CN105339390A - 靶向o-乙酰化的gd2神经节苷脂作为针对癌症干细胞的新型治疗和诊断策略 - Google Patents

靶向o-乙酰化的gd2神经节苷脂作为针对癌症干细胞的新型治疗和诊断策略 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于治疗癌症干细胞(CSC)癌的识别O-乙酰化的-GD2神经节苷脂的抗体。本发明进一步涉及用于治疗CSC癌的包含所述抗体的药物组合物和用于治疗对其有需要的患者中的CSC癌的方法，所述方法包括向所述患者给予所述抗体。本发明还涉及用于诊断CSC的方法和O-乙酰化的-GD2神经节苷脂作为CSC癌的生物标志物的用途。最后，本发明涉及用于预测患有CSC癌的受试者对用本发明的抗体或组合物进行的治疗的应答的方法。

Description

靶向O-乙酰化的GD2神经节苷脂作为针对癌症干细胞的新型治疗和诊断策略
本国际专利申请要求于2014年4月29日提交的欧洲专利申请13002268.4的优先权，将其结合于本文作为参考。
技术领域
本发明涉及用于治疗和/或诊断癌症干细胞(CSC)癌的抗体、药物组合物和方法。
背景技术
癌症干细胞
最近数十年来医学研究的发展使现有的癌症治疗策略取得了重要的改善。在不断的研究和应用包括化疗、放疗、激素疗法和外科手术的常规治疗策略的同时，出现了通常被称为“靶向癌症治疗”的新的癌症控制方法并显示出其在医疗领域的效率和利益。这些靶向疗法包括针对肿瘤抗原的单克隆抗体，例如曲妥珠单抗(抗-Her2Neu)、利妥昔单抗(抗-CD20))或贝伐单抗(抗-VEGF)，以及酪氨酸激酶抑制剂(例如，伊马替尼、厄洛替尼、吉非替尼)、CDK抑制剂等。这些新的癌症治疗方案在很大程度上改善了患者的生活，并且相比于多数常规策略具有增加的存活率和减小的副作用。然而，这些靶向治疗策略也迅速显示出局限性，尤其是由于对所述治疗的抗性，以及这些靶向治疗的特异性，其并不是对于每一种类型的癌症和患者都是有效的。这些抗性治疗现象导致治疗失败、出现转移、再发和复发。
研究表明，这些抗性的根本原因可能是癌症干细胞(CSC)的存在，其是能够自我更新和分化的癌细胞的一个小亚组，并且在癌症抵抗、复发和转移中起根本性作用。事实上，这些癌症干细胞显示出对于癌症治疗(包括放疗和化疗)的相对抵抗。此外，仅仅少量的这些癌症干细胞就足以引发新的肿瘤，并由此发生转移。因此，直接靶向这些癌症干细胞可以改善目前癌症治疗策略的效力。
由此已经深入研究了癌症干细胞和相关的机制。已经研究了鉴定这样的癌症干细胞的方法，并且发现了几种CSC标志物。遗憾的是，仍然没有被鉴定为可用于许多癌症类型的CSC标志物的抗原。目前使用CSC标志物的实例包括ALDH、CD133、CD44、CD24、CD166。在不同类型的癌症中，已鉴定了许多不同表型为CSC表型。尤其是，现今CD133被广泛用作癌症干细胞的标志物，其在神经胶质瘤中表现出是良好的CSC标志物。
现在，细胞表型CD133+与神经胶质瘤中的癌症干细胞相关；表型CD44+CD24-/低显示出与乳腺癌中的癌症干细胞相关；表型CD34+显示出与白血病中的癌症干细胞相关；更具体地，CD34+/CD38与急性髓细胞白血病中的癌症干细胞相关；以及表型CD34+/CD19+显示出与急性淋巴细胞白血病中的癌症干细胞相关。
遗憾的是，大多数已知的CSC标志物在正常组织中也表达。因此，最关注的是确定能够被用作诊断和治疗CSC标志物的特定癌症标志物：其能够出于诊断目的而被靶向，并且还能够用于治疗包含癌症干细胞的癌症(本文中称为癌症干细胞癌症(CSC癌))，而不会出现由于对健康细胞的毒性而造成的副作用。
发明内容
本发明的发明人已经示出了神经外胚层起源的癌症特异性表达GD2-O-乙酰化的神经节苷脂，并且能够通过给药靶向GD2-O-乙酰化的神经节苷脂的治疗性抗体而显示出有益效果，且不具有神经毒性，尤其是由于该癌症抗原在健康细胞上不表达，尤其是在外周神经上不表达。
现在，发明人出人意料地示出了该GD2-O-乙酰化的神经节苷脂在癌症干细胞中强烈表达，并且能够被靶向以用于CSC癌治疗。
因此，发明人提出了利用特异于O-乙酰化的-GD2神经节苷脂的8B6抗体(和其衍生物)靶向O-乙酰化的-GD2神经节苷脂以用于治疗CSC癌。
在其研究中，他们证明了该抗体显示出针对肿瘤细胞的固有强效细胞毒活性，除了免疫效应(包括CDC和ADCC)之外，还包括通过细胞凋亡或其他细胞死亡通路的直接细胞毒性。
因此，本发明涉及用于治疗治疗癌症干细胞(CSC)癌症的识别O-乙酰化的-GD2神经节苷脂的抗体，或其功能性片段，所述抗体包含：
a)轻链，至少包含来自免疫球蛋白的轻链可变区框架和由序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3限定的三个互补决定区(CDRs)，其中序列SEQIDNO:1限定CDR-L1，SEQIDNO:2限定CDR-L2，SEQIDNO:3限定CDR-L3，和/或
b)重链，至少包含免疫球蛋白的重链可变区框架和由序列SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6限定的三个互补决定区(CDRs)，其中序列SEQIDNO:4限定CDR-H1，SEQIDNO:5限定CDR-H2，SEQIDNO:6限定CDR-H3。
本发明还涉及用于治疗CSC癌的药物组合物，所述药物组合物包含本发明的抗体。
本发明进一步涉及用于诊断受试者中CSC癌的方法，其中所述方法包括确定O-乙酰化的-GD2神经节苷脂的表达，并且其中该O-乙酰化的-GD2神经节苷脂的表达是CSC癌的指征。
本发明还涉及O-乙酰化的-GD2神经节苷脂作为CSC癌的生物标志物的用途。
最后，本发明涉及预测患有CSC癌的受试者对用本发明的抗体或组合物进行的治疗的应答的方法，其中所述方法包括检测所述受试者的生物学样品中表达O-乙酰化的-GD2神经节苷脂的细胞的存在。
附图说明
图1：用对照IgG3抗体作为阴性对照染色的胶质母细胞瘤切片的代表性照片(A)；用mAb8B6染色的神经母细胞瘤肿瘤切片(B)。根据mAb8B6染色的比强度(specificintensity)对胶质母细胞瘤样品进行评分1+(C)、2+(D)、3+(E)、和4+(E)。
图2：OAcGD2在人胶质母细胞瘤癌细胞中鉴定了CD133+干细胞表型。UL，左上角，OAcGD2+U87MG人胶质母细胞瘤细胞；UR，右上角，CD133+OAcGD2+U87MG人胶质母细胞瘤细胞；LL，左下角，CD133-OAcGD2-U87MG人胶质母细胞瘤细胞；LR，右下角，CD133+U87MG人胶质母细胞瘤细胞。
图3：暴露于50μg/ml对照抗体或mAb8B6的U87MG人胶质母细胞瘤细胞的相差显微镜检查。在24小时的孵育期后，在相差显微镜下以相同的放大率×200观察由形态变化评价的凋亡细胞。箭头指示凋亡细胞。
图4：抗-OAcGD2mAb在小鼠中抑制人胶质母细胞瘤生长。
图5：抗-GD2和抗-OAcGD2抗体对乳腺癌细胞的细胞毒性。在逐渐增加的鼠抗-GD2(10B8)和抗-OAcGD2(8B6)抗体浓度下通过MTT测定来评价直接细胞毒性。
图6：小细胞肺癌中CSC中OAcGD2的表达。同时具有OAcGD2(8B6)或GD2(10B8)的CD133(CSC)的H196细胞系的流式细胞术中的表达谱。
具体实施方式
本发明的治疗策略
本发明的第一个目的涉及用于治疗癌症干细胞(CSC)癌的识别O-乙酰化的-GD2神经节苷脂的抗体，或其功能性片段，所述抗体包括：
a)轻链，至少包含来自免疫球蛋白的轻链可变区框架和由序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3限定的三个互补决定区(CDRs)，其中序列SEQIDNO:1限定CDR-L1，SEQIDNO:2限定CDR-L2，SEQIDNO:3限定CDR-L3，和/或
b)重链，至少包含来自免疫球蛋白的重链可变区框架和由序列SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6限定的三个互补决定区(CDRs)，其中序列SEQIDNO:4限定CDR-H1，SEQIDNO:5限定CDR-H2，SEQIDNO:6限定CDR-H3。
SEQ ID NO:1 QSLLKNNGNTFL
SEQ ID NO:2 KVS
SEQ ID NO:3 SQSTHIPYT
SEQ ID NO:4 EFTFTDYY
SEQ ID NO:5 IRNRANGYTT
SEQ ID NO:6 ARVSNWAFDY
所述CDR根据IMGT系统命名法来定义，其是本领域公知的(TheInternationalImmunogeneticsInformationLEFRANC等人,NucleicAcidsResearch,vol.27,p:209-212,1999)。
术语“抗体”作为其本领域一般含义是指对应于包含四条肽链的四聚体免疫球蛋白分子，这四条肽链为通过二硫键相连的两条完全相同重(H)链(全长为约50-70kDa)和两条完全相同的轻(L)链(全长为约25kDa)。轻链被分类为κ和λ。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，并将抗体的同种型分别定义为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。每条重链由N-端重链可变区(在本文中缩写为HCVR)和重链恒定区组成。对于IgG、IgD、和IgA，重链恒定区由三个结构域(CH1、CH2、和CH3)和铰链区组成；对于IgM和IgE，重链恒定区由4个结构域(CH1、CH2、CH3、和CH4)组成。每条轻链由N-端轻链可变区(在本文中缩写为LCVR)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域(CL)组成。HCVR和LCVR区能够进一步细分为高度可变的区域，被称为互补决定区(CDR)，散置有更加保守的区域，其被称为框架区(FR)。每个HCVR和LCVR由三个CDR和四个FR构成，以如下顺序从氨基端至羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。根据公知规则为每个区域分配氨基酸。抗体结合于特定抗原的功能性能力取决于每个轻链/重链对的可变区，并且在很大程度上由CDR决定。
在一种特定的实施方式中，本发明的抗体包含：
a)轻链，包含来自免疫球蛋白的轻链框架和由序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3限定的三个互补决定区(CDRs)，其中序列SEQIDNO:1限定CDR-L1，SEQIDNO:2限定CDR-L2，SEQIDNO:3限定CDR-L3，和/或
b)重链，包含来自免疫球蛋白的重链框架和由序列SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6限定的三个互补决定区(CDRs)，其中序列SEQIDNO:4限定CDR-H1，SEQIDNO:5限定CDR-H2，SEQIDNO:6限定CDR-H3。
在更特定的实施方式中，本发明的抗体包含包括氨基酸序列SEQIDNO:7的轻链可变区(LCVR)和包括氨基酸序列SEQIDNO:8的重链可变区(HCVR)。所述抗体为8B6抗体。
如本文中使用的，术语"抗体"本质上是指单克隆抗体。单克隆抗体可以是人抗体、嵌合抗体和/或人源化抗体。
如本文中使用的，术语“功能片段”是指能够识别O-乙酰化的-GD2神经节苷脂的抗体片段。本领域技术人员能够简单地识别或生产这样的片段，其包括：举例而言，Fab片段(可由木瓜蛋白酶消化产生)、Fab'片段(可由胃蛋白酶消化和部分还原产生)、F(ab')2片段(可由胃蛋白酶消化产生)、Facb(可由血浆酶消化产生)、Fd(可由胃蛋白酶消化、部分还原和重聚合产生)，以及scFv(单链Fv，由分子生物学技术产生)片段、双价抗体和单价抗体。
术语"双价抗体"是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含连接于相同多肽链(VH–VL)中的轻链可变区(VL)的重链可变区(VH)。优选地，通过利用太短以使得同一条链上的这两个结构域之间不能够配对的接头，将这两个结构域与另一条链的互补结构域强行配对并产生两个抗原结合位点。
如本文中使用的，术语"单价抗体"是指抗原结合分子，其具有重链可变结构域而无轻链可变结构域。单价抗体能够在不具有轻链的情况下结合于抗原，并且通常具有被称为CDRH1、CDRH2和CDRH3的三个CDR区。单价抗体包括"骆驼源单价抗体(camelidantibody)"，例如获自骆驼科的动物来源的VHH片段，包括偶蹄和蹄子具有皮底(leatherysole)的动物。骆驼科的动物包括骆驼(camels)、美洲驼(llamas)和羊驼(alpacas)。已经报道了当对来自其血清的材料进行分析时，骆驼(单峰驼(Camelusdromedaries)和双峰驼(Camelusbactrianus))通常缺少可变轻链结构域，这暗示了足够的抗体特异性和亲和性能够获自仅VH结构域(三个CDR环)。单价抗体还包括来自各种动物来源的经修饰的VH，尤其是哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔、马、驴、牛或人)，其能够在缺少VL的情况下结合于抗原。优选地，VH在VL的界面处被修饰从而在不存在VL的情况下提供VH与抗原的结合。本领域技术人员能够通过替代一些重要的残基(通过“骆驼源化(camelization)”)将人VH优化为天然缺乏轻链配对的骆驼源抗体重链。这使得能够获得具有类似于骆驼源化VHH的稳定性性质和表达水平，同时保持抗体片段的识别性质的抗体功能片段，所述抗体片段的识别性质包括亲和性和高特异性以及降低的免疫原性。
如本领域已知的和/或如本文中所述的，这样的片段能够通过酶促切割、合成或重组技术来制备。抗体也能够利用其中一个或多个中止密码子已被引入天然中止位点的上游的抗体基因以多种截短形式来制备。例如，编码F(ab')2重链部分的重组基因被设计为包括编码重链的CH1结构域和/或铰链区的DNA序列。抗体的多个部分能够通过常规技术化学地连接在一起，或者能够利用基因工程技术制备成邻接蛋白(contiguousprotein)。
在一种特定的实施方式中，本发明涉及本发明抗体的功能片段，其中所述片段选自包含Fab、Fab'、F(ab')2、Facb、Fd、scFv、双价抗体和单价抗体(包括VHH片段和人VH片段)的组或由Fab、Fab'、F(ab')2、Facb、Fd、scFv、双价抗体和单价抗体(包括VHH片段和人VH片段)组成的组。
根据本发明，所述功能片段能够识别O-乙酰化的-GD2神经节苷脂。
优选地，本发明的抗体的功能片段保留了与本发明抗体等同的活性，尤其是等同的细胞毒活性。
表述“识别O-乙酰化的-GD2神经节苷脂”意指本发明的抗体能够以小于10-7M，优选小于5×10-8M并且最优选小于10-8M的亲和性结合O-乙酰化的-GD2神经节苷脂。
优选地，但不是必需的，在本发明中使用的抗体是重组产生的，因为需要对通常的具有适当特异性的鼠或非-人抗体进行操作以将其转化为人源化形式。抗体可以被糖基化或不被糖基化，但优选糖基化抗体。如所公知的，抗体经由二硫键适当交联。
如本领域普遍理解的，单克隆抗体能够通过哺乳动物形式免疫的标准技术容易地以适合的特异性产生。然后可以操作这些核苷酸序列以提供人源化形式的序列。
“嵌合抗体”意指由来自鼠免疫球蛋白的可变区和来自人免疫球蛋白恒定区组成的抗体。这种改变简单地由用人抗体的恒定区代替鼠恒定区构成，由此得到人/鼠嵌合体，其可以具有药学应用中可接受的足够低的免疫原性。
已经报道了用于生产这样的嵌合抗体的大量方法，由此形成了本领域技术人员的一般知识(参见，例如，美国专利第5,225,539号)。
“人源化抗体”意指通过改变具有非-人互补决定区(CDR)的抗体的序列而部分或全部来源于人抗体种系的氨基酸序列构成的抗体。抗体可变区和最终的人源化是由现今本领域公知的技术实现的。
举例而言，英国专利申请GB2188638A和US专利第5,585,089号披露了产生重组抗体的方法，其中仅抗体的被取代一部分为互补决定区，或“CDR”。该CDR嫁接技术已被用于产生由鼠CDR、以及人可变区框架和恒定区构成的抗体(参见，例如，Riechmann等人,Nature,vol.332,p:323-327,1988)。这些抗体保留了人恒定区，其对于Fc依赖性的效应子功能是必需的，但不太可能引起针对该抗体的免疫应答。
举例而言，该可变区的框架被相应人框架区取代，仅剩非-人CDR是基本完整的，或者甚至用来源于人基因组的序列代替CDR(参见，例如，专利申请US2006/0258852)。全长人抗体在基因修饰的小鼠中产生，其免疫系统已被改变为对应于人免疫系统。如上文所述，其足以被用于本发明的方法中，以利用该抗体的免疫学特异性片段，包括表现为单链形式的片段。
人源化抗体还指包含人框架和至少一个来自非-人抗体的CDR的抗体，并且其中存在的任意恒定区与人免疫球蛋白恒定区基本完全相同，即，至少约85或90％，优选至少95％完全相同。因此，人源化抗体的所有部分(除了可能的CDR之外)均与一个或多个天然人免疫球蛋白序列的相应部分基本完全相同。例如，人源化免疫球蛋白通常不包括嵌合小鼠可变区/人恒定区抗体。
相比于非-人抗体和嵌合抗体，人源化抗体在用于人类治疗中时具有至少三个潜在优势：
1)由于效应子部分是人，因此其与人免疫系统的其他部分具有更好的相互作用(例如，通过补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体-依赖性细胞毒性(ADCC)更有效地破坏靶细胞)。
2)人免疫系统不会将人源化抗体的框架区或C区识别为异种抗体，并且因此针对所注射的这种抗体的抗体应答应该小于针对完全异种非-人抗体或部分异种嵌合抗体的应答。
3)已报道了所注射的非-人抗体在人体循环中具有的半衰期比人抗体的半衰期短得多。所注射的人源化抗体具有的半衰期与天然存在的人抗体基本完全相同，这使得能够以更小量和更低的频率给予。
举例而言，人源化免疫球蛋白的设计可如下进行：当氨基酸落在以下类别的范围内时，待使用的人免疫球蛋白(接纳体免疫球蛋白)的框架氨基酸被以下来自提供CDR的非-人免疫球蛋白(供体免疫球蛋白)的框架氨基酸代替：(a)接纳体免疫球蛋白的人框架区中的氨基酸不经常在该位置处被用于人免疫球蛋白，而供体免疫球蛋白中的相应氨基酸则通常在该位置处用于人免疫球蛋白；(b)该氨基酸的位置紧邻CDR之一；或者(c)框架氨基酸的任意侧链原子在三维免疫球蛋白模型中的CDR氨基酸的任意原子的约(中心对中心)范围内(Queen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.88,p:2869,1991)。当接纳体免疫球蛋白的人框架区的每个氨基酸的供体免疫球蛋白中的相应氨基酸在该位置处不经常被用于人免疫球蛋白时，这样的氨基酸被在该位置处通常用于人免疫球蛋白的氨基酸代替。
在一种特定的实施方式中，本发明的抗体为嵌合抗体。
在一种优选的实施方式中，所述抗体为嵌合抗体且轻链和重链框架序列分别来自小鼠免疫球蛋白轻链和重链。
优选地，所述嵌合抗体进一步包含来自人轻链和重链的恒定区。
根据本发明，本发明的嵌合抗体能够识别O-乙酰化的-GD2神经节苷脂。
优选地，本发明的嵌合抗体保留了相对于本发明抗体等量的活性，尤其是等量的细胞毒活性。
有利的是，所述抗体包含包括氨基酸序列SEQIDNO:9的轻链可变区(LCVR)。
还有利的是，所述抗体包含包括氨基酸序列SEQIDNO:10的重链可变区(HCVR)。
在一种更优选的实施方式中，所述抗体包含包括氨基酸序列SEQIDNO:9的轻链可变区(LCVR)和包括氨基酸序列SEQIDNO:10的重链可变区(HCVR)。
在另一种特定的实施方式中，本发明的抗体为人源化抗体。
在另一种优选的实施方式中，所述抗体为人源化抗体并且轻链和重链框架序列分别来自人源化免疫球蛋白轻链和重链。
优选地，本发明的人源化抗体进一步包含来自人轻链和重链的恒定区。
根据本发明，本发明的人源化抗体能够识别O-乙酰化的-GD2神经节苷脂。
优选地，本发明的人源化抗体保留了相对于本发明抗体等量的活性，尤其是等量的细胞毒活性。
本发明的人源化抗体的轻链和重链可以使用其他的序列。该免疫球蛋白可具有两对轻链/重链复合物，至少一条链包含功能性连接于人框架区片段的一个或多个小鼠互补决定区。
本发明的抗体包括免疫缀合物。
如本文中使用的，术语"免疫缀合物"是指包含结合于第二分子的至少一个抗体或其功能性片段的缀合物分子，该第二分子优选为细胞毒性剂或放射性同位素。优选地，所述抗体或其功能片段通过共价键结合于所述第二分子。
在一种实施方式中，本发明的抗体为免疫缀合物。
在一种特定的实施方式中，本发明的抗体为免疫缀合物，其中，所述免疫缀合物包含本发明的抗体或其功能性片段和细胞毒性剂。
在另一种特定的实施方式中，本发明的抗体为免疫缀合物，其中，所述免疫缀合物包含本发明的抗体或其功能性片段和放射性同位素。
术语“癌症干细胞癌”或“CSC癌”是指包含已知为癌症干细胞的特定细胞的癌症。
在一种实施方式中，CSC癌包含至少0.1％的癌症干细胞，优选CSC癌包含1％至95％的癌症干细胞，更优选CSC癌包含1％至50％的癌症干细胞。
术语“癌症干细胞”具有本领域的通用含义并且是指具有与正常干细胞相关的特性的癌细胞的亚群(在实体瘤和血液系统癌症中发现的)，尤其是能够在特定的癌症样品中产生所有细胞类型。其能够自我更新、分化为多个癌细胞谱系并且广泛增殖。其仅用少量癌症干细胞就能够产生新的肿瘤，并且倾向于对于常规治疗(包括化疗和放疗)具有耐受性。
因此，通过靶向CSC，抗-OAcGD2抗体能够预防和/或治疗由于这些CSC造成的转移。
能够通过表面标志物将这些癌症干细胞与肿瘤区分，所述表面标志物例如是CD133、CD44、CD34、CD24、ALDH1；这些标志物能够将癌症干细胞与大部分的癌细胞区分开。本领域目前已知几种方法用来体外特异性分离癌症干细胞，包括被广泛使用的特异性标志物或基于Hoechst染色的分离方法，以及基于化学抗性的分离、浸润性异质性分选，和在转移性乳腺癌细胞中在暴露于缺氧的重复循环之后的复氧分选。
已经在不同类型的癌症中识别出癌症干细胞，所述癌症包括，但不限于，包括急性髓细胞白血病和急性淋巴细胞白血病的白血病、乳腺癌、包括胶质母细胞瘤的神经胶质瘤、结肠直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、膀胱癌或胃癌。
因此，在本发明的一种实施方式中，本发明CSC癌选自包含疾病的组或由以下疾病组成的组：包括急性髓细胞白血病和急性淋巴细胞白血病的白血病、乳腺癌、包括胶质母细胞瘤的神经胶质瘤、结肠直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、膀胱癌或胃癌。
在一种优选的实施方式中，所述CSC癌为神经胶质瘤、乳腺癌、急性淋巴细胞白血病或急性髓细胞白血病。
在癌细胞团块中已经观察到了作为识别癌症干细胞的不同标志物，这样的标志物是不同的并且取决于癌症的类型。
能够用于识别的CSC癌的标志物实例包含，但不限于，CD34、CD38、CD19、白细胞介素-3-受体α(CD123)、CD33、CD44、CD44v6、CD47、CD24、EpCAM(ESA)、Lin、CD133、A2B5、SSEA-1、CD166、CD26、CD200、α2β1、Sca、CD45、Pecam、ALDH、ALDH1,Oct4、ABCG2、CXCR4、AFP、EMA、IGF-IR。
然而，不得不注意到，已知的癌症干细胞标志物可用于鉴定CSC癌，但不适合作为靶抗原来治疗所述癌症，因为其大部分在健康组织上表达。
癌症干细胞表型的一些实例包含表1中所述的表型：
表1：不同癌症干细胞的生物标志物和/或表型
因此，在一种实施方式中，所述CSC癌包含具有选自包含以下表型的组或由以下表型组成的组中的至少一种表型的细胞：CD34+/CD38-、CD34+/CD19-、CD34+/CD19+、CD34+/CD38+/CD19+、CD34+/CD38-/CD19+、CD133+/CD38-、CD133+/CD19-、白细胞介素-3-受体α+、CD33+、CD44+/CD24-/低、CD44+/CD24-/ESA+、CD44+/CD24低/-lin-/ALDH+、CD133+、A2B5+、SSEA-1+、CD133+/ESA高/CD44+、CD166+、CD26+、CD44+/CD133+/α2β1+、CD44+、Sca+/CD45-/Pecam-/CD34+、ALDH1+/Oct4+/CD133+/ABCG2+/CXCR4+、CD133+/CD44+、EpCAM+/AFP+、EMA-/CD44v6+、CD133+/CD44+/ALDH1+。
在本发明的一种实施方式中，本发明的CSC癌包含CD133+细胞。
在另一种实施方式中，本发明的CSC癌包含CD44+细胞。在更特定的实施方式中，本发明的CSC癌包含CD44+/CD24-/低细胞。
在又一种实施方式中，本发明的CSC癌包含CD34+。
在更特定的实施方式中，本发明的CSC癌包含CD34+/CD38-细胞。
在另一种特定的实施方式中，本发明的CSC癌包含CD34+/CD19+细胞，优选保护CD34+/CD38+/CD19+或CD34+/CD38-/CD19+细胞。
在本发明的一种优选实施方式中，本发明的CSC癌的特征在于，癌症干细胞的亚群中至少10％的癌症干细胞在其表面上存在O-乙酰化的-GD2神经节苷脂，优选至少30％的癌症干细胞，并且更优选至少50％的干细胞在其表面上存在O-乙酰化的-GD2神经节苷脂。
在本发明的一种特定实施方式中，所述CSC癌为乳腺癌。
在更特定的实施方式中，所述CSC癌为乳腺癌，其中癌症干细胞的特征在于CD44+/CD24-/低表型。
在本发明的另一种特定实施方式中，所述CSC癌为神经胶质瘤。
在更特定的实施方式中，所述CSC癌为神经胶质瘤，其中癌症干细胞的特征在于CD133+表型。
在本发明的另一种特定实施方式中，所述CSC为白血病，尤其是急性髓细胞白血病或急性淋巴细胞白血病。
在更特定的实施方式中，所述CSC癌为白血病，其中癌症干细胞的特征在于CD34+表型，更加尤其是所述CSC癌为急性髓细胞白血病，其中癌症干细胞的特征在于CD34+/CD38-表型或急性淋巴细胞白血病，其中癌症干细胞的特征在于CD34+/CD19+表型，优选CD34+/CD19+/CD38-或CD34+/CD19+/CD38+表型。
在本发明的上下文中，术语"治疗CSC癌"意指逆转、减轻、抑制CSC癌和/或转移的发展和增殖。该术语还包括预防CSC癌、转移或CSC癌复发。优选地，这样的治疗还导致肿瘤生长的衰退，即，可测量的肿瘤的尺寸减小。通常，这样的治疗导致可测量的肿瘤的尺寸减小。通常，这样的治疗使得患者生存期延长且不具有CSC癌进展、复发或使得总体存活期延长。
在一种实施方式中，本发明涉及本发明的抗体用于治疗CSC癌的一种或多种转移。
在本发明的上下文中，术语“治疗转移”包括防止CSC癌的转移。
在另一种实施方式中，本发明涉及本发明的抗体用于预防CSC癌的再发或复发。
本发明的用于治疗CSC癌抗体被用于改善受CSC癌折磨的患者的存活(更加尤其是5-年存活率)。
因此，在一种特定的实施方式中，本发明涉及本发明的抗体用于治疗CSC癌的用途，所述CSC癌是与预后不良相关的癌症。
如本文中所使用的，与预后不良相关的癌症对应于与少于5年，优选少于2年并且还优选少于1年的中值预后相关的癌症。
在本文中，本发明的抗体优选与用于CSC癌治疗的至少一种其他的抗癌化合物或一种其他的抗癌治疗联用。这种联用可增强抗癌治疗的效力，并降低增殖、再发或复发的风险。
抗癌化合物和治疗是多种多样并且是本领域中公知的。其包括常规的和通用的抗癌策略，例如化疗、放疗、外科手术，以及激素疗法。其还包括更具特异性的治疗，包括靶向疗法，包括直接针对肿瘤抗原和酪氨酸激酶和CDK抑制剂、血管发生抑制剂...等的单克隆抗体。
在一种实施方式中，本发明涉及本发明的抗体和至少一种其他的抗癌化合物作为组合制剂分别、同时或相继用于CSC癌治疗的用途。
在另一种实施方式中，本发明涉及本发明的抗体与外科手术、化疗、激素疗法、靶向疗法和/或放疗联合，分别、同时或相继用于CSC癌治疗的用途。
本发明抗体与另外的癌症治疗的联用能够导致肿瘤的完全抑制。
本发明的第二个目的涉及用于治疗CSC癌的药物组合物，所述药物组合物包含本发明的抗体或其功能性片段.。
本发明的抗体如上文所述。
根据本发明，所述抗体包含：
a)轻链，至少包含来自免疫球蛋白的轻链可变区框架和由序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3限定的三个互补决定区(CDRs)，其中序列SEQIDNO:1限定CDR-L1，SEQIDNO:2限定CDR-L2，SEQIDNO:3限定CDR-L3，和/或
b)重链，至少包含免疫球蛋白的重链可变区框架和由序列SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6限定的三个互补决定区(CDRs)，其中序列SEQIDNO:4限定CDR-H1，SEQIDNO:5限定CDR-H2，SEQIDNO:6限定CDR-H3。
在一种特定的实施方式中，本发明的抗体包含：
a)轻链，包含来自免疫球蛋白的轻链框架和由序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3限定的三个互补决定区(CDRs)，其中序列SEQIDNO:1限定CDR-L1，SEQIDNO:2限定CDR-L2，SEQIDNO:3限定CDR-L3，和/或
b)重链，包含免疫球蛋白的重链框架和由序列SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6限定的三个互补决定区(CDRs)，其中序列SEQIDNO:4限定CDR-H1，SEQIDNO:5限定CDR-H2，SEQIDNO:6限定CDR-H3。
在另一种实施方式中，所述组合物包含本发明抗体的功能片段，其中所述片段选自包含Fab、Fab'、F(ab')2、Facb、Fd、scFv、包括VHH片段和人VH片段的双价抗体和单价抗体的组或由Fab、Fab'、F(ab')2、Facb、Fd、scFv、包括VHH片段和人VH片段的双价抗体和单价抗体组成的组。
根据本发明，所述片段包含本发明抗体的CDR并且能够识别O-乙酰化的-GD2神经节苷脂。
在另一种实施方式中，所述组合物包含本发明的抗体并且其中所述抗体为嵌合抗体。
在一种优选的实施方式中，所述抗体包含包括氨基酸序列SEQIDNO:7的轻链可变区和包括氨基酸序列SEQIDNO:8的重链可变区。
在另一种实施方式中，所述组合物包含本发明的抗体，其中所述抗体为人源化抗体。
在另一种实施方式中，本发明的抗体为免疫缀合物。
在一种特定的实施方式中，本发明的抗体为免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含本发明的抗体或其功能性片段和细胞毒性剂。
在另一种特定的实施方式中，本发明的抗体为免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含本发明的抗体或其功能性片段和放射性同位素。
本发明的CSC癌也如上文所述。
在一种实施方式中，本发明的组合物用于治疗CSC癌，所述CSC癌选自包含以下疾病的组或由以下疾病组成的组：白血病(包括急性髓细胞白血病和急性淋巴细胞白血病)、乳腺癌、神经胶质瘤(包括胶质母细胞瘤)、结肠直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、膀胱癌或胃癌。
在一种优选的实施方式中，所述CSC癌为神经胶质瘤、乳腺癌、急性淋巴细胞白血病或急性髓细胞白血病。
在另一种实施方式中，所述CSC癌包含具有选自包含以下表型的组或由以下表型组成的组中的至少一种表型的细胞：CD34+/CD38-、CD34+/CD19-、CD34+/CD19+、CD34+/CD38+/CD19+、CD34+/CD38-/CD19+、CD133+/CD38-、CD133+/CD19-、白细胞介素-3-受体α+、CD33+、CD44+/CD24-/低、CD44+/CD24-/ESA+、CD44+/CD24低/-lin-/ALDH+、CD133+、A2B5+、SSEA-1+、CD133+/ESA高/CD44+、CD166+、CD26+、CD44+/CD133+/α2β1+、CD44+、Sca+/CD45-/Pecam-/CD34+、ALDH1+/Oct4+/CD133+/ABCG2+/CXCR4+、CD133+/CD44+、EpCAM+/AFP+、EMA-/CD44v6+、CD133+/CD44+/ALDH1+。
在本发明的一种更特定的实施方式中，本发明的CSC癌包含CD133+细胞、CD44+细胞，更加尤其是，CD44+/CD24-/低细胞或CD34+细胞，更加尤其是，CD34+/CD38-或CD34+/CD19+细胞，甚至更加尤其是CD34+/CD19+/CD38-或CD34+/CD19+/CD38+细胞。
在本发明的一种优选实施方式中，本发明的CSC癌的特征在于，癌症干细胞的亚群中至少10％的癌症干细胞表达O-乙酰化的-GD2神经节苷脂，优选至少30％的癌症干细胞，并且最优选至少50％的干细胞表达O-乙酰化的-GD2神经节苷脂。
在本发明的一种特定实施方式中，所述CSC癌为乳腺癌。在更特定的实施方式中，所述CSC癌为乳腺癌，其中癌症干细胞的特征在于CD44+/CD24-/低表型。
在本发明的另一种特定实施方式中，所述CSC癌为神经胶质瘤。在更特定的实施方式中，所述CSC癌为神经胶质瘤，其中癌症干细胞的特征在于CD133+表型。
在本发明的另一种特定实施方式中，所述CSC癌为白血病，其中癌症干细胞的特征在于CD34+表型，更加尤其是所述CSC癌为急性髓细胞白血病，其中癌症干细胞的特征在于CD34+/CD38-表型或急性淋巴细胞白血病，其中癌症干细胞的特征在于CD34+/CD19+表型，优选CD34+/CD19+/CD38-或CD34+/CD19+/CD38+表型。
在一种实施方式中，本发明涉及用于治疗CSC癌的一种或多种转移的本发明组合物。
在另一种实施方式中，本发明涉及用于防止CSC癌的再发或复发的的本发明组合物。
因此，在一种特定的实施方式中，本发明涉及用于治疗CSC癌的本发明组合物，其中所述CSC癌为与预后不良相关的癌症。
在一种实施方式中，本发明涉及本发明的组合物和至少一种其他的抗癌化合物作为组合制剂分别、同时或相继用于CSC癌治疗的用途。
在另一种实施方式中，本发明涉及本发明的组合物与外科手术、化疗、激素疗法、靶向疗法和/或放疗联合，分别、同时或相继用于CSC癌治疗的用途。
本发明的药物组合物进一步包含可药用载体。
表述"可药用的"是指当向人给药时是生理耐受的，并且通常不产生过敏反应或类似的不期望反应(例如胃部反应、头晕等)的分子实体或组合物。优选地，如本文中使用的，表达"可药用的"意指可被联邦政府主管当局接受的或美国药典或一般承认的用于动物(更具体地用于人)的处方中列出的。
术语"载体"是指利用其来基于化合物的溶剂、佐剂、赋形剂或载体。这样的药用载体可以是无菌液体，例如水或油，包括石油、动物油、植物油或合成来源的油，例如花生油、豆油、矿物油、芝麻油等等。
本发明的组合物的给药途径优选为肠胃外给药；如本文中使用的，术语“肠胃外”包括瘤内、静脉内、肌肉内、皮下、直肠、阴道或腹膜内给药。因此，该药物组合物含有打算用于注射的配方的可药用载体。其尤其可以是等渗的、无菌盐溶液(磷酸二氢钠或磷酸一氢钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等或这样的盐的混合物)、或者干燥的尤其是冻干的组合物，在根据情况添加无菌水和生理盐水后，其构成可注射溶液。E.W.Martin所编著的"Remington'sPharmaceuticalSciences"中描述了适合的药用载体。当然，静脉内或瘤内是最优选的。
抗体可溶解于缓冲液或水中或以微球、纳米球、微粒、纳米颗粒(例如，聚(乳酸-共-乙醇酸)微粒(例如，聚乳酸(PLA)；聚合(丙交酯-共-乙醇酸)(PLGA))；聚谷氨酸微球、纳米球、微粒或纳米颗粒)、脂质体或其他盖仑制剂(galenicformulation)的形式结合于乳液、微乳液、水凝胶(例如，基于PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物的水凝胶)中。在全部情况下，为了可用于注射，该制剂必须是无菌的且为流体。其在制造和储存条件下必须是稳定的并且必须防止微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。
也可以在甘油、液体聚乙二醇、它们的混合物中和在油中制备分散液。在储存和使用的一般条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。
可将抗体以中性形式或盐形式配制成组合物。可药用盐包括酸式加成盐(与蛋白质游离氨基酸基团形成)，其与无机酸形成，例如盐酸或磷酸或者有机酸例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等等。用游离羧酸基团形成的盐也能够来自于有机碱，例如，氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，和有机碱例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等等。
载体也可以是溶剂或分散介质，其含有例如，水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇和液体聚乙二醇等等)、其适合的混合物，以及植物油。本发明的水合物还可以通过聚乙二醇化被修饰，举例而言，从而增加其生物利用度(biodisponibility)。
能够例如在分散液的情况下通过利用涂覆(如卵磷脂)通过保持所需粒径并通过利用表面活性剂来保持适合的流动性。能够通过多种抗菌剂和抗真菌剂来实现防止微生物的作用，例如，对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫汞撒等等。在许情况下，优选包括等渗剂，例如，糖或氯化钠。
可注射组合物的延长吸收能够通过在组合物中利用延迟吸收的试剂来实现，例如，单硬脂酸铝、明胶、多元醇、半衰期增强共价制剂或非共价制剂。
关于肽的不稳定性和降解存在多种原因，包括水解和变性。疏水相互作用会导致分子发生结块(即，聚结)。添加稳定剂可减少或防止这个问题。
稳定剂包括环糊精及其衍生物(参见美国专利第5,730,969号)。也可以加入适合的防腐剂(例如，蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、海藻糖、葡聚糖和甘油)来稳定化最终制剂。可向制剂中加入稳定剂，该稳定剂选自离子和非-离子表面活性剂、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖、D-半乳糖醛酸、海藻糖、葡聚糖、羟乙基淀粉和它们的混合物。加入碱金属盐或氯化镁可使肽稳定化。也可以通过使肽与糖接触而使其稳定化，所述糖选自由葡聚糖、硫酸软骨素、淀粉、糖原、糖原、糊精和海藻酸盐组成的组。能够加入的其他糖包括单糖类、二糖类、糖醇类及其混合物(例如，葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇、木糖醇)。多元醇可使肽稳定化，并且是可与水混溶的或可溶于水的。适合的多元醇可以是多羟基醇类、单糖和二糖，包括甘露醇、甘油醇、乙二醇、丙二醇、三甲基二醇(trimethylglycol)、乙烯基吡咯烷酮、葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖，和他们的聚合物。各种赋形剂也可以使肽稳定化，包括血清白蛋白、氨基酸、肝素、脂肪酸和磷脂、表面活性剂、金属、多元醇、还原剂、金属螯合剂、聚乙烯基吡咯烷酮、水解明胶和硫酸铵。
在本发明的一种实施方式中，本发明的药物组合物进一步包含另外的活性化合物，其为用于单独、同时或相继使用或给药的单独剂型或单位剂型。
本发明的第三个目的涉及用于治疗受试者中CSC癌的方法，该方法包括向有需要的受试者给予有效量的本发明的抗体或组合物。
如本文中使用的，“受试者”是指哺乳动物，例如啮齿目动物、猫科动物、犬科动物、或灵长目动物，并且最优选为人。
上文中详细描述了本发明的组合物和抗体。
在一种实施方式中，本发明CSC癌选自包含疾病的组或由以下疾病组成的组：白血病(包括急性髓细胞白血病和急性淋巴细胞白血病)、乳腺癌、神经胶质瘤(包括胶质母细胞瘤)、结肠直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、膀胱癌或胃癌。
在一种优选的实施方式中，所述CSC癌为神经胶质瘤、乳腺癌、急性淋巴细胞白血病或急性髓细胞白血病。
在另一种实施方式中，所述CSC癌包含具有选自包含以下表型的组或由以下表型组成的组中的至少一种表型的细胞：CD34+/CD38-、CD34+/CD19-、CD34+/CD19+、CD34+/CD38+/CD19+、CD34+/CD38-/CD19+、CD133+/CD38-、CD133+/CD19-、白细胞介素-3-受体α+、CD33+、CD44+/CD24-/低、CD44+/CD24-/ESA+、CD44+/CD24低/-lin-/ALDH+、CD133+、A2B5+、SSEA-1+、CD133+/ESA高/CD44+、CD166+、CD26+、CD44+/CD133+/α2β1+、CD44+、Sca+/CD45-/Pecam-/CD34+、ALDH1+/Oct4+/CD133+/ABCG2+/CXCR4+、CD133+/CD44+、EpCAM+/AFP+、EMA-/CD44v6+、CD133+/CD44+/ALDH1+。
在本发明的更特定的实施方式中，本发明的CSC癌包含CD133+细胞、CD44+细胞、更加尤其是CD44+/CD24-/低细胞、或CD34+细胞，更加尤其是CD34+/CD38-或CD34+/CD19+细胞，甚至更加尤其是CD34+/CD19+/CD38-或CD34+/CD19+/CD38+细胞。
在本发明的一种优选实施方式中，本发明的CSC癌的特征在于，癌症干细胞的亚群中至少10％的癌症干细胞在其表面上存在O-乙酰化的-GD2神经节苷脂，优选至少30％的癌症干细胞，并且更优选至少50％的干细胞在其表面上存在O-乙酰化的-GD2神经节苷脂。
在本发明的一种特定实施方式中，所述CSC癌为乳腺癌。在更特定的实施方式中，所述CSC癌为乳腺癌，其中癌症干细胞的特征在于CD44+/CD24-/低表型。
在本发明的另一种特定实施方式中，所述CSC癌为神经胶质瘤。在更特定的实施方式中，所述CSC癌为神经胶质瘤，其中癌症干细胞的特征在于CD133+表型。
在本发明的另一种特定实施方式中，所述CSC癌为白血病，其中癌症干细胞的特征在于CD34+表型，更加尤其是所述CSC癌为急性髓细胞白血病，其中癌症干细胞的特征在于CD34+/CD38-表型或急性淋巴细胞白血病，其中癌症干细胞的特征在于CD34+/CD19+表型，优选CD34+/CD19+/CD38-或CD34+/CD19+/CD38+表型。
在一种实施方式中，本发明涉及用于治疗CSC癌的一种或多种转移的所述方法。
在另一种实施方式中，本发明涉及用于预防CSC癌的再发或复发的所述方法。
在一种特定的实施方式中，本发明涉及用于治疗本发明的CSC癌的方法，其中所述CSC癌是与预后不良相关的癌症。
在一种实施方式中，本发明涉及用于治疗受试者中的CSC癌的方法，所述方法包括作为组合物制剂向有需要的受试者给予有效量的本发明的抗体或组合物以及至少一种抗癌化合物，以用于在CSC癌的治疗中分别、同时或相继使用。
在另一种实施方式中，本发明涉及与外科手术、化疗、激素疗法、靶向疗法和/或放疗联合用于治疗本发明的CSC癌的方法，以用于在CSC癌的治疗中分别、同时或相继使用。
组合物的“有效量”是足以诱导肿瘤生长衰退的量。用于给药的该剂量能够被采用作为多个参数的函数，尤其是作为相关病理学的所使用的给药方式的函数，或者可替代地作为所需治疗期间的函数。当然，药物组合物的形式、给药途径、剂量和治疗方案当然取决于待治疗的疾病、疾病的严重程度、受试者的年龄、体重、性别等等。下文中提供的有效剂量的范围并不是意在限制本发明，而是代表了优选的剂量范围。然而，该优选剂量是个体受试者能够耐受的，如本领域技术人员能够理解和确定的，而不需要进行过度实验。
作为举例，至少一种缀合物的有效量为约50至约1,000mg/m2，更优选为约100至约750mg/m2，并且最优选为约250至约500mg/m2。其他的剂量是可行的，因为其缀合物的分子量会影响剂量。本领域技术人员可容易地实现确定落入该范围内的适合剂量，或者如有必要，位于该范围外。
本发明的诊断策略
本发明的第四个目的设计用于在受试者中诊断CSC癌的方法，其中，所述方法包括通过确定O-乙酰化的-GD2神经节苷脂的表达，并且其中该O-乙酰化的-GD2神经节苷脂的表达是CSC癌的指征。
本发明包括体内和体外方法。
在一种实施方式中，本发明设计用于在受试者中诊断CSC癌的体外方法，其中所述方法包括通过(i)确定O-乙酰化的-GD2神经节苷脂的表达来分析获自受试者的生物学样品的步骤，并且其中所述O-乙酰化的-GD2神经节苷脂在所述生物学样品中的表达是CSC癌的指征。
有利的是，通过之前所披露的抗体或其功能片段来评价确定步骤(i)。所述抗体或其片段可以加标记(例如，放射性标记、发色团标记、荧光标记或酶标记的抗体)或衍生的(例如，抗体与底物缀合或与蛋白/配体对的(例如，生物素-抗生蛋白链菌素)的蛋白或蛋白的配体缀合)。
可以通过多种本领域技术人员公知的技术来评价所述的分析，包括，但不限于，酶免疫测定(EIA)、放射性免疫测定(RIA)、蛋白质印迹分析和酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫薄层色谱(ITLC)、成像技术尤其是PET-Scan(正电子发射断层显像)技术。
本发明的体内方法通过适合用于体内给予的本发明的抗体或或其功能性片段来评价。优选地，通过体内成像方法来评价所述体内方法，例如PET-Scan方法。这样的方法是本领域中公知的。
如本文中使用的，术语“生物学样品”意指来源于患者的生物学样品，优选所述生物学样品是指在执行本发明方法之前从受试者身体移除的活检样品。
在一种实施方式中，所述CSC癌选自包含包括急性髓细胞白血病和急性淋巴细胞白血病的白血病、乳腺癌、包括胶质母细胞瘤的神经胶质瘤、结肠直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、膀胱癌或胃癌的组，或由包括急性髓细胞白血病和急性淋巴细胞白血病的白血病、乳腺癌、包括胶质母细胞瘤的神经胶质瘤、结肠直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、膀胱癌或胃癌组成的组。
在一种优选的实施方式中，所述CSC癌为神经胶质瘤、乳腺癌、急性淋巴细胞白血病或急性髓细胞白血病。
本发明的第五个目的涉及O-乙酰化的-GD2神经节苷脂作为CSC癌的生物标志物的用途。
术语“O-乙酰化的-GD2神经节苷脂”是指来源于GD2神经节苷脂的神经节苷脂并且对应于9(7)-O-乙酰基-GD2。
本发明的第六个目的涉及用于预测患有CSC癌的受试者对于用本发明的抗体或组合物的治疗的相应的方法，其中所述方法包含检测所述受试者的生物学样品中表达O-乙酰化的-GD2神经节苷脂的细胞的存在。
在一种实施方式中，本发明涉及用于预测患有CSC癌的受试者对于用本发明的抗体或组合物的治疗的相应的是方法，其中所述受试者的生物学样品中表达O-乙酰化的-GD2神经节苷脂的细胞与所述受试者是对所述治疗的应答者的良好可能性相关。
在更特定的实施方式中，本发明涉及所述方法，其中所述方法包括检测所述的受试者的生物学样品中所有癌症干细胞中的表达O-乙酰化的-GD2神经节苷脂的癌症干细胞的水平。
在一种优选的实施方式中，在所述受试者的生物学样品中的所有癌症干细胞中，如果存在至少10％，尤其是至少30％，优选至少50％水平的在其表面处表达O-乙酰化的-GD2神经节苷脂的癌症干细胞，则与所述受试者是对所述治疗的应答者的高度可能性相关。
在一种实施方式中，所述生物学样品是癌症样品，优选CSC癌样品。
在一种实施方式中，所述CSC癌选自包含白血病(包括急性髓细胞白血病和急性淋巴细胞白血病)、乳腺癌、神经胶质瘤(包括胶质母细胞瘤)、结肠直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、膀胱癌或胃癌的组或由白血病(包括急性髓细胞白血病和急性淋巴细胞白血病)、乳腺癌、神经胶质瘤(包括胶质母细胞瘤)、结肠直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、膀胱癌或胃癌组成的组。
在一种优选的实施方式中，所述CSC癌为神经胶质瘤、乳腺癌、急性淋巴细胞白血病或急性髓细胞白血病。
在本发明的一种实施方式中，所述方法包括通过非侵袭性方法(如利用体内成像剂来成像)来检测患者体内表达O-乙酰化的-GD2神经节苷脂的细胞的存在。这样的方法是本领域中公知的。
实施例
接下来，将参照氨基酸序列、核酸序列和实施例更加详细地描述本发明。然而，实施例的细节并不是意在限制本发明。而是，本发明适用于包含在本文实施例中没有明确提到的细节，但本领域不需过度劳动就能够发现的任何实施方式。
·神经胶质瘤
神经胶质瘤中OAcGD2神经节苷脂的表达的评价
o胶质母细胞瘤活检中的OAcGD2表达
发明人利用免疫组织化学(IHC)评价了在22个胶质母细胞瘤样品中O-乙酰化的GD2神经节苷脂(OAcGD2)的表达。图1中示出了用于诊断的免疫组织化学染色的一个实例，其中针对OAcGD2抗原对组织进行染色。
肿瘤(胶质母细胞瘤)的样品获自手术切片。去除组织样品(体积≤0.5cm3)并在冷却至液氮温度的异戊烷中冷冻。60秒后，除去并转移样品，将其保持在-70℃。利用低温恒温器(cryostat)操作10μm的切片。在载玻片SuperfrostGold+(VWR)上收集切片并风干3分钟。将其固定在丙酮(-20℃)中10分钟并再次风干。然后将切片在-20℃下储存直至使用。
利用生物素化的-山羊抗-小鼠抗体，之后是抗生蛋白链菌素-生物素-过氧化物酶复合物和DAB底物的分步孵育来检测抗体8B6免疫反应性。病理学家通过用光学显微设备来分析试样，并相比于作为阳性对照的人神经母细胞瘤冷冻切片将其分类为阴性、1+、2+或3+，并且将组织与作为阴性对照的无关的IgG3抗体一起孵育。表2中总结了结果。
表2.(ND：未确定)
他们发现，用抗-OAcGD2单克隆抗体(mAb)8B6阳性染色的所有样品的IHC评分范围为1+至3+。对于22样品中的16个样品，100％肿瘤细胞在该肿瘤中是阳性的。
o神经胶质瘤细胞系和原代细胞中的OAcGD2表达
通过流式细胞术分析来确定U87MG人胶质母细胞瘤细胞中CD133和OAcGD2的表达谱。将细胞与特异于OAcGD2的亲代小鼠mAb8B6和CD133-FITC抗体对一起进行染色。在冰冻PBS中洗涤细胞3次，用mAb8B6(10μg/ml，在PBS-BSA1％中)于4℃孵育30分钟。在冰冻PBS中洗涤3次之，用与FITC缀合30分钟的山羊抗-小鼠二抗的F(ab)’2片段检测一抗结合抗体。洗涤后，用CD133-APC缀合的抗体在4℃孵育细胞30分钟。用冰冻PBS洗涤细胞3次后，用FACSCalibur细胞计数器(BD)利用CellQuestPro软件(BD)来分析细胞。同种型-匹配抗体用作阴性对照。在细胞系中测量至少1×104个事件。
利用流式细胞术，发明人还与检测了人神经胶质瘤细胞系(3/3)和人原代神经胶质瘤细胞(12/12)的表面上的OAcGD2抗原。对于人神经胶质瘤细胞系，OAcGD2-阳性细胞的比率(rate)范围为61％至85％(图2，表3)。
他们还观察到在这些神经胶质瘤细胞系中存在CD133+OAcGD2+CSCs，以及在CD133-阳性细胞中，OAcGD2-阳性细胞的比率为约85至98％。
对于人原代胶质瘤细胞，OAcGD2-阳性细胞的比率范围为32至94％。他们还观察到在原代神经胶质瘤细胞中存在CD133+OAcGD2+CSCs，以及在CD133-阳性细胞中，OAcGD2-阳性细胞的比率为约62至100％(表3)。
表3.在胶质瘤细胞群中，OAcGD2+、CD133+和OACGD2+CD133+(在CD133+细胞中OAcGD2+细胞的百分比)。
结果证实了胶质母细胞瘤活检上获得的那些在胶质瘤原代细胞中具有强OAcGD2表达而且在胶质瘤细胞系中也具有强OAcGD2表达，此外，这些胶质瘤原代细胞和胶质瘤细胞系中对CSC(CD133+)的检索使得能够鉴别不同百分比的这种CSC(CD133+)。现在，出人意料的是，相比于非CSC，结果示出了OAcGD2表达在这些CSC中是增加的。举例而言，对于CSC而言，阳性OAcGD2细胞的百分比是非CSC(数据未示出)的两倍。
最后，结果表明，OAcGD2在富含于神经胶质瘤的CSC中并且能够用于促进靶向这些细胞。
8B6mAb对于表达OAcGD2的神经胶质瘤细胞的影响。
将U87-MG肿瘤细胞(5×105细胞)接种到平底12-孔板中并在37℃，5％CO2条件下用mAb8B6或对照-IgG3抗体孵育24小时。用配有LEICA164显微镜的LEICADFC295数码相机使细胞培养物成像。
24小时孵育期之后，在相差显微镜下以相同的放大率×200观察通过形态变化评价的细胞凋亡。箭头表示凋亡细胞。
用mAb8B6进行的治疗引起U87MG细胞形态发生变化。用mAb8B6孵育的细胞为球形并形成小泡(bleb)，其松散贴附于培养容器底部或漂浮在培养基中。将细胞隔离成具有细胞凋亡特种那个的若干片段(图3)。在U87-MG细胞中，能够推测CSC(其细胞表达最高百分比的OAcGD2)在细胞凋亡之后死亡。
在体内模型中8B6mAb对胶质母细胞瘤的影响
在法国农业部的委托下，在动物保护和利用方案(InstitutionalAnimalCareandUseProtocol)的批准下根据可适用的欧洲动物福利(EuropeanAnimalWelfare)规定在南特大学(UniversityofNantes)动物系照料和保持雌性裸(nu/nu)无胸腺小鼠(HarlanLaboratories)。
将U251细胞悬液的等分试样(3×106细胞/100μl，含有等体积的RPMI和基质胶)皮下移植到小鼠左侧腹上。一周之后，在所有原始注射的小鼠中出现肿块，然后将其随机分为三个相等组并开始抗体治疗。将抗-OAcGD2mAb8B6配制成磷酸盐缓冲盐水溶液并静脉内注射。一组用一次注射500μgmAb8B6来处理，同时对照组仅用作为载体的等体积PBS处理。第三组用作为阴性对照的同种型-匹配mAb进行处理。通过卡尺来测量肿瘤，根据如下公式来计算肿瘤体积：长度×宽度2×π/6。
发明人发现，抗-OAcGD2mAb在小鼠中抑制人胶质母细胞瘤生长(图4)。当肿瘤体积达到100mm3时，用500μg的mAb8B6或对照-IgG3mAb对小鼠进行注射并且随后使肿瘤生长。较之载体和对照IgG3-处理的小鼠，抗体8B6抑制人U251胶质母细胞瘤生长。抗体注射后68天，在载体和对照IgG3-处理组中，肿瘤体积分别平均为23±236mm3和405±176mm3。相对而言，mAb8B6治疗抑制U251肿瘤生长，其平均肿瘤体积为254±142mm3。这证实了治疗的特异性，因为用当量的非-特异性IgG3抗体的治疗仍然无效。最后，这还证明了，在用8B6处理的小鼠中没有CSC能够被鉴别(数据未示出)。
因此，结果证明了抗-OAcGD2抗体能够减少体内CSC细胞，这种减少与肿瘤生长明确且强相关。
·乳腺癌
乳腺癌中OAcGD2神经节苷脂表达的评价
o乳腺癌组织中的OAcGD2表达
发明人用8B6单克隆抗体实施了初步的免疫组织化学分析以评价OAc-GD2在固定的甲醛石蜡包埋的癌组织中的表达。
现在，他们构建了25个染色的乳腺癌活检，18的样品染色呈阳性，1个样品显示出弱染色(评分1+)，9个样品显示出中等染色(评分2+)，以及8个样品显示出强染色(评分3+)。
乳腺癌组织和OAcGD2之间的这种强相关性通过在气体乳腺癌组织的28个冷冻切片上进行的其他免疫化学分析得到了证实。对于该系列试验，所有样品针对OAcGD2均呈阳性染色。
因此，OAcGD2能够被用作乳腺癌的标志物。
oOAcGD2在乳腺癌细胞系中的表达
已经在乳腺癌细胞系SUM159中评价了OAcGD2表达。在三次荧光染色之后通过流式细胞术分析来确定OAcGD2在人乳腺癌干细胞中的表达谱。用一抗8B6、14G2a和7H2(以10μg/ml)在冰上在PBS-BSA1％中孵育细胞45分钟。在冰冻PBS中洗涤3次后，用Alexa568山羊抗-小鼠IgG(H+L)(LifeTechnologies)在冰上检测一抗结合抗体45分钟。接着，将细胞固定于PFA4％10分钟，然后用与FITC缀合的抗-CD24和与APC(BD)缀合的抗-CD44孵育25分钟。洗涤后，用LSRII流式细胞仪(BD)利用FlowJo软件(BD)对细胞进行分析。在细胞系中测量至少1×104个事件。
发现大约35％的细胞表达OAcGD2(8B6抗体)，而仅有接近15％的细胞表达GD2神经节苷脂(14G2a抗体)。这样的不同表达在另一种乳腺癌细胞系(HMLE，数据未示出)得到了证实。然后，我们评价了细胞系SUM159中CD44+CD24-/低细胞的比例，并且显示出94％的该细胞表现出CSC表型。如果CSC中OAcGD2阳性细胞的百分比与在SUM159中确定的非-CSC相当，则这样的百分比显示出在另一种乳腺癌细胞系(HMLE，数据未示出)中高5倍。因此，对于在神经胶质瘤中获得的结果，OAcGD2在乳腺癌的CSC中富集并且能够用于促进这些细胞的靶向。此外，这些结果非常有趣，因为其能够设想相对于靶向GD2治疗，靶向OAcGD2治疗的治疗效力。事实上，靶向较小百分比的表达GD2的细胞并不能确保限制相关癌症的扩散。
用8B6抗体对乳腺癌细胞的存活率抑制
发明人用抗-OAcGD2和抗-GD2抗体在乳腺癌SUM159细胞系上实施了细胞增殖测定。
在37℃将104个SUM159细胞(100μL)于96-孔微板中孵育24小时。加入来自50μL培养基中的80-1.25μg/mL抗体并在37℃孵育24小时。向每个孔中加入50μg的MTT并在37℃孵育至少4小时，之后用10％SDS溶解细胞以中止MTT染料的细胞转化并在37℃下O.N.孵育。然后在570nm和650nm处读取吸光度。570nm处的吸光度减去650nm处产物的吸光度(Abs570–Abs650)来计算染料的总转化率。用20μg依托泊苷处理的四个对照孔提供了给出0％存活率的吸光度空白。存活率(％)被表示为相对于未处理细胞的百分比，并且每个值表示为一式四份的平均±SEM。
8B6抗体在该细胞系上诱导的直接细胞毒性达到30％的存活率抑制(图5)。
·肺癌
小细胞肺癌中OAcGD2神经节苷脂表达的评价
o肺癌细胞系中的OAcGD2表达
在肺癌H196细胞系中评价了OAcGD2表达。在双重荧光染色之后，通过流式细胞术分析OAcGD2在人肺癌症干细胞中的表达谱。用一抗8B6、10B8和7H2(以10μg/ml)在冰上在PBS-BSA1％中孵育细胞45分钟。在冰冻PBS中洗涤3次之后，用与山羊抗-小鼠IgG(H+L)(JacksonResearch)缀合的FITC在冰上检测一抗结合抗体45分钟。接着，将细胞固定于PFA4％10分钟，然后用具有与APC的抗-CD133缀合物(MiltenyiBiotec)孵育25分钟。洗涤后，用ACScalibur流式细胞仪(BD)利用CellQuest软件(BD)来分析细胞。在细胞系中测量至少1×104个事件。
图6中示出了上述结果。
结果再次示出了OAcGD2的表达和CD133的表达与超过50％的表达OAcGD2的CSC细胞相关。这些细胞中GD2的表达稍高于阴性对照(即，7％)。
而且，OAcGD2在小细胞肺癌的CSC中富集并且能够促进这些细胞的靶向。
·白血病
发明人利用8B6单克隆抗体实施了初步间接免疫荧光分析以评价OAc-GD2在急性淋巴细胞白血病(ALL)和急性髓细胞白血病(AML)中的表达。
所测试的ALL细胞系中的两个呈阳性。来自患者的一个AML样品也呈阳性。

Claims (24)

1.用于治疗癌症干细胞(CSC)癌的识别O-乙酰化的-GD2神经节苷脂的抗体，或其功能性片段，所述抗体包含：
a)轻链，至少包含来自免疫球蛋白的轻链可变区框架和由序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3限定的三个互补决定区(CDRs)，其中序列SEQIDNO:1限定CDR-L1，SEQIDNO:2限定CDR-L2，SEQIDNO:3限定CDR-L3，和/或
b)重链，至少包含来自免疫球蛋白的重链可变区框架和由序列SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6限定的三个互补决定区(CDRs)，其中序列SEQIDNO:4限定CDR-H1，SEQIDNO:5限定CDR-H2，SEQIDNO:6限定CDR-H3。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中，所述抗体为权利要求1所述抗体的功能性片段，其中所述片段选自包含Fab、Fab'、F(ab')2、Facb、Fd、scFv、包括VHH片段和人VH片段的双价抗体和单价抗体的组或由Fab、Fab'、F(ab')2、Facb、Fd、scFv、包括VHH片段和人VH片段的双价抗体和单价抗体组成的组。
3.根据权利要求1所述的抗体，其中，所述抗体为嵌合抗体或人源化抗体。
4.根据权利要求1或3所述的抗体，其中，所述抗体包含包括氨基酸序列SEQIDNO:7的轻链可变区和包括氨基酸序列SEQIDNO:8的重链可变区。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体，其中，所述CSC癌选自包含以下疾病的组或由以下疾病组成的组：白血病、乳腺癌、神经胶质瘤、结肠直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、膀胱癌或胃癌，其中所述白血病包括急性髓细胞白血病和急性淋巴细胞白血病，所述神经胶质瘤包括胶质母细胞瘤。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体，其中，所述CSC癌包含具有选自包含以下表型的组或由以下表型组成的组中的至少一种表型的细胞：CD34+/CD38-、CD34+/CD19-、CD34+/CD19+、CD34+/CD38+/CD19+、CD34+/CD38-/CD19+、CD133+/CD38-、CD133+/CD19-、白细胞介素-3-受体α+、CD33+、CD44+/CD24-/低、CD44+/CD24-/ESA+、CD44+/CD24低/-lin-/ALDH+、CD133+、A2B5+、SSEA-1+、CD133+/ESA高/CD44+、CD166+、CD26+、CD44+/CD133+/α2β1+、CD44+、Sca+/CD45-/Pecam-/CD34+、ALDH1+/Oct4+/CD133+/ABCG2+/CXCR4+、CD133+/CD44+、EpCAM+/AFP+、EMA-/CD44v6+、CD133+/CD44+/ALDH1+。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体，其中，所述CSC癌包含至少具有CD133+、CD44+/CD24-/低、CD34+/CD38-或CD34+/CD19+表型的细胞。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的抗体，其中，所述CSC癌为乳腺癌、神经胶质瘤、急性髓细胞白血病或急性淋巴细胞白血病。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的抗体，其中，所述CSC癌的特征在于癌症干细胞的亚群中至少10％的癌症干细胞表达所述O-乙酰化的-GD2神经节苷脂。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体，其中，所述抗体用于治疗CSC癌的一种或多种转移和/或用于预防CSC癌的再发或复发。
11.权利要求1至10中任一项所述的抗体和至少一种其他的抗癌化合物作为组合制剂，其分别、同时或相继用于CSC癌治疗中。
12.权利要求1至10中任一项所述的抗体与外科手术、化疗、激素疗法、靶向疗法和/或放疗联合，其分别、同时或相继用于CSC癌治疗中。
13.用于治疗CSC癌的药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1至12中限定的抗体。
14.根据权利要求13所述的药物组合物，其中，所述CSC癌选自包含以下疾病的组或由以下疾病组成的组：白血病、乳腺癌、神经胶质瘤、结肠直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、膀胱癌或胃癌，，其中所述白血病包括急性髓细胞白血病和急性淋巴细胞白血病，所述神经胶质瘤包括胶质母细胞瘤。
15.根据权利要求13至14中任一项所述的药物组合物，其中，所述CSC癌包含具有选自包含以下表型的组或由以下表型组成的组中的至少一种表型的细胞：CD34+/CD38-、CD34+/CD19-、CD34+/CD19+、CD34+/CD38+/CD19+、CD34+/CD38-/CD19+、CD133+/CD38-、CD133+/CD19-、白细胞介素-3-受体α+、CD33+、CD44+/CD24-/低、CD44+/CD24-/ESA+、CD44+/CD24低/-lin-/ALDH+、CD133+、A2B5+、SSEA-1+、CD133+/ESA高/CD44+、CD166+、CD26+、CD44+/CD133+/α2β1+、CD44+、Sca+/CD45-/Pecam-/CD34+、ALDH1+/Oct4+/CD133+/ABCG2+/CXCR4+、CD133+/CD44+、EpCAM+/AFP+、EMA-/CD44v6+、CD133+/CD44+/ALDH1+。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的药物组合物，其中，所述CSC癌包含至少具有CD133+、CD44+/CD24-/低、CD34+/CD38-或CD34+/CD19+表型的细胞。
17.根据权利要求13至16中任一项所述的药物组合物，其中，所述CSC癌为乳腺癌、神经胶质瘤、急性髓细胞白血病或急性淋巴细胞白血病。
18.根据权利要求13至17中任一项所述的药物组合物，其中，所述CSC癌的特征在于癌症干细胞的亚群中至少10％的癌症干细胞表达所述O-乙酰化的-GD2神经节苷脂。
19.根据权利要求13至18中任一项所述的药物组合物，其中，所述药物组合物用于治疗CSC癌的一种或多种转移和/或用于预防CSC癌的再发或复发。
20.权利要求13至19中任一项所述的药物组合物和至少一种其他的抗癌化合物作为组合制剂，其分别、同时或相继用于CSC癌治疗中。
21.权利要求13至19中任一项所述的药物组合物与外科手术、化疗、激素疗法、靶向疗法和/或放疗联合，在CSC癌治疗中分别、同时或相继使用。
22.用于诊断受试者中CSC癌的体外方法，其中，所述方法包括通过(i)确定O-乙酰化的-GD2神经节苷脂的表达来分析获自受试者的生物学样品的步骤，并且其中所述O-乙酰化的-GD2神经节苷脂在所述生物学样品中的表达是CSC癌的指征。
23.O-乙酰化的-GD2神经节苷脂作为CSC癌的生物标志物的用途。
24.用于预测患有CSC癌的受试者对用权利要求1至12中任一项所述的抗体或权利要求13至21中任一项所述组合物进行的治疗的应答的方法，其中，所述方法包括检测所述受试者的生物学样品中表达O-乙酰化的-GD2神经节苷脂的细胞的存在。
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