 진단 및/또는 치료 방법에 관한 것이다.
암줄기세포 (Cancer Stem Cells)
최근 십수년간의 의학 연구의 발전은 현존하는 암 치료 전략을 향상시켰다.
화학요법, 방사능치료, 호르몬요법 및 수술을 포함하는 종래 치료 전략의 채택 및 지속적인 연구와 평행하게, 통상적으로 "타겟화된 항-암 치료"라 불리우는 새로운 암 메니지먼트 접근이 등장하였고, 효율을 보여주었고 의학계에서의 관심을 불러 일으켰다. 이러한 타겟화된 치료법은, trastuzumab (anti-Her2Neu), rituximab (anti-CD20) 또는 bevacizumab (anti-VEGF)와 같이 종양(tumor) 항원에 직접적으로 작용하는 모노클로날 항체 뿐 아니라 타이로신 키나아제 억제제 (예를들어, Imatinib, Erlotinib, Gefitinib), CDK 억제제 등을 포함한다. 이러한 새로운 암 치료법은 향상된 생존률과 기존 전략들과 비교하여 경감된 부작용을 가지고 있어 이에 의해 환자들의 삶을 크게 향상시켰다. 하지만, 이러한 표적치료 전략들은 특히 이러한 치료법들에 대한 내성(resistance) 때문뿐 아니라 이러한 타겟화된 치료법의 특이성(specificity), 즉 모든 종류의 암 및 환자들에게 유효하지는 않다는 특이성 때문에 빠르게 한계를 보이고 있다. 상기의 내성 현상은 치료 실패, 전이, 악화 및 재발로 이어진다.
연구에 따르면, 이러한 내성의 뿌리는 암줄기세포(CSC), 즉 스스로-갱신(renew) 및 분화하는 능력을 가지고, 암의 저항(recalcitrance), 재발(recurrence) 및 전이에 원시적인(primordial) 역할을 하는 암의 작은 부분집합인 암줄기세포의 존재에 있을 수도 있음이 확인되었다. 실제로, 이러한 암줄기세포는 화학요법, 방사선을 포함하는 암 치료에 상대적인 내성을 보여준다. 더욱이 이러한 암줄기세포는 소량만으로도 새로운 암의 시작, 및 따라서 전이에 충분하다. 따라서, 이러한 암줄기세포의 직접적인 타게팅이 현재 암치료 전략의 효율을 향상시킬 수도 있다.
따라서 암줄기세포 및 관련된 메카니즘이 많이 연구되어 왔다. 이러한 암줄기세포를 확인하는 방법이 연구되어 왔고, 소수의 CSC 마커들이 발견되었다. 불행히도, CSC 마커로 확인된 항원, 즉 많은 종양 타입들에 유용한 마커로서 확인된 CSC 항원은 아직은 없다. 현재 사용되는 CSC 마커들의 예시는 ALDH, CD133, CD44, CD24, CD166를 포함한다. 많은 다양한 표현형들이 암의 다른 종류에서 CSC 표현형들로 확인되었다. 특히, 암줄기세포의 마커로서 현재 널리 쓰이고 있는 CD133는 신경교종에 있어서 좋은 CSC 마커인 것으로 보여진다.
오늘날 세포 표현형 CD133+는 신경교종에서 암줄기세포와 관련되고; 표현형 CD44+CD24-/low는 유방암 내 암줄기세포와 관련되며; 표현형 CD34+는 백혈병 내 암세포와, 특히 CD34+/CD38는 금성 골수성 백혈병 내 암줄기세포와 관련되며, 표현형 CD34+/CD19+는 급성 림프구성 백혈병과 관련되는 것으로 나타났다.
불행히도, 대부분의 공지된 CSC 마커들은 또한 몇몇의 정상 조직들에서도 또한 발현된다. 따라서, 진단 및 치료적 CSC 마커로서 사용될 수 있는 특이적인(specific) 암 마커들을 규명하는 것은 주요 관심사이다: 이들은 진단뿐 아니라 건강한 세포들에 대한 독성 때문에 발생 되는 주요 부작용이 없이 암줄기세포를 포함하는 암 (여기서는 암줄기세포 암 (CSC 암)이라 명명됨)을 치료하는데 타겟화 될 수 있다.
본 발명자들은 신경외배엽 오리진(neuroectodermal origin)의 암이 특이하게(specifically) GD2-O-아세틸화된 갱글리오사이드를 발현하고, GD2-O-아세틸화된 갱글리오사이드를 타케팅하는 치료적 항체가 투여되어, 특히 건강한 세포, 특히 말초 신경들에 대한 이러한 암 항원의 발현이 없음에 의해 신경독성 없는 유리한 효과를 보여줄 수 있다는 점을 이미 밝혀낸 바 있다.
현재 그리고 놀랍게도, 본 발명자들은 GD2-O-아세틸화된 갱글리오사이드의 발현이 암줄기세포에 풍부하고, CSC 암의 치료를 타겟화 할 수 있음을 확인하였다.
따라서 본 발명자들은 O-아세틸화된-GD2 갱글리오사이드에 스페시픽한 8B6 항체 (및 이들의 유도체)를 사용하여 CSC 암의 치료를 위해 O-아세틸화된-GD2 갱글리오사이드를 타겟화 하는 것을 제안한다.
연구에 따르면, 이러한 항체는 CDC 및 ADCC를 포함하는 면역효과들에 더하여 세포소멸(apoptosis) 및 다른 세포 사멸 경로를 통한 암줄기세포에 대한 직접적인 세포 독성을 포함하는, 종양(tumor) 세포들에 대한 내재적 포텐(potent)의 세포독성 활동을 보여줌이 확인되었다.
따라서, 본 발명은 암줄기세포 암의 치료를 위한 O-아세틸화된-GD2 갱글리오사이드를 인식하는 항체 또는 이의 기능적인 단편들에 관한 것으로, 상기 항체는:
a)적어도 면역 글로불린으로부터의 경쇄 가변 영역 프래임워크 및 CDR-L1을 위한 서열번호 1, CDR-L2를 위한 서열번호 2, CDR-L3을 위한 서열번호 3의 서열(sequence)들에 의해 정의되는 세 개의 상보성 결정 영역(complementary determining regions)(CDRs)을 포함하는 경쇄; 및/또는
b) 적어도 면역글로불린으로부터의 중쇄 가변 영역 프래임워크 및 CDR-H1을 위한 서열번호 4, CDR-H2를 위한 서열번호 5, CDR-H3를 위한 서열번호 6의 서열들에 의해 정의되는 세 개의 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄를 포함한다.
본 발명은 또한 CSC 암을 치료하기 위한 약학적 조성물에 관한 것으로서, 상기 약학적 조성물은 본 발명에 따른 항체를 포함한다.
추가적으로 본 발명은 개체 내 CSC 암을 진단하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 O-아세틸화된-GD2 갱글리오사이드의 발현을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 O-아세틸화된-GD2 갱글리오사이드의 발현은 CSC 암의 지표(indicative)가 된다.
본 발명은 또한 O-아세틸화된-GD2 갱글리오사이드의 CSC 암에 대한 바이오마커로서의 용도에 관한 것이다.
끝으로 본 발명은 본 발명에 따른 조성물 또는 항체를 이용한 치료에 대한 CSC 암을 가지는 개체의 반응(response)을 예측하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 상기 개체의 생물학적 샘플 내의 O-아세틸화된-GD2 갱글리오사이드를 발현하는 세포들의 존재를 검출하는(detecting) 단계를 포함한다.
도 1 은 음성 대조군으로서 대조군 IgG3 항체로 염색된 교아종 종양 섹션 (A); mAb 8B6로 염색된 신경아세포종 종양 섹션(B)의 대표도이다. 교아종 종양 샘플은 mAb 8B6 염색의 구체적인 염색 정도에 따라 1+(C), 2+ (D), 3+ (E), 및 4+ (E)로 스코어 되었다.
도 2 는 인간 교아종 암 세포 내 CD133+ 줄기세포 표현형을 나타내는 OAcGD2 에 관한 도면이다. UL, 좌측 상단, OAcGD2+ U87MG 인간 교아종 세포; UR, 우측 상단, CD133+ OAcGD2+ U87MG 인간 교아종 세포; LL, 좌측 하단, CD133- OAcGD2- U87MG 인간 교아종 세포; LR, 우측 하단, CD133+ U87MG 인간 교아종 세포.
도 3 은 50 μg / ml 의 대조군 항체 또는 mAb 8B6에 노출된 U87MG 인간 교아종 세포의 위상 차 현미경 실험에 대한 도면이다. 24시간의 인큐베이션 기간 후에 형태학적 변화에 의해 측정되는 사멸 세포들(apoptotic cell)이 위상차 현미경 하에서 동일한 배율 ×200로 확인되었다. 화살표는 사멸 세포를 나타낸다.
도 4 는 마이스 내 인간 교아종 종양 성장을 억제하는 Anti- OAcGD2 mAb에 관한 도면이다.
도 5 는 유방암 세포에 대한 항-GD2 및 항- OAcGD2의 세포 독성에 대한 도면이다. 직접적인 세포독성은 뮤린 항-GD2 (10B8) 및 항-OAcGD2 (8B6) 항체의 증가하는 농도와 함께 MTT 에세이에 의해 평가된다.
도 6 은 소세포 폐암 내 CSC 내 OAcGD2의 발현에 대한 도면이다. 유동세포 측정법에서, 동시에 OAcGD2 (8B6) 또는 GD2 (10B8)와 함께 CD133 (CSC)의 H196 세포 라인에 대한 발현 프로파일이다.
본 발명의 치료적 전략 (Therapeutic strategies)
본 발명의 첫 번째 목적은 암줄기세포(CSC) 암의 치료를 위한 O-아세틸화된-GD2 갱글리오사이드를 인식하는 항체 또는 이의 기능적인 단편에 관한 것으로서, 상기 항체는:
a) 적어도 면역 글로불린으로부터의 경쇄 가변 영역 프래임워크 및 CDR-L1을 위한 서열번호 1, CDR-L2를 위한 서열번호 2, CDR-L3을 위한 서열번호 3의 서열(sequence)들에 의해 정의되는 세 개의 상보성 결정 영역(complementary determining regions)(CDRs)을 포함하는 경쇄; 및/또는
b) 적어도 면역글로불린으로부터의 중쇄 가변 영역 프래임워크 및 CDR-H1을 위한 서열번호 4, CDR-H2를 위한 서열번호 5, CDR-H3를 위한 서열번호 6의 서열들에 의해 정의되는 세 개의 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄를 포함한다.
Figure 112015116296915-pct00001
상기 CDRs은 IMGT 명명법(nomemclature)에 의해 정의되고, 이는 당해 분야에 공지되어 있다 (The International Immunogenetics Information System®, LEFRANC et al., Nucleic Acids Research, vol. 27, p: 209-212, 1999).
당해 분야의 일반적인 의미로서 용어 "항체(antibody)"는 다이설파이드(disulfide) 결합으로 상호 연결된 2개의 동일한 경쇄(L) (전체길이일때 약 25kDa) 및 2개의 동일한 중쇄(H)(전체길이일때 50-70 kDa)인, 4개의 폴리펩타이드를 포함하는 테트라머(tetramer)에 상응하는 면역글로불린을 의미한다. 경쇄는 카파(kappa) 및 람다(lamda)로 분류된다. 중쇄는 감마(gamma), 뮤(mu), 알파(alpha), 델타(delta) 또는 입실론(epsilon)으로 분류되고 항체의 아이소타입(isotype)을 각각 IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE로 정의한다. 각각의 중쇄는 N-말단 중쇄 가변역역 (여기서 HCVR로 축약됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 상기 중쇄 불변 영역은 IgG, IgD, 및 IgA의 경우 힌지 영역(Hinge region) 및 3개의 도메인들 (CH1, CH2, 및 CH3)로 구성되고; IgM 및 IgE의 경우 4 도메인들 (CH1, CH2, CH3, 및 CH4)로 구성된다; 각각의 경쇄는 N-말단 가변영역 (여기서는 LCVR로 축약됨) 및 경쇄 불변영역으로 구성된다. 상기 불변영역은 하나의 도메인인 CL로 구성된다. HCVR 및 LCVR 영역은 추가적으로 상보성 결정 영역 (complementarity determining regions: CDRs)으로 용어되어지는 초가변성의 영역, 및 프레임워크 영역 (FR)으로 용어되어지는 더 보존적인(more conserved) 영역으로 세분화 될 수 있다. 각각의 HCVR 및 LCVR은 3개의 CDRs 및 4개의 FRs로 구성되고, 아미노 말단부터 카르복시 말단까지 하기의 순서로 배치된다 : FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 이러한 아미노산의 각 도메인에 대한 배치는 종래 공지된 기술들에 따른다. 특정 항원에 결합하는 항체의 기능적인 능력은 각 경쇄/중쇄 쌍에 의해 의존되어지고, 대체로 CDRs에 의해 결정되어 진다.
특정 실시예로, 본 발명에 따른 항체는 :
a) 면역 글로불린 경쇄로부터의 경쇄 프래임워크 및 CDR-L1을 위한 서열번호 1, CDR-L2를 위한 서열번호 2, CDR-L3을 위한 서열번호 3의 서열(sequence)들에 의해 정의되는 세 개의 상보성 결정 영역(complementary determining regions)(CDRs)을 포함하는 경쇄, 및/또는
b) 면역글로불린 중쇄로부터의 중쇄 프래임워크 및 CDR-H1을 위한 서열번호 4, CDR-H2를 위한 서열번호 5, CDR-H3를 위한 서열번호 6의 서열들에 의해 정의되는 세 개의 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄를 포함한다.
더욱 상세한 실시예로서, 본 발명에 따른 항체는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (LCVR) 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 포함한다. 상기 항체는 8B6 항체이다.
Figure 112015116296915-pct00002
여기서 사용되는 용어 "항체"는 단일클론항체 그 자체를 의미한다. 단일클론 항체는 인간 항체, 키메라(chimeric) 항체 및/또는 휴머나이즈드(humanized) 항체일 수 있다.
여기서 사용되는 용어 "기능적인 단편 (functional frgment)"은 O-아세틸화된-GD2 갱글리오사이드를 인식할 수 있는 항체 단편을 의미한다. 이러한 단편들은 당업자에 의해 간단히 확인되거나 생산될 수 있고, 예를 들어 Fab 단편 (이는 파파인 소화에 의해 생성될 수 있음), Fab' 단편 (이는 펩신 소화 및 부분적 환원에 의해 생성될 수 있음), F(ab')2 단편 (이는 펩신 소화에 의해 생성될 수 있음), Facb (이는 플라스민 소화에 의해 생성될 수 있음), Fd (이는 펩신 소화, 부분적 환원 및 재결합에 의해 생성될 수 있음) 뿐만아니라 scFv (single chain Fv, 분자 생물학적 기술에 의해 생성됨) 단편, 디아바디 및 모노바디를 포함한다.
용어 "디아바디(diabodies)"는 2개의 항원-결합 사이트를 가지는 작은 항체 단편을 의미하는 것으로, 이 프래그먼트는 동일한 폴리펩타이드 체인 (VH-VL) 내에서 경쇄 가변 도메인(VL)과 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)를 포함한다. 바람직하게는, 동일 체인내 두 도메인들 사이에 페어링을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 이용하여 도메인들은 다른 체인의 상보적인 도메인들과 페어를 이룸이 강제되고, 항원-결합 사이트를 형성한다.
여기서 사용되는 용어 "모노바디(monobodies)"는 중쇄 가변 도메인과 결합하고 경쇄 가변 도메인과 결합하지 않은 항원 결합 분자를 의미한다. 모노바디는 통상적으로 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3로 지정되는 3개의 CDR 영역(regions)을 가지고 경쇄의 부재 하에서 항원과 결합할 수 있다. 모노바디는 가죽말굽(leatherly soles) 및 두 발가락을 가지는 동물들을 포함하는 낙타과 동물 소스로부터 얻어지는 VHH 단편들과 같은 "카멜리드 모노바디(camelid monobodies)"를 포함한다. 낙타과 동물들은 낙타, 라마 및 알파카를 포함한다. 낙타들 (Camelus dromedaries 및 Camelus bactrianus)은 그들의 혈청(serum)으로부터의 물질이 분석될 때, 종종 가변 경쇄 도메인들이 부족하게 됨이 보고되었는데, 이는 충분한 항체의 특이성(specificity) 및 어피니티(affinity)가 VH 도메인들 (세개의 CDR 루프들)만으로부터 기인 됨을 의미한다. 모노바디는 또한 다양한 동물 소스들, 특히 포유류 (예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 말, 당나귀, 보바인, 또는 인간)으로부터의 변형(modified)된 VH 를 포함하는데, 이는 VL의 부재 하에서 항원과 결합할 수 있다. 바람직하게는, VH는 VL 인터페이스 지점에서 변형되어 VL의 부재내에서 항원과 VH의 결합을 제공한다. 당업자는 몇몇의 중요한 잔기(residue)들의 치환(카멜라이제이션을 통해)하여 자연적으로 경쇄 파트너가 없는 카멜리드 항체 중쇄를 모방하여 인간 VH를 최적화시킬 수 있다. 이는 높은 어피니티, 높은 특이성(specificity) 및 감소하는 면역원성을 포함하는 항체 프래그먼트의 인지 특성을 유지하는 반면, 카멜리드 VHH와 유사한 안정 성질 및 발현 레벨을 가지는 항체 기능적인 단편을 얻는 것을 허용한다.
이러한 단편들은 여기서 기술된 및/또는 당해 분야에 공지된 효소적 절단, 합성 또는 재조합 기술에 의하여 제조될 수 있다. 항체들은 또한 항체 유전자들을 사용하여 다양한 절단된(truncated) 형태로 생성될 수 있는데, 여기서 하나 또는 그 이상의 정지 코돈들이 자연 정지 사이트의 업스트림에 삽입되어진다. 예를 들어, F(ab')2 중쇄 부분을 코팅하는 조합 유전자는 중쇄의 힌지 영역 및/또는 CH1 도메인을 코팅하는 DNA 서열들을 포함하여 디자인될 수 있다. 항체의 다양한 부분들은 종래 기술들에 의하여 화학적으로 함께 연결될 수 있고, 또는 유전적 엔지니어링 기술을 사용하여 인접 단백질(contiguous protein)로 제조될 수 있다.
상세한 일 실시예로, 본 발명은 본 발명에 따른 항체의 기능적인 단편에 관한 것으로, 상기 단편은 VHH 단편들 및 인간 VH 단편들을 포함하는 모노바디, 디아바디, scFv, Fd, Facb, F(ab')2, Fab' 및 Fab를 포함하거나 또는 이들로 구성된 그룹 중에서 선택된다.
본 발명에 따르면 상기 기능적인 단편들은 O-아세틸화된-GD2 갱글리오사이드를 인식할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항체의 기능적인 단편은 본 발명에 따른 항체의 그것과 동등한 활동, 특히 동등한 세포 독성 활동(activity)을 보유한다.
표현“O-아세틸화된-GD2 갱글리오사이드를 인식하는”은 10-7 M 보다 적은(less than), 바람직하게는 5 x 10-8 M 보다 적은, 더욱 바람직하게는 10-8 M 보다 적은 어피니티(affinity)를 가지고 O-아세틸화된-GD2 갱글리오사이드와 결합할 수 있는 본 발명의 항체를 의미한다.
필수적이지는 않지만 바람직하게는, 본 발명에서 유용한 항체들은 재조합적으로 생성되는데, 이들을 휴머나이즈드 형태로 전환하기 위해 적당한 특이성을 가지는 일반적으로 뮤린 또는 다른 비-인간 항체들의 조작(manupulation)이 요구된다. 비록 글리코실화된 항체들이 바람직하지만, 항체들은 글리코실화(glycosylated)되거나 또는 되지 않을 수 있다. 항체들은 종래 잘 알려진 바와 같이 다이설파이드(disulfide) 결합에 의하여 적절히 가교(cross-linked) 될 수 있다.
종래 잘 알려진 바와 같이, 단일 클론 항체들은 표유류 면역 표준 테크닉에 의해 적당한 특이성을 가지고 손쉽게 생성될 수 있다. 이러한 뉴클레오타이드 서열은 그들을 휴머나이즈드 형태로 제공하도록 조작될 수 있다.
“키메라(chimeric) 항체”는 뮤린 면역 글로불린으로부터의 가변영역 및 인간 면역 글로불린의 불변영역으로 구성된 항체를 의미한다. 이러한 개조(alteration)는 단순히 뮤린 불변영역의 인간 항체 불변영역으로의 치환 및 이에 따른 약학적으로 사용되기 충분한 낮은 면역원성(immunogenicity)을 가질 수 있는 인간/뮤린 키메라를 야기하는 것으로 구성된다.
이러한 키메라 항체들을 제조하는 수많은 방법들이 보고되어져 있고, 따라서 당업자의 통상의 지식의 일부분을 형성한다. (예를 들어, U.S. Pat. No. 5,225,539 참조).
“휴머나이즈드(humanized) 항체”는 비-인간 상보성 결정 영역 (CDR)을 가지는 항체의 서열을 변경(altering)함으로써 인간 항체 생식 세포(germline)로부터 유래된 아미노산 서열로 부분적으로 또는 전체적으로 구성되는 항체를 의미한다. 종국적으로 CDR 및 항체의 가변영역의 이러한 휴머나이제이션(humanization)은 당해 분야에서 잘 알려진 기술에 의해 수행되어진다.
예를 들어, 영국 특허 출원 GB 2188638A 및 미국 등록 특허 번호 5,585,089는 항체의 치환되는 유일한 부분이 상보성 결정 영역, 또는 "CDR"인 재조합 항체의 제조방법을 개시하고 있다. 이러한 CDR 그래프팅(grafting) 기술은 불변영역, 인간 가변영역 프래임워크 및 뮤린 CDR로 구성되는 항체들을 발생시키는데 사용되어져 왔다. (예를들어 RIECHMANN et al., Nature , vol.332, p: 323-327, 1988 참조). 이러한 항체들은 Fc 의존적 주효 기능에는 필수적이지만, 항체에 대한 면역 반응을 유발할 가능성은 매우 낮은 인간 불변 영역을 보유한다.
일 예로서, 가변영역의 프래임워크 영역은 비 인간 CDR을 실질적으로 온전하게 남기거나 또는 심지어 CDR을 인간 지놈(genome)에서 유리된 서열들로 대체하는 상응하는 인간 프래임워크 영역에 의해 치환된다. (예를 들어 특허출원 US 2006/0258852 참조). 전체적으로 인간 항체는 이의 면역 시스템이 상응하는 인간 면역 시스템으로 대체되는 유전적으로 변형된 마이스(mice)에서 생성된다. 상기에서 언급한 바와 같이, 단일 체인 형태를 대표하는 프래그먼트를 포함하여 면역학적으로 특이적인 항체의 단편을 채용하는 것은 본 발명의 방법에서 사용되기에 충분하다.
휴머나이즈드(humanized) 항체는 또한 인간 프래임워크, 적어도 하나의 비-인간으로부터의 CDR을 포함하는 항체를 의미하고, 여기에 존재하는 어떤 불변영역은 인간 면역글로불린 불변영역과 실절적으로, 예를들어 적어도 85 또는 90%, 바람직하게는 적어도 95% 동일하다. 따라서 아마(possibly) CDRs를 제외한 휴머나이즈드 항체의 모든 부분은, 하나 또는 그 이상의 네이티브(native) 인간 면역 글로불린 서열들의 상응하는 부분과 실질적으로 동일하게 된다. 예를 들어, 휴머나이즈드 면역글로불린은 일반적으로 마우스 가변영역/ 인간 불변영역 키메라 항체를 포함하지 않게 된다.
휴머나이즈드 항체들은 비-인간 및 키메라 항체들에 비하여 인간 치료의 사용에 있어서 적어도 3개의 잠재적인 이점들을 가진다:
1) 이펙터 부분 (effector portion)이 인간이기 때문에 이는 인간 면역 시스템의 다른 부분들과 더 잘 상호작용 할 수 있다. (예를들어, 상보성-의존 세포독성(CDC) 또는 항체-의존 세포 독성 (ADCC)에 의해 타겟 세포를 더 효율적으로 파괴한다)
2) 인간 면역 시스템은 프래임워크 또는 휴머나이즈드 항체의 C 영역을 외부의 것으로 인식할 수 없고, 따라서 이러한 주입된 항체들에 대한 항체 반응은 전체적으로 외부 비-인간 항체 또는 부분적으로 외부 키메라 항체들에 비하여 덜 하게 된다.
3) 주입된 비-인간 항체들은 이들의 인간 순환시스템 내에서의 반감기가 인간 항체들의 반감기보다 매우 짧은 것으로 보고되고 있다. 주입된 휴머나이즈드 항체들은 이들의 반감기가 자연적으로 발생된 인간 항체들과 실질적으로 동일할 것이고, 이는 주입 용량의 더 소량화 그리고 덜 자주 주입이 가능하도록 한다.
예를 들어, 휴머나이즈드 면역글로불린의 디자인은 다음에 따라 수행될 수 있다: 아미노산이 다음의 카테고리에 속하는 경우, 사용될 인간 면역글로불린 (수용자 면역 글로불린)의 프래임워크 아미노산 서열은 CDR-제공 비-인간 면역글로불린 (공여자 면역글로불린)으로부터의 아미노산 프래임워크에 의해 대체된다 : (a) 수용자 면역 글로불린의 인간 프래임워크 영역 내 아미노산이 해당 포지션에서의 인간 면역글로불린에 일반적이지 않은 반면, 이에 상응하는 공여자 면역글로불린 내 아미노산이 해당 포지션에서의 인간 면역 글로불린에 일반적인 경우; (b) 아미노산의 포지션이 CDRs의 하나에 즉시 인접한 경우; 또는 (c) 3차원 면역글로불린 모델에서 프래임워크 아미노산의 어느 한 사이드체인 원자가 CDR 아미노산의 어느 원자와 약 5-6Å (중심에서 중심) 범위 내인 경우 (QUEEN et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.88, p:2869, 1991). 수용자 면역글로불린의 인간 프래임워크 영역 내의 아미노산 각각 및 공여자 면역글로불린 내의 상응하는 아미노산이 그 포지션에서 인간 면역글로불린에 대해 일반적이지 않은 경우, 이러한 아미노산은 그 포지션에서 인간 면역글로불린에 일반적인 아미노산으로 대체된다.
특히 일 실시예로, 본 발명에 항체는 키메라(chimeric) 항체이다.
바람직한 실시예로, 상기 항체는 키메라 항체이고, 경쇄 및 중쇄 프레임워크 서열은 각각 마우스 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄에서 온다.
바람직하게는, 상기 키메라 항체는 추가적으로 인간 경쇄 및 중쇄로부터의 불변 영역을 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 키메라항체는 O-아세틸화된-GD2 갱글리오사이드를 인식할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 키메라 항체는 본 발명의 항체의 그것과 동등한 활동성, 특히 동등한 세포독성적 활동성을 보유한다.
유리하게도, 상기 항체는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (LCVR)을 포함한다.
다시 유리하게도, 상기 항체는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 포함한다.
더욱 바람직한 실시예로, 상기 항체는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
Figure 112015116296915-pct00003
다른 일 실시예로서, 본 발명의 항체는 휴머나이즈드 항체이다.
또 다른 바람직한 실시예로서, 상기 항체는 휴머나이즈드 항체이고 경쇄 및 중쇄 프래임워크 서열들은 각각 휴머나이즈드 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄로부터 온다.
바람직하게는, 본 발명의 휴머나이즈드 항체는 인간 경쇄 및 중쇄로부터의 불변영역을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 휴머나이즈드 항체는 O-아세틸화된-GD2 갱글리오사이드를 인식할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 휴머나이즈드 항체는 본 발명에 따른 항체의 그것과 동등한 활동성, 특히 동등한 세포 독성적 활동성을 보유한다.
본 발명의 휴머나이즈드 항체의 경쇄 및 중쇄에 대하여 다른 서열들이 가능하다. 면역글로불린은 두 쌍의 경쇄/중쇄 컴플렉스들을 가질 수 있는데, 하나 또는 그 이상의 마우스 상보성 결정 영역을 포함하는 적어도 하나의 체인은 기능적으로 인간 프래임워크 영역 세그먼트들(segments)에 연결된다. .
본 발명에 따른 항체는 면역컨쥬게이트를 포함한다.
여기서 사용되는 용어 "면역컨쥬게이트(immunoconjugate)"는 이차 분자, 바람직하게는 세포독성인자 또는 방사선 동위원소에 결합되는 적어도 하나의 항체 또는 이의 기능적 단편들을 포함한다. 바람직하게는, 상기 항체 또는 이의 기능적인 단편들은 상기 이차 분자에 공유결합에 의해 결합된다.
일 실시예로, 본 발명의 항체는 면역컨쥬게이트이다.
하나의 특정 실시예로서, 본 발명의 항체는 면역컨쥬게이트 이고, 상기 면역컨쥬게이트는 본 발명의 항체 또는 기능적인 단편들 및 세포독성 인자를 포함할 수 있다.
또 다른 특정 실시예로, 본 발명의 항체는 면역컨쥬게이트이고, 상기 면역컨주게이트는 본 발명의 항체 또는 이의 기능적인 단편들 및 방사성동위원소를 포함한다.
용어 “암줄기세포 (Cancer Stem Cells) 암” 또는 “CSC 암”은 암줄기세포로 알려진 특정 세포를 포함하는 암을 의미한다.
일 실시예로서, CSC 암은 적어도 0.1% 의 암줄기세포를 포함하고; 바람직하게는 1% 내지 95%의 암줄기세포를 포함하며, 더욱 바람직하게는 CSC 암은 1% 내지 50%의 암줄기세포를 포함한다.
용어 “암줄기세포 (Cancer Stem Cells)”는 당업계에서 일반적인 의미를 가지고 있고, 암 세포들의 부분집단(고형 종양 및 혈액학적 암들 범위 내에서 발견됨)을 의미하여, 이들은 정상 줄기 세포들과 관련된 특징들, 특히 특정 암 샘플에서 발견되는 모든 세포 타입들을 생성시킬 수 있는 능력을가진다. 그들은 스스로-갱신(renewal), 다중 암세포 혈통들로의 분화 및 집중적인 확산(proliferation)의 능력을 가진다. 그들은 소량의 암줄기세포 만으로 신규 종양을 개시할 수 있고, 화학요법 및 방사선 치료요법을 포함한 종래 치료법들에 대한 내성을 가지는 경향이 있다.
따라서, CSC를 타케팅하여, anti-OAcGD2 항체는 이러한 CSC로부터 발생되는 전이를 예방 및/또는 치료할 수 있다.
이러한 암줄기세포는 CD133, CD44, CD34, CD24, ALDH1와 같은 표면 마커들 (furface markers)에 의해 종양으로부터 분리될 수 있다; 이러한 마커들은 대량의 암 세포들 중에서 암줄기세포를 구별할 수 있도록 해준다. 특이한 마커 또는 Hoechst 염색-기초 분리법뿐 아니라 화학적 내성 기초 분리법, 비침습성의 이질성(heterogeneity) 분류 및 전이성 유방암 내 반복적인 사이클의 하이폭시아(hypoxia)에 노출 후 산소화 분류(reoxygenation sorting)의 널리 사용되는 접근들을 포함하여 in vitro상에서 특이하게 암줄기 세포를 분리하는 몇몇 방법들이 현재 공지되어 있다.
암줄기세포 (Cancer Stem Cells)는 매우 상이한 타입의 암들에서 발견되었는데, 다음을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다: 급성 골수성 백혈병 및 급성 림프구성 백혈병을 포함하는 백혈병, 유방암, 교아종을 포함하는 신경교종(glioma), 대장암(colorectal cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 전립선암(prostate cancer), 페암(lung cancer), 간암(liver cancer), 방광암(bladder cancer) 또는 위암(gastric cancer).
따라서, 본 발명의 일 실시예로서, 본 발명의 CSC 암은 급성 골수성 백혈병 및 급성 림프구성 백혈병을 포함하는 백혈병, 유방암, 교아종을 포함하는 신경교종(glioma), 대장암(colorectal cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 전립선암(prostate cancer), 페암(lung cancer), 간암(liver cancer), 방광암(bladder cancer) 또는 위암(gastric cancer)을 포함하거나 또는 이들로 구성된 군 중에서 선택되어진다.
바람직한 실시예로서, 상기 CSC 암은 신경교종(glioma), 유방암, 급성 림프구성 백혈병 또는 급성 골수성 백혈병이다.
수많은 암 세포들 중에서 암줄기세포를 확인하는 서로 다른 마커들이 관찰되었는데, 이러한 마커들은 다양하고 암의 종류에 따라 달라진다.
CSC 암을 확인하는데 사용될 수 있는 마커들의 예는 비한적으로 다음을 포함한다: CD34, CD38, CD19, interleukin-3-receptor α (CD123), CD33, CD44, CD44v6, CD47, CD24, EpCAM (ESA), Lin, CD133, A2B5, SSEA-1, CD166, CD26, CD200, α2β1, Sca, CD45, Pecam, ALDH, ALDH1 ,Oct4, ABCG2, CXCR4, AFP, EMA, IGF-IR.
하지만, 공지된 암줄기세포 마커들은 그들이 대부분 건강한 조직에서 발현되기 때문에, CSC 암을 확인하는데는 사용될 수 있지만 항원을 타겟하여 상기 암들을 치료하는데는 적합하지 않다는 것이 알려져 왔다.
몇몇의 암줄기세포 표현형들의 예는 하기 표 1에 개시된 표현형들을 포함한다.
Figure 112015116296915-pct00004
Figure 112015116296915-pct00005
표 1: 서로다른 암줄기세포들의 바이오마커 및/또는 표현형
따라서, 일 실시예로, 상기 CSC 암은 다음을 포함하거나 또는 이들로 구성된 군 중에서 선택되는 적어도 하나의 표현형을 가지는 세포들을 포함한다: CD34+/CD38-, CD34+/CD19-, CD34+/CD19+, CD34+/CD38+/CD19+, CD34+/CD38-/CD19+, CD133+/CD38-, CD133+/CD19-, interleukin-3-receptor α+, CD33+, CD44+/CD24-/low, CD44+/CD24-/ESA+, CD44+/CD24low /-lin-/ALDH+, CD133+, A2B5+, SSEA-1+, CD133+/ESAhigh/CD44+, CD166+, CD26+, CD44+/CD133+/α2β1+, CD44+, Sca+/CD45-/Pecam-/CD34+, ALDH1+/Oct4+/CD133+/ABCG2+/CXCR4+, CD133+/CD44+ , EpCAM+/AFP+, EMA-/CD44v6+, CD133+/CD44+/ALDH1+
본 발명의 일 실시예로서, 본 발명에 따른 CSC 암은 CD133+ 세포를 포함한다.
또 다른 실시예로서, 본 발명에 따른 CSC 암은 CD44+를 포함한다. 또 다른 특정 실시예로서 본 발명의 CSC 암은 CD44+/CD24-/low 세포를 포함한다.
여전히 또 다른 실시예로서, 본 발명의 CSC 암은 CD34+를 포함한다..
더욱 특정의 실시예로서 본 발명에 따른 CSC 암은 CD34+/CD38- 세포를 포함한다.
또 다른 실시예로서, 본 발명에 따른 CSC 암은 CD34+/CD19+ 세포를 포함하고, 바람직하게는 CD34+/CD38+/CD19+ 또는 CD34+/CD38-/CD19+ 세포를 포함한다.
본 발명에 따른 바람직한 실시예로, 본 발명에 따른 CSC 암은 암줄기세포의 부분집단에 의해 특징화 되는데, 적어도 10%의 암줄기세포는 그들의 표면에 O-아세틸화된-GD2 갱글리오사이드를 나타내고, 바람직하게는 적어도 30%의 암줄기세포가 그리고 더욱 바람직하게는 적어도 50%의 암줄기세포가 그들의 표면에 O-아세틸화된-GD2 갱글리오사이드를 나타내는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 특정 실시예에 따르면, CSC암은 유방암이다.
더욱 상세한 본 발명의 실시예에 따르면 상기 CSC암은 암줄기세포가 CD44+/CD24-/low 표현형에 의해 특징화 되는 유방암 이다.
본 발명에 따른 또 다른 특정의 실시예로서, 상기 CSC 암은 신경교종이다.
더욱 상세하게는, 상기 CSC암은 암줄기세포가 CD133+ 표현형에 의해 특징화 되는 신경교종이다.
본 발명에 따른 또 다른 특정 실시예로, 상기 CSC 암은 백혈병이고, 더욱 상세하게는 급성 골수성 백혈병 또는 급성 림프구성 백혈병이다.
더욱 상세한 실시예로서, 상기 CSC암은 암세포줄기가 CD34+ 표현형에 의해 특징화 되는 백혈병, 더욱 상세하게는 상기 CSC암음 암줄기세포가 CD34+/CD38- 표현형에 의해 특징화 되는 급성 골수성 백혈병이거나 또는 암줄기세포가 CD34+/CD19+ 표현형, 바람직하게는 CD34+/CD19+/CD38- 또는 CD34+/CD19+/CD38+ 표현형에 의해 특징화 되는 급성 림프구성 백혈병이다.
본 발명의 문맥에서 용어 "CSC 암의 치료"는 CSC 암의 진행(progress) 또는 증식(propagation) 및/또는 전이의 역전(reversing), 완화(alleviating), 억제(inhibiting)하는 것을 의미한다. 이 용어는 또한 CSC 암, 전이 또는 CSC 암 재발을 예방하는 것을 포함한다. 바람직하게는 이러한 치료는 또한 종양 성장의 퇴행(regression), 즉, 측정 가능한 종양의 크기의 감소로 이어진다. 일반적으로, 이러한 치료는 CSC 암의 진행, 재발 없이 환자의 생존률을 연장하거나 또는 이의 전체적 생존을 연장하는 것으로 이어진다.
일 실시예로, 본 발명은 CSC 암의 전이 또는 전이들을 치료하는 본 발명에 따른 항체에 관한 것이다.
문맥에 있어서 용어 "전이의 치료"는 CSC 암의 전이를 예방하는 것을 포함한다.
또 다른 실시예로, 본 발명은 CSC 암의 악화(relapse) 또는 재발(recurrence)을 예방하기 위한 본 발명에 따른 항체에 관한 것이다.
CSC 암의 치료를 위한 본 발명에 따른 항체는 CSC 암으로 고통받는 환자들의 생존 (더욱 상세하게는 5년 생존률)을 향상시키는데 사용된다.
따라서, 하나의 특정 실시예에서, 본 발명은 CSC 암의 치료를 위한 본 발명에 따른 항체에 관한 것으로서, 상기 CSC 암은 나쁜 예후(prognosis)와 관련된 암이다.
여기서 사용되는 나쁜 예후와 관련된 암은 5년 미만, 바람직하게는 2년 미더욱 바람직하게는 1년 미만의 중간 예후(median prognosis)와 관련된 암에 상응한다.
문맥 중, 본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 적어도 하나의 CSC 암의 치료를 위한 다른 항암 조성물 또는 다른 항암-치료와 조합하여 사용될 수 있다. 이런 조합은 항암치료 효과를 강력하게 하고 상기 CSC 암의 증식, 악화 또는 재발의 위험을 낮출 수 있다.
항-암 조성물 및 치료들은 다양하고 당업계에 잘 알려져 있다. 이들은 화학요법, 방사선 요법, 수술 뿐 아니라 호르몬 요법과 같은 통상적이고 일반화된 항-암 전략들을 포함한다. 그들은 또한 종양 항원을 직접적으로 타겟하는 단일클론항체들, 타이로신 키나아제 및 CDK 억제제, 안지오제네시스 억제제들을 포함하는 표적치료를 포함한 좀 더 스페시픽한 치료들을 또한 포함한다.
일 실시예로, 본 발명은 CSC 암의 치료에 있어서, 별도의 동시의 또는 순차적인 사용을 위한 복합제제로서의, 본 발명에 따른 항체 및 적어도 하나의 다른 항암 조성물에 관한 것이다.
또 다른 실시예로, 본 발명은 CSC 암 치료에 있어서 별도의, 동시의 또는 순차적인 사용을 위한 수술, 화학요법, 호르몬요법, 표적치료 및/또는 방사선 치료와 조합된 본 발명에 따른 항체에 관한 것이다.
본 발명의 항체와 다른 암 치료와의 조합은 종양의 완벽한 억제로 이어질 수 있다.
본 발명의 두번째 목적은 CSC 암을 치료하기 위한 약학적 조성물에 관한 것으로서, 상기 약학적 조성물은 본 발명의 항체 또는 이의 기능적인 단편을 포함한다.
본 발명에 따른 항체는 상기 언급된 것들이다.
본 발명에 따르면, 상기 항체는:
a) 적어도 면역 글로불린으로부터의 경쇄 가변 영역 프래임워크 및 CDR-L1을 위한 서열번호 1, CDR-L2를 위한 서열번호 2, CDR-L3을 위한 서열번호 3의 서열(sequence)들에 의해 정의되는 세 개의 상보성 결정 영역(complementary determining regions)(CDRs)을 포함하는 경쇄; 및/또는
b) 적어도 면역글로불린으로부터의 중쇄 가변 영역 프래임워크 및 CDR-H1을 위한 서열번호 4, CDR-H2를 위한 서열번호 5, CDR-H3를 위한 서열번호 6의 서열들에 의해 정의되는 세 개의 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄를 포함한다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 항체는 :
a) 면역 글로불린 경쇄로부터의 경쇄 프래임워크 및 CDR-L1을 위한 서열번호 1, CDR-L2를 위한 서열번호 2, CDR-L3을 위한 서열번호 3의 서열(sequence)들에 의해 정의되는 세 개의 상보성 결정 영역(complementary determining regions)(CDRs)을 포함하는 경쇄, 및/또는
b) 면역 글로불린 중쇄로부터의 중쇄 프래임워크 및 CDR-H1을 위한 서열번호 4, CDR-H2를 위한 서열번호 5, CDR-H3를 위한 서열번호 6의 서열들에 의해 정의되는 세 개의 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄를 포함한다.
또 다른 실시예로, 상기 조성물은 본 발명의 항체의 기능적인 단편을 포함하는데, 상기 단편은 VHH 단편들 및 인간 VH 단편들을 포함하는 모노바디, 디아바디, scFv, Fd, Facb, F(ab')2, Fab' 및 Fab를 포함하거나 또는 이들로 구성된 군 중에서 선택된다.
본 발명에 따르면 상기 단편은 본 발명의 항체의 CDRs을 포함하고, O-아세틸화된-GD2 갱글리오사이드를 인식할 수 있다.
또 다른 실시예로, 상기 조성물은 본 발명의 항체를 포함하고, 이때 항체는 키메라 항체이다.
바람직한 실시예로, 상기 항체는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 실시예로, 상기 조성물은 본 발명의 항체를 포함하고, 이때 항체는 휴머나이즈드 항체이다.
또 다른 실시예로서, 본 발명에 따른 항체는 면역 컨쥬게이트 이다.
다른 상세 실시예로, 본 발명에 따른 항체는 면역 컨쥬게이트이고, 이때 면역컨쥬게이트는 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적인 단편 및 세포독성인자(cytotoxic agent)를 포함한다.
또 다른 상세 실시예로, 본 발명의 항체는 면역컨쥬게이트이고, 이때 면역컨쥬게이트는 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적인 단편 및 방사선동위원소(radioisotope)를 포함한다.
본 발명의 CSC 암은 또한 위에서 설명된다.
일 실시예로, 본 발명의 조성물은 급성 골수성 백혈병 및 급성 림프구성 백혈병을 포함하는 백혈병(leukemia), 유방암, 교아종을 포함하는 신경교종(glioma), 대장암(colorectal cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 전립선암(prostate cancer), 페암(lung cancer), 간암(liver cancer), 방광암(bladder cancer) 또는 위암(gastric cancer)을 포함하거나 또는 이들로 구성된 군으로부터 선택된 CSC 암의 치료를 목적으로 한다.
바람직한 실시예로, 상기 CSC 암은 신경교종(glioma), 유방암, 급성 림프구성 백혈병 또는 급성 골수성 백혈병이다.
또 다른 실시예로, 상기 CSC암은 CD34+/CD38-, CD34+/CD19-, CD34+/CD19+, CD34+/CD38+/CD19+, CD34+/CD38-/CD19+, CD133+/CD38-, CD133+/CD19-, interleukin-3-receptor α+, CD33+, CD44+/CD24-/low, CD44+/CD24-/ESA+, CD44+/CD24low/-lin-/ALDH+, CD133+, A2B5+, SSEA-1+, CD133+/ESAhigh/CD44+, CD166+, CD26+, CD44+/CD133+/α2β1+, CD44+, Sca+/CD45-/Pecam-/CD34+, ALDH1+/Oct4+/CD133+/ABCG2+/CXCR4+, CD133+/CD44+ , EpCAM+/AFP+, EMA-/CD44v6+, CD133+/CD44+/ALDH1+을 포함하거나 또는 이들로 구성된 군 중에서 선택되는 적어도 하나의 표현형을 가지는 세포들을 포함한다.
본 발명에 따른 더욱 상세한 실시예로서, 본 발명에 따른 CSC 암은 CD133+ 세포, CD44+ 세포, 더욱 상세하게는 CD44+/CD24-/low 세포, 또는 CD34+ 세포, 더욱 상세하게는 CD34+/CD38- 또는 CD34+/CD19+ 세포, 더더욱 상세하게는 CD34+/CD19+/CD38- 또는 CD34+/CD19+/CD38+ 세포를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시예로, 본 발명에 따른 CSC 암은 암줄기세포의 부분집단에 의에 특징화 되는데, 여기서 적어도 10%의 암줄기세포가 O-아세틸화된-GD2 갱글리오사이드를 발현하고, 바람직하게는 적어도 30%의 암줄기세포가, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 50%의 줄기세포가 O-아세틸화된-GD2 갱글리오사이드를 발현한다.
본 발명의 특정 실시예에 있어서, 상기 CSC 암은 유방암이다. 더욱 산세한 실시예에서, 상기 암은 유방암으로서, 암줄기세포가 CD44+/CD24-/low 표현형에 의해 특징화 된다.
본 발명의 또 다른 상세 실시예로, CSC 암은 신경교종이다. 더욱 상세한 실시예로, 상기 CSC 암은 신경교종으로, 암줄기세포가 CD133+ 표현형에 의해 특징화 된다.
본 발명의 또 다른 상세 실시예로, 상기 CSC 암은 암줄기세포가 CD34+ 표현형에 의해 특징화 되는 백혈병이고, 더욱 상세하게는, 상기 CSC 암은 암줄기세포가 CD34+/CD38- 표현형에 의해 특징화 되는 급성 골수성 백혈병이거나 또는 암줄기세포가 CD34+/CD19+ 표현형, 바람직하게는 CD34+/CD19+/CD38- 또는 CD34+/CD19+/CD38+ 표현형에 특징화되는 급성 림프구성 백혈병이다.
일 실시예로, 본 발명은 CSC 암의 전이 또는 전이들을 치료하기 위한 본 발명의 조성물에 관한 것이다.
또 다른 실시예로, 본 발명은 CSC 암의 악화, 재발을 예방하기 위한 본 발명의 조성물에 관한 것이다.
따라서, 상세한 일 실시예에서 본 발명은 나쁜 예후와 관련된 CSC 암의 치료를 위한 본 발명의 조성물에 관련된 것이다.
일 실시예로, 본 발명은 CSC 암 치료에 있어서, 별도의(separate), 동시의(simultaneous) 또는 순차적인(sequential) 사용을 위한 복합제제로서의 본 발명에 따른 조성물 및 적어도 하나의 다른 항암 조성물에 대한 것이다.
또 다른 실시예로, 본 발명은 CSC 암 치료에 있어서 별도의(for separate), 동시의(simultaneous) 또는 순차적인(sequential) 사용을 위한, 수술, 화학요법, 호르몬요법, 표적치료 및/또는 방사선치료와 조합된 본 발명의 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 캐리어(carrier)를 추가적으로 포함한다.
표현 "약학적으로 허용가능한 (pharmaceutically acceptable)" 은 물리적으로 용인가능하고 일반적으로 인간에 투여되었을때 알러지 또는 소화불량(gastric upset), 현기증(dizziness) 및 유사 반응등 과 같은 유사한 원치않는 반응들을 발생시키지 않은 분자 집단 및 조성물을 의미한다. 바람직하게, 여기서 사용되는 "약학적으로 허용가능한"은 연방 또는 주 정부의 허가 기관에 의해 승인 받을 수 있거나 또는 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인식되는 동물, 특히 사람에 대한 사용을 위한 약전에 리스트되는 것을 의미한다.
용어 "캐리어"는 용매, 보조제(ajuvant), 첨가제(excipient) 또는 비히클(vehicle)로, 조성물과 함께 투여되는 것을 의미한다. 이러한 약학적 케리어는 물 및 오일과 같은 멸균 액체일 수 있고, 이때 오일은 땅콩 기름, 콩 기름, 미네랄 기름, 참깨 기름 및 이와 유사한 것들과 같은, 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여 경로는 바람직하게는 비경구적인(parentral)투여로, 여기서 사용되는 "비경구투여"는 종양내 투여(intratumoral), 정맥투여(intravenous), 근육내투여(intramuscular), 피하투여(subcutaneous), 직장투여(rectal), 질투여(vaginal) 또는 복강내투여(intraperitoneal)를 포함한다. 따라서, 약학적 조성물은 주사투여(injected)를 위한 제형에 허용가능한 비히클을 포함한다. 이들은 특히 등장성의(isotonic), 멸균된(sterile), 식염수 용액(모노소디움 또는 다이소디움 포스페이트, 소디움, 포타슘, 칼슘 또는 마그네슘 클로라이드 및 유사체 또는 이들 염의 혼합체)이거나 또는 주사가능한 용액의 구성을 허용하는, 용액의 케이스에 따라서, 멸균된 물 또는 생리 식염수가 부가되는 건조, 특히 동결-건조된 조성물일 수 있다. 적당한 약학적 케리어는 E.W. Martin에 의한 "레밍턴의 약학 과학 (Pharmaceutical Sciences)" 에 기재되어 있다. 이들 중 정맥 또는 종양 내 투여가 가장 바람직하다.
항체는 버퍼 또는 물에 용해되거나 또는 에멀젼(emulsions)내, 마이크로에멀젼(microemulsions), 하이드로겔(hydrogels) (예를들어, PLGA-PEG-PLGA 트리블록 코폴리머-기초 하이드로겔), 마이크로스피어(microspheres), 나노스피어(nanospheres), 마이크로입자(microparticles), 나노입자(nanoparticles) (예를들어, 폴리(락틱-코-글리콜릭 산), 마이크로입자(microparticle) (예를 들어 폴리락틱 산(PLA); 폴리(락타이드-코-글리콜릭 산) (PLGA)); 폴리글루타메이트 마이크로스피어, 나노스피어, 마이크로입자 또는 나노입자), 리포좀, 또는 다른 갈레닉(galenic) 제형 내 편입될 수 있다. 모든 케이스에서, 제형은 멸균되고 주사가능성(syringability)이 가능한 정도로 유동적이어야 한다. 이는 제조 및 저장 조건에서 안정화되어야 하고, 박테리아 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염활동에 대해서도 보존적이어야 한다.
분산제(dispersion)가 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 이들의 혼합물 및 오일 내에서 제조될 수 있다. 통상적인 저장 및 사용 조건하에서 이러한 제제(preparation)는 미생물의 성장을 억제하는 보존제(preservative)를 포함한다.
항체는 중성 또는 염(salt) 형태의 조성물로 제형화 될 수 있다. 약학적으로 가능한 염은 예를 들어, 하이드로클로릭 또는 포스포릭 산과 같은 무기 산이나 또는 아세틱산, 옥살릭 산, 타르타릭산, 만데릭 산 및 이의 유사체와 같은 유기 산과 함께 형성되는 산 부가 염 (단백질의 자유 아미노 그룹에서 형성)을 포함한다. 자유 카르복시 그룹과 함께 형성되는 염은 소듐, 포타슘, 암모늄, 칼슘, 또는 페릭 하이드록사이드와 같은 무기 염기, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 및 이의 유사체와 같은 유기 염기들에 의해 얻어질 수 있다.
캐리어는 또한 예를들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 유사체), 이들의 적당한 혼합물 및 식물성 오일을 함유하는 분산 매질 또는 용매일 수 있다. 본 발명의 컨쥬게이트는 예를 들어 페길레이션(pegylation)과 같이 변형되어 바이오디스폰서빌러티(biodisponsibility)를 향상시킬 수 있다.
적당한 유동성 (fluidity)는 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산의 경우 필요한 입자 크기의 유지를 통해, 계면활성제를 통해 유지될 수 있다. 미생물의 활동의 억제는 다양한 향균제, 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부타놀, 페놀, 소르빅 산, 티메로살 및 유사체의 사용에 의해 발생될 수 있다. 많은 경우에 있어서, 등장화제, 예를 들어 설탕 또는 소디움 클로라이드의 등장화제를 포함하는 것이 바람직할 수 있다.
주사투여 가능한 조성물의 지연된 흡수는 흡수 지연 제제를 조성물 내 사용함, 예를 들어 알루미늄, 모노스테아레이트, 젤라틴, 폴리올, 반감기 촉진 공유 및 비 공유 제형들을 사용함으로서 발생될 수 있다.
가수분해, 변성을 포함하는 펩타이드 불안정성 또는 분해에는 많은 원인들이 있다. 소수성 상호작용은 분자들의 집단화 (즉 응집(aggregation))을 유발한다. 안정화제(stabilizer)는 이러한 문제들을 예방하거나 또는 줄이기 위해 첨가될 수 있다.
안정화제는 사이클로덱스트린 및 이의 유도체를 포함한다. (미국 특허 No.5,730,969 참조). 슈크로오스, 만니톨, 소르비톨, 트레할로스, 덱스트란 및 글리세린과 같은 적당한 보존제는 또한 최종 제제의 안정화를 위해 첨가될 수 있다.이온 및 비이온 계면활성제, D-글루코오스, D-갈락토오스, D-자일로오스, D-갈락츄로닉 산, 트레할로스, 덱스트란, 하이드록시에틸 전분 및 이들의 혼합물에서 선택되는 안정화제는 제형에 첨가될 수 있다. 알칼리 금속 염 또는 마그네슘 클로라이드의 첨가는 펩타이드를 안정화 할 수 있다. 펩타이드는 또한 이들을 덱스트란, 콘드로이틴, 설퓨릭 산, 전분, 글리코겐, 덱스트린, 및 알지닉 산 염으로 구성된 군으로부터 선택되는 사카라이드에 접촉시킴으로서 안정화 할 수 있다. 첨가 가능한 다른 당들은 모노사카라이드, 다이사카라이드, 당 알콜 및 이들의 혼합물 (예를 들어 글루코오스, 만노오스, 갈락토오스, 프럭토오스, 슈크로오스, 말토오스, 락토오스, 만니톨, 자일리톤)을 포함한다. 폴리올은 펩타이드를 안정화할 수 있고, 물에 혼화되거나 또는 물에 용해될 수 있다. 적당한 폴리올은 만니톨, 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 트리메틸 글리콜, 비닐 피롤리돈, 글루코오스, 프럭토오스, 아라비노스, 만노오스, 말토오스, 슈크로오스 및 이들의 폴리머를 포함하는 폴리하이드록시 알콜, 모노사카라이드 및 다이사카라이드일 수 있다. 다양한 첨가제가 펩타이드를 안정화 시킬 수 있고, 이는 세럼 알부민, 아미노산, 헤파린, 지방산 및 인지질, 계면활성제, 금속, 폴리올, 환원제, 금속 킬레이트화제, 폴리비닐피롤리돈, 가수분해된 젤라틴 및 암모늄 설페이트를 포함한다.
본 발명의 일 실시예로, 본 발명의 약학적 조성물은 추가적인 활성 화합물을 별도의 또는 단일 투여 형태로, 별도의 동시의 또는 순차적인 사용 또는 투여를 위해 추가적으로 포함한다.
발명의 세 번째 목표는 개체 내 CSC 암을 치료하는 방법에 관한 것으로, 이를 필요로 하는 상기 개체에 유효한 용량의 본 발명의 항체 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
여기서 사용되는 용어 "개체(subject)"는 설치류(rodent), 고양잇과(canine) 또는 영장류(primate) 및 가장 바람직하게는 인간과 같은 포유류를 의미한다.
본 발명의 항체 및 조성물은 위에서 상세하게 설명된다.
일 실시예로, 본 발명은 급성 골수성 백혈병 및 급성 림프구성 백혈병을 포함하는 백혈병, 유방암, 교아종을 포함하는 신경교종, 대장암(colorectal cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 전립선암(prostate cancer), 페암(lung cancer), 간암(liver cancer), 방광암(bladder cancer) 또는 위암(gastric cancer)을 포함하거나 또는 이로 구성된 군 중에서 선택되는 CSC 암을 치료하는 상기 방법에 관한 것이다.
바람직한 실시예로, 상기 CSC 암은 신경교종(glioma), 유방암, 급성 림프구성 백혈병 또는 급성 골수성 백혈병이다.
또 다른 실시예로, 상기 CSC 암은 CD34+/CD38-, CD34+/CD19-, CD34+/CD19+, CD34+/CD38+/CD19+, CD34+/CD38-/CD19+, CD133+/CD38-, CD133+/CD19-, interleukin-3-receptor α+, CD33+, CD44+/CD24-/low, CD44+/CD24-/ESA+, CD44+/CD24low/-lin-/ALDH+, CD133+, A2B5+, SSEA-1+, CD133+/ESAhigh/CD44+, CD166+, CD26+, CD44+/CD133+/α2β1+, CD44+, Sca+/CD45-/Pecam-/CD34+, ALDH1+/Oct4+/CD133+/ABCG2+/CXCR4+, CD133+/CD44+ , EpCAM+/AFP+, EMA-/CD44v6+, CD133+/CD44+/ALDH1+ 을 포함하거나 또는 구성된 군 중에서 선택되는 적어도 하나의 표현형을 가지는 세포를 포함한다.
본 발명의 더욱 상세한 실시예로, 본 발명에 따른 CSC 암은 CD133+ 세포, CD44+ 세포, 더욱 상세하게는 CD44+/CD24-/low 세포, 또는 CD34+ 세포, 더욱 상세하게는 CD34+/CD38- 또는 CD34+/CD19+ 세포, 더욱더 상세하게는 CD34+/CD19+/CD38- 또는 CD34+/CD19+/CD38+ 세포를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시예로, 본 발명에 따른 CSC 암세포는 암줄기세포의 부분집단으로 특징화 되는데, 여기에서 적어도 10%의 암줄기세포가 표면에 O-아세틸화된-GD2 갱글리오사이드를 나타내고, 바람직하게는 적어도 30%의 암줄기세포가, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 50%의 줄기세포가 O-아세틸화된-GD2 갱글리오사이드를 그들의 표면에 나타낸다.
본 발명의 특정 실시예로, 상기 CSC 암은 유방암이다. 더욱 상세한 실시예로, 상기 CSC 암은 암줄기세포가 CD44+/CD24-/low 표현형으로 특징화되는 유방암이다.
본 발명의 또 다른 특정 실시예로, 상기 CSC 암은 신경교종이다. 더욱 상세한 실시예로, 상기 CSC 암은 암줄기세포가 CD133+ 표현형으로 특징화 되는 신경교종이다.
본 발명의 또 다른 특정 실시예로, 상기 CSC 암은 암줄기세포가 CD34+ 표현형으로 특징화 되는 백혈병이고, 바람직하게는 상기 CSC 암은 암줄기세포가 CD34+/CD38- 표현형에 의해 특징화 되는 급성 골수성 백혈병 또는 암줄기세포가 CD34+/CD19+ 표현형, 바람직하게는 CD34+/CD19+/CD38- 또는 CD34+/CD19+/CD38+ 표현형에 의해 특징화 되는 급성 림프구성 백혈병이다.
일 실시예로, 본 발명은 CSC 암의 전이 또는 전이들을 치료하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시예로, 본 발명은 CSC 암의 악화 또는 재발을 예방하는 상기 방법에 관한 것이다.
특정 실시예로, 본 발명은 본 발명에 따른 CSC 암을 치료하는 방법에 관한 것으로서, 상기 암은 나쁜 예후와 관련된 암이다.
일 실시예로, 본 발명은 개체 내의 CSC 암을 치료하는 방법에 관한 것으로, 이를 필요로 하는 상기 개체에 유효한 용량의 본 발명에 따른 항체 또는 조성물 및 적어도 하나의 항암 조성물을 CSC 암의 치료에 대한 별도의 동시의 또는 순차적인 사용을 위한 복합제제로서 투여하는 단계를 포함한다.
다른 실시예로, 본 발명은 CSC 암 치료에 있어서 별도의(for separate), 동시의(simultaneous) 또는 순차적인(sequential) 사용을 위한, 수술, 화학요법, 호르몬요법, 표적치료 및/또는 방사선치료와 조합된 본 발명에 따른 CSC 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
"유효한 용량"의 조성물은 종양 성장의 억제를 유도하기에 충분한 용량을 의미한다. 투여에 사용되는 용량은 다양한 파라미터들의 기능, 특히 사용되는 투여 형태, 관련 병리, 또는 그렇지 않으면 희망 치료 기간의 작용과 같은 기능에 맞추어 조정될 수 있다. 물론, 약학적 조성물의 형태, 투여경로, 용량 및 식이요법은 자연적으로 개체의 치료되는 상태, 질환의 심각도, 나이, 몸무게 및 성별 등에 의존한다. 아래에서 제시되는 유효 용량의 범위는 본 발명을 제한하지 않으며, 바람직한 용량 범위를 의미한다. 하지만, 바람직한 용량은 과도한 실험 없이 당업자에게 이해되고 결정될 수 있는 바와 같이 개별 개체에 의해 재단(tailored)될 수 있다.
일례로, 유효한 용량의 적어도 하나의 컨쥬게이트는 약 50 내지 약 1,000 mg/m2, 더욱 바람직하게는 약 100 내지 약 750 mg/m2, 및 가장 바람직하게는 약 250 내지 약 500 mg/m2이다. 컨쥬게이트의 분자량이 이에 영향을 가할 수 있기 때문에, 다른 용량들도 가능하다. 당업자는 상기 범위 내에서, 또는 필요하다면 상기 범위 밖에서의 적정 용량을 결정하는 것을 순조롭게 신뢰할 수 있다.
본 발명의 진단 전략 (Diagnostic strategies of the invention)
본 발명의 네 번째 목적은 개체 내의 CSC 암의 진단 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 O-아세틸화된-GD2 갱글리오사이드의 발현을 확인하는(determining) 단계를 포함하고, 이때 O-아세틸화된-GD2 갱글리오사이드의 발현은 CSC 암의 지표(indicative)가 된다.
본 발명은 in vivo 및 in vitro 방법들을 포함한다.
일 실시예로, 본 발명은 개체 내의 CSC 암을 진단하는 in vitro 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 (i) O-아세틸화된-GD2 갱글리오사이드의 발현을 확인하는 단계에 의하여 개체로부터 얻은 생물학적 샘플을 분석하는 단계를 포함하고, 상기 생물학적 샘플 내의 O-아세틸화된-GD2 갱글리오사이드 발현은 CSC 암의 지표가 된다.
유리하게도, 확인하는 단계 (i)은 앞에서 기술된 항체 또는 이의 기능적인 단에 의해서 가늠(assessed)된다. 상기 항체 또는 이의 단편은 라벨 (예를 들어 방사능-라벨, 발색단-라벨, 형광단-라벨 또는 효소-라벨된 항체)되거나 또는 유도(예를 들어, 기질과 또는 단백질 또는 단백질/리간드 페어(예를 들어 비오틴-스트렙타비딘)의 단백질의 리간드와 컨쥬게이트 된 항체)될 수 있다.
상기 분석은 다양한 공지된 기술들에 의해 수행될 수 있는데, 여기에는 효소면역측정법 (EIA), 방사면역측정법(RIA), 웨스턴블롯 및 효소면역흡착검사법(ELISA), 면역박층크로마토그래피(ITLC), 영상기법(imaging techniques), 특히 ET-Scan (양성자 방사 단층 촬영) 기법이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 in vivo 방법은 in vivo 투여에 적합한 본 발명의 항체 또는 이의 기능적인 단편에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게, 상기 in vivo 방법은 in vivo 영상 기법, 예를 들어 PET-Scan 방법과 같은 방법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 방법들은 당해 분야에 공지되어 있다.
여기서 언급되는 용어 "생물학적 샘플"은 환자로부터 얻어진 어떤 생물학적 샘플을 의미하고 바람직하게는 상기 생물학적 샘플은 생검(biopsy) 즉 본 발명의 방법을 실행하기 전 개체의 몸체로부터 제거되는 것을 의미한다.
일 실시예로, 상기 암은 급성 골수성 백혈병 및 급성 림프구성 백혈병을 포함하는 백혈병, 유방암, 교아종을 포함하는 신경교종, 대장암(colorectal cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 전립선암(prostate cancer), 페암(lung cancer), 간암(liver cancer), 방광암(bladder cancer) 또는 위암(gastric cancer)을 포함하거나 구성된 군 중에서 선택된다.
바람직한 실시예로, 상기 CSC 암은 신경교종, 유방암, 급성 림프구성 백혈병또는 급성 골수성 백혈병이다.
본 발명의 다섯 번째 목적은 O-아세틸화된-GD2 갱글리오사이드의 CSC 암에 대한 바이오마커로의 용도에 관한 것이다.
용어“O-아세틸화된-GD2 갱글리오사이드”는 GD2 갱글리오사이드로부터 유도되고, 9(7)-O-아세틸-GD2와 부합하는 갱글리오사이드를 의미한다.
본 발명의 여섯째 목적은 본 발명의 항체 또는 조성물을 이용한 치료에 대한 CSC 암을 가지는 개체들의 반응을 예측하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 상기 개체의 생물학적 샘플 내 O-아세틸화된-GD2 갱글리오사이드를 발현하는 세포의 존재를 검출(detecting)하는 단계를 포함한다.
일 실시예로, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 조성물을 이용한 치료에 대한 CSC 암을 가지는 개체의 반응을 예측하는 상기 방법에 관한 것으로서, 이때 상기 개체의 생물학적 샘플 내 O-아세틸화된-GD2 갱글리오사이드를 발현하는 세포의 존재는 상기 개체가 상기 치료의 응답자(subject ix responder)라는 좋은 개연성(good probability)과 상호 관련된다.
더 상세한 실시예로, 본 발명은, 상기 개체의 생물학적 샘플 내 모든 암 줄기세포 중 O-아세틸화된-GD2 갱글리오사이드를 발현하는 암줄기세포의 레벨을 검출하는 단계를 포함하는 방법과 관련된다.
더욱 상세한 실시예로, 상기 개체의 생물학적 샘플 내 모든 암 줄기세포 중에서 그들의 표면에 O-아세틸화된-GD2 갱글리오사이드를 발현하는 암줄기세포의 적어도 10%, 더욱 상세하게는 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 50%의 레벨은 상기 개체가 상기 치료의 응답자라는 높은 개연성(high probability)과 상호 관련된다.
일 실시예로, 상기 생물학적 샘플은 암 샘플, 바람직하게는 CSC 암 샘플이다.
일 실시예로서, 상기 CSC 암은 급성 골수성 백혈병 및 급성 림프구성 백혈병을 포함하는 백혈병, 유방암, 교아종을 포함하는 신경교종, 대장암(colorectal cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 전립선암(prostate cancer), 페암(lung cancer), 간암(liver cancer), 방광암(bladder cancer) 또는 위암(gastric cancer)을 포함하거나 이들로 구성된 군 중에서 선택된다.
바람직한 일 실시예로, 상기 CSC 암은 유방암, 신경교종, 급성 골수성 백혈병 또는 급성 림프구성 백혈병이다.
본 발명의 일 실시예로서, 상기 방법은 in vivo 영상화제(imaging agent)를 사용한 영상화(imaging)와 같은 비 침습적인 방법에 의해서, 환자 내 O-아세틸화된-GD2 갱글리오사이드를 발현하는 세포의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 이러한 방법들은 종래 잘 알려져 있다.
실시예
이하에서, 본 발명은 아미노산 서열, 핵산 서열 및 실시예를 참조하여 더 상세하게 설명된다. 하지만, 본 발명은 실시예의 세부사항에 의해 제한되지 않는다. 오히려 본 발명은 여기의 실시예에서 명백하게 언급한 세부 사항들뿐 아니라, 당업자가 과도한 노력 없이 발견할 수 있는 부분까지를 포함하는 어느 실시예까지 적용된다.
신경교종( gliomas )
신경교종 내 OAcGD2 갱글리오사이드의 발현의 평가(evaluation)
o 교아종의 생검 내 OAcGD2 발현
본 발명자들은 면역조직화학(immunohistochemistry) (IHC)을 사용하여 22 교아종 샘플 내 O-아세틸화된 GD2 갱글리오사이드(OAcGD2)의 발현을 평가하였다. 진단을 위한 면역조직화학적 염색의 일 예는 도 1에 개시되는데, 이때 조직들은 OAcGD2 항원을 위해 염색된다.
종양 (교아종)의 샘플들은 수술적 적출을 통해 획득된다. 조직 샘플 (볼륨 ≤ 0.5 cm3)은 떼어내져서(removed), 이소펜탄(isopentane)내에서 동결되어 액체 질소의 온도까지 냉각되었다. 60초 후에 샘플은 떼어내져서 이동되고 -70℃로 보존되었다. 10μm의 절단이 저온유지장치(cryostat)를 이용하여 수행되었다. 절단체는 유리슬라이드 SUPERFROST GOLD + (VWR)위에 수집되었고, 3분간 공기-건조 되었다. 이들은 그후 아세톤(-20℃)내에 10분간 고정되었고, 다시 공기-건조 되었다. 이 섹션들은 그후 -20℃에서 사용될 때 까지 저장되었다.
항체 8B6 면역반응성이 비오틴 부착-염소 항-마우스 항체, 스트렙타비딘-비오틴-퍼옥시다제 복합체 및 DAB 기질와 함께 단계적인 인큐베이션에 의해 검출되었다. 표본들은 광 미세 장치 (light microscopic equipment)를 이용하여 병리학자들에 의해 분석되었고, 인간 신경아세포종(neuroblastoma) 동결 섹션을 양성 대조군으로, 무관한 IgG3항체와 인큐베이트 된 조직을 음성 대조군으로 비교하여 음성(negative), 1+, 2+ 또는 3+로 분류되었다. 결과는 표2에 요약되었다.
Figure 112015116296915-pct00006
표 2. (ND: 검출 안됨(Not determined))
염색된 모든 샘플들이 항-OAcGD2 단일클론항체 (mAb) 8B6 에 대해, 1+ 에서 3+ 범위의 IHC 스코어를 가지고 양성적으로(positively) 염색되었다. 22 샘플 중 16 샘플에서 100% 종양 세포(tumor cell) 들이 종양(tumor) 내에서 양성이었다.
o 신경교종 세포 라인 및 일차세포에서의 OAcGD2 발현
U87MG 인간 교아종 세포 내 OAcGD2 및 CD133의 발현 프로파일이 유동세포분석법(flow cytometry analysis)에 의해 측정되었다. 세포들은 OAcGD2 에 특이적인(specific) 페런트(parent) 마우스 mAb 8B6 및 CD133-FITC 항체와 함께 염색되었다. 세포들은 아이스-콜드 PBS 내에서 3회 세척되었고, mAb 8B6 (10 μg/ml in PBS-BSA 1%)와 함께 30분간 4℃에서 인큐베이트되었다. 아이스-콜드 PBS에서 3회 세척 후 1차 결합(bound) 항체가 30분간 FITC와 컨쥬게이트된 염소 항-마우스 2차 항체의 F(ab)’2 단편과 함께 검출되었다. 세척 후 세포들은 CD133-APC 컨쥬게이트 항체와 함께 30분간 4℃에서 인큐베이트되었다. 아이스-콜드 PBS로 3회 세포 세척 후, 세포들은 Cell Quest Pro 소프트웨어 (BD)를 사용하여 FACSCalibur 사이토메터 (BD)와 함께 분석되었다. 아이소타입-매칭 항체가 음성 대조군으로서 사용되었다. 적어도 1×104 이벤트들(events)이 세포라인(cell line)에서 측정되었다.
유동세포분석법(flow cytometry)를 사용하여 발명자들은 또한 인간 일차 신경교종 세포(12/12) 및 인간 신경교종 세포라인(3/3)의 세포 표면의 OAcGD2 항원을 또한 검출하였다. 인간 신경교종 세포라인에 대하여, OAcGD2-양성 세포 양성 비율(rate)은 61 내지 85%의 범위를 가진다. (도 2, 표 3).
신경 교종 세포 라인 내 CD133+OAcGD2+ CSC 의 존재가 관찰되었는데, CD133-양성 세포들 내에서 OAcGD2-양성 세포의 비율은 약 85 내지 98% 였다.
인간 일차 신경교종 세포에 대하여 OAcGD2-양성 세포들은 32 내지 94%의 범위를 가졌다. 또한 이들 신경교종 세포들 내 CD133+OAcGD2+ CSCs가 관찰되었는데, CD133-양성 세포 내 OAcGD2-양성 세포의 비율은 약 62 내지 100%였다. (표3)
Figure 112015116296915-pct00007
Figure 112015116296915-pct00008
표 3. 신경 교종 세포 내 OAcGD2+, CD133+ 및 OACGD2+CD133+ (CD133+ 세포들 중 OAcGD2+세포의 비율) 군집 (populations)
결과에 따르면, 신경교종의 1차 세포 및 신경교종 세포라인 내 강한 OAcGD2 발현을 가지는 교아종의 생검체들을 얻었음을 확인할 수 있다. 더욱이 신경교종의 1차 세포 및 신경교종 세포라인 중 CSC (CD133+)의 검색은 이러한 CSC (CD133+)의 다양한 비율의 확인을 가능하게 하였다. 현재, 그리고 놀랍게도, 결과에 따르면 비 CSC와 비교하여 CSC에서 OAcGD2 발현이 풍부함을 확인할 수 있다. 예를 들어 양성 OAcGD2 세포의 비율은 CSC 에서 비CSC 보다 2배 더 크게 나타난다. (데이터 미제시)
끝으로, 결과에 따르면 OAcGD2는 신경교종의 CSC 에서 풍부하고, 이러한 세포들을 타겟하는 것을 가능하게 하는데 사용될 수 있다.
OAcGD2 발현 신경교종 세포에 대한 8B6 mAb 영향
U87-MG 종양 세포(5×105 cells)가 플랫 바닥 12-웰 플래이트에 이식되었고 mAb 8B6 또는 대조군-IgG3 항체와 함께 24시간 동안 37℃, 5% CO2에서 배양되었다. 세포 배양은 LEICA 164 현미경과 커플된 LEICA DFC295 디지탈카메라에 의하여 영상화 되었다.
24시간의 인큐베이션 기간 후에, 형태학적(morphological)변화에 의해 측정된 사멸 세포(apoptotic cell)가 위상차 현미경(phase-contrast microscope)하에서 ×200의 동일한 배율로 관찰되었다. 화살표는 사멸세포를 가르킨다.
mAb 8B6로의 치료는 U87MG세포 몰포로지(morphology)의 변화를 유도한다. 세포는 mAb 8B6와 함께 인큐베이트 되어 구형(sperical shape)은 벨브(belbs)로 형성되고, 이는 배양 용기(culture vessel)의 바닥에 느슨하게 부착되거나 또는 배양 배지(culture media)에 부유되게 된다. 세포는 세포소멸(apoptosis)의 성질을 가지는 몇몇의 단편들 분리되게(segregated)된다 (도3). U87-MG 세포 중에서, 가장 높은 퍼센트의 OAcGD2를 발현하는 세포인 CSC는 세포사멸(apoptosis)에 따라 사멸함이 짐작될 수 있다.
in vivo 모델 내 교아종에 대한 8B6 mAb의 영향
여성 누드 (nu/nu) 무흉선(athymic) 마이스 (Harlan Laboratories)가 프랑스 농림부로부터 승인받은 University of Nantes의 동물 시설에서 허가된 시설 동물 케어 및 사용 프로토콜(Institutional Animal Care and Use Protocol) 하에서 적용가능한 유럽동물복지(European Animal Welfare) 규정에 따라 사육되었다.
U251 세포 서스펜션 (동등 볼륨의 RPMI 및 Matrigel을 함유하는 3×106 cell/100μl)의 부분표본(Aliquots)이 마이스의 왼쪽 옆구리에 피하투여에 의해 이식되었다. 일주일 후에 모든 투여 쥐에 종양 덩어리가 존재하였고, 이들은 3개의 동등한 그룹들로 랜덤화되었으며 항체 치료가 시작되었다. 항-OAcGD2 mAb 8B6이 포스페이트-버퍼 식염수 용액으로 제형화 되었고, 정맥주사로 투여되었다. 한 그룹은 500μg의 mAb 8B6의 1회 주입에 의해 치료되었고, 반면 대조군은 비히클로 동일 볼륨의 PBS 단독으로 치료되었다. 세번째 그룹은 음성 컨트롤로 아이소타입-매칭 mAB (isotype-matching mAB)로 치료되었다. 종양이 캘리퍼(calipers)에 의해 측정되었다; 종양 볼륨은 식 길이(length) 넓이(width)2 × π/6 에 의해 계산 되었다.
본 발명자들은 또한 항(anti)-OAcGD2 mAb이 마이스 내에서 인간 교아종 종양의 성장을 억제함을 발견하였다 (도 4). 종양 볼륨이 100 mm3에 도달할 때, 마이스는 500μg의 mAb 8B6 또는 대조군(control)-IgG3 mAb를 투여받았고, 종양의 성장이 진행되었다. 항체 8B6은 인간 U251 교아종 종양의 성장을 비히클 및 대조군 IgG3-치료 마이스와 비교하여 억제하였다. 항체 투여 68일 후에 종양 볼륨음 비히클- 및 대조군 IgG3-치료 그룹들에서 각각 423 ± 236 mm3 및 405 ± 176 mm3 평균되었다. 반면에 mAb 8B6 치료는 U251 종양 성장을 254 ± 142 mm3의 평균 종양 볼륨으로 억제하였다. 동등한 용량의 비-특이적 IgG3 항체와의 치료는 비 효율적인 것으로 나타났기 때문에 치료의 특이성(specificity)이 확인되었다. 마지막으로 IgG3-치료 마이스 (데이터 미기재)와 비교하여 8B6로 치료받은 마이스 내에서 비 CSC가 식별될 수 있음이 확인되었다.
결론적으로, 결과에 따르면 항-OAcGD2 항체는 CSC 세포를 in vivo상에서 제거할 수 있었는데, 이러한 제거는 명확하고 강한 종양 성장의 억제와 관련되어 있다.
유방암
유방암 내 OAcGD2 갱글리오사이드의 발현 평가(evaluation)
o 유방암 조직 내 OAcGD2 발현
발명자들은 8B6 단일클론항체와 함께 포르말린-고정된 파라핀-내장 암 조직 내 OAc-GD2의 발현을 평가하기 위해 예비적 면역조직화학분석을 수행하였다.
25개의 염색된 유방암 생검체들 중에서 18 샘플들이 양성적으로 염색되었고, 그중 1 샘플은 희미한 염색(스코어 1+)을 보였고, 9 샘플들은 중간 염색 (스코어 +2)을, 그리고 8 샘플들은 강한 염색(스코어 3+)을 보였다.
이러한 유방암 조직과 OAcGD2의 강한 상호성(correlation)은 28개의 다른 유방암 조직들의 동결 섹션에 대해 수행된 다른 면역화학법(immunochemistries)에 의해 확인된다. 이러한 일련의 실험에 대하여 모든 샘플을은 OAcGD2에 양성적으로 염색되었다.
결론적으로 OAcGD2는 유방암의 마커로서 사용될 수 있다.
o 유방암 세포 라인 에서의 OAcGD2 발현
OAcGD2 발현이 유방암 세포 라인 SUM159에서 측정되었다. 인간 유방암 줄기세포 내 OAcGD2 발현 프로파일이 3차 형광 염색 후 유동세포분석법에 의해여 측정되었다. 세포들은 1차 항체 8B6, 14G2a 및 7H2 (10 μg/ml에서)와 함께 45분동안 PBS-BSA 1% 내 얼음에서 인큐베이트 되었다. 아이스-콜드 PBS 내에서 3번 세척 후 1차 결합 항체는 Alexa Fluor® 568 염소 향-마우스 IgG (H+L)(Life Technologies)로 45분간 아이스에서 검출되었다. 그 후, 세포는 PFA 4% 에서 10분간 고정되고, 25분간 FITC와 컨쥬게이트 된 항-CD24 및 APC(BD)와 컨쥬게이트 된 항-CD44 와 함께 배양되었다. 세척 후 세포는 FlowJo 소프트웨어 (BD)를 사용하여 LSRII 유동 세포 측정기 (BD)로 분석되었다. 적어도 1×104의 이벤트들이 세포 라인 내에서 측정되었다.
대략 35%의 세포들이 OAcGD2 (8B6 항체)를 발현하는 반면, 단지 15%만이 GD2 갱글리오사이드를 발현하였다(14G2a 항체). 이러한 상이한 발현은 또 다른 유방암 세포 라인에서도 확인되었다. (HMLE, 데이터 미제시). 그 후, 세포 라인 SUM159 내 CD44+CD24-/low 세포들의 비율을 측정하였고, 94%의 세포들이 CSC 표현형을 나타내었다. 비CSC와 비교하여 CSC 내 OAcGD2 양성 세포들의 비율이 SUM159내에서 측정되지 않았다면, 이러한 비율은 다른 유방암 세포 라인내에서 5배 더 큰 것(5 fold greater)으로 나타났다. (HMLE, 데이터 미기재). 따라서, 신경교종에서 얻은 결과와 관련하여, OAcGD2는 유방암의 CSC에 풍부하고, 이러한 암의 타게팅을 가능하게 하는데 사용될 수 있다. 더욱이, 이러한 결과는 매우 흥미로운데 왜냐하면 GD2를 타게팅하는 치료와 반대로 OAcGD2를 타게팅 하는 치료의 치료 효율을 예측할 수 있기 때문이다. 사실상, 소수 퍼센트의 GD2 발현 세포의 타게팅은 관련된 암의 번식을 확실하게 억제하게 하지 못한다.
8B6 항체에 대한 유방암 세포의 생존 억제 (viability inhibition)
발명자들은 유방암 SUM159 세포 라인 위 항-OAcGD2 및 항-GD2 항체와 함께 세포 증식 에세이를 수행하였다.
104의 SUM159 세포들(100μL)이 96-well 마이크로플레이트에서 24시간 37℃에서 배양되었다. 50μL 배지 내 80-1.25 μg/mL 항체들이 첨가되었고 24시간 동안 37℃에서 배양되었다. 50μg의 MTT가 각 웰에 첨가되었고 4시간동안 37℃에서 배양되었다. 세포들은 10% SDS 에서 용해되어 MTT 염료의 세포적 전환이 정지되었고, 37℃에서 O.N 인큐베이트 되었다. 흡광도(absorbance)는 그 후 570 및 650 nm에서 읽혀졌다. 650 nm에서의 제품의 흡광도는 570 nm에서의 흡광도로부터 삭감되어 (Abs 570 -Abs 650 ) 전체 염료의 전환이 계산되었다. 20μg의 에토포시드(etoposide)로 치료된 세포의 4개의 대조군 웰이 0%의 생존력을 나타내는 흡광도를 위한 블랭크를 제공한다. 생존력(%)은 비치료된 세포에 대한 비율(percentage)로 나타내어 지고, 각각의 수치는 4번 거듭한것(quadruplicate) 내 평균 ± SEM으로 표시된다.
8B6 항체는 이 세포라인에 직접적인 세포독성을 유도하여 30%의 생존 억제를 이끌어 낸다. (도 5).
페암 (lung cancer)
페암 (lung cancer) 소세포 내 OAcGD2 갱글리오사이드의 발현 평가
o 페암 (lung cancer) 세포 라인 내 OAcGD2 발현
OAcGD2 발현이 페암(lung cancer) 세포 라인 H196 내에서 평가되었다. 인간 폐 암줄기세포 내 OAcGD2 발현 프로파일은 이중 형광 염색 후 유동세포분석법에 의해 측정되었다. 세포들은 일차 항체 8B6, 10B8 및 7H2 (10 μg/ml) 와 함께 45분간 PBS-BSA 1% 아이스에서 인큐베이트되었다. 아이스-콜드 PBS에서의 3회 세척 후 일차 결합 항체는 FITC 컨쥬게이트 염소 항-마우스 IgG (H+L) (JacksonResearch)와 함께 45분간 아이스위에서 검출되었다. 그 다음에 세포들은 PFA 4%에서 10분간 고정(fixed)된 후 25분간 APC (Miltenyi Biotec)와 컨쥬게이트 된 항-CD133과 함께 인큐베이트 되었다. 세척 후에 세포들은 CellQuest 소프트웨어 (BD)를 사용하여 FACScalibur 유동 세포측정기 (BD)를 통해 분석되었다. 적어도 1×104 이벤트들이 세포라인 내에서 측정되었다.
결과는 도 6에 개시되었다.
또한 결과에 따르면, OAcGD2 및 CD133의 발현은 50% 보다 많은 OAcGD2를 발현하는 CSC 세포들과 상호 관련됨을 보여준다. 이들 세포 내 GD2의 발현은 음성 대조군보다 약간 크다(즉 7%).
또한, OAcGD2은 소세포 폐암의 CSC 내 풍부하고, 이들 세포의 타게팅을 가능하게 하는데 사용될 수 있다.
백혈병( leukemias )
본 발명자들은 8B6 단일클론항체와 함께 급성 림프구성 백혈병(ALL) 및 급성 골수성 백혈병(AML) 내 OAc-GD2의 발현을 평가하기 위해 예비적 비직접적 면역형광 측정법을 수행하였다. 테스트된 모든 세포라인의 둘은 양성이었다. 환자로부터의 하나의 AML 샘플 또한 양성이었다.
SEQUENCE LISTING <110> OGD2 Pharma Universite de Nantes <120> TARGETING O-ACETYLATED GD2 GANGLIOSIDE AS A NEW THERAPEUTIC AND DIAGNOSTIC STRATEGY FOR CANCER STEM CELLS CANCER <130> IP20152892FR <150> EP13002268.4 <151> 2013-04-29 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Gln Ser Leu Leu Lys Asn Asn Gly Asn Thr Phe Leu 1 5 10 <210> 2 <211> 3 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Lys Val Ser 1 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Ser Gln Ser Thr His Ile Pro Tyr Thr 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Glu Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr 1 5 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Ile Arg Asn Arg Ala Asn Gly Tyr Thr Thr 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Ala Arg Val Ser Asn Trp Ala Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 7 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Lys Asn 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Ser Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Leu Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 8 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Leu Pro Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Glu Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Arg Lys Ala Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Arg Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Ser Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Thr Glu Asp Ser Ala Thr Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Val Ser Asn Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 9 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric antibody chain <400> 9 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Lys Asn 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Ser Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Leu Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 10 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric antibody chain <400> 10 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Leu Pro Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Glu Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Arg Lys Ala Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Arg Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Ser Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Thr Glu Asp Ser Ala Thr Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Val Ser Asn Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115

Claims (24)

  1. 암줄기세포(CSC)를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물로,
    O-아세틸화된-GD2 갱글리오사이드 (O-acetylated-GD2 ganglioside)를 인식하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편(antigen-binding fragment)을 포함하고,
    상기 항체 또는 이의 단편이:
    a) 적어도 면역 글로불린으로부터의 경쇄 가변 영역 프래임워크 및 CDR-L1을 위한 서열번호 1, CDR-L2를 위한 서열번호 2, CDR-L3을 위한 서열번호 3의 서열(sequence)에 의해 정의되는 세 개의 상보성 결정 영역(complementary determining regions)(CDRs)을 포함하는 경쇄; 및
    b) 적어도 면역글로불린으로부터의 중쇄 가변 영역 프래임워크 및 CDR-H1을 위한 서열번호 4, CDR-H2를 위한 서열번호 5, CDR-H3를 위한 서열번호 6의 서열에 의해 정의되는 세 개의 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄;를 포함하고,
    상기 암줄기세포(CSC)를 포함하는 암은:
    급성 골수성 백혈병 내 암줄기세포와 관련된, CD34+/CD38-, interleukin-3-receptor α+ , 및 CD33+ 표현형;
    급성 림프구성 백혈병 내 암줄기세포와 관련된, CD34+/CD19+, CD34+/CD19-, CD34+/CD38+/CD19+, CD34+/CD38-/CD19+, interleukin-3-receptor α+, CD33+, CD133+/CD38-, 및 CD133+/CD19-표현형;
    유방암 내 암줄기세포와 관련된, CD44+/CD24-/low/ESA+ 및 CD44+/CD24-/low/-lin-/ALDH1+ 표현형;
    신경교종암 내 암줄기세포와 관련된, CD133+, A2B5+ 및 SSEA-1+ 표현형;
    대장암 내 암줄기세포와 관련된, CD133+/ESAhigh/CD44+, CD166+ 및 CD26+ 표현형;
    췌장암 내 암줄기세포와 관련된, CD133+ 및 CD44+/CD24+/ESA+ 표현형;
    전립선암 내 암줄기세포와 관련된, CD44+/CD133+/α2β1+ 및 CD44+ 표현형;
    폐암 내 암줄기세포와 관련된, Sca+/CD45-/Pecam-/CD34+ 및 ALDH1+/Oct4+/CD133+/ABCG2+/CXCR4+ 표현형;
    간암 내 암줄기세포와 관련된, CD133+/CD44+ 및 EpCAM+/AFP+ 표현형;
    방광암 내 암줄기세포와 관련된 EMA-/CD44v6+ 표현형; 및
    위암 내 암줄기세포와 관련된 CD133+/CD44+, CD44+ 및 CD133+/CD44+/ALDH1+ 표현형을 포함하거나 또는 이들로 구성된 군 중에서 선택되는 적어도 하나의 표현형(phenotype)을 가지는 세포를 포함하는, 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 CSC를 포함하는 암은 급성 골수성 백혈병 및 급성 림프구성 백혈병을 포함하는 백혈병, 유방암, 교아종을 포함하는 신경교종, 대장암(colorectal cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 전립선암(prostate cancer), 폐암(lung cancer), 간암(liver cancer), 방광암(bladder cancer) 또는 위암(gastric cancer)을 포함하거나 구성된 군 중에서 선택되는 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 CSC를 포함하는 암이 CD34+/CD38-, CD34+/CD19-, CD34+/CD19+, CD34+/CD38+/CD19+, CD34+/CD38-/CD19+, CD133+/CD38-, CD133+/CD19-, interleukin-3-receptor α+, CD33+, CD44+/CD24-/low, CD44+/CD24-/ESA+, CD44+/CD24low/-lin-/ALDH+, CD133+, A2B5+, SSEA-1+, CD133+/ESAhigh/CD44+, CD166+, CD26+, CD44+/CD133+/α2β1+, CD44+, Sca+/CD45-/Pecam-/CD34+, ALDH1+/Oct4+/CD133+/ABCG2+/CXCR4+, CD133+/CD44+ , EpCAM+/AFP+, EMA-/CD44v6+, CD133+/CD44+/ALDH1+를 포함하거나 또는 구성된 군 중에서 선택되는 적어도 하나의 표현형(phenotype)을 가지는 세포들을 포함하는 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 CSC를 포함하는 암은 적어도 CD133+, CD44+/CD24-/low, CD34+/CD38- 또는 CD34+/CD19+ 표현형을 가지는 세포들을 포함하는 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 CSC를 포함하는 암은 유방암, 신경교종, 급성 골수성 백혈병 또는 급성 림프구성 백혈병인 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 CSC를 포함하는 암은 적어도 10%의 암줄기세포가 O-아세틸화된-GD2 갱글리오사이드를 발현하는 암줄기세포 부분집단에 의해 특징화되는 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 CSC를 포함하는 암의 전이(metastasis) 또는 전이들(metastases)의 치료 및/또는 CSC를 포함하는 암의 재발(recurrence) 또는 악화(relapse)를 예방하기 위한 약학적 조성물.
  8. CSC를 포함하는 암의 치료에서, 별도의(separate), 동시의(simultaneous) 또는 순차적인(sequential) 사용을 위한 복합제제로의, 제1항의 약학적 조성물 및 적어도 하나의 다른 항-암 조성물.
  9. CSC를 포함하는 암 치료에서, 별도의(separate), 동시의(simultaneous) 또는 순차적인(sequential) 사용을 위한, 수술, 화학요법, 호르몬요법, 표적치료 및/또는 방사선치료와 결합된 제1항의 약학적 조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 항원-결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Facb, scFv 및 디아바디로 구성되거나 또는 이들을 포함하는 그룹 중에서 선택되는 약학적 조성물.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 항체는 키메라(chimeric) 또는 휴머나이즈드(humanized) 항체인 약학적 조성물.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 항체는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 약학적 조성물.
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