CN109843928A - 抗O-乙酰化的GD2神经节苷脂（OAcGD2）的人源化抗体 - Google Patents

抗O-乙酰化的GD2神经节苷脂（OAcGD2）的人源化抗体 Download PDF

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Abstract

本发明涉及特异性结合OAcGD2神经节苷脂的抗体、其功能片段和衍生物，及其在诊断和治疗中的用途，所述抗体包括i)具有氨基酸序列SEQ id n° 112的人源化的轻链可变区(VL)多肽；和ii)具有氨基酸序列SEQ id n° 76的人源化的重链可变区(VH)。

Description

抗O-乙酰化的GD2神经节苷脂（OAcGD2）的人源化抗体
本专利申请要求2016年7月15日提交的欧洲专利申请EP16001564.0的优先权，其通过引用并入本文。
技术领域
本发明提供了新抗体及其在癌症治疗和诊断中的用途。
背景技术
GD2，一种二唾液酸神经节苷脂，是在胎儿中表达的癌胚抗原，其也存在于神经干细胞和间充质干细胞中。
神经节苷脂GD2也是在包括神经母细胞瘤、神经胶质瘤、视网膜母细胞瘤、尤文氏肿瘤家族、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、小细胞肺癌和黑素瘤的广谱人类癌症和干细胞中发现的肿瘤相关表面抗原。然而，它也存在于干细胞、神经元、一些神经纤维和皮肤基底层中。
在此基础上，抗GD2的抗体达妥昔单抗(dinutuximab，UNITED THERAPEUTICS) 已获得FDA和EMA的批准，并且最近抗体达妥昔单抗β(APEIRON)最近已获得EMA 授权，它们两者都用于治疗神经母细胞瘤。然而，在85％的患者中，达妥昔单抗联合粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素2(IL-2)和异维A酸(RA)引起严重的副作用，特别是强烈的神经性疼痛(尽管用镇痛药，包括硫酸吗啡输注预处理)，严重的感觉和与GD2在神经和脑细胞上的表达有关的运动神经病变。当与使用异维A 酸的标准治疗相比，严重(3级)疼痛的发生为52％的患者对5％的患者。还报道了对中枢神经系统的毒性，这对临床医生来说是令人担忧的。现在，由于其神经毒性，其用途仅限于儿科患者的高风险神经母细胞瘤。
这种靶向毒性对患者的生活质量非常不利，限制了抗GD2疗法的功效，并且损害了靶向GD2阳性癌症的下一代免疫疗法的发展。尽管神经母细胞瘤治疗取得了重大进展，但高风险NB与差的预后有关，并且强烈需要更有效和毒性更小的药物和策略来治疗NB和其他癌症。
先前已经证明了修饰形式的GD2，即O-乙酰化的GD2神经节苷脂(OAcGD2)，与GD2相比具有更安全的表达模式，在外周神经、脑垂体或人脑细胞中没有表达，但是如GD2一样，OAcGD2在肿瘤上表达。结果，在国际专利申请PCT WO 2008/043777 中已经显示，靶向该OAcGD2的小鼠治疗性抗体(8B6)的施用与任何神经毒性无关，特别是由于该癌抗原在健康的细胞上，尤其在外周神经上没有表达。首先产生了一种名为c8B6的人-鼠嵌合抗体。该特异性抗体既不显示与GD2的交叉反应，也不显示与其他神经节苷脂的交叉反应，但显示正常脑组织中不存在OAcGD2抗原表达。在动物模型中，抗OAcGD2嵌合抗体显示出与抗GD2单克隆抗体(mAb)相似的抗肿瘤活性，同时避免了其毒性，表明OAcGD2是比GD2更好的肿瘤相关抗原，并且抗OAcGD2 mAb是最好的一种抗体，其能够减少通常与抗GD2 mAb疗法相关的令人不适的副作用，并改善患者的生活质量。然而，嵌合抗体可能引起免疫原性并降低抗OAcGD2效率。可通过产生“人”、“人源化”或“人工程化”抗体来克服该问题。现在，需要人源化的抗OAcGD2抗体。
对于在人类治疗中的用途，人源化抗体通常比小鼠，或在一些情况下嵌合抗体，具有至少三种潜在优势：
(1)因为效应部分是人的，所以它可与人免疫系统的其他部分更好地相互作用(例如，通过补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)更有效地破坏靶细胞)；
(2)人体免疫系统不会将人源化抗体的骨架或恒定区识别为外源物，因此针对这种注入抗体的抗体应答应小于完全外源的小鼠抗体或部分外源的嵌合抗体；
(3)已报道了注入的小鼠抗体在人体循环中的半衰期比人抗体的半衰期短得多。注入的人源化抗体可能会具有与天然存在的人抗体更相似的半衰期，从而允许给予更小和更低频率的剂量。
然而，人源化抗体的获得并非如此简单，因为人源化过程大多数情况下导致抗原结合亲和力丧失和/或特异性丧失。由于CDR区赋予抗原亲和力和特异性，因此修饰这些区域以降低潜在的免疫原性可能是有问题的。
因此，必须设计抗体人源化以保留抗体对抗原的特异性和亲和力，同时产生在人中具有最小免疫原性的分子。
现在，这个过程非常复杂，以至于获得这种人源化抗体从未明显。
发明内容
现在，本发明的发明人出人意料地表明，只有特定的替换才能维持结合亲和力，无论抗体的免疫原性是否得到改善或潜在改善。因此，本发明的发明人提供了具有这种替换的新型人源化抗OAcGD2抗体(OGD201)。
因此，本发明涉及特异性结合OAcGD2神经节苷脂的抗体、其功能片段和衍生物，所述抗体包括：
a)具有氨基酸序列SEQ id n°112的人源化的轻链可变区(VL)多肽；和
b)具有氨基酸序列SEQ id n°76的人源化的重链可变区(VH)。
本发明还涉及药物组合物，所述药物组合物包括至少一种这种抗体，和药学上可接受的载体。
另外，本发明涉及一种用于治疗和/或预防表达OAcGD2的癌症的方法，该方法包括向有需要其的患者提供包括至少一种所述抗体或至少一种其功能片段或衍生物的这种药物组合物。
本发明涉及一种包括至少一种这种抗体或至少一种这种其功能片段或衍生物的药物组合物，所述药物组合物用于治疗和/或预防表达OAcGD2神经节苷脂的癌症的方法中。
本发明涉及一种诊断受试者中表达OAcGD2神经节苷脂的癌症的方法，该方法包括下述步骤：使所述受试者的生物样品接触至少一种如本文所述的抗体、其功能片段或衍生物，以确定所述生物样品中OAcGD2神经节苷脂的表达水平，其中可检测的 OAcGD2的表达水平指示这种癌症。
最后，本发明涉及一种用于诊断受试者中表达OAcGD2神经节苷脂的癌症的试剂盒，该试剂盒包括至少一种这种抗体，或至少一种这种其功能片段或衍生物。
附图说明
图1显示了与小鼠抗体相比，VH人源化的抗OAcGD2(8B6 VL)mAb对IMR5细胞的结合滴定试验。
图2显示了与小鼠抗体相比，VL人源化的抗OAcGD2(8B6 VH)mAb对IMR5细胞的结合滴定试验。
图3显示了与小鼠抗体相比，VH-VL人源化的抗OAcGD2 mAb对IMR5细胞的结合滴定试验。
具体实施方式
在第一方面中，本发明涉及特异性结合OAcGD2神经节苷脂的抗体、其功能片段和衍生物，所述抗体包括：
a)具有氨基酸序列SEQ id n°112的人源化的轻链可变区(VL)多肽；
b)具有氨基酸序列SEQ id n°76的人源化的重链可变区(VH)。
在第一优选实施方式中，人源化的轻链可变区(VL)多肽选自包括VL30BH(SEQ idn°134)和VL28Bs01/A2(SEQ id n°135)的组中。
优选地，人源化的重链可变区(VH)多肽选自包括VH72Bmax(SEQ id n°131)、VH49B(SEQ id n°132)和VH49Bmax(SEQ id n°133)的组中。
事实上，本发明的发明人出人意料地确定，VH72Bmax、VH49B、VH49Bmax、 VL30BH和VL28Bs01/A2具有与其小鼠对应物相当的结合亲和力以及弱的免疫原性。
在第二优选实施方式中，人源化的轻链可变区(VL)多肽选自包括VL1(SEQ id n°8)、VL2(SEQ id n°9)、VL3(SEQ id n°10)、VL4(SEQ id n°11)、VL28BH(SEQ id n°140)、VL30BH(SEQ id n°134)和VL28Bs01/A2(SEQ id n°135)的组中。
优选地，人源化的重链可变区(VH)多肽选自包括VH1(SEQ id n°3)、VH2(SEQ idn°4)和VH3(SEQ id n°5)、VH72BCDR(SEQ id n°136)、VH72BH(SEQ id n°137)、 VH49BCDR(SEQ id n°138)、VH49BH(SEQ id n°139)、VH72Bmax(SEQ id n°131)、 VH49B(SEQ id n°132)和VH49Bmax(SEQ id n°133)的组中。
事实上，本发明的发明人出人意料地确定，所有这些序列都显示出与其小鼠对应物相当的结合亲和力以及弱的免疫原性。
抗体是对应于四聚体的免疫球蛋白分子，所述四聚体包括通过二硫键相互连接的四条多肽链、两条相同的重(H)链(当全长时约50-70kDa)和两条相同的轻(L)链(当全长时约25kDa)。轻链分为κ和λ。
如本文所用，术语“抗体”指单克隆抗体本身。
每条重链由N-末端重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由IgG的三个结构域(CH1、CH2和CH3)，以及CH1和CH2结构域之间的铰链结构域组成。
每条轻链由N-末端轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，散布有更保守的区域，称为骨架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、 FR4。每个结构域的氨基酸的编号是根据众所周知的编号系统，包括IMGT、Kabat和 Chothia系统(IMGT，国际免疫遗传学信息系统LEFRANC等，Nucleic Acids Research，vol.27，p：209-212，1999；KABAT，sequences ofProteins of Immunological Interest，5th edition.U.S Department of Health andHuman Services，Public Health Service，National Institutes of Health，NIHpublication，No91-3242，991；CLOTHIA&LESK，J Mol Biol.，vol.196(4)，p：901-917，1987)。抗体结合特定抗原的功能性能力取决于每个轻/ 重链对的可变区，并且很大程度上由CDR决定。
根据另一个优选实施方式，人源化的轻链可变区(VL)多肽是氨基酸序列SEQ idn°29。
根据另一个优选实施方式，人源化的轻链可变区(VL)多肽是氨基酸序列SEQ idn°7。
根据另一个优选实施方式，人源化的重链可变区(VH)多肽是氨基酸序列SEQ idn°12。
根据另一个优选实施方式，人源化的重链可变区(VH)多肽是氨基酸序列SEQ idn°2。
如本文所用的术语“功能片段”指特异性结合OAcGD2神经节苷脂的抗体片段。这种片段可由技术人员简单地鉴定，并且包括，例如，ScFv片段、Fab片段(例如，通过木瓜蛋白酶消化)、Fab′片段(例如，通过胃蛋白酶消化和部分还原)、F(ab′)2片段(例如，通过胃蛋白酶消化)、Facb(例如，通过纤溶酶消化)，并且Fv和Fd(例如，通过胃蛋白酶消化、部分还原和再聚集)片段也包括在本发明中。
这些片段可使用本领域熟知的方法通过酶促切割、合成或重组技术产生，比如STANWORTH等(Handbook of Experimental Immunology，vol.1，chapter 8， BlackwellScientific Publications，1978)中所述。还可使用已经在天然终止位点的上游引入了一个或多个终止密码子的抗体基因产生多种截短形式的抗体。例如，编码F(ab′)2重链部分的组合基因可设计为包括编码重链的CH1结构域和/或铰链区的 DNA序列。抗体的各个部分可通过常规技术化学连接在一起，或可使用基因工程技术制备成连续蛋白质。
表述“特异性结合O-乙酰化的GD2神经节苷脂”指在25℃下对O-乙酰化的 GD2神经节苷脂的结合亲和力(Kd)小于5×10-6M，优选Kd等于或小于5×10-7M，更优选Kd等于或小于1×10-7M或甚至5×10-8M。这种亲和力可简单通过本领域可获得的技术测量，例如斯卡查德(Scatchard)试验、竞争性ELISA、BIACORE试验或KINEXA试验。
表述“特异性结合O-乙酰化的GD2神经节苷脂”指在25℃下对GD2神经节苷脂的结合亲和力(Kd)大于5×10-5M，优选地对GD2神经节苷脂的Kd大于10-5M。
现在，这些片段至少包括前述重链和轻链的可变区。
这些片段可为可溶的，但也可作为嵌合抗原受体(CAR)的单链可变部分锚定在细胞质膜内。
如本文所用，术语“嵌合抗原受体(CAR)”指包括抗体的至少一个抗原结合结构域和至少一个效应细胞信号转导结构域的人工杂合多肽。这种CAR包括将人工特异性移植到特定免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞和NKT细胞)上的工程受体。CAR可用于以非MHC限制的方式将单克隆抗体的特异性赋予T细胞上，从而利用单克隆抗体的抗原结合特性。当在T细胞中表达时，CAR识别未加工的抗原而不依赖于它们的主要组织相容性抗原的表达，这与生理性T细胞受体(TCR) 不同，因此绕过两种主要的肿瘤逃逸机制、HLA表达的下调或蛋白酶体抗原加工。 CAR与特定抗原的结合引发免疫应答。
在特定方面，CAR包括胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。现在，该排列可为多聚体的，比如双抗体或也可为多聚体(例如，国际专利申请PCT WO 2016/016343中描述的多链嵌合抗原受体)。
胞外结构域对应于抗原结合结构域和间隔结构域(茎区)。抗原结合结构域优选为单链可变片段(scFv)。这种scFv是基因工程抗体片段，其通常由免疫球蛋白的重链和轻链或其部分比如VH和VL，通过柔性肽接头PLUCKTHUN连接在一起组成，如(The Pharmacologyof Monoclonal Antibodies，vol.113，Rosenburg and Moore eds.，Springer-Verlag，NewYork，p：269-315，1994)中所公开。柔性肽接头可为6 至40个氨基酸残基的肽。使用小氨基酸比如丙氨酸和甘氨酸可用于产生柔性接头。示例性的柔性接头包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物，比如例如(GS)n、 GSGGSn(SEQ id n°113)n、GGGSn(SEQ id n°114)n和GGGGSn(SEQ id n°115)n，其中n为至少一个甘氨酸-丙氨酸聚合物或甘氨酸-丝氨酸聚合物，或本领域已知的其他柔性接头的整数。作为可用的聚合物的例子，可参考GGGGSGGGGSGGGGS ((G4S)3；SEQ id n°116)、GSTSGSGKPGSGEGSTKG(CD19接头；SEQ id n°117)、 GGSSRSSSSGGGGSGGGG(18mer；SEQ id n°118)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS ((G4S)；SEQid n°119)、KESGSVSSEQLAQFRSLD(SEQ id n°120)、 EGKSSGSGSESKST(SEQ id n°121)、GSAGSAAGSGEF(SEQ id n°122)、 GGGGGGGG(SEQ id n°123)或GGGGGG(SEQ id n°124)。最后，这些scFv片段可通过本领域技术人员熟知的方法获得，比如GILLILAND等人描述的方法(Tissue Antigens，vol.47，p：1-20，1996)。如本文所用，术语“茎区”也称为“间隔或铰链结构域”，指用于将跨膜结构域连接到胞外结构域的任何寡肽或多肽。具体地，茎区用于为胞外结构域提供更大的灵活性和可接近性。间隔元件在CAR中起主要的结构作用。间隔区物理上将靶向部分与T细胞膜分离。每种抗原的所需的最佳距离可能不同。为了实现有效的靶访问，如果CAR结合靠近靶细胞膜的表位，或当抗原的大小和糖基化状态复杂时，似乎需要间隔区。通常使用人IgG衍生的间隔区(铰链-CH2-CH3)，因为它们对CAR表达具有稳定作用，但间隔区的Fc结构域与骨髓细胞上的Fc γ受体(FcgR)之间的相互作用可导致T细胞的活化诱导的细胞死亡和体内有限的持久性。这可通过如下来克服：删除或修饰对于FcgR结合必需的恒定重链(CH)2结构域的区域，从而在临床前模型中改善体内CAR T细胞持久性和抗肿瘤活性。通常使用的其他铰链结构域包括衍生自CD28或CD8的那些或来自人IgG衍生的间隔区的其他截短的片段。在优选的实施方式中，CAR包括胞外结构域和跨膜结构域之间的茎区。茎区可包括多达300个氨基酸，优选10至 100个氨基酸，最优选25至50个氨基酸。该茎区可源自天然存在的分子的全部或部分，例如CD8、CD4或CD28的细胞外区域的一部分，或源自抗体恒定区的全部或部分。可选地，该茎区可为合成的序列。
跨膜结构域为膜锚定结构域，并且也为胞外结构域和胞内结构域之间的接头。该跨膜结构域可为人IgG4Fc铰链区、Fc区、CD4跨膜结构域、T细胞受体跨膜、或来自其他人跨膜信号转导蛋白的其他跨膜结构域，比如CD16、TCR Zeta链 (CD3ζ)、CD28和CD8，和促红细胞生成素受体及其突变体。优选地，该跨膜结构域为T细胞受体跨膜结构域。优选地，T细胞受体跨膜结构域源自由能够与T细胞受体抗原(TCR)形成复合物的跨膜蛋白。优选地，T细胞受体跨膜结构域包括TCR Zeta链(CD3ζ)、CD28、OX40/CD134、4-1BB/CD 137/TNFRSF9、FcεRIγ、 ICOS/CD278、ILRB/CD122，IL-2RG/CD132，CD27，DAP10和CD40中的一种或多种的一部分或全部。
胞内结构域为细胞内信号转导结构域，其在胞外结构域与靶抗原结合后负责细胞内信号转导，导致免疫细胞的活化。换句话说，细胞内信号转导结构域负责激活其中表达嵌合受体的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。术语“效应子功能”指T细胞的特化功能，其可为细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“细胞内信号转导结构域”指转导效应子功能信号并指导细胞执行特化功能的蛋白质部分。虽然通常使用整个细胞内信号转导结构域，但在许多情况下，不必使用整个细胞内多肽。在可使用细胞内信号转导结构域的截短部分的程度上，可使用这种截短的部分代替完整的链，只要它仍然转导效应子功能信号即可。因此，术语细胞内信号转导结构域指包括足够转导效应子功能信号的细胞内信号转导结构域的任何截短部分。
用于多链CAR的信号转导结构域的优选例子可为Fc受体或T细胞受体和共同受体的细胞质序列，其协同作用以在抗原受体参与后启动信号转导，以及这些序列和具有相同的功能性能力的任何合成序列的任何衍生物或变体。信号转导结构域包括两种不同类型的细胞质信号序列，即启动抗原依赖性初级活化的那些，以及以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的那些。初级细胞质信号转导序列可包括信号转导基序，其被称为ITAM的基于免疫受体酪氨酸的活化基序。ITAM是明确定义的信号基序，其存在于多种受体的胞质内尾部中，其充当 syk/zap70类酪氨酸激酶的结合位点。用于本发明的ITAM的例子可包括作为非限制性例子的衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD36、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。在一个优选实施方式中，多链CAR的信号转导结构域可包括CD3ζ信号转导结构域，或FcεRIβ或γ链的胞质内结构域。
在具体的实施方式中，本发明的多链CAR的信号转导结构域包括共刺激信号分子。共刺激分子为除抗原受体或其配体之外，有效免疫应答所需要的细胞表面分子。
“共刺激配体”指抗原呈递细胞上的分子，其特异性结合T细胞上的同源共刺激分子，从而提供除了由例如结合具有负载肽的MHC分子的TCR/CD3复合物提供的主要信号之外、介导T细胞应答(包括但不限于增殖激活、分化等)的信号。共刺激配体可包括但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、 4-1BBL、OX40L、诱导型共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM、CD30L、 CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、 ILT3、ILT4)、结合Toll配体受体的激动剂或抗体以及与B7-H3特异性结合的配体。共刺激配体也尤其包括与T细胞上存在的共刺激分子，比如但不限于CD27、CD28、 4-IBB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、DAP-10、淋巴细胞功能相关抗原 -1(LFA-1)、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体特异性结合的抗体。
“共刺激分子”指T细胞上的同源结合伴侣，其特异性结合共刺激配体，从而介导细胞的共刺激应答，例如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于MHC I 类分子、BTLA和Toll配体受体。共刺激分子的例子包括CD27、CD28、CD8、4-IBB (CD137)、OX40、CD30、CD40，PD-1、ICOS、DAP-10、淋巴细胞功能相关抗原 -1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83等特异性结合的配体。
如本文所用，术语“衍生物”指与选自由SEQ id n°：2，3，4，5，7，8，9， 10，11，12，29，40，41，42，43，44，45，46，76和112组成的组中的氨基酸序列具有至少90％、优选至少95％、最优选至少98％(即分别对应于约10、5和2 个氨基酸替换)，优选至少99％(即对应于约1个氨基酸替换)的同一性百分比的氨基酸序列。鉴于其个人知识以及本专利申请的教导，本领域技术人员可简单地认识到这些衍生物。还应理解，天然氨基酸可被化学修饰的氨基酸替换。通常，这种化学修饰的氨基酸增加了多肽的半衰期。
如本文所用，两条氨基酸序列之间的“同一性百分比”指在要比较的两条序列之间的相同氨基酸的百分比，通过所述序列的最佳比对获得，该百分比完全是统计学的，并且这两条序列之间的差异随机分布在氨基酸序列上。如本文所用，“最佳比对”或“最优比对”指确定的同一性百分比(见下文)最高的比对。两条氨基酸序列之间的序列比较通常通过比较先前根据最佳比对排列的序列来实现；这种比较是在比较的部分上实现的，以便识别和比较相似的局部区域。除了通过手动方式，可通过使用由Smith和Waterman开发的局部同源性算法(Ad.App.Math.， vol.2，p：482，1981)，通过使用由Neddleman和Wunsch开发的全局同源性算法(J. Mol.Biol.，vol.48，p：443，1970)，通过使用由Pearson和Lipmolan开发的相似性方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.85，p：2444，1988)，通过使用这种算法的计算机软件(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、BLAST P、BLAST N、 FASTA、TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI USA)，通过使用MUSCLE多重比对算法(Edgar，Robert C.，Nucleic Acids Research，vol.32， p：1792，2004)实现执行比较的最佳序列比对。为了获得最佳的局部比对，可优选使用BLAST软件和BLOSUM 62矩阵。通过比较最佳比对的这两条序列来确定两条氨基酸序列之间的同一性百分比，氨基酸序列能够包括关于参考序列的添加或缺失，以便获得这两条序列之间的最佳比对。通过确定这两条序列之间的相同位置的数目，并将该数量除以比较的位置的总数，并通过将获得的结果乘以100以得到这两条序列之间的同一性百分比来计算同一性百分比。
本发明的抗体是重组产生的。
抗体可为糖基化的或不是糖基化的，但是优选糖基化的抗体。在优选的实施方式中，本发明的抗体可为低岩藻糖(fucose)。
本发明的抗体包括免疫缀合物。
如本文所用，术语“免疫缀合物”指包括与第二分子，优选免疫调节剂、细胞毒素剂或放射性同位素结合的至少一种抗体、其功能片段或衍生物的缀合物分子。这种免疫缀合物可为抗体药物缀合物(ADC)、免疫细胞因子(ICK)或抗体放射性缀合物(ARC)。现在，该第二分子可为对另一种抗原具有结合特异性的抗体，所形成的免疫缀合物为双特异性抗体，如BiTE(双特异性T细胞衔接体)。所述抗体或其片段与所述第二分子复合或共价结合(例如融合蛋白)。优选地，所述抗体或其片段通过共价键与所述第二分子结合。
本发明的第二方面涉及药物组合物在治疗中的用途，所述药物组合物包括至少一种如本文所述的抗体、其至少一种功能片段或至少一种衍生物，和药学上可接受的载体。
表述“药学上可接受的”指生理上可耐受的分子实体和组合物，并且当施用于人时通常不会产生过敏或类似的不良反应，比如胃部不适、头晕等。优选地，如本文所用，表述“药学上可接受的”指由联邦或州政府的管理机构批准的或在美国药典或其他公认的药典中列出用于动物、更特别是人类。
术语“载体”指与化合物一起施用的溶剂、佐剂、赋形剂或载剂。这种药物载体可是无菌液体，比如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，比如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。
所述组合物可为适于向患者施用的任何药物形式，包括但不限于溶液、悬浮液、冻干粉末、胶囊和片剂。现在，本发明组合物的施用途径优选为肠胃外；如本文所用，术语“肠胃外”包括静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、直肠、阴道、粘膜、鞘内、颅内或瘤内施用。因此，药物组合物含有对于期望注射的制剂是药学上可接受的载体。这些可尤其为等渗的、无菌的、盐水溶液(磷酸二氢钠或磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等，或这些盐的混合物)，或干燥的、尤其是冷冻干燥的组合物，其根据无菌水或生理盐水的情况，在添加后允许构成可注射溶液。合适的药物载体描述于E.W.Martin的“Remington′s PharmaceuticalSciences”中。
最优选地，组合物为适合于向患者静脉内施用的任何药物形式。
本发明的抗体、功能片段或衍生物可溶于缓冲液或水或掺入乳液、微乳液、水凝胶(例如基于PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物的水凝胶)、微球、纳米球、微粒、纳米颗粒(例如聚(乳酸-共-乙醇酸)微粒(例如聚乳酸(PLA)；聚(丙交酯-共-乙醇酸)(PLGA)；聚谷氨酸微球、纳米球、微粒或纳米颗粒)、脂质体或其他盖伦制剂中。在所有情况下，制剂必须在可接受的注射性程度上是无菌的和流动的。它在制造和储存条件下必须是稳定的，并且必须防止微生物比如细菌和真菌的污染作用。
分散体也可在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中和油中制备。在通常的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。
可将本发明的抗体、功能片段或衍生物配制成中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括与无机酸比如例如盐酸或磷酸，或如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等这种有机酸形成的酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)。用游离羧基形成的盐也可衍生自无机碱，比如，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，和如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等这种有机碱。
载体也可为溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油。本发明的抗体也可通过例如聚乙二醇化进行修饰，以增加其生物处理性。
例如，可通过使用涂层比如卵磷脂，在分散的情况下通过维持所需的颗粒尺寸和通过使用表面活性剂，来保持适当的流动性。可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来实现防止微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。
通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝、明胶、多元醇和半衰期增强的共价和非共价制剂，可实现可注射组合物的延长吸收。
肽不稳定或降解的原因很多，包括水解和变性。疏水相互作用可能导致分子凝集在一起(即聚集)。可添加稳定剂以减少或防止这些问题。
稳定剂包括环糊精及其衍生物(参见美国专利号5,730,969)。还可加入合适的防腐剂比如蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、海藻糖、葡聚糖和甘油以稳定最终制剂。选自离子和非离子表面活性剂、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖、D-半乳糖醛酸、海藻糖、葡聚糖、羟乙基淀粉及其混合物的稳定剂可加入到制剂中。添加碱金属盐或氯化镁可稳定肽。还可通过使肽与选自由葡聚糖、硫酸软骨素、淀粉、糖原、糊精和海藻酸盐组成的组中的糖类接触来稳定肽。可加入的其他糖包括单糖，二糖、糖醇及其混合物(例如，葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘露糖醇、木糖醇)。多元醇可稳定肽，并且可与水混溶或水溶。合适的多元醇可为多羟基醇、单糖和二糖，包括甘露醇、甘油、乙二醇、丙二醇、三甲基乙二醇、乙烯基吡咯烷酮、葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖及其聚合物。各种赋形剂也可稳定肽，包括血清白蛋白、氨基酸、肝素、脂肪酸和磷脂、表面活性剂、金属、多元醇、还原剂、金属螯合剂、聚乙烯吡咯烷酮、水解明胶和硫酸铵。
在另一个目的中，如前定义的组合物用于预防和/或治疗受试者中表达 OAcGD2神经节苷脂的癌症的方法中。
如本文所用，术语“受试者”表示哺乳动物，比如啮齿动物、猫科动物、犬科动物或灵长类动物，并且最优选人。
在本发明的上下文中，如本文所用，术语“治疗表达OAcGD2神经节苷脂的癌症”指抑制这种癌细胞的生长。优选地，这种治疗还导致肿瘤生长或转移扩散的消退，即，可测量的肿瘤的尺寸减小。最优选地，这种治疗导致肿瘤完全消退。
所述表达OAcGD2神经节苷脂的癌症选自包括神经母细胞瘤、神经胶质瘤、视网膜母细胞瘤、尤文氏肿瘤家族、肉瘤(即横纹肌肉瘤、骨肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤和纤维肉瘤)、小细胞肺癌、乳腺癌、黑素瘤、转移性肾癌、头颈癌和血液癌(即白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和骨髓瘤)的组中。
本发明的抗体以有效实现预期目的的量包括在所述药物组合物中，并且剂量适合于所选择的施用途径。
“有效量”的缀合物是足够诱导肿瘤生长或转移扩散消退的量。用于施用的剂量可作为各种参数的函数，特别是作为所使用的施用方式、相关病理学或可选地所需治疗持续时间的函数调整。当然，药物组合物的形式、施用途径、剂量和方案自然取决于待治疗的病症、疾病的严重程度、受试者的年龄、体重和性别等。下面提供的有效剂量范围不是为了限制本发明，而是代表优选的剂量范围。然而，如本领域技术人员所理解和确定的，优选的剂量可根据个体受试者调整，而无需过多的实验。
根据一个优选实施方式，抗体、其功能片段或衍生物可通过注射施用，剂量为2至2,000mg/m2的受试者，优选剂量为5至1,000mg/m2，并且最优选的剂量为 10至500mg/m2。
根据另一个优选实施方式，本发明的抗体、其功能片段或衍生物是嵌合抗原受体(CAR)的形式。因此，施用的转导细胞(例如T细胞、NKT细胞或NK细胞) 的量应考虑施用途径，并且应当引入足够数量的转导细胞以实现所需的治疗应答。此外，本文所述组合物中包括的每种活性剂的量(例如，每个待接触的细胞的量或每一定体重的量)可在不同的应用中不同。通常，转导的T细胞的浓度理想地应该足以在被治疗的受试者中提供每m2至少约1×104至约1×109个转导细胞，甚至更理想地，从约1×106或1×107至约5×108个转导细胞，但是可使用以上任一合适的量，例如，大于5×108个细胞，或更低，例如小于1×107个细胞。施用方案可基于完善建立的基于细胞的疗法(参见例如TOPALIAN和ROSENBERG，1987；美国专利号4,690,915)，或可采用交替的连续输注策略。
这些值提供了执业医生在优化用于实施本发明的本发明方法时使用的转导T 细胞范围的一般指导。本文中对这些范围的叙述绝不排除使用更高或更低量的组分，这在特定应用中可能是必要的。例如，实际剂量和时间表可根据组合物是否与其他药物组合物组合施用，或根据药代动力学、药物处置和代谢的个体间差异而变化。本领域技术人员可根据特定情况的紧急程度随时进行任何必要的调整。
本发明的第三方面涉及用于治疗和/或预防受试者中表达OAcGD2神经节苷脂的癌症的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的至少一种抗体、其功能片段或衍生物的步骤。
优选地，受试者指哺乳动物，并且最优选人。
表达OAcGD2神经节苷脂的所述癌症选自包括神经母细胞瘤、神经胶质瘤、视网膜母细胞瘤、尤文氏肿瘤家族、肉瘤(即横纹肌肉瘤、骨肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤和纤维肉瘤)、小细胞肺癌、乳腺癌、黑素瘤、转移性肾癌、头颈癌和血液癌(即白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和骨髓瘤)的组中。
本发明的第四方面涉及用于诊断受试者中表达OAcGD2神经节苷脂的癌症的方法，优选体外方法，该方法包括下述步骤：使所述受试者的生物样品接触至少一种如本文所述的抗体、其功能片段或衍生物，用于测定所述生物样品中的 OAcGD2神经节苷脂的表达水平，其中可检测的OAcGD2神经节苷脂的表达水平指示这种癌症。
优选地，所述受试者指哺乳动物，并且最优选人。
如本文所用，生物样品指可能包括癌细胞的样品，比如血液样品或癌症活组织检查。
表达OAcGD2神经节苷脂的所述癌症选自包括神经母细胞瘤、神经胶质瘤、视网膜母细胞瘤、尤文氏肿瘤家族、肉瘤(即横纹肌肉瘤、骨肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤和纤维肉瘤)、小细胞肺癌、乳腺癌、黑素瘤、转移性肾癌、头颈癌和血液癌(即白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和骨髓瘤的组中。
在优选的实施方式中，本发明的方法进一步包括将所述OAcGD2神经节苷脂的表达与对照进行比较的步骤。
如本文所用，所述“对照”指对应于来自健康受试者的生物样品的细胞的对照样品中的OAcGD2神经节苷脂的表达水平。
在第五方面中，本发明涉及用于诊断受试者中表达OAcGD2神经节苷脂的癌症的试剂盒，该试剂盒包括至少一种如前所述的抗体、功能片段或衍生物，以及向所述受试者施用所述抗体、其功能性片段或其衍生物或所述制剂的最终工具。
如前所述，所述试剂盒的所述抗体、其功能片段或衍生物可指适于通过用于体内方法中的成像技术直接检测的免疫缀合物，用于诊断受试者中表达OAcGD2 神经节苷脂的癌症，例如，包括荧光团或放射性同位素的免疫缀合物，尤其是用于通过成像和监测受试者的应答性进行诊断。
如本文所用，术语“试剂盒”指用于递送材料的任何递送系统。在反应试验的背景下，这种递送系统包括允许将反应试剂和/或支持材料(例如，缓冲液、用于进行测定的书面说明等)从一个位置储存、运输或递送到另一个位置的系统。例如，试剂盒包括一个或多个包括相关反应试剂和/或支持材料的外壳(例如盒子)。如本文所用，术语“分立试剂盒”指包括两个或更多个单独容器的递送系统，每个容器包括总试剂盒组分的子部分。容器可一起或分开地递送到预期的接收者。术语“分立试剂盒”旨在涵盖包括根据联邦食品、药物和化妆品法案的第520(e)部分规定的分析物特异性试剂(ASR)的试剂盒，但不限于此。实际上，任何包括两个或更多个单独容器(每个容器包括总试剂盒组分的子部分)的递送系统都包括在术语“分立试剂盒”中。相反，“组合试剂盒”指在单个容器中含有反应测定的所有组分的递送系统(例如，在容纳每种所需组分的单个盒子中)。术语“试剂盒”包括分立试剂盒和组合试剂盒。
本发明的试剂盒还可包括一种或多种试剂、缓冲液、杂交介质、固体支持物、数据库、用于计算分配顺序的计算机程序和/或一次性实验室器材，比如多孔板，以便于实施本发明方法。可包括在本试剂盒中的酶包括核苷酸聚合酶等。固体支持物可包括珠子等，而分子量标记物可包括可缀合的标志物，例如生物素和链霉抗生物素蛋白等。在一个实施方式中，试剂盒由用于实施本文所述方法的说明书组成。可通过有形介质以任何可理解的形式提供指令，比如印刷在纸上、计算机可读介质等。
在下文中，参考氨基酸序列、核酸序列和实施例更详细地描述本发明。然而，实施例的细节不旨在限制本发明。相反，本发明涉及包括在本文的实施例中未明确提及但本领域技术人员在无需过度努力的情况下可发现的细节的任何实施方式。
实施例
1)人源化
1.1第1轮：
通过使用最接近的鉴定的人种系，使用CDR-移植方法使8B6序列人源化。然后，所获得的人源化抗体(OGD201)的结合通过其如下孵育来测试：以不同浓度- 即0.01μg/ml至10μg/ml-在IMR5细胞上-即在其表面表达OAcGD2-在PBS 中，1％BSA在冰上进行45分钟。孵育和洗涤后，通过与在冰上与FITC(Southern Biotech)偶联的山羊抗小鼠IgG孵育30分钟来检测抗体结合。最后，通过流式细胞仪分析细胞荧光。
与唯一的功能种系相关的结果列于表1和图1和2中。
表1
CDR在参考序列和共有序列中以粗体表示，并且突变的氨基酸突变以灰色突出显示。
图1显示了与小鼠抗体(8B6)相比，VH人源化抗OAcGD2 mAB(OGD201 VH3 (SEQ idn°5)、OGD201 VH2(SEQ id n°4)和OGD201 VH1(SEQ id n°3))对IMR5细胞的结合滴定试验。
图2显示了与小鼠抗体(8B6)相比，VL人源化的抗OAcGD2 mAb(OGD201 VL1(SEQ idn°8)、OGD201 VL2(SEQ id n°9)，OGD201 VL3(SEQ id n°10)和 OGD201 VL4(SEQ id n°11))对IMR5细胞的结合滴定试验。
图3显示了与小鼠抗体(8B6)相比，VH-VL人源化的抗OAcGD2 mAb对IMR5 细胞的结合滴定试验。这些VH-VL人源化的抗OAcGD2 mAb将VH人源化抗 OAcGD2 mAB(OGD201 VH3(SEQ id n°5)、OGD201 VH2(SEQ id n°4)或OGD201 VH1(SEQ id n°3))与VL人源化的抗OAcGD2 mAB(OGD201 VL1(SEQ id n°8)、 OGD201 VL2(SEQ id n°9)、OGD201 VL3(SEQ idn°10)和OGD201 VL4(SEQ id n°11))结合。
结果显示，在众多测试的人种系(数据未显示)上，发明人鉴定了与人种系具有至少83％和84％同一性的第一VH和VL共有序列。所获得的共有序列分别比原始抗体具有高接近10％和7％的人源化，并且同时具有与OAcGD2的非常好的结合(参见图1、2和3)。
1.2优化：
为了增加抗体人源化程度，发明人开始测试8B6序列上的点突变以选择不影响与OAcGD2结合的那些。然后，如前所述测试所获得的人源化抗体(OGD201) 的OAcGD2结合。
与测试点突变相关的结果列于表2中。
CDR在共有序列中以粗体表示，并且突变的氨基酸突变以灰色突出显示。
发明人鉴定了可突变/人源化而不影响OAcGD2结合的新位置。基于这些结果，发明人建立了新的共有序列，其能够获得更多的人源化抗体度(共有序列2)。
1.3人源化第二轮：
基于先前完成的优化步骤和相应的共有序列，发明人设计了新的人源化VH 和VL序列，测试它们与OAcGD2的结合。
CDR以粗体表示，并且突变的氨基酸突变以灰色突出显示。
然后，所获得的人源化抗体的结合通过其如下孵育来测试：以不同浓度-即 0.01μg/ml至10μg/ml-在IMR5细胞上-即在其表面表达OAcGD2-在PBS中， 1％BSA在冰上进行45分钟。孵育和洗涤后，通过与在冰上与FITC(Southern Biotech)偶联的山羊抗小鼠IgG孵育30分钟来检测抗体结合。最后，通过流式细胞仪分析细胞荧光。
1.4优化：
为了再次增加抗体人源化程度，发明人此次在CDR中启动新一轮点突变，以选择那些不影响与OAcGD2结合的点突变。然后，如前所述测试所获得抗体的 OAcGD2结合。
测试的点突变列于表4中。
表4
CDR以粗体表示，并且突变的氨基酸突变以灰色突出显示。
1.5人源化第三轮：
基于先前完成的优化步骤和相应的共有序列，发明人设计了新的人源化VH 和VL序列，测试它们与OAcGD2的结合。
CDR以粗体表示，并且突变的氨基酸突变以灰色突出显示。
然后，所获得的人源化抗体的结合通过其如下孵育来测试：以不同浓度-即 0.01μg/ml至10μg/ml-在IMR5细胞上-即在其表面表达OAcGD2-在PBS中， 1％BSA在冰上进行45分钟。孵育和洗涤后，通过与在冰上与FITC(Southern Biotech)偶联的山羊抗小鼠IgG孵育30分钟来检测抗体结合。最后，通过流式细胞仪分析细胞荧光。
令人惊讶的是，结果显示，与其小鼠对应物相比，VH72Bmax、VH49B、VH49Bmax、VL30BH和VL28Bs01/A2已被很大程度修饰，它们具有与更好结合亲和力的该小鼠对应物VH49Bmax和VL28Bs01/A2相当的结合亲和力。
2)scFv构造
使用表5中公开的接头，将所选的人源化VH和VL序列以VH-接头-VL或 VL-接头-VH方向融合在一起。为了简化这些多肽的纯化步骤，可在C末端添加各种标签，优选His标签(HHHHHH；SEQ id n°125)。
表5：接头
然后，设计的scFv片段在大肠杆菌系统或哺乳动物中产生，包括CHO、Sp2/O、 HEK293，并且根据使用的标签(例如，对于His标签，与镍离子螯合的镍)通过亲和色谱法进一步纯化。
3)Kd试验
使用BIACORE T200 BIOSENSOR(GE HEALTHCARE)评估人源化抗体及其片段(scFv)的亲和力。对于这些实验，神经节苷脂(OAcGD2、GD2、GM2)通过疏水相互作用直接固定到CM5生物传感器芯片上。为此，在15分钟内以5μl/min 的流速注射(75μl)神经节苷脂稀释的混合物(5μg/ml)。
然后，制备在含有250mM NaCl的HBS-E缓冲液中稀释的纯化抗体或其片段 (scFv)的浓度增加(6.25nM至200nM)。将待测样品(60μl)以30μl/min的流速在2分钟内注射到传感器表面上。
最后，使用BIACORE T-200评估软件，通过二价分析模型和速率常数的默认参数设置来分析结合数据。
4)细胞毒活性试验
通过碘化丙锭掺入(PI)分析纯化的人源化抗体或其片段的直接细胞毒性。
在IP试验中，将1×105个IMR5细胞在37℃下在48孔板中孵育24小时。加入40μg/ml的抗体或其片段，并在37℃下孵育16小时。孵育后，加入在PBS中 10μg/ml的PI，并且立即通过流式细胞术分析荧光。死亡细胞的百分比表示为三次重复的平均值±SD。
ADCC活性试验如下。根据制造商的说明书，用膜染料PKH-26(Sigma Aldrich) 标记肿瘤细胞。将标记的细胞(100μL中104个细胞)与50μL抗体一起在96孔微量滴定板中孵育。人细胞系NK-92-RFcgIII+或总PBMC用作效应细胞。将指定的效应物与靶比率的效应细胞(50μL)加入肿瘤细胞中并在37℃下孵育24小时。然后通过添加TOPRO-3碘化物(TP3)(Life Technologies)评估PKH-26+靶细胞群内的细胞死亡。通过流式细胞计检测双阳性TP3+、PKH26+死亡靶细胞群。特异性裂解的百分比计算为：100×(非存活的双阳性靶细胞)/(非存活的双阳性靶细胞+存活的 PKH26+靶细胞)。
5)免疫原性试验
为了研究抗体的免疫原性潜力，我们还使用了抗原呈递分析(PROIMMUNE)或EPISCREEN(ANTITOPE)或EPIBASE T CELL分析(LONZA)或 IMMUNO′LINE(PLATINE)。
简言之，从组织库制备一组HLA型健康供体外周血单核细胞(PBMC)样品(选择以反映所选的HLA分布)。然后，将来自供体PBMC的单核细胞在确定的培养基中培养并分化以产生树突细胞(DC)。
为了分析T细胞活化，我们在CD4+T细胞存在下使用装载有测试抗原的 DC(即待测抗体)。最后，T细胞活化通过T细胞增殖试验来测量(即CFSE、H3)和细胞因子分泌(即IL-2、IL-6、IL-8、INFγ)。通过参数和非参数统计分析确定显著的T细胞应答。结果以内部控制为基准。
为了鉴定感兴趣的序列，我们使用收获的DC和纯化的相应HLA分子。洗脱相关的肽。通过测序质谱法分析肽样品，然后将获得的数据与由感兴趣的序列和所选生物的国际蛋白质指数(IPI)组成的蛋白质数据库文库进行比较。根据基于概率的算法对肽进行重要性排序，并且通过检索加扰的诱饵数据库来验证数据以减少假阳性。
最后，获得的数据能够确定测试抗体在人体中的潜在免疫原性。
6)细胞因子释放试验
将总PBMC与人源化抗体及其片段(scFv)或与对照小鼠抗体(8B6)一起孵育，并且根据制造商的说明书，通过Bio-Plex Precision ProTM人细胞因子免疫试验 (BIORAD)分析细胞因子分泌(IFNγ、TNFα、IL-6、IL-2、IL-10、IL-12、IL17、 IL-1β，......)。更多详细信息参见FINCO等人(Cytokine，vol.66，p：143-145，2014)。
最后，细胞因子表达谱使得能够确定测试抗体在人体中的潜在免疫原性。
令人惊讶的是，免疫原性结果显示，尽管VH72Bmax、VH49B、VH49Bmax、 VL30BH和VL28Bs01/A2对OAcGD2和GD2神经节苷脂具有与其小鼠对应物相当的结合亲和力，但它们具有弱化的免疫原性，VH72max和VH49Bmax具有最弱的免疫原性。
现在并且仍然令人惊讶地，免疫原性结果还显示，尽管VH1、VH2、VH3、 VH72BCDR、VH72BH、VH49BCDR、VH49BH、VL1、VL2、VL3、VL4和VL28BH 具有与其小鼠对应物一样良好的结合亲和力，但它们也具有最小的免疫原性。

Claims (16)

1.一种抗体、其功能片段和衍生物，其特异性结合O-乙酰化的GD2(OAcGD2)神经节苷脂，所述抗体包括：
a)具有氨基酸序列SEQ id n°112的人源化的轻链可变区(VL)多肽；和
b)具有氨基酸序列SEQ id n°76的人源化的重链可变区(VH)。
2.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体、其功能片段或衍生物包括：
-具有选自包括VL30BH(SEQ id n°134)和VL28Bs01/A2(SEQ id n°135)的组中的氨基酸序列的所述轻链可变区(VL)，和/或
-具有选自包括VH72Bmax(SEQ id n°131)、VH49B(SEQ id n°132)和VH49Bmax(SEQ idn°133)的组中的氨基酸序列的所述重链可变区(VH)。
3.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体、其功能片段或衍生物包括：
具有选自包括VL1(SEQ id n°8)、VL2(SEQ id n°9)、VL3(SEQ id n°10)、VL4(SEQ idn°11)、VL28BH(SEQ id n°140)、VL30BH(SEQ id n°134)和VL28Bs01/A2(SEQ id n°135)的组中的氨基酸序列的所述轻链可变区(VL)，和/或
具有选自包括VH1(SEQ id n°3)、VH2(SEQ id n°4)和VH3(SEQ id n°5)、VH72BCDR(SEQid n°136)、VH72BH(SEQ id n°137)、VH49BCDR(SEQ id n°138)、VH49BH(SEQ id n°139)、VH72Bmax(SEQ id n°131)、VH49B(SEQ id n°132)和VH49Bmax(SEQ id n°133)的组中的氨基酸序列的所述重链可变区(VH)。
4.如权利要求1至3中任一项所述的抗体，其中，特异性结合所述OAcGD2神经节苷脂的所述抗体、其功能性片段或衍生物，在25℃下对所述神经节苷脂呈现小于5×10-6M的Kd，优选Kd等于或小于5×10-7M，最优选Kd等于或小于1×10-7M，并且更优选Kd等于或小于5×10- 8M。
5.如权利要求1至4中任一项所述的抗体，其中，特异性结合所述OAcGD2神经节苷脂的抗体、其功能片段或衍生物，在25℃下对GD2神经节苷脂呈现大于5×10-5M的结合亲和力(Kd)，优选地对GD2神经节苷脂的Kd大于10-5M。
6.如权利要求1至5中任一项所述的抗体，其中，所述抗体、其功能片段或衍生物包括至少所述重链可变区和所述轻链可变区两者。
7.如权利要求1至6中任一项所述的抗体，其中，所述抗体、其功能片段或衍生物是嵌合抗原受体(CAR)的膜锚定单链可变部分。
8.如权利要求7所述的抗体，其中，所述CAR包括胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。
9.如权利要求1至8中任一项所述的抗体，其中所述抗体是免疫缀合物。
10.如权利要求1至9中任一项所述的抗体，其中所述功能片段选自包括ScFv片段、Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、Facb片段、Fv片段和Fd片段的组中。
11.一种药物组合物，其包括至少一种根据权利要求1至10中任一项所述的抗体、其功能片段或衍生物，和药学上可接受的载体。
12.如权利要求11所述的药物组合物，其用于预防和/或治疗受试者中表达OAcGD2神经节苷脂的癌症的方法中。
13.如权利要求11或12中任一项所述的药物组合物，其中所述受试者是哺乳动物，优选人。
14.如权利要求11至13中任一项所述的药物组合物，其中所述表达OAcGD2神经节苷脂的癌症选自包括神经母细胞瘤、神经胶质瘤、视网膜母细胞瘤、尤文氏肿瘤家族、肉瘤、小细胞肺癌、乳腺癌、黑素瘤、转移性肾癌、头颈癌和血液癌的组中。
15.一种用于诊断受试者中表达OAcGD2神经节苷脂的癌症的方法，所述方法包括下述步骤：使所述受试者的生物样品接触至少一种如权利要求1至10中任一项所限定的抗体、其功能片段或衍生物，以确定所述生物样品中所述OAcGD2神经节苷脂的表达水平，其中可检测的OAcGD2神经节苷脂的表达水平指示这种癌症。
16.一种用于诊断受试者中表达OAcGD2神经节苷脂的癌症的试剂盒，所述试剂盒包括至少一种如权利要求1至10中任一项所限定的抗体、其功能片段或衍生物，以及用于向所述受试者施用所述抗体、其功能片段或衍生物的最终工具。
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