CN110023498A - 用于产生具有非功能性t细胞受体(tcr)的t细胞的试剂、包含其的组合物及其用途 - Google Patents

用于产生具有非功能性t细胞受体(tcr)的t细胞的试剂、包含其的组合物及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN110023498A
CN110023498A CN201780067623.2A CN201780067623A CN110023498A CN 110023498 A CN110023498 A CN 110023498A CN 201780067623 A CN201780067623 A CN 201780067623A CN 110023498 A CN110023498 A CN 110023498A
Authority
CN
China
Prior art keywords
shmir
seq
dna
tcr
effect subsequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201780067623.2A
Other languages
English (en)
Inventor
P·B·加西亚
V·斯特林斯-乌福姆巴
P·罗尔文克
M·格雷厄姆
D·苏希
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Benitec Biopharma Pty Ltd
Original Assignee
Benitec Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Benitec Ltd filed Critical Benitec Ltd
Publication of CN110023498A publication Critical patent/CN110023498A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4632—T-cell receptors [TCR]; antibody T-cell receptor constructs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
    • A61K39/464412—CD19 or B4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/51—Physical structure in polymeric form, e.g. multimers, concatemers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/50—Biochemical production, i.e. in a transformed host cell
    • C12N2330/51—Specially adapted vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)

Abstract

本公开涉及用于产生包含非功能性T细胞受体(TCR)的T细胞(包括还表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，即，CAR‑T细胞)的试剂、包含所述试剂和T细胞的组合物以及所述CAR‑T细胞在疗法(例如，过继疗法)中的用途。

Description

用于产生具有非功能性T细胞受体(TCR)的T细胞的试剂、包含 其的组合物及其用途
相关申请数据
本申请要求2016年9月14日提交的美国临时申请第62/394,559号的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开涉及用于产生包含非功能性T细胞受体(TCR)的T细胞(包括还表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，即，CAR-T细胞)的试剂、包含所述试剂和T细胞的组合物以及所述CAR-T细胞在疗法(例如，过继疗法)中的用途。
发明背景
CAR T细胞疗法通过提供修饰受试者自身免疫细胞以能够治疗其癌症的能力而已为令人兴奋的进步(特别是在肿瘤学领域)。虽然自体过继细胞转移方法已成功应用于临床，但同种异体方法有可能显著简化制造过程。因此，这可以为患者提供更易获得的选择，以及通过降低移植物抗宿主病的可能性来增强安全性。限制TCR在经修饰的T细胞上的表达有助于消除识别接受者中主要和次要组织相容性抗原的能力。
有多种策略可用于产生包含非功能性TCR的T细胞，包括经工程化以表达CAR的CAR-T细胞。然而，需要改进的策略。
发明内容
本公开提供了DNA指导的RNA干扰(ddRNAi)构建体，其包含一种或多种具有编码短发夹微RNA(shmiR)的DNA序列的核酸，其中所述shmiR或每种shmiR包含：
长度为至少17个核苷酸的效应子序列；
效应子互补序列；
茎环序列；和
初级微RNA(pri-miRNA)骨架；
其中所述或每种shmiR的效应子序列与选自由以下组成的组的T细胞受体(TCR)复合物亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补：CD3-ε、TCR-α、TCR-β、CD3-γ和CD3-δ。本文描述了可以由本公开的shmiR靶向的TCR复合物亚基的示例性mRNA转录物。靶向TCR复合物亚基的mRNA转录物的示例性shmiR包括如表2和表3中所述的shmiR-CD3-ε_3、shmiR-TCR-α_1、shmiR-TCR-β_5、shmiR-CD3-γ_2和shmiR-CD3-δ_3。还考虑了表2和表3中描述的另外的示例性shmiR。
在一个实例中，ddRNAi构建体包含核酸，所述核酸包含编码包含效应子序列的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成，所述效应子序列与CD3-ε亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补。称为shmiR-CD3-ε的示例性shmiR以及编码其的核酸描述于本文中，并且应该被采用来在经必要修改后应用于描述ddRNAi的本公开的该实例和任何其它实例，除非另有明确说明，否则所述ddRNAi编码靶向CD3-ε的shmiR。在一个特定的实例中，靶向CD3-ε的shmiR是shmiR-CD3-ε_3。
在一个实例中，ddRNAi构建体包含核酸，所述核酸包含编码包含效应子序列的shmiR-TCR-α的DNA序列或由其组成，所述效应子序列与TCR-α亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补。称为shmiR-TCR-α的示例性shmiR以及编码其的核酸描述于本文中，并且应该被采用来在经必要修改后应用于描述ddRNAi的本公开的该实例和任何其它实例，除非另有明确说明，否则所述ddRNAi编码靶向TCR-α的shmiR。在一个特定的实例中，靶向TCR-α的shmiR是shmiR-TCR-α_1。
在一个实例中，ddRNAi构建体包含核酸，所述核酸包含编码包含效应子序列的shmiR-TCR-β的DNA序列或由其组成，所述效应子序列与TCR-β亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补。称为shmiR-TCR-β的示例性shmiR以及编码其的核酸描述于本文中，并且应该被采用来在经必要修改后应用于描述ddRNAi的本公开的该实例和任何其它实例，除非另有明确说明，否则所述ddRNAi编码靶向TCR-β的shmiR。在一个特定的实例中，靶向TCR-β的shmiR是shmiR-TCR-β_5。
在一个实例中，ddRNAi构建体包含核酸，所述核酸包含编码包含效应子序列的shmiR-CD3-γ的DNA序列或由其组成，所述效应子序列与CD3-γ亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补。称为shmiR-CD3-γ的示例性shmiR以及编码其的核酸描述于本文中，并且应该被采用来在经必要修改后应用于描述ddRNAi的本公开的该实例和任何其它实例，除非另有明确说明，否则所述ddRNAi编码靶向CD3-γ的shmiR。在一个特定的实例中，靶向CD3-γ的shmiR是shmiR-CD3-γ_2。
在一个实例中，ddRNAi构建体包含核酸，所述核酸包含编码包含效应子序列的shmiR-CD3-δ的DNA序列或由其组成，所述效应子序列与CD3-δ亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补。称为shmiR-CD3-δ的示例性shmiR以及编码其的核酸描述于本文中，并且应该被采用来在经必要修改后应用于描述ddRNAi的本公开的该实例和任何其它实例，除非另有明确说明，否则所述ddRNAi编码靶向CD3-δ的shmiR。在一个特定的实例中，靶向CD3-δ的shmiR是shmiR-CD3-δ_3。
在一个实例中，DNA指导的RNA干扰(ddRNAi)构建体，其包含一种或多种具有编码短发夹微RNA(shmiR)的DNA序列的核酸，其中每种shmiR包含：
长度为至少17个核苷酸的效应子序列；
效应子互补序列；
茎环序列；和
初级微RNA(pri-miRNA)骨架；
其中每种shmiR的效应子序列与选自由以下组成的组的T细胞受体(TCR)复合物亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补：CD3-ε、TCR-α、TCR-β、CD3-γ和CD3-δ。
根据其中ddRNAi构建体包含两种或更多种具有编码shmiR的DNA序列的核酸的一个实例，每种shmiR的效应子序列靶向不同TCR复合物亚基的mRNA转录物。根据其中ddRNAi构建体包含两种或更多种具有编码shmiR的DNA序列的核酸的另一个实例，每种shmiR的效应子序列靶向同一TCR复合物亚基的mRNA转录物。根据其中ddRNAi构建体包含至少三种具有编码shmiR的DNA序列的核酸的另一个实例，至少两种shmiR的效应子序列靶向不同TCR复合物亚基的mRNA转录物。
在本文所述的ddRNAi构建体的每个实例中，每种shmiR以5'至3'方向包含：
pri-miRNA骨架的5'侧翼序列；
效应子互补序列；
茎环序列；
效应子序列；和
pri-miRNA骨架的3'侧翼序列；
在一个实例中，茎环序列是SEQ ID NO:97中所示的序列。
在一个实例中，pri-miRNA骨架是pri-miR-30a骨架。然而，可以使用和描述其他pri-miRNA骨架，并且所述骨架可被考虑用于本文中的用途。
在一个实例中，pri-miRNA骨架的5'侧翼序列示于SEQ ID NO:98中，并且pri-miRNA骨架的3'侧翼序列示于SEQ ID NO:99中。
根据其中ddRNAi构建体包含两种或更多种具有编码shmiR的DNA序列的核酸的一个实例，所述两种或更多种核酸选自：
(i)包含编码包含效应子序列的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与CD3-ε亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补；
(ii)包含编码包含效应子序列的shmiR-CD3-γ的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与CD3-γ亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补；和
(iii)包含编码包含效应子序列的shmiR-TCR-β的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与TCR-β亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补。
在一个实例中，ddRNAi构建体包含：
(i)包含编码包含效应子序列的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与CD3-ε亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补；
(ii)包含编码包含效应子序列的shmiR-CD3-γ的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与CD3-γ亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补；和
(iii)包含编码包含效应子序列的shmiR-TCR-β的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与TCR-β亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补。
靶向TCR亚基TCR-β、CD3-γ和CD3-ε的mRNA转录物的shmiR的示例性效应子序列和同源效应子互补序列描述于表2中，并且涵盖于本文中。
在一个实例中，shmiR-CD3-ε包含SEQ ID NO:134中所示的效应子序列。在一个实例中，shmiR-TCR-β包含SEQ ID NO:116中所示的效应子序列。在一个实例中，CD3-γ包含SEQ ID NO:120中所示的效应子序列。
因此，在一个实例中，ddRNAi构建体包含以下中的至少两个：
(i)包含编码包含SEQ ID NO:134中所示的效应子序列的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸；
(ii)包含编码包含SEQ ID NO:120中所示的效应子序列的shmiR-CD3-γ的DNA序列或由其组成的核酸；和
(iii)包含编码包含SEQ ID NO:116中所示的效应子序列的shmiR-TCR-β的DNA序列或由其组成的核酸；
在一个实例中，ddRNAi构建体包含：
(i)包含编码包含SEQ ID NO:134中所示的效应子序列的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸；
(ii)包含编码包含SEQ ID NO:120中所示的效应子序列的shmiR-CD3-γ的DNA序列或由其组成的核酸；和
(iii)包含编码包含SEQ ID NO:116中所示的效应子序列的shmiR-TCR-β的DNA序列或由其组成的核酸。
在一个实例中，shmiR-CD3-ε包含SEQ ID NO:134中所示的效应子序列和SEQ IDNO:135中所示的效应子互补序列。在一个实例中，shmiR-TCR-β包含SEQ ID NO:116中所示的效应子序列和SEQ ID NO:117中所示的效应子互补序列。在一个实例中，shmiR-CD3-γ包含SEQ ID NO:120中所示的效应子序列和SEQ ID NO:121中所示的效应子互补序列。
因此，在一个实例中，ddRNAi构建体包含以下中的至少两个：
(i)包含编码包含SEQ ID NO:134中所示的效应子序列和SEQ ID NO:135中所示的效应子互补序列的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸；
(ii)包含编码包含SEQ ID NO:120中所示的效应子序列和SEQ ID NO:121中所示的效应子互补序列的shmiR-CD3-γ的DNA序列或由其组成的核酸；和
(iii)包含编码包含SEQ ID NO:116中所示的效应子序列和SEQ ID NO:117中所示的效应子互补序列的shmiR-TCR-β的DNA序列或由其组成的核酸。
在一个实例中，ddRNAi构建体包含：
(i)包含编码包含SEQ ID NO:134中所示的效应子序列和SEQ ID NO:135中所示的效应子互补序列的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸；
(ii)包含编码包含SEQ ID NO:120中所示的效应子序列和SEQ ID NO:121中所示的效应子互补序列的shmiR-CD3-γ的DNA序列或由其组成的核酸；和
(iii)包含编码包含SEQ ID NO:116中所示的效应子序列和SEQ ID NO:117中所示的效应子互补序列的shmiR-TCR-β的DNA序列或由其组成的核酸。
靶向TCR亚基TCR-β、CD3-γ和CD3-ε的mRNA转录物的shmiR的示例性shmiR序列描述于表3中，并且涵盖于本文中。
在一个实例中，shmiR-CD3-ε包含SEQ ID NO:153中所示的序列。在一个实例中，shmiR-TCR-β包含SEQ ID NO:144中所示的序列。在一个实例中，shmiR-CD3-γ包含SEQ IDNO:146中所示的序列。
因此，在一个实例中，ddRNAi构建体包含以下中的至少两个：
(i)包含编码包含SEQ ID NO:153中所示的序列的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸；
(ii)包含编码包含SEQ ID NO:146中所示的序列的shmiR-CD3-γ的DNA序列或由其组成的核酸；和
(iii)包含编码包含SEQ ID NO:144中所示的序列的shmiR-TCR-β的DNA序列或由其组成的核酸。
在一个实例中，ddRNAi构建体包含：
(i)包含编码包含SEQ ID NO:153中所示的序列的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸；
(ii)包含编码包含SEQ ID NO:146中所示的序列的shmiR-CD3-γ的DNA序列或由其组成的核酸；和
(iii)包含编码包含SEQ ID NO:144中所示的序列的shmiR-TCR-β的DNA序列或由其组成的核酸。
在一个实例中，ddRNAi构建体包含具有SEQ ID NO:175中所示的DNA序列的核酸或由其组成。在一个实例中，ddRNAi构建体包含具有SEQ ID NO:178中所示的DNA序列的核酸或由其组成。
根据其中ddRNAi构建体包含两种或更多种具有编码shmiR的DNA序列的核酸的另一个实例，所述两种或更多种核酸选自：
(i)包含编码包含效应子序列的shmiR-TCR-α的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与TCR-α亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补；
(ii)包含编码包含效应子序列的shmiR-TCR-β的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与TCR-β亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补；和
(iii)包含编码包含效应子序列的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与CD3-ε亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补。
在一个实例中，ddRNAi构建体包含：
(i)包含编码包含效应子序列的shmiR-TCR-α的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与TCR-α亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补；
(ii)包含编码包含效应子序列的shmiR-TCR-β的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与TCR-β亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补；和
(iii)包含编码包含效应子序列的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与CD3-ε亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补。
靶向TCR亚基TCR-α、TCR-β、CD3-ε的mRNA转录物的shmiR的示例性效应子序列和同源效应子互补序列描述于表2中，并且涵盖于本文中。
在一个实例中，shmiR-TCR-α包含SEQ ID NO:100中所示的效应子序列。在一个实例中，shmiR-TCR-β包含SEQ ID NO:116中所示的效应子序列。在一个实例中，shmiR-CD3-ε包含SEQ ID NO:134中所示的效应子序列。
因此，在一个实例中，ddRNAi构建体包含以下中的至少两个：
(i)包含编码包含SEQ ID NO:100中所示的效应子序列的shmiR-TCR-α的DNA序列或由其组成的核酸；
(ii)包含编码包含SEQ ID NO:116中所示的效应子序列的shmiR-TCR-β的DNA序列或由其组成的核酸；和
(iii)包含编码包含SEQ ID NO:134中所示的效应子序列的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸。
在一个实例中，ddRNAi构建体包含：
(i)包含编码包含SEQ ID NO:100中所示的效应子序列的shmiR-TCR-α的DNA序列或由其组成的核酸；
(ii)包含编码包含SEQ ID NO:116中所示的效应子序列的shmiR-TCR-β的DNA序列或由其组成的核酸；和
(iii)包含编码包含SEQ ID NO:134中所示的效应子序列的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸。
在一个实例中，shmiR-TCR-α包含SEQ ID NO:100中所示的效应子序列和SEQ IDNO:101中所示的效应子互补序列。在一个实例中，shmiR-TCR-β包含SEQ ID NO:116中所示的效应子序列和SEQ ID NO:117中所示的效应子互补序列。在一个实例中，shmiR-CD3-ε包含SEQ ID NO:134中所示的效应子序列和SEQ ID NO:135中所示的效应子互补序列。
因此，在一个实例中，ddRNAi构建体包含以下中的至少两个：
(i)包含编码包含SEQ ID NO:100中所示的效应子序列和SEQ ID NO:101中所示的效应子互补序列的shmiR-TCR-α的DNA序列或由其组成的核酸；
(ii)包含编码包含SEQ ID NO:116中所示的效应子序列和SEQ ID NO:117中所示的效应子互补序列的shmiR-TCR-β的DNA序列或由其组成的核酸；和
(iii)包含编码包含SEQ ID NO:134中所示的效应子序列和SEQ ID NO:135中所示的效应子互补序列的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸。
在一个实例中，ddRNAi构建体包含：
(i)包含编码包含SEQ ID NO:100中所示的效应子序列和SEQ ID NO:101中所示的效应子互补序列的shmiR-TCR-α的DNA序列或由其组成的核酸；
(ii)包含编码包含SEQ ID NO:116中所示的效应子序列和SEQ ID NO:117中所示的效应子互补序列的shmiR-TCR-β的DNA序列或由其组成的核酸；和
(iii)包含编码包含SEQ ID NO:134中所示的效应子序列和SEQ ID NO:135中所示的效应子互补序列的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸。
靶向TCR亚基TCR-α、TCR-β、CD3-ε的mRNA转录物的shmiR的示例性shmiR序列描述于表3中，并且涵盖于本文中。
在一个实例中，shmiR-TCR-α包含SEQ ID NO:136中所示的序列。在一个实例中，shmiR-TCR-β包含SEQ ID NO:144中所示的序列。在一个实例中，shmiR-CD3-ε包含SEQ IDNO:153中所示的序列。
因此，在一个实例中，ddRNAi构建体包含以下中的至少两个：
(i)包含编码包含SEQ ID NO:136中所示的序列的shmiR-TCR-α的DNA序列或由其组成的核酸；
(ii)包含编码包含SEQ ID NO:144中所示的序列的shmiR-TCR-β的DNA序列或由其组成的核酸；和
(iii)包含编码包含SEQ ID NO:153中所示的序列的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸。
在一个实例中，ddRNAi构建体包含：
(i)包含编码包含SEQ ID NO:136中所示的序列的shmiR-TCR-α的DNA序列或由其组成的核酸；
(ii)包含编码包含SEQ ID NO:144中所示的序列的shmiR-TCR-β的DNA序列或由其组成的核酸；和
(iii)包含编码包含SEQ ID NO:153中所示的序列的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸。
在一个实例中，ddRNAi构建体包含具有SEQ ID NO:172中所示的DNA序列的核酸或由其组成。在另一个实例中，ddRNAi构建体包含具有SEQ ID NO:176中所示的DNA序列的核酸或由其组成。
根据其中ddRNAi构建体包含两种或更多种具有编码shmiR的DNA序列的核酸的另一个实例，所述两种或更多种核酸选自：
(i)包含编码包含效应子序列的shmiR-TCR-α的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与TCR-α亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补；
(ii)包含编码包含效应子序列的shmiR-CD3-γ的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与CD3-γ亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补；和
(iii)包含编码包含效应子序列的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与CD3-ε亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补。
在一个实例中，ddRNAi构建体包含：
(i)包含编码包含效应子序列的shmiR-TCR-α的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与TCR-α亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补；
(ii)包含编码包含效应子序列的shmiR-CD3-γ的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与CD3-γ亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补；和
(iii)包含编码包含效应子序列的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与CD3-ε亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补。
靶向TCR亚基TCR-α、CD3-γ和CD3-ε的mRNA转录物的shmiR的示例性效应子序列和同源效应子互补序列描述于表2中，并且涵盖于本文中。
在一个实例中，shmiR-TCR-α包含SEQ ID NO:100中所示的效应子序列。在一个实例中，CD3-γ包含SEQ ID NO:120中所示的效应子序列。在一个实例中，shmiR-CD3-ε包含SEQ ID NO:134中所示的效应子序列。
因此，在一个实例中，ddRNAi构建体包含以下中的至少两个：
(i)包含编码包含SEQ ID NO:100中所示的效应子序列的shmiR-TCR-α的DNA序列或由其组成的核酸；
(ii)包含编码包含SEQ ID NO:120中所示的效应子序列的shmiR-CD3-γ的DNA序列或由其组成的核酸；和
(iii)包含编码包含SEQ ID NO:134中所示的效应子序列的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸。
在一个实例中，ddRNAi构建体包含：
(i)包含编码包含SEQ ID NO:100中所示的效应子序列的shmiR-TCR-α的DNA序列或由其组成的核酸；
(ii)包含编码包含SEQ ID NO:120中所示的效应子序列的shmiR-CD3-γ的DNA序列或由其组成的核酸；和
(iii)包含编码包含SEQ ID NO:134中所示的效应子序列的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸。
在一个实例中，shmiR-TCR-α包含SEQ ID NO:100中所示的效应子序列和SEQ IDNO:101中所示的效应子互补序列。在一个实例中，shmiR-CD3-γ包含SEQ ID NO:120中所示的效应子序列和SEQ ID NO:121中所示的效应子互补序列。在一个实例中，shmiR-CD3-ε包含SEQ ID NO:134中所示的效应子序列和SEQ ID NO:135中所示的效应子互补序列。
因此，在一个实例中，ddRNAi构建体包含以下中的至少两个：
(i)包含编码包含SEQ ID NO:100中所示的效应子序列和SEQ ID NO:101中所示的效应子互补序列的shmiR-TCR-α的DNA序列或由其组成的核酸；
(ii)包含编码包含SEQ ID NO:120中所示的效应子序列和SEQ ID NO:121中所示的效应子互补序列的shmiR-CD3-γ的DNA序列或由其组成的核酸；和
(iii)包含编码包含SEQ ID NO:134中所示的效应子序列和SEQ ID NO:135中所示的效应子互补序列的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸。
在一个实例中，ddRNAi构建体包含：
(i)包含编码包含SEQ ID NO:100中所示的效应子序列和SEQ ID NO:101中所示的效应子互补序列的shmiR-TCR-α的DNA序列或由其组成的核酸；
(ii)包含编码包含SEQ ID NO:120中所示的效应子序列和SEQ ID NO:121中所示的效应子互补序列的shmiR-CD3-γ的DNA序列或由其组成的核酸；和
(iii)包含编码包含SEQ ID NO:134中所示的效应子序列和SEQ ID NO:135中所示的效应子互补序列的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸。
靶向TCR亚基TCR-α、CD3-γ和CD3-ε的mRNA转录物的shmiR的示例性shmiR序列描述于表3中，并且涵盖于本文中。
在一个实例中，shmiR-TCR-α包含SEQ ID NO:136中所示的序列。在一个实例中，shmiR-CD3-γ包含SEQ ID NO:146中所示的序列。在一个实例中，shmiR-CD3-ε包含SEQ IDNO:153中所示的序列。
因此，在一个实例中，ddRNAi构建体包含以下中的至少两个：
(i)包含编码包含SEQ ID NO:134中所示的序列的shmiR-TCR-α的DNA序列或由其组成的核酸；
(ii)包含编码包含SEQ ID NO:146中所示的序列的shmiR-CD3-γ的DNA序列或由其组成的核酸；和
(iii)包含编码包含SEQ ID NO:153中所示的序列的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸。
在一个实例中，ddRNAi构建体包含：
(i)包含编码包含SEQ ID NO:134中所示的序列的shmiR-TCR-α的DNA序列或由其组成的核酸；
(ii)包含编码包含SEQ ID NO:146中所示的序列的shmiR-CD3-γ的DNA序列或由其组成的核酸；和
(iii)包含编码包含SEQ ID NO:153中所示的序列的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸。
在一个实例中，ddRNAi构建体包含具有SEQ ID NO:173中所示的DNA序列的核酸或由其组成。在另一个实例中，ddRNAi构建体包含具有SEQ ID NO:177中所示的DNA序列的核酸或由其组成。
根据其中ddRNAi构建体包含两种或更多种具有编码shmiR的DNA序列的核酸的另一个实例，所述两种或更多种核酸选自：
(i)包含编码包含效应子序列的shmiR-TCR-α的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与TCR-α亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补；
(ii)包含编码包含效应子序列的shmiR-CD3-δ的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与CD3-δ亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补；和
(iii)包含编码包含效应子序列的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与CD3-ε亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补。
在一个实例中，ddRNAi构建体包含：
(i)包含编码包含效应子序列的shmiR-TCR-α的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与TCR-α亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补；
(ii)包含编码包含效应子序列的shmiR-CD3-δ的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与CD3-δ亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补；和
(iii)包含编码包含效应子序列的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与CD3-ε亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补。
靶向TCR亚基TCR-α、CD3-δ和CD3-ε的mRNA转录物的shmiR的示例性效应子序列和同源效应子互补序列描述于表2中，并且涵盖于本文中。
在一个实例中，shmiR-TCR-α包含SEQ ID NO:100中所示的效应子序列。在一个实例中，CD3-δ包含SEQ ID NO:126中所示的效应子序列。在一个实例中，shmiR-CD3-ε包含SEQID NO:134中所示的效应子序列。
因此，在一个实例中，ddRNAi构建体包含以下中的至少两个：
(i)包含编码包含SEQ ID NO:100中所示的效应子序列的shmiR-TCR-α的DNA序列或由其组成的核酸；
(ii)包含编码包含SEQ ID NO:126中所示的效应子序列的shmiR-CD3-δ的DNA序列或由其组成的核酸；和
(iii)包含编码包含SEQ ID NO:134中所示的效应子序列的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸。
在一个实例中，ddRNAi构建体包含：
(i)包含编码包含SEQ ID NO:100中所示的效应子序列的shmiR-TCR-α的DNA序列或由其组成的核酸；
(ii)包含编码包含SEQ ID NO:126中所示的效应子序列的shmiR-CD3-δ的DNA序列或由其组成的核酸；和
(iii)包含编码包含SEQ ID NO:134中所示的效应子序列的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸。
在一个实例中，shmiR-TCR-α包含SEQ ID NO:100中所示的效应子序列和SEQ IDNO:101中所示的效应子互补序列。在一个实例中，shmiR-CD3-δ包含SEQ ID NO:126中所示的效应子序列和SEQ ID NO:127中所示的效应子互补序列。在一个实例中，shmiR-CD3-ε包含SEQ ID NO:134中所示的效应子序列和SEQ ID NO:135中所示的效应子互补序列。
因此，在一个实例中，ddRNAi构建体包含以下中的至少两个：
(i)包含编码包含SEQ ID NO:100中所示的效应子序列和SEQ ID NO:101中所示的效应子互补序列的shmiR-TCR-α的DNA序列或由其组成的核酸；
(ii)包含编码包含SEQ ID NO:126中所示的效应子序列和SEQ ID NO:127中所示的效应子互补序列的shmiR-CD3-δ的DNA序列或由其组成的核酸；和
(iii)包含编码包含SEQ ID NO:134中所示的效应子序列和SEQ ID NO:135中所示的效应子互补序列的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸。
在一个实例中，ddRNAi构建体包含：
(i)包含编码包含SEQ ID NO:100中所示的效应子序列和SEQ ID NO:101中所示的效应子互补序列的shmiR-TCR-α的DNA序列或由其组成的核酸；
(ii)包含编码包含SEQ ID NO:126中所示的效应子序列和SEQ ID NO:127中所示的效应子互补序列的shmiR-CD3-δ的DNA序列或由其组成的核酸；和
(iii)包含编码包含SEQ ID NO:134中所示的效应子序列和SEQ ID NO:135中所示的效应子互补序列的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸。
靶向TCR亚基TCR-α、CD3-δ和CD3-ε的mRNA转录物的shmiR的示例性shmiR序列描述于表3中，并且涵盖于本文中。
在一个实例中，shmiR-TCR-α包含SEQ ID NO:136中所示的序列。在一个实例中，shmiR-CD3-δ包含SEQ ID NO:149中所示的序列。在一个实例中，shmiR-CD3-ε包含SEQ IDNO:153中所示的序列。
因此，在一个实例中，ddRNAi构建体包含以下中的至少两个：
(i)包含编码包含SEQ ID NO:136中所示的序列的shmiR-TCR-α的DNA序列或由其组成的核酸；
(ii)包含编码包含SEQ ID NO:149中所示的序列的shmiR-CD3-δ的DNA序列或由其组成的核酸；和
(iii)包含编码包含SEQ ID NO:153中所示的序列的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸。
在一个实例中，ddRNAi构建体包含：
(i)包含编码包含SEQ ID NO:136中所示的序列的shmiR-TCR-α的DNA序列或由其组成的核酸；
(ii)包含编码包含SEQ ID NO:149中所示的序列的shmiR-CD3-δ的DNA序列或由其组成的核酸；和
(iii)包含编码包含SEQ ID NO:153中所示的序列的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸。
在一个实例中，ddRNAi构建体包含具有SEQ ID NO:174中所示的DNA序列的核酸或由其组成。
在一个实例中，ddRNAi构建体在编码shmiR的每个核酸的上游包含RNA pol III启动子。例如，所述RNA pol III启动子或每个RNA pol III启动子选自U6和H1启动子。例如，所述RNA pol III启动子或每个RNA pol III启动子是选自U6-9启动子、U6-1启动子和U6-8启动子的U6启动子。例如，一种或多种RNA pol III启动子是选自U6-9启动子、U6-1启动子和U6-8启动子的U6启动子，并且pol III启动子中的一个或多个是H1启动子。
本发明还提供了DNA构建体，其包含：
(a)如本文所述的ddRNAi构建体；和
(b)嵌合抗原受体(CAR)构建体，其包含具有编码CAR的DNA序列的核酸。
在一个实例中，CAR包含抗原结合结构域。
在一个实例中，抗原结合结构域是结合蛋白。例如，抗原结合结构域是抗体或其抗原结合结构域。
在一个实例中，抗原结合结构域与肿瘤抗原特异性结合。本文描述了示例性肿瘤抗原，并且其应该被采用来在经必要修改后应用于本公开的该实例。在一个实例中，CAR包含与CD19结合的抗原结合结构域。
在另一个实例中，抗原结合结构域与存在于感染细胞表面上的病毒抗原或病毒诱导的抗原特异性结合。在一个实例中，病毒抗原选自由以下组成的组：人巨细胞病毒(HCMV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、腺病毒(AdV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、流感病毒和BK病毒(BKV)、约翰-坎宁安(JC)病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒、鼻病毒、人偏肺病毒、单纯疱疹病毒(HSV)1、HSV II、人疱疹病毒(HHV)6、HHV 8、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、戊型肝炎病毒、轮状病毒、乳头瘤病毒、细小病毒属埃博拉病毒、寨卡病毒、汉坦病毒和水疱性口炎病毒(VSV)。
在一个实例中，编码CAR的DNA序列与包含在CAR构建体内并位于编码CAR的DNA序列的上游的启动子可操作地连接。在一个实例中，DNA构建体以5'至3'方向包含ddRNAi构建体和CAR构建体。在一个实例中，DNA构建体以5'至3'方向包含CAR构建体和ddRNAi构建体。
本公开还提供了表达载体，其包含本文所述的ddRNAi构建体或本文所述的DNA构建体。
本公开还提供了多种表达载体，其中所述表达载体之一包含本文所述的ddRNAi构建体，并且所述表达载体之一包含如本文所述的DNA构建体的CAR构建体。
在一个实例中，所述一种或多种表达载体是一种或多种质粒或一种或多种微环。
在一个实例中，所述一种或多种表达载体是选自由以下组成的组的病毒载体：腺相关病毒(AAV)载体、逆转录病毒载体、腺病毒(AdV)载体和慢病毒(LV)载体。
根据其中提供多个表达载体的实例，所述表达载体可以相同或不同。
本公开还提供了T细胞，所述T细胞包含本文所述的ddRNAi构建体或本文所述的DNA构建体或如本文所述的一种或多种表达载体。
在一个实例中，本公开的T细胞不表达功能性TCR。例如，T细胞表现出TCR复合物的至少两种组分的细胞表面表达减少即，使得功能性TCR不会组装。
在一个实例中，T细胞还表达CAR。例如，提供不表达功能性(内源性的)TCR并表达CAR的T细胞(在本文中也称为CAR-T细胞)。
在一个实例中，CAR包含抗原结合结构域。
在一个实例中，抗原结合结构域是结合蛋白。例如，抗原结合结构域是抗体或其抗原结合结构域。
在一个实例中，抗原结合结构域与肿瘤抗原特异性结合。本文描述了示例性肿瘤抗原，并且其应该被采用来在经必要修改后应用于本公开的该实例。
在另一个实例中，抗原结合结构域与存在于感染细胞表面上的病毒抗原或病毒诱导的抗原特异性结合。在一个实例中，病毒抗原选自由以下组成的组：人巨细胞病毒(HCMV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、腺病毒(AdV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、流感病毒和BK病毒(BKV)、约翰-坎宁安(JC)病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒、鼻病毒、人偏肺病毒、单纯疱疹病毒(HSV)1、HSV II、人疱疹病毒(HHV)6、HHV 8、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、戊型肝炎病毒、轮状病毒、乳头瘤病毒、细小病毒属埃博拉病毒、寨卡病毒、汉坦病毒和水疱性口炎病毒(VSV)。
本公开还提供了组合物，所述组合物包含本文所述的ddRNAi构建体或本文所述的DNA构建体或如本文所述的一种或多种表达载体或如本文所述的T细胞。
在一个实例中，组合物还包含一种或多种药学上可接受的载体。根据包含如本文所述的ddRNAi构建体、DNA构建体、一种或多种表达载体的组合物的实例，载体可适合于例如，离体地、在细胞培养中向细胞施用。根据包含如本文所述的T细胞的组合物的实例，载体可适于在疗法中向受试者(例如，人)施用。合适的载体是本领域已知的和本文中所述的。
本公开还提供了产生不表达功能性TCR的T细胞的方法，所述方法包括将本文所述的ddRNAi构建体、本文所述的DNA构建体、本文所述的一种或多种表达载体或如本文所述的组合物引入T细胞。
本公开还提供了产生T细胞的方法，所述T细胞不表达功能性TCR但表达嵌合抗原受体(CAR)，所述方法包括将如本文所述的DNA构建体、包含所述DNA构建体的如本文所述的表达载体或包含所述DNA构建体的如本文所述的组合物引入T细胞。
本公开还提供了抑制T细胞中两种或更多种TCR复合物亚基表达的方法，所述方法包括将本文所述的ddRNAi构建体、本文所述的DNA构建体、本文所述的一种或多种表达载体或如本文所述的组合物引入T细胞。
在前述实例中的每个实例中，所述方法还可包括对产生的T细胞进行HLA分型。
可以离体执行每种本文描述的方法。
在一个实例中，在执行所述方法之前从个体或细胞库获得T细胞。
在每个实例中，所述方法可包括对T细胞执行一个或多个选择步骤，以便选择T细胞的亚群。在一个实例中，所述方法包括在免疫抑制剂存在下培养T细胞，以选择对免疫抑制剂具有抗性的T细胞。
本公开还提供了本文所述的T细胞在疗法中的用途。
在一个实例中，本公开提供了预防或治疗有此需要的个体中的癌症、移植物抗宿主病、感染、一种或多种自身免疫性病症、移植排斥或放射病的方法，包括向所述个体施用CAR-T细胞例如，不表达功能性(内源性的)TCR并且表达如本文所述的CAR的T细胞。在一个实例中，所述方法包括在制剂中施用CAR-T细胞。
在一个示例中，所述方法包括：从个体或细胞库获得T细胞；通过将如本文所述的DNA构建体、包含所述DNA构建体的如本文所述的表达载体或包含所述DNA构建体的如本文所述的组合物引入T细胞来离体产生CAR-T细胞；以及向所述个体施用所述CAR-T细胞。
在一个实例中，向个体施用的T细胞例如，CAR-T细胞，是同种异体T细胞。
在一个实例中，向个体施用的T细胞例如，CAR-T细胞，是非自体T细胞。
在一个实例中，向个体施用的T细胞例如，CAR-T细胞，是自体T细胞。
本公开还提供了包含多种不同HLA类型的不表达功能性TCR的T细胞的细胞库，其中所述细胞库包含至少一种本文所述的T细胞。
附图说明
图1显示了代表性shmiR构建体的预测的二级结构，所述shmiR构建体包含5'侧翼区、siRNA有义链(效应子互补序列)；茎/环接合序列、siRNA反义链(效应子序列)和3'侧翼区。
图2显示了各个shmiR构建体对TCR亚基表达的抑制。将如通过qPCR测量的相对于pSilencer对照的抑制百分比绘制成条形图，其中在下方标示相应的shmiR和靶向亚基。该图表明所有设计的shmiR都下调了它们的靶向亚基的表达。
图3提供了示例性三重shmiR构建体的图示。如图中所示，该构建体包含位于三个shmiR序列侧翼的慢病毒长末端重复序列，其中每个shmiR在不同聚合酶-III启动子的控制下表达。
图4显示了用实施例3的三重shmiR构建体转导的Jurkat T细胞表面上的TCR展示的FACS分析。如通过FACS图所示的，三重shmiR构建体使细胞表面上TCR的组装减少了约95％。
图5显示了如通过IL-2分泌测量的用三重shmiR构建体转导的Jurkat T细胞的活化的抑制。该图描绘了对于所分析的每种三重构建体，相对于未处理细胞的IL-2分泌的抑制百分比。在每个柱下方的括号中标示所使用的构建体以及构建体所靶向的TCR的亚基。
图6显示用三重shmiR构建体转导的Jurkat T细胞中IL-2 mRNA表达的抑制。通过qPCR测量转导的Jurkat T细胞中IL-2的表达水平，并将其与未处理的细胞进行比较以计算表达的抑制百分比。在图的下方标示所使用的构建体及其TCR靶亚基。
图7显示了三重shmiR构建体抑制抗原呈递细胞对T细胞的活化的能力。通过ELISA测量转导细胞分泌的IL-2的浓度，并将其绘制为相对于未处理细胞的抑制百分比。在图的下方标示所使用的构建体及其TCR靶亚基。
图8表明三重shmiR构建体不破坏TCR非依赖性T细胞活化。通过ELISA测量转导细胞分泌的IL-2的浓度，并将其绘制为相对于未处理细胞的百分比。在图的下方标示所使用的构建体及其TCR靶亚基。
图9证明了三重shmiR构建体不会显著影响转导细胞的细胞周期转换。根据BrdUFITC测定，使用双色FACS分析计数G2/M、S或G0/G1期中的细胞群(以及凋亡细胞)。在每个柱中标示每个细胞周期阶段中鉴定的细胞的百分比，其中在图的右侧标示相应的时期。
图10提供了用于同时进行TCR表达的敲低和利用抗CD19嵌合抗原受体(CAR)的替换的临床构建体的说明。在该实例中，编码抗CD19CAR的序列位于慢病毒载体中的三重shmiR构建体的上游。CAR在EF1启动子下表达，并包含抗CD19scFv结构域和信号传导结构域。实施例3中描述了三重shmiR构建体。
图11提供了由三重构建体(A)pBL513、(B)pBL514和(C)pBL516表达的TCRshmiR的下一代测序(NGS)数据。
图12提供了如通过Quantimir测定法测定的关于由三重构建体(A)pBL513、(B)pBL514和(C)pBL516表达的TCRshmiR的每细胞拷贝数的数据。
图13提供了萤光素酶报告子测定的结果，所述结果表明经经H1启动子修饰的构建体(A)pBL528、(B)pBL529和(C)pBL530中的每一种显示相较于原始三重构建体(分别为pBL513、pBL514和pBL516)显著增强的针对CD-3ε报告子构建体的抑制活性，这与CD3-ε_1shmiR从经H1启动子修饰的构建体的表达增加一致。
图14显示了如通过ELISA测定的用慢病毒三重构建体pBL513、pBL514、pBL516、pBL528、pBL529或pBL530转导的Jurkat T细胞中IL-2的抑制百分比。
图15是说明三重发夹pBL531构建体的示意图。
序列表注释
SEQ ID NO:1:称为TCR-α_1的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:2:称为TCR-α_1的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:3:称为TCR-α_2的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:4:称为TCR-α_2的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:5:称为TCR-α_3的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:6:称为TCR-α_3的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:7:称为TCR-α_4的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:8:称为TCR-α_4的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:9:称为TCR-α_5的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:10:称为TCR-α_5的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:11:称为TCR-α_6的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:12:称为TCR-α_6的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:13:称为TCR-β_1的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:14:称为TCR-β_1的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:15:称为TCR-β_2的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:16:称为TCR-β_2的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:17:称为TCR-β_3的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:18:称为TCR-β_3的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:19:称为TCR-β_4的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:20:称为TCR-β_4的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:21:称为TCR-β_5的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:22:称为TCR-β_5的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:23:称为TCR-β_6的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:24:称为TCR-β_6的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:25:称为TCR-β_7的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:26:称为TCR-β_7的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:27:称为TCR-β_8的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:28:称为TCR-β_8的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:29:称为TCR-β_9的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:30:称为TCR-β_9的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:31:称为CD3-ε_1的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:32:称为CD3-ε_1的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:33:称为CD3-ε_2的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:34:称为CD3-ε_2的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:35:称为CD3-ε_3的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:36:称为CD3-ε_3的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:37:称为CD3-ε_4的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:38:称为CD3-ε_4的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:39:称为CD3-ε_5的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:40:称为CD3-ε_5的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:41:称为CD3-ε_6的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:42:称为CD3-ε_6的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:43:称为CD3-ε_7的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:44:称为CD3-ε_7的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:45:称为CD3-ε_8的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:46:称为CD3-ε_8的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:47:称为CD3-ε_9的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:48:称为CD3-ε_9的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:49:称为CD3-ε_10的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:50:称为CD3-ε_10的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:51:称为CD3-ε_11的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:52:称为CD3-ε_11的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:53:称为CD3-ε_12的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:54:称为CD3-ε_12的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:55:称为CD3-ε_13的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:56:称为CD3-ε_13的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:57:称为CD3-δ_1的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:58:称为CD3-δ_1的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:59:称为CD3-δ_2的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:60:称为CD3-δ_2的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:61:称为CD3-δ_3的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:62:称为CD3-δ_3的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:63:称为CD3-δ_4的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:64:称为CD3-δ_4的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:65:称为CD3-δ_5的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:66:称为CD3-δ_5的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:67:称为CD3-δ_6的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:68:称为CD3-δ_6的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:69:称为CD3-δ_7的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:70:称为CD3-δ_7的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:71:称为CD3-δ_8的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:72:称为CD3-δ_8的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:73:称为CD3-δ_9的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:74:称为CD3-δ_9的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:75:称为CD3-δ_10的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:76:称为CD3-δ_10的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:77:称为CD3-δ_11的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:78:称为CD3-δ_11的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:79:称为CD3-δ_12的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:80:称为CD3-δ_12的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:81:称为CD3-δ_13的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:82:称为CD3-δ_13的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:83:称为CD3-γ_1的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:84:称为CD3-γ_1的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:85:称为CD3-γ_2的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:86:称为CD3-γ_2的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:87:称为CD3-γ_3的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:88:称为CD3-γ_3的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:89:称为CD3-γ_4的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:90:称为CD3-γ_4的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:91:称为CD3-γ_5的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:92:称为CD3-γ_5的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:93:称为CD3-γ_6的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:94:称为CD3-γ_6的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:95:称为CD3-γ_7的shRNA的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:96:称为CD3-γ_7的shRNA的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:97:shmiR的RNA茎环序列
SEQ ID NO:98:pri-miRNA骨架的5'侧翼序列。
SEQ ID NO:99:pri-miRNA骨架的3'侧翼序列
SEQ ID NO:100:称为shmiR-TCR-α_1的shmiR的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:101:称为shmiR-TCR-α_1的shmiR的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:102:称为shmiR-TCR-α_2的shmiR的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:103:称为shmiR-TCR-α_2的shmiR的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:104:称为shmiR-TCR-α_3的shmiR的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:105:称为shmiR-TCR-α_3的shmiR的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:106:称为shmiR-TCR-α_4的shmiR的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:107:称为shmiR-TCR-α_4的shmiR的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:108:称为shmiR-TCR-β_1的shmiR的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:109:称为shmiR-TCR-β_1的shmiR的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:110:称为shmiR-TCR-β_2的shmiR的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:111:称为shmiR-TCR-β_2的shmiR的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:112:称为shmiR-TCR-β_3的shmiR的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:113:称为shmiR-TCR-β_3的shmiR的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:114:称为shmiR-TCR-β_4的shmiR的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:115:称为shmiR-TCR-β_4的shmiR的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:116:称为shmiR-TCR-β_5的shmiR的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:117:称为shmiR-TCR-β_5的shmiR的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:118:称为shmiR-CD3-γ_1的shmiR的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:119:称为shmiR-CD3-γ_1的shmiR的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:120:称为shmiR-CD3-γ_2的shmiR的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:121:称为shmiR-CD3-γ_2的shmiR的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:122:称为shmiR-CD3-δ_1的shmiR的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:123:称为shmiR-CD3-δ_1的shmiR的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:124:称为shmiR-CD3-δ_2的shmiR的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:125:称为shmiR-CD3-δ_2的shmiR的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:126:称为shmiR-CD3-δ_3的shmiR的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:127:称为shmiR-CD3-δ_3的shmiR的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:128:称为shmiR-CD3-δ_4的shmiR的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:129:称为shmiR-CD3-δ_4的shmiR的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:130:称为shmiR-CD3-ε_1的shmiR的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:131:称为shmiR-CD3-ε_1的shmiR的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:132:称为shmiR-CD3-ε_2的shmiR的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:133:称为shmiR-CD3-ε_2的shmiR的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:134:称为shmiR-CD3-ε_3的shmiR的RNA效应子序列。
SEQ ID NO:135:称为shmiR-CD3-ε_3的shmiR的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO:136:称为shmiR-TCR-α_1的shmiR的RNA序列。
SEQ ID NO:137:称为shmiR-TCR-α_2的shmiR的RNA序列。
SEQ ID NO:138:称为shmiR-TCR-α_3的shmiR的RNA序列。
SEQ ID NO:139:称为shmiR-TCR-α_4的shmiR的RNA序列。
SEQ ID NO:140:称为shmiR-TCR-β_1的shmiR的RNA序列。
SEQ ID NO:141:称为shmiR-TCR-β_2的shmiR的RNA序列。
SEQ ID NO:142:称为shmiR-TCR-β_3的shmiR的RNA序列。
SEQ ID NO:143:称为shmiR-TCR-β_4的shmiR的RNA序列。
SEQ ID NO:144:称为shmiR-TCR-β_5的shmiR的RNA序列。
SEQ ID NO:145:称为shmiR-CD3-γ_1的shmiR的RNA序列。
SEQ ID NO:146:称为shmiR-CD3-γ_2的shmiR的RNA序列。
SEQ ID NO:147:称为shmiR-CD3-δ_1的shmiR的RNA序列。
SEQ ID NO:148:称为shmiR-CD3-δ_2的shmiR的RNA序列。
SEQ ID NO:149:称为shmiR-CD3-δ_3的shmiR的RNA序列。
SEQ ID NO:150:称为shmiR-CD3-δ_4的shmiR的RNA序列。
SEQ ID NO:151:称为shmiR-CD3-ε_1的shmiR的RNA序列。
SEQ ID NO:152:称为shmiR-CD3-ε_2的shmiR的RNA序列。
SEQ ID NO:153:称为shmiR-CD3-ε_3的shmiR的RNA序列。
SEQ ID NO:154:称为shmiR-TCR-α_1的shmiR的DNA序列。
SEQ ID NO:155:称为shmiR-TCR-α_2的shmiR的DNA序列。
SEQ ID NO:156:称为shmiR-TCR-α_3的shmiR的DNA序列。
SEQ ID NO:157:称为shmiR-TCR-α_4的shmiR的DNA序列。
SEQ ID NO:158:称为shmiR-TCR-β_1的shmiR的DNA序列。
SEQ ID NO:159:称为shmiR-TCR-β_2的shmiR的DNA序列。
SEQ ID NO:160:称为shmiR-TCR-β_3的shmiR的DNA序列。
SEQ ID NO:161:称为shmiR-TCR-β_4的shmiR的DNA序列。
SEQ ID NO:162:称为shmiR-TCR-β_5的shmiR的DNA序列。
SEQ ID NO:163:称为shmiR-CD3-γ_1的shmiR的DNA序列。
SEQ ID NO:164:称为shmiR-CD3-γ_2的shmiR的DNA序列。
SEQ ID NO:165:称为shmiR-CD3-δ_1的shmiR的DNA序列。
SEQ ID NO:166:称为shmiR-CD3-δ_2的shmiR的DNA序列。
SEQ ID NO:167:称为shmiR-CD3-δ_3的shmiR的DNA序列。
SEQ ID NO:168:称为shmiR-CD3-δ_4的shmiR的DNA序列。
SEQ ID NO:169:称为shmiR-CD3-ε_1的shmiR的DNA序列。
SEQ ID NO:170:称为shmiR-CD3-ε_2的shmiR的DNA序列。
SEQ ID NO:171:称为shmiR-CD3-ε_3的shmiR的DNA序列。
SEQ ID NO:172:编码称为shmiR-TCR-α、shmiR-TCR-β和shmiR-CD3-ε的shmiR的三重构建体pBL513的DNA序列。
SEQ ID NO:173:编码称为shmiR-TCR-α、shmiR-CD3-γ和shmiR-CD3-ε的shmiR的三重构建体pBL514的DNA序列。
SEQ ID NO:174:编码称为shmiR-TCR-α、shmiR-CD3-δ和shmiR-CD3-ε的shmiR的三重构建体pBL515的DNA序列。
SEQ ID NO:175:编码称为shmiR-TCR-β、shmiR-CD3-γ和shmiR-CD3-ε的shmiR的三重构建体pBL516的DNA序列。
SEQ ID NO:176:编码称为shmiR-TCR-α、shmiR-TCR-β和shmiR-CD3-ε的shmiR的三重构建体pBL528的DNA序列。
SEQ ID NO:177:编码称为shmiR-TCR-α、shmiR-CD3-γ和shmiR-CD3-ε的shmiR的三重构建体pBL529的DNA序列。
SEQ ID NO:178:编码称为shmiR-TCR-β、shmiR-CD3-γ和shmiR-CD3-ε的shmiR的三重构建体pBL530的DNA序列。
SEQ ID NO:179:编码称为shmiR-TCR-β、shmiR-CD3-γ和shmiR-CD3-ε的shmiR以及抗CD19嵌合抗原受体(CAR)的三重构建体pBL531的DNA序列。
SEQ ID NO:180:人TCR-αmRNA转录物的RNA序列。
SEQ ID NO:181:小鼠TCR-αmRNA转录物的RNA序列。
SEQ ID NO:182:预测的猕猴TCR-αmRNA转录物的RNA序列。
SEQ ID NO:183:人TCR-βmRNA转录物的RNA序列。
SEQ ID NO:184:小鼠TCR-βmRNA转录物的RNA序列。
SEQ ID NO:185:猕猴TCR-βmRNA转录物(恒定区)的RNA序列。
SEQ ID NO:186:人CD3-γmRNA转录物的RNA序列。
SEQ ID NO:187:小鼠CD3-γmRNA转录物的RNA序列。
SEQ ID NO:188:猕猴CD3-γmRNA转录物的RNA序列。
SEQ ID NO:189:人CD3-δmRNA转录物的RNA序列。
SEQ ID NO:190:小鼠CD3-δmRNA转录物的RNA序列。
SEQ ID NO:191:猕猴CD3-δmRNA转录物的RNA序列。
SEQ ID NO:192:人CD3-εmRNA转录物的RNA序列。
SEQ ID NO:193:小鼠CD3-εmRNA转录物的RNA序列。
SEQ ID NO:194:猕猴CD3-εmRNA转录物的RNA序列。
具体实施方式
概述
在整个本说明书中，除非另外明确说明或上下文另有要求，否则对单个步骤、特征、物质组成、步骤组或特征组或多种物质组成的提及应被视为涵盖一个和多个(即，一个或多个)这些步骤、特征、物质组成、步骤组或特征组或多种物质组成。
本领域技术人员将理解，本公开易于进行除具体描述的那些外的变化和修改。应当理解，本公开包括所有此类变化和修改。本公开还包括在本说明书中个别或共同提及或指示的所有步骤、特征、组合物以及化合物，以及任何两种或更多种所述步骤或特征的任何和所有组合。
本公开不限于本文描述的具体实例的范围，所述实例仅用于举例说明的目的。功能等同的产品、组合物和方法显然在本公开的范围内。
除非另外明确说明，否则本文中的任何本公开的实例应当被采用来在经必要修改后应用于本公开的任何其它实例。
除非另外明确定义，否则本文使用的所有技术和科学术语应被视为具有与本领域中(例如，在细胞培养、分子遗传学、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学和生物化学中)普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
除非另有说明，否则本公开中使用的重组DNA、重组蛋白、细胞培养物和免疫学技术是本领域技术人员公知的标准程序。此类技术在诸如以下来源中的整个文献中进行了描述和解释：J.Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning,John Wiley和Sons(1984),J.Sambrook等Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press(1989),T.A.Brown(编辑)，Essential Molecular Biology:APractical Approach，第1卷和第2卷，IRL Press(1991),D.M.Glover和B.D.Hames(编辑),DNA Cloning:A Practical Approach，第1-4卷，IRL Press(1995年和1996年)，和F.M.Ausubel等(编辑),Current Protocols in Molecular Biology,GreenePub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括直至目前的所有更新),Ed Harlow和David Lane(编辑)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,(1988)，和J.E.Coligan等(编辑)Current Protocols in Immunology,JohnWiley&Sons(包括直至目前的所有更新)。
在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”或变化形式诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”被理解为暗示包括所述步骤或元件或整数或一组步骤或一组元件或一组整数，但不排除任何其它步骤或元件或整数或一组元件或一组整数。
术语“和/或”，例如，“X和/或Y”应理解为表示“X和Y”或“X或Y”，并且应被视为对两种含义或任一含义提供明确的支持。
选定的定义
“RNA”是指包含至少一个核糖核苷酸残基的分子。“核糖核苷酸”是指在β-D-核糖-呋喃糖部分的2'位置具有羟基的核苷酸。所述术语包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA诸如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成RNA、重组产生的RNA，以及与天然存在的RNA相异在于一个或多个核苷酸的添加、缺失、取代和/或改变的改变的RNA。此类改变可包括例如在RNA的一个或多个核苷酸处添加非核苷酸材料，诸如添加至siRNA的一个或两个末端或内部。本公开的RNA分子中的核苷酸还可以包含非标准核苷酸，诸如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可以称为类型物或天然存在的RNA的类似物。
术语“RNA干扰”或“RNAi”通常是指由细胞的细胞质中的双链RNA(dsRNA)分子引发的基因表达的RNA依赖性沉默。dsRNA分子减少或抑制靶核酸序列的转录产物积累，从而沉默基因或减少该基因的表达。
如本文中所用，术语“双链RNA”或“dsRNA”是指具有双链体结构并且包含彼此具有相似的长度的效应子序列和效应子互补序列的RNA分子。效应子序列和效应子互补序列可存在于单个RNA链中或存在于分开的RNA链中。“效应子序列”(通常称为“引导链”)与靶序列基本上互补，所述靶序列在本情况下是TCR-α、TCR-β、CD3-γ、CD3-δ或CD3-ε转录物的区域。“效应子序列”也可以称为“反义序列”。“效应子互补序列”将与效应子序列充分互补，使得其可以与效应子序列退火以形成双链体。在这方面，效应子互补序列将与靶序列的区域基本上同源。对于技术人员显而易见的是，术语“效应子互补序列”也可称为“效应子序列的互补序列”或有义序列。
如本文中所用，术语“双链体”是指两个互补或基本上互补的核酸(例如，RNA)中，或单链核酸(例如，)的两个互补或基本上互补的区域中的区域，所述区域通过沃尔森-克里克碱基配对或允许互补或基本互补的核苷酸序列之间形成稳定双链体的任何其它方式，彼此形成碱基对。本领域技术人员将理解，在双链体区域内，不需要100％的互补性；可允许基本上的互补性。基本上的互补性可包括79％或更高的互补性。例如，由19个碱基对组成的双链体区域中的单个错配(即，18个碱基对和一个错配)导致94.7％的互补性，使双链区基本上互补。在另一个实例中，由19个碱基对组成的双链体区域中的两个错配(即，17个碱基对和两个错配)导致89.5％的互补性，使双链区基本上互补。在另一个实例中，由19个碱基对组成的双链体区域中的三个错配(即，16个碱基对和三个错配)导致84.2％的互补性，使双链区基本上互补。
dsRNA可以作为发夹结构或茎环结构提供，其中双链区由通过称为茎环的至少2个核苷酸序列连接的效应子序列和效应子互补序列组成。当dsRNA作为发夹或茎环结构提供时，其可称为“发夹RNA”或“短发夹RNAi剂”或“shRNA”。在发夹或茎环结构中提供的或产生发夹或茎环结构的其它dsRNA分子包括初级miRNA转录物(pri-miRNA)和前体微RNA(pre-miRNA)。Pre-miRNA shRNA可以通过酶Drosha和Pasha的作用从pri-miRNA天然产生，所述酶识别并释放形成茎-环结构的初级miRNA转录物的区域。或者，可工程化pri-miRNA转录物以用人工/重组茎-环结构替代天然茎-环结构。也就是说，可以将人工/重组茎-环结构插入或克隆到缺乏其天然茎-环结构的pri-miRNA骨架序列中。在经工程化以作为pri-miRNA分子的一部分表达的茎环序列的情况下，Drosha和Pasha识别并释放人工shRNA。使用该方法产生的dsRNA分子称为“shmiRNA”、“shmiR”或“微RNA框架shRNA”。
如本文中所用，关于序列的术语“互补性”是指通过沃尔森-克里克碱基配对的序列的互补序列，其中鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)配对，腺嘌呤(A)与尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)配对。序列可以与另一序列的整个长度互补，或者其可以与另一序列的指定部分或长度互补。本领域技术人员将认识到U可以存在于RNA中，并且T可以存在于DNA中。因此，RNA或DNA序列的任一种中的A可以与RNA序列中的U或DNA序列中的T配对。G也可以与RNA分子中的U配对。
如本文中所用，术语“基本上互补”用于表示足够程度的互补性或精确配对，使得在核酸序列之间例如，在效应子序列与效应子互补序列之间或效应子序列与靶序列之间发生稳定和特异性结合。应理解，核酸的序列不需要与其靶标或互补序列的序列100％互补。该术语涵盖与另一个序列(悬突除外)互补的序列。在一些情况下，除1-2个错配外，序列与另外的序列互补。在一些情况下，除1个错配外，序列是互补的。在一些情况下，除2个错配外，序列是互补的。在一些情况下，除3个错配外，序列是互补的。在另外的其它情况下，除4个错配外，序列是互补的。
根据其中本公开的shmiR或shRNA包含效应子序列(所述效应子序列与靶序列的区域“基本上互补”并且相对于其包含1个、2个、3个或4个错配碱基)的实例，优选一个或多个错配不位于对应于shmiR或shRNA的种子区域(即，效应子序列的核苷酸2-8)的区域内。
如本公开的shRNA或shmiR的上下文中所用，术语“编码的”或“编码”应理解为表示能够从DNA模板转录的shmiR或shRNA。因此，编码或编码本公的shmiR或shRNA的核酸将包含DNA序列，所述DNA序列用作各自shmiR或shRNA的转录模板。
术语“DNA指导的RNAi构建体”或“ddRNAi构建体”是指包含DNA序列的核酸，所述DNA序列在转录时产生引发RNAi的shmiR或shRNA分子(优选shmiR)。ddRNAi构建体可包含核酸，所述核酸转录为能够自我退火成具有通过至少2个核苷酸的茎环连接的双链区发夹结构，即，shmiR或shRNA的单个RNA，或转录为具有多个shmiR或shRNA的单个RNA，或转录为各自分别能够折叠为单个shmiR或shRNA的多个RNA转录物。可在包含一个或多个另外的DNA序列的较大“DNA构建体”内提供ddRNAi构建体。例如，可在DNA构建体中提供ddRNAi构建体，所述DNA构建体包含编码功能性非TCR受体例如，嵌合抗原受体的另外的DNA序列。ddRNAi构建体和/或包含其的DNA构建体可以在表达载体(例如，包含一个或多个启动子的构建体)内。
如本文中所用，术语“可操作地连接的”或“可操作的键联”(或类似术语)意指编码核酸序列与调控序列(例如，启动子)以促进所述编码序列表达的方式连接或结合。调控序列包括启动子、增强子和本领域公认的并被选择来指导编码序列表达的其它表达控制元件。
“载体”应理解为意指用于将核酸引入细胞的运载体。载体包括但不限于质粒、噬菌粒、病毒、细菌和源自病毒或细菌来源的运载体。“质粒”是环状双链DNA分子。根据本公开使用的有用类型的载体是病毒载体，其中将异源DNA序列插入病毒基因组中，所述病毒基因组可以被修饰以删除一个或多个病毒基因或其部分。某些载体能够在宿主细胞中自主复制(例如，具有在宿主细胞中起作用的复制起点的载体)。其它载体可被稳定地整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。如本文中所用，术语“表达载体”应理解为意指能够表达本公开的RNA分子的载体。
如本文中所用，术语“嵌合抗原受体”或者可选地“CAR”是指重组多肽构建体，其包含至少一个细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞质信号传导结构域(在本文中也称为“细胞内信号传导结构域”)，所述细胞质信号传导结构域包含源自如下定义的刺激分子和/或共刺激分子的功能信号传导结构域。在一些实例中，CAR多肽构建体中的结构域位于同一多肽链中，例如，包含嵌合融合蛋白。在其它实施方案中，CAR多肽构建体中的结构域彼此不连续，例如，存在于不同的多肽链中。
如本文中所用，术语“抗原结合结构域”应理解为意指识别抗原并与其结合的蛋白质或其区域。示例性抗原结合结构域是与细胞表面上表达的肿瘤抗原或病毒抗原结合的结构域。
术语“肿瘤抗原”或“癌症相关抗原”是指相较于正常细胞优先在癌细胞的表面上完整地或作为片段(例如，MHC/肽)表达，并且可用于优先将药理学药剂靶向癌细胞的分子(通常为蛋白质、碳水化合物或脂质)。在一些实例中，肿瘤抗原是特定增殖性疾病共同的抗原。在一些实例中，癌症相关抗原是与正常细胞相比在癌细胞中过表达(例如，相较于正常细胞1-35倍的过表达、2倍的过表达、3倍的过表达或更多倍的过表达)的细胞表面分子。在一些实例中，癌症相关抗原是在癌细胞中不适当合成的细胞表面分子，例如，与正常细胞上表达的分子相比含有缺失、添加或突变的分子。在一些实例中，癌症相关抗原将仅在癌细胞的细胞表面上完整地或作为片段(例如，MHC/肽)表达，并且不在正常细胞的表面上合成或表达。本文描述了示例性肿瘤抗原。
如本文中所用，术语“跨膜结构域”是指跨越质膜的多肽。在一个实例中，其将细胞外序列(例如，开关结构域、细胞外识别元件，例如，抗原结合域、抑制性反配体结合域或共刺激ECD结构域)与细胞内序列(例如，开关结构域或细胞内信号传导结构域)连接。本文描述了示例性跨膜结构域。
如本文中所用，术语“细胞内信号传导结构域”是指分子的细胞内部分。在一些实例中，细胞内信号结构域传导效应子功能信号并指导细胞执行专化功能。术语“效应子功能”是指细胞的专化功能。例如，T细胞的效应子功能可为溶细胞活性或辅助活性，包括分泌细胞因子。尽管可以使用完整的细胞内信号传导结构域，但在许多情况下不必使用整条链。如果使用细胞内信号传导结构域的截短部分，则这种截短部分可代替完整链使用，只要其仍然转导效应功能信号即可。因此，术语胞内信号传导结构域意指包括胞内信号传导结构域中足以转导效应功能信号的任何截短部分。在一个实例中，细胞内信号传导结构域可包含初级细胞内信号传导结构域。示例性初级细胞内信号传导结构域包括源自负责初级刺激或抗原依赖性刺激的分子的那些。在一个实例中，细胞内信号传导结构域可包含共刺激细胞内结构域。示例性初级细胞内信号传导结构域包括源自负责初级刺激信号或抗原依赖性刺激的分子的那些。例如，在CAR-T细胞的情况下，初级细胞内信号传导结构域可包含T细胞受体的细胞质序列，并且共刺激细胞内信号传导结构域可包含来自共受体或共刺激分子的细胞质序列。
如本文中所用，术语“共刺激信号传导结构域”是指CAR-T细胞的分子(例如，内源分子)的细胞内信号传导结构域，所述细胞内信号传导结构域在与靶细胞上的其同源反配体结合后增强例如，增加免疫效应反应。共刺激细胞内信号传导结构域可以是共刺激分子的细胞内部分。“共刺激分子”是指包含“共刺激信号传导结构域”的分子。共刺激细胞内信号传导结构域可源自共刺激分子的细胞内部分。细胞内信号传导结构域可包含其所源自的分子的整个细胞内部分或整个天然细胞内信号传导结构域，或其功能片段。本文描述了示例性共刺激分子。
“T细胞”属于称为淋巴细胞的一组白细胞，并且在细胞介导的免疫中起着中心作用，并且在较低程度上发挥适应性免疫应答。通常，T细胞与其它淋巴细胞(例如，B细胞和天然杀伤细胞)区别在于存在T细胞受体(TCR)。T细胞具有各种不同的作用，所述不同的作用通过分化不同的T细胞群(可通过离散的基因表达谱识别)来实现。
术语“CAR-T细胞”、“CART细胞”或类似术语应理解为意指包含嵌合抗原受体(CAR)的T细胞。
如本文中所用，术语“治疗(treating)”、“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”及其变化形式是指被设计来改变临床病理学过程中所治疗的个体或细胞的自然进程的临床干预。理想的治疗效果包括减小疾病进展速度，改善或缓解疾病状态，以及缓和或改善预后。
如本文中所用，术语“癌症”是指特征在于异常细胞的快速和不受控制的生长的疾病。癌细胞可局部扩散，或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其它部位。各种癌症的实例包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、血癌例如，白血病、肺癌症等。本文描述了另外的示例性癌症。术语“癌症”包括所有类型的癌性生长或致癌过程、转移性组织或恶性转化的细胞、组织或器官，而与侵袭性的组织病理学类型或阶段无关。术语“肿瘤”和“癌症”在本文中可互换使用。这两个术语都包括实固体和液体，例如，弥漫性或循环性肿瘤。如本文中所用，术语“癌症”或“肿瘤”包括恶变前以及恶性癌症和肿瘤。
如本文中所用，术语“自体的”是指源自同一个体的任何材料例如，T细胞，所述材料后来例如，在治疗期间被重新引入所述个体。
如本文中所用，术语“非自体的”是指任何材料例如，T细胞，所述材料源自相对于将向其引入所述材料的个体不同的个体。
如本文中所用，术语“同种异体的”是指任何材料例如，T细胞，所述材料源自与向其引入所述材料的个体相同的物种的不同个体。当一个或多个基因座处的基因不相同时，两个或更多个个体被认为是彼此同种异体的。在一些方面，来自相同物种的个体的同种异体材料例如，T细胞可以与遗传上足够不同以抗原性相互作用。
“治疗有效量”至少是实现待治疗的疾病或病患例如，癌症或病毒感染的可测量的改善所需的最小浓度或量。技术人员将意识到这样的量将根据例如待治疗的疾病(例如，在癌症的情况下，特定类型的癌症和/或其阶段，或在病毒感染的情况下，病毒的类型)和/或特定受试者和/或所治疗的病患的类型或严重性而变化。因此，该术语不应解释为将本公开限制于本公开的组合物的细胞群的特定量，例如，重量或数量。
如本文中所用，“受试者”或“患者”可以是患有例如癌症、移植物抗宿主病、感染例如，病毒感染、一种或多种自身免疫性病症、移植排斥或放射病的人或非人动物。“非人动物”可以是灵长类动物、牲畜(例如，绵羊、马、牛、猪、驴)、伴侣动物(例如，宠物诸如狗和猫)、实验室试验动物(例如，小鼠、兔、大鼠、豚鼠、果蝇、秀丽隐杆线虫、斑马鱼)、表演动物(例如，赛马、骆驼、赛狗)或圈养野生动物。在一个实例中，受试者或患者是哺乳动物。在特别优选的实例中，受试者或患者是人。
在TCR、TCR复合物或其亚基的上下文中，术语“抑制表达”、“减少表达”或类似术语是指对应于TCR复合物或其亚基的蛋白质和/或mRNA转录物的不存在或可观察到的水平降低。减少或降低不必是绝对的，但可以是足以使TCR无功能的部分减少。
DNA指导的RNA干扰(ddRNAi)构建体
在一个实例中，本公开提供了DNA指导的RNA干扰(ddRNAi)构建体，其包含一种或多种具有编码短发夹微RNA(shmiR)的DNA序列的核酸，其中每种shmiR包含：
长度为至少17个核苷酸的效应子序列；
效应子互补序列；
茎环序列；和
初级微RNA(pri-miRNA)骨架；
其中每种shmiR的效应子序列与选自由以下组成的组的T细胞受体(TCR)复合物亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补：CD3-ε、TCR-α、TCR-β、CD3-δ和CD3-γ。例如，每种shmiR的效应子序列的长度小于30个核苷酸。例如，合适的效应子序列的长度可在17-29个核苷酸的范围内。例如，效应子序列的长度可为21个核苷酸。例如，效应子序列的长度可为21个核苷酸，并且效应子互补序列的长度可为20个核苷酸。
靶向TCR复合物亚基CD3-ε的shmiR将包含与CD3-ε亚基的RNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补的效应子序列。作为实例而非限制，参考SEQ ID NO:192-194中的任何一个或多个描述人、小鼠和猕猴CD3-ε亚基的RNA转录物。靶向根据本实例的CD3-ε亚基的ShmiR统称为“shmiR-CD3-ε”。例如，shmiR-CD3-ε的效应子序列可与CD3-ε亚基的mRNA序列内具有相应长度的区域基本上互补并含有4个相对于其的错配碱基。例如，shmiR-CD3-ε的效应子序列可与CD3-ε亚基的mRNA序列内具有相应长度的区域基本上互补并含有3个相对于其的错配碱基。例如，shmiR-CD3-ε的效应子序列可与CD3-ε亚基的mRNA序列内具有相应长度的区域基本上互补并含有2个相对于其的错配碱基。例如，shmiR-CD3-ε的效应子序列可与CD3-ε亚基的mRNA序列内具有相应长度的区域基本上互补并含有1个相对于其的错配碱基。例如，shmiR-CD3-ε的效应子序列可与CD3-ε亚基的mRNA序列内具有相应长度的区域具有100％互补性。
靶向TCR复合物亚基TCR-α的shmiR将包含与TCR-α亚基的恒定区的RNA转录物内具有相应长度的区域基本上互补的效应子序列。作为实例而非限制，参考SEQ ID NO:180-182中的任何一个或多个描述人、小鼠和猕猴TCR-α亚基的RNA转录物。靶向根据本实例的TCR-α亚基的ShmiR统称为“shmiR-TCR-α”。例如，shmiR-TCR-α的效应子序列可与TCR-α亚基的恒定区的mRNA序列内具有相应长度的区域基本上互补并含有4个相对于其的错配碱基。例如，shmiR-TCR-α的效应子序列可与TCR-α亚基的恒定区的mRNA序列内具有相应长度的区域基本上互补并含有3个相对于其的错配碱基。例如，shmiR-TCR-α的效应子序列可与TCR-α亚基的恒定区的mRNA序列内具有相应长度的区域基本上互补并含有2个相对于其的错配碱基。例如，shmiR-TCR-α的效应子序列可与TCR-α亚基的恒定区的mRNA序列内具有相应长度的区域基本上互补并含有1个相对于其的错配碱基。例如，shmiR-TCR-α的效应子序列可与TCR-α亚基的恒定区的mRNA序列内具有相应长度的区域具有100％互补性。
靶向TCR复合物亚基TCR-β的shmiR将包含与TCR-β亚基的恒定区的RNA转录物内具有相应长度的区域基本上互补的效应子序列。作为实例而非限制，参考SEQ ID NO:183-185中的任何一个或多个描述人、小鼠和猕猴TCR-β亚基的RNA转录物。靶向根据本实例的TCR-β亚基的ShmiR统称为“shmiR-TCR-β”。例如，shmiR-TCR-β的效应子序列可与TCR-β亚基的恒定区的mRNA序列内具有相应长度的区域基本上互补并含有4个相对于其的错配碱基。例如，shmiR-TCR-β的效应子序列可与TCR-β亚基的恒定区的mRNA序列内具有相应长度的区域基本上互补并含有3个相对于其的错配碱基。例如，shmiR-TCR-β的效应子序列可与TCR-β亚基的恒定区的mRNA序列内具有相应长度的区域基本上互补并含有2个相对于其的错配碱基。例如，shmiR-TCR-β的效应子序列可与TCR-β亚基的恒定区的mRNA序列内具有相应长度的区域基本上互补并含有1个相对于其的错配碱基。例如，shmiR-TCR-β的效应子序列可与TCR-β亚基的恒定区的mRNA序列内具有相应长度的区域具有100％互补性。
靶向TCR复合物亚基CD3-γ的shmiR将包含与CD3-γ亚基的RNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补的效应子序列。作为实例而非限制，参考SEQ ID NO:186-188中的任何一个或多个描述人、小鼠和猕猴CD3-γ亚基的RNA转录物。靶向根据本实例的CD3-γ亚基的ShmiR统称为“shmiR-CD3-γ”。例如，shmiR-CD3-γ的效应子序列可与CD3-γ亚基的mRNA序列内具有相应长度的区域基本上互补并含有4个相对于其的错配碱基。例如，shmiR-CD3-γ的效应子序列可与CD3-γ亚基的mRNA序列内具有相应长度的区域基本上互补并含有3个相对于其的错配碱基。例如，shmiR-CD3-γ的效应子序列可与CD3-γ亚基的mRNA序列内具有相应长度的区域基本上互补并含有2个相对于其的错配碱基。例如，shmiR-CD3-γ的效应子序列可与CD3-γ亚基的mRNA序列内具有相应长度的区域基本上互补并含有1个相对于其的错配碱基。例如，shmiR-CD3-γ的效应子序列可与CD3-γ亚基的mRNA序列内具有相应长度的区域具有100％互补性。
靶向TCR复合物亚基CD3-δ的shmiR将包含与CD3-δ亚基的RNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补的效应子序列。作为实例而非限制，参考SEQ ID NO:189-191中的任何一个或多个描述人、小鼠和猕猴CD3-δ亚基的RNA转录物。靶向根据本实例的CD3-δ亚基的ShmiR统称为“shmiR-CD3-δ”。例如，shmiR-CD3-δ的效应子序列可与CD3-δ亚基的mRNA序列内具有相应长度的区域基本上互补并含有4个相对于其的错配碱基。例如，shmiR-CD3-δ的效应子序列可与CD3-δ亚基的mRNA序列内具有相应长度的区域基本上互补并含有3个相对于其的错配碱基。例如，shmiR-CD3-δ的效应子序列可与CD3-δ亚基的mRNA序列内具有相应长度的区域基本上互补并含有2个相对于其的错配碱基。例如，shmiR-CD3-δ的效应子序列可与CD3-δ亚基的mRNA序列内具有相应长度的区域基本上互补并含有1个相对于其的错配碱基。例如，shmiR-CD3-δ的效应子序列可与CD3-δ亚基的mRNA序列内具有相应长度的区域具有100％互补性。
在一个例子中，如本文所述的shmiR-CD3-ε包含：(i)效应子序列，除1个、2个、3个或4个碱基错配外，其与SEQ ID NO:135中所示的序列基本上互补，条件是所述效应子序列能够与SEQ ID NO:135中所示的序列形成双链体；和(ii)效应子互补序列，其包含与效应子序列基本上互补的序列。例如，shmiR-CD3-ε可包含SEQ ID NO:134中所示的效应子序列和效应子互补序列，所述效应子互补序列与SEQ ID NO:134中所示的序列基本上互补并且能够与其形成双链体。与SEQ ID NO：134中所示的序列基本上互补的效应子互补序列可以是SEQ ID NO:135中所示的序列。靶向根据本实例的CD3-ε亚基的shmiR在下文中称为“shmiR-CD3-ε_3”。
在一个实例中，如本文所述的shmiR-CD3-ε包含：(i)效应子序列，除1个、2个、3个或4个碱基错配外，其与SEQ ID NO:131中所示的序列基本上互补，条件是所述效应子序列能够与SEQ ID NO:131中所示的序列形成双链体；和(ii)效应子互补序列，其包含与所述效应子序列基本上互补的序列。例如，shmiR-CD3-ε可包含SEQ ID NO:130中所示的效应子序列和效应子互补序列，所述效应子互补序列与SEQ ID NO:130中所示的序列基本上互补并且能够与其形成双链体。与SEQ ID NO：130中所示的序列基本上互补的效应子互补序列可以是SEQ ID NO:131中所示的序列。靶向根据本实例的CD3-ε亚基的shmiR在下文中称为“shmiR-CD3-ε_1”。
在一个实例中，如本文所述的shmiR-CD3-ε包含：(i)效应子序列，除1个、2个、3个或4个碱基错配外，其与SEQ ID NO:133中所示的序列基本上互补，条件是所述效应子序列能够与SEQ ID NO:133中所示的序列形成双链体；和(ii)效应子互补序列，其包含与所述效应子序列基本上互补的序列。例如，shmiR-CD3-ε可包含SEQ ID NO:132中所示的效应子序列和效应子互补序列，所述效应子互补序列与SEQ ID NO:132中所示的序列基本上互补并且能够与其形成双链体。与SEQ ID NO:132中所示的序列基本上互补的效应子互补序列可以是SEQ ID NO:133中所示的序列。靶向根据本实例的CD3-ε亚基的shmiR在下文中称为“shmiR-CD3-ε_2”。
在一个实例中，如本文所述的shmiR-TCR-α包含：(i)效应子序列，除1个、2个、3个或4个碱基错配外，其与SEQ ID NO:101中所示的序列基本上互补，条件是所述效应子序列能够与SEQ ID NO:101中所示的序列形成双链体；和(ii)效应子互补序列，其包含与所述效应子序列基本上互补的序列。例如，shmiR-TCR-α可包含SEQ ID NO:100中所示的效应子序列和效应子互补序列，所述效应子互补序列与SEQ ID NO:100中所示的序列基本上互补并且能够与其形成双链体。与SEQ ID NO:100中所示的序列基本上互补的效应子互补序列可以是SEQ ID NO:101中所示的序列。靶向根据本实例的TCR-α亚基的shmiR在下文中称为“shmiR-TCR-α_1”。
在一个实例中，如本文所述的shmiR-TCR-α包含：(i)效应子序列，除1个、2个、3个或4个碱基错配外，其与SEQ ID NO:103中所示的序列基本上互补，条件是所述效应子序列能够与SEQ ID NO:103中所示的序列形成双链体；和(ii)效应子互补序列，其包含与所述效应子序列基本上互补的序列。例如，shmiR-TCR-α可包含SEQ ID NO:102中所示的效应子序列和效应子互补序列，所述效应子互补序列与SEQ ID NO:102中所示的序列基本上互补并且能够与其形成双链体。与SEQ ID NO:102中所示的序列基本上互补的效应子互补序列可以是SEQ ID NO:103中所示的序列。靶向根据本实例的TCR-α亚基的shmiR在下文中称为“shmiR-TCR-α_2”。
在一个实例中，如本文所述的shmiR-TCR-α包含：(i)效应子序列，除1个、2个、3个或4个碱基错配外，其与SEQ ID NO:105中所示的序列基本上互补，条件是所述效应子序列能够与SEQ ID NO:105中所示的序列形成双链体；和(ii)效应子互补序列，其包含与所述效应子序列基本上互补的序列。例如，shmiR-TCR-α可包含SEQ ID NO:104中所示的效应子序列和效应子互补序列，所述效应子互补序列与SEQ ID NO:104中所示的序列基本上互补并且能够与其形成双链体。与SEQ ID NO:104中所示的序列基本上互补的效应子互补序列可以是SEQ ID NO:105中所示的序列。靶向根据本实例的TCR-α亚基的shmiR在下文中称为“shmiR-TCR-α_3”。
在一个实例中，如本文所述的shmiR-TCR-α包含：(i)效应子序列，除1个、2个、3个或4个碱基错配外，其与SEQ ID NO:107中所示的序列基本上互补，条件是所述效应子序列能够与SEQ ID NO:107中所示的序列形成双链体；和(ii)效应子互补序列，其包含与所述效应子序列基本上互补的序列。例如，shmiR-TCR-α可包含SEQ ID NO:106中所示的效应子序列和效应子互补序列，所述效应子互补序列与SEQ ID NO:106中所示的序列基本上互补并且能够与其形成双链体。与SEQ ID NO:106中所示的序列基本上互补的效应子互补序列可以是SEQ ID NO:107中所示的序列。靶向根据本实例的TCR-α亚基的shmiR在下文中称为“shmiR-TCR-α_4”。
在一个实例中，如本文所述的shmiR-TCR-β包含：(i)效应子序列，除1个、2个、3个或4个碱基错配外，其与SEQ ID NO:117中所示的序列基本上互补，条件是所述效应子序列能够与SEQ ID NO:117中所示的序列形成双链体；和(ii)效应子互补序列，其包含与所述效应子序列基本上互补的序列。例如，shmiR-TCR-β可包含SEQ ID NO:116中所示的效应子序列和效应子互补序列，所述效应子互补序列与SEQ ID NO:116中所示的序列基本上互补并且能够与其形成双链体。与SEQ ID NO:116中所示的序列基本上互补的效应子互补序列可以是SEQ ID NO:117中所示的序列。靶向根据本实例的TCR-β亚基的shmiR在下文中称为“shmiR-TCR-β_5”。
在一个实例中，如本文所述的shmiR-TCR-β包含：(i)效应子序列，除1个、2个、3个或4个碱基错配外，其与SEQ ID NO:109中所示的序列基本上互补，条件是所述效应子序列能够与SEQ ID NO:109中所示的序列形成双链体；和(ii)效应子互补序列，其包含与所述效应子序列基本上互补的序列。例如，shmiR-TCR-β可包含SEQ ID NO:108中所示的效应子序列和效应子互补序列，所述效应子互补序列与SEQ ID NO:108中所示的序列基本上互补并且能够与其形成双链体。与SEQ ID NO:108中所示的序列基本上互补的效应子互补序列可以是SEQ ID NO:109中所示的序列。靶向根据本实例的TCR-β亚基的shmiR在下文中称为“shmiR-TCR-β_1”。
在一个实例中，如本文所述的shmiR-TCR-β包含：(i)效应子序列，除1个、2个、3个或4个碱基错配外，其与SEQ ID NO:111中所示的序列基本上互补，条件是所述效应子序列能够与SEQ ID NO:111中所示的序列形成双链体；和(ii)效应子互补序列，其包含与所述效应子序列基本上互补的序列。例如，shmiR-TCR-β可包含SEQ ID NO:110中所示的效应子序列和效应子互补序列，所述效应子互补序列与SEQ ID NO:110中所示的序列基本上互补并且能够与其形成双链体。与SEQ ID NO:110中所示的序列基本上互补的效应子互补序列可以是SEQ ID NO:111中所示的序列。靶向根据本实例的TCR-β亚基的shmiR在下文中称为“shmiR-TCR-β_2”。
在一个实例中，如本文所述的shmiR-TCR-β包含：(i)效应子序列，除1个、2个、3个或4个碱基错配外，其与SEQ ID NO:113中所示的序列基本上互补，条件是所述效应子序列能够与SEQ ID NO:113中所示的序列形成双链体；和(ii)效应子互补序列，其包含与所述效应子序列基本上互补的序列。例如，shmiR-TCR-β可包含SEQ ID NO:112中所示的效应子序列和效应子互补序列，所述效应子互补序列与SEQ ID NO:112中所示的序列基本上互补并且能够与其形成双链体。与SEQ ID NO:112中所示的序列基本上互补的效应子互补序列可以是SEQ ID NO:113中所示的序列。靶向根据本实例的TCR-β亚基的shmiR在下文中称为“shmiR-TCR-β_3”。
在一个实例中，如本文所述的shmiR-TCR-β包含：(i)效应子序列，除1个、2个、3个或4个碱基错配外，其与SEQ ID NO:115中所示的序列基本上互补，条件是所述效应子序列能够与SEQ ID NO:115中所示的序列形成双链体；和(ii)效应子互补序列，其包含与所述效应子序列基本上互补的序列。例如，shmiR-TCR-β可包含SEQ ID NO:114中所示的效应子序列和效应子互补序列，所述效应子互补序列与SEQ ID NO:114中所示的序列基本上互补并且能够与其形成双链体。与SEQ ID NO:114中所示的序列基本上互补的效应子互补序列可以是SEQ ID NO:115中所示的序列。靶向根据本实例的TCR-β亚基的shmiR在下文中称为“shmiR-TCR-β_4”。
在一个实例中，如本文所述的shmiR-CD3-γ包含：(i)效应子序列，除1个、2个、3个或4个碱基错配外，其与SEQ ID NO:121中所示的序列基本上互补，条件是所述效应子序列能够与SEQ ID NO:121中所示的序列形成双链体；和(ii)效应子互补序列，其包含与所述效应子序列基本上互补的序列。例如，shmiR-CD3-γ可包含SEQ ID NO:120中所示的效应子序列和效应子互补序列，所述效应子互补序列与SEQ ID NO:120中所示的序列基本上互补并且能够与其形成双链体。与SEQ ID NO:120中所示的序列基本上互补的效应子互补序列可以是SEQ ID NO:121中所示的序列。靶向根据本实例的CD3-γ亚基的shmiR在下文中称为“shmiR-CD3-γ_2”。
在一个实例中，如本文所述的shmiR-CD3-γ包含：(i)效应子序列，除1个、2个、3个或4个碱基错配外，其与SEQ ID NO:119中所示的序列基本上互补，条件是所述效应子序列能够与SEQ ID NO:119中所示的序列形成双链体；和(ii)效应子互补序列，其包含与所述效应子序列基本上互补的序列。例如，shmiR-CD3-γ可包含SEQ ID NO:118中所示的效应子序列和效应子互补序列，所述效应子互补序列与SEQ ID NO:118中所示的序列基本上互补并且能够与其形成双链体。与SEQ ID NO:118中所示的序列基本上互补的效应子互补序列可以是SEQ ID NO:119中所示的序列。靶向根据本实例的CD3-γ亚基的shmiR在下文中称为“shmiR-CD3-γ_1”。
在一个实例中，如本文所述的shmiR-CD3-δ包含：(i)效应子序列，除1个、2个、3个或4个碱基错配外，其与SEQ ID NO:127中所示的序列基本上互补，条件是所述效应子序列能够与SEQ ID NO:127中所示的序列形成双链体；和(ii)效应子互补序列，其包含与所述效应子序列基本上互补的序列。例如，shmiR-CD3-δ可包含SEQ ID NO:126中所示的效应子序列和效应子互补序列，所述效应子互补序列与SEQ ID NO:126中所示的序列基本上互补并且能够与其形成双链体。与SEQ ID NO:126中所示的序列基本上互补的效应子互补序列可以是SEQ ID NO:127中所示的序列。靶向根据本实例的CD3-δ亚基的shmiR在下文中称为“shmiR-CD3-δ_3”。
在一个实例中，如本文所述的shmiR-CD3-δ包含：(i)效应子序列，除1个、2个、3个或4个碱基错配外，其与SEQ ID NO:123中所示的序列基本上互补，条件是所述效应子序列能够与SEQ ID NO:123中所示的序列形成双链体；和(ii)效应子互补序列，其包含与所述效应子序列基本上互补的序列。例如，shmiR-CD3-δ可包含SEQ ID NO:122中所示的效应子序列和效应子互补序列，所述效应子互补序列与SEQ ID NO:122中所示的序列基本上互补并且能够与其形成双链体。与SEQ ID NO:122中所示的序列基本上互补的效应子互补序列可以是SEQ ID NO:123中所示的序列。靶向根据本实例的CD3-δ亚基的shmiR在下文中称为“shmiR-CD3-δ_1”。
在一个实例中，如本文所述的shmiR-CD3-δ包含：(i)效应子序列，除1个、2个、3个或4个碱基错配外，其与SEQ ID NO:125中所示的序列基本上互补，条件是所述效应子序列能够与SEQ ID NO:125中所示的序列形成双链体；和(ii)效应子互补序列，其包含与所述效应子序列基本上互补的序列。例如，shmiR-CD3-δ可包含SEQ ID NO:124中所示的效应子序列和效应子互补序列，所述效应子互补序列与SEQ ID NO:124中所示的序列基本上互补并且能够与其形成双链体。与SEQ ID NO:124中所示的序列基本上互补的效应子互补序列可以是SEQ ID NO:125中所示的序列。靶向根据本实例的CD3-δ亚基的shmiR在下文中称为“shmiR-CD3-δ_2”。
在一个实例中，如本文所述的shmiR-CD3-δ包含：(i)效应子序列，除1个、2个、3个或4个碱基错配外，其与SEQ ID NO:129中所示的序列基本上互补，条件是所述效应子序列能够与SEQ ID NO:129中所示的序列形成双链体；和(ii)效应子互补序列，其包含与所述效应子序列基本上互补的序列。例如，shmiR-CD3-δ可包含SEQ ID NO:128中所示的效应子序列和效应子互补序列，所述效应子互补序列与SEQ ID NO:128中所示的序列基本上互补并且能够与其形成双链体。与SEQ ID NO:128中所示的序列基本上互补的效应子互补序列可以是SEQ ID NO:129中所示的序列。靶向根据本实例的CD3-δ亚基的shmiR在下文中称为“shmiR-CD3-δ_4”。
在任何本文所述的实例中，shmiR以5'至3'方向包含：
pri-miRNA骨架的5'侧翼序列；
效应子互补序列；
茎环序列；
效应子序列；和
pri-miRNA骨架的3'侧翼序列。
合适的环序列可选自本领域已知的那些。然而，示例性茎环序列示于SEQ ID NO:97中。
用于本公开的核酸的合适的初级微RNA(pri-miRNA或pri-R)骨架可选自本领域已知的那些。例如，pri-miRNA骨架可以选自pri-miR-30a骨架、pri-miR-155骨架、pri-miR-21骨架和pri-miR-136骨架。例如，pri-miRNA骨架是pri-miR-30a骨架。根据其中pri-miRNA骨架是pri-miR-30a骨架的实例，pri-miRNA骨架的5'侧翼序列示于SEQ ID NO:98中，并且pri-miRNA骨架的3'侧翼序列示于SEQ ID NO:99中。因此，编码本公开的各个shmiR的核酸可包含编码SEQ ID NO:98中所示的序列的DNA序列和编码SEQ ID NO:99中所示的序列的DNA序列。
根据其中shmiR-CD3-ε包含如本文所述的pri-miR-30a骨架和SEQ ID NO:97中所示的茎环序列的实例，shmiR-CD3-ε可包含SEQ ID NO:153、151或152之一中所示的序列或由其组成。因此，编码shmiR-CD3-ε的核酸序列可分别包含SEQ ID NO:171、169或170之一中所示的DNA序列或由其组成。在一个实例中，靶向CD3-ε亚基的shmiR是shmiR-CD3-ε_3，其包含由SEQ ID NO:171中所示的DNA序列编码的SEQ ID NO:153中所示的序列或由其组成。在一个实例中，靶向CD3-ε亚基的shmiR是shmiR-CD3-ε_1，其包含由SEQ ID NO:169中所示的DNA序列编码的SEQ ID NO:151中所示的序列或由其组成。在一个实例中，靶向CD3-ε亚基的shmiR是shmiR-CD3-ε_2，其包含由SEQ ID NO:170中所示的DNA序列编码的SEQ ID NO:152中所示的序列或由其组成。
根据其中shmiR-TCR-α包含如本文所述的pri-miR-30a骨架和SEQ ID NO:97中所示的茎环序列的实例，shmiR-TCR-α可包含SEQ ID NO:136-139之一中所示的序列或由其组成。因此，编码shmiR-TCR-α的核酸序列可分别包含SEQ ID NO:154-157之一中所示的DNA序列或由其组成。在一个实例中，靶向TCR-α亚基的shmiR是shmiR-TCR-α_1，其包含由SEQ IDNO:154中所示的DNA序列编码的SEQ ID NO:136中所示的序列或由其组成。在一个实例中，靶向TCR-α亚基的shmiR是shmiR-TCR-α_2，其包含由SEQ ID NO:155中所示的DNA序列编码的SEQ ID NO:137中所示的序列或由其组成。在一个实例中，靶向TCR-α亚基的shmiR是shmiR-TCR-α_3，其包含由SEQ ID NO:156中所示的DNA序列编码的SEQ ID NO:138中所示的序列或由其组成。在一个实例中，靶向TCR-α亚基的shmiR是shmiR-TCR-α_4，其包含由SEQID NO:157中所示的DNA序列编码的SEQ ID NO:139中所示的序列或由其组成。
根据其中shmiR-TCR-β包含如本文所述的pri-miR-30a骨架和SEQ ID NO:97中所示的茎环序列的实例，shmiR-TCR-β可包含SEQ ID NO:144或140-143之一中所示的序列或由其组成。因此，编码shmiR-TCR-α的核酸序列可分别包含SEQ ID NO:162或158-161之一中所示的DNA序列或由其组成。在一个实例中，靶向TCR-β亚基的shmiR可以是shmiR-TCR-β_5，其包含由SEQ ID NO:162中所示的DNA序列编码的SEQ ID NO:144中所示的序列或由其组成。在一个实例中，靶向TCR-β亚基的shmiR是shmiR-TCR-β_1，其包含由SEQ ID NO:158中所示的DNA序列编码的SEQ ID NO:140中所示的序列或由其组成。在一个实例中，靶向TCR-β亚基的shmiR是shmiR-TCR-β_2，其包含由SEQ ID NO:159中所示的DNA序列编码的SEQ ID NO:141中所示的序列或由其组成。在一个实例中，靶向TCR-β亚基的shmiR是shmiR-TCR-β_3，其包含由SEQ ID NO:160中所示的DNA序列编码的SEQ ID NO:142中所示的序列或由其组成。在一个实例中，靶向TCR-β亚基的shmiR是shmiR-TCR-β_4，其包含由SEQ ID NO:161中所示的DNA序列编码的SEQ ID NO:143中所示的序列或由其组成。
根据其中shmiR-CD3-γ包含如本文所述的pri-miR-30a骨架和SEQ ID NO:97中所示的茎环序列的实例，shmiR-CD3-γ可包含SEQ ID NO:146或145之一中所示的序列或由其组成。因此，编码shmiR-CD3-γ的核酸序列可分别包含SEQ ID NO:164或163之一中所示的DNA序列或由其组成。在一个实例中，靶向CD3-γ亚基的shmiR是shmiR-CD3-γ_2，其包含由SEQ ID NO:164中所示的DNA序列编码的SEQ ID NO:146中所示的序列或由其组成。在一个实例中，靶向CD3-γ亚基的shmiR是shmiR-CD3-γ_1，其包含由SEQ ID NO:163中所示的DNA序列编码的SEQ ID NO:145中所示的序列或由其组成。
根据其中shmiR-CD3-δ包含如本文所述的pri-miR-30a骨架和SEQ ID NO:97中所示的茎环序列的实例，shmiR-CD3-δ可包含SEQ ID NO:149、147、148或150之一中所示的序列或由其组成。因此，编码shmiR-CD3-δ的核酸序列可分别包含SEQ ID NO:167、165、166或168之一中所示的DNA序列或由其组成。在一个实例中，靶向CD3-δ亚基的shmiR是shmiR-CD3-δ_3，其包含由SEQ ID NO:167中所示的DNA序列编码的SEQ ID NO:149中所示的序列或由其组成。在一个实例中，靶向CD3-δ亚基的shmiR是shmiR-CD3-δ_1，其包含由SEQ ID NO:165中所示的DNA序列编码的SEQ ID NO:147中所示的序列或由其组成。在一个实例中，靶向CD3-δ亚基的shmiR是shmiR-CD3-δ_2，其包含由SEQ ID NO:166中所示的DNA序列编码的SEQID NO:148中所示的序列或由其组成。在一个实例中，靶向CD3-δ亚基的shmiR是shmiR-CD3-δ_4，其包含由SEQ ID NO:168中所示的DNA序列编码的SEQ ID NO:150中所示的序列或由其组成。
如本文中所述，本公开的ddRNAi构建体包含两种或更多种具有编码靶向TCR复合物的亚基的shmiR的DNA序列的核酸。在一些实例中，由至少两种核酸编码的shmiR可以靶向对应于单个TCR亚基的同一mRNA转录物的不同区域。在其它实例中，ddRNAi构建体编码至少两种shmiR，所述shmiR包含靶向TCR复合物的不同亚基的mRNA转录物的效应子序列。这样，可通过ddRNAi构建体靶向TCR复合物的多个亚基以进行RNAi。
在一个实例中，本公开的ddRNAi构建体包含选自以下的两种或更多种核酸：
(i)包含编码如本文所述的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸。
(ii)包含编码如本文所述的shmiR-TCR-α的DNA序列或由其组成的核酸。
(iii)包含编码如本文所述的shmiR-TCR-β的DNA序列或由其组成的核酸。
(iv)包含编码如本文所述的shmiR-CD3-γ的DNA序列或由其组成的核酸。
(v)包含编码如本文所述的shmiR-CD3-δ的DNA序列或由其组成的核酸。
在一个实例中，本公开的ddRNAi构建体包含含有编码如本文所述的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸，和一种或多种包含编码shmiR的DNA序列或由其组成的另外的核酸，所述shmiR选自shmiR-TCR-α、shmiR-TCR-β、shmiR-CD3-γ和shmiR-CD3-δ，所述shmiR中的每一种是如本文所述的。
在一个实例中，本公开的ddRNAi构建体包含含有编码如本文所述的shmiR-TCR-α的DNA序列或由其组成的核酸，和一种或多种包含编码shmiR的DNA序列或由其组成的另外的核酸，所述shmiR选自shmiR-TCR-β、shmiR-CD3-γ、shmiR-CD3-δ和shmiR-CD3-ε，所述shmiR中的每一种是如本文所述的。
在一个实例中，本公开的ddRNAi构建体包含含有编码如本文所述的shmiR-TCR-β的DNA序列或由其组成的核酸，和一种或多种包含编码shmiR的DNA序列或由其组成的另外的核酸，所述shmiR选自shmiR-TCR-α、shmiR-CD3-γ、shmiR-CD3-δ和shmiR-CD3-ε，所述shmiR中的每一种是如本文所述的。
在一个实例中，本公开的ddRNAi构建体包含含有编码如本文所述的shmiR-CD3-γ的DNA序列或由其组成的核酸，和一种或多种包含编码shmiR的DNA序列或由其组成的另外的核酸，所述shmiR选自shmiR-TCR-α、shmiR-TCR-β、shmiR-CD3-δ和shmiR-CD3-ε，所述shmiR中的每一种是如本文所述的。
在一个实例中，本公开的ddRNAi构建体包含含有编码如本文所述的shmiR-CD3-δ的DNA序列或由其组成的核酸，和一种或多种包含编码shmiR的DNA序列或由其组成的另外的核酸，所述shmiR选自shmiR-TCR-α、shmiR-TCR-β、shmiR-CD3-γ和shmiR-CD3-ε，所述shmiR中的每一种是如本文所述的。
在一个实例中，本公开的ddRNAi构建体包含选自以下的两种或更多种核酸：
(i)包含编码如本文所述的shmiR-TCR-β的DNA序列或由其组成的核酸。
(ii)包含编码如本文所述的shmiR-CD3-γ的DNA序列或由其组成的核酸；和
(iii)包含编码如本文所述的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸。
例如，本公开的ddRNAi构建体可以包含：
(i)包含编码如本文所述的shmiR-TCR-β的DNA序列或由其组成的核酸。
(ii)包含编码如本文所述的shmiR-CD3-γ的DNA序列或由其组成的核酸；和
(iii)包含编码如本文所述的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸。
在一个实例中，本公开的ddRNAi构建体包含选自以下的两种或更多种核酸：
(i)包含编码如本文所述的shmiR-TCR-α的DNA序列或由其组成的核酸；
(ii)包含编码如本文所述的shmiR-TCR-β的DNA序列或由其组成的核酸；和
(iii)包含编码如本文所述的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸。
例如，本公开的ddRNAi构建体可以包含：
(i)包含编码如本文所述的shmiR-TCR-α的DNA序列或由其组成的核酸；
(ii)包含编码如本文所述的shmiR-TCR-β的DNA序列或由其组成的核酸；和
(iii)包含编码如本文所述的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸。
在一个实例中，本公开的ddRNAi构建体包含选自以下的两种或更多种核酸：
(i)包含编码如本文所述的shmiR-TCR-α的DNA序列或由其组成的核酸；
(ii)包含编码如本文所述的shmiR-CD3-γ的DNA序列或由其组成的核酸；和
(iii)包含编码如本文所述的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸。
例如，本公开的ddRNAi构建体可以包含：
(i)包含编码如本文所述的shmiR-TCR-α的DNA序列或由其组成的核酸；
(ii)包含编码如本文所述的shmiR-CD3-γ的DNA序列或由其组成的核酸；和
(iii)包含编码如本文所述的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸。
在一个实例中，本公开的ddRNAi构建体包含选自以下的两种或更多种核酸：
(i)包含编码如本文所述的shmiR-TCR-α的DNA序列或由其组成的核酸；
(ii)包含编码如本文所述的shmiR-CD3-δ的DNA序列或由其组成的核酸；和
(iii)包含编码如本文所述的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸。
例如，本公开的ddRNAi构建体可以包含：
(i)包含编码如本文所述的shmiR-TCR-α的DNA序列或由其组成的核酸；
(ii)包含编码如本文所述的shmiR-CD3-δ的DNA序列或由其组成的核酸；和
(iii)包含编码如本文所述的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸。
称为shmiR-TCR-α、shmiR-TCR-β、shmiR-TCR-γ、shmiR-TCR-δ和shmiR-CD3-ε的ShmiR，包括编码其的DNA序列，已描述于本文中并且应该被采用来在经必要修改后应用于本公开的每个实例。
在一个实例中，所述至少两种核酸选自由以下组成的组：
包含编码包含SEQ ID NO:134中所示的效应子序列和SEQ ID NO:135中所示的效应子互补序列的shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，例如，包含SEQ ID NO:171中所示的DNA序列或由其组成并且编码具有SEQ ID NO:153中所示的序列的shmiR(shmiR-CD3-ε_3)的核酸；
包含编码包含SEQ ID NO:100中所示的效应子序列和SEQ ID NO:101中所示的效应子互补序列的shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，例如，包含SEQ ID NO:154中所示的DNA序列或由其组成并且编码具有SEQ ID NO:136中所示的序列的shmiR(shmiR-TCR-α_1)的核酸；
包含编码包含SEQ ID NO:116中所示的效应子序列和SEQ ID NO:117中所示的效应子互补序列的shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，例如，包含SEQ ID NO:162中所示的DNA序列或由其组成并且编码具有SEQ ID NO:144中所示的序列的shmiR(shmiR-TCR-β_5)的核酸；
包含编码包含SEQ ID NO:120中所示的效应子序列和SEQ ID NO:121中所示的效应子互补序列的shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，例如，包含SEQ ID NO:164中所示的DNA序列或由其组成并且编码具有SEQ ID NO:146中所示的序列的shmiR(shmiR-CD3-γ_2)的核酸；和
包含编码包含SEQ ID NO:126中所示的效应子序列和SEQ ID NO:127中所示的效应子互补序列的shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，例如，包含SEQ ID NO:167中所示的DNA序列或由其组成并且编码具有SEQ ID NO:149中所示的序列的shmiR(shmiR-CD3-δ_3)的核酸。
例如，在一个实例中，ddRNAi构建体包含选自由以下组成的组的至少两种核酸：
包含编码包含SEQ ID NO:116中所示的效应子序列和SEQ ID NO:117中所示的效应子互补序列的shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，例如，包含SEQ ID NO:162中所示的DNA序列或由其组成并且编码具有SEQ ID NO:144中所示的序列的shmiR(shmiR-TCR-β_5)的核酸；
包含编码包含SEQ ID NO:120中所示的效应子序列和SEQ ID NO:121中所示的效应子互补序列的shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，例如，包含SEQ ID NO:164中所示的DNA序列或由其组成并且编码具有SEQ ID NO:146中所示的序列的shmiR(shmiR-CD3-γ_2)的核酸；和
包含编码包含SEQ ID NO:134中所示的效应子序列和SEQ ID NO:135中所示的效应子互补序列的shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，例如，包含SEQ ID NO:171中所示的DNA序列或由其组成并且编码具有SEQ ID NO:153中所示的序列的shmiR(shmiR-CD3-ε_3)的核酸。
在一个实例中，ddRNAi构建体包含：
包含编码包含SEQ ID NO:116中所示的效应子序列和SEQ ID NO:117中所示的效应子互补序列的shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，例如，包含SEQ ID NO:162中所示的DNA序列或由其组成并且编码具有SEQ ID NO:144中所示的序列的shmiR(shmiR-TCR-β_5)的核酸；
包含编码包含SEQ ID NO:120中所示的效应子序列和SEQ ID NO:121中所示的效应子互补序列的shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，例如，包含SEQ ID NO:164中所示的DNA序列或由其组成并且编码具有SEQ ID NO:146中所示的序列的shmiR(shmiR-CD3-γ_2)的核酸；和
包含编码包含SEQ ID NO:134中所示的效应子序列和SEQ ID NO:135中所示的效应子互补序列的shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，例如，包含SEQ ID NO:171中所示的DNA序列或由其组成并且编码具有SEQ ID NO:153中所示的序列的shmiR(shmiR-CD3-ε_3)的核酸。
在一个实例中，ddRNAi构建体包含选自由以下组成的组的至少两种核酸：
包含编码包含SEQ ID NO:100中所示的效应子序列和SEQ ID NO:101中所示的效应子互补序列的shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，例如，包含SEQ ID NO:154中所示的DNA序列或由其组成并且编码具有SEQ ID NO:136中所示的序列的shmiR(shmiR-TCR-α_1)的核酸；
包含编码包含SEQ ID NO:116中所示的效应子序列和SEQ ID NO:117中所示的效应子互补序列的shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，例如，包含SEQ ID NO:162中所示的DNA序列或由其组成并且编码具有SEQ ID NO:144中所示的序列的shmiR(shmiR-TCR-β_5)的核酸；和
包含编码包含SEQ ID NO:134中所示的效应子序列和SEQ ID NO:135中所示的效应子互补序列的shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，例如，包含SEQ ID NO:171中所示的DNA序列或由其组成并且编码具有SEQ ID NO:153中所示的序列的shmiR(shmiR-CD3-ε_3)的核酸。
在一个实例中，ddRNAi构建体包含：
包含编码包含SEQ ID NO:100中所示的效应子序列和SEQ ID NO:101中所示的效应子互补序列的shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，例如，包含SEQ ID NO:154中所示的DNA序列或由其组成并且编码具有SEQ ID NO:136中所示的序列的shmiR(shmiR-TCR-α_1)的核酸；
包含编码包含SEQ ID NO:116中所示的效应子序列和SEQ ID NO:117中所示的效应子互补序列的shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，例如，包含SEQ ID NO:162中所示的DNA序列或由其组成并且编码具有SEQ ID NO:144中所示的序列的shmiR(shmiR-TCR-β_5)的核酸；和
包含编码包含SEQ ID NO:134中所示的效应子序列和SEQ ID NO:135中所示的效应子互补序列的shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，例如，包含SEQ ID NO:171中所示的DNA序列或由其组成并且编码具有SEQ ID NO:153中所示的序列的shmiR(shmiR-CD3-ε_3)的核酸。
在一个实例中，ddRNAi构建体包含选自由以下组成的组的至少两种核酸：
包含编码包含SEQ ID NO:100中所示的效应子序列和SEQ ID NO:101中所示的效应子互补序列的shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，例如，包含SEQ ID NO:154中所示的DNA序列或由其组成并且编码具有SEQ ID NO:136中所示的序列的shmiR(shmiR-TCR-α_1)的核酸；
包含编码包含SEQ ID NO:120中所示的效应子序列和SEQ ID NO:121中所示的效应子互补序列的shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，例如，包含SEQ ID NO:164中所示的DNA序列或由其组成并且编码具有SEQ ID NO:146中所示的序列的shmiR(shmiR-CD3-γ_2)的核酸；和
包含编码包含SEQ ID NO:134中所示的效应子序列和SEQ ID NO:135中所示的效应子互补序列的shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，例如，包含SEQ ID NO:171中所示的DNA序列或由其组成并且编码具有SEQ ID NO:153中所示的序列的shmiR(shmiR-CD3-ε_3)的核酸。
在一个实例中，ddRNAi构建体包含：
包含编码包含SEQ ID NO:100中所示的效应子序列和SEQ ID NO:101中所示的效应子互补序列的shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，例如，包含SEQ ID NO:154中所示的DNA序列或由其组成并且编码具有SEQ ID NO:136中所示的序列的shmiR(shmiR-TCR-α_1)的核酸；
包含编码包含SEQ ID NO:120中所示的效应子序列和SEQ ID NO:121中所示的效应子互补序列的shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，例如，包含SEQ ID NO:164中所示的DNA序列或由其组成并且编码具有SEQ ID NO:146中所示的序列的shmiR(shmiR-CD3-γ_2)的核酸；和
包含编码包含SEQ ID NO:134中所示的效应子序列和SEQ ID NO:135中所示的效应子互补序列的shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，例如，包含SEQ ID NO:171中所示的DNA序列或由其组成并且编码具有SEQ ID NO:153中所示的序列的shmiR(shmiR-CD3-ε_3)的核酸。
在一个实例中，ddRNAi构建体包含选自由以下组成的组的至少两种核酸：
包含编码包含SEQ ID NO:100中所示的效应子序列和SEQ ID NO:101中所示的效应子互补序列的shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，例如，包含SEQ ID NO:154中所示的DNA序列或由其组成并且编码具有SEQ ID NO:136中所示的序列的shmiR(shmiR-TCR-α_1)的核酸；
包含编码包含SEQ ID NO:126中所示的效应子序列和SEQ ID NO:127中所示的效应子互补序列的shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，例如，包含SEQ ID NO:167中所示的DNA序列或由其组成并且编码具有SEQ ID NO:149中所示的序列的shmiR(shmiR-CD3-δ_3)的核酸；和
包含编码包含SEQ ID NO:134中所示的效应子序列和SEQ ID NO:135中所示的效应子互补序列的shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，例如，包含SEQ ID NO:171中所示的DNA序列或由其组成并且编码具有SEQ ID NO:153中所示的序列的shmiR(shmiR-CD3-ε_3)的核酸。
在一个实例中，ddRNAi构建体包含：
包含编码包含SEQ ID NO:100中所示的效应子序列和SEQ ID NO:101中所示的效应子互补序列的shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，例如，包含SEQ ID NO:154中所示的DNA序列或由其组成并且编码具有SEQ ID NO:136中所示的序列的shmiR(shmiR-TCR-α_1)的核酸；
包含编码包含SEQ ID NO:126中所示的效应子序列和SEQ ID NO:127中所示的效应子互补序列的shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，例如，包含SEQ ID NO:167中所示的DNA序列或由其组成并且编码具有SEQ ID NO:149中所示的序列的shmiR(shmiR-CD3-δ_3)的核酸；和
包含编码包含SEQ ID NO:134中所示的效应子序列和SEQ ID NO:135中所示的效应子互补序列的shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，例如，包含SEQ ID NO:171中所示的DNA序列或由其组成并且编码具有SEQ ID NO:153中所示的序列的shmiR(shmiR-CD3-ε_3)的核酸。
根据如本文所述的ddRNAi构建体的任何实例，ddRNAi构建体可包含两种或更多种编码如本文所述的shmiR的核酸，诸如两种、或三种、或四种或五种编码如本文所述的shmiR的核酸。
在一些实例中，本公开的ddRNAi构建体包含与一种或多种编码本公开的shmiR的核酸连接的转录终止子。与每种编码shmiR的核酸连接的终止子可以相同或不同。例如，在其中使用RNA pol III启动子的本公开的ddRNAi构建体中，终止子可以是4个或更多个，或5个或更多个，或6个或更多个T残基的连续区段。然而，在使用不同启动子的情况下，终止子可以是不同的并且与来自终止子所源自的基因的启动子匹配。此类终止子包括但不限于SV40聚A、AdV VA1基因、5S核糖体RNA基因和人t-RNA的终止子。
可选地或另外，包含在本公开的ddRNAi构建体内的核酸可包含一个或多个限制性位点例如，有利于将一个或多个核酸克隆到克隆性载体或表达载体中。例如，本文所述的核酸可在编码本公开的shmiR的DNA序列的上游和/或下游包含限制性位点。合适的限制性酶识别序列是本领域技术人员已知的。然而，在一个实例中，本公开的一种或多种核酸可在编码shmiR的序列的5’末端(即，上游)包含BamH1限制性位点(GGATCC)以及在编码shmiR的DNA序列的3’末端(即，下游)包含HindIII限制性位点(AAGCTT)。
在一些实例中，本公开的ddRNAi构建体可包含填充片段序列以优化构建体或载体大小。用于构建表达构建体和载体的合适的填充片段序列是本领域已知的并且被考虑用于本文中的用途。在一个实例中，本公开的ddRNAi构建体包括次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)填充片段序列。在描述本公开的ddRNAi构建体的每个前述实例中，其中包含的每个核酸可以与启动子可操作地连接。例如，如本文所述的ddRNAi构建体可包含与其中包含的每个核酸可操作地连接的单一启动子例如，以驱动两种或更多种shmiR从ddRNAi构建体表达。
在另一个实例中，编码ddRNAi构建体中包含的本公开的shmiR的每个核酸与单独的启动子可操作地连接。
根据其中存在多个启动子的实例，启动子可以相同或不同。例如，构建体可包含多个拷贝的相同启动子，其中每个拷贝与本公开的不同核酸可操作地连接。在另一个实例中，与本公开的核酸可操作地连接的每个启动子是不同的。例如，编码shmiR的ddRNAi构建体中的至少两个核酸可各自与不同的启动子可操作地连接。
在一个实例中，启动子是组成型启动子。当提及启动子时，术语“组成型”是指启动子能够在特定刺激(例如，热激、化学物质、光等)不存在的情况下指导可操作地连接的核酸序列的转录。通常，组成型启动子能够在基本上任何细胞和任何组织中指导编码序列表达。用于从本公开的一种或多种核酸转录shmiR的启动子包括由RNA聚合酶II控制的遍在蛋白、CMV、β-肌动蛋白、组蛋白H4、EF-1α或pgk基因的启动子，或由RNA聚合酶I控制的启动子元件。
在一个实例中，使用Pol II启动子诸如CMV、SV40、U1、β-肌动蛋白或杂合Pol II启动子。其它合适的Pol II启动子是本领域已知的，并且可以根据本公开的该实例使用。例如，在表达pri-miRNA的本公开的ddRNAi构建体中可能需要Pol II启动子系统，所述pri-miRNA通过酶Drosha和Pasha的作用被加工成一种或多种shmiR。在本公开的ddRNAi构建体中还可能需要Pol II启动子系统，所述ddRNAi构建体包含在单个启动子控制下的编码多个shmiR的序列。在需要组织特异性的情况下，也可使用Pol II启动子系统。
在另一个实例中，使用由RNA聚合酶III控制的启动子，诸如U6启动子(U6-1、U6-8、U6-9)、H1启动子、7SL启动子、人Y启动子(hY1、hY3、hY4(参见Maraia,等，Nucleic AcidsRes 22(15):3045-52(1994))和hY5(参见Maraia,等，Nucleic Acids Res 24(18):3552-59(1994))、人MRP-7-2启动子、腺病毒VA1启动子、人tRNA启动子或5s核糖体RNA启动子。
用于本公开的ddRNAi构建体的合适启动子描述于美国专利第8,008,468号和美国专利第8,129,510号中。
在一个实例中，启动子是RNA pol III启动子。例如，启动子是U6启动子(例如，U6-1、U6-8或U6-9启动子)。在一个实例中，启动子是H1启动子。
在如本文所述的本公开的ddRNAi构建体的情况下，ddRNAi构建体中的每个核酸可以与U6启动子(例如，单独的U6启动子)可操作地连接。。
在一个实例中，构建体中的启动子是U6启动子。例如，启动子是U6-1启动子。例如，启动子是U6-8启动子。例如，启动子是U6-9启动子。
在一个实例中，构建体包含至少一个U6启动子和至少一个H1启动子，每个启动子与编码本发明的shmiR的单独DNA可操作地连接。例如，U6启动子可以是U6-1启动子。例如，U6启动子可以是U6-8启动子。例如，U6启动子可以是U6-9启动子。
在一些实例中，使用具有可变强度的启动子。例如，两个或多个强启动子(诸如PolIII型启动子)的使用可通过例如，耗竭可用核苷酸或转录所需的其它细胞组分的库加重细胞的负担。另外，或可选择地，几种强启动子的使用可在细胞中导致毒性水平的shmiR表达。因此，在一些实例中，多启动子ddRNAi构建体中的一个或多个启动子比构建体中的其它启动子弱，或者构建体中的所有启动子可以小于最大速率表达shmiR。也可以使用各种分子技术或以其它方式(例如，通过修饰各种调节元件)修饰启动子，以获得较弱的转录水平或较强的转录水平。实现减少转录的一种方法是修饰已知控制启动子活性的启动子内的序列元件。例如，已知近侧序列元件(PSE)影响人U6启动子的活性(参见Domitrovich，等,NucleicAcids Res 31:2344-2352(2003)。用来自弱启动子(诸如人U6-7启动子)的元件替换强启动子(诸如人U6-1、U6-8或U6-9启动子)中存在的PSE元件降低杂交U6-1、U6-8或U6-9启动子的活性。该方法已用于本申请中描述的实例中，但实现该结果的其它方法在本领域中是已知的。
可用于本公开的一些实例的启动子可以是组织特异性的或细胞特异性的。术语“组织特异性”，当其应用于启动子时，是指能够指导目标核酸在特定类型的组织中选择性转录，在不同类型的组织中相对不表达该相同目标核苷酸序列的启动子。术语“细胞特异性”，当其应用于启动子时，是指能够指导目标核酸在特定类型的细胞中选择性转录，在相同组织内的不同类型的细胞中相对不表达该相同目标核苷酸序列的启动子。
在一个实例中，本公开的ddRNAi构建体可另外包含一种或多种增强子，以增加由本文所述核酸编码的shmiR的表达。适用于本公开的实例的增强子包括Apo E HCR增强子、CMV增强子(Xia等，Nucleic Acids Res 31-17(2003))以及本领域技术人员已知的其它增强剂。适用于本公开的ddRNAi构建体的增强子描述于美国专利第8,008,468号中。
在另外的实例中，本公开的ddRNAi构建体可包含与编码本公开的shmiR的核酸连接的转录终止子。ddRNAi构建体中与每个核酸连接的终止子可以相同或不同。例如，在其中使用RNA pol III启动子的本公开的ddRNAi构建体中，终止子可以是4个或更多个，或5个或更多个，或6个或更多个T残基的连续区段。然而，在使用不同启动子的情况下，终止子可以是不同的并且与来自终止子所源自的基因的启动子匹配。此类终止子包括但不限于SV40聚A、AdV VA1基因、5S核糖体RNA基因和人t-RNA的终止子。其它启动子和终止子组合是本领域已知的，并且被考虑用于本公开的ddRNAi构建体中。
另外，可将启动子和终止子混合和匹配，正如通常对RNA pol II启动子和终止子所进行的那样。
在一个实例中，ddRNAi构建体中用于每个核酸的启动子和终止子组合可以不同，以降低组分之间DNA重组事件的可能性。
本公开的一个示例性ddRNAi构建体包含(i)与启动子(例如，U6启动子)和转录终止子序列(例如，TTTTT)可操作地连接的包含编码如本文所述的shmiR-TCR-β_5的DNA序列或由其组成的核酸，(ii)与启动子(例如，U6启动子)和转录终止子序列(例如，TTTTT)可操作地连接的包含编码如本文所述的shmiR-CD3-γ_2的DNA序列或由其组成的核酸，(iii)和与启动子(例如，U6或H1启动子)和转录终止子序列(例如，TTTTT)可操作地连接的包含编码如本文所述的shmiR-CD3-ε_3的DNA序列或由其组成的核酸。U6启动子可选自U6-1启动子、U6-8启动子和U6-9启动子。例如，本公开的示例性ddRNAi构建体包含(i)与U6启动子(例如，U6-9启动子)和转录终止子序列TTTTT可操作地连接的包含SEQ ID NO:162(shmiR-TCR-β_5)中所示的DNA序列或由其组成的核酸，(ii)与U6启动子(例如，U6-1启动子)和转录终止子序列TTTTT可操作地连接的包含SEQ ID NO:164(shmiR-CD3-γ_2)中所示的DNA序列或由其组成的核酸，(iii)与U6启动子(例如，U6-8启动子)和转录终止子序列TTTTT可操作地连接的包含SEQ ID NO:171(shmiR-CD3-ε_3)中所示的DNA序列或由其组成的核酸。例如，编码称为shmiR-TCR-β_5、shmiR-CD3-γ_2和shmiR-CD3-ε_3的shmiR的ddRNAi构建体可包含SEQID NO:175中所示的DNA序列或由其组成。例如，本公开的示例性ddRNAi构建体包含(i)与U6启动子(例如，U6-9启动子)和转录终止子序列TTTTT可操作地连接的包含SEQ ID NO:162(shmiR-TCR-β_5)中所示的DNA序列或由其组成的核酸，(ii)与U6启动子(例如，U6-1启动子)和转录终止子序列TTTTT可操作地连接的包含SEQ ID NO:164(shmiR-CD3-γ_2)中所示的DNA序列或由其组成的核酸，(iii)与H1启动子和转录终止子序列TTTTT可操作地连接的包含SEQ ID NO:171(shmiR-CD3-ε_3)中所示的DNA序列或由其组成的核酸。例如，编码称为shmiR-TCR-β_5、shmiR-CD3-γ_2和shmiR-CD3-ε_3的shmiR的ddRNAi构建体可包含SEQ IDNO:178中所示的DNA序列或由其组成。
本公开的另一个示例性ddRNAi构建体包含(i)与启动子(例如，U6启动子)和转录终止子序列(例如，TTTTT)可操作地连接的包含编码如本文所述的shmiR-TCR-α_1的DNA序列或由其组成的核酸，(ii)与启动子(例如，U6启动子)和转录终止子序列(例如，TTTTT)可操作地连接的包含编码如本文所述的shmiR-TCR-β_5的DNA序列或由其组成的核酸，(iii)和与启动子(例如，U6或H1启动子)和转录终止子序列(例如，TTTTT)可操作地连接的包含编码如本文所述的shmiR-CD3-ε_3的DNA序列或由其组成的核酸。U6启动子可选自U6-1启动子、U6-8启动子和U6-9启动子。例如，本公开的示例性ddRNAi构建体包含(i)与U6启动子(例如，U6-9启动子)和转录终止子序列TTTTT可操作地连接的SEQ ID NO:154(shmiR-TCR-α_1)中所示的DNA序列或由其组成的核酸，(ii)与U6启动子(例如，U6-1启动子)和转录终止子序列TTTTT可操作地连接的包含SEQ ID NO:162(shmiR-TCR-β_5)中所示的DNA序列或由其组成的核酸，(iii)与U6启动子(例如，U6-8启动子)和转录终止子序列TTTTT可操作地连接的包含SEQ ID NO:171(shmiR-CD3-ε_3)中所示的DNA序列或由其组成的核酸。例如，编码称为shmiR-TCR-α_1、shmiR-TCR-β_5和shmiR-CD3-ε_3的shmiR的ddRNAi构建体可包含SEQ IDNO:172中所示的DNA序列或由其组成。本公开的另一个示例性ddRNAi构建体包含(i)与U6启动子(例如，U6-9启动子)和转录终止子序列TTTTT可操作地连接的包含SEQ ID NO:154(shmiR-TCR-α_1)中所示的DNA序列或由其组成的核酸，(ii)与U6启动子(例如，U6-1启动子)和转录终止子序列TTTTT可操作地连接的包含SEQ ID NO:162(shmiR-TCR-β_5)中所示的DNA序列或由其组成的核酸，(iii)与H1启动子和转录终止子序列TTTTT可操作地连接的包含SEQ ID NO:171(shmiR-CD3-ε_3)中所示的DNA序列或由其组成的核酸。例如，编码称为shmiR-TCR-α_1、shmiR-TCR-β_5和shmiR-CD3-ε_3的shmiR的ddRNAi构建体可包含SEQ IDNO:176中所示的DNA序列或由其组成。
本公开的另一个示例性ddRNAi构建体包含(i)与启动子(例如，U6启动子)和转录终止子序列(例如，TTTTT)可操作地连接的包含编码如本文所述的shmiR-TCR-α_1的DNA序列或由其组成的核酸，(ii)与启动子(例如，U6启动子)和转录终止子序列(例如，TTTTT)可操作地连接的包含编码如本文所述的shmiR-CD3-γ_2的DNA序列或由其组成的核酸，(iii)和与启动子(例如，U6或H1启动子)和转录终止子序列(例如，TTTTT)可操作地连接的包含编码如本文所述的shmiR-CD3-ε_3的DNA序列或由其组成的核酸。U6启动子可选自U6-1启动子、U6-8启动子和U6-9启动子。例如，本公开的示例性ddRNAi构建体包含(i)与U6启动子(例如，U6-9启动子)和转录终止子序列TTTTT可操作地连接的包含SEQ ID NO:154(shmiR-TCR-α_1)中所示的DNA序列或由其组成的核酸，(ii)与U6启动子(例如，U6-1启动子)和转录终止子序列TTTTT可操作地连接的包含SEQ ID NO:164(shmiR-CD3-γ_2)中所示的DNA序列或由其组成的核酸，(iii)与U6启动子(例如，U6-8启动子)和转录终止子序列TTTTT可操作地连接的包含SEQ ID NO:171(shmiR-CD3-ε_3)中所示的DNA序列或由其组成的核酸。例如，编码称为shmiR-TCR-α_1、shmiR-CD3-γ_2和shmiR-CD3-ε_3的shmiR的ddRNAi构建体可包含SEQID NO:173中所示的DNA序列或由其组成。本公开的另一个示例性ddRNAi构建体包含(i)与U6启动子(例如，U6-9启动子)和转录终止子序列TTTTT可操作地连接的包含SEQ ID NO:154(shmiR-TCR-α_1)中所示的DNA序列或由其组成的核酸，(ii)与U6启动子(例如，U6-1启动子)和转录终止子序列TTTTT可操作地连接的包含SEQ ID NO:164(shmiR-CD3-γ_2)中所示的DNA序列或由其组成的核酸，(iii)与H1启动子和转录终止子序列TTTTT可操作地连接的包含SEQ ID NO:171(shmiR-CD3-ε_3)中所示的DNA序列或由其组成的核酸。例如，编码称为shmiR-TCR-α_1、shmiR-CD3-γ_2和shmiR-CD3-ε_3的shmiR的ddRNAi构建体可包含SEQ IDNO:177中所示的DNA序列或由其组成。
本公开的另一个示例性ddRNAi构建体包含(i)与启动子(例如，U6启动子)和转录终止子序列(例如，TTTTT)可操作地连接的包含编码如本文所述的shmiR-TCR-α_1的DNA序列或由其组成的核酸，(ii)与启动子(例如，U6启动子)和转录终止子序列(例如，TTTTT)可操作地连接的包含编码如本文所述的shmiR-CD3-δ_3的DNA序列或由其组成的核酸，(iii)和与启动子(例如，U6启动子)和转录终止子序列(例如，TTTTT)可操作地连接的包含编码如本文所述的shmiR-CD3-ε_3的DNA序列或由其组成的核酸。U6启动子可选自U6-1启动子、U6-8启动子和U6-9启动子。例如，本公开的示例性ddRNAi构建体包含(i)与U6启动子(例如，U6-9启动子)和转录终止子序列TTTTT可操作地连接的包含SEQ ID NO:154(shmiR-TCR-α_1)中所示的DNA序列或由其组成的核酸，(ii)与U6启动子(例如，U6-1启动子)和转录终止子序列TTTTT可操作地连接的包含SEQ ID NO:167(shmiR-CD3-δ_3)中所示的DNA序列或由其组成的核酸，(iii)与U6启动子(例如，U6-8启动子)和转录终止子序列TTTTT可操作地连接的包含SEQ ID NO:171(shmiR-CD3-ε_3)中所示的DNA序列或由其组成的核酸。例如，编码称为shmiR-TCR-α_1、shmiR-CD3-δ_3和shmiR-CD3-ε_3的shmiR的ddRNAi构建体可包含SEQ IDNO:174中所示的DNA序列或由其组成。
另外，ddRNAi构建体可包含策略性定位的一个或多个克隆位点和/或独特的限制性位点，使得可以容易地除去或替换启动子、编码shmiR的核酸和/或其它调节元件。ddRNAi构建体可使用策略性定位的限制性位点和/或互补粘性末端从较小的寡核苷酸组分组装而来。用于根据本公开的一种方法的基础载体包含具有多接头的质粒，其中所有位点均是独特的(尽管这不是绝对要求)。顺序地，将每个启动子插入其指定的独特位点之间，产生具有一个或多个启动子的基础盒，所有这些启动子都可以具有可变的取向。顺序地，再次将退火的引物对插入每个单独的启动子下游的独特位点，产生单表达盒构建体、双表达盒构建体或多表达盒构建体。可使用位于双表达盒插入物、三表达盒插入物或多表达盒插入物两侧的两个独特的限制性酶位点(相同或不同的位点)将插入物移入合适的载体骨架中。
ddRNAi构建体的产生可以使用本领域已知的任何合适的基因工程技术完成，包括但不限于PCR、寡核苷酸合成、限制性内切核酸酶消化、连接、转化、质粒纯化和DNA测序的标准技术。如果构建体是病毒构建体，则构建体包含例如将ddRNAi构建体包装至病毒颗粒中所必需的序列和/或允许ddRNAi构建体整合到靶细胞基因组中的序列。在一些实例中，病毒构建体另外包含允许病毒复制和繁殖的基因，然而将以反式方式提供此类基因。另外，病毒构建体可含有以天然形式整合的或经修饰的来自任何已知生物体的基因组的基因或遗传序列。例如，病毒构建体可包含用于在细菌中复制构建体的序列。
ddRNAi构建体还可含有另外的遗传元件。可包括在构建体中的元件的类型不受任何方式限制，并且可由本领域技术人员选择。例如，另外的遗传元件可以包括报告基因，诸如用于荧光标记蛋白诸如GFP或RFP的一个或多个基因；易于测定的酶诸如β-半乳糖苷酶、萤光素酶、β-葡糖苷酸酶、氯霉素乙酰转移酶或分泌的胚胎碱性磷酸酶；或对于其可容易用于免疫测定的蛋白质诸如激素或细胞因子。
可用于本公开的实施方案的其它遗传元件包括编码给细胞赋予选择性生长有利方面(诸如腺苷脱氨酶、氨基糖苷磷酸转移酶、二氢叶酸还原酶、潮霉素-B-磷酸转移酶)或药物抗性的蛋白质的那些遗传元件，或编码提供从营养缺陷型缺失的生物合成能力的蛋白质的那些基因。如果与构建体一起包括报告基因，则可以包括内部核糖体进入位点(IRES)序列。在一个实例中，另外的遗传元件与独立的启动子/增强子可操作地连接并受其控制。另外，可使用用于在细菌中繁殖构建体的合适的复制起点。复制起点的序列通常与ddRNAi构建体和其它遗传序列分开。此类复制起点是本领域已知的，包括pUC、ColE1、2微米或SV40复制起点。
嵌合抗原受体(CAR)
本公开还提供了嵌合抗原受体(CAR)构建体，其包含具有编码CAR的DNA序列的核酸。
在一个实例中，在具有本公开的ddRNAi构建体的重组DNA构建体中提供CAR构建体。因此，本公开提供了DNA构建体，其包含：
(a)如本文所述的ddRNAi构建体；和
(b)包含具有编码CAR的DNA序列的核酸的CAR构建体。
在一个实例中，CAR包含抗原结合结构域例如，结合蛋白。
例如，CAR可以是抗体或其抗原结合结构域。
在一个实例中，抗原结合结构域与肿瘤抗原(例如，如本文中描述的)特异性结合。在另一个实例中，抗原结合结构域与存在于感染细胞表面上的病毒抗原或病毒诱导的抗原(例如，诸如来自本文所述的病毒的抗原)特异性结合。
在一个实例中，编码CAR的DNA序列与包含在CAR构建体内并位于编码CAR的DNA序列的上游的启动子可操作地连接。启动子可以是本领域已知的用于指导CAR表达的任何合适的启动子例如，EF1p启动子元件。
根据其中在具有本公开的ddRNAi构建体的重组DNA构建体中提供CAR构建体的实例，DNA构建体可以以5'至3'方向包含ddRNAi构建体和CAR构建体。
根据其中在具有本公开的ddRNAi构建体的重组DNA构建体中提供CAR构建体的另一个实例，DNA构建体可以以5'至3'方向包含CAR构建体和ddRNAi构建体。
如本文中所述，本公开提供了包含具有编码CAR的DNA序列的核酸的CAR构建体，或包含其的重组DNA构建体，其中所述CAR包含抗原结合结构域。抗原结合结构域是例如结合蛋白(例如，抗体或抗体片段、TCR或TCR片段)，所述结合蛋白与肿瘤抗原，例如，本文所述的肿瘤抗原特异性结合，其中所述抗原结合结构域的序列与编码细胞内信号传导结构域的核酸序列邻接并处于同一阅读框架内。细胞内信号传导结构域可包含共刺激信号传导结构域和/或初级信号传导结构域，例如，ζ链。共刺激信号传导结构域是指CAR的一部分，其包含共刺激分子的细胞内结构域的至少一部分。
在某些实例中，本公开的CAR构建体包含编码scFv的序列，其中scFv之前可以是任选的前导序列，然后是任选的铰链序列、跨膜区和/或细胞内信号传导结构域，例如，共刺激信号结构域。结构域可以是连续的并且处于同一阅读框架中以形成单个融合蛋白。
在一个实例中，本公开的CAR构建体包含编码任选的前导序列、细胞外抗原结合结构域(例如，scFv)、铰链、跨膜结构域和细胞内刺激结构域的序列。
在一个实例中，本公开的CAR构建体包含任选的前导序列、细胞外抗原结合结构域、铰链、跨膜结构域、细胞内共刺激信号传导结构域(例如，共刺激信号传导结构域)和/或细胞内初级信号传导结构域。
在一个实例中，本公开的DNA构建体包含：
(a)如本文所述的ddRNAi构建体，其包含(i)与U6启动子(例如，U6-9启动子)和转录终止子序列TTTTT可操作地连接的包含SEQ ID NO:162(shmiR-TCR-β_5)中所示的DNA序列或由其组成的核酸，(ii)与U6启动子(例如，U6-1启动子)和转录终止子序列TTTTT可操作地连接的包含SEQ ID NO:164(shmiR-CD3-γ_2)中所示的DNA序列或由其组成的核酸，(iii)与H1启动子和转录终止子序列TTTTT可操作地连接的包含SEQ ID NO:171(shmiR-CD3-ε_3)中所示的DNA序列或由其组成的核酸。
(b)包含具有编码CAR例如抗CD19CAR的DNA序列的核酸的CAR构建体。
例如，本公开的ddRNAi构建体可包含：
(a)5'慢病毒末端重复(LTR)序列；
(b)ddRNAi构建体包含(i)与U6启动子(例如，U6-9启动子)和转录终止子序列TTTTT可操作地连接的包含SEQ ID NO:162(shmiR-TCR-β_5)中所示的DNA序列或由其组成的核酸，(ii)填充片段序列例如，HPRT来源的填充片段序列，(iii)与U6启动子(例如，U6-1启动子)和转录终止子序列TTTTT可操作地连接的包含SEQ ID NO:164(shmiR-CD3-γ_2)中所示的DNA序列或由其组成的核酸，(iv)填充片段序列例如，HPRT来源的填充片段序列，和(v)与H1启动子和转录终止子序列TTTTT可操作地连接的包含SEQ ID NO:171(shmiR-CD3-ε_3)中所示的DNA序列或由其组成的核酸；和
(c)包含具有编码CAR例如抗CD19CAR的DNA序列的核酸的CAR构建体；和
(d)3’LTR序列。
本公开的一个示例性DNA构建体可包含SEQ ID NO:179所示的DNA序列或由其组成。
本文描述了可包括在本公开的DNA构建体中的另外的CAR构建体及其组分。
抗原结合结构域
如本文所述的CAR将包括细胞外区域中的抗原结合结构域。
在一个实例中，抗原结合结构域是鼠抗体或包含抗原结合结构域的抗体片段。在一个实例中，抗原结合结构域是人源化抗体或包含抗原结合结构域的抗体片段。在一个实例中，抗原结合结构域是人抗体或包含抗原结合结构域的抗体片段。
抗原结合结构域的选择可取决于限定靶细胞表面的配体或受体的类型和数量。例如，可以选择抗原结合结构域以识别作为与特定疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标志物的抗原。可作为配体或受体的细胞表面标志物的实例包括与特定疾病状态相关的细胞表面标志物，例如，病毒性疾病、细菌性疾病、寄生虫感染、自身免疫性疾病和与不想要的细胞增殖相关的疾病(例如，癌症，例如，本文所述的癌症)的细胞表面标志物。
在某些实例中，抗原结合结构域识别以下增殖性病症的抗原：例如，癌症，包括但不限于原发性或转移性黑色素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌(例如，NSCLC或SCLC)、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、子宫癌、宫颈癌、肾癌、甲状腺癌、膀胱癌、肾癌和腺癌诸如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、结肠癌等。在一些实施方案中，癌症是B细胞急性淋巴性白血病(“BALL”)、T细胞急性淋巴性白血病(“TALL”)、急性淋巴性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)；另外的血液癌症或血液病，包括但不限于B细胞前淋巴细胞白血病、成浆细胞样树突状细胞肿瘤(blasticplasmacytoid dendritic cell neoplasm)、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、多毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生病、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良和脊髓发育不良综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞肿瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症。
在一个实例中，抗原结合结构域与肿瘤抗原特异性结合，所述肿瘤抗原包含一种或多种被源自哺乳动物癌症肿瘤的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)免疫识别的抗原性癌症表位。
肿瘤抗原可以是由引起免疫应答(，特别是T细胞介导的免疫应答)的肿瘤细胞产生的蛋白质。本公开的抗原结合结构域的选择将取决于待治疗的癌症的特定类型。肿瘤抗原是本领域公知的，包括例如神经胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、EGFRvIII、IL-l lRa、IL-13Ra、EGFR、FAP、B7H3、Kit、CA-IX、CS-1、MUC1、BCMA、bcr-abl、HER2、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、ALK、CD19、CD123、细胞周期蛋白B1、凝集素反应性AFP、Fos相关抗原1、ADRB3、甲状腺球蛋白、EphA2、RAGE-1、RUl、RU2、SSX2、AKAP-4、LCK、OY-TESl、PAX5、SART3、CLL-1、岩藻糖基GM1、GloboH、MN-CA IX、EPCAM、EVT6-AML、TGS5、人端粒酶逆转录酶、聚唾液酸(plysialic acid)、PLAC1、RU1、RU2(AS)、肠道羧基酯酶、lewisY、sLe、LY6K、mut hsp70-2、M-CSF、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、前列腺素酶(prostase)、前列腺特异性抗原(PSA)、PAX3、PAP、NY-ESO-1、LAGE-la、LMP2、NCAM、p53、p53突变体、Ras突变体、gplOO、prostein、OR51E2、PANX3、PSMA、PSCA、Her2/neu、hTERT、HMWMAA、HAVCR1、VEGFR2、PDGFR-β、存活素和端粒酶、豆荚蛋白、HPV E6、E7、精子蛋白17、SSEA-4、酪氨酸酶、TARP、WT1、前列腺癌瘤肿瘤抗原-1(PCTA-1)、ML-IAP、MAGE、MAGE-A 1、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Melan A/MART 1、XAGE1、ELF2M、ERG(TMPRSS2ETS融合基因)、NA17、中性粒细胞弹性蛋白酶、肉瘤易位断点、NY-BR-1、ephrinB2、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD97、CD171、CD179a、雄激素受体、FAP、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体、GD2、邻-乙酰基-GD2、GD3、GM3、GPRC5D、GPR20、CXORF61、叶酸受体(FRa)、叶酸受体β、ROR1、Flt3、TAG72、TN Ag、Tie 2、TEM1、TEM7R、CLDN6、TSHR、UPK2和间皮素。在一个实例中，肿瘤抗原选自由以下组成的组：叶酸受体(FRα)、间皮素、EGFRvIII、IL-13Ra、CD123、CD19、CD33、BCMA、GD2、CLL-1、CA-IX、MUC1、HER2及其任何组合。在一个实例中，肿瘤抗原是CD19。
在一个实例中，肿瘤抗原包含一种或多种与恶性肿瘤相关的抗原性癌症表位。恶性肿瘤表达许多可作为免疫攻击的靶抗原的蛋白质。这些分子包括但不限于组织特异性抗原诸如黑素瘤中的MART-1、酪氨酸酶和GP 100和前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺特异性抗原(PSA)。其它靶抗原包括转化相关分子，诸如致癌基因HER-2/Neu/ErbB-2。另一组靶抗原是癌胚抗原(onco-fetal antigen)诸如癌胚抗原(CEA)。在B细胞淋巴瘤中，肿瘤特异性独特型免疫球蛋白构成真正的肿瘤特异性免疫球蛋白抗原，其对于个体肿瘤是独特的。B细胞分化抗原诸如CD 19、CD20和CD37是B细胞淋巴瘤中靶抗原的其它候选者。
在一些实例中，肿瘤抗原是WO2015/120096、WO2015/142675、WO2016/019300、WO2016/011210、WO2016/109410和WO2016/069283(其内容通过引用整体并入)中描述的肿瘤抗原。
取决于待靶向的所需抗原，可将编码CAR的序列工程化以包括对所需抗原靶标有特异性的适当抗原结合结构域。
如本文所述的CAR构建体可包含编码与MHC呈递肽结合的抗原结合结构域(例如，抗体或抗体片段)的DNA序列。通常，源自内源蛋白质的肽填充主要组织相容性复合物(MHC)I类分子的口袋，并且被CD8+T淋巴细胞上的T细胞受体(TCR)识别。MHC I类复合物由所有有核细胞组成型表达。在癌症中，病毒特异性和/或肿瘤特异性肽/MHC复合物代表用于免疫疗法的独特类别的细胞表面靶标。已经描述了靶向人白细胞抗原(HLA)-Al或HLA-A2的背景下的源自病毒或肿瘤抗原的肽的TCR样抗体(参见，例如，Sastry等，J Virol.2011 85(5):1935-1942；Sergeeva等，Bood,2011,117(16):4262-4272；Verma等，J Immunol 2010 184(4):2156-2165；Willemsen等 ，Gene Ther 2001 8(21):1601-1608；Dao等，Sci TranslMed 2013 5(176):176ra33；Tassev等，Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100)。例如，可以从筛选文库诸如人scFv噬菌体展示文库来鉴定TCR样抗体。因此，本文描述的CAR可包含与分子的MHC呈递的肽结合的抗原结合结构域，所述分子选自在细胞内表达的上述任何肿瘤抗原，例如，p53、BCR-Abl、Ras、K-ras和c-met。
在一个实例中，CAR构建体或包含其的重组DNA构建体可包括具有DNA序列的另外的核酸，所述DNA序列编码第二CAR，例如，包括例如，针对同一靶标(如本文所述的癌症相关抗原)或不同靶标(例如，CD19、CD123、CD22、CD30、CD34、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-l lRa、PSCA、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、前列腺素酶、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、邻-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、TSHR、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-la、豆荚蛋白、HPV E6,E7、MAGE-A1、MAGE Al、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、prostein、存活蛋素和端粒酶、PCTA-l/Galectin 8、MelanA/MARTl、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5或IGLL1)的不同抗原结合结构域的第二CAR。根据其中DNA构建体包含编码两种或更多种不同CAR的核酸的实例，不同CAR的抗原结合结构域可以使得抗原结合结构域不相互作用。例如，第一CAR的抗原结合域，例如，作为片段(例如，scFv)，不会与第二CAR的抗原结合域形成关联。在一个实例中，第一CAR或第二CAR的抗原结合结构域是VHH。
由CAR构建体或包含其的DNA构建体编码的CAR的抗原结合结构域可源自抗体分子，例如，单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、单结构域抗体(例如，源自例如人的重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)和可变域(VHH))中的一种或多种。在一些实例中，源自CAR最终将在其中使用(例如，用于在人中使用)的相同物种的抗原结合结构域是有益的，本文所述的CAR的抗原结合结构域包含人或人源化抗原结合结构域是有益的。
在一些实例中，抗原结合结构域包含足以赋予对靶抗原的识别和特异性结合的抗体片段。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2或Fv片段、scFv抗体片段、线性抗体、单结构域抗体诸如sdAb(VL或VL)、骆驼科动物VHH结构域和由抗体片段形成的多特异性抗体。
在一个实例中，抗原结合结构域是可包含融合蛋白的“scFv”，所述融合蛋白包含抗体的VL链和VH链，其中VH和VL例如通过短柔性多肽接头连接(例如，本文所述的接头)连接。scFv能够表达为单链多肽并保留其所源自的完整抗体的特异性。此外，VL和VH可变链可以例如，相对于多肽的N末端和C末端按任何顺序连接，scFv可包含VL-接头-VH或可包含VH-接头-VL。
在一些实例中，scFv分子包含具有优化的长度和/或氨基酸组成的柔性多肽接头。柔性多肽接头长度可以极大地影响scFv的可变区折叠和相互作用的方式。事实上，如果使用短多肽接头(例如，在5个与10个氨基酸之间)，可以防止链内折叠。关于接头取向和大小的实例，参见，例如，Hollinger等，1993Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.90:6444-6448，美国专利申请公开第2005/0100543号、第2005/0175606号、第2007/0014794号和PCT公开第WO2006/020258号和第WO2007/024715号，所述文献或专利申请公开号通过引用并入本文。
在一些实例中，抗原结合结构域是单结构域抗原结合(sdAb)分子。sdAb分子包括其互补决定区是单结构域多肽的一部分的分子。实例包括但不限于重链可变结构域、天然缺乏轻链的结合分子、源自常规4-链抗体的单结构域、工程化结构域和除源自抗体的那些外的单结构域支架(例如，在下文中更详细描述的)。SDAB分子可以是本领域中的任何分子，或任何将来的单结构域分子。SDAB分子可源自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、羊驼、鱼、鲨鱼、山羊、兔和牛。
在某些实例中，SDAB分子是结合一种或多种靶抗原的单链融合多肽，其包含一个或多个单结构域分子(例如，纳米抗体)，缺乏互补可变结构域或免疫球蛋白恒定区(例如，Fc区)。
SDAB分子可以是重组的、CDR移植的、人源化的、骆驼化的、去免疫的和/或体外产生的(例如，通过噬菌体展示选择的)。
在一个实例中，抗原结合结构域部分包含人抗体或其片段。
在一些实例中，非人抗体是人源化的，其中抗体的特定序列或区域被修饰以增加与人中天然产生的抗体的相似性。在实施方案中，抗原结合结构域是人源化的。
在另一个实例中，CAR的抗原结合结构域是T细胞受体(“TCR”)或其片段，例如单链TCR(scTCR)。制备此类TCR的方法是本领域已知的。参见，例如，Willemsen RA等，GeneTherapy 7:1369-1377(2000)；Zhang T等，Cancer Gene Ther 11:487-496(2004)；Aggen等，Gene Ther.19(4):365-74(2012)(参考文献通过引用整体并入本文)。例如，可对包含通过接头(例如，柔性肽)连接的来自T细胞克隆的Vα和νβ基因的scTCR进行工程化。该方法对于癌症相关靶标是非常有用的，所述癌症相关靶标本身是细胞内的，然而，此类抗原(肽)的片段通过MHC呈递在癌细胞的表面上。
在另一个实例中，本公开的CAR构建体包含编码抗原结合结构域的DNA序列，所述抗原结合结构域与存在于感染细胞表面上的病毒抗原或病毒诱导的抗原特异性结合。在一个实例中，病毒抗原或病毒诱导的抗原可来自选自由以下组成的组的病毒：人巨细胞病毒(HCMV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、腺病毒(AdV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、流感病毒和BK病毒(BKV)、约翰-坎宁安(JC)病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒、鼻病毒、人偏肺病毒、单纯疱疹病毒(HSV)1、HSV II、人疱疹病毒(HHV)6、HHV8、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、戊型肝炎病毒、轮状病毒、乳头瘤病毒、细小病毒属埃博拉病毒、寨卡病毒、汉坦病毒和水疱性口炎病毒(VSV)。
双特异性CAR
在一些实例中，CAR构建体或包含其的重组DNA构建体包含编码双特异性CAR的DNA序列。
在一个实例中，双特异性CAR是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不超过两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。在一个实例中，第一表位和第二表位在同一抗原，例如，同一蛋白质(或多聚体蛋白质的亚基)上。在一个实例中，第一表位与第二表位重叠。在一个实例中，第一表位与第二表位不重叠。在一个实例中，第一表位和第二表位在不同抗原，例如，不同蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基)上。在一个实例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列以及对第二表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在一个实例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体和对第二表位具有结合特异性的半抗体。在一个实例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体或其片段以及对第二表位具有结合特异性的半抗体或其片段。在一个实例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的scFv或其片段以及对第二表位具有结合特异性的scFv或其片段。
在一个实例中，双特异性CAR是多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体分子。
在双特异性抗体分子的每个抗体或抗体片段内(例如，scFv)内，VH可以在VL的上游或下游。在一个实例中，以其VH(VHl)位于VL(VLl)的上游来排列上游抗体或抗体片段(例如，scFv)并且以其VL(VL2)位于其VH(VH2)的上游来排列下游抗体或抗体片段(例如，scFv)，使得整个双特异性抗体分子具有VH1-VL1-VL2-VH2的排列。在一个实例中，以其VL(VLl)位于其VH(VHl)的上游来排列上游抗体或抗体片段(例如，scFv)并且以其VH(VH2)位于其VL(VL2)的上游来排列下游抗体或抗体片段(例如，scFv)，使得整个双特异性抗体分子具有VL1-VH1-VH2-VL2的排列。任选地，如果构建体被排列为VH1-VL1-VL2-VH2，则将接头置于两个抗体或抗体片段(例如，scFv)之间，例如，VL1与VL2之间，或者如果构建体被排列为VL1-VH1-VH2-VL2，则将接头置于VH1与VH2之间。通常，两个scFv之间的接头应足够长以避免两个scFv的结构域之间的错误配对。
任选地，将接头置于第一scFv的VL与VH之间。任选地，将接头置于第二scFv的VL与VH之间。在具有多个接头的构建体中，任何两个或更多个接头可以相同或不同。因此，在一些实施方案中，双特异性CAR以如本文所述的排列包含VL、VH和任选的一个或多个接头。
在一个实例中，双特异性抗体分子的特征在于第一免疫球蛋白可变域序列(例如，scFv)，其对第一种癌症相关抗原具有结合特异性，例如，包含如本文所述的scFv，或包含来自本文所述的scFv的轻链CDR和/或重链CDR，以及对不同抗原上的第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变域序列。
嵌合TCR
在一些实例中，CAR构建体或包含其的重组DNA构建体包含编码嵌合TCR的DNA序列。例如，CAR的抗原结合结构域可以与T细胞受体(“TCR”)链(例如TCRα链或TCRβ链)的一个或多个恒定结构域连接，以产生与癌症相关抗原特异性结合的嵌合TCR。不受理论束缚，据信嵌合TCR在抗原结合时将通过TCR复合物发出信号。例如，可将如本文所公开的scFv移植到TCR链(例如，TCRα链和/或TCRβ链)的恒定结构域(例如，细胞外恒定结构域的至少一部分)、跨膜结构域和细胞质结构域。作为另一个实例，可将抗体片段(例如本文所述的VL结构域)移植到TCRα链的恒定结构域，并且可将抗体片段(例如本文所述的VH结构域)移植到TCRβ链的恒定结构域(或者可选地，可将VL结构域可以移植到TCRβ链的恒定结构域并且可将将VH结构域移植到TCRα链)。作为另一个实例，可以将抗体或抗体片段的CDR移植到TCRα和/或β链中以产生与癌症相关抗原特异性结合的嵌合TCR。例如，可将本文公开的LC CDR移植到TCRα链的可变结构域中，并且可将本文公开的HC CDR移植到TCRβ链的可变结构域，反之亦然。
非抗体支架
在一些实例中，CAR构建体或包含其的重组DNA构建体包含编码CAR的DNA序列，所述CAR包含具有非抗体支架(例如，纤连蛋白、锚蛋白、结构域抗体、脂质运载蛋白、小型模块化免疫药物、maxybody、蛋白A或affilin)的抗原结合结构域。非抗体支架具有与细胞上的靶抗原结合的能力。在一个实例中，抗原结合结构域是在细胞上表达的天然存在的蛋白质的多肽或其片段。在一个实例中，抗原结合结构域包含非抗体支架。可以使用多种非抗体支架，只要所得多肽包括至少一个与靶细胞上的靶抗原特异性结合的结合区即可。
非抗体支架包括：纤连蛋白(Novartis,MA)、锚蛋白(Molecular Partners AG,Zurich,Switzerland)、结构域抗体(Domantis,Ltd.,Cambridge,MA和Ablynx nv,Zwijnaarde,Belgium)、脂质运载蛋白(Pieris Proteolab AG,Freising,Germany)、小型模块化免疫药物(Trubion Pharmaceuticals Inc.,Seattle,WA)、maxybodies(Avidia,Inc.,Mountain View,CA)、蛋白A(Affibody AG,Sweden)和affilin(γ-晶体蛋白或遍在蛋白)(Scil Proteins GmbH,Halle,Germany)。
纤连蛋白支架可以基于纤连蛋白III型结构域(例如，纤连蛋白III型的第10个模块(10Fn3结构域))。纤连蛋白III型结构域具有7个或8个β链，其分布在两个β折叠之间，其自身彼此堆叠以形成蛋白质的核心，并且还包含将β链彼此连接并暴露于溶剂的环(类似于CDR)。在β折叠夹层的每个边缘处存在至少三个此类环，其中边缘是垂直于β链方向的蛋白质的边界(参见US 6,818,418)。由于这种结构，该非抗体支架模拟抗原结合特性，其性质和亲和力与抗体的性质和亲和力相似。
锚蛋白技术基于使用具有锚蛋白来源的重复模块的蛋白质作为用于承载可变区的支架，所述可变区可用于与不同的靶标结合。锚蛋白重复模块是由两个反向平行α-螺旋和β-转角组成的33个氨基酸的多肽。可变区的结合主要通过使用核糖体展示来优化。
Avimer源自含有天然A结构域的蛋白质，诸如HER3。这些结构域本质上用于蛋白质间相互作用，并且在人中超过250种蛋白质在结构上基于A结构域。Avimer由通过氨基酸接头连接的许多不同的“A-结构域”单体(2-10个)组成。可使用例如美国专利申请公开第20040175756号、第20050053973号、第20050048512号和第20060008844号中描述的方法产生可与靶抗原结合的Avimer。
亲合体(Affibody)亲和配体是由基于蛋白A的IgG结合结构域之一的支架的三螺旋束组成的小而简单的蛋白质。蛋白A是来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的表面蛋白质。该支架结构域由58个氨基酸组成，其中13个被随机化以产生具有大量配体变体的亲合体文库(参见例如，US 5,831,012)。亲合体分子模拟抗体，它们的分子量为6kDa，相比之下抗体的分子量为150kDa。尽管其尺寸小，但亲合体分子的结合位点与抗体的结合位点相似。
蛋白质表位模拟物(PEM)是中等大小的环状肽样分子(MW 1-2kDa)，其模拟蛋白质的β-发夹二级结构(参与蛋白质间相互作用中的主要二级结构)。抗原结合域(例如，包含scFv、单结构域抗体或骆驼科动物抗体的那些)可以针对本文所述的任何靶受体/配体。
在一个实例中，抗原结合结构域包含结合靶细胞表面上的反配体的分子的细胞外结构域或其反配体结合片段。
抗原结合结构域可包含抑制性受体的细胞外结构域。与共抑制分子的反配体的接合被重定向到免疫效应反应的优化。
抗原结合结构域可包含共刺激分子的细胞外结构域(称为共刺激ECD结构域)。与共刺激分子的反配体的接合导致免疫效应反应的优化。
跨膜结构域
在一些实例中，CAR构建体或包含其的重组DNA构建体包含编码CAR的DNA序列，所述CAR包含与细胞外序列(例如，细胞外识别元件)融合的跨膜结构域，所述细胞外序列可包含抗原结合结构域、抑制性反配体结合结构域或共刺激ECD结构域。在一个实例中，跨膜结构域是与CAR中的结构域之一天然相关的跨膜结构域。在一个实例中，跨膜结构域是与CAR中的结构域之一非天然相关的跨膜结构域。
跨膜结构域可包括与跨膜区相邻的一个或多个另外的氨基酸，例如，与所述跨膜蛋白所源自的蛋白质的细胞外区域相关的一个或多个氨基酸(例如，细胞外区域的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个至最多15个氨基酸)和/或与所述跨膜蛋白所源自的蛋白质的细胞内区域相关的一个或多个另外的氨基酸(例如，细胞内区域的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个至最多15个氨基酸)。在一个实例中，跨膜结构域是与CAR的另外的结构域之一相关的结构域例如，跨膜结构域可来自信号传导结构域、共刺激结构域或铰链结构域所源自的同一蛋白质。在另一个实例中，跨膜结构域不源自CAR的任何其它结构域所源自的同一蛋白质。
在一个实例中，跨膜结构域是最小化与其它元件(例如，其它跨膜结构域)的相互作用的跨膜结构域。在一些情况下，跨膜结构域使此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域的结合最小化，例如，以最小化与受体复合体的其它成员的相互作用。合适的实例可通过选择或修饰已知跨膜结构域的氨基酸取代来获得。在一个实例中，跨膜结构域能够促进与细胞表面上的另一个CAR的同源二聚化。在另一个实例中，跨膜结构域的氨基酸序列可以被修饰或取代，以便最小化与存在于同一表达CAR的细胞中的天然结合配偶体的结合结构域的相互作用。
跨膜结构域可包含天然存在的或非天然存在的合成序列。在天然存在的情况下，跨膜结构域可源自任何膜结合的蛋白或跨膜蛋白。
由本公开的重组DNA构建体编码的CAR可包含源自例如以下的任一种或多种的跨膜区：T细胞受体的α链、β链或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154。在一些实施方案中，跨膜结构域可至少包括以下的一个或多个跨膜区域：例如，KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD1la、CD18)、ICOS(CD278)、4-lBB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2Rβ，IL2Rγ，IL7R a、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDl ld、ITGAE、CD103、ITGAL、CDl la、LFA-1、ITGAM、CDl lb、ITGAX、CDl lc、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMFl、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D和NKG2C。
在一个实例中，可将序列，例如，铰链或间隔子序列置于跨膜结构域和与其融合的另一序列或结构域之间。在一些实例中，也可采用各种人铰链(也称为“间隔子”)，例如，包括但不限于人Ig(免疫球蛋白)铰链。在一个实例中，铰链可以是人Ig(免疫球蛋白)铰链(例如，IgG4铰链和IgD铰链)、GS接头(例如，本文所述的GS接头)、KIR2DS2铰链或CD8a铰链。任选地，长度为2至10个氨基酸的短寡肽或多肽接头可在CAR的跨膜结构域与另一个结构域(例如，细胞内信号传导结构域或共刺激结构域)之间形成键联。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别合适的接头。
在一个实例中，跨膜结构域可以是非天然存在的序列，在该情况下可以主要包含疏水残基诸如亮氨酸和缬氨酸。在一个实施方案中，将在跨膜结构域的每个末端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。
任选地，长度为2至10个氨基酸的短寡肽或多肽接头可在CAR的跨膜结构域与细胞质结构域之间形成键联。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别合适的接头。
细胞内信号传导结构域
在一些实例中，CAR构建体或包含其的重组DNA构建体包含编码包含细胞内信号传导结构域的嵌合CAR的DNA序列。细胞内信号传导结构域在细胞外结构域(例如，与其融合的抗原结合结构域)结合反配体时产生细胞内信号。细胞内信号传导结构域可包括初级细胞内信号传导结构域和共刺激信号传导结构域。在一个实例中，可构建CAR分子以用于在免疫细胞(例如，T细胞)中表达，使得CAR分子包含源自通常与所述免疫细胞相关的多肽的结构域，例如，初级细胞内信号传导结构域、共刺激信号传导结构域、抑制结构域等。仅举例来说，用于在T细胞中表达的CAR可包含41BB结构域和CD3ζ结构域。根据该实例，41BB和CD3ζ结构域均源自与T细胞相关的多肽。在另一个实例中，用于在T细胞中表达的CAR可包含CD28结构域和CD3ζ结构域。在另一个实例中，用于在T细胞中表达的CAR可包含ICOS结构域和CD3ζ结构域。在另一个实例中，用于在T细胞中表达的CAR可包含CD27结构域和CD3ζ结构域。在另一个实例中，可构建CAR分子以用于在免疫细胞(例如，T细胞)中表达，使得CAR分子包含源自通常与所述免疫细胞无关的多肽的结构域。
初级细胞内信号传导结构域
在一些实例中，CAR构建体或包含其的重组DNA构建体包含编码包含初级细胞内信号传导结构域的CAR的DNA序列。初级细胞内信号传导结构域在细胞外结构域(例如，与其融合的抗原结合结构域)结合同源抗原时产生细胞内信号。初级细胞内信号传导结构域源自初级刺激分子，例如，其包含初级刺激分子的细胞内序列。初级细胞内信号传导结构域包含足够的初级刺激分子序列，以例如在与其融合的抗原结合结构域结合同源抗原时产生细胞内信号。
初级刺激分子是在结合同源配体时例如在表达其的细胞中介导免疫效应反应的分子。通常，其产生细胞内信号，所述信号依赖于与包含抗原的同源配体的结合。TCR/CD3复合物是示例性初级刺激分子；其在与同源配体(例如，负载肽的MHC分子)结合时产生细胞内信号。通常地，例如，在TCR/CD3初级刺激分子的情况下，通过初级细胞内信号传导结构域产生细胞内信号依赖于初级刺激分子与抗原的结合。
初级刺激可介导某些分子的改变的表达，诸如TGF-β的下调和/或细胞骨架结构的重组织等。
刺激可以例如在共刺激的情况下导致CART细胞的免疫效应功能的优化(例如，增强)。刺激，例如，在CART细胞的背景下，可以介导T细胞反应，例如，增殖、活化、分化等。
在一个实例中，初级细胞内信号传导结构域包含信号传导基序，例如，基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM。初级细胞内信号传导结构域可包含含有来自(例如)TCRζ(CD3ζ)、常见FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa，FcRβ(FcεRib)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(也称为“ICOS”)、FcsRI、DAP10、DAP 12和CD66d的细胞质信号序列的ITAM。
初级细胞内信号传导结构域包含初级刺激分子(例如，CD3ζ)的功能片段或类似物。初级细胞内信号传导结构域可包含整个细胞内区域或细胞内区域的片段，所述细胞内区域的片段在与其融合的抗原结合结构域结合同源抗原时，足以产生细胞内信号。在一些实例中，初级细胞内信号传导结构域与天然存在的初级刺激分子(例如，人或其它哺乳动物，例如，非人物种，例如，啮齿动物、猴子、猿或小鼠细胞内初级刺激分子)的整个细胞内区域或细胞内区域的片段具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性，所述细胞内区域的片段足以产生细胞内信号。
在一些实例中，初级细胞内信号传导结构域与天然存在的人初级刺激分子(例如，本文公开的天然存在的人初级刺激分子)的整个细胞内区域或细胞内区域的片段的的相应残基具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，与所述相应残基相异不超过30个、25个、20个、15个、10个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸残基，所述细胞内区域的片段足以产生细胞内信号。
共刺激信号传导结构域
在一些实例中，CAR构建体或包含其的重组DNA构建体包含编码CAR的DNA序列，所述CAR包含共刺激信号传导结构域，其在与其融合的细胞外结构域(例如，抗原结合结构域)结合同源配体时产生细胞内信号。共刺激信号传导结构域源自共刺激分子。共刺激信号传导结构域包含足够的初级刺激分子序列，以例如在与其融合的细胞外结构域(例如，抗原结合结构域)结合同源配体时产生细胞内信号。
共刺激域可以是优化包含CAR的T细胞的性能，例如，持久性或免疫效应功能的共刺激结构域，所述CAR包含共刺激结构域。
共刺激分子是除促进免疫效应反应的抗原受体或其反配体外的细胞表面分子。在一些情况下，它们是高效或增强的免疫反应所需的。通常地，共刺激分子产生细胞内信号，所述信号依赖于与同源配体的结合，在某些实例中，所述同源配体不是抗原(例如，由CART细胞的抗原结合结构域识别的抗原)。通常，来自初级刺激分子和共刺激分子的信号传导有助于免疫效应反应，并且在一些情况下，两者都是高效或增强的免疫效应反应产生所需的。
共刺激结构域包含共刺激分子(例如，ICOS、CD28或4-1BB)的功能片段或类似物。其可包含整个细胞内区域或细胞内区域的片段，所述细胞内区域的片段例如在与其融合的抗原结合结构域结合同源抗原时，足以产生细胞内信号。在某些实例中，共刺激结构域与天然存在的共刺激分子(例如，人或其它哺乳动物，例如，非人物种，例如，啮齿动物、猴子、猿或小鼠细胞内初级刺激分子)的整个细胞内区域或细胞内区域的片段具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性，所述细胞内区域的片段足以产生细胞内信号。
示例性共刺激结构域包括但不限于选自以下的那些共刺激结构域：CD27、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、QX40、CD30、CD40、ICQS(CD278)、ICAM-1、LFA-1(CDl1a/CD18)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD8特异性结合的配体、CDS、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMf7、NKP80(KLRF1)、CD160(BY55)、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、C49f、ITGAD、CDlld、ITGAE、CD103、ITGAL、ITGAM、CDllb、ITGAX、CDllc、ITGBl、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAMl(CD226)、SLAMF4(C244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAMl、CRTAM、Ly9(CD229)、PSGLl、ClOO(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMFl、CD150、IP0-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS和PAG/Cbp。
在一些实例中，共刺激信号传导结构域与天然存在的人共刺激分子(例如，本文公开的天然存在的人共刺激分子)的整个细胞内区域或细胞内区域的片段的相应残基具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或与所述相应残基相异不超过30个、25个、20个、15个、10个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸残基，所述细胞内区域的片段足以产生细胞内信号。
共刺激分子配体结合结构域
在一些实例中，CAR构建体或包含其的重组DNA构建体包含编码CAR的DNA序列，所述CAR包含与促进免疫效应反应的细胞内信号传导结构域偶联的共刺激分子的细胞外配体结合结构域(称为共刺激ECD结构域)。因此，与共刺激分子的反配体的接合导致免疫效应反应的优化。
来自共刺激分子的示例性共刺激ECD结构域(由它们所源自的共刺激分子鉴定的)包括但不限于ICOS、CD28、CD27、HVEM、LIGHT、CD40L、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、SLAM、CD2和CD226。
在一些实例中，共刺激ECD结构域与天然存在的人抑制分子(例如，本文公开的天然存在的人共刺激分子)的整个细胞外区域或细胞外区域的片段的相应残基具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或与所述相应残基相异不超过30个、25个、20个、15个、10个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸残基，所述细胞外区域的片段足以与反配体接合。
抑制性CAR成员
在一些实例中，CAR构建体或包含其的重组DNA构建体包含编码包含抑制性CAR(iCAR)成员的CAR的DNA序列。iCAR成员包括：识别非靶标(例如，非癌细胞)上的抗原的抗原结合结构域(或其它细胞外结构域)；跨膜结构域；和来自抑制分子的结构域，例如，来自抑制分子的细胞内结构域。在一个实例中，iCAR成员可包含第二抑制性细胞内信号传导结构域。
在iCAR成员的抗原结合结构域(或其它细胞外结构域)与其靶抗原(或反配体)结合时，iCAR有助于抑制，例如，可逆地抑制或最小化包含iCAR的细胞的活化。因此，将iCAR成员包含在CAR(例如，和表达CAR的CAR-T细胞)中可以限制对非靶标(例如，旁观者细胞)的损伤。尽管不希望受理论束缚，但据信iCAR成员在与其抗原(或反配体)接合时限制细胞因子分泌、细胞毒性和增殖中的一种或多种。在某些例子中，效果是暂时的，并且在随后与靶细胞接合时，CAR，例如，CAR-T细胞被活化并攻击靶细胞。
iCAR成员的靶抗原可以是在靶细胞和非靶细胞上具有表达谱的抗原，使得实现对靶细胞的可接受的高水平攻击和对非靶细胞的可接受的低水平攻击。不仅抗原的选择，而且iCAR对其抗原(或反配体)的亲和力、CAR对其抗原的亲和力、iCAR的表达水平或CAR的表达水平可用来优化中靶标/脱靶响应的比率。
在一个实例中，抗原在肿瘤细胞上不存在或被下调。在一个实例中，抗原包括HLA分子。在一个实例中，抗原包含细胞表面肿瘤抑制抗原。在一个实例中，抗原包括PCML(或在淋巴瘤、乳腺癌或前列腺癌中被下调的另一种抗原)、HYAL2、DCC或SMAR1。
在一个实例中，抗原包括蛋白质、碳水化合物、脂质或细胞表面部分的翻译后修饰，例如，粘蛋白型O-聚糖(核心3-O-聚糖)。
在一个实例中，抗原包含被经历上皮至间充质转变的肿瘤细胞下调的部分。
在一个实例中，抗原包括E-钙粘蛋白。
在一个实例中，来自抑制分子的结构域在细胞外结构域(例如，与其融合的抗原结合结构域)结合同源抗原(反配体)时产生细胞内信号。抑制性细胞内信号传导结构域源自抑制分子，例如，其包含抑制分子的细胞内序列。其包含足够的抑制分子序列以例如在与其融合的抗原结合结构域结合其同源抗原时产生细胞内信号。
在一个实例中，初级细胞内信号传导结构域包含信号传导基序，例如，基于免疫受体酪氨酸的激活基序或TTIM。
来自抑制分子的结构域包含抑制分子细胞内结构域的功能片段或类似物。其可包含整个细胞内区域或细胞内区域的片段，所述细胞内区域的片段在与其融合的抗原结合结构域结合同源抗原时，足以产生细胞内信号。在一个实例中，抑制性细胞内信号传导结构域与天然存在的抑制分子(例如，诸如选自B7-H1、B7-1、CD160、P1H、2B4、PD1、TIM3、LAG3、TIGIT、CTLA-4、BTLA、LAIR1和TGF-β受体的分子)的相应残基具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性，或与所述相应残基相异不超过30个、25个、20个、15个、10个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸残基。
因此，在一个实例中，本公开的重组DNA构建体包含含有iCAR成员的CAR。iCAR成员可包含：识别非靶标(例如，非癌细胞)上的抗原的抗原结合结构域(或其它细胞外结构域)；跨膜结构域；和来自抑制分子的结构域，例如，如本文所述的。
表达载体
在一个实例中，本公开的ddRNAi构建体或CAR构建体，或包含本公开的ddRNAi构建体和CAR构建体的DNA构建体包含在一个或多个表达载体内。
在一个实例中，ddRNAi构建体和CAR构建体分开地包含在单一表达载体中。在另一个实例中，DNA构建体包含在单一表达载体中。在一个实例中，ddRNAi构建体和CAR构建体包含在单独的表达载体中。根据其中ddRNAi构建体和CAR构建体包含在单独的表达载体中的实例，各个表达载体可以相同或不同。
在一个实例中，所述表达载体或每种表达载体是质粒例如，如本领域已知的。在一个实例中，合适的质粒表达载体是pBL载体。如本文中所述，质粒可包含一种或多种启动子(描述了其合适的实例)以驱动本公开的shmiR表达。
在一个实例中，所述表达载体或每个表达载体是微环DNA。微环DNA描述于美国专利公开第2004/0214329号中。微环DNA可用于持续高水平的核酸转录。环状载体的特征在于缺乏表达沉默细菌序列。例如，微环载体与细菌质粒载体的不同之处在于它们缺乏复制起点，以及缺乏通常存在于细菌质粒中的药物选择标记，例如，β-内酰胺酶、tet等。因此，微环DNA的大小变得更小，从而允许更高效的递送。
在一个实例中，所述表达载体或每个表达载体是病毒DNA。
基于任何合适的病毒的病毒载体可用于递送本公开的ddRNAi和/或CAR构建体。另外，可以使用杂交病毒系统。病毒传递系统的选择将取决于各种参数，诸如被靶向递送的组织、系统的转导效率、致病性、免疫学和毒性问题等。
基因疗法中使用的常用病毒系统类别可根据它们的基因组是整合到宿主细胞染色质中(致癌逆转录病毒和慢病毒)还是主要作为染色体外附加体保持在细胞核中(腺相关病毒、腺病毒和疱疹病毒)而分为两组。在一个实例中，本公开的病毒载体整合到宿主细胞的染色质中。在另一个实例中，本公开的病毒载体作为染色体外附加体保持在宿主细胞的细胞核中。
在一些实例中，本公开的病毒载体是慢病毒。慢病毒载体通常用泡状滑石病毒糖蛋白(vesicular steatites virus glycoprotein)(VSV-G)来进行假型化，并且已源自人免疫缺陷病毒(HIV)；羊脑炎-慢性进行性肺炎，其可在绵羊中引起脑炎(绵羊脱髓鞘性脑白质炎(visna))或肺炎；马传染性贫血病毒(EIAV)，其在马中引起自身免疫性溶血性贫血和脑病；猫免疫缺陷病毒(FIV)，其在猫科动物中引起免疫缺陷；牛免疫缺陷病毒(BIV)，其在牛中引起淋巴结病和淋巴细胞增多症；和猿免疫缺陷病毒(SIV)，其在非人灵长目中引起免疫缺陷和脑病。基于HIV的载体通常保留<5％的亲本基因组，并且<25％的基因组被掺入到包装构建体中，这使产生恢复复制能力的HIV的可能性降至最低。通过开发自身失活型载体进一步提高了生物安全性，所述自失活型载体在下游长末端重复序列中含有调控元件的缺失，消除了载体动员所需的包装信号的转录。使用慢病毒载体的主要有利方面之一是基因转移在大多数组织或细胞类型中是持久的，甚至在转导细胞的细胞分裂后也是如此。
用于从本公开的ddRNAi构建体表达shmiR和/或用于从本公开的CAR构建体表达CAR的基于慢病毒的构建体(包括当在具有本公开的ddRNAi构建体的DNA构建体中提供时)，包含来自慢病毒的5'和3'长末端重复序列(LTR)的序列。在一个实例中，病毒构建体包含来自慢病毒的失活型或自身失活型3’LTR。可通过本领域已知的任何方法使3’LTR自身失活。例如，3’LTR的U3元件包含其增强子序列(例如，TATA盒、Sp1和NF-κB位点)的缺失。作为自身失活型3’LTR的结果，整合到宿主基因组中的前病毒将包含失活型5’LTR。LTR序列可以是来自任何物种的任何慢病毒的LTR序列。基于慢病毒的构建体还可掺入MMLV或MSCV、RSV或哺乳动物基因的序列。另外，来自慢病毒5’LTR的U3序列可用病毒构建体中的启动子序列替换。这可会增加从包装细胞系中回收的病毒的滴度。还可包括增强子序列。
在一个实例中，病毒载体是腺病毒(AdV)载体。腺病毒是具有为26-48Kbp的线性基因组的中等大小的双链无包膜DNA病毒。腺病毒通过受体介导的结合和内化进入靶细胞，渗入非分裂和分裂细胞的细胞核。腺病毒严重依赖宿主细胞进行存活和复制，并且能够使用宿主的复制机器在脊椎动物细胞的细胞核中复制。
在一个实例中，病毒载体来自细小病毒科。细小病毒科是具有约5000个核苷酸长的基因组的小的单链无包膜DNA病毒家族。家族成员中包括腺相关病毒(AAV)。在一个实例中，本公开的病毒载体AAV。AAV是一种通常需要与另一种病毒(通常为腺病毒或疱疹病毒)共感染以启动和维持生产性感染周期的依赖性细小病毒。在此种辅助病毒不存在的情况下，AAV仍然有能力通过受体介导的结合和内化感染或转导靶细胞，渗入非分裂和分裂细胞的细胞核。因为在辅助病毒不存在的情况下子代病毒不是由AAV感染产生的，所以转导的程度仅受限于感染上该病毒的初始细胞。正是这一特征使得AAV成为本公开的理想载体。此外，与逆转录病毒、腺病毒和单纯疱疹病毒不同，AAV似乎缺乏人致病性和毒性(Kay,等，Nature.424:251(2003))。由于基因组通常仅编码两个基因，因此不令人惊讶的是，作为递送运载体，AAV受限于4.5单链千碱基(kb)的包装容量。然而，虽然这一大小限制可能限制可被递送用于替代基因疗法的基因，但其不会对较短序列诸如shmiR和shRNA的包装和表达产生不利影响。
与本公开的ddRNAi构建体、CAR构建体和/或DNA构建体一起使用的另一种病毒递送系统是基于来自逆转录病毒科的病毒的系统。逆转录病毒包含单链RNA动物病毒，其特征在于两个独特的特征。首先，逆转录病毒的基因组是二倍体，由两个拷贝的RNA组成。其次，该RNA由病毒体相关酶逆转录酶转录成双链DNA。然后，该双链DNA或前病毒可整合到宿主基因组中，并作为宿主基因组的稳定整合组分从亲代细胞传递到子代细胞。
可以使用本领域技术人员已知的其它病毒或非病毒系统将本公开的ddRNAi或核酸递送至目标细胞，包括但不限于基因缺失的腺病毒-转座子载体(参见Yant,等，NatureBiotech.20:999-1004(2002))；源自辛德比斯病毒或塞姆利基森林病毒的系统(见Perri,等，J.Virol.74(20):9802-07(2002))；源自新城疫病毒或仙台病毒的系统。
测试构建体或载体
ddRNAi构建体
可通过将ddRNAi构建体或包含其的表达载体引入T细胞，随后测量由被ddRNAi构建体中的shmiR靶向的TCR复合物亚基编码的RNA或蛋白质的表达水平来测定本公开的ddRNAi构建体抑制TCR复合物亚基表达的活性。可通过TaqmanTM测定法或针对特定TCR亚基设计的其它实时PCR测定法或通过针对TCR的ELISA(例如，使用商购可得的抗体和/或ELISA试剂盒)来测定表达水平。
在实施例3中描述了用于测定由本公开的ddRNAi构建体编码的各个shmiR对TCR亚基表达的下调的示例性方法。
在实施例5中描述了用于测定由本公开的ddRNAi构建体编码的各个shmiR对TCR亚基表面表达(即，TCR在细胞表面上的表达和组装)的下调的示例性方法。
CAR构建体和包含其的DNA构建体
可通过将CAR构建体、DNA构建体或包含其的表达载体引入T细胞(例如，包含非功能性内源TCR的T细胞)，随后测量由CAR编码的RNA或蛋白质的表达水平来测定本公开的CAR构建体或DNA构建体表达CAR的活性。可以通过TaqmanTM测定法或其它实时PCR测定法或通过针对CAR的ELISA测定表达水平。
组合物和载体
在一些实例中，本公开的ddRNAi构建体、CAR构建体、DNA构建体和/或一种或多种表达载体以组合物或多种组合物的形式提供。例如，配制组合物使得其可被引入T细胞或T细胞群。
例如，本公开的组合物可包含(i)包含本公开的ddRNAi构建体的表达载体，(ii)包含本公开的ddRNAi构建体的表达载体和包含本公开的CAR构建体的表达载体，或(iii)包含本公开的DNA构建体的表达载体。根据其中在不同表达载体中提供ddRNAi构建体和CAR构建体的实例，可在单独的组合物(例如，可将它们包装在一起)中提供每种表达载体。
本公开的组合物还可包含一种或多种例如适合与T细胞一起使用的载体或稀释剂。在一个实例中，一种或多种载体或一种或多种稀释剂可以是药学上可接受的。在一个实例中，可以配制载体以帮助将本公开的ddRNAi构建体、CAR构建体、DNA构建体和/或一种或多种表达载体引入T细胞(例如，在细胞培养中)。
在一些实例中，载体是基于脂质的载体、阳离子脂质或脂质体核酸复合物、脂质体、胶束、病毒体、脂质纳米颗粒或其混合物。
在一些实例中，载体是可生物降解的基于聚合物的载体，使得形成阳离子聚合物-核酸复合物。使用阳离子聚合物将递送组合物递送至细胞是本领域已知的，诸如描述于Judge等Nature 25:457-462(2005)(其内容通过引用并入本文)中。
在另外的实例中，载体是基于环糊精的载体诸如环糊精聚合物-核酸复合物。
在另外的实例中，载体是基于蛋白质的载体诸如阳离子肽-核酸复合物。
在另一个实例中，载体是脂质纳米颗粒。示例性纳米颗粒描述于例如US7514099中。
在一些实例中，可将本公开的ddRNAi构建体、CAR构建体、DNA构建体和/或一种或多种表达载体与包含阳离子脂质/胆固醇/PEG-C-DMA/DSPC(例如，以40/48/2/10的比例)、阳离子脂质/胆固醇/PEG-DMG/DSPC(例如，以40/48/2/10的比例)或阳离子脂质/胆固醇/PEG-DMG(例如，以60/38/2的比例)的脂质纳米颗粒组合物一起配制。在一些实例中，阳离子脂质是DMA中的辛基CL、DMA中的DL、L-278、DLinKC2DMA或MC3。
在另一个实例中，可将本公开的ddRNAi构建体、CAR构建体、DNA构建体和一种或多种表达载体与任何WO 2010/021865、WO 2010/080724、WO 2010/042877、WO 2010/105209或WO 2011/022460中描述的阳离子脂质制剂一起配制。
在另一个实例中，可将本公开的ddRNAi构建体、CAR构建体、DNA构建体和一种或多种表达载体与另一种化合物缀合或复合，例如，以有利于递送。此类缀合物的非限制性实例描述于US 2008/0152661和US 2004/0162260中(例如，CDM-LBA、CDM-Pip-LBA、CDM-PEG、CDM-NAG等)。
在另一个实例中，将聚乙二醇(PEG)共价附接至本公开的ddRNAi构建体、CAR构建体、DNA构建体和一种或多种表达载体。附接的PEG可以是任何分子量，例如，约100至约50,000道尔顿(Da)。
在另外的其它实例中，可将本公开的ddRNAi构建体、CAR构建体、DNA构建体和一种或多种表达载体与包含表面修饰的脂质体的载体一起配制，所述脂质体包含聚(乙二醇)脂质(PEG修饰的或长循环脂质体或隐形脂质体)，诸如在例如WO 96/10391、WO 96/10390或WO96/10392中公开的。
其它载体包括环糊精(参见例如Gonzalez等，1999,Bioconjugate Chem.,10,1068-1074；或WO 03/46185)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和PLCA微球(参见例如US2002130430)。
组合物将理想地包括增加本公开的ddRNAi构建体、CAR构建体、DNA构建体和一种或多种表达载体的生物稳定性的材料和/或增强组合物定位于T细胞的能力的材料。可将本公开的治疗性组合物在药学上可接受的载体(例如，生理盐水)中施用。
T细胞和包含其的制剂
在一个实例中，本公开提供了T细胞，所述T细胞包含本文所述的ddRNAi构建体或本文所述的DNA构建体或本文所述的表达载体。根据该实施例的T细胞不表达功能性TCR即，不表达内源TCR。在一个实例中，T细胞表现出TCR复合物的至少两种组分的细胞表面表达降低。在一个实例中，T细胞表现出TCR复合物的至少三种组分的细胞表面表达降低。在一个实例中，T细胞包含如本文所述的CAR构建体并表达嵌合抗原受体(CAR)。因此，T细胞可以是CAR-T细胞。
CAR-T细胞可以表达例如，如本文所述的抗原结合结构域。在一个实例中，抗原结合结构域是例如，如本文先前所述的抗体或其抗原结合结构域。在一个实例中，抗原结合结构域与肿瘤抗原(例如，如本文先前所述的)特异性结合。在另一个实例中，抗原结合结构域与在细胞表面上表达的病毒抗原(例如，如本文先前所述的病毒抗原)特异性结合。
在一个实例中，T细胞可存在于已针对特定性质(例如，基于HLA分型和/对免疫抑制剂的抗性)选择的T细胞亚群中。
可以配制本公开的T细胞以用于在过继性T细胞疗法中施用。
待施用的组合物的制剂将根据所选择的施用途径和制剂(例如，溶液、乳液)而变化。可在生理学上可接受的载体中制备包含待施用的本公开的组合物的合适药物组合物。也可以使用组合物的混合物。对于溶液或乳液来说，合适的载体包括水溶液或醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物可包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发性油。本领域技术人员已知多种合适的水性载体，包括水、缓冲水、缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)、葡萄糖溶液和甘氨酸。静脉内媒介物可包括各种添加剂、防腐剂或液体、营养物或电解质补充剂(参见，通常，Remington's Pharmaceutical Science，第16版，Mack,编辑1980.该组合物可任选地含有接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，诸如pH调节剂和缓冲剂以及毒性调节剂，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙和乳酸钠。
根据本领域技术人员公知的方法，可以凭经验确定所选培养基中细胞群的最佳浓度，并且所述最佳浓度将取决于所需的最终药物制剂。
产生T细胞的方法
本公开还提供了产生本公开的T细胞的方法。
在一个实例中，提供了产生不表达功能性TCR的T细胞的方法，其中所述方法包括将本公开的ddRNAi构建体或如本文所述的包含其的表达载体或组合物引入T细胞中。
在另一个实例中，提供了抑制T细胞中两种或更多种TCR复合物亚基表达的方法，其中所述方法包括将本公开的ddRNAi构建体或如本文所述的包含其的表达载体或组合物引入T细胞中。
在另一个实例中，提供了产生不表达功能性TCR并且表达CAR的T细胞的方法，其中所述方法包括将本公开的DNA构建体或如本文所述的包含其的表达载体或组合物引入T细胞中。
可以使用本领域已知的任何合适方法将本公开的ddRNAi构建体、CAR构建体、DNA构建体和/或表达载体引入T细胞。
在一些实例中，使用重组感染性病毒颗粒(诸如例如，源自猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体)将本公开的ddRNAi构建体、CAR构建体、DNA构建体和/或表达载体引入T细胞。
在一些实例中，使用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体(诸如γ-逆转录病毒载体例如，如本文所述的)将本公开的ddRNAi构建体、CAR构建体、DNA构建体和/或表达载体引入T细胞中。慢病毒转导的方法是本领域已知的并且在本文中得以考虑。示例性方法描述于例如，Wang等(2012)J.Immunother.35(9):689-701；Cooper等(2003)Blood.101:1637-1644；Verhoeyen等(2009)Methods Mol Biol.506:97-114；和Cavalieri等(2003)Blood.102(2):497-505。
在一些实例中，通过电穿孔将本公开的ddRNAi构建体、CAR构建体、DNA构建体和/或表达载体引入T细胞中(参见，例如，Chicaybam等，(2013)PLoS ONE 8(3):e60298和VanTedeloo等，(2000)Gene Therapy 7(16):1431-1437)。在其它实例中，通过转座将本公开的ddRNAi构建体、CAR构建体、DNA构建体和/或表达载体引入T细胞中(参见，例如，Manuri等(2010)Hum Gene Ther 21(4):427-437；Sharma等(2013)Molec Ther Nucl Acids 2,e74；和Huang等(2009)Methods Mol Biol 506:115-126)。将遗传物质引入免疫细胞(例如，T细胞)并在其中表达的其它方法包括磷酸钙转染(例如，如Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,New York.N.Y.中所述的)、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染；钨颗粒促进的微粒轰击(Johnston,Nature,346:776-777(1990))；和磷酸锶DNA共沉淀(Brash等，Mol.Cell Biol.,7:2031-2034(1987))。
在一些实例中，在将本公开的ddRNAi构建体、CAR构建体、DNA构建体和/或表达载体引入T细胞之前，可以例如，从受试者或细胞库获得T细胞。T细胞可获自许多来源，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸膜积液、脾组织和肿瘤。或者，可使用本领域可商购获得的T细胞系。
在一些实例中，T细胞可以使用许多本领域技术人员已知的技术(诸如FicollTM分离)从于受试者收集的血液单元获得。在另一个实例中，通过单采血液成分术获得来自个体循环血液的细胞。可以洗涤通过单采血液成分术收集的T细胞以除去血浆部分，并任选地置于合适的缓冲液或培养基中用于后续处理步骤。洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法完成，诸如通过按照制造商的说明使用半自动化“流通式”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器，Baxter CytoMate或Haemonetics Cell Saver 5)来完成。
在一些实例中，可通过裂解红细胞并例如通过离心(通过PERCOLLTM梯度)或通过逆流离心淘洗耗竭单核细胞来从外周血淋巴细胞中分离T细胞。
示例性T细胞群包括原初T细胞、T辅助细胞(TH细胞)、终末分化的效应T细胞(Teff细胞)、效应记忆T细胞(Tem细胞)、中枢记忆T细胞(Tcm细胞)、细胞毒性T细胞(CTL)和调节性T细胞(Treg细胞)。
在一些实例中，可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离T细胞的特定亚群诸如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞。
在一些实例中，例如，在引入本公开的ddRNAi构建体、CAR构建体、DNA构建体和/或表达载体之前或之后，通过阳性选择分离T细胞亚群。例如，可将从受试者血液中分离的T细胞与特异性识别特定细胞表面蛋白的抗体在适合抗体结合的条件下一起孵育。在一些实例中，可将抗体与荧光分子(例如，FITC)缀合，并使用流式细胞术分选T细胞。
在一个实例中，可通过在免疫抑制剂存在的情况下培养T细胞并选择那些存活的T细胞来分离对免疫抑制剂具有抗性的T细胞亚群。
制备如本文所述的T细胞的方法可包括超过一个选择步骤。例如，除了上述阳性选择以外，还可例如，利用针对负选择的细胞(例如调节性T细胞或肿瘤细胞)特有的表面标志物的抗体的组合来完成通过阴性选择对T细胞群的进一步富集。一种这样的方法是通过流式细胞术进行的细胞分选和/或选择，所述细胞分选和/或选择使用针对存在于负选择的细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体混合物。此类抗体包括抗GITR、抗CD25或抗肿瘤抗原抗体。
在一些实例中，在当可能需要扩增细胞时之前的时间段从受试者收集血液样品或单采血液成分术产物。因此，可在任何必要的时间点收集待扩增细胞的来源，并且可分离和冷冻所需的T细胞以供以后用于例如，T细胞疗法，所述T细胞疗法用于许多将受益于此类T细胞疗法的疾病或病患。
根据本文所述方法产生的T细胞可以是同种异体的(例如，缺乏功能性TCR表达和/或表达CAR的同种异体T细胞)。
该方法还可包括例如，如本文所述对一种或多种T细胞进行HLA分型。。
例如，离体执行这些方法。
在一些实例中，该方法包括首先刺激细胞(例如，T细胞)生长、增殖和/或活化，然后转导活化的细胞，并在培养物中扩增至足以用于临床应用的数量。
T细胞的保存
在一个实例中，将本文描述的多种T细胞或包含其的组合物保存在库中。在一个实例中，库中的T细胞包含本公开的ddRNAi构建体并具有非功能性TCR。另外，库中的T细胞可以是本公开的CAR-T细胞。
根据该实例，可在细胞库或存储库或贮藏设施中或在其中将诸如细胞例如在液氮中保持冷冻保存(以便保护)的任何地方“保存”本公开的T细胞以供将来使用。此外，适当的计算机系统可用于数据处理，以维护与供体信息相关的记录并确保从存储库快速高效地检索细胞。
在一个实例中，可在存储于根据本公开的库中之前，用基于与供体、品系或细胞类型相关联的独特属性的正面标识(positive identification)标记每个存储容器(例如，袋或管)。例如，可将DNA遗传指纹和HLA分型与安全标识机制(诸如使用微芯片、磁条和/或条形码标签的可接受方法)一起使用。该标识步骤可包括在保存过程中。
在一个实例中，已鉴定出库中每种组合物中T细胞中的HLA等位基因中的至少一种。在一个实例中，HLA是HLA-DR等位基因。
在使用时，仅回收所需的存储单元，满足所需剂量所需的单元数是可选择的。某些疾病可能需要包括一系列重复治疗的细胞疗法。可以从库中提取细胞群，并在制备药物组合物和向受试者施用之前通过细胞扩增来增加细胞群。
用于制备如本文所述的具有非功能性TCR的T细胞(如本文所述的CAR-T细胞)的合适细胞和包含其的组合物可以从现有细胞库获得，或者可以直接从一个或多个供体受试者收集，然后进行保存。在一个实例中，从健康受试者收集细胞。例如，来自对受试者非必需的组织的细胞也可能是合适的，因为它们降低了诱导自身免疫性疾病的风险。
供体选择标准可包括收集前的一个或多个考虑因素，诸如(a)没有特定疾病；(b)特定或一般疾病；(c)与某些疾病相关的供体的参数(例如特定年龄、某些身体状况和/或症状)、与某些疾病相关的参数、与某些既往治疗史和/或预防性治疗等有关的供体参数；(d)供体是否符合一个或多个已建立的统计和/或人口统计模型或简档(例如，在统计上不可能获得某些疾病)；和(e)供体是否处于如根据现行医疗实践等所察觉的某种可接受的健康状况。
在一个实例中，通过单采血液成分术从供体外周血收集细胞，处理所述细胞(以优化收集的细胞的数量和质量)，并任选地在合适的条件下低温保存或维持在培养物中。
在一个实例中，供体是干细胞供体。例如，通过单采血液成分术收集细胞作为干细胞捐赠的一部分。在一个实例中，在将G-CSF单独施用于供体或与化学疗法或干细胞动员剂组合施用于供体后收集细胞。在一个实例中，通过骨髓收获收集细胞。
在一个实例中，通过单采血液成分术从供体外周血或通过骨髓收获从骨髓收集细胞，并且如果收集的细胞数超过干细胞移植所需的数量，则用于制备组合物。例如，收集用于制备组合物的细胞超过干细胞移植所需的细胞。
可以将收集的细胞等分成确定的剂量级分。可在任何适当的条件下(诸如在培养中或在冷冻保存的状态下)储存细胞。细胞储存方法对于技术人员来说是显而易见的。例如，可使用各种冷冻保护剂(诸如DMSO)实现细胞的冷冻保存。
可冷落保存本公开的T细胞以用于过继性T细胞转移。例如，制备含有40％盐水、40％Albumex20和20％DMSO的冷冻混合物。将盐水加入到DMSO中并冷却，然后加入Albumex20。将冷冻混合物保持冷却直至需要。
将用于冷冻保存的细胞重新悬浮，合并并充分混合。使用血细胞计数器计数细胞，测定细胞浓度和总细胞活力。
将细胞以1400rpm旋转5分钟，取出10ml上清液进行无菌和支原体检测。弃去剩余的上清液。
用补充有Albumex20的最多200ml的0.9％盐水洗涤细胞，并以1400rpm旋转5分钟。
将细胞以2x107个细胞/ml的浓度重悬于0.9％的盐水中。
对于冷冻保存T细胞，每袋添加的最大细胞体积将使用以下公式计算：每袋最大体积(mL)＝每袋所需的最大细胞数/1x107/ml。
确定要冷冻保存的袋子和质量保证样品的数量。将等体积的冷冻混合物加入到T淋巴细胞悬浮液中并混合。将所需体积的细胞转移到冷冻保存袋和/或小瓶中。将袋子和小瓶立即放入预先冷却的控速冷冻机中以开始冷冻保存。
用于疗法和保存的细胞的表型分型
在一个实例中，对本公开的T细胞进行HLA-等位基因表型分型。例如，对细胞进行部分HLA-等位基因表型分型。
在一个实例中，细胞具有选自主要HLA(例如任何I、II或III类HLA)、次要HLA和非多态性等位基因(诸如CD1家族成员的任何成员)的等位基因。
主要HLA等位基因可以更具体地选自任何I类HLA诸如，HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A24、HLA-A11、HLA-A28、HLA-A29、HLA-A32、HLA-B15、HLA-B5、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B12、HLA-B14、HLA-B18、HLA-B35、HLA-B40、HLA-C组1、HLA-C组2例如，任何II类HLA-DPB9、HLA-DPB11、HLA-DPB35、HLA-DPB55、HLA-DPB56、HLA-DPB69HLA-DPB84HLA-DPB 87、HLA-DRB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1，或任何III类HLA。HLA表型的知识可有利于随后选择用于制备本公开的组合物的细胞。
在一个实例中，对至少一种II类HLA进行表型分型。例如，对HLA-DR、HLA-DP或HLA-DQ中的至少一种进行表型分型。
在一个实例中，本公开细胞中的至少一种HLA-等位基因与向其施用组合物的受试者中的至少一种HLA-等位基因匹配。例如，将至少一种II类HLA进行匹配。例如，将HLA-DR、HLA-DP或HLA-DQ中的至少一种进行匹配。
在一个实例中，HLA等位基因是HLA-DR。例如，本公开的细胞中的HLA-DR的表型与向其施用组合物的受试者中的HLA-DR等位基因匹配。在一个实例中，治疗受试者的方法包括确定受试者中的HLA等位基因，使HLA等位基因与库中的组合物中的T细胞中的HLA等位基因匹配，以及向受试者施用包含T细胞的组合物，所述T细胞具有与受试者中的HLA等位基因相同的HLA等位基因。
治疗方法
本公开还考虑在疗法中使用包含本公开的DNA构建体(例如，表达如本文所述的CAR)的T细胞(即，CAR-T细胞)。
在一个实例中，本公开提供了在有此需要的个体中治疗或预防选自癌症、移植物抗宿主病、感染、一种或多种自身免疫性病症、移植排斥和放射病的疾病或病患的方法，包括向所述个体施用本文所述的CAR-T细胞或包含其的制剂。
在一个实例中，本公开提供了治疗与如本文所述的癌症相关抗原(或肿瘤抗原)的表达相关的疾病或病症的方法。在一个实例中，待治疗的疾病是癌症。例如，该方法可包括向受试者施用本公开的T细胞，所述T细胞已被工程化以表达与癌症相关抗原特异性结合的CAR。当本公开的CAR-T细胞与其表面上表达的至少一种癌症相关抗原接触肿瘤细胞时，CART靶向肿瘤细胞并且肿瘤的生长被抑制。
在一个实例中，本公开提供抑制癌症生长的方法，其包括使癌细胞与本文所述的CAR-T细胞接触。根据该实施例，CAR-T细胞响应于在癌细胞表面上表达的抗原而被活化，靶向癌细胞并抑制其生长。
如本文中所用，术语“癌症”意图包括所有类型的癌性生长或致癌过程、转移性组织或恶性转化的细胞、组织或器官，而与侵袭性的组织病理学类型或阶段无关。实体瘤的实例包括各种器官系统的恶性肿瘤，例如，肉瘤、腺癌和癌，诸如影响肝、肺、乳腺、淋巴、胃肠道(例如，结肠)、泌尿生殖道(例如，肾、尿路上皮细胞)、前列腺和咽的那些。腺癌包括恶性肿瘤诸如大多数结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、肺的非小细胞癌、小肠癌和食道癌。在一个实例中，癌症是黑色素瘤，例如，晚期黑色素瘤。还可使用本公开的方法和组合物治疗或预防上述癌症的转移性病变。可以治疗的其它癌症的实例包括骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病，包括急性髓样白血病、慢性粒细胞白血病、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS肿瘤)、原发性中枢神经系统淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症(包括由石棉诱发的那些癌症)和所述癌症的组合。
可以使用本公开的方法治疗的示例性癌症包括通常对免疫疗法有反应的癌症。用于治疗的癌症的非限制性实例包括黑色素瘤(例如，转移性恶性黑色素瘤)、肾癌(例如，透明细胞癌)、前列腺癌(例如，激素难治性前列腺腺癌)、乳腺癌、结肠癌和肺癌(例如，非小细胞肺癌)。
本方法对治疗血液癌症病患特别有用。血液癌症病患是影响血液、骨髓和淋巴系统的癌症的类型，诸如白血病和恶性淋巴组织增生病。白血病可分类为急性白血病和慢性白血病。急性白血病可进一步分类为急性骨髓性白血病(AML)和急性淋巴性白血病(ALL)。慢性白血病包括慢性髓性白血病(CML)和慢性淋巴性白血病(CLL)。其它相关病患包括脊髓发育不良综合征(MDS，以前称为“白血病前期”)，其为由骨髓血细胞的无效产生(或发育异常)和转化为AML的风险联合的血液病的多样化集合。
因此，在一个实例中，如本文所述的治疗癌症的方法是治疗血液癌症(包括但不限于为白血病或淋巴瘤的血液学癌症)的方法。在一个实例中，本公开的CAR-T细胞可用于治疗癌症和恶性肿瘤诸如但不限于，例如，急性白血病包，括但不限于例如，B细胞急性淋巴性白血病(“BALL”)、T细胞急性淋巴性白血病(“TALL”)、急性淋巴性白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于例如，慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)；另外的血液癌症或血液病，包括但不限于例如，B细胞前淋巴细胞白血病、成浆细胞样树突状细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、多毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生病、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良和脊髓发育不良综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞肿瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症，以及“白血病前期”，其为由骨髓血细胞的无效产生(或发育异常)等联合的血液病的多样化集合。
在一个实例中，本公开提供了用于抑制表达如本文所述的癌症相关抗原的癌细胞的增殖或减少其群体的方法，所述方法包括使表达癌症相关抗原的细胞与结合如本文所述的癌症相关抗原的CAR-T细胞接触。在某些实例中，本公开的CAR-T细胞将受试者中的细胞和/或癌细胞的数量、数目、量或百分比减少至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少65％、至少75％、至少85％、至少95％或至少99％。在一个实例中，受试者是人。
另外，可使用CAR-T细胞和包含如本文所述的CAR-T细胞的制剂来治疗难治性或复发性恶性肿瘤。如本文中所用，术语“难治性”是指对治疗没有反应的疾病，例如，癌症。在一些实例中，难治性癌症可在治疗之前或治疗开始时对治疗具有抗性。在其它实例中，难治性癌症可在治疗期间变得具有抗性。在一个实例中，治疗是化学疗法、造血干细胞移植或免疫消融。例如，受试者正在经历或即将开始或已完成化学疗法和/或造血干细胞移植和/或免疫消融疗法。
根据其中提供治疗或预防移植物抗宿主病或移植排斥的方法的一个实例，待治疗的受试者可能即将接受或已经接受实体器官诸如肾、肝、胰腺、胰岛、心脏、肺、小肠或其它实体器官的移植。
根据另一个实例，待用本公开的方法治疗的受试者正在接受或已经接受针对疾病(诸如但不限于炎性肠病、类风湿性关节炎、多发性硬化、肝炎、肾小球肾炎和肾衰竭、癌症、淋巴瘤、白血病、脊髓发育不良、骨髓瘤)的免疫抑制药物治疗或抗体治疗或可溶性受体治疗或另一种免疫调节治疗。
根据另一个实例，待用本公开的方法治疗的受试者、待治疗的受试者已遗传或出生时具有免疫系统的缺陷，诸如但不限于严重的联合免疫缺陷、常见的变异性免疫缺陷、淋巴细胞缺乏、Wiskott Aldrich综合征、共济失调性毛细血管扩张症、狄乔治综合征、白细胞粘附缺陷、免疫球蛋白缺乏症。
根据另一个实例，待用本公开的方法治疗的受试者，受试者通过感染人免疫缺陷病毒或导致免疫系统功能不全的另一种病原生物而具有获得性免疫缺陷。
在一个实例中，本公开提供了治疗与如本文所述的病毒抗原的表达相关的疾病或病患的方法，其包括向所述个体施用如本文所述的CAR-T细胞或包含其的制剂。例如，CAR-T细胞表达与病毒抗原或病毒诱导的抗原特异性结合的CAR。在一个实例中，向受试者施用T细胞赋予针对病毒的治疗性免疫应答。在一个实例中，向受试者施用T细胞赋予针对病毒的保护性免疫应答。在一个实例中，病毒抗原或病毒诱导的抗原可来自选自由以下组成的组的病毒：人巨细胞病毒(HCMV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、腺病毒(AdV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、流感病毒和BK病毒(BKV)、约翰-坎宁安(JC)病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒、鼻病毒、人偏肺病毒、单纯疱疹病毒(HSV)1、HSV II、人疱疹病毒(HHV)6、HHV 8、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、戊型肝炎病毒、轮状病毒、乳头瘤病毒、细小病毒属埃博拉病毒、寨卡病毒、汉坦病毒和水疱性口炎病毒(VSV)。
本公开的方法可包括使用本发明的CAR-T细胞输注待治疗的个体，所述CAR-T细胞已经过遗传修饰以表达特定的CAR。输注的细胞能够杀伤接受者中的患病细胞例如，癌细胞或病毒感染的细胞。与抗体疗法不同，CAR修饰的T细胞能够在体内复制，导致可以导致持续治疗(例如，肿瘤控制)的长期持久性。在各个方面，施用于患者的T细胞或其子代在向患者施用T细胞后在患者中持续至少4个月、至少5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、2年、3年、4年或5年。
本公开还考虑了一种类型的细胞疗法，其中例如，通过从本公开的CAR构建体体外转录RNA以瞬时表达CAR来进一步修饰如本文所述的具有非功能性TCR的T细胞，之后向有此需要的接受者输注所述CAR-T细胞。输注的细胞能够杀伤接受者中的患病细胞例如，癌细胞。然而，与其中已用本公开的CAR构建体稳定转染或转导的T细胞的实例相反，根据该实例向患者施用的T细胞在向所述患者施用T细胞后存在不到一个月，例如，三周、两周、一周。
根据一种治疗方法，从哺乳动物(例如，人)中分离出T细胞，并用表达如本文所述的ddRNAi构建体和CAR构建体的载体(例如，包含本公开的DNA构建体的载体)进行遗传修饰(即，体外转导或转染)。可向哺乳动物接受者施用CAR-T细胞以提供治疗益处。哺乳动物接受者可以是人，并且CAR-T细胞相对于接受者可以是自体的。
或者，细胞相对于接受者可以是同种异体或同源的。根据该实例，可对T细胞进行HLA分型以确定与接受者的相容性。
通常，如本文所述的CAR-T细胞可用于治疗和预防免疫受损个体中出现的疾病。特别地，本公开的CAR-T细胞用于治疗与本文所述的癌症相关抗原的表达相关的疾病、病症和病患。在某些实例中，本公开的CAR-T细胞用于治疗有发展与本文所述的癌症相关抗原的表达相关的疾病、病症和病患的风险的患者。因此，本公开提供了治疗或预防与本文所述的癌症相关抗原的表达相关的疾病、病症和病患的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的CAR-T细胞或包含其的制剂。
本公开的CAR-T细胞可以单独施用，或与稀释剂和/或作为与其它组分诸如IL-2或其它细胞因子或细胞群组合的药物组合物施用。
联合治疗
可将如本文所述的CAR-T细胞和包含其的制剂可以与其它已知的用于治疗特定疾病或病患的药剂和疗法组合使用。如本文中所用，“组合”施用意指在受试者患有病症的过程中向受试者递送两种(或更多种)不同的治疗，例如，在受试者已被诊断患有病症后并且在所述病症已被治愈或消除或治疗因其它原因而停止之前，递送所述两种或更多种治疗。在一个实例中，当第二次治疗的递送开始时，一种治疗的递送仍然在进行，使得在施用方面存在重叠。这有时在本文中称为“同时”或“同时递送”。在其它实例中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前结束。在任一种情况的一些实例中，治疗因联合施用而更有效。例如，与在第一治疗不存在的情况下施用第二治疗所观察到的结果相比，第二治疗更有效，例如，使用更少的第二治疗观察到等同的作用，或者第二治疗更大程度地减轻症状，或者对于第一治疗观察到类似的情况。在一些实例中，递送是使得症状或与病症相关的其它参数的减少大于对于在另一种治疗不存在的情况下递送的一种治疗所观察到的所述症状或与病症相关的其它参数的减少的递送。两种治疗的作用可部分累加、完全累加或大于累加。所述递送可以是使得当递送第二治疗时所递送的第一治疗的作用仍然是可检测的的递送。
在一个实例中，可将本文所述的CAR-T细胞或包含其的制剂和至少一种另外的治疗剂在同一组合物中或在单独的组合物中同时施用，或顺序施用。对于顺序给药，本文所述的CAR-T细胞和另外的药剂可以以任何顺序施用。
可在病症活跃期期间或在疾病缓解期或活跃性较低期期间施用CAR-T细胞疗法和/或其它治疗剂、程序或方式。可将CAR-T细胞疗法在另一种治疗之前施用、与治疗同时施用、治疗后施用或在病症缓解期间施用。
当组合施用时，可将CAR-T细胞疗法和另外的药剂(例如，第二或第三药剂)或全部药剂以比单独使用(例如，作为单一疗法)的每种药剂的量或剂量更高、更低或相同的量或剂量施用。在某些实例中，CAR-T细胞疗法、另外的药剂(例如，第二或第三药剂)或全部药剂的施用量或剂量比单独使用(例如，作为单一疗法)的每种药剂的量或剂量低至(例如，至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。在其它实例中，导致所需作用(例如，癌症的治疗)的CAR-T细胞疗法、另外的药剂(例如，第二或第三药剂)或全部药剂的量或剂量比实现相同治疗作用所需的单独使用(例如，作为单一疗法)的每种药剂的量或剂量低至(例如，低至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。
根据待治疗的疾病或病患为癌症的实例，另外的治疗剂或治疗方案可包括但不限于手术、化学疗法、放射疗法、免疫抑制剂、抗体、免疫消除剂、类固醇和辐照。
剂量和施用
用于本公开的CAR-T细胞制剂的施用的剂量范围是足够大以产生所需作用的那些剂量范围。例如，制剂应包含足以在受试者中赋予治疗性或保护性免疫应答的量的CAR-T细胞。
所述剂量不应大到引起不利的副作用，诸如高粘滞综合征、肺水肿、充血性心力衰竭等。通常，剂量将随受试者的年龄、状况、性别和疾病的程度变化而变化，并且可由本领域技术人员确定。如果出现任何并发症，可由个体医生调整剂量。剂量可以从约1x 103个细胞/kg变化至1x 1010个细胞/kg。例如，约1x 103个细胞/kg至约1x 104个细胞/kg，或约1x104个细胞/kg至约1x 105或约1x 105个细胞/kg至约1x 106，或约1x 106个细胞/kg至约1x107，或约1x 107个细胞/kg至约1x 108，或约1x 108个细胞/kg至约1x 109，或约1x 109个细胞/kg至约1x 1010。剂量可从约1×105个细胞/m2变化至约1x 1010个细胞/m2。例如，约1x 105个细胞/m2至约1x 106个细胞/m2，或约1x 106个细胞/m2至约1x 107个细胞/m2，或约1x 107个细胞/m2至约1x 108个细胞/m2，或约1x 108个细胞/m2至约1x 109个细胞/m2，或约1x 109个细胞/m2至约1x 1010cells/m2。例如，约1x 107个细胞/m2，或约2x 107个细胞/m2，或约3x 107个细胞/m2，或约4x 107个细胞/m2或约5x 107个细胞/m2。在一个实例中，可以以一次或多次剂量施用来施用剂量。在一个实例中，剂量可以重复至少一次。例如，取决于受试者的免疫状态和对先前输注的反应，间隔重复剂量。在这方面，一个或多个重复剂量不必与先前的一个或多个剂量相同，例如，其可以增加或减少。
在一个实例中，静脉内施用制剂。
在受试者对治疗没有充分反应的情况下，可以施用多个剂量。可选地，或另外地，可以施用递增剂量。
实施例
实施例1-靶向TCR亚基的shRNA和shmiR的设计和筛选
为了确定能够沉默TCR组分表达的构建体，shRNA被设计来以靶向TCR-α、TCR-β、CD3-ε、CD3-δ和CD3-γmRNA的区域。靶区域选自人、小鼠和猕猴mRNA序列之间的绝对序列保守区域，因为保守序列的使用可能简化构建体安全性和功效的临床前测试。从以下T细胞受体(TCR)亚基的mRNA序列鉴定用于设计shRNA和shmiR构建体的代表性潜在靶标的序列：TCR-α(SEQ ID NO:180-182)、TCR-β(SEQ ID NO:183-185)、CD3-δ(SEQ ID NO:186-188)、CD3-γ(SEQ ID NO:189-191)和CD3-ε(SEQ ID NO:192-194)。使用公开可用的算法(包括Ambion、Promega、Invitrogen、Origene和MWG)来选择序列。仅针对那些亚基的恒定区设计靶向TCR-α和TCR-β亚基的序列。
筛选靶向TCR-α的6种shRNA、靶向TCR-β的9种shRNA、靶向CD3-ε的13种shRNA、靶向CD3-δ的13种shRNA和靶向CD3-γ的7种shRNA的活性。这些shRNA的效应子和效应子互补序列的序列列于表1中。使用其中将shRNA靶位点克隆到萤光素酶报告子构建体的3’UTR中的传感器构建体，通过双萤光素酶测定法测定这些构建体的沉默活性。使用其中分别以有义或反义方向克隆靶位点的单独的传感器构建体测定效应子序列和效应子互补序列的活性。构建体活性和链特异性变化很大。针对TCR-α的三个效应子序列、针对TCR-β的三个效应子序列、针对CD3-ε的三个效应子序列、针对CD3-δ的四个效应子序列和针对CD3-γ的两个效应子序列被选择用于进一步表征。
然后将选择的效应子序列/效应子互补序列用于构建表达shmiR的构建体。在一些情况下，设计并测试了各个shmiR构建体的变体；对于这些变体，将效应子序列和效应子互补序列在原始shRNA靶向位点的上游或下游移动了几个碱基对，以试图产生具有增强的活性和/或链特异性的构建体。使用如下所述的双萤光素酶测定法和链特异性传感器构建体测定这些shmiR构建体的活性和链特异性。然后使用“超功能测定法”测定这些构建体的相对活性。在此类实验中，针对恒定量的传感器构建体滴定不同量的shmiR构建体并定量荧光素酶敲低；在最低量的DNA的情况下显示强敲低的构建体被认为是活性最高的。还可通过使用qRT PCR测定法测定转染的Jurkat细胞中各个靶基因的mRNA敲低来测定这些构建体针对内源基因靶标的活性。另外，在转染的Jurkat细胞中使用蛋白质印迹测定靶蛋白敲低。
然后使用这些数据来选择表2和表3中列出的各个shmiR以用于后续分析。
实施例2-靶向内源性T细胞受体的shmiR的设计
将编码实施例1中选择的shRNA的序列掺入pre-miRNA支架中以产生短发夹微小RNA(shmiR)，其包含5'侧翼区(SEQ ID NO:98)、有义链、茎/环序列(SEQ ID NO:97)、反义链和3'侧翼区(SEQ ID NO:99)。代表性shmiR的预测二级结构如图1所示。每种候选shmiR的效应子序列(反义链)和互补序列(有义链)列于表2中，并且完整的shmiR序列示于表3中。
实施例3-通过各个shmiR下调TCR亚基表达
该实施例证明了shmiR体外敲低它们的靶向TCR亚基的内源表达的能力。
细胞
将Jurkat T细胞在37℃，5％CO2下于RPMI培养基(10％FCS，pen/strep)中生长。
处理
将细胞使用Neon电穿孔系统(电压＝1350V，脉冲长度＝10，脉冲次数＝3)进行电穿孔，并用靶向TCR亚基的各个shmiR进行转导。作为对照，用表达非靶向siRNA序列的pSilencer质粒转染Jurkat T细胞。
随后用抗CD3抗体(5ug/mL的抗CD3e,OKT3溶液)和抗CD28抗体(2ug/mL的针对细胞的可溶性抗CD28)处理转导的细胞48小时以活化T细胞。活化后，将RNA收获并通过qPCR分析以测量靶向TCR亚基的表达以及测定敲低。
qPCR分析
48小时后使用Qiazol试剂收获RNA，并使用ND-1000 NanoDrop分光光度计(NanoDrop Technologies)对RNA样品进行定量。使用ABI‘高容量cDNA反转录试剂盒’(产品号4368813)和Ambion‘Superase抑制剂’通过逆转录产生cDNA。将cDNA用于使用总反应体积为10ul的Taqman qPCR预混合物进行的定量PCR反应。PCR反应如下进行：在50℃下2分钟，在95℃下10分钟，然后是40个循环：95℃下15秒，60℃下1分钟。使用GenScript TaqMan引物设计工具(https://www.genscript.com/ssl-bin/app/primer)设计引物。
将每种mRNA的表达水平归一化至GAPDH。表达水平根据总拷贝数(如通过标准曲线测定)计算，并将其转换为相对于pSilencer对照的抑制百分比。
所得的shmiR对Jurkat T细胞中TCR亚基的内源表达的抑制百分比示于图2中。如图2所示，shmiR下调TCR亚基的表达，抑制百分比范围在50％与88％之间。
实施例4-同时表达三种靶向TCR亚基的shmiR的三重shmiR构建体的制备
基于它们对TCR亚基表达的抑制，将主要候选shmiR掺入到同时表达三种shmiR的慢病毒构建体中。每个构建体由以下序列组成：5'慢病毒末端重复(LTR)序列、位于第一候选shmiR的编码序列上游的聚合酶-III启动子U6-9、第二shmiR编码序列上游的U6-1启动子、第三shmiR上游的U6-8启动子，接着是3’LTR序列。掺入到每个构建体中的shmiR示于表4中，并且图3中显示了一个这样的构建体的实例。
表4-三重shmiR构建体
三重构建体ID 第一shmiR 第二shmiR 第三shmiR SEQ ID NO：
pBL513 shmiR-TCR-α_1 shmiR-TCR-β_5 shmiR-CD3-ε_3 SEQ ID NO：172
pBL514 shmiR-TCR-α_1 shmiR-CD3-γ_2 shmiR-CD3-ε_3 SEQ ID NO：173
pBL515 shmiR-TCR-α_1 shmiR-CD3-δ_3 shmiR-CD3-ε_3 SEQ ID NO：174
pBL516 shmiR-TCR-β_5 shmiR-CD3-γ_2 shmiR-CD3-ε_3 SEQ ID NO：175
实施例5-TCR表面表达的下调
该实施例证明了三重shmiR构建体同时靶向不同TCR亚基以防止TCR在细胞表面上的表达和组装的能力。
如上文实施例3中所述培养Jurkat T细胞。将细胞使用Neon电穿孔系统(电压＝1350V，脉冲长度＝10，脉冲次数＝3)进行电穿孔，并用表4中所示的表达针对不同的TCR亚基的多个shmiR的三重shmiR载体之一转导。将细胞用KkDNA构建体共转导，所述DNA构建体将截短的MHC I类分子H-2Kk表达为表面标志物以选择转染细胞。未处理的野生型和突变型(缺乏TCR复合物)Jurkat T细胞以及用靶向丙型肝炎的无关三重shmiR构建体转导的野生型Jurkat T细胞用作对照。
20小时后，将细胞用针对Kk的MACSelect珠(Miltenyi)分选，以选择阳性转导的细胞，然后将选择的细胞培养48小时以使其恢复。
在FACS缓冲液(10％FCS,1X PBS)中使用针对TCR-α/β的抗体(eBioscience，抗人αβTCR FITC；目录号11-9986)或对照抗体(eBioscience，小鼠IgG1K同种型对照FITC；目录号11-4714)对细胞进行染色以进行流式细胞术。在BD LSRII荧光激活细胞分选仪(FACS)上分析细胞。
所得FACS曲线示于图4中。分析表明，三重shmiR构建体能够几乎完全耗竭TCR复合物的组装并阻止其在细胞表面上展示，耗竭率大于95％。
实施例6-用抗CD3抗体和抗CD28抗体活化的T细胞中TCR介导的信号传导的抑制
该实施例证明了三重shmiR构建体在由抗CD3抗体和抗CD28抗体激活的Jurkat T细胞中阻止通过TCR信号传导介导的T细胞活化的能力。
如上文实施例3中所述培养Jurkat T细胞，并使用实施例5中所述的方法用实施例4中所述的三重shmiR构建体对其进行电穿孔。20小时后，然后用针对Kk的MACSelect珠(Miltenyi)分选细胞中的阳性转导的细胞。将选择的细胞培养48小时以使其恢复。
随后用抗CD3抗体(5ug/mL的抗CD3ε,OKT3溶液)和抗CD28抗体(2ug/mL的针对细胞的可溶性抗CD28)处理转导的细胞48小时以刺激T细胞的活化。
ELISA
为了测量TCR介导的信号传导，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量活化的T细胞分泌的白细胞介素-2(IL-2)的浓度。在如上所述通过抗CD3抗体和抗CD28抗体活化后，将细胞孵育48小时，然后收获上清液。然后通过针对IL-2的ELISA在活化细胞培养物的上清液中测量TCR介导的T细胞活化。将未处理的野生型和突变体(缺乏TCR)Jurkat T细胞作为对照提供。
结果示于图5中。如通过IL-2分泌所测量的，所有测试的三重shmiR构建体均抑制TCR介导的信号传导。抑制百分比的范围为79％(对于pBL514)至100％(IL-2不可检测)(对于pBL516)。
qPCR分析
为了测量IL-2 mRNA水平，48小时后使用Qiazol试剂收获RNA，并使用ND-1000NanoDrop分光光度计(NanoDrop Technologies)定量RNA样品。使用ABI‘高容量cDNA反转录试剂盒’(产品号4368813)和Ambion‘Superase抑制剂’通过逆转录产生cDNA。将cDNA用于使用总反应体积为10ul的Taqman qPCR预混合物进行的定量PCR反应。PCR反应如下进行：在50℃下2分钟，在95℃下10分钟，然后是40个循环：95℃下15秒，60℃下1分钟。使用GenScriptTaqMan引物设计工具(https://www.genscript.com/ssl-bin/app/primer)设计引物。
将IL-2 mRNA的表达水平归一化至GAPDH。表达水平根据总拷贝数(如通过标准曲线测定)计算，并将其转换为相对未处理的野生型Jurkat T细胞对照的抑制百分比。
所得的三重shmiR构建体对Jurkat T细胞中IL-2的内源表达的抑制百分比示于图6中。三重shmiR构建体敲低IL-2的表达，抑制百分比的范围在78％与97％之间。
实施例7-通过抗原呈递细胞共培养活化的T细胞中TCR介导的信号传导的抑制
本实施例证明了三重shmiR构建体阻止由抗原呈递细胞活化的Jurkat T细胞中通过TCR信号传导介导的T细胞活化的能力。
如上文实施例3中所述培养Jurkat T细胞，并使用实施例5中所述的方法用实施例4中所述的三重shmiR构建体对其进行电穿孔。20小时后，然后用针对Kk的MACSelect珠(Miltenyi)分选细胞中的阳性转导的细胞。将选择的细胞培养48小时以使其恢复。
随后将转导的细胞与载有葡萄球菌(Staphylococcal)肠毒素的Raji B细胞(抗原呈递细胞)共培养5小时，以通过TCR介导的信号传导活化T细胞。葡萄球菌肠毒素是由金黄色葡萄球菌产生的外毒素，其具有催吐和超抗原特性，所述特性由它们刺激多种T细胞的独特能力定义。此类超抗原经由TCR信号传导刺激细胞因子诸如IL-2的产生。
因此，为了确认实施例6中观察到的结果和测量三重shmiR构建体对TCR敲低后的T细胞功能，测量Jurkat T细胞分泌的IL-2的浓度。将未处理的野生型和突变型(缺乏TCR)Jurkat T细胞以及未与Raji B细胞共培养的未处理的野生型Jurkat T细胞提供为对照。
在Jurkat T细胞与Raji B细胞共培养5小时后，收获上清液并通过针对IL-2的ELISA测量T细胞活化。图7显示对用三重shmiR构建体转导的Jurkat T细胞的IL-2分泌的抑制百分比。所有测试的三重shmiR构建体抑制T细胞活化(通过IL-2分泌测量的)高达92％。这些结果与实施例6一起确认了表4中提供的三重shmiR构建体能够抑制TCR介导的信号转导。
实施例8-三重shmiR构建体不阻止非TCR依赖性活化
鉴于实施例6和实施例7中所述的三重shmiR构建体对TCR介导的活化的强烈抑制，评估转导的T细胞是否仍然能够经由非TCR依赖性途径来活化。
如上文实施例3中所述培养Jurkat T细胞，并使用实施例5中所述的方法用如实施例4中所述的三重shmiR构建体进行电穿孔。20小时后，然后用针对Kk的MACSelect珠(Miltenyi)分选细胞的阳性转导。将选择的细胞培养48小时以使其恢复。
为了刺激活化，在培养物中用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA,SigmaAldrich#P8139,10ng/mL)和离子霉素(SigmaAldrich#I0634,1ug/mL)处理细胞4小时。活化后，收获上清液，然后通过针对IL-2的ELISA测量T细胞活化。未处理的野生型和突变型(缺乏TCR复合物)Jurkat T细胞以及用靶向丙型肝炎病毒蛋白的无关shRNA转导的野生型Jurkat T细胞用作对照。
用三重shmiR构建体转导的细胞(相对于未处理的细胞)分泌的IL2浓度示于图8中。这些数据表明三重shmiR构建体不会显著影响非TCR依赖性T细胞活化途径。用pBL513构建体转导的细胞相对于未处理的细胞显示出25％的IL-2分泌增加。而pBL514和pBL516处理的细胞维持未处理细胞分泌的IL-2水平的约80％。
实施例9-三重shmiR构建体不破坏细胞周期分布
该实施例证明，如通过FACS分析所测量的，三重shmiR构建体不会对转导细胞的周期产生不利影响。
将Jurkat T细胞如上文实施例3中所述培养，并使用实施例5中所述的方法用实施例4中所述的三重shmiR构建体进行电穿孔。20小时后，然后用针对Kk的MACSelect珠(Miltenyi)分选细胞的阳性转导。将选择的细胞培养48小时以使其恢复。
然后用胸苷类似物溴脱氧尿苷(BrdU)脉冲细胞，所述溴脱氧尿苷掺入新合成的DNA中。将细胞孵育1小时，然后用结合总DNA的7-氨基放线菌素D(7AAD)对细胞进行染色以用于流式细胞术。用FACS缓冲液(10％FCS,1X PBS)中的针对BrdU和7AAD的荧光抗体(BDBioscience)以及抗TCR抗体(eBioscience,TCR-PE；目录号12-9986-42)标记细胞。将细胞门控于TCR阴性群上，然后根据BrdU FITC测定分析细胞周期群。在BD LSRII FACS仪上进行分析。
图9中的条形图显示了如通过测定确定的细胞周期的每个阶段(G0/G1、S、G2/M)中无TCR细胞的百分比。与未处理的细胞相比，由于三重shmiR构建体导致的敲低而缺乏TCR复合物的T细胞中的细胞周期分布没有显著变化。
实施例10-用于同时进行TCR的敲低和利用嵌合抗原受体的替换的临床构建体的制备
为了指导同时进行内源TCR的基因沉默和利用嵌合抗原受体的替换，产生表达与靶向CD19的嵌合抗原受体(CAR)组合的所选shmiR中的3种的慢病毒载体。CAR是工程化受体，其基本上能够将任意特异性移植到免疫效应细胞诸如T细胞上。CD19是B细胞特异性抗原，并且是用于治疗B细胞恶性肿瘤的CAR的靶标。
上述构建体的实例示于图10中。通过将实施例4的三重shmiR构建体的序列亚克隆到慢病毒载体中的编码CAR的序列的上游或下游来产生构建体。图10中描绘的示例性构建体由以下部分组成：5’LTR、随后是EF1启动子、CD19单链可变片段(scFv；可变重链，VH；接头；可变轻链，VL)、间隔子结构域、信号传导结构域(其包括CD28跨膜结构域、41BB和CD3ζ)和转录终止序列、接着是U6-9启动子、编码shmiR-TCR-β_2的序列(SEQ ID NO:159)、U6-1启动子、编码shmiR-CD3-γ_2的序列(SEQ ID)NO:164)、U6-8启动子、编码shmiR-CD3-ε_3shmiR的序列(SEQ ID NO：171)、转录终止序列和3’LTR。
实施例11-来自三重发夹构建体的shmiR的表达水平
该实施例显示了当Jurkat T细胞中由三重发夹构建体表达时每种单独shmiR的发夹表达水平和CD3-ε-1shmiR的意料之外的低水平表达。
将Jurkat T细胞如实施例3中所述培养，并用称为pBL513、pBL514或pBL516(描述于实施例4和表4中)的三重shmiR构建体对其进行电穿孔。将选择的细胞培养48小时以使其恢复。
随后收集转导细胞并使用Qiazol试剂收获RNA，并将纯化的RNA样品重悬于不含核酸酶的水中。使用ND-1000 NanoDrop分光光度计(NanoDrop Technologies)对RNA样品进行定量。
下一代测序(NGS)
将100ng浓度为5ng/μl的DNA酶处理的总RNA送至SeqMatic(44846OsgoodRd.Fremont,CA 94539)用于下一代测序(NGS)。
Quantimir RT测定
将cDNA用于使用System Biociences(SBI)‘QuantiMir RT试剂盒’(目录号RA420A-1)通过反转录产生cDNA。使用总共10ul反应体积的2x SYBR PCR预混合物(含10uM通用反向引物和10uM发夹特异性引物)的定量PCR反应。PCR反应如下进行：50℃2分钟，95℃10分钟，然后40个循环：95℃15秒，60℃1分钟。使用GenScript TaqMan引物设计工具(https://www.genscript.com/ssl-bin/app/primer)设计引物。将每个发夹的表达水平归一化至总细胞数。根据总拷贝来(如通过标准曲线测定)计算表达水平。
通过Quantimir测定法和NGS测定的shmiR-CD3-ε_3的表达水平显著低于另外两种发夹。如图11和图12所示，无论在构建体的其它位置处存在哪种shmiR，均观察到低水平的发夹表达。
实施例12-同时表达三种靶向TCR亚基的shmiR的三重shmiR构建体中的第三启动子的替换
为了克服在pBL513、pBL514和pBL516中观察到的shmiR-CD3-ε-3的低水平表达，将驱动这些构建体的最后位置中的shmiR-CD3-ε_3表达的U6-8启动子用H1启动子替换，并克隆到慢病毒载体(CD512B-1；SBI)中，以产生构建体pBL528(SEQ ID NO:176)、pBL529(SEQID NO:177)和pBL530(SEQ ID NO:178)。
实施例13-经H1启动子修饰的三重发夹构建体的增强的生物活性
该实施例证明了H1启动子修饰的三重shmiR构建体(pBL528、pBL529和pBL529)比使用U6-8启动子的相应三重构建体更高效地下调TCR组分的能力。使用双萤光素酶测定法和转染的Jurkat细胞中IL-2产生的抑制显示了这一点。
将Jurkat T细胞培养并用质粒DNA pBL528、pBL529或pBL 530转导，并如上文实施例3中所述进行选择。对于双萤光素酶测定，还用合适的萤光素酶报告子构建体转导细胞。如图13所示，与原始构建体相比，经H1启动子修饰的构建体显示出显著增加的对CD-3报告子构建体的抑制的活性，这与增加的shmiR-CD3-ε_3表达一致。
使用如实施例6中所述的转导细胞中IL-2分泌的抑制来确认含H1构建体的增强的生物活性。将细胞用pBL528、pBL529或pBL 530转染，选择并用抗体刺激，并如实施例6所述使用ELISA测定法测定IL-2分泌。如图14所示，使用H1启动子代替U6-8启动子的构建体显示出对IL-2分泌的更大抑制。
实施例14-临床候选物的制备
基于实施例13中概述的数据，将来自pBL530的三重shmiR插入物克隆到含有CAR构建体的慢病毒载体(Creative Biolabs)中以产生pBL531(SEQ ID NO:179)。pBL531包含：5’慢病毒末端重复(LTR)序列；位于shmiR-TCR-β_5的上游的聚合酶-III启动子U6-9；HPRT来源的填充片段序列；shmiR CD3-γ_2上游的U6-1启动子；第二HPRT填充片段；和shmiR-CD3-ε_3上游的H1启动子；接着是抗CD19CAR(EF1启动子、CD19单链可变片段(scFv；可变重链，VH；接头；可变轻链，VL)、间隔子结构域、信号传导结构域(其包括CD28跨膜结构域、41BB和CD3ζ)和转录终止序列)；接着是3’LTR序列。pBL531的图谱示于图15中。
对本说明书中包括的文件、法案、材料、装置、物品等的任何讨论不应被视为承认任何或所有这些事项构成现有技术基础的一部分或者由于在本申请各项权利要求的优先权日之前就存在而为与本公开相关的领域中的公知常识。
本领域技术人员将理解，在不脱离本公开的广泛总体范围的情况下，可对上述实施方案进行多种变更和/或修改。因此，本发明的实施方案被视为在所有方面都是说明性而非限制性的。
序列表
<110> Benitec Biopharma Limited
<120> 用于产生具有非功能性T细胞受体（TCR）的T细胞的试剂、包含其的组合物及其用途
<130> 179813
<150> US 62/394,559
<151> 2016-09-14
<160> 194
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为TCR-α_1的shRNA的RNA效应子序列
<400> 1
ucuguuucaa agcuuuucuc g 21
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为TCR-α_1的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 2
cgagaaaagc uuugaaacag a 21
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为TCR-α_2的shRNA的RNA效应子序列
<400> 3
ucguaucugu uucaaagcuu u 21
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为TCR-α_2的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 4
aaagcuuuga aacagauacg a 21
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为TCR-α_3的shRNA的RNA效应子序列
<400> 5
uagguucgua ucuguuucaa a 21
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为TCR-α_3的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 6
uuugaaacag auacgaaccu a 21
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为TCR-α_4的shRNA的RNA效应子序列
<400> 7
aaguuuaggu ucguaucugu u 21
<210> 8
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为TCR-α_4的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 8
aacagauacg aaccuaaacu u 21
<210> 9
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为TCR-α_5的shRNA的RNA效应子序列
<400> 9
uuugaaaguu uagguucgua u 21
<210> 10
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为TCR-α_5的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 10
auacgaaccu aaacuuucaa a 21
<210> 11
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为TCR-α_6的shRNA的RNA效应子序列
<400> 11
agguuuugaa aguuuagguu c 21
<210> 12
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为TCR-α_6的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 12
gaaccuaaac uuucaaaacc u 21
<210> 13
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为TCR-β_1的shRNA的RNA效应子序列
<400> 13
accagcucag cuccacgugg u 21
<210> 14
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为TCR-β_1的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 14
accacgugga gcugagcugg u 21
<210> 15
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为TCR-β_2的shRNA的RNA效应子序列
<400> 15
ccauucaccc accagcucag c 21
<210> 16
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为TCR-β_2的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 16
gcugagcugg ugggugaaug g 21
<210> 17
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为TCR-β_3的shRNA的RNA效应子序列
<400> 17
gaccccacug ugcaccuccu u 21
<210> 18
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为TCR-β_3的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 18
aaggaggugc acaguggggu c 21
<210> 19
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为TCR-β_4的shRNA的RNA效应子序列
<400> 19
gugcugaccc cacugugcac c 21
<210> 20
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为TCR-β_4的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 20
ggugcacagu ggggucagca c 21
<210> 21
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为TCR-β_5的shRNA的RNA效应子序列
<400> 21
caggcggcug cucaggcagu a 21
<210> 22
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为TCR-β_5的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 22
uacugccuga gcagccgccu g 21
<210> 23
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为TCR-β_6的shRNA的RNA效应子序列
<400> 23
gagacccuca ggcggcugcu c 21
<210> 24
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为TCR-β_6的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 24
gagcagccgc cugagggucu c 21
<210> 25
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为TCR-β_7的shRNA的RNA效应子序列
<400> 25
gacuugacag cggaaguggu u 21
<210> 26
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为TCR-β_7的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 26
aaccacuucc gcugucaagu c 21
<210> 27
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为TCR-β_8的shRNA的RNA效应子序列
<400> 27
ucaggcggcu gcucaggcag u 21
<210> 28
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为TCR-β_8的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 28
acugccugag cagccgccug a 21
<210> 29
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为TCR-β_9的shRNA的RNA效应子序列
<400> 29
ucacccacca gcucagcucc a 21
<210> 30
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为TCR-β_9的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 30
uggagcugag cuggugggug a 21
<210> 31
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-ε_1的shRNA的RNA效应子序列
<400> 31
ccuuucuauu cuugcuccag u 21
<210> 32
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-ε_1的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 32
acuggagcaa gaauagaaag g 21
<210> 33
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-ε_2的shRNA的RNA效应子序列
<400> 33
cacaggcuug gccuuggccu u 21
<210> 34
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-ε_2的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 34
aaggccaagg ccaagccugu g 21
<210> 35
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-ε_3的shRNA的RNA效应子序列
<400> 35
ggguugggaa cagguggugg c 21
<210> 36
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-ε_3的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 36
gccaccaccu guucccaacc c 21
<210> 37
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-ε_4的shRNA的RNA效应子序列
<400> 37
cucauagucu ggguugggaa c 21
<210> 38
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-ε_4的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 38
guucccaacc cagacuauga g 21
<210> 39
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-ε_5的shRNA的RNA效应子序列
<400> 39
ggaugggcuc auagucuggg u 21
<210> 40
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-ε_5的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 40
acccagacua ugagcccauc c 21
<210> 41
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-ε_6的shRNA的RNA效应子序列
<400> 41
agaauacagg ucccgcuggc c 21
<210> 42
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-ε_6的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 42
ggccagcggg accuguauuc u 21
<210> 43
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-ε_7的shRNA的RNA效应子序列
<400> 43
cucugauuca ggccagaaua c 21
<210> 44
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-ε_7的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 44
guauucuggc cugaaucaga g 21
<210> 45
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-ε_8的shRNA的RNA效应子序列
<400> 45
uagucugggu ugggaacagg u 21
<210> 46
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-ε_8的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 46
accuguuccc aacccagacu a 21
<210> 47
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-ε_9的shRNA的RNA效应子序列
<400> 47
uuccggaugg gcucauaguc u 21
<210> 48
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-ε_9的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 48
agacuaugag cccauccgga a 21
<210> 49
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-ε_10的shRNA的RNA效应子序列
<400> 49
ucaggccaga auacaggucc c 21
<210> 50
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-ε_10的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 50
gggaccugua uucuggccug a 21
<210> 51
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-ε_11的shRNA的RNA效应子序列
<400> 51
auucaggcca gaauacaggu c 21
<210> 52
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-ε_11的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 52
gaccuguauu cuggccugaa u 21
<210> 53
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-ε_12的shRNA的RNA效应子序列
<400> 53
gauucaggcc agaauacagg u 21
<210> 54
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-ε_12的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 54
accuguauuc uggccugaau c 21
<210> 55
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-ε_13的shRNA的RNA效应子序列
<400> 55
uucuucauua ccaucuugcc c 21
<210> 56
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-ε_13的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 56
gggcaagaug guaaugaaga a 21
<210> 57
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-δ_1的shRNA的RNA效应子序列
<400> 57
guaucuugaa ggggcucacu u 21
<210> 58
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-δ_1的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 58
aagugagccc cuucaagaua c 21
<210> 59
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-δ_2的shRNA的RNA效应子序列
<400> 59
auauauuccu cgugggucca g 21
<210> 60
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-δ_2的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 60
cuggacccac gaggaauaua u 21
<210> 61
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-δ_3的shRNA的RNA效应子序列
<400> 61
ucccaaagca aggagcagag u 21
<210> 62
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-δ_3的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 62
acucugcucc uugcuuuggg a 21
<210> 63
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-δ_4的shRNA的RNA效应子序列
<400> 63
aaagcagaag acucccaaag c 21
<210> 64
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-δ_4的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 64
gcuuugggag ucuucugcuu u 21
<210> 65
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-δ_5的shRNA的RNA效应子序列
<400> 65
gucucauguc cagcaaagca g 21
<210> 66
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-δ_5的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 66
cugcuuugcu ggacaugaga c 21
<210> 67
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-δ_6的shRNA的RNA效应子序列
<400> 67
auuccucgug gguccaggau g 21
<210> 68
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-δ_6的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 68
cauccuggac ccacgaggaa u 21
<210> 69
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-δ_7的shRNA的RNA效应子序列
<400> 69
ccuauauauu ccucgugggu c 21
<210> 70
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-δ_7的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 70
gacccacgag gaauauauag g 21
<210> 71
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-δ_8的shRNA的RNA效应子序列
<400> 71
caccuauaua uuccucgugg g 21
<210> 72
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-δ_8的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 72
cccacgagga auauauaggu g 21
<210> 73
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-δ_9的shRNA的RNA效应子序列
<400> 73
caaggagcag aguggcaaug a 21
<210> 74
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-δ_9的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 74
ucauugccac ucugcuccuu g 21
<210> 75
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-δ_10的shRNA的RNA效应子序列
<400> 75
cugagcauca ucucgaucuc g 21
<210> 76
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-δ_10的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 76
cgagaucgag augaugcuca g 21
<210> 77
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-δ_11的shRNA的RNA效应子序列
<400> 77
auaucugucc cauuacaccu a 21
<210> 78
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-δ_11的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 78
uagguguaau gggacagaua u 21
<210> 79
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-δ_12的shRNA的RNA效应子序列
<400> 79
uauaucuguc ccauuacacc u 21
<210> 80
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-δ_12的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 80
agguguaaug ggacagauau a 21
<210> 81
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-δ_13的shRNA的RNA效应子序列
<400> 81
aaugacauca gugacaauga u 21
<210> 82
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-δ_13的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 82
aucauuguca cugaugucau u 21
<210> 83
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-γ_1的shRNA的RNA效应子序列
<400> 83
caaguguauu acagaaugug u 21
<210> 84
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-γ_1的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 84
acacauucug uaauacacuu g 21
<210> 85
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-γ_2的shRNA的RNA效应子序列
<400> 85
ggacaggaug gaguucgcca g 21
<210> 86
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-γ_2的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 86
cuggcgaacu ccauccuguc c 21
<210> 87
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-γ_3的shRNA的RNA效应子序列
<400> 87
guucgccagu cgagagcuuc a 21
<210> 88
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-γ_3的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 88
ugaagcucuc gacuggcgaa c 21
<210> 89
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-γ_4的shRNA的RNA效应子序列
<400> 89
cagacaagca gacucuguug c 21
<210> 90
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-γ_4的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 90
gcaacagagu cugcuugucu g 21
<210> 91
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-γ_5的shRNA的RNA效应子序列
<400> 91
accagccccu caaggaucga g 21
<210> 92
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-γ_5的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 92
cucgauccuu gaggggcugg u 21
<210> 93
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-γ_6的shRNA的RNA效应子序列
<400> 93
gagcuucaga caagcagacu c 21
<210> 94
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-γ_6的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 94
gagucugcuu gucugaagcu c 21
<210> 95
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-γ_7的shRNA的RNA效应子序列
<400> 95
uccaagugua uuacagaaug u 21
<210> 96
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为CD3-γ_7的shRNA的RNA效应子互补序列
<400> 96
acauucugua auacacuugg a 21
<210> 97
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> shmiR的RNA茎环序列
<400> 97
acugugaagc agaugggu 18
<210> 98
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> pri-miRNA骨架的5'侧翼序列
<400> 98
gguauauugc uguugacagu 20
<210> 99
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> pri-miRNA骨架的3'侧翼序列
<400> 99
cgccuacugc cucggacuuc aa 22
<210> 100
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-TCR-α_1的shmiR的RNA效应子序列
<400> 100
uguuucaaag cuuuucucga c 21
<210> 101
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-TCR-α_1的shmiR的RNA效应子互补序列
<400> 101
ucgagaaaag cuuugaaaca 20
<210> 102
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-TCR-α_2的shmiR的RNA效应子序列
<400> 102
uuucaaagcu uuucucgacc a 21
<210> 103
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-TCR-α_2的shmiR的RNA效应子互补序列
<400> 103
ggucgagaaa agcuuugaaa 20
<210> 104
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-TCR-α_3的shmiR的RNA效应子序列
<400> 104
aaguuuaggu ucguaucugu u 21
<210> 105
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-TCR-α_3的shmiR的RNA效应子互补序列
<400> 105
acagauacga accuaaacuu 20
<210> 106
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-TCR-α_4的shmiR的RNA效应子序列
<400> 106
uuugaaaguu uagguucgua u 21
<210> 107
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-TCR-α_4的shmiR的RNA效应子互补序列
<400> 107
uacgaaccua aacuuucaaa 20
<210> 108
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-TCR-β_1的shmiR的RNA效应子序列
<400> 108
ccauucaccc accagcucag c 21
<210> 109
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-TCR-β_1的shmiR的RNA效应子互补序列
<400> 109
cugagcuggu gggugaaugg 20
<210> 110
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-TCR-β_2的shmiR的RNA效应子序列
<400> 110
guggccgaga cccucaggcg g 21
<210> 111
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-TCR-β_2的shmiR的RNA效应子互补序列
<400> 111
cgccugaggg ucucggccac 20
<210> 112
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-TCR-β_3的shmiR的RNA效应子序列
<400> 112
acuggacuug acagcggaag u 21
<210> 113
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-TCR-β_3的shmiR的RNA效应子互补序列
<400> 113
cuuccgcugu caaguccagu 20
<210> 114
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-TCR-β_4的shmiR的RNA效应子序列
<400> 114
cuugacagcg gaagugguug c 21
<210> 115
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-TCR-β_4的shmiR的RNA效应子互补序列
<400> 115
caaccacuuc cgcugucaag 20
<210> 116
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-TCR-β_5的shmiR的RNA效应子序列
<400> 116
ugacagcgga agugguugcg g 21
<210> 117
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-TCR-β_5的shmiR的RNA效应子互补序列
<400> 117
cgcaaccacu uccgcuguca 20
<210> 118
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-CD3-γ_1的shmiR的RNA效应子序列
<400> 118
ugaagcucuc gacuggcgaa c 21
<210> 119
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-CD3-γ_1的shmiR的RNA效应子互补序列
<400> 119
uucgccaguc gagagcuuca 20
<210> 120
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-CD3-γ_2的shmiR的RNA效应子序列
<400> 120
acauucugua auacacuugg a 21
<210> 121
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-CD3-γ_2的shmiR的RNA效应子互补序列
<400> 121
ccaaguguau uacagaaugu 20
<210> 122
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-CD3-δ_1的shmiR的RNA效应子序列
<400> 122
guaucuugaa ggggcucacu u 21
<210> 123
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-CD3-δ_1的shmiR的RNA效应子互补序列
<400> 123
agugagcccc uucaagauac 20
<210> 124
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-CD3-δ_2的shmiR的RNA效应子序列
<400> 124
aaagcagaag acucccaaag c 21
<210> 125
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-CD3-δ_2的shmiR的RNA效应子互补序列
<400> 125
cuuugggagu cuucugcuuu 20
<210> 126
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-CD3-δ_3的shmiR的RNA效应子序列
<400> 126
uguacugagc aucaucucga u 21
<210> 127
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-CD3-δ_3的shmiR的RNA效应子互补序列
<400> 127
ucgagaugau gcucaguaca 20
<210> 128
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-CD3-δ_4的shmiR的RNA效应子序列
<400> 128
aaugacauca gugacaauga u 21
<210> 129
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-CD3-δ_4的shmiR的RNA效应子互补序列
<400> 129
ucauugucac ugaugucauu 20
<210> 130
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-CD3-ε_1的shmiR的RNA效应子序列
<400> 130
auucaggcca gaauacaggu c 21
<210> 131
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-CD3-ε_1的shmiR的RNA效应子互补序列
<400> 131
accuguauuc uggccugaau 20
<210> 132
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-CD3-ε_2的shmiR的RNA效应子序列
<400> 132
gauucaggcc agaauacagg u 21
<210> 133
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-CD3-ε_2的shmiR的RNA效应子互补序列
<400> 133
ccuguauucu ggccugaauc 20
<210> 134
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-CD3-ε_3的shmiR的RNA效应子序列
<400> 134
uucuucauua ccaucuugcc c 21
<210> 135
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-CD3-ε_3的shmiR的RNA效应子互补序列
<400> 135
ggcaagaugg uaaugaagaa 20
<210> 136
<211> 107
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-TCR-α_1的shmiR的RNA序列
<400> 136
gguauauugc uguugacagu gagcgaucga gaaaagcuuu gaaacaacug ugaagcagau 60
ggguuguuuc aaagcuuuuc ucgaccgccu acugccucgg acuucaa 107
<210> 137
<211> 107
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-TCR-α_2的shmiR的RNA序列
<400> 137
gguauauugc uguugacagu gagcgagguc gagaaaagcu uugaaaacug ugaagcagau 60
ggguuuucaa agcuuuucuc gaccacgccu acugccucgg acuucaa 107
<210> 138
<211> 107
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-TCR-α_3的shmiR的RNA序列
<400> 138
gguauauugc uguugacagu gagcguacag auacgaaccu aaacuuacug ugaagcagau 60
ggguaaguuu agguucguau cuguucgccu acugccucgg acuucaa 107
<210> 139
<211> 107
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-TCR-α_4的shmiR的RNA序列
<400> 139
gguauauugc uguugacagu gagcguuacg aaccuaaacu uucaaaacug ugaagcagau 60
ggguuuugaa aguuuagguu cguaucgccu acugccucgg acuucaa 107
<210> 140
<211> 107
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-TCR-β_1的shmiR的RNA序列
<400> 140
gguauauugc uguugacagu gagcgacuga gcuggugggu gaauggacug ugaagcagau 60
ggguccauuc acccaccagc ucagccgccu acugccucgg acuucaa 107
<210> 141
<211> 107
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-TCR-β_2的shmiR的RNA序列
<400> 141
gguauauugc uguugacagu gagcgacgcc ugagggucuc ggccacacug ugaagcagau 60
ggguguggcc gagacccuca ggcggcgccu acugccucgg acuucaa 107
<210> 142
<211> 107
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-TCR-β_3的shmiR的RNA序列
<400> 142
gguauauugc uguugacagu gagcgucuuc cgcugucaag uccaguacug ugaagcagau 60
ggguacugga cuugacagcg gaagucgccu acugccucgg acuucaa 107
<210> 143
<211> 107
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-TCR-β_4的shmiR的RNA序列
<400> 143
gguauauugc uguugacagu gagcgacaac cacuuccgcu gucaagacug ugaagcagau 60
gggucuugac agcggaagug guugccgccu acugccucgg acuucaa 107
<210> 144
<211> 107
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-TCR-β_5的shmiR的RNA序列
<400> 144
gguauauugc uguugacagu gagcgacgca accacuuccg cugucaacug ugaagcagau 60
ggguugacag cggaaguggu ugcggcgccu acugccucgg acuucaa 107
<210> 145
<211> 107
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-CD3-γ_1的shmiR的RNA序列
<400> 145
gguauauugc uguugacagu gagcgauucg ccagucgaga gcuucaacug ugaagcagau 60
ggguugaagc ucucgacugg cgaaccgccu acugccucgg acuucaa 107
<210> 146
<211> 107
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-CD3-γ_2的shmiR的RNA序列
<400> 146
gguauauugc uguugacagu gagcgaccaa guguauuaca gaauguacug ugaagcagau 60
ggguacauuc uguaauacac uuggacgccu acugccucgg acuucaa 107
<210> 147
<211> 107
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-CD3-δ_1的shmiR的RNA序列
<400> 147
gguauauugc uguugacagu gagcguagug agccccuuca agauacacug ugaagcagau 60
ggguguaucu ugaaggggcu cacuucgccu acugccucgg acuucaa 107
<210> 148
<211> 107
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-CD3-δ_2的shmiR的RNA序列
<400> 148
gguauauugc uguugacagu gagcgacuuu gggagucuuc ugcuuuacug ugaagcagau 60
ggguaaagca gaagacuccc aaagccgccu acugccucgg acuucaa 107
<210> 149
<211> 107
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-CD3-δ_3的shmiR的RNA序列
<400> 149
gguauauugc uguugacagu gagcguucga gaugaugcuc aguacaacug ugaagcagau 60
ggguuguacu gagcaucauc ucgaucgccu acugccucgg acuucaa 107
<210> 150
<211> 107
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-CD3-δ_4的shmiR的RNA序列
<400> 150
gguauauugc uguugacagu gagcguucau ugucacugau gucauuacug ugaagcagau 60
ggguaaugac aucagugaca augaucgccu acugccucgg acuucaa 107
<210> 151
<211> 107
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-CD3-ε_1的shmiR的RNA序列
<400> 151
gguauauugc uguugacagu gagcgaaccu guauucuggc cugaauacug ugaagcagau 60
ggguauucag gccagaauac agguccgccu acugccucgg acuucaa 107
<210> 152
<211> 107
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-CD3-ε_2的shmiR的RNA序列
<400> 152
gguauauugc uguugacagu gagcguccug uauucuggcc ugaaucacug ugaagcagau 60
gggugauuca ggccagaaua caggucgccu acugccucgg acuucaa 107
<210> 153
<211> 107
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-CD3-ε_3的shmiR的RNA序列
<400> 153
gguauauugc uguugacagu gagcgaggca agaugguaau gaagaaacug ugaagcagau 60
ggguuucuuc auuaccaucu ugccccgccu acugccucgg acuucaa 107
<210> 154
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-TCR-α_1的shmiR的DNA序列
<400> 154
ggtatattgc tgttgacagt gagcgatcga gaaaagcttt gaaacaactg tgaagcagat 60
gggttgtttc aaagcttttc tcgaccgcct actgcctcgg acttcaa 107
<210> 155
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-TCR-α_2的shmiR的DNA序列
<400> 155
ggtatattgc tgttgacagt gagcgaggtc gagaaaagct ttgaaaactg tgaagcagat 60
gggttttcaa agcttttctc gaccacgcct actgcctcgg acttcaa 107
<210> 156
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-TCR-α_3的shmiR的DNA序列
<400> 156
ggtatattgc tgttgacagt gagcgtacag atacgaacct aaacttactg tgaagcagat 60
gggtaagttt aggttcgtat ctgttcgcct actgcctcgg acttcaa 107
<210> 157
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-TCR-α_4的shmiR的DNA序列
<400> 157
ggtatattgc tgttgacagt gagcgttacg aacctaaact ttcaaaactg tgaagcagat 60
gggttttgaa 70
<210> 158
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-TCR-β_1的shmiR的DNA序列
<400> 158
ggtatattgc tgttgacagt gagcgactga gctggtgggt gaatggactg tgaagcagat 60
gggtccattc acccaccagc tcagccgcct actgcctcgg acttcaa 107
<210> 159
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-TCR-β_2的shmiR的DNA序列
<400> 159
ggtatattgc tgttgacagt gagcgacgcc tgagggtctc ggccacactg tgaagcagat 60
gggtgtggcc gagaccctca ggcggcgcct actgcctcgg acttcaa 107
<210> 160
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-TCR-β_3的shmiR的DNA序列
<400> 160
ggtatattgc tgttgacagt gagcgtcttc cgctgtcaag tccagtactg tgaagcagat 60
gggtactgga cttgacagcg gaagtcgcct actgcctcgg acttcaa 107
<210> 161
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-TCR-β_4的shmiR的DNA序列
<400> 161
ggtatattgc tgttgacagt gagcgacaac cacttccgct gtcaagactg tgaagcagat 60
gggtcttgac agcggaagtg gttgccgcct actgcctcgg acttcaa 107
<210> 162
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-TCR-β_5的shmiR的DNA序列
<400> 162
ggtatattgc tgttgacagt gagcgacgca accacttccg ctgtcaactg tgaagcagat 60
gggttgacag cggaagtggt tgcggcgcct actgcctcgg acttcaa 107
<210> 163
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-CD3-γ_1的shmiR的DNA序列
<400> 163
ggtatattgc tgttgacagt gagcgattcg ccagtcgaga gcttcaactg tgaagcagat 60
gggttgaagc tctcgactgg cgaaccgcct actgcctcgg acttcaa 107
<210> 164
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-CD3-γ_2的shmiR的DNA序列
<400> 164
ggtatattgc tgttgacagt gagcgaccaa gtgtattaca gaatgtactg tgaagcagat 60
gggtacattc tgtaatacac ttggacgcct actgcctcgg acttcaa 107
<210> 165
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-CD3-δ_1的shmiR的DNA序列
<400> 165
ggtatattgc tgttgacagt gagcgtagtg agccccttca agatacactg tgaagcagat 60
gggtgtatct tgaaggggct cacttcgcct actgcctcgg acttcaa 107
<210> 166
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-CD3-δ_2的shmiR的DNA序列
<400> 166
ggtatattgc tgttgacagt gagcgacttt gggagtcttc tgctttactg tgaagcagat 60
gggtaaagca gaagactccc aaagccgcct actgcctcgg acttcaa 107
<210> 167
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-CD3-δ_3的shmiR的DNA序列
<400> 167
ggtatattgc tgttgacagt gagcgttcga gatgatgctc agtacaactg tgaagcagat 60
gggttgtact gagcatcatc tcgatcgcct actgcctcgg acttcaa 107
<210> 168
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-CD3-δ_4的shmiR的DNA序列
<400> 168
ggtatattgc tgttgacagt gagcgttcat tgtcactgat gtcattactg tgaagcagat 60
gggtaatgac atcagtgaca atgatcgcct actgcctcgg acttcaa 107
<210> 169
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-CD3-ε_1的shmiR的DNA序列
<400> 169
ggtatattgc tgttgacagt gagcgaacct gtattctggc ctgaatactg tgaagcagat 60
gggtattcag gccagaatac aggtccgcct actgcctcgg acttcaa 107
<210> 170
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-CD3-ε_2的shmiR的DNA序列
<400> 170
ggtatattgc tgttgacagt gagcgtcctg tattctggcc tgaatcactg tgaagcagat 60
gggtgattca ggccagaata caggtcgcct actgcctcgg acttcaa 107
<210> 171
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 称为shmiR-CD3-ε_3的shmiR的DNA序列
<400> 171
ggtatattgc tgttgacagt gagcgaggca agatggtaat gaagaaactg tgaagcagat 60
gggtttcttc attaccatct tgccccgcct actgcctcgg acttcaa 107
<210> 172
<211> 2055
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 编码称为shmiR-TCR-α、shmiR-TCR-β和shmiR-CD3-ε的shmiR的三重构建体pBL513的DNA序列
<400> 172
gcggccgcgt agtacgatga ctagcatgca gggcggtgcg gctcaggctc tgccccgcct 60
ccggggctat ttgcatacga ccatttccag taattcccag cagccaccgt agctatattt 120
ggtagaacaa cgagcacttt ctcaactcca gtcaataact acgttagttg cattacacat 180
tgggctaata taaatagagg ttaaatctct aggtcattta agagaagtcg gcctatgtgt 240
acagacattt gttccagggg ctttaaatag ctggtggtgg aactcaacta gtggatccgg 300
tatattgctg ttgacagtga gcgatcgaga aaagctttga aacaactgtg aagcagatgg 360
gttgtttcaa agcttttctc gaccgcctac tgcctcggac ttcaattttt aagcttagat 420
ctgttcggct ttacgtcacg cgagggcggc agggaggacg gaatggcggg gtttggggtg 480
ggtccctcct cgggggagcc ctgggaaaag aggactgcgt gtgggaagag aaggtggaaa 540
tggcgttttg gttgacatgt gccgcctgcg agcgtgctgc ggggaggggc cgagggcaga 600
ttcgggaatg atggcgcggg gtgggggcgt gggggctttc tcgggagagg cccttccctg 660
gaagtttggg gtgcgatggt gaggttctcg gggcacctct ggaggggcct cggcacggaa 720
agcgaccacc tgggagggcg tgtggggacc aggttttgcc tttagttttg cacacactgt 780
agttcatctt tatggagatg ctcatggcct cattgaagcc ccacggatct gggcaggaag 840
agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct gttagagaga 900
taattagaat taatttgact gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg tgacgtagaa 960
agtaataatt tcttgggtag tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg gactatcata 1020
tgcttaccgt aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg tggaaaggac 1080
gaggatccgg atccggtata ttgctgttga cagtgagcga cgcaaccact tccgctgtca 1140
actgtgaagc agatgggttg acagcggaag tggttgcggc gcctactgcc tcggacttca 1200
atttttaagc tttacagctc tggtagcggt aaccatgcgt atttgacaca cgaaggaact 1260
agggaaaagg cattaggtca tttcaagccg aaattcacat gtgctagaat ccagattcca 1320
tgctgaccga tgccccagga tatagaaaat gagaatctgg tccttacctt caagaacatt 1380
cttaaccgta atcagcctct ggtatcttag ctccaccctc actggttttt tcttgtttgt 1440
tgaaccggcc aagctgctgg cctccctcct caaccgttct gatcatgctt gctaaaatag 1500
tcaaaacccc ggccagttaa atatgcttta gcctgcttta ttatgattat ttttgttgtt 1560
ttggcaatga cctggctacc tgttgtttct cccactaaaa ctttttaagg gcagggaatt 1620
gatctagaaa aaaaaaagct agtggtaccg gtcctacgcg gggcccttta cccagggtgc 1680
cccgggcgct catttgcatg tcccacccaa caggtaaacc tgacaggtca tcgcggccag 1740
gtacgacctg gcggtcagag caccaaacat acgagccttg tgatgagttc cgttgcatga 1800
aattctccca aaggctccaa gatggacagg aaagggcgcg gttcggtcac cgtaagtaga 1860
ataggtgaaa gactcccgtg ccttataagg cctgtgggtg acttcttgct agcggtatat 1920
tgctgttgac agtgagcgag gcaagatggt aatgaagaaa ctgtgaagca gatgggtttc 1980
ttcattacca tcttgccccg cctactgcct cggacttcaa gaattctgta ccgtatatag 2040
catgactgcg gccgc 2055
<210> 173
<211> 2055
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 编码称为shmiR-TCR-α、shmiR-TCR-γ和shmiR-CD3-ε的shmiR的三重构建体pBL514的DNA序列
<400> 173
gcggccgcgt agtacgatga ctagcatgca gggcggtgcg gctcaggctc tgccccgcct 60
ccggggctat ttgcatacga ccatttccag taattcccag cagccaccgt agctatattt 120
ggtagaacaa cgagcacttt ctcaactcca gtcaataact acgttagttg cattacacat 180
tgggctaata taaatagagg ttaaatctct aggtcattta agagaagtcg gcctatgtgt 240
acagacattt gttccagggg ctttaaatag ctggtggtgg aactcaacta gtggatccgg 300
tatattgctg ttgacagtga gcgatcgaga aaagctttga aacaactgtg aagcagatgg 360
gttgtttcaa agcttttctc gaccgcctac tgcctcggac ttcaattttt aagcttagat 420
ctgttcggct ttacgtcacg cgagggcggc agggaggacg gaatggcggg gtttggggtg 480
ggtccctcct cgggggagcc ctgggaaaag aggactgcgt gtgggaagag aaggtggaaa 540
tggcgttttg gttgacatgt gccgcctgcg agcgtgctgc ggggaggggc cgagggcaga 600
ttcgggaatg atggcgcggg gtgggggcgt gggggctttc tcgggagagg cccttccctg 660
gaagtttggg gtgcgatggt gaggttctcg gggcacctct ggaggggcct cggcacggaa 720
agcgaccacc tgggagggcg tgtggggacc aggttttgcc tttagttttg cacacactgt 780
agttcatctt tatggagatg ctcatggcct cattgaagcc ccacggatct gggcaggaag 840
agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct gttagagaga 900
taattagaat taatttgact gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg tgacgtagaa 960
agtaataatt tcttgggtag tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg gactatcata 1020
tgcttaccgt aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg tggaaaggac 1080
gaggatccgg atccggtata ttgctgttga cagtgagcga ccaagtgtat tacagaatgt 1140
actgtgaagc agatgggtac attctgtaat acacttggac gcctactgcc tcggacttca 1200
atttttaagc tttacagctc tggtagcggt aaccatgcgt atttgacaca cgaaggaact 1260
agggaaaagg cattaggtca tttcaagccg aaattcacat gtgctagaat ccagattcca 1320
tgctgaccga tgccccagga tatagaaaat gagaatctgg tccttacctt caagaacatt 1380
cttaaccgta atcagcctct ggtatcttag ctccaccctc actggttttt tcttgtttgt 1440
tgaaccggcc aagctgctgg cctccctcct caaccgttct gatcatgctt gctaaaatag 1500
tcaaaacccc ggccagttaa atatgcttta gcctgcttta ttatgattat ttttgttgtt 1560
ttggcaatga cctggctacc tgttgtttct cccactaaaa ctttttaagg gcagggaatt 1620
gatctagaaa aaaaaaagct agtggtaccg gtcctacgcg gggcccttta cccagggtgc 1680
cccgggcgct catttgcatg tcccacccaa caggtaaacc tgacaggtca tcgcggccag 1740
gtacgacctg gcggtcagag caccaaacat acgagccttg tgatgagttc cgttgcatga 1800
aattctccca aaggctccaa gatggacagg aaagggcgcg gttcggtcac cgtaagtaga 1860
ataggtgaaa gactcccgtg ccttataagg cctgtgggtg acttctgcta gcggtatatt 1920
gctgttgaca gtgagcgagg caagatggta atgaagaaac tgtgaagcag atgggtttct 1980
tcattaccat cttgccccgc ctactgcctc ggacttcaag aattcctgta ccgtatatag 2040
catgactgcg gccgc 2055
<210> 174
<211> 2055
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 编码称为shmiR-TCR-α、shmiR-TCR-δ和shmiR-CD3-ε的shmiR的三重构建体pBL515的DNA序列
<400> 174
gcggccgcgt agtacgatga ctagcatgca gggcggtgcg gctcaggctc tgccccgcct 60
ccggggctat ttgcatacga ccatttccag taattcccag cagccaccgt agctatattt 120
ggtagaacaa cgagcacttt ctcaactcca gtcaataact acgttagttg cattacacat 180
tgggctaata taaatagagg ttaaatctct aggtcattta agagaagtcg gcctatgtgt 240
acagacattt gttccagggg ctttaaatag ctggtggtgg aactcaacta gtggatccgg 300
tatattgctg ttgacagtga gcgatcgaga aaagctttga aacaactgtg aagcagatgg 360
gttgtttcaa agcttttctc gaccgcctac tgcctcggac ttcaattttt aagcttagat 420
ctgttcggct ttacgtcacg cgagggcggc agggaggacg gaatggcggg gtttggggtg 480
ggtccctcct cgggggagcc ctgggaaaag aggactgcgt gtgggaagag aaggtggaaa 540
tggcgttttg gttgacatgt gccgcctgcg agcgtgctgc ggggaggggc cgagggcaga 600
ttcgggaatg atggcgcggg gtgggggcgt gggggctttc tcgggagagg cccttccctg 660
gaagtttggg gtgcgatggt gaggttctcg gggcacctct ggaggggcct cggcacggaa 720
agcgaccacc tgggagggcg tgtggggacc aggttttgcc tttagttttg cacacactgt 780
agttcatctt tatggagatg ctcatggcct cattgaagcc ccacggatct gggcaggaag 840
agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct gttagagaga 900
taattagaat taatttgact gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg tgacgtagaa 960
agtaataatt tcttgggtag tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg gactatcata 1020
tgcttaccgt aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg tggaaaggac 1080
gaggatccgg atccggtata ttgctgttga cagtgagcgt tcgagatgat gctcagtaca 1140
actgtgaagc agatgggttg tactgagcat catctcgatc gcctactgcc tcggacttca 1200
atttttaagc tttacagctc tggtagcggt aaccatgcgt atttgacaca cgaaggaact 1260
agggaaaagg cattaggtca tttcaagccg aaattcacat gtgctagaat ccagattcca 1320
tgctgaccga tgccccagga tatagaaaat gagaatctgg tccttacctt caagaacatt 1380
cttaaccgta atcagcctct ggtatcttag ctccaccctc actggttttt tcttgtttgt 1440
tgaaccggcc aagctgctgg cctccctcct caaccgttct gatcatgctt gctaaaatag 1500
tcaaaacccc ggccagttaa atatgcttta gcctgcttta ttatgattat ttttgttgtt 1560
ttggcaatga cctggctacc tgttgtttct cccactaaaa ctttttaagg gcagggaatt 1620
gatctagaaa aaaaaaagct agtggtaccg gtcctacgcg gggcccttta cccagggtgc 1680
cccgggcgct catttgcatg tcccacccaa caggtaaacc tgacaggtca tcgcggccag 1740
gtacgacctg gcggtcagag caccaaacat acgagccttg tgatgagttc cgttgcatga 1800
aattctccca aaggctccaa gatggacagg aaagggcgcg gttcggtcac cgtaagtaga 1860
ataggtgaaa gactcccgtg ccttataagg cctgtgggtg acttcttgct agcggtatat 1920
tgctgttgac agtgagcgag gcaagatggt aatgaagaaa ctgtgaagca gatgggtttc 1980
ttcattacca tcttgccccg cctactgcct cggacttcaa gaattctgta ccgtatatag 2040
catgactgcg gccgc 2055
<210> 175
<211> 1975
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 编码称为shmiR-TCR-β、shmiR-CD3-γ和shmiR-CD3-ε的shmiR的三重构建体pBL516的DNA序列
<400> 175
ccatttccag taattcccag cagccaccgt agctatattt ggtagaacaa cgagcacttt 60
ctcaactcca gtcaataact acgttagttg cattacacat tgggctaata taaatagagg 120
ttaaatctct aggtcattta agagaagtcg gcctatgtgt acagacattt gttccagggg 180
ctttaaatag ctggtggtgg aactcaacta gtggatccgg tatattgctg ttgacagtga 240
gcgacgcaac cacttccgct gtcaactgtg aagcagatgg gttgacagcg gaagtggttg 300
cggcgcctac tgcctcggac ttcaattttt aagcttagat ctgttcggct ttacgtcacg 360
cgagggcggc agggaggacg gaatggcggg gtttggggtg ggtccctcct cgggggagcc 420
ctgggaaaag aggactgcgt gtgggaagag aaggtggaaa tggcgttttg gttgacatgt 480
gccgcctgcg agcgtgctgc ggggaggggc cgagggcaga ttcgggaatg atggcgcggg 540
gtgggggcgt gggggctttc tcgggagagg cccttccctg gaagtttggg gtgcgatggt 600
gaggttctcg gggcacctct ggaggggcct cggcacggaa agcgaccacc tgggagggcg 660
tgtggggacc aggttttgcc tttagttttg cacacactgt agttcatctt tatggagatg 720
ctcatggcct cattgaagcc ccacggatct gggcaggaag agggcctatt tcccatgatt 780
ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct gttagagaga taattagaat taatttgact 840
gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg tgacgtagaa agtaataatt tcttgggtag 900
tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg gactatcata tgcttaccgt aacttgaaag 960
tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg tggaaaggac gaggatccgg atccggtata 1020
ttgctgttga cagtgagcga ccaagtgtat tacagaatgt actgtgaagc agatgggtac 1080
attctgtaat acacttggac gcctactgcc tcggacttca atttttaagc tttacagctc 1140
tggtagcggt aaccatgcgt atttgacaca cgaaggaact agggaaaagg cattaggtca 1200
tttcaagccg aaattcacat gtgctagaat ccagattcca tgctgaccga tgccccagga 1260
tatagaaaat gagaatctgg tccttacctt caagaacatt cttaaccgta atcagcctct 1320
ggtatcttag ctccaccctc actggttttt tcttgtttgt tgaaccggcc aagctgctgg 1380
cctccctcct caaccgttct gatcatgctt gctaaaatag tcaaaacccc ggccagttaa 1440
atatgcttta gcctgcttta ttatgattat ttttgttgtt ttggcaatga cctggctacc 1500
tgttgtttct cccactaaaa ctttttaagg gcagggaatt gatctagaaa aaaaaaagct 1560
agtggtaccg gtcctacgcg gggcccttta cccagggtgc cccgggcgct catttgcatg 1620
tcccacccaa caggtaaacc tgacaggtca tcgcggccag gtacgacctg gcggtcagag 1680
caccaaacat acgagccttg tgatgagttc cgttgcatga aattctccca aaggctccaa 1740
gatggacagg aaagggcgcg gttcggtcac cgtaagtaga ataggtgaaa gactcccgtg 1800
ccttataagg cctgtgggtg acttcttgct agcggtatat tgctgttgac agtgagcgag 1860
gcaagatggt aatgaagaaa ctgtgaagca gatgggtttc ttcattacca tcttgccccg 1920
cctactgcct cggacttcaa gaattctgta ccgtatatag catgactgcg gccgc 1975
<210> 176
<211> 2022
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 编码称为shmiR-TCR-α、shmiR-TCR-β和shmiR-CD3-ε的shmiR的三重构建体pBL528的DNA序列
<400> 176
gcggccgcgt agtacgatga ctagcatgca gggcggtgcg gctcaggctc tgccccgcct 60
ccggggctat ttgcatacga ccatttccag taattcccag cagccaccgt agctatattt 120
ggtagaacaa cgagcacttt ctcaactcca gtcaataact acgttagttg cattacacat 180
tgggctaata taaatagagg ttaaatctct aggtcattta agagaagtcg gcctatgtgt 240
acagacattt gttccagggg ctttaaatag ctggtggtgg aactcaacta gtggatccgg 300
tatattgctg ttgacagtga gcgatcgaga aaagctttga aacaactgtg aagcagatgg 360
gttgtttcaa agcttttctc gaccgcctac tgcctcggac ttcaattttt aagcttagat 420
ctgttcggct ttacgtcacg cgagggcggc agggaggacg gaatggcggg gtttggggtg 480
ggtccctcct cgggggagcc ctgggaaaag aggactgcgt gtgggaagag aaggtggaaa 540
tggcgttttg gttgacatgt gccgcctgcg agcgtgctgc ggggaggggc cgagggcaga 600
ttcgggaatg atggcgcggg gtgggggcgt gggggctttc tcgggagagg cccttccctg 660
gaagtttggg gtgcgatggt gaggttctcg gggcacctct ggaggggcct cggcacggaa 720
agcgaccacc tgggagggcg tgtggggacc aggttttgcc tttagttttg cacacactgt 780
agttcatctt tatggagatg ctcatggcct cattgaagcc ccacggatct gggcaggaag 840
agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct gttagagaga 900
taattagaat taatttgact gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg tgacgtagaa 960
agtaataatt tcttgggtag tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg gactatcata 1020
tgcttaccgt aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg tggaaaggac 1080
gaggatccgg atccggtata ttgctgttga cagtgagcga cgcaaccact tccgctgtca 1140
actgtgaagc agatgggttg acagcggaag tggttgcggc gcctactgcc tcggacttca 1200
atttttaagc tttacagctc tggtagcggt aaccatgcgt atttgacaca cgaaggaact 1260
agggaaaagg cattaggtca tttcaagccg aaattcacat gtgctagaat ccagattcca 1320
tgctgaccga tgccccagga tatagaaaat gagaatctgg tccttacctt caagaacatt 1380
cttaaccgta atcagcctct ggtatcttag ctccaccctc actggttttt tcttgtttgt 1440
tgaaccggcc aagctgctgg cctccctcct caaccgttct gatcatgctt gctaaaatag 1500
tcaaaacccc ggccagttaa atatgcttta gcctgcttta ttatgattat ttttgttgtt 1560
ttggcaatga cctggctacc tgttgtttct cccactaaaa ctttttaagg gcagggaatt 1620
gatctagaaa aaaaaaagct agaccggtga tctgctccgt cgccgccgcg ccgccatgaa 1680
attcgaacgc tgacgtcatc aacccgctcc aaggaatcgc gggcccagtg tcactaggcg 1740
ggaacaccca gcgcgcgtgc gccctggcag gaagatggct gtgagggaca ggggagtggc 1800
gccctgcaat atttgcatgt cgctatgtgt tctgggaaat caccataaac gtgaaatgtc 1860
tttggatttg ggaatcttat aagttctgta tgagaccact cggcttgcta gcggtatatt 1920
gctgttgaca gtgagcgagg caagatggta atgaagaaac tgtgaagcag atgggtttct 1980
tcattaccat cttgccccgc ctactgcctc ggacttcaag aa 2022
<210> 177
<211> 2022
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 编码称为shmiR-TCR-α、shmiR-CD3-γ和shmiR-CD3-ε的shmiR的三重构建体pBL529的DNA序列
<400> 177
gcggccgcgt agtacgatga ctagcatgca gggcggtgcg gctcaggctc tgccccgcct 60
ccggggctat ttgcatacga ccatttccag taattcccag cagccaccgt agctatattt 120
ggtagaacaa cgagcacttt ctcaactcca gtcaataact acgttagttg cattacacat 180
tgggctaata taaatagagg ttaaatctct aggtcattta agagaagtcg gcctatgtgt 240
acagacattt gttccagggg ctttaaatag ctggtggtgg aactcaacta gtggatccgg 300
tatattgctg ttgacagtga gcgatcgaga aaagctttga aacaactgtg aagcagatgg 360
gttgtttcaa agcttttctc gaccgcctac tgcctcggac ttcaattttt aagcttagat 420
ctgttcggct ttacgtcacg cgagggcggc agggaggacg gaatggcggg gtttggggtg 480
ggtccctcct cgggggagcc ctgggaaaag aggactgcgt gtgggaagag aaggtggaaa 540
tggcgttttg gttgacatgt gccgcctgcg agcgtgctgc ggggaggggc cgagggcaga 600
ttcgggaatg atggcgcggg gtgggggcgt gggggctttc tcgggagagg cccttccctg 660
gaagtttggg gtgcgatggt gaggttctcg gggcacctct ggaggggcct cggcacggaa 720
agcgaccacc tgggagggcg tgtggggacc aggttttgcc tttagttttg cacacactgt 780
agttcatctt tatggagatg ctcatggcct cattgaagcc ccacggatct gggcaggaag 840
agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct gttagagaga 900
taattagaat taatttgact gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg tgacgtagaa 960
agtaataatt tcttgggtag tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg gactatcata 1020
tgcttaccgt aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg tggaaaggac 1080
gaggatccgg atccggtata ttgctgttga cagtgagcga ccaagtgtat tacagaatgt 1140
actgtgaagc agatgggtac attctgtaat acacttggac gcctactgcc tcggacttca 1200
atttttaagc tttacagctc tggtagcggt aaccatgcgt atttgacaca cgaaggaact 1260
agggaaaagg cattaggtca tttcaagccg aaattcacat gtgctagaat ccagattcca 1320
tgctgaccga tgccccagga tatagaaaat gagaatctgg tccttacctt caagaacatt 1380
cttaaccgta atcagcctct ggtatcttag ctccaccctc actggttttt tcttgtttgt 1440
tgaaccggcc aagctgctgg cctccctcct caaccgttct gatcatgctt gctaaaatag 1500
tcaaaacccc ggccagttaa atatgcttta gcctgcttta ttatgattat ttttgttgtt 1560
ttggcaatga cctggctacc tgttgtttct cccactaaaa ctttttaagg gcagggaatt 1620
gatctagaaa aaaaaaagct agaccggtga tctgctccgt cgccgccgcg ccgccatgaa 1680
attcgaacgc tgacgtcatc aacccgctcc aaggaatcgc gggcccagtg tcactaggcg 1740
ggaacaccca gcgcgcgtgc gccctggcag gaagatggct gtgagggaca ggggagtggc 1800
gccctgcaat atttgcatgt cgctatgtgt tctgggaaat caccataaac gtgaaatgtc 1860
tttggatttg ggaatcttat aagttctgta tgagaccact cggctgctag cggtatattg 1920
ctgttgacag tgagcgaggc aagatggtaa tgaagaaact gtgaagcaga tgggtttctt 1980
cattaccatc ttgccccgcc tactgcctcg gacttcaaga at 2022
<210> 178
<211> 2017
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 编码称为shmiR-TCR-β、shmiR-CD3-γ和shmiR-CD3-ε的shmiR的三重构建体pBL530的DNA序列
<400> 178
gcggccgcgt agtacgatga ctagcatgca gggcggtgcg gctcaggctc tgccccgcct 60
ccggggctat ttgcatacga ccatttccag taattcccag cagccaccgt agctatattt 120
ggtagaacaa cgagcacttt ctcaactcca gtcaataact acgttagttg cattacacat 180
tgggctaata taaatagagg ttaaatctct aggtcattta agagaagtcg gcctatgtgt 240
acagacattt gttccagggg ctttaaatag ctggtggtgg aactcaacta gtggatccgg 300
tatattgctg ttgacagtga gcgacgcaac cacttccgct gtcaactgtg aagcagatgg 360
gttgacagcg gaagtggttg cggcgcctac tgcctcggac ttcaattttt aagcttagat 420
ctgttcggct ttacgtcacg cgagggcggc agggaggacg gaatggcggg gtttggggtg 480
ggtccctcct cgggggagcc ctgggaaaag aggactgcgt gtgggaagag aaggtggaaa 540
tggcgttttg gttgacatgt gccgcctgcg agcgtgctgc ggggaggggc cgagggcaga 600
ttcgggaatg atggcgcggg gtgggggcgt gggggctttc tcgggagagg cccttccctg 660
gaagtttggg gtgcgatggt gaggttctcg gggcacctct ggaggggcct cggcacggaa 720
agcgaccacc tgggagggcg tgtggggacc aggttttgcc tttagttttg cacacactgt 780
agttcatctt tatggagatg ctcatggcct cattgaagcc ccacggatct gggcaggaag 840
agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct gttagagaga 900
taattagaat taatttgact gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg tgacgtagaa 960
agtaataatt tcttgggtag tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg gactatcata 1020
tgcttaccgt aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg tggaaaggac 1080
gaggatccgg atccggtata ttgctgttga cagtgagcga ccaagtgtat tacagaatgt 1140
actgtgaagc agatgggtac attctgtaat acacttggac gcctactgcc tcggacttca 1200
atttttaagc tttacagctc tggtagcggt aaccatgcgt atttgacaca cgaaggaact 1260
agggaaaagg cattaggtca tttcaagccg aaattcacat gtgctagaat ccagattcca 1320
tgctgaccga tgccccagga tatagaaaat gagaatctgg tccttacctt caagaacatt 1380
cttaaccgta atcagcctct ggtatcttag ctccaccctc actggttttt tcttgtttgt 1440
tgaaccggcc aagctgctgg cctccctcct caaccgttct gatcatgctt gctaaaatag 1500
tcaaaacccc ggccagttaa atatgcttta gcctgcttta ttatgattat ttttgttgtt 1560
ttggcaatga cctggctacc tgttgtttct cccactaaaa ctttttaagg gcagggaatt 1620
gatctagaaa aaaaaaagct agtaccggtg atctgctccg tcgccgccgc gccgccatga 1680
aattcgaacg ctgacgtcat caacccgctc caaggaatcg cgggcccagt gtcactaggc 1740
gggaacaccc agcgcgcgtg cgccctggca ggaagatggc tgtgagggac aggggagtgg 1800
cgccctgcaa tatttgcatg tcgctatgtg ttctgggaaa tcaccataaa cgtgaaatgt 1860
ctttggattt gggaatctta taagttctgt atgagaccac tcggctagcg gtatattgct 1920
gttgacagtg agcgaggcaa gatggtaatg aagaaactgt gaagcagatg ggtttcttca 1980
ttaccatctt gccccgccta ctgcctcgga cttcaag 2017
<210> 179
<211> 12415
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 编码称为shmiR-TCR-β、shmiR-CD3-γ和shmiR-CD3-ε的shmiR以及抗CD19嵌合抗原受体(CAR)的三重构建体pBL531的DNA序列
<400> 179
tggaagggct aattcactcc caaagaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca 60
cacaaggcta cttccctgat tagcagaact acacaccagg gccaggggtc agatatccac 120
tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agataaggta gaagaggcca 180
ataaaggaga gaacaccagc ttgttacacc ctgtgagcct gcatgggatg gatgacccgg 240
agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac gtggcccgag 300
agctgcatcc ggagtacttc aagaactgct gatatcgagc ttgctacaag ggactttccg 360
ctggggactt tccagggagg cgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat 420
cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga 480
gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct 540
tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc 600
agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg cccgaacagg gacttgaaag 660
cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcacgg 720
caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga 780
aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta ttaagcgggg gagaattaga tcgcgatggg 840
aaaaaattcg gttaaggcca gggggaaaga aaaaatataa attaaaacat atagtatggg 900
caagcaggga gctagaacga ttcgcagtta atcctggcct gttagaaaca tcagaaggct 960
gtagacaaat actgggacag ctacaaccat cccttcagac aggatcagaa gaacttagat 1020
cattatataa tacagtagca accctctatt gtgtgcatca aaggatagag ataaaagaca 1080
ccaaggaagc tttagacaag atagaggaag agcaaaacaa aagtaagacc accgcacagc 1140
aagcggccgg ccgctgatct tcagacctgg aggaggagat atgagggaca attggagaag 1200
tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta ggagtagcac ccaccaaggc 1260
aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag agcagtggga ataggagctt tgttccttgg 1320
gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg cgcagcgtca atgacgctga cggtacaggc 1380
cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca gcagaacaat ttgctgaggg ctattgaggc 1440
gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag cagctccagg caagaatcct 1500
ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa 1560
actcatttgc accactgctg tgccttggaa tgctagttgg agtaataaat ctctggaaca 1620
gatttggaat cacacgacct ggatggagtg ggacagagaa attaacaatt acacaagctt 1680
aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa ccagcaagaa aagaatgaac aagaattatt 1740
ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa ttggtttaac ataacaaatt ggctgtggta 1800
tataaaatta ttcataatga tagtaggagg cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt 1860
actttctata gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca ttatcgtttc agacccacct 1920
cccaaccccg aggggacccg acaggcccga aggaatagaa gaagaaggtg gagagagaga 1980
cagagacaga tccattcgat tagtgaacgg atctcgacgg tatcgccttt aaaagaaaag 2040
gggggattgg ggggtacagt gcaggggaaa gaatagtaga cataatagca acagacatac 2100
aaactaaaga attacaaaaa caaattacaa aaattcaaaa ttttcgggtt tattacaggg 2160
acagcagaga tccagtttat cgaagcggcc gcgtagtacg atgactagca tgcagggcgg 2220
tgcggctcag gctctgcccc gcctccgggg ctatttgcat acgaccattt ccagtaattc 2280
ccagcagcca ccgtagctat atttggtaga acaacgagca ctttctcaac tccagtcaat 2340
aactacgtta gttgcattac acattgggct aatataaata gaggttaaat ctctaggtca 2400
tttaagagaa gtcggcctat gtgtacagac atttgttcca ggggctttaa atagctggtg 2460
gtggaactca actagtggat ccggtatatt gctgttgaca gtgagcgacg caaccacttc 2520
cgctgtcaac tgtgaagcag atgggttgac agcggaagtg gttgcggcgc ctactgcctc 2580
ggacttcaat ttttaagctt agatctgttc ggctttacgt cacgcgaggg cggcagggag 2640
gacggaatgg cggggtttgg ggtgggtccc tcctcggggg agccctggga aaagaggact 2700
gcgtgtggga agagaaggtg gaaatggcgt tttggttgac atgtgccgcc tgcgagcgtg 2760
ctgcggggag gggccgaggg cagattcggg aatgatggcg cggggtgggg gcgtgggggc 2820
tttctcggga gaggcccttc cctggaagtt tggggtgcga tggtgaggtt ctcggggcac 2880
ctctggaggg gcctcggcac ggaaagcgac cacctgggag ggcgtgtggg gaccaggttt 2940
tgcctttagt tttgcacaca ctgtagttca tctttatgga gatgctcatg gcctcattga 3000
agccccacgg atctgggcag gaagagggcc tatttcccat gattccttca tatttgcata 3060
tacgatacaa ggctgttaga gagataatta gaattaattt gactgtaaac acaaagatat 3120
tagtacaaaa tacgtgacgt agaaagtaat aatttcttgg gtagtttgca gttttaaaat 3180
tatgttttaa aatggactat catatgctta ccgtaacttg aaagtatttc gatttcttgg 3240
ctttatatat cttgtggaaa ggacgaggat ccggatccgg tatattgctg ttgacagtga 3300
gcgaccaagt gtattacaga atgtactgtg aagcagatgg gtacattctg taatacactt 3360
ggacgcctac tgcctcggac ttcaattttt aagctttaca gctctggtag cggtaaccat 3420
gcgtatttga cacacgaagg aactagggaa aaggcattag gtcatttcaa gccgaaattc 3480
acatgtgcta gaatccagat tccatgctga ccgatgcccc aggatataga aaatgagaat 3540
ctggtcctta ccttcaagaa cattcttaac cgtaatcagc ctctggtatc ttagctccac 3600
cctcactggt tttttcttgt ttgttgaacc ggccaagctg ctggcctccc tcctcaaccg 3660
ttctgatcat gcttgctaaa atagtcaaaa ccccggccag ttaaatatgc tttagcctgc 3720
tttattatga ttatttttgt tgttttggca atgacctggc tacctgttgt ttctcccact 3780
aaaacttttt aagggcaggg aattgatcta gaaaaaaaaa agctagtggt accggtgatc 3840
tgctccgtcg ccgccgcgcc gccatgaaat tcgaacgctg acgtcatcaa cccgctccaa 3900
ggaatcgcgg gcccagtgtc actaggcggg aacacccagc gcgcgtgcgc cctggcagga 3960
agatggctgt gagggacagg ggagtggcgc cctgcaatat ttgcatgtcg ctatgtgttc 4020
tgggaaatca ccataaacgt gaaatgtctt tggatttggg aatcttataa gttctgtatg 4080
agaccactcg gctagcggta tattgctgtt gacagtgagc gaggcaagat ggtaatgaag 4140
aaactgtgaa gcagatgggt ttcttcatta ccatcttgcc ccgcctactg cctcggactt 4200
caatttttcg gaattctgta ccgtatatag catgactgcg gccgcttcga tgagtaattc 4260
atacaaaagg actcgcccct gccttgggga atcccaggga ccgtcgttaa actcccacta 4320
acgtagaacc cagagatcgc tgcgttcccg ccccctcacc cgcccgctct cgtcatcact 4380
gaggtggaga agagcatgcg tgaggctccg gtgcccgtca gtgggcagag cgcacatcgc 4440
ccacagtccc cgagaagttg gggggagggg tcggcaattg aaccggtgcc tagagaaggt 4500
ggcgcggggt aaactgggaa agtgatgtcg tgtactggct ccgccttttt cccgagggtg 4560
ggggagaacc gtatataagt gcagtagtcg ccgtgaacgt tctttttcgc aacgggtttg 4620
ccgccagaac acaggtaagt gccgtgtgtg gttcccgcgg gcctggcctc tttacgggtt 4680
atggcccttg cgtgccttga attacttcca cgcccctggc tgcagtacgt gattcttgat 4740
cccgagcttc gggttggaag tgggtgggag agttcgaggc cttgcgctta aggagcccct 4800
tcgcctcgtg cttgagttga ggcctggctt gggcgctggg gccgccgcgt gcgaatctgg 4860
tggcaccttc gcgcctgtct cgctgctttc gataagtctc tagccattta aaatttttga 4920
tgacctgctg cgacgctttt tttctggcaa gatagtcttg taaatgcggg ccaagatctg 4980
cacactggta tttcggtttt tggggccgcg ggcggcgacg gggcccgtgc gtcccagcgc 5040
acatgttcgg cgaggcgggg cctgcgagcg cggccaccga gaatcggacg ggggtagtct 5100
caagctggcc ggcctgctct ggtgcctggc ctcgcgccgc cgtgtatcgc cccgccctgg 5160
gcggcaaggc tggcccggtc ggcaccagtt gcgtgagcgg aaagatggcc gcttcccggc 5220
cctgctgcag ggagctcaaa atggaggacg cggcgctcgg gagagcgggc gggtgagtca 5280
cccacacaaa ggaaaagggc ctttccgtcc tcagccgtcg cttcatgtga ctccacggag 5340
taccgggcgc cgtccaggca cctcgattag ttctcgagct cgagcttttg gagtacgtcg 5400
tctttaggtt ggggggaggg gttttatgcg atggagtttc cccacactga gtgggtggag 5460
actgaagtta ggccagcttg gcacttgatg taattctcct tggaatttgc cctttttgag 5520
tttggatctt ggttcattct caagcctcag acagtggttc aaagtttttt tcttccattt 5580
caggtgtcgt gattcgaatt cgccgccacc atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg 5640
ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg ccggacatcc agatgacaca gactacatcc 5700
tccctgtctg cctctctggg agacagagtc accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt 5760
agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac 5820
catacatcaa gattacactc aggagtccca tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca 5880
gattattctc tcaccattag caacctggag caagaagata ttgccactta cttttgccaa 5940
cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga ggggggacca agctggagat cacaggtggc 6000
ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc ggcggatctg aggtgaaact gcaggagtca 6060
ggacctggcc tggtggcgcc ctcacagagc ctgtccgtca catgcactgt ctcaggggtc 6120
tcattacccg actatggtgt aagctggatt cgccagcctc cacgaaaggg tctggagtgg 6180
ctgggagtaa tatggggtag tgaaaccaca tactataatt cagctctcaa atccagactg 6240
accatcatca aggacaactc caagagccaa gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact 6300
gatgacacag ccatttacta ctgtgccaaa cattattact acggtggtag ctatgctatg 6360
gactactggg gccaaggaac ctcagtcacc gtctcctcaa ccacgacgcc agcgccgcga 6420
ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc 6480
cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg agggggctgg acttcgcctg tgatttctgg 6540
gtgctggtcg ttgtgggcgg cgtgctggcc tgctacagcc tgctggtgac agtggccttc 6600
atcatctttt gggtgaggag caagcggagc agactgctgc acagcgacta catgaacatg 6660
accccccgga ggcctggccc cacccggaag cactaccagc cctacgcccc tcccagggat 6720
ttcgccgcct accggagcaa acggggcaga aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca 6780
tttatgagac cagtacaaac tactcaagag gaagatggct gtagctgccg atttccagaa 6840
gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg 6900
tacaagcagg gccagaacca gctctataac gagctcaatc taggacgaag agaggagtac 6960
gatgttttgg acaagagacg tggccgggac cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag 7020
aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg cagaaagata agatggcgga ggcctacagt 7080
gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt 7140
ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc 7200
gagggcagag gcagcctgct gacatgtggc gacgtggaag agaaccctgg ccccatgtgg 7260
ctgcagagcc tgctgctctt gggcactgtg gcctgcagca tctctcgcaa agtgtgtaac 7320
ggaataggta ttggtgaatt taaagactca ctctccataa atgctacgaa tattaaacac 7380
ttcaaaaact gcacctccat cagtggcgat ctccacatcc tgccggtggc atttaggggt 7440
gactccttca cacatactcc tcctctggat ccacaggaac tggatattct gaaaaccgta 7500
aaggaaatca cagggttttt gctgattcag gcttggcctg aaaacaggac ggacctccat 7560
gcctttgaga acctagaaat catacgcggc aggaccaagc aacatggtca gttttctctt 7620
gcagtcgtca gcctgaacat aacatccttg ggattacgct ccctcaagga gataagtgat 7680
ggagatgtga taatttcagg aaacaaaaat ttgtgctatg caaatacaat aaactggaaa 7740
aaactgtttg ggacctccgg tcagaaaacc aaaattataa gcaacagagg tgaaaacagc 7800
tgcaaggcca caggccaggt ctgccatgcc ttgtgctccc ccgagggctg ctggggcccg 7860
gagcccaggg actgcgtctc ttgccggaat gtcagccgag gcagggaatg cgtggacaag 7920
tgcaaccttc tggagggtga gccaagggag tttgtggaga actctgagtg catacagtgc 7980
cacccagagt gcctgcctca ggccatgaac atcacctgca caggacgggg accagacaac 8040
tgtatccagt gtgcccacta cattgacggc ccccactgcg tcaagacctg cccggcagga 8100
gtcatgggag aaaacaacac cctggtctgg aagtacgcag acgccggcca tgtgtgccac 8160
ctgtgccatc caaactgcac ctacggatgc actgggccag gtcttgaagg ctgtccaacg 8220
aatgggccta agatcccgtc catcgccact gggatggtgg gggccctcct cttgctgctg 8280
gtggtggccc tggggatcgg cctcttcatg taataatcta gaccgcgtct ggaacaatca 8340
acctctggat tacaaaattt gtgaaagatt gactggtatt cttaactatg ttgctccttt 8400
tacgctatgt ggatacgctg ctttaatgcc tttgtatcat gctattgctt cccgtatggc 8460
tttcattttc tcctccttgt ataaatcctg gttgctgtct ctttatgagg agttgtggcc 8520
cgttgtcagg caacgtggcg tggtgtgcac tgtgtttgct gacgcaaccc ccactggttg 8580
gggcattgcc accacctgtc agctcctttc cgggactttc gctttccccc tccctattgc 8640
cacggcggaa ctcatcgccg cctgccttgc ccgctgctgg acaggggctc ggctgttggg 8700
cactgacaat tccgtggtgt tgtcggggaa gctgacgtcc tttccatggc tgctcgcctg 8760
tgttgccacc tggattctgc gcgggacgtc cttctgctac gtcccttcgg ccctcaatcc 8820
agcggacctt ccttcccgcg gcctgctgcc ggctctgcgg cctcttccgc gtcttcgcct 8880
tcgccctcag acgagtcgga tctccctttg ggccgcctcc ccgcctggaa ttaattctgc 8940
agtcgagacc tagaaaaaca tggagcaatc acaagtagca atacagcagc taccaatgct 9000
gattgtgcct ggctagaagc acaagaggag gaggaggtgg gttttccagt cacacctcag 9060
gtacctttaa gaccaatgac ttacaaggca gctgtagatc ttagccactt tttaaaagaa 9120
aagaggggac tggaagggct aattcactcc caacgaagac aagatatcct tgatctgtgg 9180
atctaccaca cacaaggcta cttccctgat tagcagaact acacaccagg gccaggggtc 9240
agatatccac tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agataaggta 9300
gaagaggcca ataaaggaga gaacaccagc ttgttacacc ctgtgagcct gcatgggatg 9360
gatgacccgg agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac 9420
gtggcccgag agctgcatcc ggagtacttc aagaactgct gatatcgagc ttgctacaag 9480
ggactttccg ctggggactt tccagggagg cgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga 9540
gccctcagat cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga 9600
ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata 9660
aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta 9720
gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtagta gttcatgtca 9780
tcttattatt cagtatttat aacttgcaaa gaaatgaata tcagagagtg agaggccttg 9840
acattgctag cgttttaccg tcgacctcta gctagagctt ggcgtaatca tggtcatagc 9900
tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca 9960
taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct 10020
cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac 10080
gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc 10140
tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt 10200
tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg 10260
ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg 10320
agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat 10380
accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta 10440
ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct 10500
gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc 10560
ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa 10620
gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg 10680
taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag 10740
tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt 10800
gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta 10860
cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc 10920
agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca 10980
cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa 11040
cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat 11100
ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct 11160
taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt 11220
tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat 11280
ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta 11340
atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg 11400
gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt 11460
tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg 11520
cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg 11580
taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc 11640
ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa 11700
ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac 11760
cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt 11820
ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg 11880
gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa 11940
gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata 12000
aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc gacggatcgg 12060
gagatcaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat 12120
ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat 12180
gtatcttatc atgtctggat caactggata actcaagcta accaaaatca tcccaaactt 12240
cccaccccat accctattac cactgccaat tacctgtggt ttcatttact ctaaacctgt 12300
gattcctctg aattattttc attttaaaga aattgtattt gttaaatatg tactacaaac 12360
ttagtagttt ttaaagaaat tgtatttgtt aaatatgtac tacaaactta gtagt 12415
<210> 180
<211> 1508
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 180
uuuugaaacc cuucaaaggc agagacuugu ccagccuaac cugccugcug cuccuagcuc 60
cugaggcuca gggcccuugg cuucuguccg cucugcucag ggcccuccag cguggccacu 120
gcucagccau gcuccugcug cucgucccag ugcucgaggu gauuuuuacc cugggaggaa 180
ccagagccca gucggugacc cagcuuggca gccacgucuc ugucucugaa ggagcccugg 240
uucugcugag gugcaacuac ucaucgucug uuccaccaua ucucuucugg uaugugcaau 300
accccaacca aggacuccag cuucuccuga aguacacauc agcggccacc cugguuaaag 360
gcaucaacgg uuuugaggcu gaauuuaaga agagugaaac cuccuuccac cugacgaaac 420
ccucagccca uaugagcgac gcggcugagu acuucugugc ugugagugau cucgaaccga 480
acagcagugc uuccaagaua aucuuuggau cagggaccag acucagcauc cggccaaaua 540
uccagaaccc ugacccugcc guguaccagc ugagagacuc uaaauccagu gacaagucug 600
ucugccuauu caccgauuuu gauucucaaa caaauguguc acaaaguaag gauucugaug 660
uguauaucac agacaaaacu gugcuagaca ugaggucuau ggacuucaag agcaacagug 720
cuguggccug gagcaacaaa ucugacuuug caugugcaaa cgccuucaac aacagcauua 780
uuccagaaga caccuucuuc cccagcccag aaaguuccug ugaugucaag cuggucgaga 840
aaagcuuuga aacagauacg aaccuaaacu uucaaaaccu gucagugauu ggguuccgaa 900
uccuccuccu gaaaguggcc ggguuuaauc ugcucaugac gcugcggcug ugguccagcu 960
gagaucugca agauuguaag acagccugug cucccucgcu ccuuccucug cauugccccu 1020
cuucucccuc uccaaacaga gggaacucuc cuacccccaa ggaggugaaa gcugcuacca 1080
ccucugugcc cccccgguaa ugccaccaac uggauccuac ccgaauuuau gauuaagauu 1140
gcugaagagc ugccaaacac ugcugccacc cccucuguuc ccuuauugcu gcuugucacu 1200
gccugacauu cacggcagag gcaaggcugc ugcagccucc ccuggcugug cacauucccu 1260
ccugcucccc agagacugcc uccgccaucc cacagaugau ggaucuucag uggguucucu 1320
ugggcucuag guccuggaga auguugugag ggguuuauuu uuuuuuaaua guguucauaa 1380
agaaauacau aguauucuuc uucucaagac guggggggaa auuaucucau uaucgaggcc 1440
cugcuaugcu gugugucugg gcguguugua uguccugcug ccgaugccuu cauuaaaaug 1500
auuuggaa 1508
<210> 181
<211> 1420
<212> RNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 181
ggacaacaga gcagucauug ccaagggagg agcaucucuc aguuaauagu cuccaggucu 60
uguccacagg gagauuuucc ugaauacauc ucucagccuu cucacugccu agccauguuc 120
cuagugacca uucugcugcu cagcgcguuc uucucacuga gaggaaacag ugcccagucc 180
guggaccagc cugaugcuca cgucacgcuc uaugaaggag ccucccugga gcucagaugc 240
aguuauucau acagugcagc accuuaccuc uucugguacg ugcaguaucc uggccagagc 300
cuccaguuuc uccucaaaua caucacagga gacgccguug uuaaaggcac caagggcuuu 360
gaggccgagu uuaggaagag uaacuccucu uucaaccuga agaaaucccc agcccauugg 420
agcgacucag ccaaguacuu cugugcacug gagguuucca auaccgacaa agucgucuuu 480
ggaacaggga ccagauuaca agucucacca aacauccaga acccagaacc ugcuguguac 540
caguuaaaag auccucgguc ucaggacagc acccucugcc uguucaccga cuuugacucc 600
caaaucaaug ugccgaaaac cauggaaucu ggaacguuca ucacugacaa aacugugcug 660
gacaugaaag cuauggauuc caagagcaau ggggccauug ccuggagcaa ccagacaagc 720
uucaccugcc aagauaucuu caaagagacc aacgccaccu accccaguuc agacguuccc 780
ugugaugcca cguugaccga gaaaagcuuu gaaacagaua cgaaccuaaa cuuucaaaac 840
cugucaguua ugggacuccg aauccuccug cugaaaguag cgggauuuaa ccugcucaug 900
acgcugaggc ugugguccag uugaggucug caagacugac agagccugac ucccaaguuc 960
cguccuccuc accccuccgc ucccucuuca agccaaaagg agccggcugu cuggggucug 1020
guuggcccug auucacaauc ccaccuggau cucccagauu ugugaggaag guugcuggag 1080
agcuaagcgc ugcugccgca cccacucagc ucccucacug cugcugacca uucacaaaaa 1140
aaaaaaaaac ggcaggggcg gggcuucucc uggaucugaa gaccccuccc ccauggcaga 1200
cuccccuaua aaaucucuug gagaauguug uaaaaaauau ggguuuuuuu uuuuuuggcg 1260
gguuuacuuu uuuaagcauc cauaaagaaa ugcauauuac ucuuucauca agguguagaa 1320
auuaucucau ugucuagacc cuccugcuac uguguguauu gagccacauu guauauuauu 1380
cugcugccca ugacaucauu aaaggugauu cagaaaaacc 1420
<210> 182
<211> 1329
<212> RNA
<213> 食蟹猕猴(Macaca fascicularis)
<400> 182
augcuccugg uguucauccc acugcugggg auacauuuug uccugagaac ugccagagcc 60
cagucaguga cccagccuga uauccauauc acugucucug aaggagccuc acuggaguug 120
agauguaacu auuccuaugg ggcaacaccu ucucucuucu gguaugucca gucccccggc 180
caaggccucc agcugcuccu gaaguacuuu ucaggagaca cugugguuca aggcauuaaa 240
ggcuuugagg cugaauuuaa gaggagucaa uauuccuuca accugaggaa acccucugug 300
cauuggagug augcugcuga guacuucugu gcugcaggug ccacagugcc ugggucugca 360
gggggagcug aacacaaacu gccuaugcua gagaaguuuu cagagacuca guguaucuuc 420
cuguggcauu uucaaagauc ucuugcuuuu aggaugccug ucuucucuug cauugauagu 480
uugauguuuc uucauacugc uuugaaaaug ggugagcaga ggagagagug uggggcugca 540
ucuuccuacc gaucuggcau ugcccagaag auaacucaaa cccaaccagc aauguucgug 600
caggaaaagg aggcugugac ucuggacugc acauaugaca ccagugauca aaauuacggu 660
cuauucuggu acaagcaacc cagcagugga gagaugauuu uucuuauucu ucagaugucu 720
uaugacaagc aaaaugcaac agaaggacgc uacucauuga acuuccagaa ggcaagaaaa 780
uccgucaacc uugucaucuc ugcuucacaa gugggggacu cagcaacgua uuucugugca 840
auguacccgu caggaaacag agcucuuguc uuuggaaagg gcacaagacu uucugugauu 900
ccaaauaucc agaacccuga cccugccgug uaccagcuga gaggcucuaa auccaaugac 960
accucugucu gccuauuuac ugauuuugau ucuguaauga augugucaca aagcaaggau 1020
ucugacgugc auaucacaga caaaacugug cuagacauga ggucuaugga cuuuaagagc 1080
aacggugcug uggccuggag caacaaaucc gauuuugcau guacaagcgc cuucaaggac 1140
agcguuauuc cagcagacac cuucuucccc ggcacagaaa gugucuguga ugccaaccug 1200
guugagaaaa gcuuugaaac agauaugaac cuaaacuuuc aaaaccuguc agugauuggg 1260
uuccgaaucc uccuccugaa aguggccggg uuuaaucugc ucaugacgcu gcggcugugg 1320
uccagcuga 1329
<210> 183
<211> 1151
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 183
cuggucuaga auauuccaca ucugcucuca cucugccaug gacuccugga ccuucugcug 60
ugugucccuu ugcauccugg uagcgaagca uacagaugcu ggaguuaucc agucaccccg 120
ccaugaggug acagagaugg gacaagaagu gacucugaga uguaaaccaa uuucaggcca 180
caacucccuu uucugguaca gacagaccau gaugcgggga cuggaguugc ucauuuacuu 240
uaacaacaac guuccgauag augauucagg gaugcccgag gaucgauucu cagcuaagau 300
gccuaaugca ucauucucca cucugaagau ccagcccuca gaacccaggg acucagcugu 360
guacuucugu gccagcaguu ucucgaccug uucggcuaac uauggcuaca ccuucgguuc 420
ggggaccagg uuaaccguug uagaggaccu gaacaaggug uucccacccg aggucgcugu 480
guuugagcca ucagaagcag agaucuccca cacccaaaag gccacacugg ugugccuggc 540
cacaggcuuc uuccccgacc acguggagcu gagcuggugg gugaauggga aggaggugca 600
cagugggguc agcacagacc cgcagccccu caaggagcag cccgcccuca augacuccag 660
auacugccug agcagccgcc ugagggucuc ggccaccuuc uggcagaacc cccgcaacca 720
cuuccgcugu caaguccagu ucuacgggcu cucggagaau gacgagugga cccaggauag 780
ggccaaaccc gucacccaga ucgucagcgc cgaggccugg gguagagcag acuguggcuu 840
uaccucggug uccuaccagc aagggguccu gucugccacc auccucuaug agauccugcu 900
agggaaggcc acccuguaug cugugcuggu cagcgcccuu guguugaugg ccauggucaa 960
gagaaaggau uucugaaggc agcccuggaa guggaguuag gagcuucuaa cccgucaugg 1020
uucaauacac auucuucuuu ugccagcgcu ucugaagagc ugcucucacc ucucugcauc 1080
ccaauagaua ucccccuaug ugcaugcaca ccugcacacu cacggcugaa aucucccuaa 1140
cccaggggga c 1151
<210> 184
<211> 924
<212> RNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 184
augaacaagu ggguuuucug cuggguaacc cuuugucucc uuacuguaga gaccacacau 60
ggugauggug gcaucauuac ucagacaccc aaauuccuga uuggucagga agggcaaaaa 120
cugaccuuga aaugucaaca gaauuucaau caugauacaa uguacuggua ccgacaggau 180
ucagggaaag gauugagacu gaucuacuau ucaauaacug aaaacgaucu ucaaaaaggc 240
gaucuaucug aaggcuauga ugcgucucga gagaagaagu caucuuuuuc ucucacugug 300
acaucugccc agaagaacga gauggccguu uuucucugug ccagcaguau agggacagaa 360
uaugaacagu acuucggucc cggcaccagg cucacgguuu uagaggaucu gagaaaugug 420
acuccaccca aggucuccuu guuugagcca ucaaaagcag agauugcaaa caaacaaaag 480
gcuacccucg ugugcuuggc caggggcuuc uucccugacc acguggagcu gagcuggugg 540
gugaauggca aggaggucca cagugggguc agcacggacc cucaggccua caaggagagc 600
aauuauagcu acugccugag cagccgccug agggucucug cuaccuucug gcacaauccu 660
cgaaaccacu uccgcugcca agugcaguuc caugggcuuu cagaggagga caauuggcca 720
gagggcucac ccaaaccugu cacacagaac aucagugcag aggccugggg ccgagcagac 780
uguggaauca cuucagcauc cuaucaucag gggguucugu cugcaaccau ccucuaugag 840
auccuacugg ggaaggccac ccuauaugcu gugcugguca guggccuggu gcugauggcc 900
auggucaaga aaaaaaauuc cuga 924
<210> 185
<211> 387
<212> RNA
<213> 食蟹猕猴(Macaca fascicularis)
<400> 185
aggaccugaa aaagguguuc ccacccaagg uugcuguguu ugagccauca gaagcagaga 60
ucucccacac ccaaaaggcc acgcuggugu gccuggccac aggcuucuac cccgaccacg 120
uggagcugag cuggugggug aacgggaaag aggugcacag uggggucagc acggacccac 180
agccccucaa ggagcagccc gcccucgagg acuccagaua cugccugagc agccgccuga 240
gggucucggc caccuucugg cacaaccccc gcaaccacuu ccgcugccaa guccaguucu 300
augggcucuc ggaggaugac gaguggacug aggacaggga caagcccauc acccaaaaga 360
ucagcgccga ggucuggggu agagcag 387
<210> 186
<211> 549
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 186
auggaacagg ggaagggccu ggcuguccuc auccuggcua ucauucuucu ucaagguacu 60
uuggcccagu caaucaaagg aaaccacuug guuaaggugu augacuauca agaagauggu 120
ucgguacuuc ugacuuguga ugcagaagcc aaaaauauca caugguuuaa agaugggaag 180
augaucggcu uccuaacuga agauaaaaaa aaauggaauc ugggaaguaa ugccaaggac 240
ccucgaggga uguaucagug uaaaggauca cagaacaagu caaaaccacu ccaaguguau 300
uacagaaugu gucagaacug cauugaacua aaugcagcca ccauaucugg cuuucucuuu 360
gcugaaaucg ucagcauuuu cguccuugcu guuggggucu acuucauugc uggacaggau 420
ggaguucgcc agucgagagc uucagacaag cagacucugu ugcccaauga ccagcucuac 480
cagccccuca aggaucgaga agaugaccag uacagccacc uucaaggaaa ccaguugagg 540
aggaauuga 549
<210> 187
<211> 549
<212> RNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 187
auggagcaga ggaagggucu ggcuggccuc uuccugguga ucucucuucu ucaaggcacu 60
guagcccaga caaauaaagc aaagaauuug guacaagugg auggcagccg aggagacggu 120
ucuguacuuc ugacuugugg cuugacugac aagacuauca aguggcuuaa agacgggagc 180
auaauaaguc cucuaaaugc aacuaaaaac acauggaauc ugggcaacaa ugccaaagac 240
ccucgaggca cguaucagug ucaaggagca aaggagacgu caaacccccu gcaaguguau 300
uacagaaugu gugaaaacug cauugagcua aacauaggca ccauauccgg cuuuaucuuc 360
gcugagguca ucagcaucuu cuuccuugcu cuugguguau aucucauugc gggacaggau 420
ggaguucgcc agucaagagc uucagacaag cagacucugu ugcaaaauga acagcuguac 480
cagccccuca aggaccggga auaugaccag uacagccauc uccaaggaaa ccaacugagg 540
aagaaguga 549
<210> 188
<211> 546
<212> RNA
<213> 食蟹猕猴(Macaca fascicularis)
<400> 188
augguucagg ggaagggccu gacuggcuuc auccuggcua ucauucuucu ucaagguagu 60
uuggcccaau cauuugaaga aaaccgcaag cuuaacgugu auaaccaaga agaugguuca 120
guacuucuga cuugucaugu gaaaaacaca aauaucacau gguuuaaaga agggaagaug 180
auagacaucc uaacugcaca uaaaaauaaa uggaaucugg gaaguaauac caaggacccu 240
cgaggggugu aucaguguaa aggaucaaag gacaagucaa aaacacucca aguguauuac 300
agaauguguc agaacugcau ugaacuaaau gcagccacca uauugggcuu ugucuuugcu 360
gaaaucauca gcauuuucuu ccuugcuguu ggggucuacu ucauugcugg acaggaugga 420
guucgccagu cgagagcuuc agacaagcag acucuguugc cuaaugacca gcucuaccag 480
ccccucaagg aucgagaaga ugaccaguac agucaccuuc aagggaacca guugaggaug 540
aauuga 546
<210> 189
<211> 516
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 189
auggaacaua gcacguuucu cucuggccug guacuggcua cccuucucuc gcaagugagc 60
cccuucaaga uaccuauaga ggaacuugag gacagagugu uugugaauug caauaccagc 120
aucacauggg uagagggaac ggugggaaca cugcucucag acauuacaag acuggaccug 180
ggaaaacgca uccuggaccc acgaggaaua uauaggugua augggacaga uauauacaag 240
gacaaagaau cuaccgugca aguucauuau cgaaugugcc agagcugugu ggagcuggau 300
ccagccaccg uggcuggcau cauugucacu gaugucauug ccacucugcu ccuugcuuug 360
ggagucuucu gcuuugcugg acaugagacu ggaaggcugu cuggggcugc cgacacacaa 420
gcucuguuga ggaaugacca ggucuaucag ccccuccgag aucgagauga ugcucaguac 480
agccaccuug gaggaaacug ggcucggaac aaguga 516
<210> 190
<211> 522
<212> RNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 190
auggaacaca gcgggauucu ggcuagucug auacugauug cuguucuccc ccaagggagc 60
cccuucaaga uacaagugac cgaauaugag gacaaaguau uugugaccug caauaccagc 120
gucaugcauc uagauggaac gguggaagga ugguuugcaa agaauaaaac acucaacuug 180
ggcaaaggcg uucuggaccc acgagggaua uaucugugua augggacaga gcagcuggca 240
aagguggugu cuucugugca aguccauuac cgaaugugcc agaacugugu ggagcuagac 300
ucgggcacca uggcuggugu caucuucauu gaccucaucg caacucugcu ccuggcuuug 360
ggcgucuacu gcuuugcagg acaugagacc ggaaggccuu cuggggcugc ugagguucaa 420
gcacugcuga agaaugagca gcuguaucag ccucuucgag aucgugaaga uacccaguac 480
agccgucuug gagggaacug gccccggaac aagaaaucuu aa 522
<210> 191
<211> 516
<212> RNA
<213> 食蟹猕猴(Macaca fascicularis)
<400> 191
auggaacaua gcacguuucu gucuggccug guacuggcua cccuucucuc ccaagugagc 60
cccuucaaga uaccuguaga ggaacuugag gacagagugu uugugaaaug caauaccagc 120
gucacauggg uagagggaac ggugggaaca cugcucacaa auaauacaag acuggaccug 180
ggaaaacgca uccuggaccc acgaggaaua uauaggugua augggacaga uauauacaag 240
gacaaagaau cugcugugca aguucauuau cgaaugugcc agaacugugu ggagcuggau 300
ccagccaccc uggcuggcau cauugucacu gaugucauug ccacucugcu ccuugcuuug 360
ggagucuucu gcuuugcugg acaugagacu ggaaggcucu cuggggcugc cgacacacaa 420
gcucuauuga ggaaugacca ggucuaucag ccccuccgag aucgagauga ugcucaguac 480
agccgccuug gaggaaacug ggcucggaac aaguga 516
<210> 192
<211> 624
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 192
augcagucgg gcacucacug gagaguucug ggccucugcc ucuuaucagu uggcguuugg 60
gggcaagaug guaaugaaga aauggguggu auuacacaga caccauauaa agucuccauc 120
ucuggaacca caguaauauu gacaugcccu caguauccug gaucugaaau acuauggcaa 180
cacaaugaua aaaacauagg cggugaugag gaugauaaaa acauaggcag ugaugaggau 240
caccugucac ugaaggaauu uucagaauug gagcaaagug guuauuaugu cugcuacccc 300
agaggaagca aaccagaaga ugcgaacuuu uaucucuacc ugagggcaag agugugugag 360
aacugcaugg agauggaugu gaugucggug gccacaauug ucauagugga caucugcauc 420
acugggggcu ugcugcugcu gguuuacuac uggagcaaga auagaaaggc caaggccaag 480
ccugugacac gaggagcggg ugcuggcggc aggcaaaggg gacaaaacaa ggagaggcca 540
ccaccuguuc ccaacccaga cuaugagccc auccggaaag gccagcggga ccuguauucu 600
ggccugaauc agagacgcau cuga 624
<210> 193
<211> 570
<212> RNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 193
augcggugga acacuuucug gggcauccug ugccucagcc uccuagcugu uggcacuugc 60
caggacgaug ccgagaacau ugaauacaaa gucuccaucu caggaaccag uguagaguug 120
acgugcccuc uagacaguga cgagaacuua aaaugggaaa aaaauggcca agagcugccu 180
cagaagcaug auaagcaccu ggugcuccag gauuucucgg aagucgagga caguggcuac 240
uacgucugcu acacaccagc cucaaauaaa aacacguacu uguaccugaa agcucgagug 300
ugugaguacu guguggaggu ggaccugaca gcaguagcca uaaucaucau uguugacauc 360
uguaucacuc ugggcuugcu gauggucauu uauuacugga gcaagaauag gaaggccaag 420
gccaagccug ugacccgagg aaccggugcu gguagcaggc ccagagggca aaacaaggag 480
cggccaccac cuguucccaa cccagacuau gagcccaucc gcaaaggcca gcgggaccug 540
uauucuggcc ugaaucagag agcagucuga 570
<210> 194
<211> 597
<212> RNA
<213> 食蟹猕猴(Macaca fascicularis)
<400> 194
augcagucgg gcacucgcug gagaguucug ggccucugcc ucuuaucaau uggcguuugg 60
gggcaagaug guaaugaaga aauggguagu auuacacaga caccauauca agucuccauc 120
ucuggaacca caguaauacu gacaugcucu cagcaucuug gaucugaagc acaauggcaa 180
cacaauggua aaaacaaagg agauucuggg gaucaacugu uucugccgga auuuucagaa 240
auggagcaaa gugguuauua ugucugcuac cccagaggaa gcaauccaga ggacgcgagc 300
caucaucucu accugaaggc aagagugugu gagaacugca uggagaugga ugugauggcg 360
guggccacaa uugucauagu ggacaucugc aucacucugg gcuugcugcu gcugguuuac 420
uacuggagca agaauagaaa ggccaaggcc aagccuguga cacgaggagc aggugcuggc 480
ggcaggcaaa ggggacaaaa caaggagagg ccaccaccug uucccaaccc agacuaugag 540
cccauccgga aaggccagca ggaucuguau ucuggccuga aucagagacg caucuga 597

Claims (60)

1.一种包含两种或更多种具有编码短发夹微RNA(shmiR)的DNA序列的核酸的DNA指导的RNA干扰(ddRNAi)构建体，其中每种shmiR包含：
长度为至少17个核苷酸的效应子序列；
效应子互补序列；
茎环序列；和
初级微RNA(pri-miRNA)骨架；
其中每种shmiR的效应子序列与选自由以下组成的组的T细胞受体(TCR)复合物亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补：CD3-ε、TCR-α、TCR-β、CD3-γ和CD3-δ。
2.如权利要求1所述的ddRNAi构建体，其中每个shmiR以5'至3'方向包含：
所述pri-miRNA骨架的5'侧翼序列；
所述效应子互补序列；
所述茎环序列；
所述效应子序列；和
所述pri-miRNA骨架的3'侧翼序列。
3.如权利要求2所述的ddRNAi构建体，其中所述茎环序列是SEQ ID NO:97中所示的序列。
4.如权利要求2或权利要求3所述的ddRNAi构建体，其中所述pri-miRNA骨架是pri-miR-31a骨架。
5.如权利要求4所述的ddRNAi构建体，其中所述pri-miRNA骨架的5'侧翼序列示于SEQID NO:98中，并且所述pri-miRNA骨架的3'侧翼序列示于SEQ ID NO:99中。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的ddRNAi构建体，其中所述两种或更多种核酸选自：
(i)包含编码包含效应子序列的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与所述CD3-ε亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补；
(ii)包含编码包含效应子序列的shmiR-CD3-γ的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与所述CD3-γ亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补；和
(iii)包含编码包含效应子序列的shmiR-TCR-β的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与所述TCR-β亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补。
7.如权利要求6所述的ddRNAi构建体，所述ddRNAi构建体包含：
(i)包含编码包含效应子序列的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与所述CD3-ε亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补；
(ii)包含编码包含效应子序列的shmiR-CD3-γ的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与所述CD3-γ亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补；和
(iii)包含编码包含效应子序列的shmiR-TCR-β的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与所述TCR-β亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补。
8.如权利要求6或权利要求7所述的ddRNAi构建体，其中：
(i)shmiR-CD3-ε包含SEQ ID NO:134中所示的效应子序列；
(ii)shmiR-CD3-γ包含SEQ ID NO:120中所示的效应子序列；和
(iii)shmiR-TCR-β包含SEQ ID NO:116中所示的效应子序列。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的ddRNAi构建体，其中：
(i)shmiR-CD3-ε包含SEQ ID NO:134中所示的效应子序列和SEQ ID NO:135中所示的效应子互补序列；
(ii)shmiR-CD3-γ包含SEQ ID NO:120中所示的效应子序列和SEQ ID NO:121中所示的效应子互补序列；和
(iii)shmiR-TCR-β包含SEQ ID NO:116中所示的效应子序列和SEQ ID NO:117中所示的效应子互补序列。
10.根据权利要求6至9中任一项所述的ddRNAi构建体，其中：
(i)shmiR-CD3-ε包含SEQ ID NO:153中所示的序列或由其组成；
(ii)shmiR-CD3-γ包含SEQ ID NO:146中所示的序列或由其组成；和
(iii)shmiR-TCR-β包含SEQ ID NO:144中所示的序列或由其组成。
11.根据权利要求1至5中任一项所述的ddRNAi构建体，其中所述两种或更多种核酸选自：
(i)包含编码包含效应子序列的shmiR-TCR-α的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与所述TCR-α亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补；
(ii)包含编码包含效应子序列的shmiR-TCR-β的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与所述TCR-β亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补；和
(iii)包含编码包含效应子序列的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与所述CD3-ε亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补。
12.如权利要求11所述的ddRNAi构建体，所述ddRNAi构建体包含：
(i)包含编码包含效应子序列的shmiR-TCR-α的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与所述TCR-α亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补；
(ii)包含编码包含效应子序列的shmiR-TCR-β的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与所述TCR-β亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补；和
(iii)包含编码包含效应子序列的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与所述CD3-ε亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补。
13.如权利要求11或权利要求12所述的ddRNAi构建体，其中：
(i)shmiR-TCR-α包含SEQ ID NO:100中所示的效应子序列；
(ii)shmiR-TCR-β包含SEQ ID NO:116中所示的效应子序列；和
(iii)shmiR-CD3-ε包含SEQ ID NO:134中所示的效应子序列。
14.根据权利要求11至13中任一项所述的ddRNAi构建体，其中：
(i)shmiR-TCR-α包含SEQ ID NO:100中所示的效应子序列和SEQ ID NO:101中所示的效应子互补序列；
(ii)shmiR-TCR-β包含SEQ ID NO:116中所示的效应子序列和SEQ ID NO:117中所示的效应子互补序列；和
(iii)shmiR-CD3-ε包含SEQ ID NO:134中所示的效应子序列和SEQ ID NO:135中所示的效应子互补序列。
15.根据权利要求11至14中任一项所述的ddRNAi构建体，其中：
(i)shmiR-TCR-α包含SEQ ID NO:136中所示的序列或由其组成；
(ii)shmiR-TCR-β包含SEQ ID NO:144中所示的序列或由其组成；和
(iii)shmiR-CD3-ε包含SEQ ID NO:153中所示的序列或由其组成。
16.根据权利要求1至5中任一项所述的ddRNAi构建体，其中所述两种或更多种核酸选自：
(i)包含编码包含效应子序列的shmiR-TCR-α的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与所述TCR-α亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补；
(ii)包含编码包含效应子序列的shmiR-CD3-γ的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与所述CD3-γ亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补；和
(iii)包含编码包含效应子序列的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与所述CD3-ε亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补。
17.如权利要求16所述的ddRNAi构建体，所述ddRNAi构建体包含：
(i)包含编码包含效应子序列的shmiR-TCR-α的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与所述TCR-α亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补；
(ii)包含编码包含效应子序列的shmiR-CD3-γ的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与所述CD3-γ亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补；和
(iii)包含编码包含效应子序列的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与所述CD3-ε亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补。
18.如权利要求16或权利要求17所述的ddRNAi构建体，其中：
(i)shmiR-TCR-α包含SEQ ID NO:100中所示的效应子序列；
(ii)shmiR-CD3-γ包含SEQ ID NO:120中所示的效应子序列；和
(iii)shmiR-CD3-ε包含SEQ ID NO:134中所示的效应子序列。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的ddRNAi构建体，其中：
(i)shmiR-TCR-α包含SEQ ID NO:100中所示的效应子序列和SEQ ID NO:101中所示的效应子互补序列；
(ii)shmiR-CD3-γ包含SEQ ID NO:120中所示的效应子序列和SEQ ID NO:121中所示的效应子互补序列；和
(iii)shmiR-CD3-ε包含SEQ ID NO:134中所示的效应子序列和SEQ ID NO:135中所示的效应子互补序列。
20.根据权利要求16至19中任一项所述的ddRNAi构建体，其中：
(i)shmiR-TCR-α包含SEQ ID NO:136中所示的序列或由其组成；
(ii)shmiR-CD3-γ包含SEQ ID NO:146中所示的序列或由其组成；和
(iii)shmiR-CD3-ε包含SEQ ID NO:153中所示的序列或由其组成。
21.根据权利要求1至5中任一项所述的ddRNAi构建体，其中所述两种或更多种核酸选自：
(i)包含编码包含效应子序列的shmiR-TCR-α的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与所述TCR-α亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补；
(ii)包含编码包含效应子序列的shmiR-CD3-δ的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与所述CD3-δ亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补；和
(iii)包含编码包含效应子序列的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与所述CD3-ε亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补。
22.如权利要求21所述的ddRNAi构建体，所述ddRNAi构建体包含：
(i)包含编码包含效应子序列的shmiR-TCR-α的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与所述TCR-α亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补；
(ii)包含编码包含效应子序列的shmiR-CD3-δ的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与所述CD3-δ亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补；和
(iii)包含编码包含效应子序列的shmiR-CD3-ε的DNA序列或由其组成的核酸，所述效应子序列与所述CD3-ε亚基的mRNA转录物中具有相应长度的区域基本上互补。
23.如权利要求21或权利要求22所述的ddRNAi构建体，其中：
(i)shmiR-TCR-α包含SEQ ID NO:100中所示的效应子序列；
(ii)shmiR-CD3-δ包含SEQ ID NO:126中所示的效应子序列；和
(iii)shmiR-CD3-ε包含SEQ ID NO:134中所示的效应子序列。
24.根据权利要求21至23中任一项所述的ddRNAi构建体，其中：
(i)shmiR-TCR-α包含SEQ ID NO:100中所示的效应子序列和SEQ ID NO:101中所示的效应子互补序列；
(ii)shmiR-CD3-δ包含SEQ ID NO:126中所示的效应子序列和SEQ ID NO:127中所示的效应子互补序列；和
(iii)shmiR-CD3-ε包含SEQ ID NO:134中所示的效应子序列和SEQ ID NO:135中所示的效应子互补序列。
25.根据权利要求21至24中任一项所述的ddRNAi构建体，其中：
(i)shmiR-TCR-α包含SEQ ID NO:136中所示的序列或由其组成；
(ii)shmiR-CD3-δ包含SEQ ID NO:149中所示的序列或由其组成；和
(iii)shmiR-CD3-ε包含SEQ ID NO:153中所示的序列或由其组成。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的ddRNAi构建体，所述ddRNAi构建体在每种编码shmiR的核酸的上游包含RNA pol III启动子。
27.根据权利要求26所述的ddRNAi构建体，其中每种RNA pol III启动子选自U6和H1启动子。
28.根据权利要求26或权利要求27所述的ddRNAi构建体，其中每种RNA pol III启动子是选自U6-9启动子、U6-1启动子和U6-8启动子的U6启动子。
29.一种DNA构建体，所述DNA构建体包含：
(a)根据权利要求1至28中任一项所述的ddRNAi构建体；和
(b)嵌合抗原受体(CAR)构建体，其包含具有编码CAR的DNA序列的核酸。
30.根据权利要求29所述的DNA构建体，其中所述CAR包含抗原结合结构域。
31.根据权利要求30所述的DNA构建体，其中所述抗原结合结构域是结合蛋白。
32.根据权利要求31所述的DNA构建体，其中所述抗原结合结构域是抗体或其抗原结合结构域。
33.根据权利要求30至32中任一项所述的DNA构建体，其中所述抗原结合结构域特异性结合至肿瘤抗原。
34.根据权利要求30至32中任一项所述的DNA构建体，其中所述抗原结合结构域特异性结合至存在于感染细胞表面上的病毒抗原或病毒诱导的抗原。
35.根据权利要求29至34中任一项所述的DNA构建体，其中所述编码CAR的DNA序列可操作地连接至包含在所述CAR构建体内并位于所述编码CAR的DNA序列的上游的启动子。
36.根据权利要求29至35中任一项所述的DNA构建体，其中所述DNA构建体以5'至3'方向包含所述ddRNAi构建体和所述CAR构建体。
37.根据权利要求29至35中任一项所述的DNA构建体，其中所述DNA构建体以5'至3'方向包含所述CAR构建体和所述ddRNAi构建体。
38.一种表达载体，其包含根据权利要求1至28中任一项所述的ddRNAi构建体或如权利要求29至37中任一项所述的DNA构建体。
39.根据权利要求38所述的表达载体，其中所述表达载体是质粒或微环。
40.根据权利要求38或权利要求39所述的表达载体，其中所述表达载体是选自由以下组成的组的病毒载体：腺相关病毒(AAV)载体、逆转录病毒载体、腺病毒(AdV)载体和慢病毒(LV)载体。
41.一种T细胞，其包含根据权利要求1至28中任一项所述的ddRNAi构建体或如权利要求29至37中任一项所述的DNA构建体或根据权利要求38至40中任一项所述的表达载体。
42.根据权利要求41所述的T细胞，其中所述T细胞不表达功能性TCR。
43.根据权利要求41或权利要求42所述的T细胞，其中所述T细胞表现出所述TCR复合物的至少两种组分的细胞表面表达降低。
44.根据权利要求41-43中任一项所述的T细胞，其中所述T细胞还表达嵌合抗原受体(CAR)。
45.根据权利要求44所述的T细胞，其中所述CAR包含抗原结合结构域。
46.根据权利要求45所述的T细胞，其中所述抗原结合结构域是结合蛋白。
47.根据权利要求45或权利要求46所述的T细胞，其中所述抗原结合结构域是抗体或其抗原结合结构域。
48.根据权利要求45至47中任一项所述的T细胞，其中所述抗原结合结构域特异性结合至肿瘤抗原。
49.根据权利要求45至47中任一项所述的T细胞，其中所述抗原结合结构域特异性结合至存在于感染细胞表面上的病毒抗原或病毒诱导的抗原。
50.一种组合物，其包含根据权利要求1至28中任一项所述的ddRNAi构建体或根据权利要求29至37中任一项所述的DNA构建体或根据权利要求38至40中任一项所述的表达载体或根据权利要求41至49中任一项所述的T细胞。
51.根据权利要求50所述的组合物，所述组合物还包含一种或多种药学上可接受的载体。
52.一种产生不表达功能性TCR的T细胞的方法，所述方法包括将根据权利要求1至28中任一项所述的ddRNAi构建体或根据权利要求29至37中任一项所述的DNA构建体或根据权利要求38至40中任一项所述的表达载体或根据权利要求50或权利要求51所述的组合物引入T细胞。
53.一种产生不表达功能性TCR但表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的方法，所述方法包括将根据权利要求29至37中任一项所述的DNA构建体或包含所述DNA构建体的根据权利要求38至40中任一项所述的表达载体或包含所述DNA构建体的根据权利要求50或权利要求51所述的组合物引入T细胞。
54.根据权利要求53所述的方法，所述方法还包括对在52中产生的T细胞进行HLA分型。
55.一种抑制T细胞中两种或更多种T细胞受体(TCR)复合物亚基表达的方法，所述方法包括向所述T细胞施用根据权利要求1至28中任一项所述的ddRNAi构建体或根据权利要求29至37中任一项所述的DNA构建体或根据权利要求38至40中任一项所述的表达载体或根据权利要求50或权利要求51所述的组合物。
56.根据权利要求52至55中任一项所述的方法，其离体地进行。
57.一种在有此需要的个体中预防或治疗癌症、移植物抗宿主病、感染、一种或多种自身免疫性病症、移植排斥或放射病的方法，所述方法包括向所述个体施用根据权利要求41至49中任一项所述的T细胞或根据权利要求50或权利要求51所述的包含所述T细胞的组合物。
58.根据权利要求57所述的方法，其中向所述个体施用的T细胞是同种异体T细胞。
59.根据权利要求57所述的方法，其中向所述个体施用的T细胞是非自体T细胞。
60.一种包含多种不表达功能性TCR的不同HLA类型的T细胞的细胞库，其中所述细胞库包含至少一种根据权利要求41至49中任一项所述的T细胞。
CN201780067623.2A 2016-09-14 2017-09-14 用于产生具有非功能性t细胞受体(tcr)的t细胞的试剂、包含其的组合物及其用途 Pending CN110023498A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662394559P 2016-09-14 2016-09-14
US62/394,559 2016-09-14
PCT/AU2017/050995 WO2018049471A1 (en) 2016-09-14 2017-09-14 REAGENTS FOR PRODUCING T-CELLS WITH NON-FUNCTIONAL T-CELL RECEPTORS (TCRs) COMPOSITIONS COMPRISING SAME AND USE THEREOF

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110023498A true CN110023498A (zh) 2019-07-16

Family

ID=61618523

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780067623.2A Pending CN110023498A (zh) 2016-09-14 2017-09-14 用于产生具有非功能性t细胞受体(tcr)的t细胞的试剂、包含其的组合物及其用途

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20190309307A1 (zh)
EP (1) EP3512950A1 (zh)
JP (1) JP2019531718A (zh)
KR (1) KR20190064590A (zh)
CN (1) CN110023498A (zh)
AU (1) AU2017326748A1 (zh)
CA (1) CA3036722A1 (zh)
WO (1) WO2018049471A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114761560A (zh) * 2019-11-25 2022-07-15 国立大学法人京都大学 T细胞主细胞库

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017192536A1 (en) * 2016-05-02 2017-11-09 University Of Kansas Eliminating mhc restriction from the t cell receptor as a strategy for immunotherapy
US20210108197A1 (en) * 2017-03-31 2021-04-15 Staidson (Beijing) Biopharmaceuticals Co., Ltd. Shrna expression cassette, polynucleotide sequence carrying same, and application thereof
EP4006153B1 (en) * 2018-01-12 2024-07-03 Curocell Inc. Enhanced immune cells using dual shrna and composition including the same
CN110616188B (zh) * 2018-06-20 2023-05-09 上海隆耀生物科技有限公司 一种通用型car-t细胞及其制备方法和应用
WO2020020359A1 (en) * 2018-07-26 2020-01-30 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Nef-containing t cells and methods of producing thereof
EP3864138A4 (en) * 2018-10-10 2022-10-26 The Regents Of The University Of California COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODIFYING REGULATORY T LYMPHOCYTES
CN113993999B (zh) * 2019-04-03 2022-11-22 精密生物科学公司 包含microRNA适应的shRNA(shRNAmiR)的遗传修饰的免疫细胞
CN114144202A (zh) * 2019-05-02 2022-03-04 达尔马科恩有限公司 用于载体的多重shRNA
KR20220035326A (ko) * 2019-05-02 2022-03-22 셀리아드 다중화된 억제성 rna를 갖는 세포
CN113046320B (zh) * 2021-02-19 2023-04-14 中国医学科学院基础医学研究所 胞外段为Vδ1(GTM)Vγ4的CAR分子及表达该分子的CAR-T细胞及其用途

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2937157A1 (en) * 2016-07-25 2018-01-25 Ucl Business Plc Protein-based t-cell receptor knockdown

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114761560A (zh) * 2019-11-25 2022-07-15 国立大学法人京都大学 T细胞主细胞库

Also Published As

Publication number Publication date
CA3036722A1 (en) 2018-03-22
US20190309307A1 (en) 2019-10-10
AU2017326748A1 (en) 2019-04-11
KR20190064590A (ko) 2019-06-10
WO2018049471A1 (en) 2018-03-22
JP2019531718A (ja) 2019-11-07
EP3512950A1 (en) 2019-07-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110023498A (zh) 用于产生具有非功能性t细胞受体(tcr)的t细胞的试剂、包含其的组合物及其用途
KR102608405B1 (ko) 키메라 수용체 및 그의 사용 방법
AU2022200108B2 (en) Chimeric receptors to FLT3 and methods of use thereof
US11952408B2 (en) HPV-specific binding molecules
KR102584280B1 (ko) 키메라 항원 및 t 세포 수용체 및 사용 방법
KR20210018797A (ko) Dll3에 대한 키메라 수용체 및 이의 사용 방법
US10604740B2 (en) Nucleic acids encoding chimeric antigen receptor proteins which bind epidermal growth factor receptor and T lymphocyte expressing the protein
CN106146666B (zh) 靶向cldn6的免疫效应细胞及其制备方法和应用
CN115003802B (zh) 一种经修饰的免疫效应细胞及其制备方法
KR20220119176A (ko) B 세포 악성종양 및 다른 암을 치료하는데 유용한 자가 t 세포 및 그의 조성물의 생산 방법
KR20140060541A (ko) 암을 치료하기 위한 rna 조작된 t 세포
WO2021197391A1 (zh) 一种制备经修饰的免疫细胞的方法
US20230069322A1 (en) Compositions and methods for gamma delta tcr reprogramming using fusion proteins
CN108864310A (zh) 一种靶向间皮素并携带PD-Ll阻断剂的CAR-T细胞的构建及其应用
KR20220097984A (ko) 키메라 항원 수용체를 발현하는 t 세포를 제조하기 위한 제조 방법
US20230398148A1 (en) Cells expressing a chimeric receptor from a modified invariant cd3 immunoglobulin superfamily chain locus and related polynucleotides and methods
CN110628821B (zh) 一种细胞模型及其制备方法、应用
CN111983218A (zh) 一种用于检测活细胞-活细胞表面受体-配体相互作用的试剂盒
KR102292657B1 (ko) 암 상살 능력이 향상된 면역세포
US20230054266A1 (en) Method for purifying ucart cell and use thereof
KR102587454B1 (ko) T 세포 수용체, t 세포 수용체를 포함하는 면역 세포 및 이를 이용하는 방법
US20240342280A1 (en) Optimizing t cell differentiation state with micrornas
CN113234757B (zh) 嵌合抗原受体及制备方法
CA3236268A1 (en) Developing inducible cluster chimeric antigen receptor (ccar) constructs
CN115803438A (zh) 用于cd3+细胞体外和体内表达基因治疗产物的启动子序列

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20190716

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication