CN114761560A - T细胞主细胞库 - Google Patents

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CN114761560A CN202080081737.4A CN202080081737A CN114761560A CN 114761560 A CN114761560 A CN 114761560A CN 202080081737 A CN202080081737 A CN 202080081737A CN 114761560 A CN114761560 A CN 114761560A
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cells
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tcr
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有马寿来留
泷口麻衣子
葛西义明
林哲
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Takeda Pharmaceutical Co Ltd
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Kyoto University
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
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Abstract

本发明提供包含T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库的T细胞产品的提供系统。

Description

T细胞主细胞库
技术领域
本发明涉及T细胞主细胞库及T细胞工作细胞库、以及包含该库的T细胞产品的提供系统等。
背景技术
近年来，作为针对癌症的治疗方法，免疫细胞治疗备受瞩目。免疫细胞治疗为将于患者体外进行了增殖及激活的免疫细胞施予至患者，使该免疫细胞攻击癌细胞的治疗方法。免疫细胞治疗与以往的外科治疗、放射治疗、化学治疗这三大治疗方法相比，具有几乎没有副作用的优点。免疫细胞治疗中具有各种各样的治疗方法，其中，现成的(off-the-shelf)同种异体(Allogenic)T细胞产品被寄予厚望。
作为提供上述同种异体的T细胞产品的系统，报道了下述系统：利用iPS细胞的建库技术(例如，专利文献1等)、向iPS细胞导入CAR基因的技术(例如，专利文献2等)，预先在iPS细胞中导入CAR基因，对制得的iPS细胞进行扩大培养之后，将该细胞储存，由此构建具有CAR基因的iPS细胞的主细胞库，将通过使源自该细胞库的iPS细胞分化成T细胞而得到的T细胞用作同种异体的T细胞产品(例如，非专利文献1)。
上述系统中，需要在iPS细胞这样的多潜能干细胞中导入CAR基因等外源性基因、使该细胞分化成T细胞的工艺。因此，需要满足各国当局制定的GMP(药品生产质量管理规范，Good Manufacturing Practice)标准的同时进行该工艺中各阶段的细胞(例如，iPS细胞、T细胞、CAR-T细胞)的维持管理工序、分化工序及培养工序。例如，由于使用iPS细胞的主细胞库，因此需要使iPS细胞分化成T细胞以制备T细胞产品，而iPS细胞具有多潜能性(multipotency)，为了每批次诱导均一的分化细胞，每次均要求高水平的工序·品质管理，人力、时间及金钱的成本极高。该成本对T细胞产品的稳定提供带来甚大的影响。特别是欲提供多种T细胞产品的情况下，各种成本、时间累积，其影响会更严重。因此，期望用于供给既满足了GMP标准又抑制了成本的产品的系统、以及即使在使用了多种T细胞产品的情况下，也能够以高品质低成本提供该产品的系统。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国公开第2009-0299763号
专利文献2：国际公开第2017/088012号
非专利文献
非专利文献1：Bob Valamehr(Vice President of Fate Therapeutics)“Generation of off-the-shelf TCR-less CAR T cells from renewable pluripotentcells”,April 14-18,2018(AACR Annual Meeting 2018Press Program)
发明内容
发明所要解决的课题
因此，本发明的课题在于提供可降低人力、时间及金钱的成本、并且批次间差异小且高品质的现成的同种异体(Allogenic)T细胞产品的提供系统。另外，课题还在于提供可用于前述系统的提供的T细胞主细胞库及T细胞工作细胞库、以及它们的集合(collection)。
用于解决课题的手段
本申请发明人为了解决上述课题进行了认真研究，结果，非专利文献1等记载的现有技术中专门着眼于iPS细胞的主细胞库的构建方法，推测这是由于与T细胞相比，iPS细胞的增殖能力优异。因此获得了下述构思：如果能通过对T细胞进行扩大培养而将其充分增殖，就能够将T细胞或该增殖的T细胞用作主细胞库。即，本申请发明人获得了下述构思：不构建具有CAR基因等外源性基因的iPS细胞的主细胞库、而是构建包含该外源性基因的T细胞的主细胞库，从而可由该细胞库迅速地提供高品质的T细胞产品。据本申请发明人所知，构建T细胞的主细胞库这一想法是完全未知且完全新颖的。本申请发明人基于上述见解进一步反复进行研究，从而完成了本发明。
即，本发明提供以下方式。
[1]T细胞产品的提供系统，其包含T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库。
[2]如[1]所述的系统，其中，前述T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库包含源自诱导多潜能干细胞的T细胞。
[3]如[1]或[2]所述的系统，其中，前述T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库包含至少一种HLA基因的表达被抑制的T细胞。
[3a]如[1]～[3]中任一项所述的系统，其中，前述T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库包含导入有外源性基因的T细胞。
[3b]如[1]～[3a]中任一项所述的系统，其还包括收集T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库并构建T细胞主细胞库集合及/或T细胞工作细胞库集合的步骤，
该集合包含2种以上的T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库。
[3c]如[1]～[3b]中任一项所述的系统，其中，前述T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库的种类为2种以上。
[3d]如[1]～[3c]中任一项所述的系统，其还包括选择T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库的步骤。
[4]如[1]～[3d]中任一项所述的系统，其包括在由前述T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库准备的T细胞中导入包含外源性基因的核酸的步骤。
[5]如[4]所述的系统，其中，前述外源性基因为CAR基因或外源性TCR基因。
[6]如[1]～[5]中任一项所述的系统，其中，前述T细胞产品的种类为2种以上。
[6a]如[1]～[6]中任一项所述的系统，其还包括选择T细胞产品的步骤。
[7]如[1]～[6a]中任一项所述的系统，其还包括对由前述T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库准备的T细胞进行扩大培养的步骤。
[8]如[7]所述的系统，其中，前述对T细胞进行扩大培养的步骤包括利用CD30激动剂刺激该细胞的工序。
[8a]如[7]所述的系统，其中，对前述T细胞进行扩大培养的步骤中包括于CD30激动剂的存在下培养该细胞的工序。
[9]如[7]～[8a]中任一项所述的系统，其还包括制造包含前述经扩大培养的T细胞的冷冻T细胞产品的步骤。
[10]如[6]～[9]中任一项所述的系统，其还包括收集T细胞产品并构建包含2种以上的T细胞产品的T细胞产品集合的步骤。
[10a]如[1]～[10]中任一项所述的系统，其还包括获取受试者的信息的步骤。
[10b]如[10a]所述的系统，其还包括基于受试者的信息选择适宜的T细胞主细胞库及/或适宜的T细胞工作细胞库的步骤。
[10c如[10a]所述的系统，其还包括基于受试者的信息选择适宜的T细胞产品的步骤。
[11]如[1]～[10c]中任一项所述的系统，其还包括对受试者的肿瘤中表达的肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原进行鉴定的步骤。
[12]如[11]所述的系统，其还包括从包含2种以上的T细胞产品的T细胞产品集合中选择表达可识别并结合经鉴定的抗原的CAR或外源性TCR的T细胞产品的步骤。
[13]T细胞产品的制备方法，其包括构建T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库的工序。
[14]如[13]所述的T细胞产品的制备方法，其中，前述T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库包含源自诱导多潜能干细胞的T细胞。
[15]如[13]或[14]所述的T细胞产品的制备方法，其中，前述T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库包含至少一种HLA基因的表达被抑制的T细胞。
[15a]如[13]～[15]中任一项所述的T细胞产品的制备方法，其中，前述T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库包含导入有外源性基因的T细胞。
[16]如[13]～[15a]中任一项所述的T细胞产品的制备方法，其还包括在由前述T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库准备的T细胞中导入包含外源性基因的核酸的工序。
[17]如[16]所述的T细胞产品的制备方法，其中，前述外源性基因为CAR基因或外源性TCR基因。
[18]如[13]～[17]中任一项所述的T细胞产品的制备方法，其还包括对T细胞进行扩大培养的工序。
[19]如[18]所述的T细胞产品的制备方法，其中，前述对T细胞进行扩大培养的工序中包括利用CD30激动剂刺激该细胞的工序。
[19a]如[18]所述的T细胞产品的制备方法，其中，前述对T细胞进行扩大培养的工序中包括于CD30激动剂的存在下培养该细胞的工序。
[20]T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库。
[21]如[20]所述的T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库，其包含源自诱导多潜能干细胞的T细胞。
[22]如[20]或[21]所述的T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库，其包含至少一种HLA基因的表达被抑制的T细胞。
[22a]如[20]～[22]中任一项所述的T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库，其包含导入有外源性基因的T细胞。
[23]T细胞主细胞库集合及/或T细胞工作细胞库集合，其包含[20]～[22a]中任一项记载的2个以上种类的T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库。
[24]构建T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库的方法，其包括以下工序：
(I)使不具有嵌合抗原受体(CAR)基因的诱导多潜能干细胞分化成用于CAR-T疗法的T细胞的工序；
(II)储存该分化的T细胞的工序；及
(III)进行该分化的T细胞的特性分析的工序。
[25]构建T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库的方法，其包括以下工序：
(i)使不具有外源性T细胞受体(TCR)基因的诱导多潜能干细胞分化成用于TCR-T疗法的T细胞的工序；
(ii)储存该分化的T细胞的工序；及
(iii)进行该分化的T细胞的特性分析的工序。
[25a]如[24]或[25]所述的方法，其中，前述诱导多潜能干细胞具有外源性基因。
[26]如[24]或[25a]所述的方法，其中，前述诱导多潜能干细胞具有外源性T细胞受体(TCR)基因。
[27]如[24]～[26]中任一项所述的方法，其中，前述诱导多潜能干细胞缺失至少一种HLA基因。
[27a]如[24]～[26]中任一项所述的方法，其中，前述诱导多潜能干细胞中至少一种HLA基因的表达被抑制。
[28]如[24]～[27a]中任一项所述的方法，其中，前述T细胞表达CD8αβ。
[29]T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库，其是通过[24]～[28a]中任一项所述的方法构建的。
[30]制备表达CAR或外源性TCR的T细胞产品的方法，其包括以下工序：
(A)由[29]所述的T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库准备T细胞的工序；
(B)在该准备的T细胞中导入CAR基因或外源性TCR基因的工序；及
(C)对该导入有CAR基因或外源性TCR基因的T细胞进行扩大培养的工序。
[30a]如[30]所述的方法，其还包括(D)对经扩大培养的T细胞进行冷冻的工序。
[31]如[30]或[30a]所述的方法，其特征在于，前述CAR或外源性TCR识别并结合肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原。
[32]如[30]～[31]中任一项所述的方法，其中，前述工序(C)包括利用CD30激动剂刺激T细胞的工序。
[32a]如[30]～[31]中任一项所述的T细胞产品的制备方法，其中，前述工序(C)包括于CD30激动剂的存在下培养T细胞的工序。
[33]T细胞产品，其是通过[30]～[32a]中任一项所述的方法制备的。
[34]包含2种以上的T细胞产品的T细胞产品集合的构建方法，其包括收集[33]所述的T细胞产品的工序。
[35]T细胞产品集合，其是通过[34]所述的方法构建的。
[36]提供适合受试者的T细胞产品的方法，其包括以下工序：
(x)对受试者的肿瘤中表达的肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原进行鉴定的工序；及
(y)从[35]所述的T细胞产品集合中选择表达可识别并结合该经鉴定的抗原的CAR或外源性TCR的T细胞产品的工序。
[37]提供适合受试者的T细胞产品的方法，其包括以下工序：
(p)获取受试者的信息的工序；及
(q)基于该获取的受试者的信息选择适宜的T细胞主细胞库及/或适宜的T细胞工作细胞库的工序。
发明效果
根据本发明，提供可降低人力、时间及金钱的成本、并且批次间差异小且高品质的现成的同种异体T细胞产品的提供系统及提供方法。该系统及提供方法在提供多种T细胞产品的情况下特别优异。另外，还提供可用于前述系统或方法的提供的、T细胞的主细胞库及T细胞工作细胞库以及它们的集合。
本说明书中使用的各种各样的细胞有时分别称为下述名称。对各细胞的概要一并进行记载。
＜诱导多潜能干细胞(iPSC)＞
αβ-iPSC：导入有TCR-α链基因(TRA基因)及TCR-β链基因(TRB基因)的iPS细胞
Vγ9Vδ2-iPSC：导入有编码Vγ9Vδ2TCR G115的TCR-γ链基因(TRG基因)及TCR-δ链基因(TRD基因)的iPS细胞
＜造血祖细胞(HPC)＞
Vγ9Vδ2-iHPC：导入有编码Vγ9Vδ2TCR G115的TCR-γ链基因(TRG基因)及TCR-δ链基因(TRD基因)的HPC
＜T细胞＞
iγδTC：由未导入外源性TCR的iPS细胞分化的T细胞
iαβTC：由αβ-iPSC分化的T细胞
Vγ9Vδ2-iTC：由Vγ9Vδ2-iPSC分化的T细胞
Vγ9Vδ2-iHTC：由Vγ9Vδ2-iHPC分化的T细胞
＜导入有CAR基因的T细胞＞
CD19iαβCARTC：在iαβTC中导入编码抗CD19-CAR的基因而制作的T细胞
BCMAiαβCARTC：在iαβTC中导入编码抗BCMA-CAR的基因而制作的T细胞
CD19-CD30-iαβCARTC：在iαβTC中导入编码包含源自CD30的胞内结构域的抗CD19-CAR的基因而制作的T细胞
＜导入了CAR基因及IL-15Rα/IL-15基因的T细胞＞
CD19/IL15iαβCARTC：在iαβTC中导入编码抗CD19-CAR的基因及编码IL-15Rα/IL-15嵌合蛋白的基因而制作的T细胞
CD19/IL15iVγ9Vδ2CARTC：在Vγ9Vδ2-iTC中导入编码抗CD19-CAR的基因及编码IL-15Rα/IL-15嵌合蛋白的基因而制作的T细胞
CD19/IL15iγδCARTC：在iγδTC中导入编码抗CD19-CAR的基因及编码IL-15Rα/IL-15嵌合蛋白的基因而制作的T细胞
附图说明
[图1]示出包含T细胞细胞库的T细胞产品的提供系统的一个例子。
[图2]示出由T细胞细胞库集合提供多个T细胞产品的系统的一个例子。图2中的“装甲(Armored)”意味着导入有与细胞因子及/或趋化因子的分泌有关的外源性基因。
[图3]示出iγδTC的细胞膜表面上的CD3、γδTCR及αβTCR的表达。实心峰表示非抗体染色组的结果，空白峰表示使用了各抗原特异性的抗体的染色结果。
[图4]示出iγδTC的细胞膜表面上的TCR-Vδ1链及TCR-V2δ链的表达。横轴与纵轴分别表示TCR-Vδ1链(Vdelta1)与TCR-Vδ2链(Vdelta2)的表达。
[图5]示出Vγ9Vδ2-iTC的细胞膜表面上的CD3及γδTCR分子的表达。左图的横轴与纵轴分别表示CD3与pan-γδTCR的表达。右图的横轴与纵轴分别表示TCR-Vδ2链与TCR-Vγ9链的表达。
[图6]示出Vγ9Vδ2-iHTC的细胞膜表面上的CD3及γδTCR分子的表达。左图的横轴与纵轴分别表示CD3与pan-γδTCR的表达。右图的横轴与纵轴分别表示CD3与TCR-Vγ9链的表达。
[图7]为示出iγδTC的细胞增殖的图。纵轴表示细胞数，横轴表示自增殖培养开始起的经过天数。箭头表示开始基于固定化抗CD3激动剂抗体/RetroNectin(注册商标)及抗CD30激动剂抗体的刺激的当日。
[图8]为示出Vγ9Vδ2-iTC的细胞增殖的图。纵轴表示细胞数，横轴表示自增殖培养开始起的经过天数。箭头表示开始基于固定化抗CD3激动剂抗体/RetroNectin(注册商标)的刺激的当日。
[图9]为示出利用固定化抗CD3激动剂抗体/RetroNectin(注册商标)刺激的CD19-iαβCARTC的增殖曲线的图。纵轴表示细胞数，横轴表示自开始上述刺激当日起的经过天数。箭头表示开始基于固定化抗CD3激动剂抗体/RetroNectin(注册商标)的刺激的当日。
[图10]为示出在iαβTC中导入编码抗CD19-CAR的基因或编码抗BCMA-CAR的基因而制作的CART细胞(分别为CD19iαβCARTC(A)及BCMAiαβCARTC(B))及iαβTC对CD19阳性Raji细胞(A)或BCMA阳性H929细胞(B)的抗原特异性细胞毒活性的图。
[图11]为示出CD19-CD30-iαβCARTC对CD19阳性Raji癌细胞的细胞毒活性的图。纵轴表示2小时后被杀死的细胞数的比例，横轴表示效应细胞(CD19iαβCARTC)与靶细胞(CD19阳性Raji癌细胞)的混合比例。
[图12]为示出CD19/IL15iγδCARTC的抗原特异性细胞毒活性的图。黑圆点及白圆点分别表示对CD19阳性Raji癌细胞及CD19阴性CCRF-CEM癌细胞的细胞毒活性。纵轴表示2小时后的残存细胞数的比例，横轴表示效应细胞(CD19/IL15iγδCARTC)与靶细胞(CD19阳性Raji癌细胞或CD19阴性CCRF-CEM癌细胞)的混合比例。
[图13]为示出CD19/IL15iVγ9Vδ2CARTC的细胞增殖的图。纵轴表示细胞数，横轴表示自增殖培养开始起的经过天数。箭头表示开始基于固定化抗CD3激动剂抗体/RetroNectin(注册商标)的刺激的当日。
[图14]为示出CD19/IL15iγδCARTC带来的人CD19表达Nalm6肿瘤异种移植小鼠的存活天数延长效果的图。
[图15]为示出CD19/IL15iVγ9δ2CARTC带来的人CD19表达Nalm6异种移植小鼠的存活天数延长效果的图。
[图16]示出包含T细胞细胞库的T细胞产品的提供系统的一个例子。
[图17]为示出T细胞产品选择部所含的硬件构成的一个例子的图。
具体实施方式
1.T细胞主细胞库、T细胞工作细胞库、及T细胞产品的提供系统
本发明提供T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库。以下，作为包含T细胞主细胞库和T细胞工作细胞库的细胞库，有时使用“T细胞细胞库”这一用语。另外，另一方式中，本发明提供包含T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库的、T细胞产品的提供系统(以下，有时称作“本发明的提供系统”)。
本说明书中，“细胞库”意味着满足世界各国的药监局根据ICH(国际人用药品注册技术协调会，International Council for Harmonisation of Technical Requirementsfor Pharmaceuticals for Human Use)的指南设立的品质标准等的、经特性分析的相同的起始材料(ICH指南Q5D，ICH guideline Q5D))。通常细胞库通过使填充于适宜的容器中的细胞冷冻而构建，但在上述的点上，其与单纯使细胞冷冻而得到的冷冻储存(frozenstock)有所区别。根据需要，除特性分析以外，还可对细胞库实施用于质量评估的试验。细胞库的构建方法及所构建的细胞库的特性分析及质量评估的试验项目根据作为细胞库的对象的细胞的生物学性质(例如，营养缺陷性)、培养经历及试验的实施可行性而有所不同，可由本领域技术人员、或基于本领域技术人员与监管机构的协议内容等而适当设定。与这些构建方法以及特性分析及质量评估结果有关的信息在各国的生产及上市许可申请中被提交给药监局。“主细胞库”意味着，使成为所有制备用细胞种子(cell seed)的起源的种株在一定的培养条件下经最低限度的传代数增殖，并将其分注于多个安瓿中，将该细胞为T细胞的主细胞库称作“T细胞主细胞库”。另外，“工作细胞库”意味着，将在确认充分稳定的条件下进一步对将主细胞库的一个或多个合并而得到的细胞进行培养，并将其分注于多个安瓿中，将该细胞为T细胞的工作细胞库称作“T细胞工作细胞库”(本说明书中，有时将T细胞主细胞库及T细胞工作细胞库称作“T细胞细胞库”)。根据ICH Q5D，通常对主细胞库实施特性分析的试验，通常对各工作细胞库也实施一部分的特性分析的试验。
特性分析的试验中，主要对没有混入外源性感染性因子进行评价。特别是外源性病毒引起的污染在在临床使用中可能会导致严重的事态，因此按照ICH Q5A(R1)进行评价。作为其他试验，有用于检测其他细胞株引起的交叉污染的同一性试验。另外，有时也实施核型分析、致瘤性试验。
作为质量评估的试验项目，可举出使用了作为T细胞的适宜的细胞表型的确认试验、纯度试验、源自制备工序的杂质试验、及细胞数、细胞存活率等含量试验等。
T细胞细胞库可由制备及/或提供T细胞产品的人自行构建，也可导入由他人构建的细胞库并用于T细胞产品的制备。
根据ICH Q5D，由主细胞库构建工作细胞库这样的2阶段方式的细胞库的构思已被广泛接纳作为在持续进行药物制备的基础上用于供给细胞基材的最实际的方法。
工作细胞库来源于一个容器或更多数量的主细胞库。可根据需要由主细胞库进行工作细胞库的更新。关于新构建的工作细胞库，ICH Q5D中记载了需要通过进行特性分析等来适当地确认其合格性。
作为本发明的一个方式，将T细胞分注于多个保存容器(无菌瓶等)，使其冷冻并进行储存，由此可构建T细胞主细胞库。可将该T细胞主细胞库中的一个容器分量的T细胞融化，适宜地供于特性分析的试验。另外，从同一容器或别的经融化的一个容器将T细胞分注于多个适宜的容器，进行冷冻并储存，由此可构建T细胞工作细胞库。
作为本发明的一个方式，将T细胞细胞库的一个或多个容器分量的T细胞融化，在T细胞中导入包含外源性基因的核酸，进行扩大培养，由此可制备T细胞产品。
本发明中，“储存”意味着，将分注(allocate)有T细胞等细胞的多个容器汇总适当进行保管，对温度等保管条件、进出等进行管理。保管这些容器的场所可以为一个位置，也可以为多个位置。
本发明中，“T细胞”意味着CD3阳性细胞，作为可用于本发明的T细胞，例如，可举出作为CD8阳性细胞的细胞毒性T细胞(CTL)、作为CD4阳性细胞的辅助性T细胞、调节性T细胞、效应T细胞、作为T细胞受体(TCR)γ链及TCRδ链阳性细胞的γδT细胞等。另外，CD4/CD8双阳性细胞也包括在T细胞中。T细胞中的TCR可以为基于内源性TCR基因的表达的TCR，也可以为基于外源性TCR基因的表达的TCR。外源性TCR可以为后述的TCR的变异体(variant)。本发明中提供的T细胞细胞库中的T细胞优选为细胞毒性T细胞，更优选为表达CD8αβ的CD8αβ阳性细胞毒性T细胞。另外，本说明书中，“T细胞产品”意味着，将T细胞填充于保存容器(无菌瓶、输血袋等)而得的产品、或对其适宜地实施了外包装、贴标签等而得的产品。T细胞产品可以进行冷冻，也可以不进行冷冻，但从T细胞的稳定性的观点出发，进行长期保存的情况下，优选进行冷冻。本说明书中，将经冷冻的T细胞产品特别称为“冷冻T细胞产品”。本说明书中，除非另有说明，“T细胞产品”包括不进行冷冻的T细胞产品及经冷冻的T细胞产品(冷冻T细胞产品)这两者。本说明书中，“T细胞产品”包括被施予至包括人在内的哺乳动物的对象的临床试验用的产品和市售用的产品这两者。
如上所述，以往的使用了iPS细胞的主细胞库或工作细胞库的T细胞产品的提供方法的人力、时间及金钱成本极高。特别是，欲提供2种以上的T细胞产品的情况下，各种成本、时间累积，其影响会更严重。另一方面，根据本发明的提供系统，由于使用T细胞的主细胞库或工作细胞库，因此特别是提供2种以上的T细胞产品时，与现有技术相比，能够极度降低人力、时间及金钱成本。因此，本发明的提供系统中提供的T细胞产品的种类可以为1种，但在为2种以上的情况时特别优异。
本说明书中，“阳性”意味着，蛋白质或基因以可通过本领域中已知的方法所能检测到的量进行表达。蛋白质的检测了利用使用了抗体的免疫学分析、例如ELISA、免疫染色、流式细胞术来进行。另外，于细胞内表达且不出现在细胞表面的蛋白质(例如转录因子或其亚基等)的情况下，可通过使报告蛋白与该蛋白质一同表达，检测该报告蛋白，从而检测作为对象的蛋白质。基因的检测可利用例如RT-PCR、生物芯片(例：微阵列)、RNAseq等核酸扩增方法及/或核酸检测方法来进行。
本说明书中，“阴性”意味着蛋白质或基因的表达量低于基于上述那样已知的方法的全部或任一种的检测下限值。蛋白质或基因的表达的检测下限值因各手法而有所不同。
本说明书中，“基因的表达”包括由该基因的特定的核苷酸序列合成mRNA(也称作转录或mRNA的表达)及基于该mRNA的信息合成蛋白质(也称作翻译或蛋白质的表达)这两者，除非另有说明，“基因的表达”或单纯“表达”意味着蛋白质的表达。
本说明书中，“培养”是指，在体外环境中维持细胞，使其增殖(生长)、且/或分化。“进行培养”是指在组织外或体外、例如细胞培养板、培养皿或培养瓶中维持细胞，使其增殖(生长)、且/或分化。
构成T细胞细胞库的T细胞可通过对具有向T细胞分化的能力的干细胞进行分化诱导而制备。作为该干细胞，例如可举出多潜能干细胞(pluripotent stem cell)、多能干细胞(multipotent stem cell)等。本说明书中，“多潜能干细胞(pluripotent stem cell)”是指，具有能够分化成生物体的具有各种不同形态、功能的组织、细胞、可分化成三胚层(内胚层、中胚层、外胚层)中的任何一个谱系的细胞的能力的干细胞。作为多潜能干细胞，没有特别限定，例如可举出诱导多潜能干细胞(本说明书中，有时也称作“iPS细胞”)、胚胎干细胞(ES细胞)、源自通过核移植而获得的克隆胚胎的胚胎干细胞(nuclear transferEmbryonic stem cell：ntES细胞)、多能性生殖干细胞、胚胎生殖干细胞(EG细胞)等。本说明书中，“多能干细胞(multipotent stem cell)”是指具有能够分化成多个有限数量的谱系的细胞的能力的干细胞。另外，作为“多能干细胞(multipotent stem cell)”，例如可举出造血干细胞、牙髓干细胞、源自口腔粘膜的干细胞、毛囊干细胞、源自培养的成纤维细胞、骨髓干细胞的成体干细胞等。优选的多潜能干细胞(pluripotent stem cell)为ES细胞及iPS细胞，特别优选为iPS细胞。上述多潜能干细胞为来源于ES细胞或人胚胎的任意细胞的情况下，该细胞可以为破坏胚胎而制作的细胞，也可以为不破坏胚胎而制作的细胞，优选为不破坏胚胎而制作的细胞。上述干细胞优选来源于哺乳动物(例：小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、犬、猴、红毛猩猩(Orang hutan)、黑猩猩、人)，更优选来源于人。因此，作为本发明中使用的干细胞，最优选为人iPS细胞。
“诱导多潜能干细胞(iPS细胞)”是指在哺乳动物体细胞或未分化干细胞中导入特定的因子(核重编程因子)并进行重编程而得到的细胞。现在，“诱导多潜能干细胞(iPS细胞)”的种类很多，除了山中等人通过在小鼠成纤维细胞中导入Oct3/4·Sox2·Klf4·c-Myc这4种因子而建立的iPS细胞(Takahashi K,Yamanaka S.,Cell,(2006)126:663-676)以外，还可以使用将同样的4种因子导入人成纤维细胞中而建立的源自人细胞的iPS细胞(Takahashi K,Yamanaka S.,等,Cell,(2007)131:861-872.)、导入上述4种因子后以Nanog的表达为指标进行分选而建立的Nanog-iPS细胞(Okita,K.,Ichisaka,T.,and Yamanaka,S.(2007).Nature 448,313-317.)、以不含c-Myc的方法而制作的iPS细胞(Nakagawa M,Yamanaka S.,等,Nature Biotechnology,(2008)26,101-106)、用无病毒法(virus-freemethod)导入6种因子而建立的iPS细胞(Okita K等,Nat.Methods 2011May；8(5):409-12,Okita K等,Stem Cells.31(3):458-66.)。另外，还可使用由Thomson等制作的导入OCT3/4·SOX2·NANOG·LIN28这4种因子而建立的诱导多潜能干细胞(Yu J.,Thomson JA.等,Science(2007)318:1917-1920.)、由Daley等制作的诱导多潜能干细胞(Park IH,DaleyGQ.等,Nature(2007)451:141-146)、由樱田等制作的诱导多潜能干细胞(日本特开2008-307007号)等。
除此以外，也可使用已公开的所有论文(例如，Shi Y.,Ding S.,等,Cell StemCell,(2008)Vol3,Issue 5,568-574；Kim JB.,Scholer HR.,等,Nature,(2008)454,646-650；Huangfu D.,Melton,DA.,等,Nature Biotechnology,(2008)26,No 7,795-797)、或专利(例如，日本特开2008-307007号、日本特开2008-283972号、US2008-2336610、US2009-047263、WO2007/069666、WO2008/118220、WO2008/124133、WO2008/151058、WO2009/006930、WO2009/006997、WO2009/007852)中记载的本领域中已知的诱导多潜能干细胞中的任一种。作为诱导多潜能干细胞株，可利用NIH、理研、京都大学等建立的各种iPS细胞株。例如，若为人iPS细胞株，则可举出理研的HiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株、京都大学的253G1株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株、再生医学用iPS细胞储存(例如，Ff-I01s04株、QHJI株等)等。
ES细胞为由人、小鼠等哺乳动物的早期胚胎(例如囊胚)的内部细胞团建立的具有多能性与自我复制带来的增殖能力的干细胞。ES细胞是于1981年在小鼠中发现的(M.J.Evans and M.H.Kaufman(1981),Nature 292:154-156)，然后在人、猴等灵长类中也建立了ES细胞株(J.A.Thomson等,(1998),Science 282:1145-1147；J.A.Thomson等,(1995),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:7844-7848；J.A.Thomson等,(1996),Biol.Reprod.,55:254-259；J.A.Thomson and V.S.Marshall(1998),Curr.Top.Dev.Biol.,38:133-165)。ES细胞可通过从对象动物的受精卵的囊胚中取出内部细胞团，并在成纤维细胞的饲养层上对内部细胞团进行培养而建立。人及猴的ES细胞的建立与维持的方法记载于例如USP5,843,780；Thomson JA,等,(1995),Proc Natl.Acad.Sci.U S A.92:7844-7848；ThomsonJA,等,(1998),Science.282:1145-1147；Suemori H.等,(2006),Biochem.Biophys.Res.Commun.,345:926-932；Ueno M.等,(2006),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:9554-9559；Suemori H.等,(2001),Dev.Dyn.,222:273-279；Kawasaki H.等,(2002),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99:1580-1585；Klimanskaya I.等,(2006),Nature.444:481-485等。或者，ES细胞可通过仅使用囊胚期以前的卵裂期的胚胎的单一卵裂球来建立(Chung Y.等,(2008),Cell Stem Cell 2:113-117)，也可以使用已停止发育的胚胎来建立(Zhang X.等,(2006),Stem Cells 24:2669-2676.)。作为“ES细胞”，若为小鼠ES细胞，则能利用inGenious targeting laboratory公司、理研(理化学研究所)等建立的各种小鼠ES细胞株，若为人ES细胞，则能利用威斯康星大学、NIH、理研、京都大学、国立成育医疗研究中心及Cellartis公司等建立的各种人ES细胞株。例如，作为人ES细胞株，可利用ESI Bio公司出售的CHB-1～CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1～HUES28株等、WiCell Research出售的H1株、H9株等、理研出售的KhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株等。
nt ES细胞为源自通过核移植技术而制作的克隆胚胎的ES细胞，具有与源自受精卵的ES细胞几乎相同的特性(Wakayama T.等,(2001),Science,292:740-743；S.Wakayama等,(2005),Biol.Reprod.,72:932-936；Byrne J.等,(2007),Nature,450:497-502)。即，由源自通过将未受精卵的核与体细胞的核进行置换而获得的克隆胚胎的囊胚的内部细胞团建立的ES细胞为nt ES(nuclear transfer ES)细胞。为了制作nt ES细胞，可利用核移植技术(Cibelli J.B.等,(1998),Nature Biotechnol.,16:642-646)与ES细胞制作技术(上述)的组合(若山清香等(2008),实验医学,26卷,5号(增刊),47～52页)。核移植中，在哺乳动物的去除核的未受精卵中注入体细胞的核，进行数小时培养，由此可进行重编程。
多潜能生殖干细胞为源自生殖干细胞(GS细胞)的多潜能干细胞。该细胞与ES细胞同样地，能分化诱导成各种系列的细胞，例如具有若移植于小鼠囊胚则可制作嵌合小鼠等的性质(Kanatsu-Shinohara M.等,(2003)Biol.Reprod.,69:612-616；Shinohara K.等,(2004),Cell,119:1001-1012)。能够在包含源自胶质细胞系的神经营养因子(glial cellline-derived neurotrophic factor(GDNF))的培养液中自我复制，且通过在与ES细胞同样的培养条件下反复进行传代，可得到生殖干细胞(竹林正则等人(2008),实验医学,26卷,5号(增刊),41～46页,羊土社(东京、日本))。
EG细胞为由胎生期的原始生殖细胞建立、具有与ES细胞同样的多潜能性的细胞。可通过在LIF、bFGF、干细胞因子(stem cell factor)等物质的存在下对原始生殖细胞进行培养而建立(Matsui Y.等,(1992),Cell,70:841-847；J.L.Resnick等,(1992),Nature,359:550-551)。
1-1.向T细胞的分化诱导
干细胞向T细胞的分化诱导只要可分化成T细胞，则没有特别限制，可使用已知的方法。使用多潜能干细胞作为干细胞的情况下，上述向T细胞的分化诱导例如可包括：(1)使多潜能干细胞分化成造血祖细胞的工序(process)；及(2)使该造血祖细胞分化成T细胞的工序。
(1)使多潜能干细胞分化成造血祖细胞的工序
本说明书中，“造血祖细胞(Hematopoietic Progenitor Cells(HPC))”意味着CD34阳性细胞，优选为CD34/CD43双阳性(DP)细胞。本发明中，造血祖细胞与造血干细胞并没有区别，只要没有特别说明，则表示同一细胞。
作为由多潜能干细胞向造血祖细胞分化的方法，只要可分化成造血祖细胞，则没有特别限制，例如可举出如国际公开第2013/075222号、国际公开第2016/076415号及LiuS.等,Cytotherapy,17(2015)；344-358等中记载的那样在向造血祖细胞诱导的培养基中对多潜能干细胞进行培养的方法。
本发明中，向造血祖细胞诱导的培养基没有特别限制，可制备用于培养动物细胞的培养基作为基础培养基。作为基础培养基，例如可举出Dulbecco's培养基(例：IMDM)、Eagle培养基(例：DMEM、EMEM、BME、MEM、αMEM)、ham培养基(例：F10培养基、F12培养基)、RPMI培养基(例:RPMI-1640培养基、RPMI-1630培养基)、MCDB培养基(例:MCDB104、107、131、151、153培养基)、Fisher培养基、199培养基、灵长类ES细胞用培养基(灵长类ES/iPS细胞用培养液、Reprocell公司)、小鼠ES细胞用培养基(TX-WES培养液、Thromb-X公司)、无血清培养基(mTeSR、Stemcell Technology社)、ReproFF、StemSpan(注册商标)SFEM、StemSpan(注册商标)H3000、StemlineII、ESF-B培养基、ESF-C培养基、CSTI-7培养基、Neurobasal培养基(Thermo Fisher Scientific公司)、StemPro-34培养基、StemFit(注册商标)(例：StemFitAK03N,StemFit AK02N)等，但并不限于此。此外，这些培养基也可根据需要进行混合等而使用，例如，可举出DMEM/F12培养基等。
根据需要，基础培养基中可以包含培养基添加物等，作为该培养基添加物，例如可举出血清、维生素C类(例：抗坏血酸)、白蛋白、胰岛素、运铁蛋白、硒化合物(例：亚硒酸钠)、脂肪酸、微量元素、2-巯基乙醇、硫代甘油(例：α-单硫代甘油(MTG))、脂质、氨基酸、L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(例：Glutamax(注册商标))、非必需氨基酸、维生素、生长因子、低分子化合物、抗生素(例：青霉素、链霉素)、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类、细胞因子等。
本发明中，维生素C类意味着L-抗坏血酸及其衍生物，L-抗坏血酸衍生物意味着在生物体内通过酶反应而成为维生素C的物质。作为本发明中使用的抗坏血酸的衍生物，可例示出维生素C磷酸酯(例：抗坏血酸-2-磷酸酯，Ascorbic acid 2-phosphate)、抗坏血酸葡糖苷、乙基抗坏血酸醚、酯化维生素C、四己基癸醇抗坏血酸酯(ascorbyltetrahexyldecanoate)、抗坏血酸硬脂酸酯及抗坏血酸-2磷酸-6棕榈酸酯。优选为维生素C磷酸酯(例：抗坏血酸-2-磷酸酯)，例如可举出L-抗坏血酸磷酸酯Na或L-抗坏血酸磷酸酯Mg等L-抗坏血酸磷酸酯盐。
使用维生素C类的情况下，维生素C类优选每4天、每3天、每2天、或每1天另行添加(补充)，更优选按每1天进行添加。某一实施方式中，在培养液中添加与5ng/ml～500ng/ml相当的量(例：与5ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml相当的量)的该维生素C类。另一实施方式中，在培养液中添加与5μg/ml～500μg/ml相当的量(例：与5μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml相当的量)的该维生素C类。
工序(1)中使用的培养基中还可以添加选自由BMP4(骨形态发生蛋白4，Bonemorphogenetic protein 4)、VEGF(血管内皮生长因子，vascular endothelial growthfactor)、SCF(干细胞因子，Stem cell factor)、TPO(促血小板生成素)、FLT-3L(Flt3配体，Flt3Ligand)、bFGF(碱性成纤维细胞生长因子，basic fibroblast growth factor)组成的组中的至少1种细胞因子。更优选为添加BMP4、VEGF及bFGF而进行的培养，进一步优选为添加BMP4、VEGF、SCF及bFGF而进行的培养。
使用细胞因子的情况下，作为培养基中的浓度，例如，BMP4可以为5ng/ml～500ng/ml，VEGF可以为5ng/ml～500ng/ml，SCF可以为5ng/ml～100ng/ml，TPO可以为1ng/ml～100ng/ml，FLT-3L可以为1ng/ml～100ng/ml，bFGF可以为5ng/ml～500ng/ml。
另外，前述培养基中也可以添加TGFβ抑制剂。TGFβ抑制剂为干扰TGFβ家族的信号转导的低分子抑制剂，例如包含SB431542、SB202190(以上见R.K.Lindemann等,Mol.Cancer2:20(2003))、SB505124(GlaxoSmithKline)、NPC30345、SD093、SD908、SD208(Scios)、LY2109761、LY364947、LY580276(Lilly Research Laboratories)等。例如，TGFβ抑制剂为SB431542时，培养基中的浓度优选为0.5μM～100μM。
多潜能干细胞的培养可以为贴壁培养或悬浮培养。贴壁培养的情况下，也可以使用用细胞外基质成分进行了包被的培养容器而进行，或也可以与饲养细胞进行共培养。作为饲养细胞，没有特别限定，例如可举出成纤维细胞(小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、小鼠成纤维细胞(STO)等)。饲养细胞优选通过本身已知的方法、例如放射线(γ射线等)照射、抗癌剂(丝裂霉素C等)处理等进行灭活。作为细胞外基质成分，可举出Matrigel(Niwa A,等,PLoSOne.6(7):e22261,2011)、明胶、胶原、弹性蛋白等纤维蛋白；透明质酸、硫酸软骨素等葡糖胺聚糖、蛋白聚糖、纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白等细胞粘附蛋白等。
悬浮培养为以不粘附于培养容器的状态对细胞进行培养，没有特别限定，可使用未出于提高与细胞的粘附性的目的进行人工处理(例如，基于细胞外基质等的包被处理)的培养容器、或者人为地进行了抑制粘附的处理(例如，聚甲基丙烯酸羟乙酯(poly-HEMA)或基于非离子性表面活性多元醇(Pluronic F-127等)的包被处理)的培养容器而进行。悬浮培养时，优选形成类胚体(EB)而进行培养。
本发明中，造血祖细胞可由通过对多潜能干细胞进行培养而获得的囊状结构物(也称作ES-sac或iPS-sac)而制备。此处，“囊状结构物”为源自多潜能干细胞的三维的囊状(内部伴有空间)结构体，是由内皮细胞群等形成、内部包含造血祖细胞的结构体。
培养温度的条件没有特别限制，例如为37℃～42℃左右，优选为37℃～39℃左右。另外，关于培养时间，能够由本领域技术人员监测造血祖细胞的数量等而适当决定。只要可得到造血祖细胞，天数没有特别限定，例如，至少6天以上、7天以上、8天以上、9天以上、10天以上、11天以上、12天以上、13天以上、14天以上，优选14天。虽然通常在造血祖细胞的制造中培养时间长不会被视为问题，但优选例如35天以下，更优选21天以下。另外，可以在低氧条件下进行培养，本发明中，低氧条件可例示出15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％或这些以下的氧浓度。
(2)使造血祖细胞分化成T细胞的工序
作为由造血祖细胞向T细胞的分化方法，只要可将造血祖细胞分化成T细胞，则没有特别限制，例如可举出如国际公开第2016/076415号或国际公开第2017/221975号等中记载的那样以与由造血祖细胞诱导T细胞的方法同样的培养条件对造血祖细胞进行培养的方法。
本发明中，作为向T细胞分化诱导的培养基，没有特别限制，可制备用于培养动物细胞的培养基作为基础培养基。另外，根据需要，基础培养基中可以包含培养基添加物等。作为基础培养基及培养基添加物，可举出与上述工序(1)中使用的相同的物质。
工序(2)中使用维生素C类的情况下，可举出与工序(1)中记载的维生素C类相同的维生素C类，并能以同样的方式进行添加。某一实施方式中，培养基中或培养液中的维生素C类的浓度优选为5μg/ml～200μg/ml。另一实施方式中，在培养液中添加与5μg/ml～500μg/ml相当的量(例：与5μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml相当的量)的该维生素C类。
工序(2)中，优选使用p38抑制剂及/或SDF-1(基质细胞衍生因子1，Stromal cell-derived factor 1)。本发明中，“p38抑制剂”意味着抑制p38蛋白(p38MAP激酶)的功能的物质，例如可举出p38的化学抑制剂、p38的显性负性突变体或编码其的核酸等，但并不限于此。
作为本发明中使用的p38的化学抑制剂，可例示出SB203580(4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基磺酰基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑，4-(4-fluorophenyl)-2-(4-methylsulfonylphenyl)-5-(4-pyridyl)-1H-imidazole)、及其衍生物、SB202190(4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑，4-(4-fluorophenyl)-2-(4-hydroxyphenyl)-5-(4-pyridyl)-1H-imidazole)及其衍生物、SB239063(反式-4-[4-(4-氟苯基)-5-(2-甲氧基-4-嘧啶基)-1H-咪唑-1-基]环己醇，trans-4-[4-(4-fluorophenyl)-5-(2-methoxy-4-pyrimidinyl)-1H-imidazol-1-yl]cyclohexanol)及其衍生物、SB220025及其衍生物、PD169316、RPR200765A、AMG-548、BIRB-796、SClO-469、SCIO-323、VX-702、FR167653，但并不限于此。这些化合物已有市售，例如SB203580、SB202190、SC239063、SB220025及PD169316可从Calbiochem公司购买，SClO-469及SCIO-323可从Scios公司等购买。作为P38的化学抑制剂，优选为SB203580(4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基磺酰基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑)及其衍生物。
本发明中使用的p38的显性负性突变体可举出使p38的位于DNA结合区的180位的苏氨酸点突变为丙氨酸而得的p38T180A、使人及小鼠中的p38的182位的酪氨酸点突变为苯丙氨酸而得的p38Y182F等。培养基中以约1μM～约50μM的范围含有p38抑制剂。使用SB203580作为P38抑制剂的情况下，培养基中可以以1μM～50μM、5μM～30μM、10μM～20μM的范围含有。
本发明中使用的SDF-1不仅为SDF-1α或其成熟型，还可以为SDF-1β、SDF-1γ、SDF-1δ、SDF-1ε或SDF-
Figure BDA0003660012140000231
等异构体或它们的成熟型，也可以为它们的任意比例的混合物等。优选使用SDF-1α。需要说明的是，SDF-1有时也被称作CXCL-12或PBSF。
本发明中，SDF-1只要具有其作为趋化因子的活性，可以在其氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1个或多个氨基酸(将这样的缺失、取代、插入及/或添加了氨基酸的SDF-1称作“SDF-1突变体”)。另外，同样地，SDF-1或SDF-1突变体中，也可以缺失、取代、插入及/或添加糖链。作为上述SDF-1的突变体，例如可举出保持至少4个半胱氨酸残基(人SDF-1α的情况下，Cys30、Cys32、Cys55及Cys71)、且相对于天然体的氨基酸序列而言具有90％以上的同一性的突变体等，但并不限于该氨基酸突变。SDF-1可以为哺乳动物、例如人的SDF-1；例如猴、羊、牛、马、猪、犬、猫、兔、大鼠、小鼠等非人哺乳动物的SDF-1。例如，作为人的SDF-1α，可使用以GenBank登录号：NP_954637注册的蛋白质，作为SDF-1β，可使用以GenBank登录号：NP_000600注册的蛋白质。
SDF-1可以使用市售的SDF-1，也可以使用从天然中纯化的SDF-1，或使用通过肽合成、基因工程手法而制备的SDF-1。例如，培养基中以约10ng/ml～约100ng/ml的范围含有SDF-1。另外，也可使用具有类似SDF-1的活性的SDF-1替代物以代替SDF-1。作为这样的SDF-1替代物，可例示出CXCR4激动剂，也可在培养基添加具有CXCR4激动剂活性的低分子化合物等以代替SDF-1。
工序(2)中使用的培养基中可以添加选自由SCF、TPO(促血小板生成素)、FLT-3L及IL-7组成的组中的细胞因子的至少1种，还优选在培养液中添加全部的上述细胞因子。对于它们的浓度，例如，SCF为10ng/ml～100ng/ml，TPO为10ng/ml～200ng/ml，IL-7为1ng/ml～100ng/ml，FLT-3L为1ng/ml～100ng/ml。
工序(2)中，可以对造血祖细胞进行贴壁培养或悬浮培养，贴壁培养的情况下，可以对培养容器进行包被而使用，还可以与饲养细胞等进行共培养。作为进行共培养的饲养细胞，可例示出骨髓基质细胞株OP9细胞(可由理研BioResource Center获得)。该OP9细胞优选为恒定表达DLL4或DLL1的OP9-DL4细胞或OP9-DL1细胞(例如，Holmes R1 and Zuniga-Pflucker JC.Cold Spring Harb Protoc.2009(2))。本发明中，使用OP9细胞作为饲养细胞的情况下，也可通过在培养基中适当添加另行准备的DLL4或DLL1、或者DLL4或DLL1与Fc等的融合蛋白而进行。使用饲养细胞的情况下，优选适宜更换该饲养细胞而进行培养。饲养细胞的更换可通过将培养中的对象细胞转移到预先接种的饲养细胞上而进行。可每5天、每4天、每3天、或每2天进行该更换。另外，对类胚体进行悬浮培养而得到造血祖细胞的情况下，优选将其分离成单细胞后进行贴壁培养。也可以与饲养细胞进行共培养，但优选不使用饲养细胞而进行培养。
贴壁培养的情况下，作为包被培养容器时的包被剂，例如可举出Matrigel(NiwaA,等,PLos One,6(7):e22261,2011))、胶原、明胶、层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、RetroNectin(注册商标)、DLL4或DLL1、或者DLL4或DLL1与抗体的Fc区域(以下有时也称作Fc)等的融合蛋白(例：DLL4/Fc嵌合体)、巢蛋白、及/或它们的组合，优选为RetroNectin及DLL4与Fc等的融合蛋白的组合。
工序(2)中，培养温度条件没有特别限定，例如为约37℃～约42℃左右，优选为约37℃～约39℃左右。另外，关于培养时间，能够由本领域技术人员监测T细胞的数量等而适当决定。只要可得到T细胞，天数没有特别限定，例如，典型地至少为10天以上、12天以上、14天以上、16天以上、18天以上、或20天以上，优选21天。另外，优选90天以下，更优选42天以下。
通过以上工序得到的细胞群包含T细胞，工序(2)还可包括以下的工序(3)。
(3)使T细胞浓缩的工序
作为使T细胞浓缩的方法，只要可浓缩T细胞，没有特别限制，例如可举出国际公开第2016/076415号及国际公开第2017/221975号等中记载的那样的以与由CD4CD8双阳性T细胞诱导CD8阳性T细胞的工序同样的培养条件对T细胞进行培养的方法。
本说明书中，“使···浓缩”是指使细胞的组合物等组合物中的特定的构成成分的比例增加，“浓缩”是指，用于对细胞的组合物、例如细胞群进行说明时，特定的构成成分的量与浓缩前的细胞群中的这样的构成成分的比例相比得以增加的细胞群。例如，可针对靶细胞型浓缩细胞群等组合物，因此，靶细胞型的比例与浓缩前的细胞群内存在的靶细胞的比例相比得以增加。就细胞群而言，可通过本技术领域中已知的细胞选择及分选方法针对靶细胞型进行浓缩。细胞群也可通过本说明书中记载的特定的培养方法、分选或选择工艺进行浓缩。本发明的特定的实施方式中，通过将靶细胞群浓缩的方法，细胞群就靶细胞群而言至少浓缩10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％。
本说明书中，“细胞群”意味着相同种类或不同种类的2个以上的细胞。“细胞群”也意味着相同种类或不同种类的细胞的一个团(mass)。
本发明中，作为T细胞的浓缩中使用的培养基，没有特别限制，可制备用于培养动物细胞的培养基作为基础培养基。根据需要，基础培养基中可以包含培养基添加物等。作为基础培养基及培养基添加物，可举出与上述工序(1)中使用的相同的物质。
工序(3)中使用维生素C类的情况下，可举出与工序(1)中记载的维生素C类相同的维生素C类，并能以同样的方式进行添加。某一实施方式中，培养基中或培养液中的维生素C类的浓度优选为5μg/ml～200μg/ml。另一实施方式中，在培养液中添加与5μg/ml～500μg/ml相当的量(例：与5μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml相当的量)的该维生素C类。
工序(3)中使用激素的情况下，作为激素，可举出肾上腺皮质激素。肾上腺皮质激素为糖皮质激素或其衍生物，可例示出乙酸可的松、氢化可的松、乙酸氟氢可的松、泼尼松龙(predonisolone)、曲安西龙(triamcinolone)、甲泼尼龙(methylprednisolone)、地塞米松、倍他米松、丙酸倍氯米松。优选为地塞米松。肾上腺皮质激素为地塞米松的情况下，培养基中的其浓度为1nM～100nM。
工序(3)中，培养基中可包含CD3/TCR复合物激动剂。CD3/TCR复合物激动剂只要为可通过特异性结合于CD3/TCR复合物而将信号从CD3/TCR复合物转导至T细胞内的分子，则没有特别限制。作为CD3/TCR复合物激动剂，例如可举出CD3激动剂及/或TCR激动剂。作为CD3激动剂，可举出抗CD3激动剂抗体(也简称作“抗CD3抗体”)或其结合片段，作为TCR激动剂，可举出选自由抗TCR激动剂抗体(也简称作“抗TCR抗体”)或其结合片段、MHC/抗原肽复合物或其多聚体及MHC/超抗原复合物或其多聚体组成的组中的至少一者。使用抗CD3抗体的情况下，抗CD3抗体包含多克隆抗体及单克隆抗体，优选为单克隆抗体。另外，该抗体可以属于IgG、IgA、IgM、IgD或IgE中任意的免疫球蛋白类别，优选为IgG。作为抗CD3抗体，例如可举出由OKT3克隆产生的抗体(OKT3)及由UCHT1克隆产生的抗体(UCHT1)等，优选为UCHT1。抗CD3抗体在培养基中的浓度例如为10ng/ml～1000ng/ml，优选为50ng/ml～800ng/ml，更优选为250ng/ml～600ng/ml。上述CD3/TCR复合物激动剂可以使用市售的CD3/TCR复合物激动剂，也可以使用从天然中纯化的CD3/TCR复合物激动剂，或使用通过肽合成、基因工程手法或化学合成法而制备的CD3/TCR复合物激动剂。例如，OKT3及UCHT1可从ThermoFisher公司、GeneTex公司等购买。
工序(3)中使用细胞因子的情况下，作为细胞因子，可举出IL-2及IL-7等。细胞因子为IL-2的情况下，培养基中的其浓度为10U/ml～1000U/mL，为IL-7的情况下，培养基中的其浓度为1ng/ml～1000ng/mL。
工序(3)中，培养温度条件没有特别限定，例如为约37℃～约42℃左右，优选为约37℃～约39℃左右。另外，关于培养时间，能够由本领域技术人员监测T细胞的数量等而适当决定。只要可浓缩细胞，天数没有特别限定，例如，至少1天以上、2天以上、3天以上、4天以上、5天以上，优选6天。另外，优选28天以下，更优选14天以下。
对于构成T细胞细胞库的T细胞而言，可适宜调节内源性基因的表达。具体而言，从降低异体移植的排斥反应的观点出发，优选构成T细胞细胞库的T细胞中的至少1种(例：1种、2种、3种、6种、9种)的HLA(人白血球型抗原基因)基因的表达被抑制、或缺失该HLA基因。因此，本发明的一个方式中，本发明的提供系统包含至少一种HLA基因的表达被抑制的T细胞。本说明书中，HLA基因的表达的抑制也包括该基因的缺失。
作为上述HLA基因，具体而言，可举出选自由第I类的HLA(即，HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F及HLA-G)基因及第II类的HLA(即，HLA-DR、HLA-DQ及HLA-DP)基因组成的组中的1种以上的HLA基因。或也可抑制上述HLA基因的表达、向细胞表面呈递中重要的基因的表达。作为该基因，例如可举出编码作为对于将HLA第1类的HLA呈递至细胞表面而言重要的蛋白质的B2M的B2M基因、编码作为对于第II类的HLA基因的表达而言重要的蛋白质的CIITA的CIITA基因等。另一方面，由于HLA基因的表达抑制，HLA基因表达被抑制的细胞易成为自然杀伤(NK)细胞的靶标，为了避免成为该NK细胞的靶标，优选：使CD47基因过表达；仅抑制HLA-A基因及HLA-B基因这两个基因的表达；维持对于回避NK细胞的攻击而言重要的HLA-C基因、HLA-E基因、HLA-F基因及HLA-G基因的表达(此时，可抑制也可不抑制第II类的HLA基因的表达，从免疫相容性的观点出发，优选抑制该基因的表达)。可见，在优选的方式中，作为成为表达的抑制对象的HLA基因的组合，可举出：(i)HLA-A基因及HLA-B基因的组合；(ii)HLA-A基因、HLA-B基因、HLA-DR基因、HLA-DQ基因及HLA-DP基因的组合；以及(iii)HLA-A基因、HLA-B基因、HLA-C基因、HLA-E基因、HLA-F基因、HLA-G基因、HLA-DR基因、HLA-DQ基因及HLA-DP基因的组合。上述中，以作为人的主要组织相容性基因复合体(MHC)的HLA为例进行了说明，但在使用除了人以外的MHC的情况下，也优选同样地抑制至少1种的MCH基因的表达。
作为抑制HLA基因的表达的方法，可适宜使用已知的方法，例如通过将HLA mRNA、B2M mRNA、及/或以CIITA mRNA为靶标的siRNA、shRNA、miRNA、反义寡核酸、核酶导入由多潜能细胞向T细胞分化的阶段的细胞(例：多潜能干细胞、造血祖细胞(CD34+/CD43+)、ProT细胞(CD4-/CD8-)、CD3+/CD4+/CD8+T细胞、CD3+/CD4-/CD8+T细胞、或其他的细胞(例：CD3-/CD4+/CD8+细胞等)等)；或通过将编码该分子的核酸利用下述方法导入该细胞中，由此可敲低HLA基因的表达。或可以通过基因组编辑(例如，CRISPR系统、TALEN、ZFN等)敲除细胞内的HLA基因、B2M基因、及/或CIITA基因。
另外，对于构成T细胞细胞库的T细胞，优选：通过siRNA抑制该TCR链的表达，或通过导入已知对施予T细胞的受试者而言无害的外源性TCR等，从而抑制该T细胞内存在的TCR的表达。适用基于前述siRNA的方法的情况下，为了避免siRNA对外源性TCR的效果，优选将编码该TCR的核酸的碱基序列设为不同于与抑制内源性TCR链的表达的siRNA所作用的RNA对应的碱基序列的序列(密码子转换型序列)。上述方法记载于例如国际公开第2008/153029号。前述碱基序列可通过向从天然获取的编码TCR的核酸导入沉默突变、化学合成人为设计的核酸而制作。或为了避免与内源性TCR链的错配，可以将导入的编码TCR的核酸的恒定区的一部分或全部替换为源自受试者以外的动物的恒定区。
另外，构成T细胞细胞库的T细胞中可导入包含外源性基因的核酸，该外源性基因产物也可以进行表达。
作为上述外源性基因，没有特别限定，可使用编码有助于控制T细胞的功能的蛋白、细胞因子、趋化因子等的外源性基因。作为上述外源性基因，例如可举出编码嵌合抗原受体(CAR)的基因(以下也称作“CAR基因”)、编码外源性T细胞受体(TCR)的基因(以下也称作“TCR基因”)等。由被导入细胞中的基因表达而得的上述CAR及TCR可识别并结合抗原及/或该抗原-HLA复合物。本说明书中，编码TCR的核酸意味着，包含编码形成TCR的一条链的碱基序列与编码另一条链的碱基序列的核酸。
本说明书中使用的“可结合(capable of binding)”这样的用语意味着“具有进行结合的能力(having an ability to bind)”，是指与1个或其以上的其他分子形成非共价键复合物的能力。用于确定结合能力的各种方法及试验是本技术领域中已知的。结合通常为具有高亲和性的结合，以KD值测得的结合亲和性(binding affinity)优选小于1μM，更优选小于100nM，进一步更优选小于10nM，进一步更优选小于1nM，进一步更优选小于100pM，进一步更优选小于10pM，进一步更优选小于1pM。“KD”或“KD值”这样的用语与本技术领域中已知的平衡解离常数有关，表示分子间的结合亲和性。KD值越小，表示结合亲和性越高。
本发明中使用的TCR中不仅包含TCR的α链与β链构成异源二聚体的TCR(即，αβTCR)、或TCR的γ链与δ链构成异源二聚体的TCR(即，γδTCR)，还包含构成同二聚体的TCR。此外，也可使用恒定区的一部分或全部缺失的TCR、将氨基酸序列重组而得的TCR。
另外，对于上述TCR链的恒定区，可以在作为其来源的细胞毒性T细胞(CTL)克隆的TCR链的恒定区中实施规定的修饰。作为该修饰，例如可举出通过将CTL克隆的TCR的恒定区的特定氨基酸残基取代为半胱氨酸残基，由此提高基于TCR链间的二硫键的二聚体表达效率等，但并不限于此。
另外，上述TCR可以为变异体，除非另有说明，以下TCR包含其变异体。作为该变异体，例如可举出本申请发明人开发的将两个包含选自由α链、β链、γ链及δ链组成的组中的TCR链的恒定区的多肽组合而成的、T细胞受体的变异体等。TCR的变异体的特征在于，均不包含TCRα链及β链的互补决定区(CDR)或同一种类的链的互补决定区(CDR)(优选包含该CDR的可变区的一部分或全部)；及不包含恒定区所来源的T细胞受体链的互补决定区(CDR)或同一种类的链的互补决定区(CDR)(优选包含该CDR的可变区的一部分或全部)。可见，上述变异体不包含天然型或人工型(例如，作为恒定区和可变区的来源的动物物种不同)的αβTCR、γδTCR、或在这些TCR中进一步添加氨基酸而得的TCR变异体。例如，属于本发明的变异体的至少一条链的多肽包含T细胞受体α链的恒定区的情况下，该多肽不包含T细胞受体α链的互补决定区、优选不包含包含该互补决定区的可变区的一部分或全部，但可包含除α链及β链以外的不同的TCR链、例如γ链、δ链的CDR、可变区。同样地，属于上述变异体的至少一条链的多肽包含T细胞受体β链的恒定区的情况下，该多肽中不包含T细胞受体β链的互补决定区，优选不包含包含该互补决定区的可变区的一部分或全部，但可包含除了α链及β链以外的不同的TCR链、例如γ链、δ链的CDR、可变区。对于γ链及δ链也同样。
上述TCR可以添加膜转移信号肽(以下称作“信号肽”)。作为信号肽，可使用CD8、免疫球蛋白H(免疫球蛋白-H，IGH)、CD4、以及来源于编码具有跨膜结构域的各种肽的基因的膜转移信号肽及/或、由在该信号肽的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1个或多个(例如，2个、3个、4个、5个)氨基酸而得的氨基酸序列形成的信号肽、或由与该信号肽的氨基酸序列具有同一性的氨基酸序列形成的信号肽。信号肽在添加时的结合位置及信号肽的数量没有特别限定。
本发明中，“嵌合抗原受体(CAR)”意味着包含抗原结合结构域、跨膜结构域、和细胞内信号转导结构域的融合蛋白。CAR的抗原结合结构域包含介由接头(例：由G与S形成的接头(GS接头))等间隔基团将抗体的可变区的轻链(VL)与重链(VH)串联结合而得的短链抗体(scFv)。使CAR表达的T细胞在scFV区域识别抗原之后，将该识别信号通过细胞内信号转导结构域传递至T细胞内。通过在T细胞中导入CAR，能够赋予针对目标抗原的特异性。另外，CAR可不依赖于HLA第I类或第II类而直接识别抗原分子，因此对HLA第I类或第II类基因的表达降低的细胞也可发生高的免疫反应。作为前述CAR靶向的抗原，可举出与前述TCR靶向的上述的抗原相同的抗原。
作为CAR的跨膜结构域，例如可举出来源于选自由TCR的α链、β链或ζ链、CD28、CD3ε链、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、4-1BB(CD137)及CD154组成的组中的1种以上的蛋白质的跨膜结构域等，但并不限于此。可以使用连接于抗原结合结构域的最初的细胞内信号转导结构域所来源的分子的跨膜结构域，例如，连接于抗原结合结构域的最初的细胞内信号转导结构域所来源的分子为CD28的情况下，跨膜结构域还可以来源于CD28。或也可使用人为设计的跨膜结构域。
作为CAR的细胞内信号转导结构域，例如可举出来源于选自由CD3ζ链(TCRζ链)、FcRγ链、FcRβ链、CD3γ链、CD3δ链、CD3ε链、CD5、CD22、CD79a、CD79b及CD66d组成的组中的1种以上的蛋白质的胞内结构域，但并不限于此。上述之中，优选来源于CD3ζ链的细胞内信号转导结构域。另外，细胞内信号转导结构域还可以包含共刺激分子的胞内结构域，作为该共刺激分子，例如可举出选自由CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及CD83组成的组中的1种以上的蛋白质的胞内结构域。通过选择结合的共刺激分子的种类、数量，可调控CAR的活性强度、持续时间(例如，Mol Ther.2009；17:1453-1464.)。
可以在CAR的抗原结合结构域与跨膜结构域之间、或CAR的细胞内信号转导结构域与跨膜结构域之间插入间隔基团，作为该间隔基团，可使用由通常300个氨基酸以下、优选10～100个氨基酸、最优选25～50个氨基酸形成的肽。具体而言，可举出包含源自IgG1的铰链区、免疫球蛋白的CH2CH3区域与CD3的一部分的肽等，但并不限于此。
作为具体的CAR，可举出介由间隔基团将scFV与CD3ζ链结合而得的第一代CAR；为了增强针对T细胞的活化能力而在第一代的CAR的scFV与CD3ζ链之间插入来源于CD28的跨膜结构域与胞内结构域而得的第二代CAR；以及在第二代CAR的CD28的胞内结构域与CD3ζ链之间插入与CD28不同的共刺激分子(4-1BB或OX40)的胞内结构域而得的第三代CAR，但并不限于此。
作为本发明中使用的CAR，更具体而言，可举出包含识别CD19作为抗原结合结构域的scFv、作为跨膜结构域的CD8的跨膜结构域、作为细胞内信号转导结构域的来源于CD28的胞内结构域、来源于CD30的胞内结构域、来源于4-1BB的胞内结构域、来源于CD3ζ链的胞内结构域的嵌合抗原受体。细胞内信号转导结构域中所含的上述各胞内结构域的顺序没有特别限制，例如依次含有来源于CD28的胞内结构域、来源于CD30的胞内结构域或来源于4-1BB的胞内结构域、来源于CD3ζ链的胞内结构域。更具体而言，本发明的嵌合抗原受体由例如由序列号4或5表示的氨基酸序列、或由序列号4或5表示的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1个或2个以上(优选1～100个左右、优选1～50个左右、进一步优选1～10个左右、特别优选1～多(2、3、4或5)个)氨基酸而得的氨基酸序列形成。
另外，作为来源于CD30的胞内结构域，例如可举出在由序列号7表示的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1个或2个以上(优选1～100个左右、优选1～50个左右、进一步优选1～10个左右、特别优选1～多(2、3、4或5)个)氨基酸而得的氨基酸序列等。上述缺失、取代、插入及/或添加了氨基酸序列的情况下，只要可保持CD30的胞内结构域的功能，该缺失、取代、插入及/或添加的位置没有特别限定。
作为上述TCR、CAR靶向的抗原，例如可举出肿瘤抗原，但并不限于此。肿瘤抗原可以为肿瘤特异性抗原(TSA)，也可以为肿瘤相关抗原(TAA)。作为该肿瘤抗原，具体而言，可举出选自由MART-1/MelanA(MART-I)、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2等分化抗原；WT1、Glypican-3、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15等肿瘤特异性多系列抗原、CEA等胚胎抗原、p53、Ras、HER-2/neu等过表达的肿瘤基因或突变的肿瘤抑制基因；BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR等染色体易位引起的固有的肿瘤抗原；以及EB病毒(Epstein–Barr virus)抗原EBVA以及人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6及E7等病毒抗原组成的组中的1种以上的抗原。作为其他肿瘤抗原，可举出TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM17.1、NuMa、K-ras、β-连环蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白质\亲环蛋白C相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP及TPS，但并不限于此。
上述TCR或CAR(以下有时省略为“TCR等”)特异性识别并结合抗原可通过已知的方法进行确认，作为适宜的方法，例如可举出Dextramer试验或ELISPOT试验等。通过进行ELISPOT试验，可确认于细胞表面表达TCR等的T细胞通过该TCR等识别靶抗原，并将该信号传递至细胞内。
此外，本申请发明人以前发现了表达一并包含上述CAR与IL-15及IL-15Rα的融合蛋白(以下有时省略为“IL-15/IL-15Rα”)的细胞与仅表达CAR的细胞相比，细胞毒活性上升。因此，从细胞毒活性的观点出发，构成T细胞细胞库的T细胞优选表达IL-15/IL-15Rα，进一步更优选表达上述CAR。为了得到表达IL-15/IL-15Rα的T细胞，将该IL-15/IL-15Rα基因导入由多潜能细胞向T细胞分化的阶段的细胞(例：多潜能干细胞、造血祖细胞(CD34+/CD43+)、ProT细胞(CD4-/CD8-)、CD3+/CD4+/CD8+T细胞、CD3+/CD4-/CD8+T细胞、或其他细胞(例：CD3-/CD4+/CD8+细胞等)等)。IL-15/IL-15Rα的导入优选以编码它们的核酸的形态导入细胞，该导入可与进行上述核酸导入步骤的情况同样地进行。
基于IL-15的信号转导系统中，通常抗原呈递细胞上表达的IL-15Rα与IL-15结合，将IL-15呈递至CD8阳性CD4阴性细胞上的由IL-15Rβ与共同γ链(γc)形成的IL-15受体(反式呈递，trans-presentation)，从而维持CD8阳性CD4阴性细胞的细胞毒活性。因此，表达IL-15/IL-15Rα的T细胞在该细胞为CD8阳性CD4阴性的情况下，可介由IL-15受体将IL-15信号传递至自身细胞内。或，表达IL-15/IL-15Rα的T细胞可介由IL-15受体将IL-15信号传递至其他的CD8阳性CD4阴性细胞内。如上所述，IL-15/IL-15Rα能维持CD8阳性CD4阴性细胞的细胞毒活性，因此可期待对成为CAR的靶标的细胞的持续的细胞杀伤效果。
IL-15/IL-15Rα可以为跨膜型蛋白，也可以为分泌型蛋白。已知IL-15Rα中自成熟型蛋白质的N末端起1-65氨基酸的IL-15结合域为用于与IL-15结合的关键区(Wei X.等,J.Immunol.,167:277-282,2001)。因此，跨膜型蛋白只要为保持IL-15结合域且保持IL-15Rα的跨膜结构域的蛋白质即可。另一方面，作为分泌型蛋白，只要为保持IL-15结合域且缺失了IL-15Rα的跨膜结构域的蛋白质(例如，由IL-15Rα的1-65氨基酸残基、1-85氨基酸残基、或1-182氨基酸残基形成的蛋白质、包含与该氨基酸序列的85％以上(例:90％、95％、97％、98％、99％)相同的氨基酸序列的肽等)即可。
对于IL-15/IL-15Rα，可以在IL-15与IL-15Rα之间插入间隔基团，作为该间隔基团，可使用由通常300氨基酸以下、优选10～100氨基酸、最优选20～50氨基酸形成的肽。具体而言，可举出上述的GS接头等，但并不限于此。
作为IL-15/IL-15Rα，只要为将IL-15与IL-15Rα融合而得的蛋白质，没有特别限制，具体而言，可举出由序列号7形成的肽。或者，作为IL-15/IL-15R，只要可与IL-15受体结合并将IL-15信号传递至细胞内，则没有限制，例如可举出包含与序列号7所示的氨基酸序列具有约90％以上、优选约95％以上、更优选约97％以上、特别优选约98％以上、最优选约99％以上的同源性或同一性的氨基酸序列的肽。此处，“同源性”或“同一性”意味着，使用该技术领域中已知的数学算法将2个氨基酸序列进行比对的情况下的最适合的比对(优选：该算法可考虑向序列的一者或两者导入空位以获得最优比对)中的、相对于重叠的所有氨基酸残基而言的同一氨基酸及相似氨基酸残基(同一性的情况下，为同一氨基酸残基)的比例(％)。“相似氨基酸”意味着物理化学性质相似的氨基酸，例如可举出芳香族氨基酸(Phe、Trp、Tyr)、脂肪族氨基酸(Ala、Leu、Ile、Val)、极性氨基酸(Gln、Asn)、碱性氨基酸(Lys、Arg、His)、酸性氨基酸(Glu、Asp)、具有羟基的氨基酸(Ser、Thr)、侧链小的氨基酸(Gly、Ala、Ser、Thr、Met)等被分类为同一组的氨基酸。可预测基于这样的相似氨基酸的取代并不会导致蛋白质的表型发生变化(即，保守的氨基酸取代)。保守的氨基酸取代的具体例是该技术领域中已知的，并记载于各种文献中(例如参见Bowie等人，Science,247：1306-1310(1990))。本说明书中的氨基酸序列的同源性或同一性可使用同源性计算算法NCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment SearchTool)，基于以下的条件(期望值＝10；允许空位；矩阵＝BLOSUM62；过滤＝OFF)进行计算。
外源性基因的导入了利用已知的方法进行，导入核酸为DNA的形态的情况下，例如可利用磷酸钙共沉淀法、PEG法、电穿孔法、显微注射法、脂质体转染法等进行。例如，可使用细胞工程附录8新细胞工程实验方案，263-267(1995)(秀润社发行)、病毒学(Virology)，52卷，456(1973)、日药理志(Folia Pharmacol.Jpn.),第119卷(第6号),345-351(2002)等中记载的方法。使用病毒载体的情况下，根据需要将核酸与包装载体一同导入适宜的包装细胞(例如Plat-E细胞)、互补细胞株(例如293细胞)，回收培养上清液中产生的病毒载体，利用与各病毒载体相对应的适宜的方法，将细胞感染该载体，由此可导入细胞。作为该病毒载体，可举出反转录病毒载体(包含慢病毒载体、假型载体)、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、仙台病毒载体、附加型载体等。另外，也可以使用转座子表达系统(PiggyBac系统)。作为质粒载体，可举出动物细胞表达质粒(例如，pa1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo)等。具体而言，国际公开第2007/69666号、Cell,126,663-676(2006)及Cell,131,861-872(2007)等公开了使用反转录病毒载体作为载体的具体的手段。特别是，使用反转录病毒载体的情况下，通过使用作为重组纤连蛋白片段的CH-296(Takara Bio Inc.制)，能够对各种细胞进行高效的基因导入。在导入核酸为DNA的形态、并且使用病毒载体的情况下，可根据导入对象的细胞的种类而适宜选择病毒载体的种类。对象细胞为T细胞的情况下，优选使用反转录病毒载体，更优选使用γ反转录病毒载体。对象细胞为iPS细胞的情况下，优选使用慢病毒载体。
也可以将导入核酸以RNA的形态直接导入细胞，于细胞内使导入的基因表达。作为RNA的导入方法，可使用已知的方法，例如，可适宜地使用脂质体转染法、电穿孔法等。另外，重编程因子为蛋白质的形态的情况下，例如可通过脂质体转染、与细胞穿膜肽(例如，源自HIV的TAT及聚精氨酸)的融合、显微注射等手法等导入细胞。
上述TCR等可以以编码TCR等的核酸的形态被导入细胞。另外，包含IL-15及IL-15Rα的融合蛋白也可以以编码该融合蛋白的核酸的形态被导入细胞。该核酸及用于抑制上述HLA基因的表达的核酸可以为DNA，也可以为RNA，或还可以为DNA/RNA嵌合体，优选为DNA。另外，该核酸可以为双链，也可以为单链。双链的情况下，可以为双链DNA、双链RNA或DNA:RNA的混合物(hybrid)。核酸为RNA的情况下，对于RNA的序列，则将T换成U。另外，只要可在体外或细胞中表达多肽，则该核酸可以包含天然核苷酸、修饰核苷酸、核苷酸类似物、或它们的混合物。
上述核酸可利用本身已知的方法而构建。例如，基于已知的TCR或CAR的氨基酸序列或核酸序列，化学合成DNA链，或利用PCR法、Gibson Assembly法将合成的部分重叠的寡DNA短链连接，从而能够构建编码TCR或CAR的全长或一部分的DNA。用于抑制HLA基因的表达的核酸、以及编码包含IL-15及IL-15Rα的融合蛋白的核酸也可以以同样的方式构建。
上述核酸可整合至表达载体中。该载体可以为整合至靶细胞的基因组的载体，也可以为不整合至靶细胞的基因组的载体。一个实施方式中，不整合至基因组的载体可在靶细胞的基因组之外进行复制。载体可以在靶细胞的基因组之外以多拷贝而存在。本发明的另一实施方式中，载体被整合至靶细胞的基因组。或者，导入的核酸也可通过使用了基因组编辑(例如，CRISPR系统、TALEN、ZFN等)的同源重组等而整合至基因组。优选的实施方式中，载体等核酸被整合至靶细胞的基因组的预先确定的位置。
作为用于上述载体的启动子，例如可使用EF1α启动子、CAG启动子、SRα启动子、SV40启动子、LTR启动子、CMV(巨细胞病毒)启动子、RSV(劳氏肉瘤病毒)启动子、MoMuLV(莫洛尼鼠白血病病毒)LTR、HSV-TK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)启动子、TCR Vα基因启动子、TCRVβ基因启动子等。其中，优选EF1α启动子、CAG启动子、MoMuLV LTR、CMV启动子、SRα启动子等。
除了上述启动子以外，上述载体可以根据期望包含转录及翻译调控序列、核糖体结合位点、增强子、复制起点、poly A添加信号、选择标记基因等。作为选择标记基因，例如可举出二氢叶酸还原酶基因、新霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因等。
本发明的一个实施方式中，将包含编码TCR的α链的核酸和编码β链的核酸的表达载体导入靶细胞内，可在靶细胞内、细胞表面构成TCR的α链与β链的异源二聚体。这种情况下，编码TCR的α链的核酸与编码β链的核酸可以整合至不同的表达载体，也可以整合至1个表达载体。整合至1个表达载体的情况下，优选这2种核酸介由能实现多顺反子表达的序列而被整合。通过使用能实现多顺反子表达的序列，能更有效地表达整合至1种表达载体的多个基因。作为能实现多顺反子表达的序列，例如可举出2A序列(例：源自口蹄疫病毒(FMDV)的2A序列(F2A)、源自马鼻炎A病毒(ERAV)的2A序列(E2A)、源自猪捷申病毒(Porcineteschovirus，PTV-1)的2A序列(P2A)、源自东亚细亚病毒(Thosea asigna virus，TaV)的2A序列(T2A序列)(PLoS ONE 3,e2532,2008、Stem Cells 25,1707,2007)、内部核糖体进入位点(IRES)(U.S.Patent No.4,937,190)等，从均一的表达量的观点出发，优选P2A序列及T2A序列。使用包含编码TCR的γ链的核酸和编码δ链的核酸的表达载体的情况也同样。
被导入构成T细胞细胞库的T细胞的外源性基因可被导入在由干细胞(例如，iPS细胞或ES细胞)向T细胞分化的过程中产生的细胞。此处，在由干细胞(例如，iPS细胞或ES细胞)向T细胞分化的过程中产生的细胞也包含干细胞(例如，iPS细胞或ES细胞)及T细胞。
本发明的一个方式中，被导入构成T细胞细胞库的T细胞的外源性基因可被导入iPS细胞、造血祖细胞及/或T细胞。
另外，本发明的一个方式中，在构成T细胞细胞库之前，根据需要可通过后述的“1-5.扩大培养”所示的方法对上述得到的T细胞进行扩大培养。
将通过上述方法得到的T细胞分注于多个保存容器(无菌瓶等)，进行储存，由此可构建T细胞主细胞库。优选该储存的T细胞被冷冻。可根据需要融化该T细胞主细胞库中的一个容器分量的T细胞，适宜地供于特性分析的试验。另外，根据需要通过后述的“1-5.扩大培养”所示的方法对由同一容器或别的容器准备的T细胞进行扩大培养，将得到的T细胞分注于针对各扩大培养的多个容器，进行储存，由此可构建T细胞工作细胞库。优选该储存的T细胞被冷冻。
因此，本发明的提供系统可以包括构建T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库的步骤(以下也称作“T细胞细胞库构建步骤”)。以下，有时将以执行T细胞细胞库构建步骤的方式构成的部分称作“T细胞细胞库构建部”。
1-2.T细胞的冷冻
如上所述，优选T细胞细胞库的T细胞被冷冻。T细胞的冷冻也可利用已知的方法进行。作为该方法，例如可通过将包含T细胞的容器静置于冷冻装置(例：超低温冷冻装置)内，或使该细胞与低温的介质(例：液氮等)接触、保存于冷冻装置或冷冻保存系统(例：Locator等)而实现，但并不限于此。冷冻温度典型地为0℃以下，优选为-20℃以下，更优选为-40℃以下，进一步优选为-80℃以下。另外，作为冷冻操作中的冷却速度，典型地，可举出花费1～5小时、优选2～4小时、特别是约3小时左右从4℃开始冷却至达到-80℃为止的冷却速度。该冷却速度可通过将包含T细胞的容器直接供于、或收纳于冷冻处理容器而供于设定为所期望的温度的冷冻设备来实现。冷冻处理容器可以具有将容器内的温度的降低速度控制为规定速度的功能。作为该冷冻处理容器，例如可使用BICELL(注册商标)(日本冷冻装置)等。另外，上述冷却速度可通过使用能够利用程序设定等控制冷却速度的冷冻装置而实现。作为该冷冻装置，可使用已知的任意冷冻装置、例如程序冷冻装置(例如，CryoMed(ThermoFisher)、PDF-2000G(Strex)、KRYO-560-16(Asahi Life Science))等。
冷冻操作可以在将浸渍有菌落的培养液、生理缓冲液等用作冷冻保存液，在实施了向其中添加冷冻保护剂、或将培养液替换成包含冷冻保护剂的冷冻保存液等处理的基础上而进行。将培养液替换成冷冻保存液的情况下，可以在实质完全去除培养液后添加冷冻保存液，也可以以残留一部分培养液的状态添加冷冻保存液。冷冻保存液可以使用市售的冷冻保存液，例如可举出CryoStor(注册商标)CS10、STEM-CELLBANKER(注册商标)(ZENOAQ)。
作为冷冻保护剂，没有特别限定，例如可举出二甲基亚砜(DMSO)、乙二醇(EG)、丙二醇(PG)、1,2-丙二醇(1,2-PD)、1,3-丙二醇(1,3-PD)、丁二醇(BG)、异戊二醇(IPG)、二丙二醇(DPG)、甘油等。冷冻保护剂可以单独使用，也可以组合使用2种或3种以上。另外，冷冻保护剂可以与细胞外冷冻保护剂组合使用。作为细胞外冷冻保护剂，例如可举出聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基淀粉(HES)、葡聚糖、白蛋白等。
相对于培养液或冷冻保存液整体而言，冷冻保护剂在培养液中的添加浓度或冷冻保存液中的冷冻保护剂的浓度典型地为2～20％(v/v)，优选为5～15％，更优选为8～13％。上述浓度可根据冷冻保护剂的种类而适当调节，例如，使用DMSO作为冷冻保护剂的情况下，相对于培养液或冷冻保存液整体而言，DMSO的浓度典型地为2～20％(v/v)，优选为2.5～12.5％，更优选为5～10％。
冷冻保存剂、冷冻装置的具体例如上所述。另外，作为包含T细胞的容器，可使用冷冻保存容器，作为冷冻保存容器的具体例，可举出无菌瓶(例：玻璃安瓿、聚合物制瓶(AT-closed vial)等)等。
1-3.T细胞的准备
本发明中，通常T细胞细胞库中包含分注并冷冻有T细胞的一个或多个容器，因此T细胞的准备也包括下述工序：从T细胞细胞库中采集一个或多个容器，将该T细胞融化的工序；根据需要对融化的细胞进行洗涤的工序；进行预培养使细胞复苏的工序；对该细胞进行维持培养的工序等。上述各工序可以由同一主体进行，也可以由不同主体进行。
将前述T细胞融化的方法可利用已知的方法进行，例如，可通过使用水浴、孵育器等，使从T细胞细胞库中采集的包含冷冻的T细胞的容器与温度高于冷冻温度的固体、液体或气体状的介质(例：水、培养液)接触而实现，但并不限于此。介质的温度典型地为4℃～50℃，优选为30℃～40℃，更优选为36℃～38℃。另外，通过将融化时间典型地设为2分钟以内、特别是设为20秒以内，可大幅抑制细胞的存活率的降低。融化时间例如可通过改变融化手段或浸渍介质的温度、冷冻时的培养液或冷冻保存液的容量或组成等而进行调节。
细胞的洗涤可利用已知的方法进行，例如可通过将细胞悬浮于可包含细胞洗涤液(例：可含有血清、血清成分(血清白蛋白等)的培养液或生理缓冲液等)，进行离心分离，废弃上清液，回收沉淀的细胞而实现，但并不限于此。在洗涤细胞的工序中，可以进行1次或多次(例：2次、3次、4次、5次或以上)上述悬浮、离心分离、回收的循环。本发明的一个方式中，可以在将从T细胞细胞库中采集的T细胞融化的工序之后立刻进行洗涤细胞的工序。作为可在本发明中使用的市售的细胞洗涤液的例子，可举出CELLOTION(Japan ZENYAKU KOGYO)等。
本发明中，作为前述预培养及维持培养的培养基，没有特别限制，可制备用于培养动物细胞的培养基作为基础培养基。根据需要，基础培养基中可以包含培养基添加物等。作为基础培养基及培养基添加物，可举出与上述1-1.的工序(1)中列举的相同的物质。
作为预培养及维持培养的培养时间，可根据目的适当进行，优选进行1天以上(例：5天、6天、7天)，另外，优选10天以下(例：7天、8天、9天、10天)。培养温度没有特别限定，为30℃～40℃，优选为37℃，在含CO2的空气的存在下进行培养，CO2浓度优选为2～5％。
1-4.向由T细胞细胞库准备的T细胞导入核酸
本发明的提供系统可以包括在由T细胞细胞库准备的T细胞中导入包含外源性基因的核酸的步骤(step)(以下也称作“核酸导入步骤”)。本说明书中，“包括步骤”或“包括工序”意味着，包含以执行步骤或工序的方式构成的部分。另外，以下有时将以执行核酸导入步骤的方式构成的部分称作“核酸导入部”。
核酸导入步骤中导入核酸的方法、以及外源性基因及包含其的核酸与上述同样。
核酸导入步骤中进行导入的外源性基因可以与已被导入构成T细胞细胞库的T细胞的外源性基因相同，也可以不同。
核酸导入部具备基础培养基、培养容器、和无菌空间，只要以能够在上述准备的T细胞中导入包含外源性基因的核酸的方式构成即可。本说明书中，无菌空间意味着由洁净通道(Clean Chamber)、洁净工作台、无菌室等划定的无菌的内部空间，由核酸导入部整体划定的无菌的内部空间、及核酸导入部的内部空间的一部分的无菌的空间也包括在该无菌空间中。核酸导入部中具备的装置、培养基等可根据该装置的特性、核酸导入的方法等适当选择。另外，核酸导入部可根据需要具备1种以上的培养基添加物、洁净工作台、孵育器、细胞培养用生物反应器、显微镜、离心机、抽吸器、导入用的核酸、编码用于基因组编辑的蛋白质等的核酸、移液器、管(tube)、缓冲剂(例：乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、柠檬酸盐磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、酒石酸盐缓冲液、Tris缓冲液、磷酸盐缓冲生理盐水、Mcilvaine缓冲液等)、基因导入助剂等，此外，还可根据核酸导入方法的种类而进一步具备其他的试剂、装置等。
核酸导入部所具备的上述基础培养基、培养基添加物的具体例如上所述。另外，作为培养容器，可举出细胞的培养中通常使用的培养皿、瓶(flask)、塑料培养袋、Teflon(注册商标)袋、培养皿、陪替氏培养皿、组织培养用培养皿、多联培养皿、微量培养板、微孔培养板、多联培养板、多孔培养板、室载玻片、细胞培养瓶、旋转培养瓶、管、托盘、培养袋、摇瓶等。这些培养容器的材质没有特别限制，例如可举出玻璃、聚氯乙烯、乙基纤维素、乙酰基纤维素等纤维素系聚合物、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚砜、聚氨酯、聚酯、聚酰胺、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚丁二烯、聚(乙烯-乙酸乙烯酯)共聚物、聚(丁二烯-苯乙烯)共聚物、聚(丁二烯-丙烯腈)共聚物、聚(乙烯-丙烯酸乙酯)共聚物、聚(乙烯-甲基丙烯酸酯)共聚物、聚氯丁二烯、苯乙烯树脂、氯磺化聚乙烯、乙烯乙酸乙烯酯、丙烯酸系嵌段共聚物等塑料等。
作为上述其他的试剂、装置，例如，利用磷酸钙共沉淀法进行核酸导入的情况下，核酸导入部可以具备1种以上的各种试剂溶液(例：CaCl2及其溶液、HCl及其溶液、NaCl及其溶液、MgCl2及其溶液、Na2HPO4及其溶液、KH2PO4及其溶液、NP-40及其溶液、HEPES及其溶液、DMSO及其溶液等)等。例如，使用电穿孔法的情况下，核酸导入部可以具备1种以上的电穿孔仪、电极(例：铂电极、比色皿电极(cuvette electrode)、铂金培养皿电极(petri dishplatinum plate electrode)等)、电穿孔板、腔室(例：电极用腔室、培养板腔室等)等。例如，使用脂质体转染法的情况下，可以具备1种以上的转染用试剂(例：Lipofectamine(invitrogen)、jetPEI(Polyplus-transfection)、XfectTM(Clontech TaKaRacellartis)、GenomONETM(ISHIHARA SANGYO KAISHA))、Trans IT(Mirus Bio LLC)、RmesFect/RmesFect Stem(OZ BIOSCIENCES)等)等。例如，利用病毒载体进行核酸导入的情况下，核酸导入部可以具备1种以上的上述中列举的各种病毒载体、包装载体质粒、包装细胞(例如Plat-E细胞)、互补细胞株、生物安全二级的实验室等。
1-5.扩大培养
本发明的提供系统可以包括对在由T细胞主细胞库准备的T细胞或该T细胞中导入包含外源性基因的核酸而得的T细胞进行扩大培养的步骤(以下，也称作“扩大培养步骤”)。以下，将以执行扩大培养步骤的方式构成的部分称作“扩大培养部”。
本说明书中，“扩大培养”意味着以使所期望的细胞群增殖、增加细胞数为目的而进行培养。细胞数的增加只要通过使细胞增殖带来的增加数量超过死亡引起的减少数量而实现即可，无需细胞群的所有细胞增殖。与开始扩大培养前相比，细胞数的增加可以为1.1倍、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、300倍、500倍、1,000倍、3,000倍、5,000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍以上。
扩大培养步骤也可利用已知的方法进行，从细胞的增殖效率的观点出发，优选通过本申请发明人发现的包括利用CD30激动剂刺激T细胞的工序的方法而进行。通过于CD30激动剂的存在下对T细胞进行培养，能够基于CD30激动剂刺激T细胞，因此优选通过包括于CD30激动剂的存在下对T细胞进行培养的工序的方法而进行。因此，本发明的一个方式中，扩大培养步骤可包括于CD30激动剂的存在下对T细胞进行培养的工序。另外，于CD30激动剂的存在下进行扩大培养的情况下，优选该培养用培养基中还存在CD3/TCR复合物激动剂、及纤连蛋白或其变异体。可利用CD3/TCR复合物激动剂及CD30激动剂分别刺激CD3/TCR复合物及CD30。
与iPS细胞的增殖能力相比，由iPS细胞分化的T细胞的增殖能力低，因此于T细胞阶段构建主细胞库及/或工作细胞库难以供给施予人或多人并能得到所期待的治疗效果的程度的量的T细胞及T细胞产品。本发明克服了该困难。此外，通过使用在扩大培养步骤中包括利用上述CD30激动剂刺激T细胞的工序的方法，能够于T细胞阶段构建主细胞库及/或工作细胞库，更稳定地供给T细胞产品。
本说明书中，“刺激”意味着某物质结合于各种受体等并激活其下游的信号通路。
本发明中，作为T细胞的扩大培养步骤中使用的培养基，没有特别限制，可制备用于培养动物细胞的培养基作为基础培养基。根据需要，基础培养基中可以包含培养基添加物等。作为基础培养基及培养基添加物，可举出与上述1-1.的工序(1)中列举的相同的物质。培养例如可在CO2孵育器中、于约1～约10％、优选约2～约5％的CO2浓度的气氛下、以约30～约40℃、优选约37℃进行。另外，关于培养时间，能够由本领域技术人员监测T细胞的数量等而适当决定。只要可得到T细胞，天数没有特别限定，例如至少3天以上、5天以上、7天以上、10天以上、14天以上、21天以上，优选7天以上15天以下。另外，优选30天以下，更优选21天以下。培养时间例如为3～30天、5～30天、7～30天、10～30天、14～30天、21～30天、3～21天、5～21天、7～21天、10～21天、14～21天、3～15天、5～15天、7～15天、10～15天、14～15天等。
扩大培养步骤中使用维生素C类的情况下，可举出与工序(2-1)中记载的相同的物质，并能以同样的方式进行添加。某一实施方式中，培养基中或培养液中的维生素C类的浓度优选为5μg/ml～200μg/ml。另一实施方式中，在培养液中添加与5μg/ml～500μg/ml相当的量(例：与5μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml相当的量)的该维生素C类。
扩大培养步骤中使用CD3/TCR复合物激动剂的情况下，作为该步骤中使用的CD3/TCR复合物激动剂，可举出与上述1-1.的工序(3)中记载的相同的物质。另外，CD3/TCR复合物激动剂在培养基中的浓度也与上述1-1.的工序(3)中记载的浓度同样。
扩大培养步骤中，优选培养基中存在纤连蛋白或其变异体。该纤连蛋白只要为可结合于T细胞的分子，则没有特别限制。纤连蛋白的变异体只要为可结合于T细胞表面的VLA-5及VLA-4的分子，则没有特别限制，例如可举出RetroNectin。纤连蛋白或其变异体在培养基中的存在形态为任意。例如，可以在培养时含有在培养基中，也可以固定化于培养容器，优选固定化于培养容器。
培养基中含有纤连蛋白或其变异体的情况下，培养基可以与含有CD3/TCR复合物激动剂的培养基同样。另外，血清、添加物等的有无也可以与含有CD3/TCR复合物激动剂的培养基同样。培养基中含有纤连蛋白或其变异体的情况下，对于纤连蛋白或其变异体的浓度，作为下限，可以为10ng/ml以上，优选为100ng/ml以上，作为上限，可以为10000μg/ml以下，优选为1000μg/ml以下。
扩大培养步骤中，优选培养基中存在CD30激动剂。该CD30激动剂只要为可通过特异性结合于CD30而将信号从CD30传递至细胞内的分子，则没有限制。作为CD30激动剂，例如可举出选自由抗CD30激动剂抗体(也简称作“抗CD30抗体”或其结合片段及CD30配体或其结合片段组成的组中的至少一者。
扩大培养步骤中使用的CD30激动剂与CD3/TCR复合物激动剂同样，只要以培养时能与CD30接触的方式存在，则其存在形态为任意。例如，可以在培养时含有在培养基中，也可以固定化于培养容器，优选含有在培养基中。
培养基中含有CD30激动剂的情况下，培养基可以与含有CD3/TCR复合物激动剂的培养基同样。另外，血清、添加物等的有无也可以与含有CD3/TCR复合物激动剂的培养基同样。培养基中含有CD30激动剂的情况下，培养基中的CD30激动剂的浓度可由本领域技术人员根据CD30激动剂而适当决定。例如，CD30激动剂为抗CD30激动剂抗体或其结合片段的情况下，培养基中的抗CD30激动剂抗体或其结合片段的浓度通常为1ng/ml～10000ng/ml，优选为30ng/ml～300ng/ml。
另外，CD30激动剂固定化于培养容器的情况下，培养容器可以与固定化有CD3/TCR复合物激动剂的培养容器为同一培养容器。另外，将CD30激动剂向培养容器进行固定化的方法也可以与CD3/TCR复合物激动剂的固定化方法同样。对于使CD30激动剂向培养容器固定化时的CD30激动剂的溶液的浓度，作为下限，可以为0.1ng/ml以上，优选为1ng/ml以上，作为上限，可以为10000ng/ml以下，优选为1000ng/ml以下。该浓度例如为0.1～10000ng/ml、1～10000ng/ml、0.1～1000ng/ml、1～1000ng/ml、30ng/ml～300ng/ml等。
扩大培养步骤中使用细胞因子的情况下，作为细胞因子，可举出IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21等，它们可以仅使用1种，或也可以使用多种(优选所有种类)。细胞因子为IL-2的情况下，培养基中的其浓度可以为10U/ml～1000U/ml或0.01ng/mL～1000000ng/mL，为IL-7的情况下，培养基中的其浓度可以为0.1ng/ml～1000ng/ml、1ng/ml～500ng/ml、5ng/ml～100ng/ml(例如，10ng/ml)。另外，IL-12在培养基中的浓度可以为0.1ng/ml～1000ng/ml、1ng/ml～500ng/ml、5ng/ml～100ng/ml(例如，50ng/ml)，IL-15在培养基中的浓度可以为0.1ng/ml～1000ng/ml、1ng/ml～500ng/ml、5ng/ml～100ng/ml(例如，10ng/ml)，IL-18在培养基中的浓度可以为0.1ng/ml～1000ng/ml、1ng/ml～500ng/ml、5ng/ml～100ng/ml(例如，50ng/ml)，IL-21在培养基中的浓度可以为0.1ng/ml～1000ng/ml、1ng/ml～500ng/ml、5ng/ml～100ng/ml(例如，20ng/ml)。
扩大培养步骤中，培养基中还可以包含TNF家族细胞因子作为细胞因子。作为TNF家族细胞因子，例如可举出TNF-α、TNF-β、淋巴毒素α、Fas配体、TRAIL、TWEAK、TL1A、RANK配体、OX40配体、APRIL、AITRL、BAFF、4-1BBL及CD40配体等，优选TL1A。使用TL1A的情况下，作为其在培养基中的浓度，可以为5ng/ml～500ng/ml，优选为10ng/ml～300ng/ml，更优选为20ng/ml～200ng/ml(例如，50ng/ml)。
另外，扩大培养步骤中，培养基中还可以包含细胞凋亡抑制剂。作为细胞凋亡抑制剂，可举出蛋白酶抑制剂，例如，可举出半胱天冬酶抑制剂。作为半胱天冬酶抑制剂，优选Pan Caspase FMK inhibitor Z-VAD(N-苄基氧基羰基-Val-Ala-Asp(O-Me)氟甲基酮，N-benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp(O-Me)fluoromethylketone)(以下有时也称作“Z-VAD-FMK”)，作为其在培养基中的浓度，可以为1μM～1000μM，优选为1μM～500μM，更优选为1μM～200μM，特别优选为1μM～50μM(例如，10μM)。
本发明中，得到的T细胞可以进行分离而使用，也可以直接(即，作为可能含有其他细胞种类的细胞群)使用。进行分离的情况下，可使用选自由αTCR、βTCR及CD3组成的组中的至少一个分子作为指标而进行分离，该分离的方法可使用本领域技术人员已知的方法。例如可举出：使用(根据需要结合有磁珠等的)αTCR、βTCR及CD3的抗体，利用流式细胞术或利用磁性细胞分离法进行分离的方法；使用固定化有所期望的抗原的亲和柱等进行纯化的方法，但并不限于此。
另外。直接使用的情况下，可以使用本领域技术人员已知的方法，增加T细胞在细胞群中所占的比例。作为增加细胞群中T细胞所占的比例的方法，可举出Front.Immunol.,5：636(2014)、日本特表2017-537625、日本特表2003-529363等的方法，但并不限于此。
因此，扩大培养部具备基础培养基、培养容器、和无菌空间，还优选具备CD3激动剂，只要以可对T细胞进行扩大培养的方式构成即可。核酸导入部中具备的装置、培养基等可根据该装置的特性、扩大培养的方法等适当选择。使用CD3激动剂的情况下，扩大培养部所具备的培养容器与CD30激动剂可以为CD30固定化于培养容器的形态。另外，扩大培养部可根据需要具备1种以上的CD3/TCR复合物激动剂、纤连蛋白或其变异体、细胞凋亡抑制剂、培养基添加物、洁净工作台、孵育器、细胞培养用生物反应器、显微镜、离心机、抽吸器、移液器、管、缓冲剂(例：乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、柠檬酸盐磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、酒石酸盐缓冲液、Tris缓冲液、磷酸盐缓冲生理盐水、Mcilvaine缓冲液等)等，此外，还可根据培养方法的种类而进一步具备其他的试剂、装置等。特别是使用细胞因子作为培养基添加物的情况下，作为适宜的细胞因子，例如可举出IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、TNF家族细胞因子等。
扩大培养部所具备的上述基础培养基、培养基添加物、CD3激动剂、CD3/TCR复合物激动剂、纤连蛋白或其变异体及细胞凋亡抑制剂的具体例如上所述。另外，作为培养容器的具体例，可举出与1-4.中记载的相同的培养容器。将经扩大培养的T细胞填充于适宜的保存容器(无菌瓶、输血袋等)，根据需要，在该容器上贴附标签，对该容器进行包装，由此可制备T细胞产品。
1-6.冷冻T细胞产品的制备
本发明的提供系统可以包括由前述经扩大培养的T细胞制备冷冻T细胞产品的步骤(以下也称作“冷冻T细胞产品制备步骤”)。以下有时将以执行冷冻T细胞产品制备步骤的方式构成的部分称作“冷冻T细胞产品制备部”。
冷冻T细胞产品制备步骤可利用与1-2.同样的方法进行。
因此，冷冻T细胞产品制备部至少具备冷冻保存剂、冷冻保存容器、冷冻装置及/或冷冻保存系统(例：Locator等)，只要以可制备经扩大培养的T细胞的冷冻储存的方式构成即可。另外，冷冻储存制备部可根据需要具备1种以上的低温的介质(例：液氮等)、移液器、管、缓冲剂(例：乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、柠檬酸盐磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、酒石酸盐缓冲液、Tris缓冲液、磷酸盐缓冲生理盐水、Mcilvaine缓冲液等)等。
冷冻T细胞产品制备部所具备的冷冻保存剂、冷冻装置的具体例如上所述。另外，作为冷冻保存容器的具体例，可举出冻存管(cryovial)(例：玻璃安瓿、塑料管等)等。
1-7.T细胞产品集合的构建
本发明的提供系统可以包括收集T细胞产品并构建包含2种以上的T细胞产品的T细胞产品集合的步骤(以下也称作“T细胞产品集合构建步骤”)。以下有时将以执行T细胞产品集合构建步骤的方式构成的部分称作“T细胞产品集合构建部”。
构成T细胞产品集合的T细胞产品可以为冷冻T细胞产品，进行长期保存的情况下，从T细胞的稳定性的观点出发，优选为冷冻T细胞产品。
T细胞产品集合构建步骤也可利用已知的方法进行。作为该方法，例如可通过利用上述的方法制备2种以上的T细胞产品，以可区分T细胞产品的种类的方式附上标签等，进行保管，由此进行构建。也可通过在该构建的T细胞产品集合中进一步追加不同种类的T细胞产品，从而追加集合的种类。从保管的容易性出发，优选保管在同一空间(例：同一冷冻装置内、同一房间内、同一建筑物内、同一场地等)，也可以保管在物理上分离的空间。对于T细胞产品的种类的区分，只要可区分种类，可以使用任意的方法，例如可进行下述方法：在容器上附上标签等；保存于不同的冷冻装置、冷冻保存系统的情况下，在这些冷冻装置、冷冻保存系统上附上标签等；或使用管理软件等进行区分等。
因此，T细胞产品集合构建部至少具备作为收集对象的T细胞产品，以收集如上述方式构建的T细胞产品并可构建包含2种以上的T细胞产品的T细胞产品集合的方式构成即可。另外，T细胞产品集合构建部可根据需要具备1种以上的标签、冷冻装置、冷冻保存系统、管理软件等。冷冻装置的具体例如上所述。
1-8.抗原的鉴定
本发明的提供系统可以包括对受试者的肿瘤中表达的肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原(以下，也简称作“抗原”)进行鉴定的步骤(以下也称作“抗原鉴定步骤”)。以下有时将以执行抗原鉴定步骤的方式构成的部分称作“抗原鉴定部”。
抗原鉴定步骤也可利用已知的方法进行。作为该方法，例如可从受试者采集肿瘤组织片、可能包含肿瘤细胞的体液(例：血液、血清、血浆等)等生物体样品，从该样品中提取mRNA，根据需要由该mRNA合成cDNA，使用该核酸，利用数字PCR(例：ddPCR)、RT-PCR、生物芯片(例：微阵列)、RNAseq等核酸扩增方法及/或核酸检测方法，进行鉴定。PCR例如可使用能够扩增肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原的mRNA的引物对和PCR装置而进行。另外，使用RNAseq的情况下，可使用下一代测序仪进行。
因此，抗原鉴定部只要以可对受试者的肿瘤中表达的肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原进行鉴定的方式构成即可。例如，抗原鉴定部至少具备上述引物对与PCR装置，或至少具备上述生物芯片，或至少具备上述下一代测序仪。
作为上述下一代测序仪，可举出illumina公司制的装置(例：MiSeq、HiSeq2500)、Thermo Fisher Scientific公司制的装置(例：Ion Proton、Ion PGM)、罗氏诊断(RocheDiagnostic)公司制的装置(例：GS FLX+、GS Junior)等，但不限于这些装置。
1-9.T细胞产品的选择
本发明的提供系统可获取受试者的信息并基于该信息选择适宜的T细胞产品。因此，本发明的提供系统可以包括受试者信息获取步骤及/或选择适合受试者的T细胞产品的步骤。以下有时将以执行受试者信息获取步骤的方式构成的部分称作“受试者信息获取部”。
作为受试者的信息，没有特别限定，例如可举出受试者的基因信息(例如，HLA基因相关信息、异常基因信息等)、诊断结果、既往史、用药史、年龄、性别、血型、身高、体重、受试者具有肿瘤时与该肿瘤中表达的肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原有关的信息等。
本发明的一个方式中可以包括根据受试者的信息从包含T细胞产品的T细胞产品集合中选择表达可识别并结合经鉴定的抗原的CAR或外源性TCR的T细胞产品的步骤(以下也称作“T细胞产品选择步骤”)。以下有时将以执行T细胞产品选择步骤的方式构成的部分称作“T细胞产品选择部”。T细胞产品选择步骤中的T细胞产品可以为冷冻T细胞产品，从T细胞的稳定性的观点出发，优选为冷冻T细胞产品。
从包含T细胞产品的T细胞产品集合中选择表达可识别并结合经鉴定的抗原的CAR或外源性TCR的T细胞产品的步骤在概念上包括基于获取的受试者的信息选择适合受试者的T细胞产品的步骤。受试者信息获取部可包含抗原鉴定部。本发明的一个方式中，T细胞产品选择步骤可基于例如提供的T细胞产品的制备计划书的记载内容等，选择包含表达适宜的CAR、外源性TCR、细胞因子、趋化因子等的T细胞的T细胞细胞库。
T细胞产品选择步骤可利用已知的方法进行。作为该方法，例如，可通过基于显示上述抗原鉴定步骤带来的鉴定结果的资料(纸介质或电子数据介质)，从预先制作的T细胞产品的清单等中选择包含表达可识别并结合经鉴定的抗原的CAR或外源性TCR的T细胞的T细胞产品而进行。通过抗原鉴定步骤确认到多种肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原的表达的情况下，可基于表达量最高、或利用T细胞产品最能期待其效果等评价标准，选择包含T细胞的T细胞产品。所选择的T细胞产品的种类可以仅为1种，或也可以为2种以上。这些步骤可以使用为了选择上述T细胞产品而设计的软件。T细胞产品可根据医师或医疗机构等的指示(处方笺等)而进行选择。
因此，T细胞产品选择部至少具备显示抗原鉴定步骤带来的鉴定结果的资料，只要以可从包含T细胞产品的T细胞产品集合中选择表达可识别并结合经鉴定的抗原的CAR或外源性TCR的T细胞产品的方式而构成即可。另外，T细胞产品选择部可根据需要具备1种以上的T细胞产品的清单、为了选择上述T细胞产品而设计的软件等。
T细胞细胞库构建部、T细胞细胞库集合构建部(后述)、T细胞细胞库选择部(后述)、冷冻T细胞产品制备部、T细胞产品集合构建部及T细胞产品选择部中，管理与构成T细胞细胞库及T细胞产品的T细胞有关的信息(以下称作“T细胞相关信息”)。作为T细胞相关信息，包含与该T细胞有关的制备记录、特性分析结果、质量评估结果、保存温度管理记录、制备计划等。另外，该T细胞为源自iPS细胞的T细胞的情况下，包含与该iPS细胞有关的制备记录、特性分析结果、质量评估结果、保存温度记录、特定的基因信息等。另外，该T细胞为导入有编码外源性基因的核酸的T细胞的情况下，包括该外源性基因的信息(例如，该外源性基因所编码的蛋白质及细胞因子等的种类等)等。T细胞细胞库选择部及T细胞产品选择部中，可基于作为提供对象的T细胞产品的制备计划书的记载内容等，分别选择T细胞细胞库及T细胞产品。T细胞细胞库选择部及T细胞产品选择部中，可以进一步基于受试者信息获取部获取的受试者的信息，分别选择适宜的T细胞细胞库及T细胞产品。因此，T细胞细胞库选择部及T细胞产品选择部即使在T细胞细胞库及/或T细胞产品仅为1种的情况下也可使用。
参考图16边对本发明的一个方式进行说明。需要说明的是，本说明书及附图中，对于实质具有同一功能构成的构成要素，通过附以相同符号来省略重复的说明。
如图16所示，T细胞产品提供系统100由T细胞细胞库102准备T细胞，以提供T细胞产品131。T细胞细胞库102可以通过T细胞细胞库构建部101而构建。另外，构建2种以上的T细胞细胞库的情况下，可以通过T细胞细胞库集合构建部111收集这些T细胞细胞库而构建T细胞细胞库集合112。
所准备的T细胞可以根据需要在核酸导入部103中导入所期望的外源性基因。进一步，该T细胞可以根据需要在扩大培养部104中进行扩大培养。此外，该T细胞可以根据需要在冷冻T细胞产品制备部105中被冷冻，制成冷冻T细胞产品106。制备2种以上的冷冻T细胞产品的情况下，可以通过T细胞产品集合构建部121收集这些冷冻T细胞产品而构建T细胞产品集合122。
另外，T细胞细胞库选择部154及T细胞产品选择部155中，可基于T细胞相关信息171，分别选择适宜的T细胞细胞库及T细胞产品作为提供的T细胞产品131。该T细胞相关信息在T细胞细胞库构建部101、T细胞细胞库集合构建部111、T细胞细胞库选择部154、T细胞产品集合构建部121及T细胞产品选择部155中进行管理。
另外，为了提供更适合受试者的治疗及/或予防的T细胞产品，可以用受试者信息获取部152获取受试者的信息151，基于该受试者的信息，通过T细胞产品选择部155选择适宜的T细胞产品131。T细胞产品为1种的情况下，T细胞产品131与T细胞产品106相同，从T细胞产品集合122中选择的情况下，T细胞产品131可以为该T细胞产品集合122中所含的1种或多种T细胞产品。受试者信息获取部可包含抗原鉴定部153。基于受试者信息获取部152中获取的信息，可以通过T细胞细胞库选择部154选择适宜的T细胞细胞库161。T细胞细胞库为1种的情况下，T细胞细胞库161与T细胞细胞库102相同，从T细胞细胞库集合112中选择的情况下，T细胞细胞库161可以为该T细胞细胞库集合112中所含的1种或多种T细胞细胞库。可由T细胞细胞库161准备T细胞，以与上述同样的方式提供T细胞产品。
接着，对受试者信息获取部、T细胞细胞库构建部、T细胞细胞库选择部及/或T细胞产品选择部中可包含的硬件的构成进行说明。由于T细胞细胞库选择部与T细胞产品选择部具有同样的硬件结构，因而此处对T细胞产品选择部中可包含的硬件结构进行说明。
图17为示出T细胞产品选择部200中可包含的硬件结构的一个例子的图。如图17所示，T细胞产品选择部200具有处理器201、存储器202、辅助存储装置203、I/F(Interface，接口)装置204、通信装置205、驱动装置206。需要说明的是，T细胞产品选择部200的各硬件介由总线207相互连接。
处理器201具有CPU(中央处理器，Central Processing Unit)、GPU(图形处理器，Graphics Processing Unit)等各种运算装置。处理器201在存储器202上读取并执行辅助存储装置203中安装的各种软件等程序。
存储器202具有ROM(只读存储器，Read Only Memory)、RAM(随机存取存储器，Random Access Memory)等主存储装置。处理器201与存储器202形成所谓的计算机，处理器201执行于存储器202上读取的各种软件等程序，从而该计算机实现各种功能。
辅助存储装置203储存各种软件等程序、通过处理器201执行各种软件等程序时使用的各种信息(例如，T细胞相关信息、受试者的信息等)及数据。
I/F装置204为连接操作装置210及显示装置211与T细胞产品选择部200的连接装置。I/F装置204介由操作装置210接收针对T细胞产品选择部200的各种指示。另外，I/F装置204介由显示装置211输出T细胞产品选择部200带来的处理结果。
通信装置205为用于介由网络与其他装置进行通信的通信装置。
驱动装置206为用于设置记录介质212的装置。此处所说的记录介质212包含CD-ROM、软盘、光磁盘等这样以光、电或磁的方式记录信息的介质。另外，记录介质212可以包含ROM、快闪存储器等这样以电记录信息的半导体存储器等。
需要说明的是，辅助存储装置203中安装的各种软件等程序可通过例如将分配的记录介质212设置于驱动装置206、并通过驱动装置206读取该记录介质212中记录的各种软件等程序而安装。或者，可以通过介由通信装置205从网络下载辅助可安装至存储装置203的各种软件等程序并进行安装。
1-10.T细胞产品的用途
由本发明的提供系统提供的T细胞产品可对例如癌细胞、癌干细胞、肿瘤细胞等显示细胞毒活性，因此可用于癌、肿瘤的予防或治疗，可施予受试者。本说明书中，受试者意味着在临床试验等中被施予T细胞产品的哺乳动物(例：小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猫、犬、牛、羊、猴、人)等，优选受试者为人。
可利用上述T细胞产品予防或治疗的癌、肿瘤记载于例如“Daniel Baumhoer等,AmJ.Clin Pathol,2008,129,899-906”等中。具体而言，可举出肝癌(例：肝细胞癌)、卵巢癌(例：卵巢透明细胞腺癌)、儿童癌症、肺癌(例：鳞状细胞癌、小细胞肺癌)、睾丸癌(例：睾丸非精原细胞瘤)、软组织肿瘤(例：脂肪肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤)、子宫癌(例：宫颈上皮内肿瘤、宫颈鳞状细胞癌)、黑色素瘤、肾上腺肿瘤(例：肾上腺腺瘤)、神经性肿瘤(例：神经鞘瘤)、胃癌(例：胃腺癌)、肾癌(例：格拉维茨氏瘤)、乳腺癌(例：浸润性小叶癌、粘液癌)、甲状腺癌(例：髓样癌)、喉癌(例：鳞状细胞癌)、膀胱癌(例：浸润性移行细胞癌)等，但并不限于此。
上述T细胞产品中所含的T细胞可以在施予至对象前使用适宜的培养基及/或刺激分子进行培养及/或刺激。作为刺激分子，可举出细胞因子类、适宜的蛋白质、其他成分等，但并不限于此。作为细胞因子类，可例示例如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IFN-γ等，可优选使用IL-2。作为IL-2在培养基中的浓度，没有特别限定，例如，适宜为0.01～1×105U/mL，更适宜为1～1×104U/mL。另外，作为适宜的蛋白质，例如可例示出CD3配体、CD28配体、抗CD3抗体、抗CD30抗体、抗IL-4抗体。另外，其他还可以添加凝集素等淋巴细胞刺激因子。此外，可以在培养基中添加血清、血浆。它们在培养基中的添加量没有特别限定，可例示出0体积％～20体积％，另外，可根据培养阶段变更使用的血清、血浆的量。例如，也可以阶段性地降低血清或血浆浓度而使用。作为血清或血浆的来源，自体或异体中的任一者均可，从安全性的观点出发，优选源自自体的血清或血浆。
上述T细胞优选以非口服地施予至对象而使用。作为非口服的施予方法，可举出静脉内、动脉内、肌肉内、腹腔内、及皮下施予等的方法。施予量可根据对象的状态、体重、年龄等适当选择，通常对体重60kg的对象，以每一次以细胞数计通常成为1×106～1×1010个的方式、优选成为1×107～1×109个的方式、更优选成为5×107～5×108个的方式进行施予。另外，可以以1次进行施予，也可以分多次进行施予。
2. T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库的构建方法
另外，本发明提供构建上述T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库的方法(以下有时也称作“本发明的细胞库构建方法”)。本发明的一个方式中，上述外源性基因为CAR基因的情况下，本发明的细胞库构建方法包括下述工序：(I)使不具有CAR基因的诱导多潜能干细胞分化成用于CAR-T疗法的T细胞的工序；(II)储存该分化的T细胞的工序；及(III)进行该分化的T细胞的特性分析的工序。上述工序(II)与(III)通常依次进行，但是也可以在工序(III)之后进行工序(II)。另外，另一方式中，上述外源性基因为TCR基因的情况下，本发明的细胞库构建方法包括下述工序：(i)使不具有外源性TCR基因的诱导多潜能干细胞分化成用于TCR-T疗法的T细胞的工序；(ii)储存该分化的T细胞的工序；及(iii)进行该分化的T细胞的特性分析的工序。上述工序(ii)与(iii)通常依次进行，但是也可以在工序(iii)之后进行工序(ii)。上述各工序可以由同一主体进行，也可以由不同主体进行。
另外，本发明的另一方式中，提供通过本发明的细胞库构建方法构建的T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库(以下有时也称作“本发明的T细胞细胞库”)。
2-1.由不具有CAR基因或外源性TCR基因的诱导多潜能干细胞向T细胞的分化诱导
上述2.的工序(I)及(i)可使用不具有CAR基因及/或外源性TCR基因的诱导多潜能干细胞，利用上述1-1.的工序(1)及(2)中记载的方法而进行。工序(I)中的用于CAR-T疗法意味着于T细胞表达的CAR带来的治疗或予防用途，排除了通过于T细胞表达的外源性TCR及内源性TCR进行治疗或予防，该T细胞可以包含出于除了治疗或予防目的以外的其他目的、例如上述1-1.中记载的那样的抑制内源性TCR基因的表达的目的及有效地制备均一的T细胞的目的而导入的外源性TCR基因等。同样地，工序(i)中的用于TCR-T疗法意味着于T细胞表达的外源性TCR带来的治疗或予防用途，排除了通过于T细胞表达的CAR及内源性TCR进行治疗或予防，该T细胞中可以包含出于除了治疗或予防目的以外的其他目的、例如上述1-1.中记载的那样的抑制内源性TCR基因的表达的目的等而导入的外源性TCR基因等。
上述工序(I)及(i)中的CAR及TCR的说明、TCR、CAR靶向的抗原的具体例、T细胞等各用语的定义与上述1.及1-1.中记载的定义相同。另外，上述工序中分化诱导而得到的T细胞的具体例与上述1.中记载的T细胞的具体例相同。该T细胞优选为细胞毒性T细胞，更优选为表达CD8αβ的CD8αβ阳性细胞毒性T细胞。
2-2.分化的T细胞的储存
上述2.的工序(III)及(iii)可使用上述2-1.中得到的T细胞，利用上述1-1.及1-2.中记载的方法而进行。
本发明的细胞库构建方法及本发明的T细胞细胞库中使用的诱导多潜能干细胞可利用上述1-1.中记载的方法而建立。另外，前述诱导多潜能干细胞或上述2.的工序(II)及(ii)中使用的T细胞与上述1-1.中记载的细胞同样地优选至少1种HLA基因的表达被抑制。具体的HLA基因、组合、该基因的表达的抑制的定义、抑制方法等与上述1-1.中记载的相同。
2-3.T细胞的特性分析
上述2.的工序(III)及(iii)中的特性分析的试验项目根据作为细胞库的对象的细胞的生物学性质(例如，营养缺陷性)、培养经历及试验的实施可行性而有所不同，可由本领域技术人员、或基于本领域技术人员与监管机构的协议内容等而适当设定。这些构建方法以及特性分析及质量评估结果有关的信息在各国的生产及上市许可申请中被提交给药监局。T细胞细胞库的特性分析中，主要对没有混入外源性感染性因子进行评价。特别是外源性病毒引起的污染在临床使用中可能会导致严重的事态，因此按照ICH Q5A(R1)彻底地进行评价。作为其他试验，有用于检测其他细胞株引起的交叉污染的同一性试验。另外，有时也实施核型分析、致瘤性试验。
作为质量评估的试验项目，可举出作为T细胞的使用了适宜的细胞表型的确认试验、纯度试验、源自制备工序的杂质试验、及细胞数、细胞存活率等含量试验等。
2-4.T细胞细胞库集合的构建
本发明的提供系统可以包括收集T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库，构建包含2种以上的T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库的T细胞主细胞库集合及/或T细胞工作细胞库集合(以下也称作“T细胞细胞库集合”)的步骤(以下也称作“T细胞细胞库集合构建步骤”)。本说明书中，有时将以执行T细胞细胞库集合构建步骤的方式构成的部分称作“T细胞细胞库集合构建部”。
在用于提供1个或2个以上的T细胞产品的T细胞细胞库可能不足的情况下、根据施予对象的特性而考虑适合使用来自不同种类的T细胞细胞库中的T细胞产品的情况下，可在现有的T细胞细胞库中追加另行构建的T细胞细胞库。如此，通过收集多个T细胞细胞库并构建T细胞细胞库集合，可提供更稳定牢固的T细胞产品的提供系统。
T细胞细胞库集合构建步骤也可利用已知的方法进行。作为该方法，例如可通过利用上述的本发明的细胞库构建方法制备2种以上的T细胞细胞库，以可区分T细胞细胞库的种类的方式附上标签等，进行保管，由此进行构建。也可通过在该构建的T细胞细胞库集合中进一步追加不同种类的T细胞细胞库，从而追加集合的种类。从保管的容易性出发，优选保管在同一空间(例：同一冷冻装置内、同一房间内、同一建筑物内、同一场地等)，也可以保管在物理上分离的空间。对于T细胞细胞库的种类的区分，只要可区分种类，可以使用任意的方法，例如可进行下述方法：在冷冻保存容器上附上标签等；保存于不同的冷冻装置、冷冻保存系统的情况下，在这些冷冻装置、冷冻保存系统上附上标签等；或使用管理软件等进行区分等。
因此，T细胞细胞库集合构建部至少具备作为收集对象的T细胞细胞库。只要以可收集以上述方式构建的T细胞细胞库，并构建包含2种以上的T细胞细胞库的T细胞细胞库集合的方式构成即可。另外，T细胞细胞库集合构建部可以根据需要具备1种以上的标签、冷冻装置、冷冻保存系统、管理软件等。冷冻装置的具体例如上所述。T细胞细胞库集合的构建可以由与构建T细胞细胞库的主体相同的主体进行，也可以由不同主体进行。T细胞细胞库集合可包含由不同主体构建的T细胞细胞库。
2-4-1.T细胞细胞库的选择
本发明的提供系统可以包括从包含T细胞细胞库的T细胞细胞库集合中选择用于制备提供的T细胞产品的T细胞细胞库的步骤(以下也称作“T细胞细胞库选择步骤”)。本说明书中，有时将以执行T细胞细胞库选择步骤的方式构成的部分称作“T细胞细胞库选择部”。
T细胞细胞库选择步骤可利用已知的方法进行。作为该方法，例如，可基于提供的T细胞产品的制备计划书的记载内容等，选择包含表达适宜的T细胞受体的T细胞的T细胞细胞库。
另外，本发明的一个方式中，可获取受试者的信息，并基于该信息选择适宜的T细胞细胞库。因此，本发明的提供系统可以包括获取受试者的信息的步骤(以下也称作“受试者信息获取步骤”)及/或选择适合受试者的T细胞细胞库的步骤。以下有时将以执行获取受试者的信息的步骤的方式构成的部分称作“受试者信息获取部”。
作为受试者的信息，没有特别限定，例如可举出受试者的基因信息(例如，HLA基因相关信息、异常基因信息等)、诊断结果、既往史、用药史、年龄、性别、血型、身高、体重、受试者具有肿瘤时与该肿瘤中表达的肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原有关的信息等。
3.制备T细胞产品的方法
另外，另一方式中，本发明提供制备T细胞产品的方法(以下有时也称作“本发明的T细胞产品的制法”)，该方法可以包括下述工序：(A)由本发明的T细胞细胞库准备T细胞的工序；(B)在该准备的T细胞中导入CAR基因或外源性TCR基因的工序；及(C)对该导入有CAR基因或外源性TCR基因的T细胞进行扩大培养的工序。本发明的T细胞产品的制法还可以包括(D)对该经扩大培养的T细胞进行冷冻的工序。另外，还提供通过本发明的T细胞产品的制法制备的T细胞产品(以下有时也称作“本发明的T细胞产品”)。上述各工序可以由同一主体进行，也可以由不同主体进行。
3-1.T细胞的准备
上述3.的工序(A)可使用本发明的T细胞细胞库，利用上述1-3.中记载的方法而进行。
3-2.核酸的导入
上述3.的工序(B)可使用上述3-1.的方法中准备的T细胞，利用上述1-4.中记载的方法而进行。另外，优选工序(B)中使用的T细胞表达IL-15/IL-15Rα。核酸的种类、CAR、TCR及IL-15/IL-15Rα的说明、各用语的定义、TCR、CAR靶向的抗原的具体例等与上述1-1.中记载的相同。可见，一个方式中，本发明的冷冻储存的制法中使用的T细胞、或本发明的T细胞冷冻储存中所含的T细胞的特征可在于，前述CAR或外源性TCR识别并结合上述1-1.的肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原。
3-3.扩大培养
上述3.的工序(C)可使用以上述3-2.的方法导入有核酸的T细胞，利用上述1-5.中记载的方法而进行。扩大培养的方法、扩大培养中使用的化合物的具体例、该化合物在培养基中的浓度、各用语的定义等与上述1-5.中记载的相同。可见，一个方式中，本发明的冷冻储存的制法可包括于CD30激动剂的存在下培养前述T细胞的工序。
3-4.T细胞的冷冻
上述3.的工序(D)可使用以上述3-3.的方法扩大培养的T细胞，利用上述1-2.中记载的方法而进行。
4.T细胞产品集合的构建方法
此外，另一方式中，本发明提供包含2种以上的T细胞产品的T细胞产品集合的构建方法(以下有时也称作“本发明的T细胞产品集合构建方法”)，该方法可包括收集本发明的T细胞产品的工序。另外，还提供通过本发明的T细胞产品集合构建方法构建的T细胞产品集合(以下有时也称作“本发明的T细胞产品集合”)。构成本发明的T细胞产品集合的T细胞产品可以为冷冻T细胞产品，从T细胞的稳定性的观点出发，优选为冷冻T细胞产品。
收集本发明的T细胞产品的工序可使用本发明的T细胞产品，利用上述1-7.中记载的方法而进行。T细胞产品集合中所含的T细胞产品可以由与构成T细胞产品集合的主体相同的主体制备，也可以由不同的主体制备。因此，T细胞产品集合可包含由不同的主体制备而得的T细胞产品。
5.T细胞产品的制备方法
另外，本发明还提供T细胞产品的制备方法(以下有时也称作“本发明的T细胞产品的制法”)，该方法可包括构建T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库的工序。
T细胞、T细胞产品、主细胞库、工作细胞库等具体例、用语的定义与上述1-1.中记载的相同。另外，上述多潜能干细胞、T细胞、T细胞产品、主细胞库及工作细胞库可利用例如上述1.及2.中记载的方法等而制备·构建。另外，本发明的T细胞产品的制法可包括下述工序：(a)使多潜能干细胞分化成T细胞的工序；(b)储存该分化的T细胞的工序；(c)进行该分化的T细胞的特性分析的工序；(d)由该细胞的储存准备T细胞的工序；(e)在T细胞中导入包含外源性基因的核酸的工序；及/或(f)对T细胞进行扩大培养的工序。另外，本发明的T细胞产品的制法中使用的T细胞可以为至少一种HLA基因的表达被抑制的T细胞。具体的HLA基因、组合、该基因的表达的抑制的定义、抑制方法等与上述1-1.中记载的相同。上述各工序可以由同一主体进行，也可以由不同主体进行。
上述5.的工序(a)可使用上述1-1.中记载的多潜能干细胞，利用上述1-1.的工序(1)及(2)中记载的方法而进行。上述多潜能干细胞优选为诱导多潜能干细胞，更优选为人诱导多潜能干细胞。本发明的细胞库构建方法及本发明的T细胞细胞库中使用的诱导多潜能干细胞可利用上述1-1.中记载的方法而建立。上述5.的工序(b)可使用通过上述工序(1)分化的T细胞，利用上述1-1.及1-2.中记载的方法而进行。上述5.的工序(c)可使用通过上述工序(1)分化的T细胞，利用上述2-2.中记载的方法而进行。上述工序(d)可使用通过上述工序(c)制备的细胞的储存，利用上述1-3.中记载的方法而进行。
上述5.的工序(e)可使用通过前述工序(a)分化的T细胞、通过前述工序(b)储存的细胞、通过前述工序(c)进行了特性分析的T细胞、或通过前述工序(d)准备的T细胞，利用上述1-4.中记载的方法而进行。另外，优选工序(e)中使用的T细胞表达IL-15/IL-15Rα。核酸的种类、CAR、TCR及IL-15/IL-15Rα的说明、各用语的定义、TCR、CAR靶向的抗原的具体例等与上述1-1.中记载的相同。可见，一个方式中，本发明的冷冻储存的制法中使用的T细胞、或本发明的T细胞冷冻储存中所含的T细胞的特征可在于，前述CAR或外源性TCR识别并结合上述1-1.的肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原。
上述5.的工序(f)可使用通过前述工序(e)导入有核酸的T细胞，利用上述1-5.中记载的方法而进行。扩大培养的方法、扩大培养中使用的化合物的具体例、该化合物在培养基中的浓度、各用语的定义等与上述1-5.中记载的相同。可见，一个方式中，本发明的T细胞产品的制法可包括对于前述T细胞，于CD30激动剂的存在下培养该细胞从而刺激T细胞的工序。
6.T细胞产品的提供方法
此外，本发明提供适合受试者的T细胞产品的提供方法(以下有时也称作“本发明的提供方法”)。为了提供适合受试者的T细胞产品，可获取受试者的信息，基于该信息选择适宜的T细胞细胞库及/或适宜的T细胞产品。因此，本发明的提供方法包括下述工序：(p)获取受试者的信息的工序；及(q)基于该获取的受试者的信息选择适宜的T细胞细胞库及/或适宜的T细胞产品的工序。可使用所选择的T细胞细胞库，供于上述5.中的工序(e)及/或工序(f)，制备T细胞产品并提供至受试者。另外，本发明的提供方法在受试者具有肿瘤的情况下，可获取与该肿瘤中表达的肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原有关的信息，并基于该信息选择适宜的T细胞产品。因此，本发明的提供方法包括下述工序：(x)对受试者的肿瘤中表达的肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原进行鉴定的工序；及(y)从本发明的T细胞产品集合中选择表达可识别并结合该经鉴定的抗原的CAR或外源性TCR的T细胞产品的工序。(x)对受试者的肿瘤中表达的肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原进行鉴定的工序、及(y)从本发明的T细胞产品集合中选择表达可识别并结合该经鉴定的抗原的CAR或外源性TCR的T细胞产品的工序在概念上包括：(p)获取受试者的信息的工序；及(q)基于该获取的受试者的信息选择适宜的T细胞产品的工序。T细胞、T细胞产品、受试者等的用语的种类、定义与上述1-1.～1-10.中记载的相同。上述各工序可以由同一主体进行，也可以由不同主体进行。
上述6.的工序(x)可使用来自受试者的生物体样品，利用上述1-8.中记载的方法而进行。来自受试者的生物体样品的具体例与上述1-8.中记载的相同。
上述6.的工序(y)可基于前述工序(x)的鉴定结果，利用上述1-9.中记载的方法而进行。CAR及TCR的说明、定义、肿瘤特异性抗原及肿瘤相关抗原的具体例、评价标准的具体例等与上述1-1.、1-9.中记载的相同。
可利用通过本发明的提供方法提供的T细胞产品予防或治疗的癌、肿瘤的具体例与上述1-10.中记载的相同。另外，上述T细胞产品中所含的T细胞的培养及/或刺激方法、施予途径、施予量、受试者的种类等也与上述1-1-10.中记载的相同。
用以下的实施例进一步对本发明进行具体说明，但本发明的范围并不限于这些实施例。
实施例
[实施例1]
1.iPS细胞的准备
iPS细胞使用由京都大学iPS细胞研究所(CiRA)供应的iPS细胞(Ff-I01s04株：源自健康人末梢血单核细胞)。iPS细胞培养依照CiRA发布的方案“无饲养层条件下的人iPS细胞的培养”而进行。
2.T细胞受体(TCR)基因向iPS细胞的导入
2-1.WT1-TCR基因的导入
用P2A序列将编码源自由爱媛大学大学院医学研究科安川正贵教授供应的TAK1的、HLA-A*24:02限制性WT1特异性TCR的TRB基因和TRA基因连接而得到基因(WT1-TCR)，将其导入iPS细胞。向iPS细胞的基因导入可通过整合至由理化学研究所供应的CS-UbC-RfA-IRES2-hKO1慢病毒载体并使iPS细胞感染而进行。以下，有时将导入有WT1-TCR基因的iPS细胞称作“WT1αβ-iPSC”。
2-2.Vγ9Vδ2-TCR基因的导入
用P2A序列将编码源自G115γδT细胞克隆的Vγ9Vδ2T细胞受体的TRG基因和TRD基因连接而得到基因(Vγ9Vδ2TCR G115)，将其导入iPS细胞。Vγ9Vδ2TCR G115为人工合成的寡DNA，其编码以从N末端按表1的顺序排列的方式设计的多肽(序列号1)。
[表1]
从N末端起的顺序 基因 氨基酸数
1 TRG(源自G115) 315
2 P2A 22
3 TRD(源自G115) 292
从pLVSIN-CMV Neo(Clontech公司)中去除编码新霉素抗性基因的序列，制作使用了将CMV启动子替换为人泛素启动子而得的pLVSIN-Ub的慢病毒载体。将上述中合成的编码Vγ9Vδ2TCR G115的人工寡DNA整合至pLVSIN-Ub慢病毒载体的多克隆位点。使用该质粒与Clontech公司的Lenti-XTM293T细胞株及Lenti-XTMPackaging Single Shots(VSV-G)，制作慢病毒载体。通过使[实施例1]的1.中准备的iPS细胞感染所制作的慢病毒载体，将Vγ9Vδ2-TCR基因导入iPS细胞。以下有时将导入有Vγ9Vδ2TCR G115基因的iPS细胞称作“Vγ9Vδ2-iPSC”。
[实施例2]
1.iPS细胞向造血祖细胞(HPC)的分化
iPS细胞向造血祖细胞(HPC)的分化使用了依据已知的方法(例如，Cell Reports2(2012)1722-1735、国际公开第2017/221975号中记载的方法)分化的悬浮细胞群。具体而言，将[实施例1]的1.、[实施例1]的2-1.及[实施例1]的2-2.中得到的iPS细胞、WT1αβ-iPSC及Vγ9Vδ2-iPSC分别以3x105细胞/孔接种于经超低粘附处理的6孔板，在EB培养基(在StemPro34中添加10μg/ml人胰岛素、5.5μg/ml人运铁蛋白、5ng/ml亚硒酸钠、2mM L-谷氨酰胺、45mMα-单硫代甘油、及50μg/ml抗坏血酸-2-磷酸酯)中加入10ng/ml BMP4、50ng/mlbFGF、15ng/ml VEGF、2μM SB431542，于低氧条件下(5％O 2)，进行5天培养。接着，添加50ng/ml SCF、30ng/ml TPO、10ng/ml Flt3L，进一步进行5～9天培养，得到悬浮细胞群。需要说明的是，培养期间，每2天或3天进行培养基更换。使用表2的抗体组对包含HPC的上述悬浮细胞群进行染色。将进行了上述染色的细胞群供于基于FACSAria的分选。
[表2]
抗CD34抗体 Abcam PE/Cy7
抗CD43抗体 BD APC
抗CD45抗体 BioLegend BV510
抗CD14抗体 BioLegend APC/eFluor780
抗CD235a抗体 BD FITC
2.Vγ9Vδ2-TCR基因向HPC的导入
对[实施例2]的1.中得到的细胞级分中导入用P2A序列将编码源自G115γδT细胞克隆的Vγ9Vδ2T细胞受体的TRG基因和TRD基因连接而得的基因(Vγ9Vδ2TCR G115)。基因的导入利用与[实施例1]的2-2.同样的方法而进行。以下有时将在HPC中导入有Vγ9Vδ2TCRG115基因而得的HPC称作“Vγ9Vδ2-iHPC”。
[实施例3]
1.HPC向T细胞的分化
依照已知的方法(例如，Journal of Leukocyte Biology 96(2016)1165-1175、国际公开第2017/221975号中记载的方法)，使[实施例2]的1.中得到的细胞级分及[实施例2]的2.中得到的Vγ9Vδ2-iHPC分化成淋巴细胞系细胞。具体而言，将造血祖细胞群以2000细胞/孔接种于包被有重组h-DLL4/Fc嵌合体(SinoBiological)和Retronectin(Takara BioInc.)的48孔板，于5％CO2、37℃条件下进行培养。培养期间，每2天或3天进行培养基更换。需要说明的是，使用了培养基中添加了15％FBS与2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100ng/ml链霉素、55μM 2-巯基乙醇、50μg/ml抗坏血酸-2-磷酸酯、10μg/ml人胰岛素、5.5μg/ml人运铁蛋白、5ng/ml亚硒酸钠、50ng/ml SCF、50ng/ml IL-7、50ng/ml Flt3L、100ng/ml TPO、15μM SB203580、30ng/ml SDF-1α而得的αMEM培养基。自培养开始起第7天及第14天在进行了同样的包被的48孔板中进行传代。在培养开始第21天回收所有细胞，利用流式细胞仪确认存在CD45(+)、CD3(+)级分。将得到的细胞接种于24孔板，于5％CO2、37℃条件下进行培养。作为培养基，使用了包含15％FBS与2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100ng/ml链霉素、50ng/ml抗坏血酸-2-磷酸酯、10μg/ml人胰岛素、5.5μg/ml人运铁蛋白、5ng/mL亚硒酸钠、500ng/mL抗CD3抗体(UCHT1或OKT3克隆)、10nM地塞米松(富士制药工业株式会社：10171-H02H)、100U/ml IL-2、10ng/mL IL-7的αMEM培养基。在培养开始第27天(Day41)回收所有细胞。以下，有时将由[实施例1]的1.中得到的iPS细胞分化的T细胞称作“iγδTC”，将由[实施例1]的2-1.中得到的WT1αβ-iPSC分化的T细胞称作“iWT1αβTC”，将由[实施例1]的2-2.中得到的Vγ9Vδ2-iPSC分化的T细胞称作“Vγ9Vδ2-iTC”，将由[实施例]的2.中得到的Vγ9Vδ2-iHPC分化的T细胞称作“Vγ9Vδ2-iHTC”。
使用表3的抗体组对iγδTC进行染色(图3及4)。
[表3]
Vδ1Myltenyi FITC
Vδ2Myltenyi APC
γδTCR BD BV510
CD3 BioLegend APC/Cy7
αβTCR eBioscience FITC
针对iγδTC，用流式细胞仪测定细胞膜表面上的CD3、VδTCR、αβTCR、TCR-Vδ1链、及TCR-Vδ2链的表达(图3及4)。
针对Vγ9Vδ2-iTC(图5)及Vγ9Vδ2-iHTC(图6)，用流式细胞仪测定细胞膜表面上的CD3、VδTCR、TCR-Vδ1链及TCR-Vδ2链的表达。
[实施例4]
T细胞的扩大培养
1.iγδTC的扩大培养
1-1.扩大培养
将[实施例3]中得到的iγδTC以2,000,000细胞/mL悬浮于在包含15％FBS的α-MEM培养基中添加表4的细胞因子而得的培养基，接种于固定化有抗CD3抗体(UCHT1)和RetroNectin的培养板，于5％CO2/37℃下，进行3天培养。在培养第3天从培养板回收细胞，使用NucleoCounter(注册商标)NC-200(ChemoMetec)对细胞数进行计测，并且适量悬浮于在包含15％FBS的α-MEM培养基中添加表5的细胞因子而得的培养基，添加于未进行固定化的G-Rex(注册商标)6孔板(WILSONWOLF)，于5％CO2/37℃下进行培养。然后在培养第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第14天中的任一天，从培养板中回收一部分细胞，使用NucleoCounter(注册商标)NC-200计测细胞数，进行4～6次。抗CD3抗体及RetroNectin向培养板的固定化用以下的方法进行。在培养板中添加以必需的浓度溶解于PBS的抗CD3抗体(UCHT1、最终浓度3000ng/mL)及RetroNectin(最终浓度150μg/mL)，然后4℃下静置过夜。
1-2.增殖率
将重复了5次[实施例4]的1-1.的扩大培养时的、iγδTC的细胞数的增殖率示于图7。iγδTC能够扩大培养至至少1011倍以上，可用作构成T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库的T细胞。
[表4]
产品名称 制造商 最终浓度
胰岛素-运铁蛋白-硒补充剂 Invitrogen 1x
抗坏血酸-2-磷酸酯 sigma 50μg/ml
IL-2 Peprotech 15ng/ml
IL-7 Peprotech 10ng/ml
IL-15 Peprotech 10ng/ml
IL-21 Peprotech 20ng/ml
IL-12 Merck 50ng/ml
IL-18 MBL 50ng/ml
TL-1A Peprotech 50ng/ml
Z-VAD-FMK R&D 10μM
人CD30抗体 R&D 300ng/ml
[表5]
产品名称 制造商 最终浓度
胰岛素-运铁蛋白-硒补充剂 Invitrogen 1x
抗坏血酸-2-磷酸酯 sigma 50μg/ml
IL-2 Peprotech 15ng/ml
IL-7 Peprotech 10ng/ml
IL-15 Peprotech 10ng/ml
2.Vγ9Vδ2-iTC的扩大培养
2-1.扩大培养
将[实施例3]中得到的Vγ9Vδ2-iTC以2,000,000细胞/mL悬浮于在包含15％FBS的α-MEM培养基中添加表6的细胞因子而得的培养基，接种于固定化有抗CD3抗体(OKT3)和RetroNectin的培养板，于5％CO2/37℃下进行3天培养。在培养第3天从培养板回收细胞，使用NucleoCounter(注册商标)NC-200(ChemoMetec)对细胞数进行计测，并且适量悬浮于在包含15％FBS的α-MEM培养基中添加表5的细胞因子而得的培养基，添加于未进行固定化的G-Rex(注册商标)6孔板(WILSONWOLF)，于5％CO2/37℃下进行培养。然后在培养第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第14天中的任一天，从培养板中回收一部分细胞，使用NucleoCounter(注册商标)NC-200计测细胞数，进行4～6次。抗CD3抗体及RetroNectin向培养板的固定化用[实施例4]的1-1.的方法实施。
2-2.增殖率
将重复了5次[实施例4]的2-1.时的、Vγ9Vδ2-iTC的细胞数的增殖率示于图8。Vγ9Vδ2-iTC能够扩大培养至至少1012倍以上，可用作构成T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库的T细胞。
[表6]
产品名称 制造商 最终浓度
胰岛素-运铁蛋白-硒补充剂 Invitrogen 1x
抗坏血酸-2-磷酸酯 sigma 50μg/ml
IL-2 Peprotech 15ng/ml
IL-7 Peprotech 10ng/ml
IL-15 Peprotech 10ng/ml
IL-21 Peprotech 20ng/ml
IL-12 Merck 50ng/ml
IL-18 MBL 50ng/ml
TL-1A Peprotech 50ng/ml
Z-VAD-FMK R&D 10μM
3.WT1αβ-iTC的扩大培养
3-1.扩大培养
将[实施例3]中得到的iWT1αβTC以2,000,000细胞/mL悬浮于在包含15％FBS的α-MEM培养基中添加表6的细胞因子而得的培养基，接种于固定化有抗CD3抗体(OKT3)和RetroNectin的培养板，于5％CO2/37℃下进行3天培养。在培养第3天从培养板回收细胞，使用NucleoCounter(注册商标)NC-200(ChemoMetec)对细胞数进行计测，并且适量悬浮于在包含15％FBS的α-MEM培养基中添加表5的细胞因子而得的培养基，添加于未进行固定化的G-Rex(注册商标)6孔板(WILSONWOLF)，于5％CO2/37℃下进行培养。然后在培养第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第14天、第17天中的任一天，从培养板中回收一部分细胞，使用NucleoCounter(注册商标)NC-200计测细胞数，进行4～6次。抗CD3抗体及RetroNectin向培养板的固定化用以下的方法进行。在培养板中添加以必需的浓度溶解于PBS的抗CD3抗体(OKT3、最终浓度3000ng/mL)及RetroNectin(最终浓度150μg/mL)，然后4℃下静置过夜。
3-2.增殖率
将重复了4次的[实施例4]的3-1.的扩大培养时的、iWT1αβTC的细胞数的增殖率示于图9。iWT1αβTC能够扩大培养至至少1010倍以上，可用作构成T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库的T细胞。
[实施例5]
1.T细胞主细胞库的构建
将[实施例4]中得到的T细胞的培养液替换成包含冷冻保护剂的冷冻保存液(CryoStor CS10)，分注于多个保存容器(无菌瓶(聚合物制瓶(AT-closed vial)))。将包含该T细胞的容器静置于冷冻装置内，从而使T细胞冷冻。作为冷冻装置，使用作为程序冷冻装置的CryoMed(Thermo Fisher)。将其储存，由此构建冷冻的T细胞主细胞库。
2.T细胞工作细胞库的构建
从[实施例5]的1.的冷冻的T细胞主细胞库中采集包含T细胞的容器。将该容器浸于约37℃的水浴中约15秒，融化T细胞。将融化而得到的T细胞适量悬浮于加入有表5的细胞因子的培养基，添加于6孔板，于5％CO2/37℃下进行培养。进行1天至3天培养后，用[实施例4]的方法对T细胞进行扩大培养后，与上述同样地进行冷冻，进行储存，由此构建T细胞工作细胞库。
3.特性分析与质量评估
以与[实施例5]的2.同样的方式从T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库中采集一个容器，将T细胞融化。对得到的T细胞进行特性分析与质量评估。
4.T细胞细胞库集合的构建
收集[实施例5]的1.中得到的多种T细胞的主细胞库，以可区分T细胞主细胞库的种类的方式附上标签等，进行保管，由此构建T细胞主细胞库集合。
[实施例6]
1.T细胞的准备
以与[实施例5]的2.同样的方式从T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库中采集一个容器，将T细胞融化。将融化而得到的T细胞适量悬浮于加入有表5的细胞因子的培养基，添加于6孔板，于5％CO2/37℃下进行培养。进行1天至3天培养后，以2,000,000细胞/mL悬浮于在包含15％FBS的α-MEM培养基中添加表4或表6的细胞因子而得的培养基，接种于固定化有抗CD3抗体(UCHT1或OKT3)与RetroNectin的培养板，于5％CO2/37℃下进行3天培养。在培养第3天从培养板回收细胞，使用NucleoCounter(注册商标)NC-200(ChemoMetec)对细胞数进行计测，并且适量悬浮于在包含15％FBS的α-MEM培养基中添加表5的细胞因子而得的培养基，添加于未进行固定化的细胞培养瓶(25cm2或75cm2)，于5％CO2/37℃下进行1天培养，由此准备T细胞。
2.核酸向T细胞的导入
2-1.抗CD19-CAR基因的导入
作为编码抗CD19-CAR的基因，人工合成了编码以从N末端按表7的顺序排列的方式设计的多肽(序列号2)的寡DNA。
[表7]
从N末端起的顺序 基因 氨基酸数
1 免疫球蛋白重链的前导序列 22
2 抗CD19抗体(FMC63)轻链的可变区 104
3 GGGGS接头 15
4 抗CD19抗体(FMC63)重链的可变区 120
5 源自CD8的序列(包含跨膜区) 83
6 CD28的胞内结构域 41
7 4-1BB的胞内结构域 47
8 CD3ζ的胞内结构域 112
将上述中合成的人工寡DNA整合至pMEI-5反转录病毒载体的多克隆位点。病毒载体制作委托Unitech公司。使[实施例3]中制作的iWT1αβTC感染所制作的携带编码抗CD19-CAR的基因的反转录病毒载体，制作源自iPS细胞的抗CD19-CART细胞(以下有时称作“CD19iWT1αβCARTC”)。
2-2.抗BCMA-CAR基因的导入
作为编码抗BCMA-CAR的基因，人工合成了编码以从N末端按表8的顺序排列的方式设计的多肽(序列号3)的寡DNA。
[表8]
从N末端起的顺序 基因 氨基酸数
1 免疫球蛋白重链的前导序列 19
2 抗BCMA抗体轻链的可变区 111
3 接头 18
4 抗BCMA-抗体重链的可变区 117
5 源自CD8的序列(包含跨膜区) 86
6 CD28的胞内结构域 41
7 4-1BB的胞内结构域 47
8 CD3ζ的胞内结构域 112
将上述中合成的人工寡DNA整合至pMEI-5反转录病毒载体的多克隆位点。病毒载体制作委托Unitech公司。使[实施例3]中制作的iWT1αβTC感染所制作的携带编码抗BCMA-CAR的基因的反转录病毒载体，制作源自iPS细胞的抗BCMA-CART细胞(以下有时称作“BMCAiWT1αβCARTC”)。
2-3.包含源自CD30的胞内结构域的抗CD19-CAR基因的导入
作为包含源自CD30的胞内结构域的抗CD19-CAR基因，人工合成了编码以从N末端按表9的顺序排列的方式设计的多肽(序列号4)的寡DNA。
[表9]
从N末端起的顺序 基因 氨基酸数
1 免疫球蛋白重链的前导序列 22
2 抗CD19抗体(FMC60)轻链的可变区 104
3 GGGGS接头 15
4 抗CD19抗体(FMC60)重链的可变区 120
5 源自CD8的序列(包含跨膜区) 83
6 CD28的胞内结构域 41
7 CD30的胞内结构域(序列号6) 87
8 CD3ζ的胞内结构域 112
将上述中合成的人工寡DNA整合至pMY反转录病毒载体的多克隆位点。使用用于产生反转录病毒载体的FLYRD18细胞，制作病毒载体。使[实施例1]的3.中制作的WT1αβ-iTC感染所制作的携带包含源自CD30的胞内结构域的抗CD19-CAR基因的反转录病毒载体，制作包含源自CD30的胞内结构域的源自iPS细胞的抗CD19-CART细胞(以下有时称作“CD19-CD30-iWT1αβCARTC”)。
2-4.抗CD19-CAR基因的导入
作为编码抗CD19-CAR的基因，人工合成了编码以从N末端按表10的顺序排列的方式设计的多肽(序列号5)的寡DNA。
[表10]
从N末端起的顺序 基因 氨基酸数
1 免疫球蛋白重链的前导序列 22
2 抗CD19抗体(FMC63)轻链的可变区 104
3 GGGGS接头 15
4 抗CD19抗体(FMC63)重链的可变区 120
5 源自CD8的序列(包含跨膜区) 83
6 4-1BB的胞内结构域 47
7 CD3ζ的胞内结构域 112
将上述中合成的人工寡DNA整合至pMY反转录病毒载体的多克隆位点。使用用于产生反转录病毒载体的FLYRD18细胞，制作病毒载体。使[实施例3]中制作的iγδTC感染所制作的携带编码抗CD19-CAR的基因的反转录病毒载体，制作源自iPS细胞的抗CD19-CART细胞(以下有时称作“CD19iγδCARTC”)。
[实施例7]
1.T细胞的细胞毒活性等
1-1.CD19iWT1αβCARTC及BMCAiWT1αβCARTC的细胞毒活性
分别评价[实施例6]的2-1.及2-2.中得到的CD19iWT1αβCARTC及BMCAiWT1αβCARTC对CD19阳性Raji癌细胞及BCMA阳性H929癌细胞的细胞毒活性。针对Raji细胞以16倍的比例混合CD19iWT1αβCARTC或iWT1αβTC，根据2小时后的靶细胞死亡情况对CD19iWT1αβCARTC的细胞毒活性进行评价。另外，针对H929细胞以16倍的比例混合BCMAiWT1αβCARTC或iWT1αβTC，根据2小时后的靶细胞死亡情况对BCMAiWT1αβCARTC的细胞毒活性进行评价。表明CD19iWT1αβCARTC及BMCAiWT1αβCARTC分别对CD19阳性Raji癌细胞及BCMA阳性H929癌细胞具有细胞毒活性，可由相同的iWT1αβTC制备2种CART(图10)。
1-2.CD19-CD30-iWT1αβCARTC的细胞毒活性
评价[实施例6]的2-3.中得到的CD19-CD30-iWT1αβCARTC对CD19阳性Raji癌细胞的细胞毒活性。针对Raji细胞以0.5、1、2、4、8、16倍的比例混合CD19-CD30-iWT1αβCARTC，根据2小时后的靶细胞死亡情况对CD19-CD30-iWT1αβCARTC的细胞毒活性进行评价。表明CD19-CD30-iWT1αβCARTC对CD19阳性Raji癌细胞具有细胞毒活性，可由相同的iWT1αβTC制备不同的CART(图11)。
1-3.CD19iγδCARTC的细胞毒活性
对[实施例6]的2-4.中得到的CD19iγδCARTC的细胞毒活性进行评价。将CD19阳性Raji细胞及CD19阴性CCRF-CEN细胞作为靶细胞，针对靶细胞以0.5、1、2、4、8、16倍的比例混合CD19iγδCARTC，根据2小时后的靶细胞死亡情况对CD19iγδCARTC的细胞毒活性进行评价。表明CD19iγδCARTC对CD19阳性Raji细胞具有细胞毒活性，对CD19阴性CCRF-CEN细胞不具有细胞毒活性，具有抗原特异性的细胞毒活性(图12)。
[实施例8]
1.抗CD19-CAR基因及IL-15Rα/IL-15基因的导入
作为IL-15Rα/IL-15基因，人工合成了编码以从N末端按表11的顺序排列的方式设计的多肽(序列号7)的寡DNA。
[表11]
从N末端起的顺序 基因 氨基酸数
1 人IL-2的前导序列 23
2 人IL-15的C端序列 114
3 GGGGS接头 24
4 人IL-15RA的C端序列 239
将上述中合成的人工寡DNA整合至pMY反转录病毒载体的多克隆位点。使用用于产生反转录病毒载体的FLYRD18细胞，制作病毒载体。使[实施例3]中制作的iγδTC及Vγ9Vδ2-iTC感染所制作的携带IL-15Rα/IL-15基因的反转录病毒载体及[实施例6]的2-4.中制作的携带抗CD19-CAR基因的反转录病毒载体，分别制作CD19/IL15iγδCARTC及CD19/IL15iVγ9Vδ2CARTC。
[实施例9]1.T细胞产品
1-1.T细胞的扩大培养(CD19/IL15iVγ9Vδ2CARTC)
将[实施例8]中得到的CD19/IL15iVγ9Vδ2CARTC以2,000,000细胞/mL悬浮于在包含15％FBS的α-MEM培养基中添加表6的细胞因子而得的培养基，接种于固定化有抗CD3抗体(UCHT1)和RetroNectin的培养板，于5％CO2/37℃下进行3天培养。在培养第3天从培养板回收细胞，使用NucleoCounter(注册商标)NC-200(ChemoMetec)对细胞数进行计测，并且适量悬浮于在包含15％FBS的α-MEM培养基中添加表5的细胞因子而得的培养基，添加于未进行固定化的G-Rex(注册商标)6孔板(WILSONWOLF)，于5％CO2/37℃下进行培养。然后在培养第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第14天、第17天中的任一天，从培养板中回收一部分细胞，使用血细胞计数器计测细胞数，进行4～6次。抗CD3抗体及RetroNectin向培养板的固定化用以下的方法进行。在培养板中添加以必需的浓度溶解于PBS的抗CD3抗体(UCHT1、最终浓度3000ng/mL)及RetroNectin(最终浓度150μg/mL)，然后4℃下静置过夜。
1-2.增殖率
将重复了3次[实施例9]的1-1.的扩大培养时的、CD19/IL15iVγ9Vδ2CARTC的细胞数的增殖率示于图13。CD19/IL15iVγ9Vδ2CARTC能够扩大培养至至少109倍以上。
如此，可由T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库对CAR-T细胞进行扩大培养，大量制备并提供T细胞产品(例如，CAR-T细胞产品)。将经扩大培养的各种T细胞填充于适宜的保存容器(无菌瓶、输血袋等)，在该容器上贴附标签，对该容器进行包装，制备T细胞产品。
1-3.T细胞产品的冷冻
将包含经扩大培养的各种T细胞的容器以与[实施例5]的1.同样的方式进行冷冻，制备冷冻T细胞产品。
1-4.T细胞产品集合的构建
对上述中得到的冷冻T细胞产品以可区分它们的种类的方式附上标签进行保管，由此构建T细胞产品集合。
[实施例10]
1.抗原的鉴定
从受试者采集肿瘤组织片、可能包含肿瘤细胞的体液(例：血液、血清、血浆等)等生物体样品，从该样品中提取mRNA，根据需要由该mRNA合成cDNA，使用该cDNA，利用数字PCR(例：ddPCR)、RT-PCR、生物芯片(例：微阵列)、RNAseq等核酸扩增方法及/或核酸检测方法进行鉴定。
2.T细胞产品的选择
基于显示来自[实施例10]的1.的鉴定结果的资料(纸介质或电子数据介质)，从预先制作的T细胞产品的清单等中选择包含表达可识别并结合经鉴定的抗原的CAR或外源性TCR的T细胞的T细胞产品。
[实施例11]
1.CD19/IL15iγδCARTC带来的存活天数延长效果
将5x105个Nalm6细胞(ATCC)尾静脉移植至NOD/Shi-scid,IL-2RγKO(NOG)小鼠(实验动物中央研究所、雌性、7-8周龄)，制作Nalm6异种移植小鼠。在移植后第4天，尾静脉施予将CD19/IL15iγδCARTC(5x106个(细胞))悬浮于0.1mL的HBSS-缓冲液而得的悬浮液或等量的HBSS-缓冲液之后，确认存活天数。对于经尾静脉移植有CD19阳性Nalm6癌细胞的小鼠，对照施予组在3周以内全部死亡，与之相比，CD19/IL15iγδCARTC施予组全部存活直到至少6周后(图14)。
2.CD19/IL15iVγ9Vδ2CARTC的抗肿瘤效果
将5x105个表达萤光素酶的Nalm6细胞(ATCC)尾静脉移植于NOD/Shi-scid,IL-2RγKO(NOG)小鼠(实验动物中央研究所、雌性、7-8周龄)，制作表达萤光素酶的Nalm6异种移植小鼠。在移植后第4天，尾静脉施予将[实施例6]的1-2.中得到的CD19/IL15iVγ9Vδ2CARTC(107个(细胞))悬浮于0.2mL的HBSS-缓冲液而得的悬浮液或等量的HBSS-缓冲液之后，确认存活天数。对于经尾静脉移植有CD19阳性Nalm6癌细胞的小鼠，对照施予组在3周以内全部死亡，与之相比，CD19/IL15iγδCARTC施予组全部存活直到至少6周后(图15)。
产业上的可利用性
根据本发明，可提供可降低人力、时间及金钱的成本、并且批次间差异小且高品质的现成的同种异体T细胞产品(特别是多种CAR-T细胞产品)的提供系统，以此方式提供的T细胞产品对癌、肿瘤等疾病的予防或治疗是有用的。
本申请以于日本提出申请的日本特愿2019-212718(申请日：2019年11月25日)为基础，通过于此提及而将其内容全部包括在本说明书中。
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Claims (36)

1.T细胞产品的提供系统，其包含T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库。
2.如权利要求1所述的系统，其中，所述T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库包含源自诱导多潜能干细胞的T细胞。
3.如权利要求1或2所述的系统，其中，所述T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库包含至少一种HLA基因的表达被抑制的T细胞。
4.如权利要求1～3中任一项所述的系统，其包括在由所述T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库准备的T细胞中导入包含外源性基因的核酸的步骤。
5.如权利要求4所述的系统，其中，所述外源性基因为CAR基因或外源性TCR基因。
6.如权利要求1～5中任一项所述的系统，其中，所述T细胞产品的种类为2种以上。
7.如权利要求1～6中任一项所述的系统，其还包括对由所述T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库准备的T细胞进行扩大培养的步骤。
8.如权利要求7所述的系统，其中，所述对T细胞进行扩大培养的步骤包括利用CD30激动剂刺激该细胞的工序。
9.如权利要求7或8所述的系统，其还包括制造包含所述经扩大培养的T细胞的冷冻T细胞产品的步骤。
10.如权利要求6～9中任一项所述的系统，其还包括收集T细胞产品并构建包含2种以上的T细胞产品的T细胞产品集合的步骤。
11.如权利要求1～10中任一项所述的系统，其还包括对受试者的肿瘤中表达的肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原进行鉴定的步骤。
12.如权利要求11所述的系统，其还包括从包含2种以上的T细胞产品的T细胞产品集合中选择表达可识别并结合经鉴定的抗原的CAR或外源性TCR的T细胞产品的步骤。
13.T细胞产品的制备方法，其包括构建T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库的工序。
14.如权利要求13所述的T细胞产品的制备方法，其中，所述T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库包含源自诱导多潜能干细胞的T细胞。
15.如权利要求13或14所述的T细胞产品的制备方法，其中，所述T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库包含至少一种HLA基因的表达被抑制的T细胞。
16.如权利要求13～15中任一项所述的T细胞产品的制备方法，其还包括在由所述T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库准备的T细胞中导入包含外源性基因的核酸的工序。
17.如权利要求16所述的T细胞产品的制备方法，其中，所述外源性基因为CAR基因或外源性TCR基因。
18.如权利要求13～17中任一项所述的T细胞产品的制备方法，其还包括对T细胞进行扩大培养的工序。
19.如权利要求18所述的T细胞产品的制备方法，其中，所述对T细胞进行扩大培养的工序中包括利用CD30激动剂刺激该细胞的工序。
20.T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库。
21.如权利要求20所述的T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库，其包含源自诱导多潜能干细胞的T细胞。
22.如权利要求20或21所述的T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库，其包含至少一种HLA基因的表达被抑制的T细胞。
23.T细胞主细胞库集合及/或T细胞工作细胞库集合，其包含权利要求20～22中任一项记载的2个以上种类的T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库。
24.构建T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库的方法，其包括以下工序：
(1)使不具有嵌合抗原受体(CAR)基因的诱导多潜能干细胞分化成用于CAR-T疗法的T细胞的工序；
(2)储存该分化的T细胞的工序；及
(3)进行该分化的T细胞的特性分析的工序。
25.构建T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库的方法，其包括以下工序：
(1)使不具有外源性T细胞受体(TCR)基因的诱导多潜能干细胞分化成用于TCR-T疗法的T细胞的工序；
(2)储存该分化的T细胞的工序；及
(3)进行该分化的T细胞的特性分析的工序。
26.如权利要求24所述的方法，其中，所述诱导多潜能干细胞具有外源性T细胞受体(TCR)基因。
27.如权利要求24～26中任一项所述的方法，其中，所述诱导多潜能干细胞缺失至少一种HLA基因。
28.如权利要求24～27中任一项所述的方法，其中，所述T细胞表达CD8αβ。
29.T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库，其是通过权利要求24～28中任一项所述的方法构建的。
30.制备表达CAR或外源性TCR的T细胞产品的方法，其包括以下工序：
(1)由权利要求29所述的T细胞主细胞库及/或T细胞工作细胞库准备T细胞的工序；
(2)在该准备的T细胞中导入CAR基因或外源性TCR基因的工序；及
(3)对该导入有CAR基因或外源性TCR基因的T细胞进行扩大培养的工序。
31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述CAR或外源性TCR识别并结合肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原。
32.如权利要求30或31所述的方法，其中，所述工序(3)包括利用CD30激动剂刺激T细胞的工序。
33.T细胞产品，其是通过权利要求30～32中任一项所述的方法制备的。
34.包含2种以上的T细胞产品的T细胞产品集合的构建方法，其包括收集权利要求33所述的T细胞产品的工序。
35.T细胞产品集合，其是通过权利要求34所述的方法构建的。
36.提供适合受试者的T细胞产品的方法，其包括以下工序：
(1)对受试者的肿瘤中表达的肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原进行鉴定的工序；及
(2)从权利要求35所述的T细胞产品集合中选择表达可识别并结合该经鉴定的抗原的CAR或外源性TCR的T细胞产品的工序。
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